MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
DIPLOMOVÁ PRÁCE
BRNO 2010
BC. KRISTINA VNUKOVÁ
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chemie a biochemie
Stanovení fenolových látek a antioxidační aktivity u různých druhů chleba, pečiva a jiných obilných výrobků Diplomová práce
Vedoucí práce:
Vypracoval:
doc. RNDr. Ing. Pavel Stratil, Ph.D.
Brno 2010
Bc. Kristina Vnuková
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Stanovení fenolových látek a antioxidační aktivity u různých druhů chleba, pečiva a jiných obilných výrobků vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.
dne ………………………………………. podpis diplomanta ……………………….
PODĚKOVÁNÍ
Na tomto místě bych velmi ráda poděkovala vedoucímu diplomové práce doc. RNDr. Ing. Pavlu Stratilovi, Ph.D. za cenné rady a materiál pro vyhotovení diplomové práce, dále za informace a odborné vedení během analytického stanovení a zpracování dat. Také děkuji svým nejbližším za poskytnuté zázemí v průběhu celého studia.
ABSTRAKT Obsahu fenolových látek a jejich antioxidační aktivitě v potravinách se věnuje ve světě několik výzkumných laboratoří. Tato práce je zaměřena na fenolové látky a jejich antioxidační aktivitu u různých druhů chleba, pečiva a jiných obilných výrobků. Analýza byla provedena celkem u 42 vzorků, z toho 6 druhů chlebů a 19 různých druhů ostatního pečiva. Dále byly analyzovány dvě nejvýznamnější obiloviny pro pekařské účely v ČR, a to pšenice a žito a jejich vymleté mouky a otruby. Ke stanovení celkového obsahu fenolových látek byla použita spektrofotometrická metoda s Folin-Ciocalteu reagentem (FCM) a ke stanovení celkové antioxidační aktivity byla použita metoda TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity). Celozrnné produkty mají významně vyšší obsah fenolových látek, což spolu s vyšším obsahem vitaminů, minerálních látek, fosfolipidů a vlákniny působí příznivě na lidské zdraví a jsou závažným důvodem pro preferování jejich konzumace místo výrobků z mouky bílé.
Klíčová slova: fenolové látky, antioxidační aktivita, FCM, TEAC, obiloviny, pečivo, mouka.
ABSTRACT To the total content of phenolic substances and their antioxidant activity in foodstuffs pay attention several research labs of the word. This work is focused on determination of the phenolic compounds and total antioxidant activity in different types of bread, buns and rolls and other cereal products. Determination has been made in 42 samples, from those 6 samples were bread, 19 kinds of other different types of buns and rolls. It was analyzed the two most important cereals for baking purposes in the Czech Republic, namely wheat and rye and their flours and bran. Spectrofotometric method FC method (Folin-Ciocalteu) for determination of phenolic compounds and TEAC method (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) for estimation of antioxidant capacity was used. Wholemeal products have significantly higher content of phenolics, which together with higher content of vitamins, minerals, phospholipids, and fibres is beneficial for human health and therefore there is important reason for preferable consumption of them instead of white flour products.
Key words: phenolic compounds, antioxidant activity, cereals, bread, flour.
OBSAH ABSTRAKT............................................................................................................................... 5 OBSAH ...................................................................................................................................... 6 1 ÚVOD ..................................................................................................................................... 7 2 CÍL PRÁCE............................................................................................................................. 8 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED......................................................................................................... 9 3. 1 Základní informace o obilovinách používaných k výrobě .................................................. 9 3. 1. 1 Morfologie části zrna a jejich zpracovatelský význam ................................................... 9 3. 2 Fenolové látky: biosyntéza a klasifikace fenolových látek v potravinách ........................ 12 3. 2. 1 Deriváty kyseliny skořicové, benzoové a jednoduché fenoly ....................................... 13 3. 2. 2 Fenolové látky v obilovinách ........................................................................................ 14 3. 2. 3 Absorpce a metabolismus.............................................................................................. 22 3. 3 Antioxidační vlastnosti fenolů v potravinách.................................................................... 23 3. 3. 1 Přírodní antioxidanty..................................................................................................... 25 3. 4 Příjem fenolových látek v potravě a vliv na lidské zdraví ................................................ 26 3. 4. 1 Farmakologické účinky ................................................................................................. 28 4 MATERIÁL A METODIKA ................................................................................................ 30 4.1 Chemikálie a reagenty ........................................................................................................ 30 4.2 Přístroje .............................................................................................................................. 31 4.3 Software ............................................................................................................................. 31 4.4 Analyzované vzorky........................................................................................................... 31 4.4.1 Příprava vzorků ............................................................................................................... 33 4.4.2 Extrakce volných a celkových fenolových látek z rostlinných materiálů ....................... 33 4.5 Stanovení fenolových látek ................................................................................................ 33 4.6 Stanovení antioxidační aktivity vzorků.............................................................................. 34 6 ZÁVĚR.................................................................................................................................. 47 7 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY ................................................................................. 49
1 ÚVOD Epidemiologické studie prokázaly, že pravidelná konzumace celozrnných výrobků, je spojená se snížením rizika různých typů chronických onemocnění, jako jsou kardiovaskulární choroby, diabetes druhého typu, některých druhů rakovin a obezity (Slavin, 2004; Ragaee et al., 2006; Liu, 2007; Gorinstein et al., 2008; Bondia-Pons et al., 2009). Některé studie naznačují, že příjem potravin obsahujících určité polyfenoly může chránit organismus před formami rakovin jako především rakoviny plic, trávicího traktu a rakoviny prsu u žen a rakoviny prostaty u mužů. Rovněž řada experimentů na laboratorních zvířatech a nádorových
buňkách
prokázala
antikarcinogenní
účinky
rostlinných
polyfenolů.
Epidemiologická data ukazují na korelaci mezi množstvím flavonoidů v potravě a snížením rizika kardiovaskulárních onemocnění, v některých studiích až o více než 50 % (Hollman, Katan, 1999). Cereálie jsou bohatým zdrojem vlákniny, vitaminů, minerálů a fytochemikálií, fenolů, karotenoidů, vitaminu E, lignanů, β-glukanu, inulinu, rezistentních škrobů, sterolů a fytátů, které byly označeny jako zdraví prospěšné (Slavin, 2004; Liu, 2007). Potraviny rostlinného původu, jako je ovoce, zelenina a celozrnné potraviny, které obsahují značné množství bioaktivních fytochemikálií, mohou poskytnout žádoucí přínos pro zdraví nad rámec základní výživy a přispět tak ke snížení rizika chronických onemocnění (Liu, 2007). Některé z těchto fytochemikálií jako ferulová kyselina a diferuláty jsou převážně obsaženy v obilí, ale nejsou přítomny ve významném množství v ovoci a zelenině, takže cereálie obsahují unikátní fytochemikálie, které doplňují ty v ovoci a zelenině. V mnoha rozvojových zemích, obiloviny poskytují až 75 % přijímané energie ze stravy (Kaletuc, Breslauer, 2003). Zlepšení a rozvoj produktů z obilovin a jejich zpracování vyžaduje lepší porozumění vlivu zpracování a podmínek skladování na fyzikální vlastnosti a strukturu před a po zpracování materiálů. Komerční cereální produkty jsou obvykle tvarovány, pufovány, vločkovány nebo jinak přeměňovány na požadované výrobky. Mnohé výzkumy ukázaly, že zpracování celozrnných produktů neodstraní biologicky důležité složky. Analýzy zpracovaného chleba a dalších cereálních výrobků prokázaly, že jsou bohatým zdrojem antioxidantů. Zpracování může rozrušit buněčné stěny a tím usnadnit uvolňování fytochemikálií z pevných vazeb (Slavin, 2004).
7
2 CÍL PRÁCE Cílem práce bylo podat literární přehled o fenolových látkách a jejich antioxidační aktivitě v obilovinách, moukách a pekařských výrobcích, dále pak sběr vzorků obilných produktů, analýza vzorků a následné vyhodnocení naměřených hodnot. Ke stanovení celkového obsahu fenolových látek byla použita spektrofotometrická metoda s Folin-Ciocalteu reagentem (FCM) a ke stanovení celkové antioxidační aktivity byla použita metoda TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity). Analýza byla provedena celkem u 42 vzorků, z toho 6 druhů chleba, 19 druhů různých druhů ostatního pečiva. Dále byly analyzovány dvě nejvýznamnější obiloviny pro pekařské účely v ČR, a to pšenice a žito a jejich vymleté mouky a otruby.
8
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3. 1 Základní informace o obilovinách používaných k výrobě Mezi majoritní cereální zrniny patří pšenice, rýže a kukuřice, dále mezi zrniny minoritní patří oves, žito, ječmen, triticale, čirok, proso (Slavin, 2004; Liu, 2007). Pro lidskou výživu se přímo používá z obilovin výhradně zrno. Obiloviny patří botanicky mezi traviny – lat. Graminae. Téměř všechny známé obiloviny patří do čeledi lipnicovité, lat. Poaceae. Výjimku tvoří pohanka, patřící do čeledi rdesnovité (Polygonaceae). V posledních letech se také porůznu začala uplatňovat další semena, např. amarant, patřící do čeledi amaranthovité (Amaranthaceae). V našich podmínkách se jedná především o pšenici a žito. V jiných částech světa mimo Evropu dosahují značného významu další obiloviny, zejména rýže, kukuřice, proso a čirok. Často se aspoň z části míchají s pšenicí pro výrobu pečených výrobků blížících se evropskému typu (Příhoda et al., 2003). Zpracovatelské vlastnosti mouky souvisejí se základní stavební strukturou obilného zrna, a tudíž s jeho chemickým složením, strukturním uspořádáním hlavních chemických složek a s jejich změnami v důsledku reakcí probíhajících uvnitř zrna při jeho zrání, vymílání mouky a skladování obilí a mouky. Obilné zrno se až do okamžiku svého umrtvení (mechanickým rozrušením, teplem, ozářením apod.) chová jako živý systém. Proto změny chemických vlastností souvisejí s biologickými a biochemickými pochody, při nichž hrají významnou roli enzymy, které působí ještě dlouho ve vymleté mouce, a řada z nich dokonce ještě v těstě až do jejich tepelné inaktivace v peci (Příhoda et al., 2003). Čím méně je zrno vymleto a mouka je bělejší (původem blíže k endospermu), tím více v ní klesá podíl bílkovin a mírně stoupá obsah sacharidů (škrobu) a výrazně klesá obsah tuku a zejména hrubé vlákniny (celulosy z obalových vrstev).
3. 1. 1 Morfologie části zrna a jejich zpracovatelský význam Obalové vrstvy chrání obilku před vnějšími vlivy, v mlýnské technologii je označujeme jako otruby. Vnější vrstvy jsou složeny převážně z nerozpustných polysacharidů typu celulosy s velkou mechanickou pevností. Podpovrchové obalové vrstvy jsou složeny rovněž z polysacharidů, které ale s vodou bobtnají, nebo se částečně rozpouštějí, a jsou schopny vodu velmi pevně vázat. Vnější obalové vrstvy mohou sloužit jako zdroj nestravitelné vlákniny, což může být využíváno z hlediska potřeb úpravy výživových hodnot výrobků (snížení 9
energetického obsahu výrobku a zvýšení obsahu balastních nestravitelných látek), ale z hlediska pekárenské technologie mají tyto složky zhoršující účinek na kvalitu a zpracovatelnost těsta a často i na vzhled hotového výrobku. Podpovrchové obalové vrstvy mohou mít příznivý účinek na zvýšení vaznosti mouk a prodloužení vláčnosti střídy pekařských výrobků, ale mohou také zvyšovat lepivost těsta. Klíček (embryo) je vlastním zárodkem nové rostliny a nositelem genetických informací. Při mlýnském zpracování je oddělován. Je však bohatým zdrojem některých významných látek z hlediska lidské výživy, ale na vzduchu má velmi krátkodobou stabilitu, protože jeho tukové složky rychle žluknou. Endosperm představuje největší podíl zrna a je technologicky nejvýznamnější částí. Pšeničná mouka je téměř čistý rozdrcený pšeničný endosperm. Do žitné mouky se dostává více podobalových vrstev. Okolo 50-75 % (75–80% dle Liu, 2007) endospermu je tvořena škrobem, ale pro pekárenskou technologii je velmi významná i obsažená bílkovina, která tvoří jen 10 % endospermu (8-18 % dle Slavin, 2004). Kolísání obsahu bílkoviny a její rozdílná kvalita je určující pro pekárenskou zpracovatelskou kvalitu pšeničné mouky (Příhoda et al., 2003). Do celkového obsahu endospermu bývá zvykem zahrnovat také jeho vrchní vrstvu pod vnějšími obaly, nazývanou aleuronová vrstva. Ta sice obsahuje podstatně více bílkovin než ostatní endosperm, ale tyto bílkoviny nepatří k nejpevnějším lepkotvorným, které by byly nositelem pekařské síly mouky. V praxi tedy může mouka, která má vyšší obsah této aleuronové vrstvy (výše vymleté mouky, zadní mouky), vykazovat vyšší obsah bílkoviny a mokrého lepku, avšak její schopnost vytvořit pevnou a stabilní strukturu pšeničného pečiva bude snížena (Příhoda et al., 2003).
10
Obrázek 1. Morfologické části zrna
(Zdroj: http://www3.czu.cz/php/skripta/kapitola.php?titul_key=81&idkapitola=4)
Typy pšeničných mouk Při vymíláni mouk sledujeme hlavně získání co největšího podílu endospermu. Mlýnská technologie pro mletí pšenice je tradičně zaměřena na postupné vymílání středových částí zrna a v konečných fázích mletí pak na vydírání zbylého endospermu ze zbytků otrub. V důsledku toho je nejvíce pekařsky kvalitních bílkovin obilného zrna obsaženo v krupicích a prvních moukách z počátečních chodů ve mlýně (přední mouky). V dalších chodech se zvyšuje podíl částic z podobalových a v konci mletí i oděrků z obalových vrstev zrna. Tyto mouky mají proto zvýšený podíl složek: minerálních látek (tzv. popel), aleuronových bílkovin, rozpustných a nerozpustných obalových polysacharidů, vitaminů a barviv z obalových vrstev (Příhoda et al., 2003).
11
3. 2 Fenolové látky: biosyntéza a klasifikace fenolových látek v potravinách Nejvýznamnější a nejrozmanitější skupinou látek s antioxidačním účinkem běžně se vyskytujících v rostlinných potravinách jsou fenolové látky. Fenolové sloučeniny (používaná synonyma: fenoly, polyfenoly - vztahuje se k počtu OH skupin) jsou látky, které mají jeden nebo více benzenových kruhů substituovaných jednou nebo několika hydroxylovými skupinami a jejich funkční deriváty (estery, glykosidy apod.). Po chemické stránce tvoří několik skupin strukturně podobných sloučenin. Jednotlivé rostliny obvykle obsahují celou řadu fenolových látek různé struktury, včetně tokoferolů a tokotrienolů (Velíšek, 2002). V rostlinách se vyskytuje několik tisíc strukturně velmi různorodých fenolových sloučenin. Vzhledem k jejich širokému rozšíření a poměrně velké koncentraci v rostlinách jsou běžnou součástí lidské potravy. Nejběžnějšími rostlinnými polyfenoly jsou flavonoidy a fenolové kyseliny (Vnuková, 2008; Liu, 2007). Hlavními zdroji polyfenolů jsou především nápoje (víno, káva, čaj, ovocné džusy), čokoláda a ovoce (Slanina, Táborská, 2004). Fenolové látky v potravinách reprezentují široce distribuované rostlinné sekundární metabolity, používající jejich prospěšné efekty jako lapače volných radikálů a chelátory prooxidantů kovů, chrání lipoproteiny s nízkou hustotou proti oxidaci, posilují imunitní funkci a jsou proti dělení DNA (Shahidi, Naczk, 2004). Celozrnné výrobky jsou doporučovány pro zdravou stravu jako uznané zdroje vlákniny a antioxidačních látek (Ragaee et al., 2006; Liyana-Pathirana, Shahidi, 2007). Fenolové látky v potravinách pocházejí z jedné z hlavních tříd sekundárních metabolitů v rostlinách odvozených z fenylalaninu. Chemicky mohou být fenoly definovány jako látky mající aromatický řetězec s jednou nebo více hydroxylovými skupinami, zahrnující jejich funkční deriváty. Syntetické fenoly mohou také vstupovat do potravin úmyslným přimícháváním k zabránění oxidaci lipidů a jejich složek (Shahidi, Naczk, 2004). Rostliny a potraviny obsahují množství druhů fenolových derivátů, zahrnující jednoduché fenoly, fenylpropanoidy, deriváty kyseliny benzoové, flavonoidy, stilbeny, taniny, lignany a ligniny. Společně s dlouhými řetězci karboxylových kyselin jsou fenoly také složky suberinu a kutinu. Tyto spíše různé složky jsou nezbytné pro růst a reprodukci rostlin a také působí jako antipatogeny, přispívají k pigmentaci rostlinných plodin. Navíc fenoly působí jako antibiotika, přírodní pesticidy, signální látky pro vytvoření symbiózy s hlízkovými bakteriemi, atraktanty pro opylovače, ochranné prostředky proti ultrafialovému záření, izolační materiály pro
12
buněčné stěny, aby nepropouštěly plyn a vodu, a jako stavební materiály pro rostlinnou stabilitu (Shahidi, Naczk, 2004). Mnohé vlastnosti rostlinných produktů jsou asociovány s výskytem, typem a množstvím fenolových složek. Příznivé zdravotní účinky některých fenolových látek nebo jejich potenciální antinutriční vlastnosti, pokud se nachází ve velkém množství, jsou významné pro výrobce a spotřebitele potravin. Navíc, anthokyany jsou hojně obsaženy v potravinách, zejména v ovoci. Mohou být použity jako látky s blahodárným účinkem na zdraví v sušených a práškových formách z ovoce nebo jeho vedlejších produktů. Tyto antokyany jsou zodpovědné za červenou, modrou, fialovou a nachovou barvu mnohých rostlinných druhů a jejich produktů a ovoce (Shahidi, Naczk, 2004). Ferulové kyseliny se vyskytují zejména v semenech a listech rostlin, především kovalentně konjugované s mono- a disacharidy, rostlinnými
polysacharidy
buněčné
stěny,
glykoproteiny,
polyaminy,
ligninem
a nerozpustnými sacharidy (Liu, 2007).
3. 2. 1 Deriváty kyseliny skořicové, benzoové a jednoduché fenoly Fenylalanin-amoniaklyasa (PAL) katalyzuje uvolňování amoniaku z fenylalaninu a vede ke vzniku C=C dvojné vazby. Vytváří trans-skořicové kyseliny. V některých rostlinách a travinách je tyrozin převedený na 4-hyroxyskořicovou kyselinu díky činnosti tyrosin-amoniaklyasy (TAL). Zavedení hydroxylové skupiny do para polohy kruhu skořicové kyseliny probíhá přes katalýzu monooxygenas využitím cytochromu P450 a kyslíku jako vazebné polohy. p-Kumarová kyselina může být hydroxylovaná dále v pozicích 3 a 5 pomocí hydroxylas
a
eventuálně
i
denaturovaná
pomocí
O-methyltransferasy
s S-methyladenosylmethioninu jako dárce methylu. To vede k vytvoření kávové, ferulové a sinapové kyseliny. Tyto sloučeniny mají fenolový kruh (C6) a C3 na postranním řetězci, a jsou tedy souhrnně nazývané fenylpropanoidy, které slouží jako prekurzory pro syntézu ligninu a mnoha dalších sloučenin (Shahidi, Naczk, 2004). Benzoové kyseliny se tvoří přes ztrátu dvou uhlíků z fenolpropanoidů. Salicylová kyselina je derivát kyseliny benzoové, který se chová jako signální složka. Po infekci nebo UV ozáření, mnoho rostlin zvyšuje obsah kyseliny salicylové, která může vyvolat biosyntézu obranných látek. Aspirin, je acetyl ester salicylové kyseliny, poprvé izolovaný z kůry vrby. Hydroxylace a možná i metylace hydroxybenzoové kyseliny vede k tvorbě kyseliny dihydrobenzoové, vanillové, syrignové a gallové. Hydroxybenzoové kyseliny jsou běžně přítomné ve vázané 13
formě v potravinách a často jsou součástí struktur jako ligniny a hydrolyzovatelné třísloviny. Jsou také vázané na organické kyseliny a deriváty sacharidů. Nicméně, některé jsou přítomny především ve volné formě (Shahidi, Naczk, 2004). Konvenčně, fenylpropanoly a deriváty benzoové kyseliny jsou kolektivně nazývány „fenolové kyseliny“ v potravinářsko-vědecké literatuře. Dekarboxylace kyseliny benzoové a fenylpropanových derivátů vede k tvorbě jednoduchých fenolů. Tepelným rozkladem ligninu nebo mikrobiální transformací mohou být produkovány jednoduché fenoly v potravinách. Např. vinyl-substituované fenoly mohou být vytvořené dekarboxylací hydroxyskořicové kyseliny. Množství jednoduchých fenolů, a to fenol, o-kresol, guajakol, 4-vinylguajacol a eugenol, se vyskytují v potravinách rostlinného původu (Shahidi, Naczk, 2004).
3. 2. 2 Fenolové látky v obilovinách Fenolové látky jsou všudypřítomné v cereáliích, luštěninách a ořeších. Rozdílné fenoly patřící do tříd kyseliny benzoové a skořicové, flavonoidům a tříslovinám mohou být přítomné volné, esterifikované nebo v nerozpustně vázáných formách. Proto může být ferulová kyselina spojena s polysacharidy, ligniny a suberinem; p-kumarové kyseliny mohou být spojeny s polysacharidy, ligniny a kutinem. V aleuronové vrstvě obilných zrn jsou ferulové kyseliny především vázány s polysacharidy esterovou vazbou
na O-5 pozici arabinofuranosy.
Ferulové kyseliny mohou také podléhat dimerovému oxidačnímu spojení katalyzovanému peroxidasou. Dehydrodimery z ferulové kyseliny mohou vytvářet vzájemné vazby mezi arabinoxylanovými řetězci (Shahidi, Naczk, 2004). Množství fenolů přítomných v obilných zrnech, především v pečených výrobcích, může být ovlivněno vedlejšími produkty vzniklými při enzymatické nebo tepelné degradaci substituované
benzoové
a
skořicové
kyseliny.
Při
tepelném
rozkladu
skořicové
a hydroxyskořicové kyseliny, za podmínek í pečení obilných zrn, byly hlavními produkty tepelného rozkladu 4-vinyl deriváty těchto kyselin. Nicméně některé fenoly s prodlouženým alkylovým postranním řetězcem, jako je 5-n-alkyl-resorcinol, se přirozeně vyskytují v obilných zrnech (Shahidi, Naczk, 2004). Zpracování potravin, jako je tepelné zpracování, pasterizace, kvašení, a zmrazení, přispívá k uvolnění vázaných fenolových kyselin (Liu, 2007; Slavin, 2004). Oligomerní flavanoly, produkty kondenzace (+)-katechinu, (+)-gallokatechinu
14
a jejich epimerů, byly také nalezeny v mnoha rostlinných produktech. Nicméně, v obilných zrnech přítomnost oligomerních flavanolů byl zjištěna pouze v čiroku a ječmeni.
3. 2. 2. 1 Pšenice Pšenice je světově nejrozšířenější obilovinou pro pekařské využití (Příhoda et al., 2003). Pšeničné odrůdy se liší od sebe s ohledem na optimální podmínky pěstování, barvu zrna, tvrdost a složení. Odrůdy vysázené v létě nebo na podzim pro sklizeň následující léto se nazývají zimní pšenice, mezi ně patří červená a bílá pšenice, stejně jako tvrdé a měkké odrůdy. Odrůd pšenice vysazených na jaře pro sklizeň v pozdním létě, jsou známé jako jarní odrůdy a zahrnují odrůdy durum, stejně jako tvrdé červené a tvrdé a měkké bílé odrůdy. Špalda (Triticum aestivum ssp. Spelta), sub-druh pšenice, je starobylá plodina, která se stále pěstuje v několika zemích regionu střední a východní Evropy. Produkty založené na špaldě jsou lehce stravitelné a mají mírně vyšší obsah bílkovin než pšenice a mohou být tolerovány osobami s alergiemi na pšenici (Zielijski et al, 2008).
Fenolové kyseliny Bylo zjištěno, že zrna pšenice obsahují volné fenolové sloučeniny a jejich deriváty. Celkový obsah fenolových kyselin u šesti pšeničných odrůd pěstovaných na čtyřech místech v Kanadě se pohyboval v rozmezí 1608-2687 mg ekvivalentu ferulové kyseliny/kg (Abdel-Aal et al., 2001). Bylo zjištěno, že zrna pšenice polských kultivarů obsahují 3,44 až 3,55 mg/kg volných fenolových kyselin, 42,9 až 69,9 mg/kg fenolové kyseliny odvozené od esterů a od 3,68 až 9,83 mg/kg fenolových kyselin odvozených od rozpustných glykosidů. Ferulová, vanillová, kávová, p-kumarová, sinapová a další kyseliny, jakož i vanilin a syringaldehyd, byly zjištěny v zrnu pšenice (Shahidi, Naczk, 2004). Je známo, že se ferulové kyseliny vyskytují ve velkém množství v lepku buněčných stěn zrna a méně ve slupce a embryu. Ve zralém obilí se obsah ferulové kyseliny může pohybovat v rozmezí 535 do 783 mg/kg zrna (Abdel-Aal et al., 2001). Kromě toho bylo zjištěno, že mimo ferulové kyseliny je kávová, p-kumarová a sinapové kyselina jsou hlavní fenolové kyseliny. Vázaná ferulová kyselina a vázaná p-kumarová kyselina dosáhne maximální úrovně v buněčných stěnách tvrdé pšenice v průběhu hydratace (spojena s druhou fází rozvoje zrna) a potom rychle klesá během dehydratace zrna.
15
Klíčení zrna významně zvyšuje obsah v ethanolu-rozpustných fenolových kyselin, maximální koncentrace je dosaženo asi 9 dnů po klíčení. Poté obsah fenolových kyselin začíná klesat a dosáhne minima o 4 až 5 týdnů později. Úroveň ferulové kyseliny se snižuje téměř o 50 % během zrání zrna.
Ostatní fenoly Celkový obsah alkylfenolů v sušině, vyjádřených ekvivalentem 5-n-pentadecylresorcinolu, se pohybuje od 657 do 927 mg/kg pšenice a od 633 do 863 mg/kg pro triticale. Pšeničné otruby mají nejvyšší obsah alkylresorcinolu (2110 mg/kg); mouka obsahuje pouze 380 mg/kg. Otruby tvrdé pšenice obsahují řadu flavonoidních pigmentů. V závislosti na odrůdě pšenice, obsah flavonoidů se pohybuje od 149,1 až 405,7 mg/kg. Tricin je dominantní flavonový pigment v kultivovaných a divokých pšenicích. Přibližně jedna třetina z celkového obsahu flavonů v pšenici je vyjádřeno jako ekvivalent tricinu), je obsažena v endospermu a dvě třetiny v otrubách a embryu. Dva další flavonoidy byly také izolovány z pšeničných klíčků, označené jako apigenin glykosidy (Shahidi, Naczk, 2004). Fenolové aldehydy, jako je p-hydroxybenzaldehyd, vanilin a syringaldehyd mohou být zjištěny u pšenice druhu Triticum dicoccoides a Aegilops geniculata. Kromě toho jsou veratraldehyd a protokatechualdehyd nalezené v pšenice druhu Triticum dicoccoides (Shahidi, Naczk, 2004).
Vliv zpracování Čerstvá pšeničná mouka obsahuje 71,4 mg/kg fenolových kyselin. Ferulová kyselina je hlavní fenolovou kyselinou, které tvoří přibližně 89,1 % z celkových fenolových kyselin. Více než 84 % fenolových kyselin jsou přítomny v nerozpustné vázané formě. Skladování pšeničné mouky přináší ztrátu volných fenolů, rozpustných esterů a nerozpustných vázáných fenolů vlivem destruktivní oxidační reakce (Shahidi, Naczk, 2004). Ferulová, syringová, kávová, sinapová, p-kumarová a vanillová kyselina byly zjištěny v pšeničném lepku. Ferulová kyselina (49-77 mg/kg sušiny lepku) převažuje, následuje sinapová kyselina (14 až 35 mg/kg sušiny lepku). Fenoly rozpustné v aceton-methanol-vodě obsahují 64 až 85% z celkového počtu sinapové kyseliny a pouze 5 až 50 % ferulové kyseliny zjištěné u pšeničného lepku (Labat et al., 2000). Během míchání lepku zmizí 21 - 66 % ferulové a 22 - 94 % sinapové původní rozpustné formy a kyseliny (Labat et al., 2000). Abdel-Aal et al., (2001) zkoumali distribuci fenolových kyselin ve frakcích pšenice. Asi 73 % fenolových kyselin bylo nalezeno ve šrotu, ale pouze 5% v první, druhé a třetí mlecí frakci. 16
3. 2. 2. 2 Žito Vzhledem k tomu, že žito může být pěstováno za různých podmínek, je (Secale cereale L) jedním z nejvíce rozšířených obilovin. Žito může být pěstováno v písčité půdě s nízkou plodností, ve vysokých nadmořských výškách a v chladném podnebí, stejně jako v polosuchých oblastech v blízkosti pouště. Německo, Polsko a Rusko jsou hlavními producenty žita. Žito se používá jako mouka na chléb a hlavní krmivo pro zvířata (Shahidi, Naczk, 2004). Výroba žitného a žitno-pšeničného chleba je tradicí ve střední a východní Evropě, avšak ve světovém měřítku žito zdaleka nedosahuje významu pšenice (Příhoda et al., 2003). Fenolové sloučeniny žita, jako fenolové kyseliny, lignany a alkylresorcinoly, jsou soustředěny do vnější vrstvy zrna. Fenolové kyseliny jsou hlavní fenolové látky celého žitného zrna (103 do 300 mg/100 g zrno), z nichž nejhojnější jsou ferulové kyseliny. Žitné lignany jsou přítomny v koncentraci 2 mg/100 g obilí. Alkylresorcinoly (36 až 320 mg/100 g zrna) by mohly být začleněny do membrán lidských erytrocytů. Proto jsou předmětem zvláštního zájmu vzhledem k jejich potenciálnímu využití jako markery příjmu žita a pšenice (BondiaPons et al., 2009). Je známo, že zrna polských odrůd obsahují 14,6 až 15 mg/kg volných fenolových kyselin, 89,9 až 151,9 mg/kg fenolové kyseliny pocházejících z esterů a 16,9 až 17,4 mg/kg fenolových kyselin pocházejících z rozpustných glykosidů. Ferulová, kávová, p-kumarová a sinapová kyselina jsou převládající fenolové kyseliny v žitném zrnu. Byl zjištěn (Andreasen et al. 2000b) obsah fenolových kyselin v obilkách 17ti odrůd žita pěstovaných na jednom místě v Dánsku v letech 1997 a 1998. Jejich obsah se pohyboval v rozmezí: ferulové kyseliny od 900 do 1170 mg/kg, sinapové kyseliny mezi 70 a 140 mg/kg a p-kumarové kyseliny 70 mg/kg. Celkový obsah dehydrodimerů kyseliny ferulové v zrnu žita se pohybuje od 241 do 409 mg/kg sušiny (Andreasen et al., 2000b). Kromě tradičního využití různých typů žitné mouky, vyrábí se také různé druhy žitných vloček a snídaňové cereálie s obsahem žita až 55 % (Michalska et al., 2007). 3. 2. 2. 3 Ječmen Ječmen se pěstuje v mnoha částech světa pro potravu a krmivo. V USA se používá většinou jako krmivo i jako obilovina pro vaření a výrobu ethanolu. Zrna ječmene také byly zkoumány pro jeho celozrnný potenciál (Ragaee et al., 2006). Pouze malé množství ječmene je používáno ve formě mouky a zrn jako součást potravinářských produktů jako polévek, omáček, příkrmů a speciálních výrobků. Fenoly přítomné v zrnu ječmene jsou tvořeny od 17
tyrosinu, tyraminu a jeho derivátů. Fenolové kyseliny a jejich estery a glykosidy a antokyany jsou odpovědné za modrou a červenou barvu ječmenných lignanů a látek souvisejících s ligninem (Shahidi, Naczk, 2004). Sladovnický ječmen přispívá fenolovými a polyfenolovými sloučeninami v raných fázích procesu vaření piva. Korelační koeficient 0,9 byl zjištěn mezi obsahem fenolových látek v ječmeni a sladu. Při zpracování sladu mohou fenoly polymerovat a zvedat obsah polyfenolů v pivu. Ty poskytují barvu a propůjčují trpkou chuť, slouží jako hnědnoucí substrát a podílí se na srážení špatně srážlivých bílkovin piva. Na druhou stranu, proanthokyanidiny z ječného sladu mají vliv na vývoj zákalu v pivu, protože 80% těchto fenolových látek přítomných v normálním pivu jsou odvozeny ze sladovnického ječmene (Shahidi, Naczk, 2004). Množství volných fenolových látek klesá během pečení, zatímco množství vázaných fenolových látek se zvyšuje (Holtekjolen et al., 2008).
Vliv zpracování Pražený ječmen se používá jako součást denních nápojů v Číně po mnoho staletí. Pražení ječmene 1 min při 327 do 342 °C snižuje obsah katechinů v obilí o více než 65%. 3. 2. 2. 4 Pohanka Pohanka (Fagopyrum esculentum Moench) patří do čeledi Polygonaceae, která zahrnuje rostliny, jako rebarbora a japonské indigo. Pohanka poskytuje menší sklizeň semene v porovnání s ostatními obilovinami. V západní Kanadě, je pohanka považována za významnou alternativní plodinu a je prodávaná do Japonska k výrobě soba nudle. V USA se pohankový endosperm používá k výrobě mouky na palačinky. Některá pohanka se prodává rovněž v podobě krup používaných jako snídaňové cereálie. Výroba krup zahrnuje oloupání semen, které jsou upraveny na vlhkost 22 % a pak se podrobí 10-20ti minutovému záhřevu od 150 do 164 °C. Kroupy mohou být dodatečně pražené při 100 až 150 °C po dobu 1 až 2 hodin. Pohanky a nealergenní quinoa mají nejvyšší obsah polyfenolů a celkový nejvyšší antioxidační potenciál mezi obilovinami a pseudoobilovinami (Gorinstein et al., 2007). Pohanka je považována za dobrý zdroj rutinu. Denní příjem 100 g pohanky přináší asi 10 % terapeutické dávky rutinu (180 až 350 mg/den). Mezi udávané zdravotní účinky rutinu patří protizánětlivé a antikarcinogenní účinky, vazba na estrogenové receptory, uvolnění spasma hladké svaloviny a schopnost snižovat křehkost krevních cév. Dietní příjem rutinu a quercetinu, při nízkém dietním příjmu tuků, může výrazně potlačit neoplazie tlustého střeva (Shahidi, Naczk, 2004). 18
Fenolové kyseliny a flavonoidy Chemie běžných fenolových látek pohanky a výrobků z ní se výrazně liší od ostatních výrobků z obilovin. V pohance je obsah ferulové a hydroxyskořicové kyseliny nízký. Lepkové frakce z otrub pohanky obsahují vázánou syringovou, p-hydroxybenzoovou, vanillovou a p-kumarovou kyselinu. Tyto kyseliny mohou být nepřístupné alkalické nebo kyselé hydrolýze, což ukazuje na možnou přítomnost fenolových kyselin ve formě esterů a glykosidů (Shahidi, Naczk, 2004). Pohanková semena slouží jako bohatý zdroj flavonoidů. Semena a slupky z kanadských odrůd pohanky obsahují v průměru 387 a 1314 mg flavonoidů /100 g. Na druhou stranu, celkový obsah flavonoidů v semeni a slupce z pohanky polské odrůdy jsou 18,8 a 74,4 mg/100 g sušiny. Flavonoly jako rutin, hypertin, quercitrin a quercetin a flavony, jako vitexin, isovitexin, orientin a isoorientin byly identifikovány jako čtyři katechiny. Koncentrace flavonoidů v pohance je ovlivněna několika faktory, včetně polohy, růstovými podmínkami a dalšími faktory. Geografická poloha je hlavním faktorem zodpovědným za celkový obsah flavonoidů a rutinu v semenech, ale vegetační podmínky mají také významný vliv na celkový obsah flavonoidů ve slupce (Shahidi, Naczk, 2004).
Vliv zpracovávání Frakce pohankových otrub obsahují 13,1 až 47,6 mg rutin/100 g, mouka 1,9 až 16,8 mg rutin/100 g a slupky 2,9 mg rutin/100 g. Tepelné zpracování semen před oloupáním ovlivňuje obsah rutinu v krupici. Ve vodě jsou semena po dobu 20 minut při 164 ° C, následuje 50ti minutové ošetření v páře při 150 °C, obsah rutinu se snižuje téměř o 75 % (Shahidi, Naczk, 2004).
3. 2. 2. 5 Kukuřice Produkce kukuřice v Severní Americe tvoří více než polovinu světových zásob. V USA a Kanadě se kukuřice používá především jako doplňková plodina, ale zejména v rozvojových zemích slouží jako plodina potravinářská. Mezi výrobky z kukuřice patří kukuřičná krupice, kukuřičné mouky a další kukuřičné pokrmy. Kukuřičná mouka je složkou snídaňových cereálií i v mnoha suchých směsích jako jsou směsi na palačinky, vdolky a koblihy. 19
Fenolové kyseliny Kukuřičná mouka obsahuje 309,1 mg fenolových kyselin /100 g. Obsahuje také třikrát více fenolových kyselin než obilné mouky získané z rýže, pšenice a ovsa. Fenolové kyseliny z kukuřice jsou volné, esterifikované i v nerozpustných vázaných formách. Tyto nerozpustně vázáné fenolové kyseliny jsou převažujícími frakcemi a představují 69,2 % z celkového množství fenolových kyselin (Shahidi, Naczk, 2004).
3. 2. 2. 6 Proso Proso je menšího významu v západních státech, ale považuje se za základní potraviny v Africe a Asii. V České republice se vyskytuje 1 druh z rodu prosa (Panicum), další 4 druhy jsou jen ojediněle zplaňující či zavlékané. Proso seté (Panicum miliaceum) je pěstovaná obilnina a může se vyskytovat i jako plevel v jiných plodinách, zvláště v teplých oblastech (http://cs.wikipedia.org/wiki/Proso). Jako vzácně a přechodně zplanělé byly nalezeny další druhy, a sice Setaria italica, Pennisetum typhoideum (známá jako „pearl proso“), Eleusine coracana (známý jako „finger proso“), Echinochloa frumentacea. Pearl proso je významným zdrojem bílkovin, obsahuje důležité minerály a je zdrojem energie v mnoha rozvojových zemích. Proto je široce pěstované v Africe a Asii. Celkový obsah polyfenolů v prosu se může pohybovat v rozmezí od 0,5 do cca 0,8 %. Obsah dehydrodimerů ferulové kyseliny v otrubech prosa je až 10 krát vyšší než v rýži, kukuřici, ovsu, žitu a pšeničných otrubách (Shahidi, Naczk, 2004). Proso může být použito na pufované nebo vařené snídaňové cereálie nebo jako náhrada za pšeničnou mouku v některých pekařských výrobcích. Obsahuje od 0,05 % do 0,178 tříslovin ((+)-katechin ekvivalentu). Tmavě zbarvená semena mají nejvyšší obsah tříslovin. Olupovací proces snižuje obsah tříslovin od 65 do 80 %, protože slupky obsahují 15 až 40krát více tříslovin než oloupaná zrna (Shahidi, Naczk, 2004). „Finger proso“ je důležitá potravinová plodina v Indii a Africe. Protokatechová, gallová a kávová kyselina jsou převládajícími volnými fenolovými kyselinami prosa. Vysoký obsah taninů u tmavých semen prosa je spojen s jejich nízkou stravitelností. Olupovací proces odstraňuje 88,1 až 100 % taninu původně přítomného v zrnu, v závislosti na druhu odrůdy (Shahidi, Naczk, 2004).
20
3. 2. 2. 7 Oves Oves je produkován celosvětově a výrazně se liší od ostatních obilovin v tom, že otruby nejsou odděleny od endospermu při mletí. Obilky ovsa jsou používány především jako snídaňové cereálie nebo jako krmivo pro zvířata. Ovesné produkty se rovněž používají v potravinách, jako jsou tyčinky pro děti, jsou součástí chleba a sušenek, stejně jako zahušťovadla do polévek, šťáv a omáček. V posledních publikacích o fenolových látkách v ovsu byla zjištěna přítomnost derivátů kyseliny benzoové a skořicové a také flavony, flavonoly, chalkony, flavanony, anthokyanidiny a amino-fenoly (Shahidi, Naczk, 2004). Ferulová kyselina je hlavní fenolová kyselina přítomná jako rozpustná i nerozpustně vázáná fenolová kyselina v ovsu.
Vliv zpracování Zahřívání ovsa se slupkou (při 100 °C po dobu 10ti minut) významně zvyšuje obsah kyseliny vanillové, vanilinu, p-kumarové kyselin a p-hydroxybenzaldehydu v kroupách. Tento nárůst (25 až 900 %) obsahu fenolových látek při zpracování může být působen jejich uvolněním ze slupek a jejich difuzí do krupice (Shahidi, Naczk, 2004).
3. 2. 2. 8 Rýže Rýže se pěstuje a sklízí ve více než 100 zemích světa, je základní potravinou pro více než polovinu světové populace. Zpracování rýže zahrnuje odstranění slupky pro výrobu hnědé rýže, pak se provádí ještě odstranění otrub a leštění jádra. Rýžová mouka obsahuje 856 mg fenolových kyselin /kg. Jejich obsahem je podobná ovesné a pšeničné mouce. Ferulové kyseliny jsou hlavní fenolové kyseliny přítomné v rýžové mouce. Přibližně 74,2 % z celkových fenolových látek jsou v nerozpustné vázané formě, a proto fenolové kyseliny mají jen malý vliv na barvu nebo chuť rýže. Nicméně, zpracování za mokra, zejména v zásaditém prostředí, a vaření nebo pečení může vést k uvolnění některých vázaných fenolových látek, které zvýší senzorické vlastností výrobku (Shahidi, Naczk, 2004).
3. 2. 2. 9 Čirok Čirok je důležitou obilninou pro lidskou výživu. V některých částech Asie, Afriky a v USA, se používá především jako zdroj krmiv pro zvířata. Z polyfenolových sloučenin obsahuje čirok především flavonoidy, anthokyanidiny, flavanoly a fenolové kyseliny. 21
Jednoduché flavanoly jako monomery, dimery a trimery jsou nalezeny ve vyvíjejících se zrnech čiroku, zatímco vysoce polymerizované flavanoly (třísloviny) jsou nacházeny ve zralých semenech čiroku. Jednoduché flavanoly jsou obecně považovány za prekurzory autooxidativní polymerizace produktů, které mohou utvářet nerozpustné komplexy s proteiny (Shahidi, Naczk, 2004). Nicméně, čirok obsahuje třísloviny volné, případně obsahuje stopové množství hydrolyzovatelných tříslovin. Třísloviny čiroku snadno reagují s proteiny čiroku. Asi 68 % z celkového množství tříslovin se získá z albuminové, globulinové, prolaminové a glutelinové frakce. Avšak stále není známo, zda tyto typy tanin-proteinových komplexů existují in situ nebo jsou tvořeny pouze během procesu extrakce.
3. 2. 3 Absorpce a metabolismus Informace o biologické dostupnosti a vstřebávání fenolových látek potravou jsou velmi rozdílné, fragmentární a kontroverzní.
Obrázek 2: Absorpce a metabolismus polyfenolů v potravě polyfenoly v potravě
tkáň žluč
tenké střevo
játra
tlusté střevo
ledviny
stolice
moč
Obrázek 2 ukazuje možné cesty metabolismu polyfenolů po požití. Enzymy fenolsulfotransferasy
katechol-O-transferasy,
β-glukosidasy,
laktázy-phloridzinoxidasy
a UDP-glukuronosyltransferasy jsou zapojeny do polyfenolového metabolismu. Absorpce a biologická dostupnost polyfenolů v těle závisí na jejich metabolismu v tenkém střevě. Původně se předpokládalo, že polyfenoly nemohou být resorbovány z trávícího traktu člověka ve formě relativně polárních glykosidů nebo esterů. Míra jejich resorpce byla považována za nízkou a závislou na schopnosti střevní mikroflóry uvolnit nepolární aglykony, což je nutně spojeno s jejich rozsáhlou mikrobiální degradací (Slanina, Táborská, 2004). Pouze polyfenoly, které nejsou vstřebány v žaludku a tenkém střevě, jsou degradovány střevní mikroflórou. Glykosylové polyfenoly mohou být absorbovány jako takové nebo po hydrolýze 22
střevními enzymy (Shahidi, Naczk, 2004). Metabolismus polyfenolů je ovlivněn faktory jako je molekulární velikost, lipofilní rozpustnost a pKa, stejně jako žaludeční a střevní doba pasáže, membránová permeabilita a střevní pH. Celozrnné produkty jsou bohatými zdroji fermentovatelných sacharidů zahrnujících dietní vlákninu, nerozpustné škroby a oligosacharidy. Nestravitelné sacharidy putují do tlustého střeva, kde jsou fermentovány pomocí střevní mikroflóry na krátkořetězcové mastné kyseliny a plyny. Jednoduché mastných kyselin zahrnují acetát, butyrát a propionát, který je s butyrátem preferovaným energetickým zdrojem pro buňky tlustého střeva. Jednoduché mastné kyseliny jsou spojovány se schopností snižovat hladinu sérového cholesterolu a snižovat riziko vzniku rakoviny. Nestravitelné sacharidy zvyšují vlhkost stolice, hmotnost tráveniny a rychlost střevní pasáže (Slavin, 2004).
Interakce s proteiny Reakcí fenolů a jejich enzymatických a neenzymatických oxidačních produktů s proteiny v zrnu, jídle nebo moukách vede ke snížení výživné hodnoty příslušných proteinů. Oxidované fenoly mohou reagovat s aminokyselinami a proteiny a potlačují aktivitu enzymů, jako je trypsin a lipáza. Schopnost polyfenolů tvořit nerozpustné komplexy s proteiny interferuje s využitím dietní bílkoviny (Shahidi, Naczk, 2004).
3. 3 Antioxidační vlastnosti fenolů v potravinách Antioxidanty výrazně oddalují či brání oxidaci substrátu, jsou-li přítomny v potravinách nebo v těle v nízkých koncentracích ve srovnání s oxidovatelným substrátem. Do potravinářských výrobků se používají a převážně přírodní fenolové antioxidanty, aby se zabránilo zhoršení kvality výrobků a pomohly udržet jejich výživovou hodnotu. Antioxidanty mají také příznivý vliv na zdraví, protože pomáhají tělu bránit se proti poškození reaktivními formami kyslíku (ROS), stejně jako reaktivními formami dusíku (RNS) a reaktivními druhy chlóru (RCS), což je spojeno se vznikem degenerativních chorob (Shahidi, Naczk, 2004). Přírodní antioxidanty potravin patří mezi fenolové a polyfenolové látky. Mechanismus, podle kterého tyto antioxidanty účinkují, se může lišit v závislosti na složení potravin, včetně minoritní složky. Konzumace potravin rostlinného původu a v nich přítomných fenolových látek je spojováno se snížením rizika kardiovaskulárních chorob, rakoviny a šedého zákalu, 23
i řady dalších degenerativních onemocnění. Toho je dosaženo tím, že brání oxidaci lipidů a bílkovin a mutacím DNA, v pozdějších fázích i poškození tkáně (Shahidi, Naczk, 2004). Přestože fenolové sloučeniny a některé jejich deriváty jsou velmi efektivní při prevenci autooxidace, je v současnosti pouze několik fenolových sloučenin povoleno jako potravinové antioxidanty. Hlavními důvody pro omezenou použitelnost těchto antioxidantů je jejich reaktivita a potenciální toxicita nebo karcinogenita. Schválené fenolové antioxidanty byly podrobně zkoumány, ale toxikologie jejich degradačních produktů stále není jasná (Shahidi, Naczk, 2004). Proces autooxidace polynenasycených tuků v potravinách zahrnuje řetězovou reakci volných radikálů, která je zpravidla zahájena expozicí lipidů světlu, vyšší teplotě, ionizujícímu záření, kovovým iontům nebo katalytickému působení metaloproteinasy. Enzym lipoxygenasa může také zahájit oxidaci. Klasická cesta autooxidace zahrnuje iniciaci (tvorba volných tukových radikálů), propagaci a terminaci
Reaktivní formy kyslíku způsobují nemoci jako: artritida, ateroskleróza, rakovina, diabetes, infekce (malárie, AIDS), zánět, ischemie (mozek, srdce), Parkinsonova choroba, radioaktivní poškození, stárnutí. Flavonoidy jsou nejsilnější antioxidační sloučeniny rostlinných fenolů. Je však potřeba dalšího zkoumání možnosti jejich použití v potravinách a určení jejich potenciální toxikologické důsledky jejich použití při komerční výrobě potravin (Shahidi, Naczk, 2004).
Prevence autooxidace a používání antioxidantů Balení potravin ve vakuu (neboli sous vide) nebo v inertním plynu (tj., modifikovaná atmosféra balení) slouží k vyloučení kyslíku, a stejně jako chlazení nebo zmrazení, může snížit stupeň autooxidace. Nicméně, tyto prostředky nejsou vždy praktické, protože jen velmi 24
málo kyslíku je zapotřebí k zahájení a udržení oxidačního procesu. Není to ani ekonomické a ani vhodné odstranit stopy kyslíku z potravin, proto je docela běžné kombinovat tyto metody s využitím antioxidantů. Hlavní důvod pro použití antioxidantů je prodloužení trvanlivosti potravin a snížení množství odpadu a nutričních ztrát tím, že zabrání a oddálí oxidaci. Podle USDA Code of Federal Regulations, "antioxidanty jsou látky používané k uchovávání potravin zpomalením jejich kažení žluknutím nebo inhibice změny barvy v důsledku oxidace". Ideální antioxidant v potravinách by měl být bezpečný, neovlivnit barvu, vůni či chuť, být účinný při nízkých koncentracích, být snadno zpracovatelný do potraviny, být stabilní při zpracování i v konečném produktu, a také být dostupný za nízkou cenu (Shahidi, Naczk, 2004).
Odhad antioxidační aktivity Činnost antioxidantů lze odhadnout na základě kvantitativního určení primárních nebo sekundárních produktů autooxidace lipidů nebo sledováním ostatních změn V těle mohou být volné radikály přispívat ke vzniku řady nemocí, poškození tkání a onemocnění orgánů, jako jsou plíce, srdce, kardiovaskulární systému, ledviny, játra, oči, svaly a mozek, a rovněž urychlují proces stárnutí. Oxidanty a radikály jsou u zdravých jedinců obecně zneškodňovány antioxidačními enzymy. Nicméně, s věkem a jednotlivců s určitými chorobami, mohou endogenní antioxidanty být nedostatečné a vyžadovat pomoc exogenních antioxidantů přijatých potravou, v zájmu zachování integrity buněčných membrán (Shahidi, Naczk, 2004). 3. 3. 1 Přírodní antioxidanty Přírodní sloučeniny s antioxidačním účinkem (tzv. přírodní antioxidanty) jsou velmi početnou a z chemického hlediska velmi rozmanitou skupinou sloučenin. Každá z těchto skupin antioxidantů má své výhody i nevýhody. Z potravinářského hlediska se většinou dává přednost syntetickým antioxidantům z ekonomických důvodů (nižší výrobní náklady, vyšší účinnost, standardní vlastnosti). V poslední době jsou však u některých syntetických antioxidantů běžně používaných v potravinářských technologiích zjišťovány při dlouhodobém podávání pokusným zvířatům i negativní vlivy na jejich zdraví, takže by mohly mít i negativní vliv na lidské zdraví při jejich častějším příjmu. Proto jsou hledány nové syntetické i přírodní sloučeniny s antioxidačním účinkem (Velíšek, 2002). 25
Antioxidanty v potravinách mohou pocházet ze sloučenin, které se vyskytují přirozeně v potravinách nebo z látek, které vznikají v průběhu jich zpracování. Přírodní antioxidanty jsou především rostlinné fenolové a polyfenolové látky, které se mohou vyskytovat ve všech částech rostliny. Předpokládá se, že na protektivním účinku se podílí schopnost rostlinných polyfenolů zhášet reaktivní kyslíkové radikály a omezovat jejich tvorbu chelatací iontů přechodných kovů, především kationtů železa, které jsou schopny generovat vysoce reaktivní hydroxylové radikály (Shahidi, Naczk, 2004; Slanina, Táborská, 2004). Mezi příklady běžných rostlinných fenolových antioxidantů patří flavonoidové sloučeniny, skořicové kyselin, kumariny, tokoferoly a polyfunkční organické kyseliny. Několik studií bylo provedeno s cílem určit přírodní fenoly, které mají antioxidační aktivitu. Některé přírodní antioxidanty již byly extrahovány z rostlinných zdrojů a jsou vyráběny komerčně.
3. 4 Příjem fenolových látek v potravě a vliv na lidské zdraví Celozrnné produkty jsou bohaté na nutriční látky a fytochemikálie, které jsou známé svými blahodárnými účinky. Mají vysoké koncentrace dietní vlákniny, nerozpustných škrobů a oligosacharidů, také jsou bohaté na antioxidanty zahrnující stopy minerálních a fenolových látek, které byly označeny jako zdraví prospěšné (Slavin, 2004). Látky v celozrnných produktech spojené s příznivým vlivem na lidské zdraví, zahrnují lignany, tokotrienoly, fenolové látky a další nutriety jako fytová kyselina, třísloviny a inhibitory enzymů. Proces čištění zrna a odstranění obalových vrstev přináší ztrátu dietní vlákniny, vitaminů, minerálů, lignanů, fytoestrogenů, fenolových látek a fytové kyseliny (Slavin, 2004). Příznivý vliv rostlinných polyfenolů na zdraví člověka, prokázaný jak klinickými studiemi, tak pokusy na zvířatech a buněčných kulturách, podnítil zájem o studium biologické dostupnosti těchto látek. Bylo studováno mnoho účinků různých polyfenolových složek v potravinách (včetně resveratrolu, katechinu, atd.) na chronická onemocnění člověka jako je rakovina či zánětlivá onemocnění. Možný molekulární mechanismus jejich protizánětlivých působení nasvědčuje, že inhibující enzymy související se záněty (např. cyklooxygenasa, lipooxygenasa) (Yoon, Baek, 2005). Polyfenoly chrání lipoproteiny o nízké hustotě (LDL) před oxidační modifikací, která je považována za jeden z klíčových dějů při rozvoji aterosklerózy (Slanina, Táborská, 2004). Mohou také působit proti vzniku krevních sraženin a tím snižovat riziko infarktu myokardu nebo mozkové mrtvice. 26
Málo je však známo o tom, zda a v jakém množství jsou rostlinné polyfenoly resorbovány z trávícího traktu člověka, jaké je rozpětí koncentrací v krevní plazmě, jak jsou metabolizovány a vylučovány z organismu. Rovněž znalosti o obsahu fenolových sloučenin v potravinách nejsou zdaleka kompletní. Mnoho konzumentů si neuvědomuje zdravotní prospěšnost konzumace celozrnných produktů a v rozporu s doporučeními nezvyšují jejich příjem. Také je spousta zmatků, které produkty jsou opravdu celozrnné (Slavin, 2004). Z hlediska zdraví je však mnohem důležitější pravidelný denní příjem antioxidantů, i když méně účinných, než občasný krátkodobý příjem komerčních rostlinných extraktů antioxidantů, často jen s předpokládaným vysokým účinkem. Ty mohou být vhodné pro léčbu zdravotních potíží, obvykle vzniklých dlouhodobým nezdravým způsobem života (špatná nebo nadměrná strava, kouření, nadměrný konzum alkoholu, nedostatečná nebo naopak nadměrná fyzická aktivita, znečištěné životní nebo pracovní prostředí apod.), což je často provázeno zvýšenou tvorbou kyslíkových radikálů v organismu (Hernández-Borges, 2005). Příjem fenolových látek je do značné míry ovlivněn stravovacími návyky a preferencí jednotlivce. Průměrný denní příjem v potravě polyfenolů je asi 1 g na osobu (Slanina, Táborská, 2004), hlavními zdroji jsou nápoje, ovoce a v menší míře zelenina a luštěniny. Kromě toho takové faktory jako strukturální rozmanitost fenolových látek, nedostatek standardizovaných a spolehlivých metod pro kvantifikaci jednotlivých tříd fenolových látek, změny v obsahu fenolových látek v každém jídle, nerovnoměrná distribuce fenolových látek v rostlinných potravinách a zpracování potravin, jsou pro přesné posouzení příjmu fenolů potravinou těžkopádné a obtížné. Přesnější údaje o příjmu fenolových látek lze získat provedením komplexního měření obsahu fenolových látek v široké řadě potravin (Shahidi, Naczk, 2004) Zdravotní přínos celozrnných produktů byl zčásti připsán jejich obsahu fytochemických látek. Zdraví prospěšné fytochemikálie celozrnných produktů jsou jedinečně distribuovány jako volné, rozpustné-konjugované a vázané formy. Většina z nich jsou fytochemikálie v nerozpustné formě, vázané na materiály buněčné stěny. Buněčné stěny jsou materiály těžko stravitelné, mohou odolávat trávení v horní části gastrointestinálního traktu a nakonec se dostávají do tlustého střeva. Trávení těchto materiálů v tlustém střevě pomocí mikroflóry může uvolnit část vázaných fytochemikálií a tím umožnit jejich příznivý zdravotní účinek. Například, gastrointestinální esterázy (ze střevní sliznice a mikroflóry), mohou uvolnit ferulové kyseliny a diferulové kyselin z obilných otrub. Tyto sloučeniny mají silný antioxidační účinek a bylo prokázáno jejich vstřebávání do krevní plazmy. To může částečně 27
vysvětlit snížené riziko rakoviny tlustého střeva při zvýšené konzumaci celozrnných výrobků., Fytochemikálie v ovoci a zelenině jsou především ve volných nebo rozpustných (glykosidy) formách a mohou být snadno tráveny v horní části gastrointestinálního traktu (Liu, 2007; Vinson et al., 1998; Vinson et al., 2001). Koncentrace polyfenolů v tlustém střevě vzhledem k jejich omezené resorpci v tenkém střevě a resorpci vody v tlustém střevě může dosáhnout vysokých hodnot, řádově v mmol.l-1 a může působit preventivně proti vzniku kolorektálního karcinomu (Slanina, Táborská, 2004).
Vláknina, inulin, a rezistentní škrob Vláknina byla identifikována jako důležitá součást zdravé výživy. Celozrnné produkty jsou dobrým zdrojem vlákniny. Vláknina je definována jako součást rostlinných buněk, které v lidském traktu odolávají trávicím enzymům. U celozrnných produktů k vláknině patří celulóza, hemicelulóza, lignin, inulin, rezistentní škrob a další složky distribuované ve slupce a v části škrobového endospermu obilí. Ve studii z USA se u žen s vysokým příjmem obilovin ukázalo o 34 % nižší riziko vzniku koronárních příhod srdečních onemocnění ve srovnání s ženami s nízkým příjmem vlákniny z obilovin. Vláknina z ovoce a zeleniny neprojevovala stejný účinek v této studii. Vláknina může mít tyto účinky prostřednictvím několika fyziologických mechanismů, které zahrnuje zvýšené vylučování cholesterolu ve stolici, vazba žlučových kyselin, modulace hormonální aktivity, stimulace imunitního systému, což usnadňuje látkovou výměnu toxinů přes trávicí trakt a např. tvorbu krátkořetězcových mastných kyselin v tlustém střevě. Inulin a rezistentní škrob jsou nejvíce studované dietní vlákniny celozrnných produktů (Liu, 2007).
Je zapotřebí dalších studií u lidí k získání jasných důkazů o jejich účinku při ochraně zdraví a ke zhodnocení rizika, které mohou vyplývat z příliš vysoké spotřeby polyfenolů (Gorinstein et al., 2008).
3. 4. 1 Farmakologické účinky Antimikrobiální aktivita Mnoho konzervantů se přidává do potravin jako antioxidanty nebo mikrobiální prostředky. Fenolové sloučeniny jsou známé, že mají obě tyto vlastnosti, ale lipofilní povaha fenolů může snižovat jejich antimikrobiální aktivitu. 28
Antimikrobiální účinek fenolových sloučenin byl nejprve spojován s inaktivací buněčných enzymů, která souvisí s rychlosti pronikání látek do buňky. Fenoly způsobují změny membránové permeability (Shahidi, Naczk, 2004).
Antivirové vlastnosti Řada flavonoidů přítomných v potravinách rostlinného původu má antivirovou aktivitu. Quercetin, taxifolin a flavonoidy z červeného vína, jsou schopny inaktivovat celou řadu virů a brání jejich infekci. Třísloviny jahod jsou schopny zlepšovat obrnu a inhibovat střevní a herpes viry. Quercetin, flavonol aglykon se vyskytují v řadě druhů ovoce, jako jsou jablka, meruňky, fíky, švestky, jahody a rajčata, vykazují protivirové aktivity proti herpes simplex virus typu 1, parainfluenza virus typu 3 a polioviru typu 1 v in vivo a in vitro studiích. Čajové polyfenoly jsou schopny inhibovat chřipkovou infekci typu A a B tím, že zabrání uchycení viru na buňky, zatímco hesperetin inhibuje infekčnost virů herpes simplex typu, virům dětské obrny a parainfluenzy (Shahidi, Naczk, 2004).
29
4 MATERIÁL A METODIKA Metody pro stanovování celkového obsahu fenolových látek a určení jejich antioxidační funkce jsou většinou založeny na oxidačně redukčních vlastnostech, tj. schopnosti fenolových látek poskytovat hydrogenový radikál nebo elektron. Folin-Ciocalteuova metoda (FCM) je běžně používána pro stanovení celkového množství fenolových látek v rostlinných extraktech. Obsah fenolových látek je vyjádřena jako ekvivalent kyseliny gallové nebo katechinu (Shahidi, Naczk, 2004). Nicméně jsou zde i další metody pro stanovování fenolových látek, jmenovitě metoda s kyanoželezitanem podle Price and Butler (PBM) a metody využívající 4-aminoantipirin (AAPM), které při kalibraci na gallovou kyselinu dávají u vzorků nižší hodnoty, což je způsobeno jejich vysokou reaktivitou s gallovou (Stratil aj., 2006). Pro stanovení antioxidačních účinků je používáno více než dvacet metod, z nichž mnohé používají stejný chemický princip a liší se v některých detailech provedení. Antioxidační aktivita látek v potravinách a biologických systémech závisí na testovacím systému (metodě) a substrátu, který má být antioxidantem chráněn. Závisí tedy na mnoha faktorech, včetně dispersních vlastnostech substrátů, na podmínkách prostředí a stavu oxidace a lokalizaci antioxidantu v různých fázích. Používané metody je možné rozdělit do dvou základních skupin, a to na testy s lipofilními substráty a testy s hydrofilními substrát. Význam měřených hodnot a vzájemných srovnání výsledků získaných individuálními metodami je stále nevyřešený problém. Metody založené na podobných redoxních reakcích, např. antioxidační kapacita v ekvivalentu Troloxu (TEAC), schopnost redukce železitých iontů antioxidantem (ferric reducing antioxidant power, FRAP) a metoda s 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylovým radikálem (DPPH) mohou při použití pro měření antioxidační aktivity vzorků korelovat poměrně dobře (Stratil aj., 2007).
4.1 Chemikálie a reagenty Methanol, chlorovodíková kyselina, uhličitan sodný, gallová kyselina (stupně čistoty p.a.), hydrogenfosforečnan sodný dodekahydrát (Na2HPO4 .12 H2O), dihydrogenfosforečnan sodný monohydrát (NaH2PO4 . H2O), persulfát/thiosíran draselný (K2S2O4).
30
Trolox (purum, ≥ 99 %, HPLC, Fluka), Folin-Ciocalteu reagent (FC reagent, Fluka), 2,2´-azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonát) diamonná sůl (ABTS, ≈ 98,0 %, Sigma), deionizovaná voda.
4.2 Přístroje • Analytické váhy (přesnost 0,1 mg), Precisa 240A • Laboratorní ultramixer • Spektrofotometr HEλIOS β, Spectronic Unicam • Zařízení na deionizovanou vodu, MILLI-Q-RG, ZFMQ 050 RG, Millipore, USA • Centrifuga MLW T 23
4.3 Software • Software VISION 32, Chromspec • Excel 2007 (Microsoft)
4.4 Analyzované vzorky Analýza byla provedena celkem u 42 vzorků, z toho 6 druhů chleba, 19 druhů různých druhů ostatního pečiva. Dále byly analyzovány dvě nejvýznamnější obiloviny pro pekařské účely v ČR, a to pšenice a žito a jejich vymleté mouky a otruby. Vzorky byly zakoupeny v Pekařství Růžička a Delta pekárně ve Znojmě, dále pak v obchodní síti supermarketů Kaufland a Billa v Brně. Ke vzorkům z Pekařství Růžička byly dodány i příslušné mouky. Zrniny a k nim dané mouky byly obdrženy z mlýnů Litoměřice, Havlíčkův Brod, Kojetín a Pekárenský mlýn.
31
Tabulka 1. Analyzované vzorky Poř. číslo 1 2 3 4 6 5 7 19 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
Obchodní název vzorku rohlík 43 g chléb maďarský 750 g dalamánek 60 g kornspitz 60 g rustal 60 g rohlík 43 g chléb šumavský 1200 g cerea - čtyřzrnný chléb krájený (pšenično-žitné pečivo, vícezrnný) 250 g kaiserka natural (běžné pšeničné pečivo) 60 g kaiserka se sezamem (běžné pšeničné pečivo) 60 g kaiserka zrníčková (vícezrnné pečivo) 60 g fitness bulka (vícezrnné pečivo) 72 g trojhran arašídový (vícezrnné pečivo, jemné) 90 g dýňová bagetka (vícezrnné pečivo) 90 g bagetka (běžné pšeničné pečivo) 80 g kornspitz (běžné pšenično-žitné pečivo) 55 g bageta tmavá (běžné pšeničné pečivo) 315 g slunečnicový chléb (vícezrnné pečivo) 480 g kovářův chléb (žitno-pšeničné pečivo, speciální) 475 g fit den (celozrnný chléb, žitný) krájený 250 g bio bageta (běžné pečivo) 100 g bio croissant (jemné pečivo) 50 g kaiserka pohanková 63 g bageta grahamová (běžné pšeničné pečivo) 88 g bageta (pšenično-žitné pečivo celozrnné) 35 g mouka hladká (speciálka) → rohlík mouka chlebová → chléb maďarský mouka žitná → dalamánek mouka směsná s přídavkem hladké mouky speciál → kornspitz pšenice pšeničná mouka chlebová pšenice pšeničná mouka světlá pšeničná mouka chlebová pšeničné otruby žito žitná mouka žito žitná mouka T930 žito
41
žitná mouka
42
žitné otruby
Zdroj
Pekařství Růžička
Delta pekárny
Kaufland
Penam
Billa
Pekařství Růžička
Litoměřice
Havlíčkův Brod
Kojetín Pekárenský mlýn
Havlíčkův Brod
32
4.4.1 Příprava vzorků Čerstvé vzorky chleba a dalšího pečiva byly k dalšímu zpracování vysušeny v sušárně při teplotě 70 °C po dobu 20ti hodin. Zrniny a produkty z nich byly použity v nativním stavu bez dalšího snižování obsahu vody, která podle literatury činí u skladovaných obilovin 12 až 13% (včetně vody fyziologicky vázané), tzn., že vlastní absolutní sušina činí 87 až 88 % nativní hmotnosti. Vzorky byly rozmixovány laboratorním ultramixerem na jemný prášek, který byl přesátý přes silonové sítko s průměrem ok do 0,5 mm.
4.4.2 Extrakce volných a celkových fenolových látek z rostlinných materiálů Pro extrakci fenolových látek bylo odváženo 500 mg ± 0,1 % každého prášku vzorku do speciálních polykarbonátových lahviček uzavíratelných vzduchotěsně šroubovacím víčkem. Do každé lahvičky bylo přidáno 10 ml směsi 50 % methanolu s přídavkem HCl (o výsledné koncentraci 1,2 mol.l-1). Několik studií ukázalo, že 50-80% methanol je efektivní rozpouštědlo při získávání fenolů a dalších polárních látek v obilovinách (Ragaee et al., 2006). Při této koncentraci HCl dochází k hydrolýze etherových (glykosidických) vazeb fenolových látek vázaných na sacharidy. Lahvičky byly dobře uzavřeny šroubovacím víčkem a inkubovány při teplotě kolem 81 °C (teplota varu použitých extrakčních roztoků) po dobu 2,5 hodin. Lahvičky se suspenzí vzorku byly zváženy před a po inkubaci po vychladnutí s přesností na 1 mg pro ověření zda nedošlo ke ztrátě roztoku během inkubace. Do vychladlých lahviček bylo přidáno 10 ml metanolu a následně protřepáno a ponecháno 15 minut stát. Vzorky byly centrifugovány po dobu 13 minut při 6 tis. otáčkách. Supernatanty byly slity do skleněných lahviček se šroubovacím víčkem. Extrakt je možné uchovávat při 4 °C do analýzy (je-li brzy provedena) nebo při –20 °C s dusíkovou atmosférou při delší době uchovávání (i několik týdnů). Pro měření byly vzorky neutralizovány přidáním pevného NaOH.
4.5 Stanovení fenolových látek Stanovení celkového obsahu fenolových sloučenin jako sumy stanovených obsahů individuálních fenolových sloučenin je velmi složitý a nákladný analytický problém. Proto se pro stanovení sumy fenolových látek používá standardně nejčastěji Folin-Ciocalteuova metoda (FCM), která stanovuje fenolové látky na principu jejich redukční schopnosti. 33
Metoda s Folin-Ciocaleteu reagentem (FCM) Metoda je založena na oxidačně-redukční reakci, při níž se v alkalickém prostředí oxidují fenolové sloučeniny (ale také oxidovatelné formy jiných sloučenin) a současně se redukuje fosfowolframový-fosfomolybdenový komplex za vzniku modrého zbarvení. Stanovení dobře koreluje s redoxními a antioxidačními vlastnostmi fenolových sloučenin.
Pracovní postup: Postup podle Singletona a Vinsona byl použit v modifikované formě na reakční objem 1 ml. Do plastikové zkumavky bylo napipetováno 500 µl FC reagentu/činidla a 100 µl extraktu vzorku a roztok promíchán. Přibližně za 10 min bylo přidáno 400 µl 7,5 % Na2CO3 (výsledné pH ≅ 10). Reakcí činidla s oxidovatelnými fenolovými látkami vzniká modré zbarvení stálé několik hodin a je malý nebo žádný vliv zbarvení vzorků. Za 30 minut stání při laboratorní teplotě byla měřena absorbance při 760 nm (možné v rozmezí 730760 nm) v objemu 1 ml roztoku na kyvetu. Blank obsahoval reakční roztok a místo vzorku 100 µl vody. Jeho absorbance je téměř stejná jako vody (Singleton et. al, 1999; Vinson et. al, 1998; Vinson et. al, 2001b). Použitý standard: 2 mmol.l-1 gallová. Obsah fenolových látek (volných nebo celkových) bývá v publikacích vyjádřen v µmol nebo mg ekvivalentu standardu na gram suché hmoty vzorku (Vnuková, 2008).
4.6 Stanovení antioxidační aktivity vzorků Pro určení antioxidační aktivity extraktů byla použita metoda TEAC, které je založena na oxidačně-redukční reakci a to schopnosti antioxidantu poskytovat vodíkový radikál H•: R• +Aox-H → RH + Aox•
(Aox = antioxidant)
Metoda TEAC Metoda TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) bývá také označována jako TAA metoda (Total Antioxidant Activity). TEAC metoda je jednou z nejčastěji používaných metod k určení množství radikálů, které mohou být zneškodněny nějakým antioxidantem, tj. celkové antioxidační
kapacity.
jednoelektronovou
Je oxidací
založena
na
neutralizaci
syntetického
azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonátu) na radikál: ABTS – e– → ABTS•+
34
radikálkationtu
chromoforu
ABTS,
vzniklého 2,2´-
Vzniklý radikál má silnou absorbanci v rozsahu 700-750 nm a může být snadno stanoven spektrofotometricky. V nepřítomnosti donorů vodíku je radikál poměrně stálý. S donory vodíkového atomu reaguje rychle na nebarevný ABTS.
Pracovní postup: Podle Re (Re et al, 1999) a Longa (Long, Halliwell, 2001) byl modifikován na celkový reakční objem 1 ml. Příprava pracovního roztoku: ABTS byl rozpuštěn ve vodě na finální koncentraci 7 mmol.l-1 a roztok smíchán s roztokem persulfátu draselného na finální koncentraci 2,45 mmol.1-1. Směs byla ponechána stát při pokojové teplotě přes noc ve tmě. ABTS je oxidován na barevný radikálkationt ABTS•+, který má absorpční maxima při 417, 645, 734 a 815 nm. Roztok tohoto radikálu byl naředěn na absorbanci 1,000 až 1,500 při 734 nm pomocí PBS (Phosphate Buffered Saline, stabilizační roztok). Vlastní stanovení: Do zkumavky bylo napipetováno 975 µl pracovního roztoku radikálkationtu ABTS•+ a přidáno 25 µl vzorku, promícháno a po 30 minutách měřena absorbance při 734 nm. Jako kontrola byl použít 1 ml PBS (místo roztoku ABTS•+.). Některé vzorky se silnou antioxidační aktivitou bylo potřeba naředit 2-4krát. Různé fenolové látky mohou reagovat různou rychlostí a reakce se vzorkem rostlinného extraktu má parabolický průběh s tím, že většina reakce proběhne za 3 až 6 minut. Absorbance má však i dále stále mírně klesající tendenci v důsledku spontánního rozpadu radikálkationtu ABTS. Nevýhodou metody je tedy její určitá nestabilita a stálý pomalý rozklad radikálu. Pro analýzu většího počtu vzorků byla podle křivky průběhu reakce zvolena konstantní doba inkubace reakční směsi tak, aby proběhla většina reakce. Antioxidační kapacita se vyjadřuje ekvivalentem ke standardu tj. v mmol.l-1 Troloxu tj. Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC). Protože reakce probíhá v pufrovaném prostředí a s malým objemem vzorku, není závislá na pH vzorku (Vnuková, 2008). Pokles absorbance spontánním rozpadem radikálkationtu byl eliminován korekcí při výpočtu.
35
5 VÝSLEDKY A DISKUSE
Měření bylo provedeno u 42 vzorků (chleba a dalšího pečiva, zrnin a mouk). Ke stanovení obsahu fenolových látek v extraktech byla použita spektrofotometrická metoda FCM a pro stanovení antioxidační aktivity v extraktech spektrofotometrická metoda TEAC. Stanovení bylo u každého vzorku provedeno třikrát. Průměrné hodnoty měření každého vzorku jsou zaznamenány v tabulce č. 2 a 3. Pro větší přehlednost jsou výsledky v µmol/g MH (mokré hmoty) znázorněny v grafech 1-7.
36
Tabulka 2. Hodnoty obsahu fenolových látek a antioxidační aktivity u různých druhů chleba a pečiva. Obsah fenolových látek (EG) FCM µmol/g MH
aktivita (ET) TEAC
µmol/g SH
průměr odchylka mg/g EG
Antioxidační
µmol/g MH
průměr
průměr
odchylka
1
rohlík 1
20,08
0,22
3,42
16,55
65,96
1,59
2
chléb maďarský
25,64
0,50
4,36
17,60
74,30
0,40
3
dalamánek
25,70
0,50
4,37
20,50
71,91
0,17
4
kornspitz 1
25,94
0,07
4,41
20,77
74,21
1,19
5
rohlík 2
20,96
0,18
3,57
16,82
69,87
0,34
6
rustal
28,83
0,45
4,90
22,92
77,96
1,76
7
chléb šumavský
29,30
0,50
4,98
18,72
77,11
0,17
8
kaiserka natural
22,88
0,37
3,89
16,16
70,89
0,17
9
kaiserka se sezamem
22,54
0,25
3,83
16,90
71,32
1,42
10
kaiserka zrníčková
26,35
0,41
4,48
19,62
75,32
0,62
11
fitness bulka
31,97
0,70
5,44
21,85
64,26
0,30
12
trojhran arašídový
35,85
0,42
6,10
25,54
89,28
0,45
13
dýňová bagetka
27,17
0,63
4,62
19,74
80,99
0,42
14
bagetka
21,29
0,47
3,62
15,83
74,61
0,49
15
kornspitz 2
31,74
0,57
5,40
25,92
82,61
0,25
16
bageta tmavá
28,15
0,58
4,79
20,86
80,23
0,55
17
slunečnicový chléb
33,01
0,42
5,61
20,15
81,59
0,25
18
kovářův chléb
43,68
0,70
7,43
29,05
128,45
0,53
19
cerea - čtyřzrnný chléb
38,18
0,58
6,49
26,91
127,09
1,21
20
fit den (celozrnný žitný)
44,79
0,56
7,62
29,59
126,13
1,02
21
bio bageta
26,49
0,48
4,51
19,56
74,81
0,62
22
bio croissant
23,74
0,30
4,04
18,57
72,14
0,25
23
kaiserka pohanková
33,27
0,65
5,66
26,42
82,81
0,34
24
bageta grahamová
24,94
0,49
4,24
18,16
76,11
0,15
25
bageta (pšenično-žitná)
28,09
0,43
4,78
22,30
76,26
0,23
EG = ekvivalent gallové kyseliny, ET = ekvivalent Troloxu 37
Tabulka 3. Hodnoty obsahu fenolových látek a antioxidační aktivity u zrnin a mouk.
Obsah fenolových látek (EG)
Antioxidační aktivita (ET)
FCM
TEAC
µmol/g MH
µmol/g MH
průměr odchylka mg/g EG průměr
odchylka
26
mouka hladká pro rohlík
19,37
0,19
3,30
66,92
0,53
27
mouka pro ch. maďarský
25,42
0,15
4,32
73,39
0,26
28
mouka žitná pro dalamánek
27,63
0,43
4,70
69,79
0,28
29
mouka směsná pro kornspitz
47,02
0,67
8,00
139,01
0,95
30
pšenice (Lit)
23,74
0,46
4,04
70,7
0,49
31
pšeničná mouka chleb. (Lit)
24,94
0,42
4,24
73,22
0,13
32
pšenice (H. B.)
31,07
0,20
5,29
76,68
0,28
33
pšeničná mouka světlá (H. B.)
21,29
0,19
3,62
72,06
0,15
34
pšeničná mouka chleb (H. B.)
25,17
0,37
4,28
73,45
0,17
35
pšeničné otruby (H. B)
69,04
1,12
11,74
219,35
1,66
36
žito (Kojetín)
35,64
0,06
6,06
77,05
0,47
37
žitná mouka (Kojetín)
26,13
0,26
4,44
69,93
0,15
38
žito (Pekárenský mlýn)
39,22
0,78
6,67
118,41
0,19
39
žitná mouka T930 (Pek. mlýn)
25,59
0,82
4,35
69,92
0,45
40
žito (H. B.)
34,92
0,46
5,94
110,07
0,61
41
žitná mouka (H. B.)
30,22
0,51
5,14
73,67
0,38
42
žitné otruby (H. B.)
70,66
1,12
12,02
238,3
2,72
EG = ekvivalent gallové kyseliny, ET = ekvivalent Troloxu
38
50,00 45,00 40,00
Koncentrace µmol/g MH
35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00
Graf 1. Hodnoty obsahu fenolových látek v pečivu stanovený FCM v µmol/g MH (X +/- SD, n=2)
39
140,00
Koncentrace µmol/g MH
120,00
100,00
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
Graf 2. Hodnoty obsahu antioxidačních látek v pečivu stanovený TEAC metodou v µmol/g MH (X +/- SD, n=2)
40
90,00
80,00
70,00
Koncentrace µmol/g MH
60,00
50,00
40,00
30,00
FCM TEAC
20,00
10,00
0,00
rohlík 1
rohlík 2
kaiserka natural
kaiserka se sezamem
bio croissant
bio bageta
bageta grahamová
bageta tmavá
Graf 3. Hodnoty obsahu fenolových látek a antioxidační aktivity u běžného pšeničného pečiva FCM a TEAC metodou v µmol/g MH (X +/- SD, n=2)
140,00
120,00
Koncentrace μmol/g MH
100,00
80,00
60,00
FCM
40,00
TEAC
20,00
0,00
chléb maďarský
chléb šumavský
slunečnicový chléb
fit den
cereal - čtyřzrnný chléb
kovářův chléb
Graf 4. Hodnoty obsahu fenolových látek a antioxidační aktivity u různých druhů chleba FCM a TEAC metodou v µmol/g MH (X +/- SD, n=2)
41
100,00 90,00 80,00
Koncentrace µmol/g MH
70,00 60,00 50,00 40,00 FCM
30,00
TEAC 20,00 10,00 0,00
fitness bulka
kaiserka zrníčková
rustal
dýňová bagetka
kaiserka pohanková trojhran arašídový
Graf 5. Hodnoty obsahu fenolových látek a antioxidační aktivity u vícezrného pečiva FCM a TEAC metodou v µmol/g MH (X +/- SD, n=2)
90,00
80,00
70,00
60,00
Koncentrace µmol/g MH
50,00
40,00 FCM
30,00
TEAC 20,00
10,00
0,00
dalamánek
kornspitz 1
bagetka
bageta
kornspitz 2
Graf 6. Hodnty obsahu fenolových látek a antioxidační aktivity u pšenično žitného pečiva FCM a TEAC metodou v µmol/g MH (X +/- SD, n=2)
42
250,00
200,00
150,00
Koncentrace µmol/g MH
100,00
50,00
0,00
FCM
Graf 7. Hodnoty obsahu fenolových látek a antioxidační aktivity v obilovinách a z nich vymletých moukách FCM a TEAC metodou µmol/g MH (X +/- SD, n=2)
43
TEAC
Z naměřených výsledků znázorněných v tabulkách a grafech 1 a 2 jednoznačně vyplývá, že nejvyšších hodnot, jak u fenolových látek, tak u antioxidační aktivity, dosahují chleby s hodnotami: kovářův chléb (žitno-pšeničné pečivo) 44 µmol/g MH pro FCM a 128 µmol/g MH pro TEAC, cerea čtyřzrnný (pšenično-žitné pečivo, vícezrnný) 38 µmol/g MH pro FCM a 127 µmol/g MH pro TEAC a fit den (celozrnný chléb, žitný) 45 µmol/g MH pro FCM a 126 µmol/g MH pro TEAC. V grafech 3 až 6 je znázorněno porovnání výsledků stanovení fenolových látek a antioxidační aktivity FCM a TEAC metody pro různé druhy pečiva. V grafu 3 se výsledky pro běžné pšeničné pečivo pohybují v rozmezí: 20-28 µmol/g pro FCM a 66-80 µmol/g MH pro TEAC metodu, nejvyšších hodnot dosahuje bageta tmavá. V grafu 4 se výsledky stanovení chleba pohybují v rozmezí: 26-46 µmol/g pro FCM a 74-128 µmol/g pro TEAC metodu. V grafu 5 jsou výsledky u vícezrnného pečiva: 26-36 µmol/g pro FCM a 64-89 µmol/g pro TEAC metodu. V grafu 6 jsou hodnoty pro pšenično-žitné pečivo 21-32 µmol/g: pro FCM a 72-83 µmol/g pro TEAC metodu. Výsledky ukazují, že pečivo z pšenično-žitné mouky, vícezrnné nebo celozrnné má vyšší obsah fenolových látek a antioxidační aktivity než běžné pečivo pšeničné.
Srovnání hodnot stanovených fenolových látek a antioxidační aktivity FCM a TEAC metodou v µmol/g MH pečiva a k němu příslušné mouky z Pekařství Růžička uvádí tabulka 4, kde lze vidět, že hodnoty u rohlíku, dalamánku a chleba se téměř nemění. Mírné zvýšení hodnot u hotového pečiva může být způsobeno procesem výroby pečiva, které může přinést uvolnění dalších fenolových látek z pevných vazeb struktury zrna (Slavin, 2004; Shahidi, Naczk, 2004). Pouze hodnoty u výrobku kornspitz jsou téměř poloviční oproti mouce, ze které je vyráběn. Tabulka 4: Porovnání hodnot obsahu fenolových látek a antioxidační aktivity FCM a TEAC metodou v µmol/g MH pečiva a k němu příslušné mouky z Pekařství Růžička. µmol/g MH FCM
µmol/g MH
TEAC
FCM
TEAC
mouka hladká pro rohlík
19,37
66,92
rohlík
20,08
65,96
mouka pro ch. maďarský
25,42
73,39
chléb maďarský
25,64
74,30
mouka žitná pro dalamánek
27,63
69,79
dalamánek
25,70
71,91
mouka směsná pro kornspitz
47,02
139,01
kornspitz
25,94
74,21
44
V grafu 7 je znázorněno stanovení fenolových látek a antioxidační aktivity v obilovinách a z nich vymletých moukách FCM a TEAC metodou. Hodnoty fenolových látek pro pšenici byly celkem vyrovnané, jak v porovnání zrno a z něj vymletá mouka, tak i vzorky od různých dodavatelů, FCM se pohybovali v rozmezí 24-31 µmol/g, což odpovídá výsledkům pšenice 31,5 µmol/g dle Vnuková, 2008. Dále je můžeme srovnat s výsledky Ragaee et al., 2006, kteří stanovili obsah celkových fenolových látek u pšenice jen 0,5 mg/g EG, zatímco hodnoty v mých vzorcích jsou podstatně vyšší a pohybují se v rozsahu 4-5 mg/g ekvivalentu gallové kyseliny. Hodnoty z TEAC metody byly v rozmezí 71-77 µmol/g. Nejvyšší hodnoty mají pšeničné otruby, méně než poloviční má celé zrno, dále pak mouka chlebová a nejnižší mouka světlá. Hodnoty u žita se u FCM pohybují v rozmezí 26-36 µmol/g, což odpovídá hodnotě stanovené u žita 35,5 µmol/g pro bakalářskou práci (Vnuková, 2008). Dále je můžeme srovnat s výsledky Ragaee et al., 2006, kdy stanovili obsah celkových fenolových látek u žita na 1 mg/g EG, zatím co hodnoty mých vzorků se pohybují v rozsahu 4-6 mg/g ekvivalentu gallové kyseliny U metody TEAC jsou hodnoty 70-120 µmol/g. Nejvyšší hodnoty mají žitné otruby, méně než poloviční má celé zrno a pak mouka. Hodnoty mouk jsou oproti zrnu nižší. Větší rozdíly mezi naměřenými hodnotami a hodnotami dle Ragaee et al., 2006, mohou být dány původem vzorků, rozdílnými klimatickými podmínkami, ale asi především v rozdílném množství vyextrahovaných fenolových látek, extrakce probíhala z 5 g navážené mouky nebo mletého zrna smícháním s 50 ml 80% methanolu. Reakční směsi obsahovaly 250 µl obilného extraktu, 250 µl zředěného Folin-Ciocalteuového činidla a 500 µl nasyceného roztoku uhličitanu sodného.
45
Korelace výsledků Použité metody pro hodnocení fenolových látek a antioxidační kapacity jsou založeny na redoxním potenciálu, měla by existovat určitá korelace mezi obsahem fenolových sloučenin a antioxidační kapacity měřené podle jednotlivých metod (Stratil et al. 2007). Vysoký celkový obsah polyfenolů zvyšuje antioxidační aktivitu a proto je mezi fenoly a antioxidačním potenciálem lineární korelace (Gorinstein et al., 2007). V grafech 8 a 9 je statisticky vyhodnocena korelace naměřených výsledků stanovení fenolových látek a antioxidační aktivity. Z grafů a výpočtů vyplývá, že hodnoty mají vysoce významný korelační koeficient. 140,00
120,00
y = 1,8981x + 57,173 R² = 0,6059
TEAC metoda
100,00
80,00
60,00 y = 0,8338x + 17,983 R² = 0,8839 40,00
20,00
0,00 0
5
10
FCM
15
20
25
30
Graf 8. Korelace výsledků stanovení fenolových látek a antioxidační aktivity u různých druhů chleba a pečiva
300
250
y = 3,4x - 15,89 R² = 0,953
200 y = 3,9172x + 64,27 R² = 0,1401
TEAC metoda
150
100
50
0 0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
FCM
Graf 9. Korelace výsledků stanovení fenolových látek a antioxidační aktivity u zrnin a mouk
46
80,00
6 ZÁVĚR Fenolové látky obsažené v potravinách jsou významné pro udržení dobrého zdraví do vysokého věku. Někdy se spekuluje, že by fenolové látky mohly mít také škodlivý účinek na zdraví, což však bylo zjištěno jen experimentálně při velkých dávkách (okolo 3-4 g/den) syntetických antioxidantů typu BHT a BHA. Běžný příjem fenolových látek potravou je spíše nedostatečný a obilné potraviny jako základní potraviny mohou být jejich významným zdrojem. Biodostupnost a biotransformace jsou faktory, které významným způsobem limitují fyziologické účinky rostlinných polyfenolů. Výsledky získané v posledních letech ukazují, že po příjmu polyfenoly podléhají velice rozsáhlým a různorodým přeměnám, jak v trávícím traktu, tak v samotném organismu. Proto je nutné věnovat více pozornosti studiu účinků jejich metabolitů. Znalost rozsahu koncentrací rostlinných polyfenolů a jejich metabolitů v krvi a tkáních je rovněž důležitá pro interpretaci výsledků experimentů získaných na buněčných kulturách, stejně jako pokusů na zvířecích modelech. Sortiment výrobků pekáren na tuzemském trhu nabízí velké množství výrobků obohacené o množství významných látek s benefičním účinkem. Např. pekárny Penam, ze které byl vzorek chlebu žitného celozrnného z jejich řady Fit den, kde dle internetových stránek http://www.penam.cz/ připravili to nejzdravější pečivo pro zákazníky a především zákaznice, které dbají o svou kondici a zdravou výživu. V atraktivních obalech se skrývají vynikající chleby plné cereálií, vlákniny, a které jsou obohaceny o vitaminy a minerály. Dalším příkladem mohou být výrobky řady Cerea, ze které byl zvolen vzorek Čtyřzrnný chléb, kde nabízí oproti běžným pekařským výrobkům vyšší podíl žitné mouky a zvýšený obsah vlákniny v receptuře. Kterýkoliv z ucelené řady celozrnných krájených chlebů si tak může dopřát každý, kdo ctí zásady zdravého životního stylu. Zvýšený podíl vlákniny v receptuře umožňuje efektivnější využití obsažené energie. Jak je uvedeno na internetových stránkách http://www.unitedbakeries.cz/cerea/produkty/info.html,
Cerea
čtyřzrnný
obsahuje
vysoký
obsah
nenasycených mastných kyselin, které příznivě ovlivňují metabolizmus tuků. Publikované studie s podáváním celozrnných produktů svědčí o zlepšení zdravotních biomarkerů jako jsou ztráta hmotnosti, zlepšení krevních lipidů a antioxidační aktivity. Ačkoliv je těžké oddělit ochranné vlastnosti celozrnných produktů od účinků dietní vlákniny a dalších složek (Slavin, 2004). Modifikace příjmu potravin zvýšením 47
spotřeby nejrůznějšího ovoce, zeleniny a celozrnných výrobků je velmi přínosná strategie pro spotřebitele s cílem optimalizovat své zdraví a snížit tak riziko chronických onemocnění (Liu, 2007).
48
7 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY ABDEL-AAL, E.-S.M., HULC, P., SOSULSKI, F.W., GRAF, R., GILLOT, C., AND PIETRZAK, L., 2001: Screening spring wheat for midge resistance in relation to ferulic acid content. J.Agric. Food Chem., 49: 3559-3556
ANDREASEN, M.F., CHRISTENSEN, L.P., MEYER, A.S. AND HANSEN, A., 2000b: Content of phenolic acids and ferulic acid dehydrodimers in 17 rye (Secale cereal L.) varieties. J.Agric. Food Chem., 48: 2837-2842
ISABEL
BONDIA-PONS,
ANNA-MARJA
AURA,
SATU
VUORELA,
MARJUKKA
KOLEHMAINEN, HANNU MYKKANEN, KAISA POUTANEN, 2009: Rye phenolics in nutrition and health. Journal of Cereal Science 49, p. 323–336
SHELA GORINSTEIN ET AL., 2007: The total polyphenols and the antioxidant potentials of some selected cereals and pseudocereals. Eur Food Res Technol, 225: p. 321–328
SHELA GORINSTEIN et al., 2008: Comparison of composition and antioxidant capacity of some cereals and pseudocereals. International Journal of Food Science and Technology, 43, p. 629–637
HOLLMAN P. C. H., KATAN M. B., 1999: Food Chem. Toxicol. 37, p. 937 YOON J.H., BAEK S.J., 2005: Molecular tagrets of dietary polyphenols with antiinflamatory properties, Younsei medical journal, vol. 46, no. 5, p. 585-596
A.K. HOLTEKJOLEN, A.B. BEAVRE, M. RODBOTTEN, H. BERG, S.H. KNUTSEN, 2008: Antioxidant properties and sensory profiles of breads containing barley flour. Food Chemistry 110, p. 414–421
HERNÁNDEZ-BORGES J., GONZÁLEZ-HERNÁNDEZ G., BORGES-MIQUEL T., RODRÍGUEZDELGADO M. A., 2005: Determination of antioxidants in edible grain derivatives from the Canary Islands by capillary electrophoresis, Food Chemistry 91, p.105-111 49
GONUL KALETUC, KENNETH J. BRESLAUER, 2003: Characterization of cereal and flours (Properties, Analysis, and Applications). Marcel Dekker, Inc., New York, 523 s.
LABAT, E., MOREL, M.-H.,
AND
ROUAU, X., 2000: Wheat gluten phenolic acids:
occurrence and fate upon mixing. J.Agric. Food Chem., 48: 6280-6283
LONG L., HALLIWELL B., 2001: Flavonoids and Other Polyphenol. Methods in Enzymology, vol. 335, Paker L., (ed.), Academic Press, London, p. 181-190
CHANDRIKA M. LIYANA-PATHIRANA, FEREIDOON SHAHIDI, 2007: The antioxidant potential of milling fractions from breadwheat and durum. Journal of Cereal Science 45, p. 238–247
ANNA MICHALSKA, ALICJA CEGLINSKA, HENRYK ZIELINSKI, 2007: Bioactive compounds in rye flours with different extraction rates. Eur Food Res Technol 225: p. 545–551
PŘÍHODA, J., HUMPOLÍKOVÁ, P., NOVOTNÁ, J., 2003: Základy pekárenské technologie. Pekař a cukrář s.r.o., Praha, 363 s.
SANAA RAGAEE, EL-SAYED M. ABDEL-AAL, MAHER NOAMAN, 2006: Antioxidant activity and nutrient composition of selected cereals for food use. Food Chemistry 98, p. 32–38
RE R., PELLEGRINI N., PROTEGGENTE A., PANNALA A., YANG M., RICE-EVANS C., 1999: Free Rad. Biol. Med. Ě6, p. 1231-1237
RUI HAI LIU, 2007: Whole grain phytochemicals and health. Journal of Cereal Science 46 (2007) p. 207–219
FEREIDOON SHAHIDI, MARIAN NACZK, 2004: Phenolics in Food and Nutraceuticals. CRC Press LLC Florida, 558 s.
50
SINGLETON V.L., ORTHOFER R., LAMUELA-RAVENTÓS R.M, 1999.: Methods in Enzymology 299, p. 152-178
SLANINA J., TÁBORSKÁ E., 2004: Příjem, biologická dostupnost a metabolismus rostlinných polyfenoly, Chemické listy, roč. 98, s. 239-245
SLAVIN, JOANNE, 2004: Whole grains and human health. Nutrition Research Reviews, 17: 99-110.
STRATIL P., KLEJDUS B., KUBÁŇ V., 2007: Determination of phenolic compounds and their antioxidant activity in fruits and cereals. Talanta 71, p. 1741-1751
VELÍŠEK J., 2002: Chemie potravin 2, 2.vydání, OSSIS Tábor, s. 2-54
VELÍŠEK J., 2002: Chemie potravin 3, 2.vydání, OSSIS Tábor, s. 165-174
VINSON J.A., HAO Y., SU X., ZUBÍK L., 1998: Phenol antioxidant quantity and quality in foods: vegetables. J. Agriculture Food Chemistry 46/9, p.3630-3634
VINSON J.A., PROCH J., BOSE P., 2001: Flavonoids and Other Polyphenols, Methods in Enzymology 335, p. 103-114
VNUKOVÁ KRISTINA, 2008: Fenolické látky v luštěninách a zrninách a jejich antioxidační aktivita. Bakalářská práce, Ústav chemie a biochemie (AF), MENDELU.
HENRYK ZIELIJSKI, ALICJA CEGLIJSKA, ANNA MICHALSKA, 2008: Bioactive compounds in spelt bread. Eur Food Res Technol, 226: p. 537–544
Internetové zdroje: http://www.penam.cz/ http://www.united-bakeries.cz/cerea/produkty/info.html
51
SEZNAM OBRÁZKŮ A GRAFŮ
Obrázek 1. Morfologické části zrna Obrázek 2: Absorpce a metabolismus polyfenolů v potravě Graf 1. Hodnoty obsahu fenolových látek v pečivu stanovený FCM v µmol/g MH (X +/- SD, n=2) Graf 2. Hodnoty obsahu antioxidačních látek v pečivu stanovený TEAC metodou v µmol/g MH (X +/- SD, n=2) Graf 3. Hodnoty obsahu fenolových látek a antioxidační aktivity u běžného pšeničného pečiva FCM a TEAC metodou v µmol/g MH (X +/- SD, n=2) Graf 4. Hodnoty obsahu fenolových látek a antioxidační aktivity u různých druhů chleba FCM a TEAC metodou v µmol/g MH (X +/- SD, n=2) Graf 5. Hodnoty obsahu fenolových látek a antioxidační aktivity u vícezrného pečiva FCM a TEAC metodou v µmol/g MH (X +/- SD, n=2) Graf 6. Hodnocení obsahu fenolových látek a antioxidační aktivity u pšenično žitného pečiva FCM a TEAC metodou v µmol/g MH (X +/- SD, n=2) Graf 7. Hodnocení obsahu fenolových látek a antioxidační aktivity v obilovinách a z nich vymletých moukách FCM a TEAC metodou µmol/g MH (X +/- SD, n=2) Graf 8. Korelace výsledků stanovení fenolových látek a antioxidační aktivity u různých druhů chleba a pečiva Graf 9. Korelace výsledků stanovení fenolových látek a antioxidační aktivity u zrnin a mouk
52
