MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
DIPLOMOVÁ PRÁCE
BRNO 2014
Bc. SIMONA JAKUBČÍKOVÁ
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav chovu a šlechtění zvířat
Frekvence výskytu morfologických změn spermií hřebců v Zemském hřebčinci Tlumačov s.p. Diplomová práce
Vedoucí práce:
Vypracovala:
prof. Ing. Ladislav Máchal, DrSc.
Bc. Simona Jakubčíková
Brno 2014
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Frekvence výskytu morfologických změn spermií hřebců v Zemském hřebčinci Tlumačov s.p. vypracovala samostatně a používala jsem pouze prameny, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu použité literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF Mendelovi Univerzity v Brně.
Dne: 29. 4. 2014
Podpis:
PODĚKOVÁNÍ Tímto bych chtěla poděkovat svému vedoucímu práce prof. Ing. Ladislavu Máchalovi, DrSc. za odborné vedení a pomoc při vypracování diplomové práce. Dále bych chtěla poděkovat Ing. Šárce Hanulákové Ph. D., za částečné vedení při tvorbě diplomové práce. Děkuji také panu Ing. Ondřeji Mamicovi Ph. D., za umožnění návštěv hřebčince v Tlumačově, za ochotu odborně odpovídat na mé dotazy a asistovat mi při praktických úkonech v hřebčinci.
ABSTRAKT Morfologické hodnocení spermií má dlouhou historii a je základním prvkem analýzy spermatu, který poskytuje chovateli neocenitelné informace pro posouzení zdravotního stavu plemeníka a jeho potenciální plodnosti. Důležitou roli hraje procento zdravých spermií vzhledem k abnormálně vyvinutým. Tato hodnota hraje důležitou roli ve využitelnosti kvalitních hřebců v plemenitbě. Sperma plemenných hřebců určené k inseminaci chovných klisen v nativní formě nesmí obsahovat více, než 40 % defektních spermií z celkového množství a jejich aktivita by neměla být pod hodnotou 60 %. V případě dávek určených k hlubokému mražení je povoleno pouze 20 % patologických forem spermií. Aktivita ejakulátu vybraného ke kryokonzervaci by neměla klesnout pod 80 %. Tématem diplomové práce bylo zjistit frekvenci výskytu patomorfologických vad spermií u skupiny plemenných hřebců Zemského hřebčince Tlumačov a.s. zařazených do plemenitby pro rok 2013. Vyšetření morfologie spermií bylo provedeno u 72 vzorků ejakulátů získaných od 12 plemeníků v průběhu připouštěcí sezóny v období od května do srpna. U každého hřebce byla zaznamenána aktivita spermií subjektivní metodou ihned po odběru a byla sledována korelace vzhledem k morfologickým abnormalitám téhož vzorku. Pro vyšetření abnormalit morfologické stavby spermií byly nátěry barveny dvěma metodami cytologického barvení - barvení dle Čeřovského a barvení dle B. T. Farellyho. Po obarvení byly preparáty hodnoceny pod světelným mikroskopem. Zjištěné vady byly rozděleny do 6 kategorií – vady hlavičky, vady akrozomu, vady krčku, vady bičíku, abnormální formy spermií a nezralé spermie. Sledován byl také počet normospermií vyjádřený v procentech. Další částí analýzy bylo teoretické srovnání obou použitých barvících technik vzhledem k vhodnosti pro vyšetření morfologických odchylek spermií u hřebců. Klíčová slova: spermie, morfologie spermií, aktivita, barvící metody, hřebec
ABSTRACT Morphological evaluation of sperm has a long history and is an essential element analysis of semen, which provides breeders invaluable information to assess the health status of animal and its potential fertility. An important role is played by the percentage of healthy sperm due to abnormally developed. This value plays an important role in the usability of quality in breeding stallions. Stallion sperm intended for artificial insemination breeding mares in native form may not contain more than 40 % of defective sperm and the total amount of their activity should not be below 60 %. In the case of benefits intended for deep freezing is allowed
only
20
%
pathological
forms
of
sperm.
Activity
selected
for cryopreservation of semen should not fall below 80 %. The topic of the thesis was to determine the frequency of morphologic sperm defects in a group of stallions stud farm Tlumačov s.p., included in breeding season for 2013. Sperm morphology examination was performed on 72 samples of ejaculates collected from 12 stallions during the breeding season from May to August. For each stallion sperm activity was recorded of subjective method, immediately after collection, and the correlation was observed with respect to morphological abnormalities of the same sample. To investigate the morphological structure of sperm abnormalities were stained with two methods of cytological stain – staining of B.T.Farelly and staining of Čeřovský. After staining the preparations were evaluated under a light microscope. Identified defects were divided into 6 categories - defects in the head, acrosome defects, defects of the neck, tail defects, abnormal forms of sperm and immature sperm. We studied a number of normospermia and total sperm pathology also expressed as a percentage. Another part of the analysis was a theoretical comparison of both the staining techniques with respect to suitability for the examination of morphological sperm abnormalities in stallions.
Keywords: sex organs of stallion, ejaculate, sperm analysis, sperm morphology
OBSAH 1 ÚVOD.........................................................................................................................7 2 CÍL PRÁCE................................................................................................................8 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED............................................................................................9 3.1 Biologické vlastnosti hřebčího semene.....................................................................9 3.2 Spermiogeneze hřebčích spermií...............................................................................9 4 Morfologická stavba hřebčí spermie........................................................................12 4.1 Patologie morfologických vlastností spermií..........................................................14 4.1.1 Patologie struktur hlavičky..........................................................................15 4.1.1.1 Vady akrozomu..........................................................................................15 4.1.1.2 Patologické změny tvaru, počtu a vnitřních struktur hlavičky spermie....17 4.1.2 Patologie struktur bičíku..............................................................................20 4.1.2.1 Abnormality krčku spermie.......................................................................20 4.1.2.2 Abnormality hlavního oddílu bičíku.........................................................24 5 Vliv morfologických vad spermií na fertilitu hřebců...............................................26 6 Hodnocení morfologických změn spermií...............................................................27 6.1 Metody barvení morfologických preparátů.....................................................30 6.1.1 Metoda barvení spermií dle B. T. Farellyho.................................................30 6.1.2 Metoda barvení podle Hancocka (barvení roztokem Giemsy).....................31 6.1.3 Metoda barvení podle Karrase.....................................................................31 6.1.4 Metoda barvení WELS X.............................................................................32 6.1.5 Metoda barvení dle Čeřovského...................................................................32 7 MATERIÁL A METODIKA....................................................................................33 7.1 Materiál....................................................................................................................33 8 Metodika...................................................................................................................37 8.1 Odběr semene..................................................................................................37 8.2 Hodnocení aktivity hřebčího semene..............................................................38 8.3 Příprava ejakulátu k morfologickému vyšetření.............................................38 8.4 Hodnocení morfologických abnormalit spermií.............................................38 8.5 Barvení spermatu k morfologickému vyšetření..............................................39 8.5.1 Barvení dle B. T. Farellyho..........................................................................39 8.5.2 Barvení dle Čeřovského...............................................................................40 9 VÝSLEDKY A DISKUZE.......................................................................................40 9.1 Frekvence výskytu patologickomorfologických změn spermií u vybraných hřebců................................................................................................40 10 ZÁVĚR.....................................................................................................................63 11 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY.......................................................................66 12 SEZNAM TABULEK...............................................................................................71 13 SEZNAM GRAFŮ...................................................................................................72
1 ÚVOD Kvalitu plemenných hřebců nelze vidět pouze v jejich sportovní výkonnosti, nebo na základě jejich původu. Dříve tomu tak bylo, dnes by tento postup mohl být považován za chybný a to především z toho hlediska, že ani ten nenadanější plemeník nemusí být schopen produkovat dostatečně množství kvalitního semene. Vzhledem k zavedení umělé inseminace a jejímu hojnému využívání v chovech všech hospodářských zvířat, je právě kvalita spermatu jedním z určujících prvků pro zařazení mladých zvířat do plemenitby. Často se stává, že hřebci vynikajících chovných hodnot nemohou být zařazeni do plemenitby kvůli poruše reprodukčních vlastností. Důvodem může být zdravotní stav pohlavního systému, samotného zvířete, chybná výživa a další vlivy. Jedním z hlavních určujících prvků pro zařazení hřebce do plemenitby je kvalita jeho ejakulátu. Kvalita ejakulátu je tvořená vlastnostmi kvantitativními, jako jsou objem, barva, typický pach a podobně a vlastnostmi kvalitativními. Do skupiny vlastností kvalitativních řadíme např. aktivitu, hustotu a skupinu vyšetření zaměřených na hodnocení morfologické stavby spermií. Morfologická stavba je správné uspořádání vnějších i vnitřních struktur hřebčí spermie. Každý úsek spermie má svůj specifický úkol a hraje důležitou roli v procesu oplození. Právě chyby ve stavbě spermie jsou častým důvodem vzniku reprodukčních poruch u všech samců. Nejen, že je vyšetření morfologické stavby spermií nepostradatelnou částí analýzy ejakulátu určeného především k umělé inseminaci mraženým i nativním semenem, ale pomáhá nám také určit, kdy vady vznikají, jejich původ a v případě, že se nejedná o patologii vzniklou z genetických důvodů, také nalézt možná řešení pro odstranění těchto morfologických abnormalit. Pokud však je při vyšetření odhaleno, že chyby jsou geneticky determinovány a vyskytují se ve vyšším procentu než je přípustné, je nutné hřebce z plemenitby vyřadit. Vyšetření morfologické stavby spermie je nepostradatelnou součástí analýzy semene poskytující informace o plemenné hodnotě mladých hřebců v testacích před zařazením do chovu, ale také u hřebců již v plemenitbě působících. Slouží tak ke kontrole jejich reprodukčního potenciálu a průběžné kvality produkovaného semene. 7
2 CÍL PRÁCE Cílem této diplomové práce bylo vyšetření ejakulátu plemenných hřebců v majetku Zemského hřebčince Tlumačov a určení frekvence výskytu morfologických vad spermií za pomoci dvou rozdílných barvících metod. Součástí analýzy bylo také pozorování vlivu morfologických abnormalit na aktivitu spermií, jako jednoho z ukazatelů kvality ejakulátu u jednotlivých hřebců v průběhu celé připouštěcí sezóny.
8
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1
Biologické vlastnosti hřebčího semene
Kliment et al. (1989) popisuje semeno jako výměšek pohlavních orgánů samců, který se skládá ze semenné plazmy a spermií. Vlastnosti semene a jeho kvalita záleží často na úrovni výživy a na metabolismu ovlivněném výživou. Kvalita spermatu společně s jeho vlastnostmi se mezi jednotlivými druhy zvířat výrazně liší, zejména díky biochemickému složení. Kozumplík a Gamčík et al. (1992) doplňují, že spermie jsou nejdůležitější složkou ejakulátu, jelikož jsou nositelkami kyseliny deoxyribonukleotidové, jakožto genetické informace. Semenná plazma spermiím poskytuje výživu, energii a ochranné prostředí před nepříznivými vlivy v samčích a samičích pohlavních cestách. Semenná plazma hřebce obsahuje množství ergothioneinu a kyseliny citronové produkované přídatnými pohlavními žlázami. Zanedbatelný není ani obsah glycerylfosforylcholinu. Dále je pro hřebce typická absence fruktózy v semenné plazmě, která je zdrojem energie pro spermie například u býků. U hřebce tuto funkci zastává již zmíněný ergothionein (Kozumplík a Gamčík et al., 1992) K fyziologickým vlastnostem spermií patří jejich schopnost aktivního pohybu, schopnost oplodnit samičí vajíčko a schopnost plnohodnotně přenést otcovský dědičný materiál na potomky. Tyto vlastnosti jsou dány především morfologickou stavbou spermií a cytochemickými vlastnostmi (Kliment et al., 1989).
3.2
Spermiogeneze hřebčích spermií
Vývoj spermií probíhá v semenotvorných kanálcích varlete. Výchozím bodem pro spermatogenezi je množení prvopohlavních buněk v embryonálním základu gonád v období prenatálního vývoje plodu. Z gonocytů vznikají následně spermatogonie. U hřebce je spermatogeneze zahájena okolo věku 12. měsíců. 9
Celý vývoj spermií probíhá ve třech fázích – fáze množení, růstu a zrání. Celá spermiogeneze se dělí na dva důležité děje, na spermatocytogenezi a spermiohistogenezi (Marvan et al., 2007). Fáze rozmnožování Marvan et al. (2003) a Brito et al. (2007) uvádí, že tato první fáze spermatocytogeneze je typická několikanásobným dělením spermatogonií nácházejících se při bazální membráně epiteliálních buněk v semenotvorných kanálcích varlat. Tímto procesem dochází k postupnému rozdělení spermatogonií na několik forem. První typ spermatogonií označovaných jako spermatogonie typu A ,charakterizuje Věžník et al. (2004), jako buňky s velkým jádrem, které rychle podléhají dalšímu dělení. Z těchto buněk vznikají dceřinné spermatogonie typu A a spermatogonie intermediální. Intermediální spermatogonie mají odlišný tvar jádra a jejich dělením vznikají spermatogonie typu B, které tvoří základ pro další vývojová stadia spermií a dostávají se do další fáze spermatocytogeneze. Fáze růstu Tato fáze je charakteristická růstem spermatogonií typu B a změnami v jejich jádře. Výsledkem jsou spermatocyty I.řádu, nebo také takzvané primární spermatocyty (Marvan et al., 2007). Věžník et al. (2004) doplňuje, že spermatocyty I. řádu se postupně dostávají k lumen semenotvorného kanálku a jsou prvními buňkami vstupujícími do meiotického dělení, které je typické pro další fázi, fázi zrání Fáze zrání Tato fáze je nazývána také meiotická, protože je pro ni typické meiotické dělení primárních spermatocytů. Jsou to dvě po sobě jdoucí buněčná dělení při, kterých dochází k redukci chromozomů pohlavních buněk na haploidní počet. Výsledná spermie má jen jeden chromozom z původního páru (Gamčík a Kozumplík et al., 1992).
10
Gamčík a Kozumplík et al. (1992) ve své práci dále uvádí, že při prvním meiotickém dělení dochází ke vzniku sekundárních spermatocytů. Výsledným produktem druhého dělení jsou 4 rovnocenné spermatidy. Spermatidy jsou tvarem kulaté buňky ležící těsně při lumenu semenotvorného kanálku, umístěné v podpůrných Sertoliho buňkách epitelu (Marvan et al, 2007). Spermatidy se dále nedělí, ale podléhají významné morfologické transformaci označované jako spermiohistogeneze, nebo spermathelióza. Spermiohistogenezi lze popsat jako děj, při kterém se postupnými strukturálními změnami ze sférické spermatidy stává spermie. Celý proces lze rozdělit na několik stadií. Stadium iniciální, kdy zůstává spermatida téměř beze změn. Dalším stadiem je stadium Golgiho aparátu, kdy dochází k aktivaci Golgiho komplexu a vzniká budoucí základ akrozomu. Další vývoj je označován jako fáze hlavičky, které postupně přechází ve stadium akrozomu a je dokončována morfologická transformace spermie. Stadium akrozomu doprovází dotváření spojovací části bičíku a uvolňování nadbytečné cytoplazmy (Věžník et al., 2004). Zrání spermií Zrání probíhá v nadvarletech hřebce. Je to děj při, kterém již nedochází k hrubým změnám v morfologické stavbě spermie (Marengo et al., 2007). Brito et al. (2007) dodává, že celková doba, kterou spermie setrvají v nadvarleti se pohybuje okolo dvou týdnů. V nadvarleti působí mnoho biochemických a biofyzikálních efektů, které ovlivňují především stabilizaci celkové stavby spermie tvorbou chemických disulfidových vazeb oxidací SH skupin zpevňujících vnitřní struktury spermie, hlavně v bičíku. Podstatným vlivem zracích procesů při průchodu spermií nadvarletem je dokončení vývoje funkčních vlastností spermie, vznik schopnosti pohybu (Marengo et al., 2007). Dle Brita et al. (2007) je celková doba průběhu spermatogeneze u zdravého hřebce 57 dní.
11
4 Morfologická stavba hřebčí spermie Vežník et al. (2004) obecně popisuje spermie jako buňky, které díky své morfologické stavbě plní cílenou funkci a jsou schopné samostatného života. Přenos genetické informace je zprostředkován pomocí jádra, které v důsledku strukturních i funkčních změn v průběhu spermatheliózy svým konečným vzezřením podmiňuje tvar hlavičky spermie. Hlavička hřebčí spermie je oválného protáhlého tvaru s rozšířením v přední třetině. Na podélném řezu je hlavička relativně plochá eliptického tvaru s mírným zesílení bazálního konce. Délka hlavičky je průměrně 6,52 µm a její šířka se pohybuje okolo 3,26 µm (Brito et al., 2007). Pesch a Bergmann et al. (2006) uvádí, že hlavičku spermie tvoří jádro a akrozom a celá hlavička je obklopena plazmatickou membránou. Jádro obsahuje kondenzovaný chromatin, který je nositelem genetické informace a je celé obaleno ve dvojité jaderné membráně. Tvar jádra je velmi druhově specifický a obvykle je dorsoventrálně zploštělý. Věžník et al. (2004) dále popisují přední část hlavičky, kterou kryje čepičkovitý útvar akrozom tvořený vnitřní a vnější membránou. Akrozom lze rozčlenit na apikální, hlavní a ekvatoriální úsek. Zmíněná ekvatoriální oblast neobsahuje žádné enzymy a neúčastní se akrozomální reakce, avšak její membrána se spojuje s membránou oocytu v momentu oplození. Apikální část akrozomu je důležitá zejména z důvodu obsahu hydrolytických enzymů, jako je acrosin, hyaluronidáza a další hydrolázy a esterázy. Tyto enzymy hrají esenciální roli při narušení zony pellucidy a penetraci přes coronu radiatu do oocytu při oplození. Tyto enzymy se uvolní při akrozomální reakci ve chvíli, kdy dochází ke koagulaci vnější membrány akrozomu s plazmatickou membránou (Pesch a Bergmann et al., 2006). Bičík popisují Gamčík a Kozumplík et al. (1992) jako organelu pohybu sloužící zejména k dopravě na místo oplození. Důležitou úlohu hrají mitochondrie v mitochondriálním úseku bičíku, které slouží jako zdroj energie pro spermii. Bičík má několik oddílů, lišících se od sebe vlastnostmi a strukturou. 12
Prvním oddílem je centriolový oddíl, nebo také krček. Morfologicky se krček skládá z proximálního a distálního centriolu. Z distálního centriolu vychází základ pro tvorbu bičíku – axonema. Axonema je soubor osových vláken tvořený ústředními mikrotubuly, kolem kterých je uloženo 9 párů vláken zvaných dublety. Dublety jsou tvořeny dvěma typy elementů- A a B. Z obou typů elementů vychází raménka. Ta se spojují a vytváří peptid dyenin, který je schopen uvolňovat energii díky své ATPázové aktivitě a přenášet ji na tubulin kontraktilních vláknech bičíku. Výsledkem přenosu energie a změn v uspořádání bílkovin uvnitř bičíku je pohyb. Celková délka bičíku hřebčích spermií se pohybuje okolo 51 µm (Věžník et al., 2004). Na krček nasedá oddíl tvořený mitochondriální pochvou. Tento úsek bičíku se vyznačuje obsahem mitochondrií uložených okolo osového vlákna (Kliment et al., 1989). Brito et al. (2007) uvádí, že u hřebce je tato mitochondriální pochva tvořena 60 mitochondriemi, které slouží zejména k tvorbě energie pro pohyb spermií. Na kaudálním konci pochvy se nachází útvar zvaný Jensenův prstenec, který lze označit za konec mitochondriálního oddílu. Brito et al. (2007) dále dodává, že hlavní část bičíku není vnitřní stavbou nijak výrazně odlišná od předešlých částí. Její povrch kryje fibrózní pochva, která svou funkcí a stavbou výrazně přispívá k pružnosti bičíku při pohybu a podporuje pevnost vnitřních struktur. Je tvořena dvěma podlouhlými elementy probíhajícími paralelně s osovými vlákny. Terminální část bičíku obsahuje pouze volně zakončené nefixované mikrotubuly a volné dublety. Celý povrch spermie pokrývá cytoplazmatická membrána, která sestává především z fosfolipidů, cholesterolu a proteinů. Tyto látky spolu vytváří sloučeniny a vzniká tak dvouvrstvá membrána. Poměr a vlastnosti jednotlivých složek zajišťují cytoplazmatické membráně pružnost (Juhász et al., 2000).
13
4.1
Patologie morfologických vlastností spermií
Pohlavní orgány všech samců obecně produkují obrovské množství spermií, denně to může být až 35 miliard. Ne všechny spermie, které vzniknou při spermatogenezi lze označit za plnohodnotně vyvinuté. Tato nadprodukce pohlavních buněk s sebou přináší přirozený výskyt abnormálně vyvinutých a nekvalitních spermií. Na produkci zdravých oplozeníschopných spermií má vliv velká řada faktorů zahrnující výživu, podmínky chovu, sportovní využití hřebce, zdravotní stav a také vliv plemene a individuality zvířete. Velmi důležitý je vztah morfologie spermií k jejich aktivitě a tím také k oplozeníschopnosti, neboli fertilitě hřebce (Věžník at al., 2004). Chenoweth et al. (2005) doplňuje, že jedním z velmi významných faktorů ovlivňujících vznik vad spermií je také genetická determinace, která může být v korelaci s ostatními negativními vlivy. Věžník et al. (2004) uvádí, že většina získaných ejakulátů slouží k tvorbě inseminačních dávek a tato skutečnost zesiluje význam a nutnost provádět kvalitní morfologická vyšetření semene nejen u hřebců, ale i u ostatních plemenných samců. Gamčík a Kozumplík et al. (1992) dále uvádí maximální přípustná procenta výskytu abnormálních spermií. Z celkového počtu spermií může být pouze 20 % defektních, z toho nesmí být více jak 5 % spermií změněno degenerativními poruchami, vady hlavičky se nesmí vyskytovat ve více než 5 %. Dalším negativním jevem v semeni může být výskyt nezralých spermií, které mohou být přítomny pouze do 2 %. Tyto údaje upravuje Card et al. (2005) tvrzením, že u hřebců je normální hodnota 50 % morfologicky nezměněných spermií. Nezralých buněk se v semeni nesmí vyskytovat více než 10 %, vad hlaviček a krčku nesmí být více než 30 % a méně, než 25 % abnormalit ve struktuře proximálního dropletu. Card et al. (2005) dále doplňuje, že u hřebců s méně, než 40 % morfologicky zdravých spermií nemusí dojít nutně k výraznému snížení plodnosti, ale takovýto ejakulát lze použít pouze v nativní podobě. Naopak semeno hřebců s 60 % zdravých spermií může být děleno do více inseminačních dávek díky vysoké oplozeníschopnosti.
14
Všeobecně lze vady vzniklé v morfologii spermií rozdělit na vývojové a získané. Vývojové vady převažují nad získanými, které jsou typické tím, že mohou vzniknout až po dokončení vývoje spermie (Věžník et al., 2004). Juházs et al. (2000) toto tvrzení doplňuje tím, že kategorizace defektů spermií je často závislá na metodách využívaných v konkrétních laboratořích a klasifikuje vady dle původu jejich vzniku na primární a sekundární. Primární vady vznikají při vývoji a zrání spermií, zatímco sekundární vznikají při průchodu semene vývodnými pohlavními cestami a nešetrnou manipulací s odebraným ejakulátem. Další skupinu morfologických poruch tvoří vady teratoidní, jak ve své publikaci zmiňuje Kozumplík a Gamčík et al. (1992). Tyto vady jsou specifické především poruchou tvaru hlavičky spermie a zmožením počtu bičíků či hlaviček. Věžník et al. (2004) doplňuje, že kriteria morfologického hodnocení semene prošla a stále procházejí množstvím názorových změn. To nemění roli morfologického vyšetření jako jednoho z hlavních ukazatelů plodnosti samce. Velkým pozitivem je dosažitelnost těchto metod pro většinu laboratoří díky nenáročnosti na vybavení, vysoké přesnosti a preciznosti při hodnocení jednotlivých preparátů.
4.1.1 Patologie struktur hlavičky Nejčastějšími vadami hlavičky jsou abnormality akrozomu, změny tvaru, velikosti a počtu a změny vnitřní struktury hlavičky (Brito.et al, 2007; Veeramachaneni et al., 2006; Love et al., 2000).
4.1.1.1 Vady akrozomu Pesch a Bergamnn et al. (2006) udávají, že pouze spermie s intaktní membránou akrozomu může podstoupit správnou akrozomální reakci a proniknout do vajíčka při oplození. Abnormality v oblasti akrozomu jsou obecně asociovány s poruchami v průběhu spermatogeneze. Jsou to tedy vady vývojové.
15
Brito el at. (2007) popisuje jednu ze základních morfologických vad akrozomu, kterou je knoflíkový defekt (knobbed acrosome defect), častý zejména u býků a kanců. U hřebců se vyskytuje strukturálně obdobná porucha. Defektní akrozom je utvářen z membrány a akrozomálního matrix a vyčnívá nad vrcholem hlavičky. Tento membránový vesikul obsahuje granula, nebo membránové inkluze obvykle zachycené do akrozomální matrix. Knoflíkový defekt vzniká pravděpodobně v době vývoje akroblastu. Pomocí elektronogramu bylo doloženo, že tato vada není podložena pouze perzistencí akroblastického granula, ale jedná se také o reziduum složitých struktur Golgiho komplexu (Věžník et al., 2004). Vznik knoflíkového defektu akrozomu je pod vlivem mnoha faktorů - průběh spermatogeneze, teplota pohlavních orgánů hřebce, stres, toxické látky a genetické založení jedince. U býků je tato vada způsobená recesivním genem vázaným na pohlaví a běžně se vyskytuje v kombinaci s mnoha dalšími vadami na stejné spermii, obdobné je to i u kanců. Zvířata, u nichž je genetická podstata vzniku vady potvrzena, produkují vysoké procento abnormálních spermií. U hřebců zatím vztah genetiky a vzniku knoflíkového defektu nebyl prokázán, avšak tato vada se u některých jedinců vyskytuje ve vyšší míře, což může nasvědčovat přítomnosti kandidátních genů v genomu hřebce (Brito et al., 2007). Yu a Xu et al. (2004) popisují další abnormality, které jsou u hřebců při vyšetřeních pravidelně klasifikovány. Jedná se o vady, kdy dochází k částečné, nebo úplné ztrátě akrozomu, k jeho deformaci a ztrátě správné funkce při akrzomální reakci. Častý je výskyt zvýšené kondenzace akrozomální hmoty tvořící tmavě zbarvený hřeben hlavičky spermie při pozorování v mikroskopu. Byl popsán i defekt představovaný vakuolizací akrozomu. Tato změna byla popsána především u kanců a existuje doměnka, že se jedná o perzistenci cystických útvarů (Věžník et al., 2004). Tímto defektem se také zabývají Pescha a Bergman et al. (2007) a doplňují, že vakuolizace akrozomu byla prokázána nejen u kanců a hřebců, ale také u mužů. Dutiny vakuol mohou být vyplněny amorfním materiálem a jsou často obklopeny dvěma membránami. Mimo oblast akrozomu je možné pozorovat vakuoly v krčku spermie. 16
Brito et al. (2007) uvádí několik dalších poruch akrozomálních struktur, které byly popsány pomocí světelné a elektronové mikroskopie. Jedná se o různé typy ohnutí, shrnutí a svlečení akrozomu z hlavičky spermie. Velmi častým jevem je zvrásněný akrozom a zploštělý apikální pól akrozomální čepičky. Některé z abnormalit bylo možné pozorovat pouze elektornovým mikroskopem. Je to například akrozom s předčasně probíhající akrozomální reakcí a invaginace vnitřní akrozomální membrány do struktur jádra. Baccetti et al. (2002) zařazuje do této skupiny vad morfologické stavby spermie zbobtnalý akrozom, který se často vyskytuje společně s otokem krčku spermie. Tento stav spermie svědčí o nastávající apoptóze, neboli buněčné smrti. Zbobtnání akrozomu a dalších částí spermie vzniká v důsledku poruch integrity povrchové membrány, což při mikroskopickém vyšetření lze definovat, jako změny v kresbě a strukturální celistvosti membrány. Povrchová cytoplazmatická membrána začne ztrácet svoji jasnou konturu a perinukleární prostor svoji difúzní homogenitu. Postupně se v akrozomální oblasti i v celé hlavičce tvoří vakuoly, až přechází tento stav v bulózní prosáknutí povrchu spermie a dojde k jejímu zbobtnání a následnému rozpadu. Tato patologie není omezena jen na akorozom, ale postihuje také kalíšek jádra, krček a spojovací část (Věžník et al., 2007). Všechny výše zmíněné patologické stavy akrozomu hřebčích spermií mají vliv na snížení fertility plemeníků a jsou pravděpodobně způsobeny poruchou již při spermiogenezi (Věžník et al., 2007). 4.1.1.2 Patologické změny tvaru, počtu a vnitřních struktur hlavičky spermie Výskyt abnormalit hlavičky je nejrozšířenější poruchou morfologické stavby spermií. Tvar hlavičky je podmíněn především tvarem jádra. Utváření jádra může ovlivňovat tlak sertoliho buněk na vyvíjející se spermie a vnitřní faktory, které mají dopad na kondenzaci chromatinu jádra (Brito et al., 2007). Gamčík a Kozumplík et al. (1992) řadí do skupiny morfologických změn hlaviček spermií několik patologií se změnou uspořádání DNA v jádře. Jsou to diploidní spermie, spermie s poruchou obsahu DNA a poruchou tvaru hlavičky, a spermie se zdvojenými 17
hlavičkami. Diploidní spermie jsou typické hrubší, výrazněji se barvící hlavičkou kvůli dvojnásobnému obsahu DNA a dvěma bičíky. Příčinou vzniku diploidních spermií je nerovnoměrné rozdělení jaderné hmoty v době spermiogeneze. Pescha a Bergman at al. (2007) doplňují toto tvrzení o skutečnost, že diploidní spermie lze označit, také jako spermie s gigantickými hlavičkami a často jsou triploidní, až tetraploidní. Podobně, jako diploidní spermie vznikají spermie se zdvojenými hlavičkami. Základ vzniku této teratoidní poruchy ve vývoji obsahu chromatinu nese spermatocyt I.řádu (Gamčík a Kozumplík et al., 1992). Věžník et al. (2004) tyto údaje doplňuje o tvrzení, že původ diploidních spermií je pravděpodobně geneticky podmíněn. Chenoweth et al. (2005) souhlasí s touto domněnku a dodává, že tyto vady mohou být vyvolány působením, některých toxických látek v době spermatocytogeneze. Do skupiny změn vnitřních struktur chromatinu je řazena granulace jaderné hmoty spermie a pravé vakuoly, vznikající invaginací jaderné membrány (Gamčík a Kozumplík et al., 1992). Card et al. (2005) specifikuje tvarové abnormality hlaviček do několika základních typů, jsou to mikrocefalické hlavičky, makrocefalické hlavičky, hlavičky hruškovitého tvaru (pyriformní), výskyt od bičíků oddělených hlaviček (detached heads) a hlavičky s pravými vakuolami. Tuto klasifikaci používá také Brito et al. (2011) a doplňuje, že tento způsob kategorizace poruch hlavičky spermií se řídí změnami nejen tvaru, ale i velikosti. Malé hlavičky jsou často provázené nálezy hruškovitých forem, vakuolizací jader spermií a perzistujícím akroblastem, nezralou formou akrozomu. Existuje předpoklad, že utváření mikrocefalické a makrocefalické hlavičky ovlivňuje celá řada faktorů, které mají vliv na metafázi spermiogeneze a tím i na dělení chromozomů. Obdobný je ve svém základu, také vznik abortivních a teratoidních spermií, protože změna tvaru jádra ovlivňuje změnu povrchových struktur hlavičky. Vyšší podíl těchto poruch svědčí o vážném poškození parenchymu varlat a narušení spermiogenetické funkce epitelu semenotvorných kanálků (Věžník et al., 2004).
18
Dekapitace hlaviček by se podle Brita et al. (2003) neměly v semeni hřebce zařazeného v plemenitbě vyskytovat ve více, než v 5 % k celkovému počtu spermií v ejakulátu. Velké procento dekapitovaných hlaviček je pozorováno v případě, že dochází k výrazné akumulaci semene v nadvarleti. V tomto případě se jedná o symptom stárnutí spermií, nebo vážnou poruchu spermiogenetického cyklu. Pokud se tato porucha projeví ve vyšší koncentraci,výrazně poklesne oplozeníschopnost semene (Love et al., 2000). Gamčík a Kozumplík et al. (1992) vznik dekapitace spermií, neboli dezintegraci spermií, popisují detailněji. Patologie souvisí s migrací zbytkové protoplazmy z krčku spermie na distální konec spojovacího oddílu bičíku při skladování a migraci nadvarletem. Dalšími příčinami jsou také zánětlivé procesy v nadvarlatech a kolísající teplota pohlavních orgánů hřebce v průběhu vývoje spermií. Vznik vakuolárních změn v jádru spermie připisuje Věžník et al. (2004) působení virových agens a stresu. S tímto tvrzení souhlasí i Pescha a Bergman et al. (2007) a doplňuje, že jaderné vakuoly se mohou objevit po prodělaných horečnatých infekcích , v případě výskytu testiculárních tumorů. Brito et al. (2007) popisuje vakuoly, jako tmavé tečky pozorovatelné po použití barvení eosin – nigrosin v různých oblastech hlavičky. Gamčík a Kozumplík et al. (1992) upřesňují místa nálezu vakuol do oblasti apikálního okraje nukleoplazmy a ekvatoriálního segmentu hlavičky spermie. Vznik vakuol spadá do třetí fáze metamorfózy spermie a je symptomem poruchy diferenciace nukleoplazmy. Věžník et al. (2004) mezi vakuolární změny řadí diadémový defekt jádra. Označení defektu je odvozené od vzhledu defektu při barvení preparátů, kdy se v postakrozomální části hlavičky v dolní hranici ekvatoriálního segmentu nachází útvary připomínající perličky různého počtu seřazené do řetězce. Elektronovou analýzou bylo zjištěno, že jde o kráterovité změny v jádru spermie, kdy jsou do vchlípenin jadrné membrány vnořeny mikrotubulární útvary.
19
Tvarové odchylky může vykazovat také báze hlavičky, která může být plochá, vchlípená, zúžená, nebo příliš široká. Tyto tvarové malformace vznikají v konečné fázi spermiogeneze, nebo při nepravidelném nahromadění chromatinu (Gamčík a Kozumplík et al., 1992). Uvedené vady mají negativní vliv na plodnost plemenných hřebců. Bylo zjištěno, že patomorfologické anomálie hlaviček spermií mají esenciální vliv na fertilitu i v případě, že v semeni se vyskytují jiné druhy abnormalit. Pokud stoupne procento vad hlaviček o 1 %, projeví se pokles plodnosti hřebce snížením počtu zabřeznutých klisen o 0,67 % (Jasko et al., 1990; Love et al., 2000).
4.1.2 Patologie struktur bičíku Do skupiny těchto změn zařazuje Gamčík a Kozumplík et al. (1992) rozdílné degenerativní anomálie v utváření jednotlivých úseků bičíku spermie. Z hlediska významu jsou nejdůležitější zejména změny na spojovacím oddíle bičíku, na krčku spermie.
4.1.2.1 Abnormality krčku spermie Dle Loudy et al. (2001) vyžaduje rozeznání poruch krčku spermie zkušeného laboranta s citlivým okem, aby došlo k zaznamenání i velmi jemných změn mezi, které patří zkrácení a prodloužení spojovací části, její zesílení, zúžení, absence struktur v některých úsecích, nebo rozvázání mitochondriální pochvy krčku, což se v mikroskopu jeví, jako spirálovitý velmi tenký útvar. Brito et al. (2011) doplňuje klasifikaci vad krčku o další abnormality, ohnutí, či stočení, zlomení krčku, otoky a další změny, kam lze zařadit např. aplazii segmentu mitochondriální pochvy, nebo její duplikaci. O dalších změnách ve spojovací části spermie se zmiňují Pescha a Bergman et al (2007) a jsou to zejména cytoplazmatické kapénky a vada nazývaná Dag defekt.
20
Běžnou vadou spojovacího oddílu hřebčí spermie je podle Brita et al. (2007) reflexní ohnutí distální části krčku (DMR), který se pod mikroskopem jeví, jako ohnutí do tvaru písmene J, v jehož ohybu je často zadržena distální cytoplazmatická kapénka. U býků je vznik ohnutí spojen s vlivem nepříznivých životních podmínek v době migrace spermií nadvarletem, což může vyvolat změnu pH prostředí nadvarlat. Dag defekt, neboli Daglike defekt identifikovaný poprvé u býka plemene Jersey, po kterém je nazván je prezentován složením, stočením a zlomením distální části krčku spermie za současné retence cytoplasmatické kapénky v ohnutí, nebo bez ní (Chenoweth et al., 2005). Věžník et al. (2004) s předešlým tvrzením souhlasí a dodává, že hlavním typem změny u Daglike defektu je několikanásobně stočený bičík. Dle Loudy et al. (2001) je Dag defekt způsoben poruchou vývinu vnitřních struktur bičíku, kdy je narušena stavba bičíkových fibril a místo obvyklého uspořádání 9+9+2, vzniká deformace, kdy skupina fibril ve vnějším kruhu chybí. Původ těchto změn organizace a počtu dubletů je situován do oblasti nadvarlete. Ve varlatech i při výskytu stočených bičíků nebyly při vyšetření nalezeny anomálie ve vývoji obvyklého počtu fibril. Nepravidelnosti ve struktuře bičíku mohou být způsobeny nedostatkem některých látek. U Dag defektu byl prokázán vliv karence zinku a selenu. Konkrétně u zinku se předpokládá jeho inkorporace do keratinových struktur fibril v době spermatogeneze s účastí na uplatnění a stabilizaci proteinů bohatých na SH skupiny a na regulaci a organizaci disulfidických můstků při epididimální maturaci (Věžník et al., 2004). Byla odhalena genetická podstata Dagova defektu, který je typický u býků. Jedná se o působení recesivního genu. Existuje tedy předpoklad, že u hřebců jde také o dědičnou vadu. Taková zvířata produkují ve svém ejakulátu velké procento postižených spermií a vykazují velmi nízkou fertilitu, až sterilitu.(Chenoweth et al., 2005).
21
Velkou skupinu změn tvoří abnormality v utváření mitochondriální pochvy spojovacího oddílu. Nejčastěji jde o úplnou absenci mitochondrií, kdy je v mikroskopu pozorovatelné jen holé osové vlákno, nebo o nitkovité utváření pochvy. Defekty mitochondriální pochvy mají většinou genetický základ, ale může je vyvolat i virová infekce způsobující orchitidu (Gamčík a Kozumplík et al., 1992). V proximálním úseku, kde jsou mitochondrie řazeny podél dlouhé osy bičíku, než se jejich sklon mění ve spirálovitý, je možné sledovat rozvinutí vláken tvořených mitochondriemi. Při rozvolnění spirály je obvykle narušená plazmatická membrána a spermie mají výrazně sníženou mobilitu, nebo jsou zcela imobilní (Věžník et .,2004). V menší míře se u spermií plemeníků vyskytuje segmentální aplazie, neboli parciální absence mitochondrií ve spirále. V důsledku segmentální aplazie se stává mitochondriální pochva křehčí a je náchylná k frakturám (Brito et al., 2007). Věžník et al. (2004) upozorňuje, že tento druh vady se častěji vyskytuje v semeni při vážných poruchách funkce pohlavních orgánů. Připomíná, že nejde o změnu týkající se vývoje mitochondrií, ale o změnu v jejich počtu a uložení. Samostatnou skupinu abnormit tvoří pseudoprotoplazmatické kapénky. Jde o defekt ve tvorbě mitochondriálního úseku, kdy mitochondriální spirála je neporušená, ale nad ní se nachází útvary ohraničené mitochondriemi, které jsou vyplněné částicemi s vyšší elektronovou hustotou (Věžník et al., 2004) Chenoweth et al. (2005) pseudokapénku také zmiňuje, a uvádí, že poprvé byla vada nalezena v ejakulátech býků. Dále uvádí defekt, kdy dochází k nahromadění mikrotubulární hmoty v oblasti krčku. Vada byla popsána u několika plemenných hřebců, jako nepravidelné nahloučení malých abnormálně vyvinutých mikrotubulů v proximálním úseku krčku. Strukturálně podobný defekt zvaný „korálkový defekt“ u sterilních hřebců vzniká nahloučením mitochondrií. Podobné změny byly zjištěny také u býků. Alvarenga et al. (1997) doplňuje, že hromadění mikrotubulů je pravděpodobně způsobeno genetickou predispozicí, což prokázal při vyšetření několika hřebců, kteří měli stejného otce.
22
Vzácnou, ale významnou poruchou vývoje krčku je jeho vývrtkovité utváření. Vada byla popsána u býků i u hřebců a je prezentována nepravidelným rozložením, vyboulením, mitochondrií v manžetě, která při pohledu do miksroskopu připomíná vývrtku (Pescha a Bergman et al., 2006). Vývrtkovitý tvar krčku má zřejmě genetický základ, bohužel přesný gen není znám. Uplatňuje se mnoho dalších vlivů, u hřebců je to zejména působení cytotoxických látek typu gossypol a jiné (Chenoweth et al., 2005). Brito et al. (2007) zmiňuje vadu označovanou, jako otok spojovací části a dává s ní do spojitosti většinu výše uvedených abnormalit, zejména pseudokapénku a vývrtkovitý defekt, nahloučení mikrotubulární hmoty a cytoplasmatické kapénky. Cytoplasmatické kapénky jsou jednou z nejčastějších poruch. Jedná se o projev selhání maturačních procesů v nadvarleti hřebce. Proximální kapénka se nachází v oblasti krčku a její výskyt lze diagnostikovat zejména v hlavě nadvarlete, distální je umístěna na konci bičíku a je přítomna při průchodu ocasem nadvarlete (Pescha a Bergman et al., 2006). Cytoplasmatická kapénka je pozůstatek z vývoje spermie. Při průchodu nadvarletem a účinkem zracích pochodů se kapénka postupně dostává přes krček až po konec bičíku od nějž se oddělí a je v nadvarleti vstřebána. Tímto krokem se ze spermie stává zralá buňka. Pokud jsou v semeni nalezeny spermie s kapénkami jedná se o nezralé formy spermií, což může při vyšším výskytu mít negativní vliv na kvalitu ejakulátu. Nezralé spermie jsou typické zejména pro mladé hřebce a pro hřebce s kratší přestávkou mezi jednotlivými odběry semene (Card et al., 2005; Love et al., 2000). Brito et al. (2003) dodává, že výskyt proximálních kapének nad 10 % u býků, vyvolal snížení fertility z důvodu neschopnosti spermií penetrovat přes zonu pelucidu. U hřebců byl taktéž prokázán negativní vliv výskytu proximální kapénky na fertilizační vlastnosti ejakulátu (Jasko et al., 1990; Pesch et al., 2006; Love et al., 2000). Pescha et al. (2006) potvrzuje existenci negativní korelace mezi procentem cytoplasmatických kapének a procentem zabřezlých klisen po připuštění, avšak neuvádí rozdíly mezi proximálním a distálním uložením kapénky.
23
4.1.2.2 Abnormality hlavního oddílu bičíku Do skupiny tvarových změn hlavní části bičíku řadí Gamčík a Kozumplík et al. (1992) zdvojení bičíku, anomálie v uložení bičíku, torze bičíku a ohnutí různého stupně, až úplné svinutí. Pescha a Bergman et al. (2006) uvádí, že nejčastěji se vyskytující vadou je jednoduché ohnutí bičíku. Věžník et al. (2004) dodává, že bičík se může ohnout buď kolem protoplazmatické kapénky, nebo dochází k ohnutí kvůli abnormálnímu vývoji dubletových mikrotubulů, což vede k jednostranné absenci jednoho, nebo více párů mikrotubulů. Totální svinutí bičíku vzniká v důsledku poruchy průchodu bičíku buněčnou membránou v období spermiohistogeneze a další vývin probíhá uvnitř membrány spermatidy. Abnormity uložení bičíku v implantační jamce hlavičky, zejména uložení abaxiální, paraaxiální a retroaxiální, se projevují změnou charakteru směru pohybu a způsobují snížení motility, až imobilitu spermií (Věžník et al., 2004). Duplikace bičíků je provázena duplikací implantační jamky. Vnitřní struktury bičíku i hlavičky jsou většinou zachovány. Často se dva a více bičíků vyskytují společně s vyšším počtem hlaviček, které mohou mít změněný obsah, nebo strukturu DNA (Brito et al., 2007). Pescha a Bergman et al. (2006) popisují anomálie ve vývoji mikrotubulů a dyeninových ramen, díky kterým je bičík schopen pohybu. Tyto poruchy jsou obvykle důvodem imobility spermií a sterility samce. Při morfologickém vyšetření takovýchto spermií lze pozorovat rozrušené axonemální uspořádání (Chenoweth et al., 2005) Popis doplňuje Věžník et al. (2004) definicí stavu, při kterém je pozorována absence dyeninových spojení mezi dublety. Byly zjištěny i nedostatky v uplatnění ATP při těchto poruchách stavby bičíku např.při struktuře 9+9+0. Syndrom imobility spermií má genetický základ. Gen zodpovědný za jeho vznik byl popsán u myší a existuje reálná pravděpodobnost, že hřebci a jiná hospodářská zvířata nebudou vyjímkou (Sapiro et al., 2002). Chenoweth et al. (2005) dále uvádí vzácnou genetickou poruchu vývoje bičíku spermie nazývanou pahýlový defekt. 24
Pescha a Bergman et al. (2006) zahrnují do strukturálních projevů tohoto syndromu hyperplazii a dezorganizaci fibrózní pochvy na povrchu bičíku a anomálie ve vývoji distálního centriolu. Pahýlový defekt označuje Věžník et al.(2004), jako hypogenezi, až agenezi bičíku. Nález může být rozmanitý od malého rezidua bičíku u báze hlavičky, nebo může pahýl dosahovat velikosti, až poloviny spojovacího oddílu. U tohoto tvaru je pomocí elektronového mikroskopu prokázáno, že může jít o vývin normálních základů bičíku uloženého v bázi hlavičky s mitochondriemi, které jsou chaoticky uspořádané. Další možností je normální uložení proximálního centriolu, ale nejsou vytvořeny filamenta a mitochondrie jsou opět chaoticky uloženy. Reziduální pahýly jsou tvořené membránovým útvarem vyplněným pouze fragmenty filament bez mitochondrií. Vznik těchto patologicky vyvinutých forem bičíku je přisuzován abnormálnímu vývoji spermatidy. Brito et al. (2007) dodává, že výskyt této vady v ejakulátu je zodpovědný za výrazné snížení fertility. Uvedené změny spermií mohou být příčinou poruch plodnosti, pokud se budou vyskytovat ve vyšším množství. Za fyziologickou mez se považuje 5 – 10 % morfologicky změněných spermií. Velmi opatrně se musí hodnotit abnormity primárního původu. U mnohých vad se uplatňuje genetický základ, u některých jsou, již známé geny. Mimo dědičnost se na vzniku patomorfologií ve stavbě spermií podílí změny semenotvorného epitelu a množství vnějších vlivů(Gamčík a Kozumplík et al., 1992). Vzhledem k množství možných abnormit se obecně považuje, konkrétně u hřebců, za přípustné procento normálních spermií hodnota 50 % normospermií (Card et al., 2005). Love et al. (2000) upozorňuje, že je důležité brát v potaz i výkyvy během připouštěcí sezóny. Z toho důvodu je nutné pro objektivní posouzení morfologie spermií provádět vyšetření pravidelně každé 2 – 4 týdny. Důvod k obavám nastává tehdy, pokud je stanoveno procento výskytu vad hlaviček > 30 %, procento výskytu proximální cytoplasmatické kapénky > 25 % a pokud poklesne procento normospermií pod 40 % ( Colenbrander et al., 2003; Card et al., 2005). 25
Saacke et al. (2000) prokázal při studiu morfologie býčích spermií, že některé abnormálně vyvinuté spermie jsou schopné oplodnit vajíčko a způsobit nenormálním vývojem zárodku předčasný embryonální úhyn. Tento fakt potvrzuje negativní vztah, mezi morfologickými vadami a plodností plemeníků a má mimo jiné negativní dopad na ekonomiku chovu. V případě degenerativních onemocnění pohlavních orgánů samce, je indikující schopnost regenerace zárodečného epitelu. Časový průběh regenerace se hodnotí podle délky spermiogenetického cyklu a migrace spermií nadvarletem. Pokud se kvalita ejakulátu neupraví ani po 4 měsících od výskytu abnormálního semene na požadované hodnoty semene využitelného pro reprodukci, měl by být plemeník vyřazen z chovu, protože jde pravděpodobně o dědičně determinovanou vadu, kterou nelze eliminovat (Gamčík a Kozumplík et al., 1992).
5 Vliv morfologických vad spermií na fertilitu hřebců Abnormality ve vývoji spermií obecně negativně ovlivňují plodnost samců a některé závažné poruchy mohou způsobit jejich úplnou infertilitu (Chenoweth et al., 2005). Vztah mezi výskytem abnormálně vyvinutých spermií a fertilitou je nutné stanovovat především na základě výsledného počtu zabřezlých klisen po připuštění (Gamčík a Kozumplík et al., 1992). Podobnou definici uvádí také Mocé et al. (2008) a dodává, že plodnost hřebce lze hodnotit i na základě procentuálního počtu klisen, které se ohřebily po připuštění hřebcem v daném období. Mocé et al. (2008) dále udává, že korelace mezi plodností a vlastnostmi semene, jako je motilita a morfologická stavba spermií se pohybuje mezi hodnotami 0,06 – 0,86. Upozorňuje také, že žádný s testů fertilizačních vlastností semene není schopen poskytnout přesné hodnoty. Je to způsobeno nepřesnostmi údajů analýz plodnosti a multifaktoriální povahou funkce spermií. Walters et al. (2005) charakterizuje určení korelace mezi abnormální morfologií spermií a fertilitou jako obtížně stanovitelnou hodnotu. Velmi důležité je procento vad. 26
Pokud se v semeni nachází dostatek normospermií, většinou vyblokují ty, které mohou nést některé abnormity, se kterými jsou schopné oplození a mohou vyvolat vznik defektních zygot. Jasko et al. (1990) uvádí konkrétní příklad. U hřebců prokázal negativní vztah mezi abnormálně vyvinutými hlavičkami spermií a plodností. Z celkového procenta všech vad, se na variabilitě procenta zabřeznutých plemenic nejvíce podíleli vadné hlavičky spermií. Toto tvrzení uvádí také Love et al. (2000) a Held et al. (1991). Brito et al. (2007) dále zmiňuje vliv abnormalit bičíku u hřebců, které byly podobné Daglike defektu na motilitu spermií. V případě výskytu vysokého procenta této vady docházelo k poklesu motility, až na 1 %. Pesch et al. (2006) a Jasko et al. (1990) diskutují negativní vliv vad spojovacího úseku bičíku a hlavního oddílu. Pro přesnější stanovení korelace je nutné přesně stanovit nalezené variability stavby spermií a jejich původ, protože ne každá má na snížení plodnosti vliv. U nezralých spermií hraje velkou roli umístění cytoplasmatické kapénka. Pesch et al. (2006) a Brito et al. (2007) poznamenali, že konkrétně u hřebců, negativní korelace mezi výskytem proximální kapénky a poklesem plodnosti je třikrát vyšší, než je u výskytu distální kapénky. Tohle tvrzení vyvrací Love et al.(2000) a uvádí, že procento výskytu proximálních kapének není ve výrazné asociaci s plodností hřebců. Na vztah plodnosti a morfologických ukazatelů ejakulátu má tedy efekt mnoho činitelů. Jedná se zejména o druh vyskytujících se vad a jejich početnost vzhledem k počtu zdravě vyvinutých spermií. Dále jsou to fertilizační schopnosti spermií s poruchami a celkové množství spermií v inseminační dávce (Thundathil et al., 2001).
6 Hodnocení morfologických změn spermií Hodnocení morfologie spermií je základním prvkem analýzy hřebčího semene a poskytuje mnoho cenných informací na základě, kterých je možné hodnotit plemennou hodnotu hřebců a kvalitu jejich inseminačních dávek (Brito et al., 2011).
27
Jedním z účelů patomorfologického vyšetření je včas identifikovat příčiny vzniku poruch v produkci kvalitního semene a identifikovat hřebce se sníženou plodností, případně hřebce zcela neplodné (Brito et al., 2007). Věžník et al. (2004) doplňuje, že morfologické vyšetření semene hřebců je neoddělitelným diagnostickým kriteriem vedle hodnocení motility a koncentrace spermií. Při posuzování struktury spermií je pozornost zaměřená na hlavičku, spojovací oddíl, krček a bičík. Na těchto částech spermie jsou posuzovány jednotlivé abnormality na rozdíl od zdravých spermií, případně odchylky vzniklé vlivem barvících metod pro vizualizaci spermií na nátěrech pod mikroskopem. Při hodnocení nátěrů určujeme zejména poměr normospermí k abnormálně vyvinutým, jejich kvalitativní poruchy, přítomnost dalších buněčných elementů, z nich se zaměřením hlavně na nezralé formy spermií. Gamčík a Kozumplík et al. (1992) dodává, že abnormálně vyvinuté spermie mohou být příčinou vzniku defektní zygoty a mohou blokovat fertilizaci normálních spermií. Kliment et al. (1989) uvádí, že prostřednictvím speciálního mikroskopického vyšetření lze provádět kontrolu: poruch spermiogeneze jako důsledku degenerativních procesů ve varlatech vyvolaných nevhodnou výživou, toxickými a infekčními agens, traumaty varletní tkáně, stresem a dalšími. Dále slouží ke kontrole zánětlivých onemocnění pohlavních orgánů hřebce, poruch tvorby a uvolňování pohlavních hormonů, dědičných defektů vázaných na abnormální stavbu spermií, negativního vlivu ředících látek při výrobě inseminačních dávek a jejich vlivů na akrozomální struktury spermie a cytoplasmatickou membránu, odolnosti a poškození během hlubokého zmrazování semene a dlouhodobém uchování dávek. Základním dělením metod pro laboratorní vyšetření semene se zabývá Louda et al. (2001). Vyšetřovací metody dělí do dvou velkých skupin - makroskopické vyšetření a mikroskopické metody vyšetření. Makroskopické hodnocení se týká stanovení objemu semene, pachu, barvy, konzistence a cizích příměsí v semeni ihned po odběru. Pomocí mikroskopických metod jsou hodnoceny např. aktivita spermií, motilita, hustota, hodnocení semene pomocí biochemických zkoušek a v neposlední řadě hodnocení morfologické stavby spermií (Louda et al., 2001).
28
Věžník et al. (2004) zmiňuje moderní metodu hodnocení morfologie spermií pomocí striktní analýzy morfologie spermií – SASMO. Jedná se o metodu, při níž je brána v úvahu celá spermie a veškeré vady na ní se vyskytující. SASMO slouží pro přesnější charakterizaci morfologických nálezů a je využívána jako konfrontační metoda pro srovnání výsledků rutinně používaných metod. Jedná se o metodu relativně drahou, k základnímu vybavení patří mikroskop upravený speciálně pro cytomorfologii, výkonný počítač se speciálním programem. Princip metody spočívá v určení morfologicky normálních spermií a spermií patologických. Pro hodnocení používá program velkou skupinu kriterií, kterými přesně definuje nalezené vady na spermii. Nejčastěji používanou metodou pro stanovení morfologie spermií je světelná mikroskopie. Vzhledem k možnosti vzniku arteficiálních vad při zhotovení nátěrů a barvení preparátů je nutné, aby každá laboratoř měla možnost využít pro porovnání dvě metody (Kliment et al., 1989) Louda et al. (2001) dále uvádí, že laboratornímu a cytochemickému vyšetření musí být ejakulát podroben čerstvý, zbavený želatinózního sekretu přídatných pohlavních žláz. Všechny pomůcky, které budou v kontaktu se spermatem musí být sterilní, bez chemických nečistot s přibližně stejnou teplotou jako má semeno. Roztok používaný k ředění nesmí vyvolat sekundární změny, nejvhodnější je fyziologický roztok. Ředění se provádí na předehřátém sklíčku v poměru 1:1, nebo 1:2, podle hustoty. Kapka naředěného semene se nanese na okraj tenkého podložního sklíčka a speciálním roztěrovým sklem se zabroušenou hranou se pod úhlem 45° plynulým tahem sklíčka vytvoří tenký souvislý povlak semene. Zhotovený nátěr se nechá zaschnout a před mikroskopickým vyšetřením je preparát obarven, některou z dostupných barvících metod pro lepší zobrazení vyskytujících se abnormalit. Kozumplík a Gamčík et al. (1992) doplňují, že při výběru správné barvící metody je nutné brát v potaz, zda jde o analýzu určitých kategorií morfologických vad, nebo jde o orientační vyšetření semene. Podle těchto kriterií je možné použít barvící metody přehledné, nebo speciální. Věžník et al. (2004) ve své publikaci uvádí, že při hodnocení morfologických nátěrů se posuzuje zejména poměr normospermií k abnormálně vyvinutým, změny jejich kvality a přítomnost nezralých buněk spermatogenního cyklu. 29
6.1 Metody barvení morfologických preparátů Louda et al. (2001) zahrnuje do skupiny barvení určených pro vyšetření morfologické stavby spermií širokou škálu metod. Z nichž nejvhodnější k vyšetření semene hřebce jsou dvě nejpoužívanější metody: metoda dle B. T. Farellyho a metoda dle Hancocka, ve výčtu metod uvádí, také metodu barvení WELS X. Věžník et al. (2004) zmiňuje další používané barvící techniky využitelné pro hřebčí semeno, metodu barvení dle Karrase a metodu barvení dle Čeřovského, tato metoda se používá běžně i u kanců.
6.1.1 Metoda barvení spermií dle B. T. Farellyho Tato barvící technika slouží k relativně přesnému určení patologických abnormalit spermií a nezralých forem buněk, pro vyšetření stavu akrozomu a střední části bičíku. Díky své jednoduchosti je ve spermiologické diagnostice využívána v mnoha inseminačních stanicích a veterinárních klinikách. Základní složení reagencií barvící směsi je 10% roztok formalínu ve fyziologickém roztoku, 5% roztok anilinové modři v destilované vodě a 0,5% roztok krystalické violeti v destilované vodě. Nátěr je nejdřív fixován formalínem po dobu 15 vteřin, opláchne se vodou a barví anilinovou modří zhruba půl minuty. Po dalším opláchnutí se na 6 – 15 vteřin ponoří do roztoku krystalické violeti, opláchne se a nechá zaschnout. Při pozorování pod mikroskopem za použítí olejové imerze jsou spermie fialovo – modrého zbarvení. Akrozom je viditelně barevně separován od zadní části hlavičky. Spodní polovina hlavičky je zbarvená do temně fialového odstínu. Dobře lze diferencovat i abnormality na krčku a bičíku.
30
6.1.2 Metoda barvení podle Hancocka (barvení roztokem Giemsy) Tuto metodu je možné považovat za standartní způsob barvení preparátů. Je vhodná zejména pro sledování změn na hlavičce spermie, konkrétně akrozomu. Věžník et al. (2004) metodu dává do spojitosti se SASMO vyšetřením spermií, jako nejvice používanou. Složkami barvícího roztoku je fixační roztok složený z formalínu, fyziologického roztoku, hydrogenuhličitanu sodného a destilované vody a vlastní barvící roztok: tvořený Giemsou, Sörensenovým pufrem a vodou. Suchý nátěr je fixován půl hodiny ve formalínu, opláchne se a suchý se vloží do roztoku Giemsy až na tři hodiny, potom se opláchne a nechá zaschnout. Pokud je barvení provedeno správně, akrozom se zbarví výrazně modro – fialově, ekvatoriální segment se obarví kontrastně světleji a zadní půlka hlavičky má je světlý nádech.
6.1.3 Metoda barvení podle Karrase Tuto barvící techniku vytvořil Karras (1958) a má dvě modifikace. Popisem této barvící metody sloužící zejména pro zobrazení abnormalit na akrozomu se zabývá Věžník et al. (2004). Při tomto barvení se používají dva barvící roztoky. Prvním je nasycený vodní roztok metalchromové žluti a druhým roztok Viktoriánské modři. Před ponořením do prvního barvícího média je nátěr dvakrát fixován pomocí 96% ethanolu. Po 5 minutách v metalchromové žluti je praparát opláchován dokud nevymizí žluté zabarvení. Následuje moření v odvaru z dubové kůry asi 1 minutu. Preparát se znovu opláchne a ponoří na 5 – 7 minut do roztoku Viktoriánské modři. Gamčík a Kozumplík et al. (1992) uvádí, že výsledkem barvení je jasně modrý akrozom, světle růžový ekvatoriální segment, pars posterior a bičík jsou světle žluté.
31
6.1.4 Metoda barvení WELS X Tato metoda je vhodná pro zobrazení nezralých spermií a také pro vyšetření akrozomu pomocí polychromatických barviv (Louda et al., 2001). Pro tento způsob zobrazení patologických forem spermií se používá několik barvících roztoků – konžská červeň, roztok bazického fuchsinu, alkoholový roztok bromthylové modři a vodní nasycený roztok Janusové, případně brilantinové zeleně. Roztěr na sklíčku se fixuje teplem v termostatu asi 10 minut. Po uschnutí se barví konžskou červení 5 minut. Praparát se opláchne, nechá uschnout a barví se 3 minuty v bromthylové modři. Po opláchnutí a uschnutí se na minutu ponoří do roztoku brilantinové, nebo Janusové zeleně a opláchne se.
6.1.5 Metoda barvení dle Čeřovského Postup při této metodě popisuje Věžník et al. (2004). Používané reagencie jsou nasycený roztok kongo červeně a 0,5% roztok krystalické violeti. Suchý nátěr se ponoří do kyvety s kongo červení po dobu 20 sekund, po vytažení se opatrně opláchne pod tekoucí vodou. Nechá se okapat a ponoří se na několik sekund do roztoku krystalické violeti, opláchne vodou a po zaschnutí je možné provést morfologické vyšetření pod mikroskopem za použití olejové imerze.
32
7 MATERIÁL A METODIKA
7.1
Materiál
Materiálem použitým pro diplomovou práci bylo čerstvé semeno 12 licentovaných hřebců zařazených do plemenitby pro rok 2013 v majetku Zemského hřebčince Tlumačov. Skupina hřebců zahrnovala 5 teplokrevných hřebců různých plemen, 1 hřebce plemene Starokladrubský bělouš, 2 hřebce plnokrevné, 2 hřebce chladonokrevné a 1 hřebce plemene Huculský kůň. Od každého z hřebců byla vyšetřena aktivita čerstvě odebraného semene a byly zhotoveny nátěry pro morfologickou analýzu spermií. Vzorky semene byly vyšetřovány po celou dobu připouštěcí sezóny 2013, od května do konce srpna, celkový počet analyzovaných morfologických nátěrů byl 59 kusů
Plemenný hřebec A Plemeno: Anglický plnokrevník Plnokrevný bílý hřebec narozen v roce 2000, zařazený v roce 2013 i do chovu teplokrevných klisen, má za sebou vynikající dostihovou kariéru. V letech 2004 – 2007 byl nejlepším sprinterem s velmi dobrým nadáním pro skoky. V jeho původu se vyskytují i takové legendy jako je hřebec Secretariat. Uplatnění tohoto hřebce v teplokrevném chovu sleduje zejména zlepšení skokových vlastností sportovních koní. Již první hříbata tohoto hřebce dokazují jeho kvality svým dobrým hodnocením.
33
Plemenný hřebec B Plemeno: Český teplokrevník Hřebec ryzého zbarvení narozený roku 1999 zařazený do akceleračního programu. Je jediným synem hřebce 2559 Genius – 11 zařazeným do plemenitby. Při 100-denním testu se hřebec umístil na prvním místě a po té se účastnil soutěží KMK. Nyní již působí pouze v chovu.
Plemenný hřebec C Plemeno: Českomoravský belgický kůň Souladný chladnokrevný plemeník, ryzák s bílými odznaky. Narozený roku 1994. Je vybrán jako genový zdroj svého plemene s původním počtem genů 59,7 %. V roce 2004 absolvoval výkonnostní zkoušky s bodovým hodnocením 8,2 za exteriér a 8,5 za výkon.
Plemenný hřebec D Plemeno: Slezský norik Hřebec tmavě rezavého zbarvení náleží do genového zdroje svého plemene s původním počtem genů 60,1 %. Narozen je v roce 2003, v roce 2005 úspěšně složil výkonnostní zkoušky s bodovým hodnocením 8,46 za exteriér a 8,97 za výkon. V chovu má již zařazeny dva syny a pět dcer.
Plemenný hřebec E Plemeno: Furioso Tmavě hnědý hřebec narozený 1990 je dostatečně mohutný, souladný hřebec výborného charakteru s velmi tvrdou konstitucí. Hřebec byl využíván jako sportovní voltižní kůň s účastí na mnoha mezinárodních soutěžích.
34
Plemenný hřebec F Plemeno: Český teplokrevník Tmavě hnědý hřebec s bílými odznaky narozený v roce 1997. Do plemenitby byl zařazen v roce 2000 po úspěšném složení výkonnostních zkoušek s bodovým hodnocením 7,65 za exteriér a 7,80 za výkon. Svou vlastní výkonností se dostal na úroveň T ve skokových soutěžích. V chovu je po tomto hřebci zařazeno 6 klisen.
Plemenný hřebec G Plemeno: Huculský kůň Černý hnědák narozený roku 2009 je jedním z mála hřebců svého plemene linie Pietrosu, původem z Rumunska v České republice. Hřebec je díky svému původu téměř nepříbuzný s klisnami chovanými na území republiky a poskytuje možnost chovatelům huculských koní přilít do chovu novou krev. Byl vybrán jako genová rezerva, vyniká dobrým charakterem a dobrou mechanikou pohybu díky, které je dobrým jezdeckým a zápřahovým koněm
Plemenný hřebec H Plemeno: KWPN Hřebec bílého zbarvení narozený roku 1996 byl do ČR importován z Holandska. Jde o skokově nadaného hřebce s výborným charakterem, mohutného kratšího rámce se suchým fundamentem. Absolvoval 100-denní test hřebců, kde se umístil mezi 19 účastníky na 6. pozici. V 5ti letech byl druhý ve finále KMK a úspěšně sportoval ve skokovém sportu na úrovni „TT“. Na mistrovství republiky se umístil vždy mezi pěti nejlepšími koňmi a v roce 2009 vyhrál. Plemeník je zařazen do akceleračního programu a má v chovu již 9 klisen.
35
Plemenný hřebec CH Plemeno: Holštýnský kůň Výrazný moderní typ sportovního koně s dokonalým hřebčím výrazem narozený v roce 2005. Hřebec vyniká perfektním exteriérem, charakterem a velmi kvalitním pedigree. Všechny chody vynikají vznosem a prostorností. Hřebec má špičkové skokové nadání ve všech ohledech. Test hřebců absolvoval v Německu v roce 2009 a byl ohodnocen celkovým indexem 110,99 a zařadil se mezi nejlepší účastníky testu. Jeho otcem je hřebec Canturo, účastník Olympijských her v Aténách a matkou klisna Ruffiness v jejímž původu figuruje plemeník Landgraf I, jeden z nejúspěšnějších producentů parkurových koní.
Plemenný hřebec I Plemeno: Arabský plnokrevník – Shagya arab Tento plemeník narozený roku 2003 náleží k třinácté linii uchované na základě čistokrevné plemenitby bez přílivu genů jiných plemen, než plemene Shagya. Hřebec představuje ideální typ koně, středního rámce s všestrannou využitelností. Zkoušky výkonnosti vykonal hřebec v Národním hřebčíně Topločianky a získal ohodnocení 9,43 bodů za výraz, 8,59 bodů za exteriér a 8, 80 bodů za výkonnost. Na základě výsledného počtu bodů byl zařazen do třídy Elita.
Plemenný hřebec J Plemeno: Starokladrubský kůň Mohutný bílý hřebec dobré mechaniky pohybu a dobrého charakteru. Hřebec se narodil v roce 1996 v Národním hřebčíně Kladruby nad Labem. Hřebec je příslušníkem linie Genarale – Generalissimus a rodiny Ragusa. Je vybrán jako genová rezerva a při zařazení do chovu mu byly uděleny známky 7,8 za typ, 7,5 za exteriér a za výkonnost 7, 7 bodů. V plemenné knize má zařazeno 10 dcer.
36
Plemenný hřebec K Plemeno: Český teplokrevník Hnědák narozený v roce 2005 je moderním typem hřebce s dobrými sportovními předpoklady. Hřebec se účastnil 100 denního testu a ukončil jej s bodovým hodnocením 8,1. V roce 2009 se jako čtyřletý prezentoval v soutěžích KMK a sezónu zakončil svým vítězstvím. Následující rok byl druhý mezi pětiletými hřebci a v roce 2011 se po úspěšném ukončení sezóny ve finále KMK výhrou mezi šestiletými hřebci zařadil do akceleračního programu plemen Český teplokrevník. Aktuálně se hřebec úspěšně zúčastňuje skokových soutěží na úrovni ST**.
8 Metodika 8.1 Odběr semene Hřebci vybraní k morfologickému vyšetření ejakulátu byly odebíráni standardním způsobem za použití umělé zkrácené vagíny typu Krakov. Přípravu umělé vagíny pro býky popisuje Louda et al. (2001), u hřebců je postup obdobný s několika modifikacemi. Umělá vagína byla připravována zvlášť pro každého hřebce. Gumová vložka byla napuštěna teplou vodou, zhruba o teplotě 40 – 42°C a dofouknuta pro simulaci tlaku pohlavních cest klisny. Dovnitř byl vložen polyethylenový sběrač sloužící k zachycení semene, jeho okraj byl upevněn k vagíně pomocí gumičky, tak aby hřebci nijak nepřekážel. Okraj takto uchystané vagíny byl potřen bílou vazelínou, což mělo napodobit kluzkost pohlavních cest klisny v říji. Pomocí takto připravené vagíny bylo semeno hřebců odebráno při vzeskoku na fantom. Ihned po odběru byl stanoven celkový objem získaného ejakulátu a byla subjektivně zhodnocena aktivita spermií u každého hřebce. Další ošetření ejakulátu byla závislá na tom, zda bude semeno použito pro tvorbu inseminační dávky a připuštění klisny, nebo pouze pro morfologickou analýzu a dále s ním manipulováno nebude.
37
8.2 Hodnocení aktivity hřebčího semene Aktivita byla hodnocena u každého ejakulátu bezprostředně po odběru. Metodu charakterizují Gamčík a Kozumplík et al (1992) a také Louda et al. (2001). V laboratoři reprodukčního střediska hřebčince Tlumačov byla použita obdobná metoda s několika úpravami. Na předehřáté podložní sklíčko byla přenesena kapka spermatu a přikryta krycím sklíčkem. Aktivita byla posouzena mikroskopicky při teplotě 39 ± 1°C na vyhřívací destičce instalované na mikroskopickém stolku. Hodnocení aktivity bylo provedeno ve 3 zorných polích vždy stejným pracovníkem a odhadem bylo stanoveno procentuální zastoupení spermií pohybujících se přímočaře za hlavičkou směrem vpřed. U každého hřebce byla aktivita hodnocena stejným způsobem a ve stejných podmínkách.
8.3 Příprava ejakulátu k morfologickému vyšetření Čerstvý ejakulát byl přecezen přes čistou gázu a byla odebrána kapka neředěného semene na sterilní podložní sklíčko. Do kapky spermatu byla přidána kapka fyziologického roztoku a krouživými pohyby bylo semeno na sklíčku promícháno. Pomocí roztěrového skla se zbroušenou hranou byl vytvořen nátěr, který byl ponechán na vyhřívacím stolku dokud nebyl dokonale suchý. Po uschnutí byl preparát zabalen do jemného papíru. Zabalené nátěry všech hřebců byly uskladněny ve speciální cytologické krabici a převezeny do laboratoře reprodukce Ústavu chovu a šlechtění hospodářských zvířat Mendelovy univerzity, kde bylo provedeno cytologické barvení a mikroskopické hodnocení patomorfologických změn spermií u jednotlivých hřebců. 8.4 Hodnocení morfologických abnormalit spermií Hlavní součástí vyšetření spermatu bylo patomorfologické hodnocení spermií jednotlivých hřebců. Nátěry byly zhotoveny u všech odebraných ejakulátů. Vždy dva na jednoho hřebce. 38
Jeden nátěr byl barven metodou dle B. T. Farellyho a druhý metodou dle Čeřovského. Morfologické odchylky byly posuzovány mikroskopicky při 1000 násobném zvětšení za použití olejové imerze. Bylo stanoveno 7 kategorií morfologických ukazatelů, které byly sledovány po celou dobu připouštěcí sezóny 2013 od května do konce srpna u všech hřebců. Byl sledován počet normospermií, počet spermií s vadnými hlavičkami, frekvence výskytu abnormalit akrozomu, změny na krčku spermie, poruchy bičíku, abnormálně vyvinuté spermie (dvojitý bičík, zdvojená hlavička, degenerativní formy spermií a jiné) a nezralé spermie. U každého preparátu bylo vyšetřeno 200 spermií, tedy celkem 400 spermií na jednoho hřebce při každém odběru. Frekvence změn byla vyjádřena procenticky ve vztahu k morfologicky nezměněným spermiím zvlášť pro každou metodu barvení.
8.5 Barvení spermatu k morfologickému vyšetření Morfologické preparáty byly hodnoceny pomocí dvou rozdílných barvících metod. Metodou barvení dle B. T. Farellyho a metodou barvení dle Čeřovského. Obě metody byly v závěru práce na základě svých charakteristik a použitelnosti u určitých druhů hospodářských zvířat srovnány z hlediska vhodnosti k hodnocení hřebčích spermií.
8.5.1 Barvení dle B. T. Farellyho Pří barvení preparátů bylo použito metodického návodu, který uvádí Louda et al. (2001). Tento způsob barvení je rychlou metodou vhodnou pro sledování nezralých spermií a většiny patologických poruch stavby spermií. Suché nátěry byly fixovány asi 15 sekund v kyvetě s roztokem formaldehydu, po té byl nátěr opláchnut destilovanou vodou a ponořen do kyvety s 5% roztokem anylinové modři na dobu 15 sekund. Následovalo opatrné opláchnutí jemným proudem vody a finální barvení v roztoku krystalické violeti o koncentraci 0,5 % po dobu 5 sekund. Obarvený preparát byl usušen na vyhřívacím stolku a připraven k pozorování.
39
8.5.2 Barvení dle Čeřovského Preparáty barvené touto metodou byly nejdříve ponořeny to roztoku konžské červeně na 20 sekund. Po tomto barvení byly lehce opláchnuty destilovanou vodou a ponechány na vzduchu lehce oschnout. Posledním krokem barvení bylo ponoření preparátu na 5 sekund do roztoku krystalické violeti. Po obarvení byl preparát opláchnut a ponechán k dokonalému uschnutí na vyhřívacím stolku. Statistické vyhodnocení získaných údajů patomorfologického hodnocení spermií bylo provedeno pomocí balíku programu STATISTICA verze 9.0.
9 VÝSLEDKY A DISKUZE
9.1
Frekvence výskytu patologickomorfologických změn spermií
u vybraných hřebců Pro zpracování výsledků bylo použito celkem 72 vzorků nativního semene od 12 plemenných hřebců, kteří byly po dobu analýzy zařazeni do plemenitby pro rok 2013. Veškeré zjištěné hodnoty byly vyhodnoceny statistickým programem STATISTICA 10.0. Zjištěné hodnoty objemu, aktivity, frekvence jednotlivých kategorií morfologických vad, normospermií a patologicky změněných spermií pro každého hřebce jsou uvedeny v tabulce 1.v částech A - C.
40
Tabulka 1A.: Souhrn všech zjištěných hodnot aktivity, objemu a frekvencí výskytu abnormalit Hřebec
odběr 1. 2.
A
3. 4. 5. 6.
B
45
80
25
85
45
80
50
85
50
80
60
75
50
2.
40
3.
25
4.
30
5.
25 30
1.
110
2.
210
3.
200
4.
140
5.
75
6.
D
aktivita %
1.
6.
C
Objem ml
130
1.
75
2.
50
3.
50
4.
70
5.
80
6.
45
75 75 75 65 75 70 55 50 55 45 50 50 65 60 60 55 65 65
Typ barvení F Č F Č F Č F Č F Č F Č F Č F Č F Č F Č F Č F Č F Č F Č F Č F Č F Č F Č F Č F Č F Č F Č F Č F Č
Hlavička 8 3 7 5,5 2 1,5 0 0,5 0,5 1,5 1 1 1 2,5 4 2,5 4 4,5 0 0,5 1,5 1,5 1 0 6,5 5 2 2 11,5 6 15 12 1,5 0,5 5,5 5,5 3 1 0,5 1 3 0,5 5,5 5 1,5 2 0 1
Frekvence výskytu vad spermií % Akrozom Krček Bičík Abnormální spermie 0,5 8,5 23 0 0 8,5 18 1 0,5 10,5 12,5 0 1 6,5 14 0 0 15 8 0 0,5 1 8,5 0 0 15 13 0 0 6 19,5 0,5 0 18,5 12,5 0 0 18 10,5 0 0 8,5 25 0,5 1 11,5 16 0 0,5 13 29,5 1 0 21 28 1 0 14 24 0 0 5,5 51 0,5 1 20,5 23,5 0,5 1,5 17 19,5 0 0,5 16,5 26,5 0,5 0 16,5 30,5 0 2 23 17,5 0,5 0,5 18 19,5 0,5 0 29 21,5 0,5 0 24,5 31 0 0 3 7,5 0,5 0 3,5 11 0 0,5 16 13,5 0,5 0,5 15 33,5 0,5 2 5,5 24 1 1 10 28,5 0 0 6 25 0 0 7 25,5 0,5 0 16 15 0,5 0,5 5,5 35,5 0,5 3 11,5 16 0,5 2,5 11 15 0 0,5 6,5 18,5 0 0 6 17 2 0 20,5 28 0 0 20 20,5 0 1,5 15 30 0,5 0 11,5 37,5 0 0 16 24 0,5 0,5 15 22 0 0 13,5 20 0,5 0 15,5 19,5 0 0 31 22,5 1,5 0 10 38 0
41
Nezralé 1,5 0 3,5 3 1 2 3 2 5,5 4 0,5 3,5 0,5 0,5 2 0,5 2 1,5 0 3 0 0 0,5 0,5 2,5 2 2,5 2,5 2,5 1 2 1 2 0 1,5 2 2,5 2,5 2,5 8 4,5 5 2 1,5 2 3 5 2,5
Normo spermie % 58,5 69,5 66,0 70,0 74,0 86,5 69,0 71,5 63,0 66,0 64,5 67,0 54,5 47,0 56,0 40,0 48,5 56,0 56,0 49,5 55,5 60,0 47,5 44,0 80,0 78,5 65,0 46,0 53,5 53,5 52,0 54,0 65,0 57,5 62,0 64,0 69,0 71,5 48,5 50,5 45,5 45,5 52,0 56,0 62,5 60,0 40,0 48,5
Patologicky změněné spermie % 41,5 30,5 34 30 26 13,5 31 28 37 34 35 33 44,5 52 44 59,5 51 44 43,5 50,5 44 39,5 52 56 19,5 21,5 34,5 53,5 45,5 46,5 48 45,5 34,5 42 37,5 36 31 26,5 51,5 49,5 54 54,5 47,5 44 37 40 58,5 51,5
Tabulka 1B.: Souhrn všech zjištěných hodnot aktivity, objemu a frekvencí výskytu abnormalit Hřebec odběr
E
1.
140
2.
100
3.
130
4.
120
5.
60
6.
F
65
2.
110
3.
170
4.
120
5.
110
75 80 80 70 75 85 80 85 85 80 80
75
75
1.
50
55
2.
15
55
3.
50
50
4.
50
45
5.
50
45
55
50
1.
50
75
2.
60
75
3.
30
85
4.
45
85
40
80
6.
H
70
1.
6.
G
Objem aktivita ml %
5. 6.
50
80
Frekvence výskytu vad spermií % Typ barvení Hlavička Akrozom Krček Bičík Abnormální spermie F 5,5 0 7,5 20,5 1 Č 3 0 17,5 16,5 0,5 F 3 1 12 9,5 1 Č 1,5 0 11,5 10,5 0 F 6 1 12 13 1,5 Č 4 0 27 4,5 0,5 F 5 0 19,5 12,5 0 Č 1,5 0 13,5 22 1 F 2 0 23,5 11 0,5 Č 1 0 24,5 6 0 F 2 0 21,5 11 1 Č 2,5 0,5 17,5 8,5 0 F 8 1,5 20,5 7,5 0 Č 3 0 11,5 14 0,5 F 4 0 7,5 7,5 0,5 Č 2,5 0 7 12,5 0 F 5,5 0 10,5 8 0 Č 3 0,5 6 10,5 0 F 0,5 0 18,5 9,5 1 Č 1 0 17 10 0,5 F 0 0 16 11,5 0,5 Č 1 0 19 12 0 F 2 1 17 3,5 1 Č 1 0,5 16 3 1 F 10 0 8 12 0 Č 1,5 0 10,5 6 0 F 1 1 22 27,5 0 Č 0 0 16 49,5 0,5 F 1 0 12,5 50,5 0 Č 0 0 13,5 56 0 F 0,5 0 20 43 0,5 Č 1 0 17,5 38 0 F 0,5 0 35,5 14,5 0 Č 0 0 25,5 16,5 0 F 2 1 17 20 0 Č 1 0,5 20 19 0,5 F 8,5 0 7,5 21,5 0,5 Č 4 0 5,5 34 0,5 F 6,5 0,5 4 22,5 0 Č 3 0 4 31 0 F 9,5 1 12 9,5 2 Č 1,5 0 7 24 1,5 F 4,5 1,5 18,5 12,5 1 Č 5 2 17 9,5 0,5 F 4 0,5 12,5 5,5 1,5 Č 4 3,5 14 13,5 0,5 F 3 0,5 12 8 0,5 Č 2,5 1 15 13 1
42
Normo Nezralé spermie % 0,5 65,0 2,5 60,0 2 71,5 2 74,5 0,5 66,0 2 62,0 0 63,0 0 62,0 0 63,0 0 68,5 0 64,5 0,5 70,5 0,5 62,0 0,5 70,5 0 80,5 0,5 77,5 0,5 75,5 2,5 77,5 0,5 70,0 0,5 71,0 0 72,0 0,5 67,5 0 75,5 0 78,5 2 68,0 1 81,0 2,5 46,0 1 33,0 3 33,0 1,5 29,0 2,5 33,5 3 40,5 0,5 49,0 5 53,0 2 58,0 1 58,0 2 60,0 3,5 52,5 6,5 60,0 3 59,0 1 65,0 1,5 64,5 0 62,0 0,5 65,5 2,5 73,5 3 61,5 0,5 75,5 2 65,5
Patologicky Změněné spermie % 34 39,5 27,5 25,5 32,5 37,5 37 37 36,5 31,5 34,5 29,5 38 29 19 22,5 24,5 22,5 29 28,5 27,5 32,5 23,5 20,5 32 19 54 66,5 67 71 66 59,5 51 47 42 41,5 39,5 47 40 41 33 34 37 34 25 38 24 33,5
Tabulka 1C.: Souhrn všech zjištěných hodnot aktivity,objemu a frekvencí výskytu abnormalit Objem ml
aktivita %
1.
75
70
2.
45
80
3.
30
75
4.
80
85
5.
70
80
Hřebec odběr
CH
6.
I
10
80
2.
10
75
3.
20
80
4.
15
85
5.
10
80
15
75
1.
80
75
2.
40
75
3.
40
70
4.
50
75
5.
45
75
6.
K
75
1.
6.
J
75
50
70
1.
10
80
2.
25
85
3.
20
75
4.
20
80
5.
15
75
6.
25
85
Typ barvení Hlavička F 9 Č 1 F 4,5 Č 2 F 0,5 Č 0,5 F 5 Č 1 F 3 Č 2,5 F 1,5 Č 1 F 2 Č 6,5 F 5,5 Č 5 F 4,5 Č 5,5 F 4,5 Č 3 F 4 Č 5 F 5,5 Č 3,5 F 4 Č 3 F 2,5 Č 1 F 2,5 Č 2 F 3 Č 2,5 F 4 Č 2 F 3,5 Č 3 F 1,5 Č 0 F 7 Č 3,5 F 0 Č 0,5 F 1 Č 0,5 F 3 Č 1,5 F 0 Č 0,5
Frekvence výskytu vad spermií % Akrozom Krček Bičík Abnormální spermie Nezralé 0,5 7 28,5 0,5 2,5 0 6,5 32 0,5 5 0 10,5 24 0,5 3 0,5 10,5 31 0 2 0 8 36 0,5 2 0 4,5 40 0 2,5 0,5 10,5 24 0 0,5 0 7,5 32 0 4 0 6,5 33,5 0 3 0 9 26 0,5 2 0,5 9 28 0 2,5 0 8 31 0 2 0 5,5 15 0,5 0,5 0,5 2 7 0,5 1,5 0 2 9,5 0 0,5 0 4 15 0 0 0 4,5 21 1 0 0 4,5 11,5 0 0 0 2,5 12 0 1 0 4 10 0,5 0 0,5 3 14 0,5 0 0 2 10,5 1 0 0 2,5 13 0 1 0 4,5 15 0,5 0,5 0,5 12,5 9 0 0 0,5 12 8,5 0,5 0,5 0,5 6,5 6 0 0 0 6,5 13,5 0 0 0,5 5 8 0,5 0 0,5 6 7 0,5 0,5 0,5 5,5 7,5 0 0 0 5 6,5 0 0,5 0 7 8 0,5 0 0,5 6,5 10 1 0 0,5 6,5 10,5 0,5 0,5 0 6 9,5 0,5 0 1 15 4,5 0 5,5 0,5 23 8,5 0 4 0,5 12,5 7 0 4 0 9 11,5 0 6 0 10 13 0 0 0 9 22 0,5 0,5 0 8 12 0,5 3 0 10,5 8,5 0 2,5 0,5 13 13,5 0 4,5 1 12,5 16 0 2 0,5 11,5 12,5 0,5 0 0 9,5 14 0 1,5
43
Normo spermie % 52,0 55,0 57,5 54,0 53,0 52,5 59,5 55,5 54,0 60,0 58,5 58,0 76,5 82,0 82,5 76,0 69,0 78,5 80,0 82,5 78,0 81,5 78,0 76,0 74,0 75,0 84,5 79,0 83,5 83,5 83,5 85,5 80,5 80,0 78,0 81,0 72,5 64,0 69,0 70,0 77,0 67,5 75,5 78,0 65,5 67,0 75,0 74,5
Patologicky Změněné spermie % 47,5 44,5 42 46 46,5 47,5 40,5 44,5 46 39,5 41,5 42 23 17,5 17,5 24 30 21,5 20 17 21,5 17,5 22 23,5 26 24,5 15,5 21 16 16 16,5 14,5 19 19 21,5 18,5 27,5 36 31 30 23 32 24 22 34,5 33 24,5 25,5
Z tabulky 1 vyplývá, že u hřebce A byl mezi prvními dvěma odběry a ostatními znatelný rozdíl zejména v množství odebraného semene a výskytu vad hlaviček. Nejvyšší zjištěné procento vadných hlaviček bylo 8 %, tato hodnota přesahuje standartní požadavek maximálního množství do 5 % spermií s atypicky vyvinutými hlavičkami. Od třetího odběru se ustálil objem semene i výskyt vadným hlaviček.Celá skupina hřebců byla odebírána od dubna do srpna, obvykle je několik prvních odběrů na začátku sezóny ne zcela kvalitních, jelikož hřebci ještě nemají dostatečně nastartovanou spermatogenezi. Další zajímavou hodnotu, kterou vyšetření morfologie u tohoto hřebce prokázalo bylo vyšší procento 18,5 % vadných krčků spermií a vyšší procento spermií nezralých 5,5 % na 4. a 5. odběru. Louda et al. (2001) upozorňuje, že ejakulát zdravého jedince by neměl vykazovat více než 2 % nezralých spermií. Tyto odběry byly uskutečněny v době, kdy panovaly velmi vysoké teploty, v červenci a srpnu, jak zjistil Jannet et al. (2003) ve svém pokusu na teplokrevných hřebcích, může být letní počasí a s ním spojené vyšší nároky na organismus hřebců jedním z vlivů na vznik poruch ve stavbě spermií a v průběhu spermatogeneze. U hřebce B bylo při vyšetření stanoveno vysoké procento 29 % vadných krčků při posledním odběru. Tato hodnota je těsně pod hranicí přípustnosti dle Card et al (2005), která uvádí, že mezní hranice poruch krčku je na 30 %. Velmi vysoké procento vadných bičíků, až 51 % ukázal druhý odběr. Od druhého odběru vykazoval hřebec postupný pokles množství ejakulátu s nejnižším objemem 25 ml. Tento teplokrevník byl po dobu připouštěcí sezóny zařazen do běžného pracovního provozu pod sedlem, což může být důvodem pro pokles jeho reprodukčních schopností. Hřebci C a D byly chladnokrevní koně, pro které je typický vyšší objem ejakulátu, než pro plemena teplokrevná a plnokrevná. Objem semene hřebce C se pohyboval často přes 100 ml, nejvyšší objem 210 ml odevzdal při druhém odběru. Nejnižší objem 75 ml při odběru pátém v letním období. Vysoké hodnoty abnormalit u spermií byly nalezeny hlavně u hlaviček 15 % u čtvrtého odběru a 35,5 % vadných bičíků u pátého odběru. Card et al. (2005) diskutuje o přípustnosti až 10 % morfologicky vadných hlaviček, avšak, ani tomuto kriteriu hřebec nevyhověl. U hřebce D byl nejméně kvalitní ejakulát při posledním vyšetření. Bylo zjištěno 31 % vadných krčků, 38 % abnormálních bičíků a 5 % nezralých forem spermií při objemu 45 ml. 44
Card et al. (2005) zjistila při analýze semene dvanáctiletého hřebce velmi vysoká procenta vadných hlaviček, až 28 % a 50 % atypicky vyvinutých krčků a poukazuje na negativní vliv stresu v ohledu na vyšší produkci kortizolu, jehož dopadem na varletní tkáň, může být zvýšená produkce nezralých spermií. Ejakulát hřebce E obsahoval nejvíce abnormalit v oblasti krčku spermie s nejvyšší hodnotou 24 %. Na prvních třech odběrech bylo možné sledovat vyšší procento až 6 % vadných hlaviček doprovázené 2 % výskytem nezralých spermií. Tento fakt koresponduje se zmiňovaným počátkem připouštěcí sezóny, kdy hřebci ještě nejsou zcela připraveni z hlediska rozvoje spermatogeneze. U hřebce F bylo v semeni diagnostikováno při první analýze 8 % hlaviček s poruchami vývoje doprovázené vyšším výskytem 1,5 % porušených akrozomů.Objem ejakulátu byl nejnižší 65 ml za celou dobu vyšetření a opět je možné přisuzovat zjištěné údaje počátku připouštěcího období.V porovnání s výsledky analýzy Hurtgena a Johnsona et al. (1982), kteří stanovily u skupiny vyšetřovaných hřebců, až 47 % patologicky vyvinutých akrozomů, lze usoudit, že údaje zjištěné u hřebce F jsou v pořádku. Sperma plemenného hřebce huculského plemene, označeného jako hřebec G, vykazovalo vysoké procento abnormálně utvářených - stočených bičíků ve dvou odběrech, ve třetím a čtvrtém. První vysoká hodnota 49,50 % byla vyhodnocena při objemu ejakulátu pouze 15 ml a druhá vysoká hodnota 56 % vadných bičíků byla stanovena na třetím odběru při objemu 50 ml. Tyto hodnoty jsou typické pro mladé hřebce v období puberty a rozvoje pohlavní činnosti. Card et al. (2005) zkoumala ve své studii dvouletého hřebce a stanovila u něj pouze 30 % morfologicky zdravých spermií a aktivitu stanovila na úrovni 20 %. Nízká aktivita a vysoké procento morfologických vad je pro mladé hřebce typické, vzhledem k příslušnosti k huculskému plemeni, které je méně prošlechtěné a mladému věku hřebce, je možné, že zjištěné hodnoty budou další připouštěcí sezónu zcela vyhovovat požadavkům na ejakulát určený k inseminaci. Vysoké procento anomálií ve tvaru a struktuře hlavičky bylo stanoveno u hřebce H. Nejvyšší hodnoty 9,5 % dosáhl při třetím odběru, kdy také poklesl objem odebraného spermatu. Žádný z odebraných ejakulátů nebyl diagnostikován bez přítomnosti abnormalit ve stavbě a tvaru hlaviček.
45
Louda et al. (2001) uvádí za přijatelnou míru frekvenci do 5 % poruch ve vývoji hlavičky. Pokud dojde k navýšení přítomnosti vadných hlaviček může se jednat o degenerativní poruchu semenotvorného epitelu, s tímto souhlasí také Card et al. (2005), avšak hodnoty zjištěné u šesti letého dospělého hřebce byly mnohem vyšší, 40 % atypických hlaviček, než u hřebce H. Pro hřebce CH byly typické zvýšené hodnoty ohledně množství nenormálně vyvinutých bičíků. Studium ejakulátu ze třetího odběru vykázalo nejvyšší procento, 40 % abnormálně utvářených bičíků, avšak rozdíly mezi jednotlivými odběry nebyly příliš výrazné. Věžník et al. (2004) se při morfologickém hodnocení ejakulátu 29 hřebců metodou SASMO dostali ve své práci na celkovou nižší hodnotu vad bičíku 15,38 %. U zkoumaného hřebce bylo také diagnostikováno 9 % abnormálních hlaviček a 5 % nezralých spermií na prvním odběru. Hřebci je 18 let, je tedy možné brát v úvahu vliv věku na sníženou schopnost spermatogenního epitelu varlat vzhledem k správnému průběhu spermatocytogeneze. U hřebce I je zajímavý celkově nízký objem ejakulátu, jedná se o hřebce plemene arabský plnokrevník, pro něhož, je nízký objem typický. Zajímavé hodnoty frekvence výskytu patologií vykázalo vyšetření hlaviček. Maximální hodnota byla 6,5 % při prvním odběru. Held et al. (1991) vyšetřovali sperma 9 letého arabského plnokrevníka u něhož stanovily 75 % vadných hlaviček z celkového množství abnormálních spermií 92 %. V porovnání s těmito výsledky morfologické analýzy, lze konstatovat, že hřebec I je schopen poskytnout velice kvalitní ejakulát. Při vyšetřování semene hřebce J a K bylo dosaženo velmi uspokojivých hodnot. Frekvence výskytu vad se obvykle pohybovala pod stanovenou přípustnou hodnotou celkového množství patologických forem spermií. U hřebce J byl vyhodnocen, jako nejhorší, ejakulát z prvního vyšetření, s vyšším výskytem vad krčku až 12,5 % a maximální hodnotou vad bičíku 13,5 %. Hřebec K měl ve svém semeni přítomno více nezralých buněk, než je přípustné dle Věžníka et al. (2004), který uvádí, že procento nezralých spermií by nemělo přesahovat 2 % z celkového množství analyzovaných spermií. Vzorek semene testovaného hřebce z druhého odběru obsahoval 6 % nezralých buněk.
46
S . \%&&F^ S . \%&&[^ 1 # # , P# 3.4. 1 / . #, 4 1 # I
# %[ B 4 *# 4,1 . + . 5 D . % + 3 75 / .3 + ..3 # I . 1 # * 3 6
) *+"- ! " &."$. / " &."$
# " 6 7 = > 6 @ A !
; B 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
9
x ,-.,0 5/.+ +-.,0 3(.3/ 55.+ ,-.,0 +,55.+ 54.(5 50.00 ,-
DE 0.53 *.(, 0.53 0.53 +./* 0.53 *.*5 *.*5 +./* 0.53 /.+, *.*5
x 3,.54 +(./( 3-.4/ +*.(0 3+.,3 50.(5 *,.+ 30.5( ++.54 5,.0, ,-.35 5(./4
DE 3.4/ +.44 (-.* 4.,/ *.*+ +.0( (+.4* 3./0 /.,( 0.,* 0.3, *.5*
6 $ ; < x 0(./( *,.54 04.-, *+.,5 0*.(* /3.,0 +(.+ 03./4 **./( /(./3 (4.00 /,.5(
DE 3.4( +.44 (-.0+ 4.4+ *.0+ +.*/ (+.,, 3.+ /., 0.5+ 0.3+ *.54
X+,*# . ..3 [& B t ((G B 3 43 6 ] .. [& EF B t FGC B 3 . # 6 S @.3 .5 . 6 7 + # # ,1 C& B .# # . ! .1 !# 3 . \%&&'^ D5,# . \%&&(^ = 6 7 < 0 3 4+*.5 . .# # E& EF B t FGCB , I 4 + .# + . 6 7 3 . / . 3 . # 6 < CEGZ B t FGC B 6 0 GF'G B t [F' B X+3**# . 3 # # 3 4 6 . # E&CG B t FCE B S / . . 3 3 .1 # .. 6 3 'ZFF Bt FC[ B 3 +,*# 4+*.5 . / 5 6 7 1 +3**# # 5 / 6 + 3 4 GEFE B t FE( B 3 4 1 #
(G
Spermie hřebce G vykazovaly nejvyšší celkovou patologii 51,50 % ± 15,88 %, vzhledem k nejnižší hodnotě normálně vyvinutých spermií 48,50 % ± 15,94 % je hřebec G pod požadovanou hranicí minimálně 60 % morfologicky zdravých spermií v nativních inseminačních dávkách. Na základě výsledků Colebrandera et al. (2003), který ve své publikaci uvádí, že pokud klesne procento morfologicky zdravých spermií pod 50 % z celkového obsahu, je nutné podrobit ejakulát jedince speciálním testům a vyhledat příčinu. Při hodnocení normospermií je nutné brát ohled na vliv plemene, hřebec J je plemene teplokrevného, hřebec I je plnokrevník a hřebec G je huculský kůň, jedná se o plemeno méně prošlechtěné. Dle Brita et al. (2007) a studie Colebrandera et al. (1992) je vliv plemene prokazatelný s ohledem na další vnitřní a vnější vlivy. Zjistili, že u teplokrevných a plnokrevných koní je obvyklá hodnota normálních spermií okolo 70 %, zatímco u plemen méně prošlechtěných a chladnokrevných se přirozeně procento normospermií pohybuje níže, kolem 55 % spermií. Grafické vyjádření rozdílů průměrných hodnot aktivity mezi jednotlivými hřebci je zaznamenáno v grafu č.1.
aktivita %
Průměrná aktivita jednotlivých hřebců 90 80,83 77,5 80,83 80 72,5 70 61,62 60 50,83 50 50 40 30 20 10 0 A B C D E F G
80 77,5 79,17
80
aktivita
H
CH
hřebci
Graf. 1: Porovnání hodnot aktivity spermií mezi hřebci
48
73,33
I
J
K
D !% + 44 53 4#/ .3 # . 3 455I 1 # 4 +.1 6
! !"#$%'$ . $ <
(-4,53+*0/(-
<
#
"
6
7
=
>
6
@
A
!
F
$ % !&&' ! "
D . F + 3 4+*.5/ .3 / 1 I . # +.1 6 7 = ,/ 6 33 .3 3 ! 3 4 ! !# # 3 ./ 4 / 0 1 & " # / &."$ 2+ F
F
&
# $
' DE x
& '
x
DE
x
DE
x
DE
x
DE
#
/.30.
/.5(
-./4
-.*
(-.30..<.
+.//
(+.*/..>.6
+.*/
-.(5.F
-.00
/.*3.
[email protected]
(.+4
"
(.4/.6
(.+,
-.+
-.35
(,./(..6.6.@
3.-5
/3.,0..=.
[email protected].!
,.,5
-.*/
-.03
-.4/.7.
-.45
*.+4
-.,0
(.-5
4.(5
4.-3
-.0,
-.0(
(.,
-.5, (.,5
6
3.-,
..".7.G.>.F.9.!
.".=.>
*.5+
/-.,0
.G.A
x
DE
7
/ .6
(.5,
-./(
-.*+
(+.-* .F.@.!
3.5,
/*.54 .=.
[email protected].!
5.((
-.*/
-.35
0.*/ .".=.
[email protected]
=
0.-,
(.3,
-./(
-.*
(5./4.6.6
[email protected]
3.-,
(/.(0.".7.>.6
+.0
-.+,
-.+(
-.,0.7.F.!
-.4,
/.30G.
/.0/
-./4
-.+
(0.,,G.6.9
+.((
4.(0G."..7.>.6
0.*(
-.*/
-.*/
-.+G.#.7.6.!
-.35
>
(.+*<.6
/.50
-./(
-.*
(,.(5< ..6.F.6
[email protected]
5.05
/4.0,< .#.=. .
[email protected].!
(5./
-.(0<.
-./0
/.-,<.9
(./*
*.35
/.*
-.,,F.
(.-+
(-.5+F.<..F
+.-/
(5.-*F.>.6
4.0*
-.54 F..>.F.!
-.3/
/.(5 F..A
(.53
6
/.30F.
/.+
-.(5
-./+
,.(0F.=.". .>
(.,5
0-.+F.#.=. .
[email protected].!
*.53
-./(F.F
-./3
/.+,F.=.
[email protected]
(.(/
@
*.+*
(./+
-.-,
-.(4
(.//
(/.54
.".7.>.6
0.3(
-.0,
-.0,
-.*/.#.7.F.6F.!
-.+(
A
/.5+9.
-.,5
-.00
-./+
5.-,9.7.=.G
/.*4
,.359.".6.7>.6
/.-+
-.00
-.00
-.(59.#.7.< ..6.!
-./+
!
(.+, .6
/.-+
-.00
-.04
((.43 .7.@
*.-0
((.4/ .".7.>.6
*.+5
-.(0 .
-./0
/.54 ..=.
[email protected]
/.-3
.F
0.*/
..=. .F.".7.>.!
( ) *+,+-. / ( 0 ) 1+,+ !23 4!' ! % 67 " ! 3 2'
(Z
Při hodnocení patomorfologických ukazatelů ejakulátu vybraných hřebců bylo zjištěno, že nejvyšší procento 6,08 % ± 4,59 % vadných hlaviček obsahovalo semeno hřebce C, vyšší obsah byl zjištěn také u hřebce H se 4,67 % ± 2,4 % a u hřebce I se 4,54 % ± 1,25 % abnormálně vyvinutých hlaviček. Gamčík a Kozumplík et al. (1992) upozorňují, že pro inseminační dávky je požadována hodnota morfologicky vadných hlaviček nižší, než 5 %. Hřebec C tomuto kriteriu tedy výrazně nevyhovuje, nejčastěji se jednalo u nenormální tvary hlaviček. Pescha et al. (2006) při svém výzkumu indikoval u 5 z dvaceti vyšetřovaných hřebců, že na tvar hlavičky spermie má signifikantní vliv individualita hřebce, uvádí, že koeficient variačního rozpětí utváření hlavičky u těchto hřebců byl 5 % - 8 %. U hřebce C byly také statisticky stanoveny vysoké hodnoty průkaznosti p<0,01, ve srovnání s ostatními zkoumanými hřebci. Nejnižší hodnotu patologicky vyvinutých hlaviček vykázal hřebec G s frekvencí 1,54 % ± 2,73 % tvarově abnormálních hlaviček a hřebec K s hodnotou 1,58 % ± 2,05 %. Ostatní kategorie sledovaných patologií se u hřebce K pohybovali v přijatelných mezích a poukazují na velmi kvalitní ejakulát a dobrý zdravotní stav hřebce. Ejakulát hřebce G vykazoval vyšší procento 29,38 % ± 17,2 % bičíků s poruchou stavby. Z Tab.2 je patrné, že u tohoto hřebce byla stanovena vysoká celková patologie, která dosáhla hodnoty 51,50 % ± 15,88 %, takové procento celkové patologie je vysoko nad maximální hranicí výskytu celkových abnormálních spermií a bylo by vhodné provést další vyšetření. Zajímavého výsledku dosáhl při své analýze Hellander et al. (1991), který zkoumal semeno osmiletého teplokrevníka, u kterého byla zhodnocena velmi nízká fertilita na základě množství nezabřezlých klisen. Tento hřebec měl v semeni až 85 % vadných bičíků a aktivita spermií se pohybovala v rozmezí 0 % - 10 %. V porovnání s výsledky pokusu Věžníka et al.(2004), který stanovil u skupiny 29 hřebců pouze 2,17 % ± 3,22 % stočených bičíků metodou SASMO. Je důležité brát v potaz, že údaje vykázané hřebcem G získané pozorováním ve světelném mikroskopu jsou pouze orientační a další vyšetření jsou závislá na výsledcích plemenitby a procentu zabřezlých klisen. Při vyšetření vad akrozomu byla u hřebce H prokázána nejvyšší hodnota 0,88 % ± 1,05 %. Nejnižší frekvenci výskytu abnormálního akrozomu 0,17 % ± 0,20 % měl hřebec CH. 50
Velmi vysokou frekvenci anomálií akrozomu stanovil Hurtgen et al. (1982) u skupiny tří hřebců. Výskyt kolísal od 38 % k 50 % vadných akrozomů, což mělo za následek výrazné snížení počtu zabřezlých klisen. Velmi překvapivě zjistil, že u hřebce s 50 % chybně vyvinutých akrozomů zabřezly veškeré připuštěné klisny. Varner et al. (2001) ve své práci konstatuje, že u abnormalit akrozomu se často jedná o poruchu schopnosti akrozomové reakce spermie, tento druh vady lze zjistit velmi dobře elektronovou a fluorescenční mikroskopií. Nejvyšší výskyt vadných krčků spermií 18,21 % ± 6,07 % měl ve svém semeni hřebec B a nejnižších hodnot 7,08 % ± 2,49 % dosáhl hřebec J. Frekvence vad bičíků spermie 30,5 % ± 4,76 % byla prokázána jako nejvyšší u hřebce CH, nejméně patologicky postižených bičíků 8,67 % ± 2,05 % se vyskytovalo u hřebce J. K pozoruhodnému výsledku se dopracoval Alvarenga et al. (1997) při zkoumání semene pětiletého arabského hřebce. Bičíky jeho spermií vykazovaly normální stavbu i funkčnost, po přidání obvyklého extendoru došlo ke zhroucení vnitřní struktury bičíků a vzniku jejich imobility.. Při hodnocení četnosti výskytu abnormálně změněných spermií, neboli degenerativních forem spermií byla u hřebce H zjištěna hodnota 0,79 % ± 0,62 %, která byla vyhodnocena jako nejvyšší. Velmi nízkou hodnotu 0,13 % ± 0,23 vykázal hřebec K. Ostatní hřebci také zůstali pod hranicí maximální hranice 5 % degenerativních forem spermií jak uvádí Louda et al. (2001). Poslední sledovanou kategorií abnormalit, byly nezralé formy spermií, jejichž nejvyšší hodnota 3,42 % ± 1,87 % byla prokázána u hřebce D. Hodnota 0,17 % ± 0,25 % byla vyhodnocena, jako nejnižší a byla stanovena u hřebce J. Dopad vysokého výskytu nezralých buněk diskutuje Amann et al. (2000) i Thundathil et al. (2001), kterým se podařilo při vyšetření spermií in vitro demonstrovat neschopnost nezralých spermií navázat se na stěnu vajíčka, a upozorňují, že hřebci s vyšším obsahem nezralých buněk v ejakulátu mohou mít sníženou fertilitu.
51
Frekvence výskytu všech kategorií abnormalit pro každého hřebce je graficky vyjád-
morfologické vady %
řena v grafu č.3.
50 45 40 35 30 25
Frekvence výskytu morfologických vad pro jednotlivé hřebce hlavička akrozom krček bičík
20 15 10 5 0
Abnormálně vyvinuté nezralé A
B
C
D
E
F G hřebci
H
CH
I
J
K
Graf 3.: Frekvence výskytu morfologických vad spermií – porovnání hřebců
Součástí statistického vyhodnocení získaných dat bylo určení korelačních vztahů jednice a vady, aktivity a množství normospermií, aktivity a patologicky změněných spermií a korelace jednotlivých vad mezi sebou. V tabulce 4 jsou zaznamenány vztahy mezi jedincem a vadou, a také korelace abnormalit mezi sebou.
Tabulka 4.: Vzájemné korelace mezi proměnnými
proměnná hřebec hlavička
hřebec
hlavička
akrozom
krček
Abnormální spermie
bičík
nezralé
1
-0,03595
-0,093042
-0,323488
-0,21834
-0,05907
-0,08687
-0,03595
1
0,247615
-0,343119
-0,159944
0,056983
-0,048202
akrozom
-0,93042
0,247615
1
0,097403
-0,148568
0,100708
0,010457
krček
-0,323488
-0,343119
0,097403
1
0,002089
0,030142
0,089234
bičík Abnormální spermie
-0,218341
-0,159944
-0,148568
0,002089
1
-0,75714
0,225362
-0,05907
0,056983
0,100708
0,030142
-0,75714
1
-0,236093
nezralé -0,08687 -0,048202 0,010457 0,089234 Červené hodnoty: statisticky dok ázaná průkaznost p<0,05
0,225362
-0,236093
1
52
Z údajů uvedených v korelační tabulce 4 je zřejmé, že byla stanovena negativní závislost mezi individualitou hřebce a výskytem abnormálně vyvinutých bičíku spermie (r = -0,218341) a také výskytem vadných krčků spermie (r = -0,323488). Výskyt vadných hlaviček pozitivně koreloval s výskytem vad akrozomu (r = 0,247615) a byl prokázán negativní vliv hlavičky na výskyt abnormalit krčku (r = -0,343119). Dle Jaska et al. (1990) mají defektní hlavičky negativní vliv i na celkovou fertilitu hřebce, tuto asociaci potvrzuje také Love et al. (2000). Vzájemný vztah mezi abnormalitami ve stavbě bičíku a výskytem nezralých buněk je pozitivní (r=0,225362), zatímco vliv nezralých spermií na výskyt spermií abnormálně vyvinutých je naopak v negativní korelaci. (r = -0,236093). Jasko et al. (1990) již dříve potvrdil negativní vliv nezralých spermií na ukazatele plodnosti hřebců. S tímto tvrzením souhlasí i Pesch et al. (2006), která ve své práci indikovala negativní korelaci celkového počtu spermií s cytoplazmatickými kapénkami a fertilitou hřebce hodnocenou podle zabřezávání klisen na jeden říjový cyklus. Korelačními vztahy zmíněných proměnných se zabýval také Love et al. (2011) ve své práci, kdy stanovil korelace nejen mezi jednotlivými vadami, ale také vztahy abnormalit a ukazatelů plodnosti a motility. Zkoumal skupinu 88 hřebců a podařilo se mu určit, že vztah vadných hlaviček a abnormalit spojovací části spermie s abnormálně ohnutým bičíkem je na stejné úrovni (r= 0,41), zatímco negativní korelační vztah (r=-0,43) uvádí u vztahu defektů hlaviček s vadným krčkem. Nezralé spermie, byly rozděleny na dvě skupiny – spermie s proximální kapénkou a spermie s distální kapénkou. U spermií s proximálními kapénkami určil negativní korelaci (r=-0,32) s výskytem distálních kapének a s bičíky ohnutými do podoby vlásenky zjistil negativní hodnotu korelace (r=-0,28). Nezralé buňky s protoplazmatickou kapénkou uloženou distálně vykázali pozitivní vliv na ohnutí bičíku (r=0,22). U všech zjištěných korelačních vztahů Love et al.(2011) také prokázal míru průkaznosti p<0,05.
53
V tabulce 5 jsou uvedeny korelační vztahy aktivity, normospermií a celkového procenta spermií patologicky vyvinutých. Tabulka 5. : Vzájemné korelace mezi proměnnými proměnná Aktivita % Celková Patologie % Normospermie % Aktivita % 1 0,498249 -0,498249 0,498249 1 --Normospermie % Celková Patologie % -0,498249 --1
Z tabulky je patrná pozitivní korelace (r=0,498249) mezi procentem aktivity a procentem normospermií v ejakulátu vyšetřovaných hřebců. Love et al. (2011) toto zjištění potvrzuje i u své skupiny analyzovaných hřebců. Uvádí korelaci mezi normospermiemi a motilitou spermií r=0,80. Rozbor je však detailnější i s ohledem na vliv jednotlivých typů abnormalit. Výskyt patologických forem spermií se navzájem negativně ovlivňuje s nízkým procentem aktivity. Love et al. (2011) stanovil míru negativní korelace (r=-0,40) mezi abnormálními bičíky a procentem aktivity. Negativní hodnoty korelací zjistil i u všech ostatních defektů spermií. Hellander et al. (1991) také souhlasí s našim zjištěním a doplňuje, že v jeho pokusu prokázal enormně nízkou aktivitu (1 % – 10 %) při 85 % frekvenci výskytu vadných bičíků, čímž potvrzuje správnost zjištěného korelačního vztahu vad spermií a procenta aktivních spermií v semeni hřebců analyzovaném v této práci. Součástí morfologické analýzy odebíraných vzorků po celou dobu pokusu bylo orientační srovnání barvících metod použitých pro barvení nátěrů a vizualizaci spermií pro vyšetření pomocí mikroskopu. V tabulce 6 jsou uvedeny hodnoty celkových frekvencí výskytu jednotlivých poruch ve stavbě spermií a jsou rozděleny dle typu použitého cytologického barvení.
54
7 5$#$ & &."$ " .$ !< F &
$ & ' $
" "):) x I@% I#J 0.30 -.-(+.--.*/ -.-0.+(/.+3 (.-0+.+(3.4/ 0.++-.+-.*( -.-/.-(.3-.-3.+-
DE 0.-* -.+4 3.,4 4./, -.*+ (.+,
0+.+0
KE -.,* (.*/ -.++ -.++ (.( -.44
" 1 'F
x
/.0, -.0( ((.04 (4.+0 -.0( (.53
DE I@% I#J -.-(/.-- /.-* -.-0.+-.3( (.-/5.-3.0 0.-+3.-- ((.,/ -.-/.--.*( -.-,.-(.30
KE -.,3 (.44 -.++ -.3( (.0( -.40
0+.35
) 75 1 . / 3 1 # 3 4+*.5 , 5 .3 1. ,.3 3*.6# # 6 !# + , + 3 4 + 3 */ .3 ) . # :0 3 3 . 1 # F[[F B .3 # # J6 / 1 !. # # F[CG B X+3**# 4# 6.3 .3 3 4/ !# 7 ) # # . :0 3 3 . ./. 3 'CZ%B t Z%E B .3 # J6 / 1 1 3. 1 !# 7 . 'Z[FB t ''E% B .. I
. # 4# ! %C' B . \%&&[^ / .6 3 # ,#/ . 14 9+. , #! # . I # 1 , . # . .5 4 4. . 6 4 # I X 4 5 ./. + ,/ 4.. 5 .3 # + / + , ++ 4 4!# . + ./56 ./ . . \%&&G^ / ,# 4 # I 1 4/ 4#3 1 . 4 +.1 4 3 D !( + 443 4#/ .3 * !1 #
[[
Celková frekvence abnormalit spermií - srovnání barvících metod
celková frekvence výskytu vad %
25 19,53
20
16,92
15
Farelly Čeřovský
12,56 11,39
10 5
3,63
2,38 0,420,31
0 hlavička
akrozom
0,410,31
krček
bičík
1,6 1,76
abnormální nezralé
typ vady
Graf 4.: Porovnání rozdílných frekvencí dle typu barvení
Pro detailnější srovnání obou typů barvení slouží tabulka 7, kde jsou uvedeny průměrné údaje výskytu jednotlivých kategorií patologických vad spermií, zvlášť pro každého hřebce s minimálními a maximálními diagnostikovanými hodnotami.
56
[G
Největší procento vadných hlaviček 7,00 % ± 5,33 % při barvení dle B.T Farelly bylo zachyceno u hřebce C, při barvení dle Čeřovského to byl opět hřebec C s hodnotou 5,16 % ± 3,98 %, zde tedy nedošlo téměř k žádnému rozdílu. Minimální údaj 1,92 % ± 1,96 % vykázalo semeno hřebce B u barvení B.T. Farelly a hřebce G 0,58 % ± 0,66 % u barvení dle Čeřovského. Hřebec C dosáhl další maximální hodnoty 0,92 % ± 1,28 % z celé skupiny vyšetřovaných zvířat i ve frekvenci výskytu abnormalit akrozomů pro barvení dle B.T.Farelly. Minimum, 0,08 % ± 0,20 % vadných akrozomů bylo nalezeno v semeni hřebce I. U barvení dle Čeřovského bylo stanoveno 1,08 % ± 1,43 % abnormálních akrozomů hlaviček spermií u hřebce H. Nejnižší hodnota výskytu atypických akrozomů pro toto barvení byla 0,08 % ± 0,20 % zjištěná u hřebců D, E, CH a I. Vysokou hodnotu patologicky změněných krčků obsahoval ejakulát hřebce B, s hodnotou 19,33 % ± 6,08 % a nejlepší semeno v tomto ohledu měl hřebec I s hodnotou 3,33 % ± 1,36 % pro barvení B.T. Farelly. Při pozorování nátěrů obarvených dle Čeřovského měl nejvíce vadných krčků 18,58 % ± 6,07 % hřebec E a nejméně 3,50 % ± 1,18 % jako v předchozím případě hřebec I. U maximálních hodnot bičíků pro oba typy barvení 29,00 % ± 4,91 % pro B. T. Farelly a 32,00 % ± 4,52 % pro barvení dle Čeřovského dominoval hřebec CH. Hřebec F měl při metodě barvení dle B. T. Farelly nejnižší hodnotu 7,92 % ± 2,65 % vadných bičíků, zatímco u druhého typu barvení to byla hodnota 9,17 % ± 2,52 % zjištěná v se meni hřebce J. Abnormální spermie při sledování preparátů obarvených metodou dle B. T. Farellyho se v největší míře 0,92 % ± 0,74 % vyskytly u hřebce H a minimální frekvence 0,08 % ± 0,20 % byla zachycena v semeni hřebců A a G. Preparát barvený dle Čeřovského, který vykázal hodnotu 0,67 % ± 0,52 % patřil hřebci H, tak jako v předchozím barvení to byla nejvyšší hodnota. Minimální výskyt abnormálních spermií 0,08 % ± 0,20 % byl zjištěn u hřebce K. Nejvíce nezralých buněk objevených ve vzorcích semene pro první typ barvící techniky 3,08 % ± 1,32 % bylo nalezeno v semeni hřebce D a nejmíň 0,08 % ± 0,20 % spermií, které nedokončili maturační procesy obsahovalo sperma hřebce J.
58
Podobných hodnot dosáhli stejní hřebci i u druhé metody barvení, nejvíce nezralých spermií 3,75 % ± 2,38 % bylo u hřebce D a minimum 0,25 % ±0,27 % nezralých spermií měl hřebec K. Poslední dvě hodnocené kategorie se týkali celkového obsahu zdravých, morfologicky normálních spermií a spermií patologicky změněných celkově.
Nejkvalitnější
ejakulát z hlediska obsahu normospermií 80,67 % ± 4,1 % zjištěných při technice barvení dle B.T.Farelly a 80,66 % ± 3,66 % při typu barvení dle Čeřovského byl odebírán od hřebce J. U téhož hřebce byla nejnižší celková frekvence výskytu patologických forem spermií. U prvního typu barvení dosáhla minimální hodnota patologie na 19,08 % ± 4,07 % a u druhého barvení bylo patologických spermií celkem 18,92 % ± 3,57 %. Z celkového pohledu na ostatní údaje v tabulce 6., je semeno hřebce J jedno z nejkvalitnějších a odpovídá v mnoha ohledech požadavkům pro tvorbu mražených dávek. Věžník et al. (2004) uvádí, že semeno hřebce určené k umělé inseminaci by nemělo obsahovat více než 40 % patologických forem spermií a méně než 15 % primárně změněných spermií. Dle výsledků zjištěných při morfologické analýze ejakulátu hřebce J, má tento plemeník velmi dobré reprodukční vlastnosti a je ve výborném zdravotním stavu z hlediska spermiogenetického epitelu a průběhu spermatocytogeneze. Tento odhad neplatí pro hřebce G. Jeho sperma vykazovalo po celou dobu vyšší procento defektních forem spermií. Pro barvení dle B.T. Farelly byla tato hodnota 52,00 % ± 13,61 % a pro barvení dle Čeřovského 50,75 % ± 19,20 %. V porovnání s hodnotami normospermií na prvním barvení 47,92 % ± 13,70 % a 49,08 % ± 19,23 % na druhém barvení, je sperma tohoto hřebce výrazně pod normálem. Možné příčiny takto vysoké frekvence patologicky vyvinutých spermií jsou diskutovány u výsledků v tabulce 1. Jak uvádí Brito et al. (2007) u hřebců s poklesem normospermií pod hranici 50 % při preventivních vyšetřeních, je nutné semeno hřebce podrobit dalším speciálním analýzám a pokusit se najít příčinu vzniku defektů a odstranit ji, případně hřebce z plemenitby vyřadit. Všechny zjištěné frekvence patologicky vyvinutých spermií jsou zachyceny v grafech 5 – 10.
59
% morfologicky vadných hlaviček
Frekvence výskytu morfologických abnormalit hlavičky rozdíly mezi hřebci dle typu barvení 8 6
Farelly
4
Čeřovský
2 0 A
B
C
D
E
F
G
H
CH
I
J
K
hřebci
Graf 5.: Porovnání frekvencí výskytu vad hlavičky
% vad akrozomu
Frekvence výskytu morfologických abnormalit v utváření akrozomu rozdíly mezi hřebci dle typu barvení 1,5 Farelly Čeřovský
1 0,5 0 A
B
C
D
E
F
G
H
CH
hřebci
Graf 6.:Porovnání frekvencí výskytu patologií akrozomu
60
I
J
K
% abnormalit krčku
Frekvence výskytu morfologických abnormalit krčku rozdíly mezi hřebci dle typu barvení 25 20
Farelly Čeřovský
15 10 5 0 A
B
C
D
E
F
G
H
CH
I
J
K
hřebci
Graf 7.: Porovnání frekvence výskytu patologií krčku
% abnormálních bičíků
Frekvence výskytu morfologických abnormalit bičíku rozdíly mezi hřebci dle typu barvení 35 30 25
Farelly Čeřovský
20 15 10 5 0 A
B
C
D
E
F
G
H
CH
hřebci
Graf 8.: Porovnání frekvencí výskytu vadné stavby bičíku
61
I
J
K
% abnormálně vyvinutých spermií
Frekvence výskytu abnormalně vyvinutých spermií rozdíly mezi hřebci dle typu barvení 1 0,8
Farelly Čeřovský
0,6 0,4 0,2 0 A
B
C
D
E
F
G
H
CH
I
J
K
hřebci
Graf 9.: Porovnání frekvence výskytu abnormálně vyvinutých spermií
% nezralých spermií
Frekvence výskytu nezralých spermií rozdíly mezi hřebci dle typu barvení 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0
B.T.Farelly Čeřovský
A
B
C
D
E
F
G
H
CH
hřebci
Graf 10.: Porovnání frekvence výskytu nezralých spermií
62
I
J
K
10
ZÁVĚR
Cílem diplomové práce bylo zjistit pomocí mikroskopické analýzy morfologické stavby spermií frekvenci výskytu patomofrologických vad spermií v ejakulátu plemenných hřebců v majetku Zemského hřebčince Tlumačov s.p. Součástí výzkumu bylo určení korelačních vztahů mezi vybranými proměnnými a snaha zjistit průkazné rozdíly vlivu individuality hřebců na vznik a výskyt některých typů vad spermií a dále byly sledovány vzájemné korelace abnormalit mezi sebou. Důležitým sledovaným prvkem při vyšetření spermatu byl vztah procenta patologicky vyvinutých spermií a aktivity, jako jednoho z ukazatelů kvalitativních znaků semene. Při analýze byla teoreticky vyhodnocena rozdílnost použitých vizualizačních barvících technik nátěrů spermií pro pozorování specifik narušeného vývoje spermií ve světelném mikroskopu. Na základě zjištěných výsledků morfologického vyšetření ejakulátů odebíraných po celou dobu připouštěcího období 2013, lze konstatovat, že celkově je skupina hřebců na dobré úrovni kvality ejakulátu. Pouze u hřebců B a G byla diagnostikována nízká hodnota normálně vyvinutých spermií, která nepřekročila požadovanou minimální hodnotu 60 % spermií morfologicky zdravých. Oba hřebce by bylo vhodné podrobit speciálním vyšetřením morfologie spermií, např.metodou SASMO, aby se zjištěné údaje pomocí použitých preventivních a orientačních technik potvrdily, nebo vyvrátily zcela s jistotou. U hřebce B měly nejvyšší podíl na celkové patologii spermie s atypicky utvářenými a bičíky společně s vyšším procentem vadných krčků. Hřebec G vykazoval poruchy reprodukce i při odběrech ejakulátu v reprodukčním středisku v hřebčinci a aktivita jeho spermií byla nižší, než je požadavek pro nativní sperma určené k inseminaci. Při pozorování v připouštěcí místnosti neprojevoval dostatek pohlavního chovaní typického pro hřebce, byl spíše flegmatického charakteru a při odběru často ejakuloval, až na několikátý skok na fantom. Ve srovnání s ostatními hřebci, kteří ejakulovali po prvním, maximálně po druhém vzeskoku, bylo toto chování velmi neobvyklé. Znepokojivé hodnoty byly u tohoto hřebce zjištěny ve vysokém procentu výskytu vadných bičíků a zvýšené frekvenci přítomných nezralých spermií.
63
Z hlediska plemenné příslušnosti hřebce k plemeni huculskému, tedy méně ušlechtilému, pozdějšímu z hlediska dospívání a staří 4 let v době analýzy, je velmi pravděpodobné, že zjištěné hodnoty se po plnohodnotném vyvinutí funkcí vývoje spermií ustálí. Nižší procento normálně vyvinutých spermií bylo určeno i u hřebců C, D a CH. První dva hřebci jsou chladnokrevného typu a je pro ně typická nižší hodnota morfologicky zdravých spermií, včetně obvykle nižší aktivity, narozdíl od hřebců teplokrevných plemen u kterých je procento motilních spermií vyšší, jak je patrné z dosažených výsledků pozorování. Znepokojivá je u hřebce C vysoká hodnota vadných hlaviček přesahující standard pro semeno používané pro tvorbu inseminačních dávek. Chladnokrevní hřebci obvykle odevzdali větší objem ejakulátu, než teplokrevní, nebo plnokrevní, z čehož lze usoudit na určitou kompenzaci nižších hodnot kvalitních spermií jejich množstvím. U hřebce CH jsou vyšší hodnoty abnormalit zřejmě v korelaci s jeho prošlechtěností na sportovní výkonnost, tedy vlastnost produkční, která je obecně v negativní korelaci s vlastnostmi reprodukčními. Nejkvalitnější ejakulát z pohledu obsahu normospermií byl odebírán od hřebce J. U jeho semene celková frekvence výskytu abnormalit spermií nestoupla přes 20 %, což je hodnota, která je přípustná, jako maximální, pro sperma určené k tvorbě hluboce mražených inseminačních dávek. Bylo zajímavé pozorovat vliv vysokých letních teplot, na které byla minulá připouštěcí sezóna bohatá, zejména v druhé polovině letního období na kvalitu odebíraného ejakulátu. U většiny hřebců došlo ke snížení objemu ejakulátu a u některých bylo možné pozorovat mírné zvýšení přítomných abnormalit. Pravděpodobně za tyto změny může vyšší tělesná teplota a s tím související vyšší teplota varlat, která mohla mít na vývoj spermií vliv. Při statistickém hodnocení vztahů mezi námi vybranými proměnnými byla zaznamenána negativní korelace vysokého procenta defektních spermií a aktivity a naopak, kdy vysoké procento aktivity obvykle souviselo s vysokým procentem normospermií. Ve vztahu individuality jedince a vady byla zjištěna negativní korelační hodnota téměř u všech kategorií vad, ovšem pouze u krčku a bičíku byla stanovena vysoká hodnota průkaznosti. 64
Pozitivní vztah jednotlivých vad navzájem byl určen mezi hlavičkou a akrozomem spermie. Mezi výskytem nezralých spermií a vadných bičíků byla prokázána, taktéž pozitivní korelace s vysokým stupněm průkaznosti. Při porovnání obou barvících postupů využitých při morfologické analýze vzhledem k četnosti vad spermií zjištěných u jednotlivých hřebců dle typu barvení, nebyly zjištěny žádné výrazné rozdíly, které by mohly vyvrátit vhodnost obou metod k preventivnímu vyšetření morfologické stavby hřebčích spermií.
65
11
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
AMANN, P. - SEIDEL, G.E. - MORTIMER, R.G, 2000 : Fertilizing potential in vitro of semen from young beef bulls conatining a high or low percent of bovine sperm with a proximal droplet. Theriogenology 54, 1499 – 1515. ALVARENGA, F. - ALVARENGA, M.A, 1997: Microtubular defect in equine spermatozoa associated with infertility. Equine Veterinary Journal 29, 476 – 481. BACCETTI, B. - CAPITANI, S. - COLLODEL, G. - STREHLER, E. - PIOMBONI, P, 2002: Recent advances in human sperm pathology. Contraception 65, 283 – 287. BRITO, F. C. - SILVA, E. D. F. - BARBOSA, T. - UNANIAN, M, 2003: Effects of scrotal isulation on sperm production, semen quality and testicular echotexture in Bos indicus and Bos indicus x Bos taurus bulls. Animal Reproduction Science 98, 1 – 15. BRITO, F. C, 2007: Evaluation of stallion sperm morphology. Clinical Techniques in Equine Practice 6, 249 – 264. BRITO, F. C. - GREEN, L. M. - KELLEMAN, A. - KNOBBE, M. - TURNER, R, 2011: Effect of method and clinician on stallion sperm morphology evaluation. Theriogenology 76, 745 – 750. COLEBRANDER, B. - PUYK, H. - ZANDEE, A. R, 1992: Evaluation of stallion for breedenig. Acta Veterinaria Scandinavica Supplementum 88, 29 – 37. COLEBRANDER, B. - GADELLA, B. M. - STOUT, T.A, 2003: The predictive value of semen analysis in teh evaluation of stallion fertillity. Reproduction in Domestic Animals Journal 38, 305 – 311.
66
CARD, C, 2005: Cellular associations and differential spermiogram: Making sense of stallion spermatozoal morphology. Theriogenology 64, 558 – 567. GAMČÍK, P. - KOZUMPLÍK, J. - MESÁROŠ, P. - SCHVARC, F. - VLČEK, Z. ZIBRÍN, M, 1992: Andrológia a umelá inseminácia hospodárskych zvierat. Bratislava: Nakladatelstvo Príroda, 3. vydání, 299 s. HELD, J. P. - PRATER, P. - STETTLER, M, 1991: Spermatozoal head defects as a cause of infertility in a stallion. Journal of American Veterinary Medical Association 199, 1760 – 1761. HELLANDER, J. C. - SAMPER, J. C. - CRABO, B. G, 1991: Fertility of a stallion with low sperm motility and high insidence of an unusual sperm tail defects. Veterinary Record 128, 449 – 451. HURTGEN, J. P. - JOHNSON, L. A, 1982: Fertility in stallions with abnormalities of the sperm acrosome. Journal of reproduction and fertility 32, 15 – 20. CHENOWETH, P, 2005: Genetic sperm defects. Theriogenology 54, 457 – 468. JASKO, D. J. - LEIN, D. H. - FOOTE, R. H, 1990: Determination of the relationship between sperm morphologic classifications and fertility in stallions. Journal of American Medical Association 197, 389 – 394. JANNET, F. - THUN, R. - NEIDERER, K, 2003: Seasonal changes in semen quality and freezability in the Warmblood stallion. Theriogenology 60, 453 – 461. JANNET, F. - THUN, R. - BETTSCHEN, S, 2003: Seasonal chnages of semen quality an freezability in Frances – Montagnes stallions. Animal Reproduction Science 77, 213 – 221.
67
JUHÁSZ, J. - NAGY, P. - KULCSAR, M. - HUSZENICZA, G. Y, 2000: Methods for semen and endocrionological evaluation of the stallion: a review. Acta Veterinaria Brno 69, 247 – 259. KLIMENT, Jozef a kol., 1989: Reprodukcia hospodárskych zvierat. Bratislava: Vydavatelstvo kníh a časopisov Príroda, 2. vydání, 392 s. LOUDA, F. - ČEŘOVSKÝ, J. - JEŽKOVÁ, A. - STÁDNÍK, L, 2001: Inseminace hospodářských zvířat se základy biotechnologických metod. Praha: Česká zemědělská univerzita, 1. vydání, 225 s. LOVE, C. C, 2011: Relationship between sperm motility, morphology and the fertility in stallions. Theriogenology 76, 547 – 557. LOVE, C. C. - VARNER, D.D. - THOMPSON, J. A, 2000: Intra and inter – stallion variation in sperm morphology and their relationship with fertility. Jornal of Reproduction and Fertility 56, 93 – 100. MARENGO, S. R, 2007: Maturing the sperm: Unique mechanisms for modifying integral proteins in the sperm plasma membrane. Animal Reproduction Science 105, 52 – 63.
68
MARVAN, F. – HAMPL, A. - HLOŽÁNKOVÁ, E. – KRESAN, J. – MASSANYI, L. – VERNEROVÁ, E., Morfologie hospodářských zvířat. 3. vydání. Praha: Česká zemědělská univerzita,2003, 304 s. MARVAN, F. - HAMPL, A. - HLOŽÁNKOVÁ, E. - KRESAN, J. - MASSANYI, L. VERNEROVÁ, E., Morfologie hospodářských zvířat. 4 vydání. Praha: Česká zemědělská univerzita, 2007. 304 s. + 24 s. Přílohy. ISBN 978 – 80 – 213 – 1658 – 4. MOCÉ, E. - GRAHAM, J. K, 2008: In vitro evaluation of sperm quality. Animal Reproduction Sicence 105, 104 – 118. PESCH, S. - BERGMANN, M, 2006: Structure of mammalian spermatozoa in respect to viability, fertility and cryopreservation. Micron 37, 597 – 612. PESCH, S. - FAILING, K. - BOSTEDT, H. - BERGMANN, M, 2006: Advanced fertility diagnosis in stallion semen using transmission electron microscopy. Animal Reproduction Science 91, 285 – 298. SAPIRO, R. - KOSTETSKII, I. - OLDS-CLARKE, P. - GERTON, G. L. - STRAUSS, J.F, 2002: Male infertility, impaired sperm motility and hydrocephalus in mice deficient in sperm associated antigen 6. Molecular and Cellular Biology 22, 6298 – 6305. SAACKE, R. G. - DALTON, J. C. - NADIR, S, 2000: Relationship of seminal traits and insemination time to fertilization rate and emrbryo quality. Animal Reproduction Science 60, 663 – 677. SOLER, C. - GADEA, B. - SOLER, A. J. - FERNANDÉZ-SANTOS, M. R. - STESO, M. C, 2005: Comparison of trhree different staining methods for the assassment of epididymal red deer sperm morphometry by computerized analysis with ISAS. Theriogenology 64, 1236 – 1243.
69
THUNDATHIL, J. - PALOMINO, J. - BARTH, A, 2001: Fertilizing charakteristics of bovine sperm with faltened or indented acrosomes. Animal Reproduction Science 67, 921 – 243. VEERAMACHANENI, D. N. - MOELLER, C. L. - SAWYER, H. R, 2006: Sperm morphology in stallions: ultrastructure as a functional and diagnostic tool. Veterinary Clinics of North America Equine Practice 22, 683 – 692. VĚŽNÍK, Z. a kol., 2004: Repetitorium spermatologie a andrologie a metodiky spermatoanalýzy. Výzkumný ústav veterinárního lékařství, Brno, 258 s. WALTERS, A. H. - EYESTONE, W. E. - SAACKE, R. G. - PEARSON, R. E. GWASZDAUSKAS, F. C, 2005: Bovine embryo development after IVF with spermatozoa having abnormal morphology. Theriogenology 63, 1925 – 1937. YU, J.J. - XU, Y.M, 2004: Ultrastructural defects of the acrosome in infertile man. Archives of andrology 50, 405 – 409.
70
12
SEZNAM TABULEK
Tabulka 1A, 1B, 1C - Souhrn všech zjištěných hodnot aktivity, objemu a frekvencí výskytu abnormalit Tabulka 2 - Průměrné hodnoty aktivity, normospermií a patologicky změněných spermií Tabulka 3 - Frekvence výskytu morfologických vad spermií u jednotlivých hřebců Tabulka 4 - Vzájemné korelace mezi proměnnými Tabulka 5 - Vzájemné korelace mezi proměnnými Tabulka 6 - Srovnání frekvencí výskytu vady spermií vzhledem k typu barvení Tabulka 7 - Souhrnná tabulka porovnání barvících metod
71
13
SEZNAM GRAFŮ
Graf. 1: Porovnání hodnot aktivity spermií mezi hřebci
Graf 2: Porovnání hodnot normospermií a patologicky změněných spermií mezi hřebci Graf 3.: Frekvence výskytu morfologických vad spermií – porovnání hřebců Graf 4.: Porovnání rozdílných frekvencí dle typu barvení Graf 5.: Porovnání frekvencí výskytu vad hlavičky Graf 6.:Porovnání frekvencí výskytu patologií akrozomu Graf 7.: Porovnání frekvence výskytu patologií krčku Graf 8.: Porovnání frekvencí výskytu vadné stavby bičíku Graf 9.: Porovnání frekvence výskytu abnormálně vyvinutých spermií Graf 10.: Porovnání frekvence výskytu nezralých spermií
72
