MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
DIPLOMOVÁ PRÁCE
BRNO 2012
Bc. VIKTORIE PÁRALOVÁ
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Morfologie, fyziologie a genetiky zvířat
Ověření autenticity hovězího masa v rámci systému zpětné dohledatelnosti Diplomová práce
Vedoucí práce: Ing. Libor Stehlík, Ph.D.
Vypracovala: Bc. Viktorie Páralová
Brno 2012
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma Ověření autenticity hovězího masa v rámci systému zpětné dohledatelnosti vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Diplomová práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.
dne ……………………………….……… podpis diplomanta ……………………….
Zpracovaná diplomová práce na téma „Ověření autenticity hovězího masa v rámci systému zpětné dohledatelnosti“ spadá svým řešením do širší problematiky projektu 2B08037 „Biotechnologické metody pro inovace hodnocení zpracovatelské a spotřebitelské kvality hovězího masa jako potravinového zdroje živočišných protenů,“ zadaným ministerstvem školství, mládeže a tělovýchovy, který byl v letech 2008-2011 řešen týmem pracovníků Laboratoře agrogenomiky na Ústavu morfologie, fyziologie a genetiky živočichů Agronomické fakulty Mendelovy univerzity.
PODĚKOVÁNÍ
Děkuji vedoucímu mé diplomové práce, Ing. Liborovi Stehlíkovi, Ph.D. za povzbuzující přístup, permanentní ochotu a otevřené jednání.
Děkuji rodině, zejména mámě, za její trpělivost a podporu.
ABSTRAKT Ověření autenticity hovězího masa v rámci systému zpětné dohledatelnosti
Cílem této diplomové práce bylo popsat současné metody využívané v České republice v oblasti dohledatelnosti původu a ověření autenticity hovězího masa a ověřit jejich funkčnost. Pro tento účel byla vytvořena databáze vzorků hovězího masa. Bylo provedeno ověření původu masa z pohledu spotřebitele a následně byly vzorky podrobeny genetické analýze metodami izolace DNA a genotypování mikrosatelitů. Bylo zjištěno, že informace z oficiálních databází se vzájemně neshodují a že údaje uváděné prodejcem na etiketách nebyly pravdivé. Na základě zjištěných skutečností byla věnována pozornost možným zlepšením systému dohledatelnosti. Jedná se například o převedení veškeré administrativy a dokumentace spojené s chovem skotu a produkcí hovězího masa do výlučně elektronické formy a zřízení genetické banky pro provádění analýz DNA skotu a archivaci jejich výsledků ve speciální databázi.
Verification of the authenticity of beef in the traceability system
The aim of this thesis was to describe the current methodes focused on traceability and authenticity of beef and verify their functioality in Czech republic. For this purpose, a database of samples of beef was created. Origin of meat was verified from a cosumer perspective and then were the samples subjected to genetic analysis methods like DNA isolation and gynotyping of microsatellites. It was found that information from official databases are not similar to each other and that the information written on the labels by seller were not true. Based on this findings were given possible improvements of current traceability system. These includes for example the transfer of all administration and documentation associated with the breeding of cattle and with beef production into the electronic version. Another possible improvement is establishment of genetic bank for cattle DNA analysis and for archiving of their results in a specialised database.
ABSTRAKT .................................................................................................................... 6 1
ÚVOD....................................................................................................................... 9
2
SOUČASNÝ STAV POZNATKŮ ....................................................................... 10 2.1 BEZPEČNOST POTRAVIN V EVROPSKÉ UNII ...................................................................... 10 2.1.1 HACCP..................................................................................................................... 10 2.1.2 RASFF...................................................................................................................... 11 2.1.2.1 Dioxinový skandál v Německu ........................................................................................ 12
2.1.3 Problematika trhu s hovězím masem........................................................................ 14 2.1.3.1 Krize BSE........................................................................................................................ 14 2.1.3.2 Nová opatření jako důsledky krize BSE .......................................................................... 15 2.1.3.3 Elektronická identifikace hovězího dobytka.................................................................... 16
2.2 ZÁKONNÁ OPATŘENÍ V ČESKÉ REPUBLICE SOUVISEJÍCÍ S DOHLEDATELNOSTÍ ................ 18 2.2.1 Značení hovězího dobytka........................................................................................ 18 2.2.2 Značení hovězího masa ............................................................................................ 20 2.3 GENETICKÉ METODY – ANALÝZA DNA ........................................................................... 21 2.3.1 Polymerázová řetězová reakce ................................................................................. 23 2.3.1.1 Složení reakční směsi...................................................................................................... 24 2.3.1.2 Průběh reakce................................................................................................................. 24 2.3.1.3 Vyhodnocení PCR – elektroforéza .................................................................................. 26 2.3.1.4 Modifikace PCR.............................................................................................................. 26
2.3.2 Fragmentační analýza............................................................................................... 29 2.3.2.1 Průběh reakce................................................................................................................. 30 2.3.2.2 Vyhodnocení fragmentační analýzy - kapilárová elektroforéza ..................................... 30
3
CÍLE PRÁCE........................................................................................................ 31
4
METODIKA.......................................................................................................... 32 4.1 OVĚŘENÍ PŮVODU MASA Z POHLEDU ZÁKAZNÍKA ........................................................... 35 4.2 OVĚŘENÍ AUTENTICITY MASA GENETICKÝMI METODAMI ................................................ 35 4.2.1 Izolace DNA z tkáně ................................................................................................ 35 4.2.1.1 Postup izolace DNA........................................................................................................ 36
4.2.2 Genotypování 18 mikrosatelitů ................................................................................ 37 4.2.2.1 PCR ................................................................................................................................ 37 4.2.2.2 Fragmentační analýza .................................................................................................... 38
4.2.3 Genotypování mikrosatelitů pro determinaci pohlaví .............................................. 38
4.2.3.1 PCR ................................................................................................................................ 39 4.2.3.2 Fragmentační analýza .................................................................................................... 40
5
VÝSLEDKY .......................................................................................................... 40 5.1 VEŘEJNĚ DOSTUPNÉ INFORMACE ..................................................................................... 40 5.2 VÝSLEDKY IZOLACE DNA ............................................................................................... 41 5.3 VÝSLEDKY GENOTYPOVÁNÍ 18 MIKROSATELITŮ ............................................................. 42 5.3.1 Vysvětlivky ............................................................................................................... 43 5.3.2 Shrnutí ...................................................................................................................... 44 5.4 VÝSLEDKY GENOTYPOVÁNÍ MIKROSATELITŮ PRO DETERMINACI POHLAVÍ .................... 44
6
DISKUSE............................................................................................................... 45 6.1 VEŘEJNĚ DOSTUPNÉ INFORMACE ..................................................................................... 46 6.2 GENOTYPOVÁNÍ MIKROSATELITŮ .................................................................................... 47 6.3 NÁVRHY NA ZLEPŠENÍ SYSTÉMU DOHLEDATELNOSTI ...................................................... 50 6.3.1 Elektronická evidence .............................................................................................. 51 6.3.2 Genetická banka ....................................................................................................... 53 6.3.2.1 Podmínky pro zřízení genetické banky............................................................................ 54 6.3.2.2 Začlenění genetické banky do systému Evropské unie.................................................... 58
7
ZÁVĚR .................................................................................................................. 59
POUŽITÁ LITERATURA........................................................................................... 61
1
ÚVOD Situace na trhu s masem se v České republice mění jen velmi pomalu. Klesající
stavy chovaných masných zvířat a trvale se snižující počet podnikatelů v tomto oboru, jsou důsledkem nedostatečné podpory domácích zemědělců ze strany státu. Zastoupení masa a masných výrobků českého původu se tak na domácím trhu neustále snižuje. Není to však dáno preferencemi koncových spotřebitelů, ale zejména možností velkých prodejců, jako jsou nákupní řetězce a velkovýrobci, dovážet maso ve velkém objemu levněji z jiných zemí. Konkrétně u hovězího masa to není dáno pouze nižší výrobní cenou, ale také tím, že řada nadnárodních řetězců má v daných zemích hlavní zpracovatelské kapacity svých značek, což jim značně snižuje náklady na výrobu. Převážná většina k nám dovezeného masa pochází z takových závodů. Podíl českého hovězího masa na tuzemském trhu klesl již v roce 2009 pod 50 %. Hlavními konkurenty českých producentů jsou z evropských zemí především Polsko, Irsko, Německo a Rakousko. Z toho, že se jedná převážně o země s vysokou životní úrovní, v mnoha ohledech vyšší než v České republice, je patrné, že zde funguje lépe systém finančních pobídek a podpory nejen ze strany domácích vlád, ale lepší je i využívání dotačních možností, které nabízí svým členským státům Evropská unie. Paradoxně se na rozdíl od vývoje na poli chovatelském ubírají změny u spotřebitelů opačným směrem. Zájem o hovězí maso pomalu vzrůstá, konzumenti jej vyhledávají více jak v restauračních zařízeních, tak v řeznictvích a obchodních řetězcích. Strach z nemoci šílených krav ustupuje, lidé začínají věřit producentům a prodejcům také díky propagaci a informování v oblasti dohledatelnosti původu masa. Prioritou odpovídajících státních orgánů by tak vzhledem k tomuto trendu měla být podpora domácí produkce oproti importu. Nezbytnou součástí této podpory je i pokračující osvěta veřejnosti zacílená na informování o systémech kontroly bezpečnosti masa a jeho zpětné dohledatelnosti, které musí tuzemští chovatelé používat a o následné kontrole dodržování těchto zákonných pravidel příslušnými úřady České republiky. Jedině tak bude mít koncový spotřebitel dostatek informací, aby začal cíleně upřednostňovat hovězí maso od domácích producentů. 9
2
SOUČASNÝ STAV POZNATKŮ
2.1 Bezpečnost potravin v Evropské unii Problematikou bezpečnosti potravin, které se vyskytují na evropském trhu, se Unie zabývá dlouhodobě. Ochrana zdraví lidí je jednou z priorit. Jako člen Evropské unie je Česká republika zavázána k dodržování evropských zákonů a nařízení. V rámci potravinového práva vydala Evropská komise v lednu roku 2000 tzv. Bílou knihu. Jedná se o soubor dokumentů stanovujících pravidla pro zdravotní nezávadnost veškerých potravin vyskytujících se na trhu Evropské unie. Tato nařízení platí jak pro potraviny domácí produkce, tak pro produkty dovážené ze třetích zemí. Popisují pravidla pro celý proces výroby, počínaje pěstováním plodin či chovem zvířat, tedy prvovýrobou, přes zpracování surovin, výrobu, balení a přepravu až po cestu výrobku ke koncovému spotřebiteli. I když je pro unijní trh vytvořen tzv. Systém rychlého varování, řešící případné krizové situace v oblasti nezávadnosti potravin, každý vzniklý předpis potravinového práva vychází z principu předběžné opatrnosti, tedy prevence rizika.
2.1.1 HACCP
V podmínkách Evropské unie je hlavním nástrojem prevence ohrožení zdraví lidí a zvířat tzv. Systém analýzy rizika a stanovení kritických kontrolních bodů (Hazard Analysis and Critical Control Point, HACCP). Jeho dodržování je vyžadováno od roku 2004, kdy byl zaveden, u všech potravinářských podniků a všech podniků jakkoliv vstupujících do potravinového řetězce. HACCP je založen na sedmi základních principech: − analýza nebezpečí – rizika, kterým je třeba předcházet, eliminovat je nebo stanovit jejich maximální povolenou úroveň; − určení kritických kontrolních bodů – pro každý zpracovatelský, výrobní 10
nebo jiný postup v potravinovém řetězci; − stanovení kritických mezí – limity, jejichž překročení již nelze akceptovat; − monitoring – kontrolní postupy pro jednotlivé kritické body; − stanovení nápravných opatření – pro případ, kdy bude prokázáno nedodržení některého z kritických bodů pod kontrolou; − ověřovací postupy – pro pravidelně se opakující kontrolu funkčnosti výše zmíněných opatření; − vedení příslušné dokumentace – odpovídající druhu a velikosti podniku pro zpětné dohledání dodržování zásad HACCP.
2.1.2 RASFF
Pro případy, kdy je zjištěno, že systém HACCP selhal, funguje na evropském trhu tzv. Systém rychlého varování pro potraviny a krmiva (Rapid Alert System for Food and Feed, RASFF). Byl zřízen v roce 2002 společně s Evropským úřadem pro bezpečnost potravin. Členy systému jsou členské státy Evropské unie a Evropského sdružení volného obchodu (European Free Trade Association, EFTA) vyjma Švýcarska, které není součástí evropského hospodářského prostoru. V případě, že má některý z členských států informaci o přímém či nepřímém zdravotním riziku, jež by mohlo ohrozit lidské zdraví, předá ji prostřednictvím Systému Evropské komisi. Komise vyhodnotí reálnost rizika a vydá podle toho příslušné oznámení. Dle vyhodnocení jsou to: − Varování (RASFF Alert) - v případě závažného rizika vyžadujícího rychlé jednání v dané věci, neboť potraviny či krmiva jsou na trhu nabízena spotřebitelům. − Informace (RASFF Information) - u nezávažných rizik nebo v případě, kdy již závadné potraviny či krmiva nejsou na trhu k dispozici a tudíž není rychlá reakce členských zemí potřebná. − Odmítnutí na hranicích (RASFF Border rejection) - oznámení pro členské země o potravinách nebo krmivech, které byly po otestování odmítnuty na hranicích 11
evropského hospodářského prostoru pro nesplnění některého z kritérií pro dovoz. − Novinky (RASFF News) - informují příslušné kontrolní orgány o zjištěních, které nejsou sdělovány žádnou z předchozích forem, ale jsou považovány za důležité pro fungování Systému.
Od členských zemí je vyžadována zpětná vazba, tedy okamžité informování Komise o opatřeních přijatých na základě údajů a informací obdržených v rámci Systému rychlého varování. RASFF byl v České republice legislativně upraven roku 2005. Příslušným pověřeným orgánem je Státní zemědělská a potravinová inspekce, která jako Národní kontaktní místo shromažďuje hlášení o možných rizicích od domácích dozorových orgánů a po jejich vyhodnocení odesílá informace o závadných výrobcích Evropské komisi k dalšímu posouzení. Při potvrzení rizika jsou o něm informovány všechny členské státy. Stejně tak je i Česká republika seznámena s každým kontrolním zjištěním z ostatních členských zemí.
2.1.2.1 Dioxinový skandál v Německu
I přes značnou propracovanost má RASFF celou řadu slabých míst. V současnosti, kdy nejsou veškeré databáze a registry vedeny od počátku do konce výrobního a prodejního procesu čistě v elektronické formě, je jedním z nich bezesporu i lidský faktor. Nejedná se pouze o určitou chybovost, ale také o časový odstup mezi získáním informací a jejich zanesením do elektronické evidence, kde jsou přístupny na nadnárodní úrovni. Tyto nedostatky se ve značné míře projevily ke konci roku 2010 během tzv. Dioxinového skandálu v Německu. Informace o výskytu rakovinotvorných dioxinů v krmivu pro hospodářská zvířata se v Systému rychlého varování objevila se zpožděním několika týdnů. Později vyšlo najevo, že pouze zpracování prvních odebraných 12
vzorků z počátku prosince trvalo měsíc. Jakmile byly vyhodnoceny a zveřejněny, skandál propukl naplno. Přitom zásilky kontaminovaných krmiv mířící například i do České republiky stáhly a zlikvidovaly německé úřady v průběhu prosince 2010 v naprosté tichosti, aniž by informovaly Evropskou komisi o zjištěném riziku. Poté, co vyšla počátkem ledna 2011 kontaminace najevo a objevilo se varování v RASFF, Evropská komise nedokázala zajistit dostatečné přezkoumání vzorků a nevydala ani souhrnné nařízení pro členské státy, jak postupovat v případě dováženého masa či krmiv z Německa. Jednotlivé země reagovaly nejednotně, podle toho, jak byla postupně zveřejňována rozsáhlost celého dioxinového skandálu. Během celého prosince a ledna byly uzavírány podezřelé výrobny krmiv a kontaminované chovy drůbeže, prasat i skotu v Německu a následně dohledávány kontaminované zásilky z těchto chovů po celé Evropě i mimo ni. Kromě selhání RASFF došlo v České republice i na kritiku tuzemských odpovědných orgánů, které nedokázaly zanalyzovat dostatečné množství vzorků a informovat veřejnost o hrozícím riziku, neboť o něm samy nezískaly dostatek informací a pokud již nějaké informace měly, nezvládly je zpracovat a předat veřejnosti odpovídajícím způsobem. Například varování o podezření, že se část krmných tuků kontaminovaných dioxiny dostala do České republiky a Polska, které se objevilo v systému RASFF koncem ledna 2011 se dostalo k příslušným českým úřadům až po týdnu od zveřejnění Evropskou komisí. Malé množství vzorků a špatná komunikace s německou stranou vedly k tomu, že většina kontaminovaných zásilek nebyla zachycena včas a velké množství produktů se zvýšeným obsahem dioxinů se dostalo na trh. Dioxinový skandál prověřil Systém rychlého varování a poukázal na jeho nedostatky. Je zřejmé, že pokud by veškerá dokumentace byla vedena elektronicky, nebylo by možné v tichosti odstranit podezřelé zásilky jako se to podařilo německým úřadům, které se tak pokusily kontaminaci dioxiny zatajit, aby neohrozily domácí export. Na takřka měsíc se jim to podařilo, což ale vedlo pouze k tomu, že celá aféra narostla do ohromných rozměrů, které donutily Evropskou unii podpořit intervenčními sklady trh s vepřovým masem, který se kvůli dioxinům dostal do velké krize.
13
2.1.3 Problematika trhu s hovězím masem
Na Evropském trhu s hovězím masem se zásadní měrou podepsaly zejména opakované krize BSE a následná nedůvěra konzumentů v bezpečnost hovězího masa z evropských chovů.
2.1.3.1 Krize BSE
Vlny nákazy bovinní spongiformní encefalopatie se objevovaly v Evropě již od roku 1986, kdy byla u skotu zjištěna poprvé. Nejsilněji však trh zasáhly ty, které prošly Evropou v roce 1996 a poté znovu i když v měnší míře, na přelomu tisíciletí. Události s nimi spojené velkou měrou ovlivnily politiku Společenství v oblasti hovězího masa. Bylo to dáno nejen nebezpečím spočívajícím v samotné BSE, ale také reakcí spotřebitelů na její výskyt. Odezva na četné pozitivní nálezy BSE nebyla dostatečně rychlá. Lokalizace ohniska nákazy a jejího zdroje trvala nepřiměřeně dlouhou dobu, během které se BSE šířila dále do Evropy. Tato skutečnost měla negativní dopad na vývoz hovězího masa a dobytka mimo Unii. Částečně také z důvodu nedostatečné informovanosti laické veřejnosti o BSE došlo k nárazovému propadu poptávky po hovězím mase u koncových spotřebitelů, v mnoha státech jako Německo či Francie až o desítky procent. Unie byla nucena vykupovat hovězí maso od producentů po statisících tun, aby alespoň částečně pokryla jejich ztráty. Vykoupené maso pak bylo po dlouhou dobu uskladněno bez odbytiště anebo bylo zlikvidováno v kafileriích. Krize BSE postihla během svého trvání existenčně až jednu čtvrtinu evropských farem. Jejich podpora spočívající ve výkupu masa však nebyla jediným finančním nákladem, kterým BSE zatížila Společenství. Jako původní zdroj nemoci byla po důkladných laboratorních šetřeních stanovena masokostní moučka, která byla zkrmována dobytkem a která obsahovala infekční složky z ovcí nemocných klusavkou. Tento důkaz byl získán již po prvním zjištění výskytu 14
BSE u skotu v roce 1986. V roce 1994 pak došlo k celounijnímu zákazu zkrmování masokostních a kostních mouček z přežvýkavců. Značný časový skluz mezi prokázáním zdroje nákazy a přijetím opatření na úrovni Společenství byl způsoben složitým vyjednáváním, kdy se jednotlivé členské státy nemohly dohodnout na podmínkách opatření. Paradoxně tak byla Česká republika mezi prvními, kdo zákaz zkrmování mouček přijal a to již v roce 1991. Zkrmování masokostních mouček bylo pro chovatele hovězího dobytka dlouhodobě výhodné, neboť krmné směsi s masokostní moučkou byly cenově výhodnější než bílkovinná krmiva rostlinného původu a výrobní průmysl se v této oblasti dobře rozvíjel. Další náklady spojené s BSE tak přineslo právě přijetí jejich zákazu. Evropská unie byla nucena vykupovat a likvidovat v kafileriích již vyrobenou masokostní moučku a veškeré krmné směsi, které ji obsahovaly. Kromě toho bylo třeba odškodnit výrobce bílkovinných krmiv, kteří ji využívali a podpořit producenty bílkovinných směsí rostlinného původu tak, aby nevznikl na trhu nedostatek těchto krmiv.
2.1.3.2 Nová opatření jako důsledky krize BSE
Neméně podstatné byly také finance vynaložené na nové systémy pro prevenci a kontrolu výskytu zmíněných onemocnění, BSE a klusavky. V roce 2007 byla Radou Evrospké unie zavedena nová pravidla pro trvalou identifikaci každého kusu hovězího dobytka a to od narození až do smrti. Identifikace spočívá ve dvou identických ušních značkách, důkladné evidenci vedené na každém hospodářství, průvodních listech pro každé zvíře - takzvaných pasech a ve vedení specializované počítačové databáze na národní úrovni. V roce 2001 pak Unie vydala nařízení zavádějící celoroční monitoring BSE a klusavky. Ukládá povinné odebírání a testování tkáně skotu staršího 24 měsíců při nucené porážce a nad 30 měsíců věku při běžné porážce pro lidskou spotřebu. Rizikový materiál z jatečných těl je vždy likvidován na moučku v kafilériích a poté spálen. Toto nařízení je závazné pro všechny členské státy. Jedinou výjimku si vyjednalo Švéd15
sko, které tak smí provádět kontrolní testy pouze namátkově, ne tedy u všech poražených zvířat. Ročně však musí provést deset tisíc takových testů. V nařízení bylo dále zakázáno krmení přežvýkavců bílkovinami získanými z jakýchkoliv savců, čímž byl rozšířen zákaz používání masokostních a kostních mouček z roku 1994. Krize vyvolaná BSE tak vedla ke změně evropského pojetí a filosofie společné zemědělské politiky zejména v oblasti hovězího masa. V posledních letech se jeho spotřeba zvýšila na relativně normální úroveň, jaká byla před krizí. V roce 2003 přesáhla v Evropské unii poptávka nabídku poprvé za 20 let. Souvisí to zejména s faktem, že i přes snahu chovatelů masného skotu prosadit se na trhu, stále ještě pochází dvě třetiny produkce z vyřazených kusů mléčného skotu. Na rozdíl od jen pomalu narůstajících počtů stád masného skotu se stavy dojnic v Evropě prudce snižují kvůli kvótám v mlékárénském průmyslu. S nimi se pak logicky snižuje i domácí produkce hovězího masa. Relativně stálá poptávka ze strany spotřebitelů a nedostatečná nabídka tak udržují relativně vysokou cenu této komodity, což láká mimoevropské dovozce. Společenství se snaží upravit zahraniční politiku a usnadnit nejen vývoz hovězího masa svým producentům, ale i dovoz z ostatních zemí. Zejména Jižní Amerika je významným producentem hovězího masa, ale její výrobci se dlouhodobě potýkají s problémy při dokládání dodržování pravidel Unie právě v oblasti dohledatelnosti původu masa.
2.1.3.3 Elektronická identifikace hovězího dobytka
Dalším krokem ve zdokonalení kontroly bezpečnosti a dohledatelnosti původu hovězího masa by mělo být zavedení elektronické identifikace skotu. Za cíl má nejen snížení administrativní zátěže subjektům, které se účastní výroby hovězího masa a produktů z něj, na všech výrobních stupních. Dalším dopadem by měla být možnost propojení elektronických databází na nadnárodní úrovni. V dnešní době je veškerý pohyb zvířat zaznamenáván v papírové formě a až následně převáděn do počítačové databáze. To přináší určité zpoždění, které by mohlo při pátrání po původu zdravotního nebezpečí způsobit problémy. Díky elektronické identifikaci bude pohyb zvířat sledovatelný 16
takřka v reálném čase. Systém elektronického značení je dnes používán v Evropě u ovcí, koz, koní, oslů a z domácích zvířat u psů, koček a fretek. Nově schválená identifikace se bude týkat skotu, vodních buvolů a bizonů. Návrh byl přijat Evropskou komisí v srpnu roku 2011 a předložen Evropskému parlamentu a Evropské radě. Nyní závisí na těchto dvou institucích, jak rychle se dokážou domluvit na podmínkách a uvedou návrh v platnost. Přestože v některých členských zemích je již elektronická identifikace využívána, je to ve většině případů pouze iniciativa konkrétních farem, jak si zjednodušit vedení vnitřní evidence. V první fázi po schválení zavedení na unijní úrovni se počítá s dobrovolnou aplikací, nikoliv s povinností toto vylepšení používat. Nicméně již v návrhu předloženém Komisí je ponechán prostor pro povinné zavedení metody do praxe pro všechny členské země. Z toho vyplývá, že si každý stát může zvolit, zda bude v jeho podmínkách tento způsob identifikace dobrovolný nebo povinný pro všechny hospodářské subjekty. Lze také předpokládat, že bude předložen dlouhodobý výhled a určen rok, od kterého bude značkování s elektronickými paměťovými prvky povinné a do té doby bude na každém členském státě a hospodářském subjektu zda bude či nebude systém využívat. Stejný postup byl zvolen například u zavádění obohacených klecí v klecových chovech nosnic. Bylo by nicméně vhodné včas podchytit možný skluz v zavádění nové technologie, aby nenastala podobná krize, jako je v současné době na trhu s vejci a produkty z nich.
17
2.2 Zákonná opatření v České republice související s dohledatelností
Systém zpětné dohledatelnosti je v České republice nejpropracovanější právě u hovězího masa, neboť povinnost umožnit vysledování jeho původu až k chovateli, u kterého se zvíře narodilo, je v naší zemi dána zákonem. Toto opatření má za cíl umožnit rychlé dohledání původu konkrétního zvířete či masa a to zejména při zjištění závadnosti masa či infekčnosti zvířete. Rychlým zásahem je pak možno zajistit nakažený chov nebo zpracovatelský závod, ve kterém se nákaza objevila a tím zabránit ohrožení zdraví lidí a ostatních zvířat. Veškeré právní úpravy této problematiky vychází z předpisů a nařízení Evropské unie a jsou tedy v souladu s její legislativou. Monitorováním bezpečnosti potravin a tudíž i zdravotního stavu obyvatelstva se společně zabývá Ministerstvo zemědělství, Ministerstvo životního prostředí a Ministerstvo zdravotnictví, neboť problematika zasahuje do více oblastí. Z tohoto důvodu je v naší zemi také více dozorujících státních orgánů. Jedná se o Státní zemědělskou a potravinářskou inspekci, Státní veterinární správu a příslušné orgány zajišťující ochranu veřejného zdraví. Tyto organizace kontrolují z pověření nadřízené instituce dodržování příslušných právních předpisů. Pro označování zvířat a potravin jsou to Zákon o potravinách a tabákových výrobcích, Plemenářský zákon a také Zákon veterinární.
2.2.1 Značení hovězího dobytka
Každé tele narozené v České republice musí být do 72 hodin po porodu označkováno dvěma ušními známkami. Tyto jsou zcela identické a nesou číselný kód unikátní pro každé označované zvíře. Kód sestává z čísel udávajících zemi původu, specifické 18
registrační číslo hospodářství, tedy přesné místo narození telete, včetně číselného označení kraje a číslice odlišující pohlaví jedince. Pro jalovici je to číslo 9 a pro býka 0 psané na sedmém místě kódu. Ušní známka dále nese kód Ministerstva zemědělství jako příslušného odpovědného úřadu. Po označení je zvíře pod svým identifikačním číslem zavedeno do ústřední evidence hospodářských zvířat a farmového chovu. Tato evidence je vedena pověřenou organizací. V České republice je to Českomoravská společnost chovatelů, a.s. (ČMSCH), která vydává na žádost chovatelů identifikační čísla pro zvířata a po zanesení do registru vystavuje průvodní listy skotu. V nich je uvedeno místo narození a pohyb zvířete jako je například převoz nebo změna majitele. Dále je uváděna totožnost zvířete společně s údaji, které jsou potřebné v rámci příslušných šlechtitelských programů, pokud je do nich zvíře zařazeno. Chovatel registrovaného zvířete je pak povinen po celý život zvířete tyto listy udržovat aktuální, hlásit případné změny a po úmrtí zvířete je vrátit svazu. Kromě státní centrální databáze vedené Českomoravskou společností chovatelů a.s., ukládá zákon každému chovateli skotu vést vlastní registr. Ten musí obsahovat běžné údaje, jako jsou druh a počet chovaných zvířat, jejich pohlaví a identifikační číselné kódy. Dále musí zaznamenat každý přesun zvířete. K převozu zvířete je navíc potřeba mít vystavené osvědčení k přemístění, tedy souhlas příslušné veterinární správy a ten uchovat v databázi po dobu tří let. V registru chovatele jsou dále povinné záznamy o provedených očkováních, podávaných medikamentech a veterinárních léčivech, které zvíře užívalo a jejichž rezidua by mohla mít vliv na kvalitu výsledných živočišných produktů z tohoto zvířete. Za chovatele je považován každý, kdo drží skot k jakémukoliv účelu. Již od jednoho kusu je zákonem dána povinnost se registrovat u ČMSCH a.s. a vést příslušnou evidenci. Označovací povinnost přebírá po přijetí zvířete na jatka provozovatel tohoto závodu. Každý kus musí být označen nezaměnitelným způsobem pro umožnění identifikace jatečného těla pro účely veterinární prohlídky.
19
2.2.2 Značení hovězího masa
Značení hovězího masa a produktů z něj má také svá zákonná nařízení a pravidla. Povinně uváděné údaje musí být pro domácí spotřebitele v češtině, umístěné na dobře viditelném místě, dobře čitelné a psané srozumitelně. Informace nesmí být nijak překryta, přelepena ani přerušena a nesmí být možné ji jakkoliv smazat. Podle těchto pravidel musí být na etiketě výrobku při jeho uvádění na trh vyznačena kategorie skotu, nezaměnitelný identifikační číselný kód zvířete, identifikační číslo jatek, na kterých bylo zvíře poraženo včetně označení pro zemi, ve které porážka proběhla. Dále čísla vyjadřující bourárnu, opět včetně kódu země, kde bourání jatečného těla proběhlo. V případě, že se jedná o maso nebo masné výrobky importované na český trh z jiné země, je pro tuzemské spotřebitele vyžadováno uvedení číselných kódů představujících zemi, ve které se zvíře narodilo, kde bylo vykrmeno a kde byla provedena porážka. Taktéž jsou povinné údaje o posledním majiteli a přesné datum porážky konkrétního kusu. U pultového prodeje hovězího či telecího masa musí být veškeré tyto údaje umístěny viditelně, nebo jinak zákazníkovi k dispozici, pokud není jejich umístění přímo na mase možné. Podle těchto kódů je spotřebitel schopen si v centrální databázi ČMSCH a.s. vyhledat původ a plemeno zvířete, ze kterého pochází jím zakoupené maso či masný výrobek. Uvádění plemenné příslušnosti či případně zastoupení jednotlivých plemen v procentech u kříženců není přímo na výrobku našimi zákony vyžadováno. Přesto se s těmito údaji můžeme na etiketách setkat a to zejména u nadnárodních prodejních řetězců, které působí ve více evropských zemích, z nichž alespoň jedna tyto informace na výrobcích požaduje.
20
2.3 Genetické metody – analýza DNA
V poslední době se metody analýzy DNA rozmáhají nejen v souvislosti s chovem zvířat, ale také ve spojitosti s genetikou člověka. Rozbor DNA je využíván v archeologii při badatelských výzkumech, v soudním lékařství pro určování totožnosti, rodičovství a podobně. Forenzní genetika je dnes již běžnou součástí vyšetřovacích postupů při objasňování trestných činů. Analýza genetické informace vnesla nové možnosti do kontroly průběhu prenatálního vývoje člověka, odhaluje vrozené genetické vady a jiné anomálie ve vývinu plodu. Další využití v lékařství představují identifikace patogenů, onkogenů, analýzy nádorů, rozbory před transplantacemi a další. Rychlé anonymní testy otcovství jsou hitem nedávno uplynulých let a v současnosti jsou i díky tomuto komerčnímu využití příslušné postupy neustále zdokonalovány a zrychlovány. I chovatelé tak mají k dispozici poměrně snadný a oproti minulosti i relativně levný způsob, jak ověřit původ svých zvířat. Nejvíce jsou rozbory genetické informace využívány u hodnotných plemenných jedinců a jejich potomků aby byl potvrzen nebo vyvrácen uváděný původ a rodokmen zvířete před zařazením do plemenitby. Genetické metody výrazně zkracují generační interval ve šlechtění zvířat, neboť je možné ověřit si užitkové vlastnosti zvířete pomocí analýzy DNA dlouho předtím, než dospěje a je zařazeno do chovu, nebo než se mohou sledované ukazatele projevit na jeho potomcích. Další využití genetických metod spočívá v sexování embryí, odhalování geneticky mo21
difikovaných organismů a stále častěji i u dohledatelnosti původu potravin.
Při ověřování původu hovězího masa se informace získané analýzou DNA běžně nevyužívají. Jediným státem, který zákonem ustanovil povinnost odebírat vzorky DNA u všech poražených zvířat je Japonsko. „Zákon pro sledovatelnost skotu“ tam platí od roku 2003. Vzorky tkáně jsou odebrány těsně po porážce každému kusu hovězího dobytka, který pochází z domácí produkce. Od narození je zvíře registrováno pod unikátním čárovým kódem v elektronickém registru. Veškeré přesuny a další doplňující informace jsou oznamovány do registru také pouze elektronicky, což značně urychluje aktualizování informací. Po odebrání DNA je tento vzorek přiřazen k čárovému kódu zvířete, čímž je propojen předchozí život zvířete s masem, které z něj pochází. Do registru jsou zaznamenáni jak všichni chovatelé, kteří měli zvíře v držení, tak příslušná jatka, bourárna, velkoobchod či maloobchod hovězím masem, dodavatel potravin a případně i stravovací zařízení. Čárový kód je uveden na všech produktech ze zvířete a konzument si tak může v registru zjistit veškeré informace od narození zvířete po koncový prodej. Další možností je porovnání DNA odebraného u koncového prodejce, tedy například i v restauraci, se vzorkem v databázi. Takto propracovaný systém umožňuje takřka okamžité vyhledání zdroje nákazy, pokud by byl potvrzen například výskyt BSE, neboť testy DNA odkáží vyšetřovatele přes elektronický registr přímo na konkrétní provozy, kterými zvíře za svůj život prošlo. I v jiných státech však již existují oficiálně schválené postupy ověřování původu hovězího masa pomocí DNA. Zatím však pouze v komerční sféře, kdy firmy nabízí svoje programy na dohledatelnost a je na producentech a zpracovatelích, zda se rozhodnou do nich investovat a nabídnout tak svým zákazníkům záruku původu svých výrobků. Například se jedná o systém pro sledování původu hovězího a vepřového masa na základě analýzy DNA s názvem „DNA TraceBack®“ irské firmy IdentiGEN. Tento komerční systém byl zaveden v Evropě již v roce 2000. V dnešní době proniká úspěšně na severoamerický kontinent, do Spojených států amerických a do Kanady. Americké ministerstvo zemědělství jej schválilo v roce 2007 jako vládními organizacemi ověřený proces, což firmě usnadňuje získávání zakázek pro tento projekt. Celý systém je založen 22
na logickém principu, že maloobchodníci, zpracovatelé masa a poskytovatelé různých potravinářských služeb chtějí uspokojit poptávku svých zákazníků po možnosti ověřit si, že produkt, který kupují má skutečně ten daný původ, který je při jeho prodeji uváděn. Zavedení systému do provozu pak vyžaduje pouze několik úprav v používaných postupech zpracování a manipulace s masem. Po následném spuštění systému mohou zpracovatelé deklarovat svým odběratelům původ nabízeného masa a ti si mohou tyto informace snadno ověřit. Zkušenosti ukazují, že po různých krizích vyvolaných BSE či aférami s dioxiny dávají zákazníci přednost masu se zaručeným původem.
V Evropské unii jsou dle příslušných zákonů vzorky DNA odebírány u vyváženého hovězího masa, pokud si vývozce nárokuje vývozní náhrady. Tyto finanční kompenzace slouží k pokrytí případného rozdílu mezi cenami na domácím a zahraničním trhu a přispívají tak k podpoře exportu. Metody odběru definuje Nařízení Komise (ES) č.765/2002 „o odběru vzorků a přijetí některých pravidel v souvislosti s fyzickou kontrolou vykostěných kusů hovězího masa, pro které jsou poskytovány vývozní náhrady“. Analýza DNA pak zde slouží k potvrzení původu masa, neboť náhrady jsou přiznávány pouze u toho hovězího masa, které je vykostěné a splňuje stanovený minimální obsah libového masa a dále jen u masa, které pochází z dospělého zvířete samčího pohlaví.
2.3.1 Polymerázová řetězová reakce
Polymerase chain reaction (PCR) je metoda založena na replikaci nukleových kyselin, což vede k rychlému namnožení požadovaného úseku DNA. Byla objevena v roce 1983 Kary Mullisem, který za ni o 10 let později obdržel Nobelovu cenu za chemii. Do jejího objevení bylo možné namnožit úsek DNA pouze jeho vložením do bakteriálního plasmidu a jeho následným klonováním. Během PCR probíhá namnožení zcela in vitro, podstatně rychleji a v nesrovnatelně větším měřítku. V současnosti je to nejpoužívanější metoda analýzy DNA díky své vysoké specifičnosti a rychlosti, se kterou 23
k požadovanému namnožení genetického materiálu dochází.
2.3.1.1 Složení reakční směsi
Reakční směs obsahuje templát DNA, tedy vzorek DNA, kterou chceme amplifikovat, namnožit. Vzorek nemusí být nijak velký, pro reakci stačí i malé množství nukleové kyseliny. Nesmí však být kontaminován jinou DNA, například během manipulace či přípravy reakční směsi, protože by mohlo dojít i k namnožení této cizí genetické informace a tím k znehodnocení výsledku. K templátu je přidána Taq polymeráza, enzym katalyzující celou reakci. Dalšími reaktanty jsou pufr a Mg2+, které tvoří iontové prostředí vhodné pro činnost katalyzátoru. Přimícháním směsi deoxynukleitidtrifosfátů s obsahem adeninu, guaninu, thyminu a cytosinu získáme stavební prvky pro vznikající nové vlákno DNA. Posledními z reaktantů jsou dva specifické primery, které ohraničí amplifikované vlákno tím, že od jednoho z nich započne a u druhého skončí syntéza komplementárního vlákna. Všechny vložené složky je třeba důkladně promíchat, ale tak, aby co nejméně směsi ulpělo na stěnách zkumavky.
2.3.1.2 Průběh reakce
Namnožení DNA probíhá v několikrát se opakujících cyklech ve speciálním přístroji, termálním cykléru. Během každého opakování celého cyklu se množství DNA ve zkumavce zdvojnásobí. Cyklus má tři základní fáze:
1. Denaturace, během které je reakční směs zahřáta na 95 °C, díky čemuž dojde k rozpadu vodíkových můstků a následně k oddělení vláken dvoušroubovice DNA od sebe. Během prvního cyklu se tak stane u dvoušroubovice 24
původní DNA z templátu. Jedná se o tzv. úvodní denaturaci, která trvá dvě minuty. V dalších cyklech se takto oddělují i vlákna již nově namnožené, amplifikované DNA a denaturace trvá v každém cyklu 20 sekund.
2. Annealing, neboli dosednutí primeru, je fází, během které nasedají oba primery na svou komplementární část DNA a tím označují počátek a konec amplifikace. Teplota v cykléru se pohybuje okolo 60 °C a musí přesně odpovídat teplotě, za které zvolený primer hybridizuje, tedy je schopen se navázat na vlákno DNA. Čas annealingu v každém cyklu je vymezen na 30 sekund.
3. Elongace je fází, kdy teplota 75 °C aktivuje Taq polymerázu, enzym, který katalyzuje připojování bází na primery, čímž vzniká nový řetězec komplementární s templátem. Každá elongace probíhá po dobu 45 sekund. Reakční složky ve směsi se postupně vyčerpávají, takže se množství amplifikovaných řetězců snižuje. K dosyntetizování řetězců pak na konci reakce slouží tzv. závěrečná elongace, kdy je teplota 72 °C udržována po dobu pěti minut a během které jsou vyčerpány reakční složky a získáno maximum DNA, které lze z reakce získat.
Reakce tedy začíná úvodní denaturací. Poté se cyklus denaturace, annealingu a elongace, tedy hlavních fází, opakuje přibližně 30krát. Délky trvání jednotlivých fází je možné přizpůsobovat například podle typu použitých primerů nebo podle požadavků na výsledný produkt. Po maximálním vyčerpání reaktantů během závěrečné elongace je třeba zchladit reakční směs a udržovat její teplotu na 10 °C po dobu dvanácti hodin, čímž dojde k deaktivaci polymerázy a k úplnému přerušení polymeračních reakcí. Pokud je výsledný produkt ihned používán v dalších postupech, je možné přerušit polymerační reakce také prudkým zchlazením uložením směsi na ledu ihned po doběhnutí poslední elongace v termocykléru.
25
2.3.1.3 Vyhodnocení PCR – elektroforéza
Vyhodnocení úspěšnosti polymerázové řetězové reakce lze provést elektroforézou pomocí speciálního agarózového nebo akrylamidového gelu. Princip této metody je založen na detekci výsledného produktu za využití záporného náboje DNA, kdy po zapnutí elektrického proudu putuje DNA gelem od záporné elektrody ke kladné. Hustota gelu zapříčiní, že kratší molekuly prochází gelem snadněji a dostanou se tedy ke kladné elektrodě blíže, než dlouhé molekuly DNA. Pokud během reakce nasedly primery na správné místo, vznikly v každém cyklu molekuly DNA o stejné délce a sekvenci. Ty pak budou v gelu po spuštění elektroforézy putovat stejnou rychlostí a vytvoří pouze jeden pruh. Pokud nasedaly primery na nesprávných nebo na více místech, oddělí se různě dlouhé molekuly od sebe a budou gelem putovat různou rychlostí, což poznáme na výsledné fotografii podle více pruhů. Pokud reakce z nějakého důvodu neproběhla a produkt nevznikl, nebude na fotografii žádný patrný proužek molekul.
2.3.1.4 Modifikace PCR
Výzkum v oblasti analýzy DNA jde neustále kupředu a stejně tak se vyvíjí i postupy u polymerázové řetězové reakce. Každá vzniklá modifikace slouží k usnadnění průběhu této reakce za konkrétních laboratorních podmínek, které mohou nastat a při nichž by tradiční PCR metoda mohla mít nějaké nedostatky, nebo by její výsledky nemusely být zcela průkazné a spolehlivé. Jedná se například o tyto variace:
1. Real-time PCR, neboli PCR v reálném čase umožňuje přesné a rychlé zaznamenávání produktu okamžitě po jeho vzniku v každém cyklu reakce. Do 26
reakční směsi jsou přidávány speciální fluorescenčně značené sondy nebo fluorescenční barviva. Během syntézy komplementárních vláken je fluorescenční látka uvolněna, čímž vzroste celkové záření, které je zaznamenáváno ve speciálním termocykléru. Ten naměřený údaj přepošle přes operační software do počítače. Na obrazovce se tak v reálném čase zobrazuje množství vznikající naamplifikované DNA. Výhodou je odpadnutí zdlouhavého vyhodnocování pomocí elektroforézy a dále například fakt, že lze zpětným výpočtem zjistit přesné množství vstupní DNA, tedy templátu. Nevýhodou metody je vysoká náročnost na kvalitu zvolených primerů a na celkové laboratorní podmínky. Pokud není reakce dokonale optimalizována, nejsou výsledky dostatečně přesné.
2. Hot-start PCR je založená na tzv. horkém startu reakce. DNA polymerázy jsou aktivní i při nižších teplotách, může tedy dojít k hybridizaci primeru na nespecifická místa ještě před dosažením optimální reakční teploty, tedy před samotnou denaturací. Aby se zamezilo takovému vzniku nespecifických produktů, je možné přidat některý z reaktantů až poté, co reakční směs dosáhne teploty denaturace. Nevýhodou je možná kontaminace při této pozdější manipulaci se směsí. Řešením může být vložení odděleného reaktantu do zkumavky ve voskové kuličce spolu se zbytkem směsi ještě před započetím reakce, přičemž vosk se rozpustí po zahřátí na teplotu denaturace a látka se tak uvolní právě na jejím počátku. Další variantou je inaktivování polymerázy specifickou protilátkou. Po zahřátí látky dojde k rozkladu protilátky a k aktivaci činnosti polymerázy.
3. Asymetrická PCR zajistí během svého průběhu amplifikaci pouze jednoho vlákna z původní dvouvláknové DNA. Výsledné jedno vlákno je používáno například pro sekvenování DNA. Principem je přimíchání jednoho z primerů ve výrazně vyšším množství než u druhého zvoleného primeru, v poměru až 100:1. Z počátku tedy reakce probíhá standardně, vzniká dvouvláknová amplifikovaná DNA. Po několika cyklech se méně zastoupený primer zcela vy27
čerpá a dále vzniká pouze jedno amplifikované vlákno, pro jehož vznik je ve směsi primeru dostatek.
4. Multiplex PCR slouží k amplifikaci více DNA produktů současně během jedné reakce. Do reakční směsi je přidáno více primerových párů, které jsou určeny na rozpoznávání odlišných cílových sekvencí na DNA. Během PCR pak dochází k současnému nasednutí primerů na více místech vlákna DNA a k následnému namnožení různých úseků původní templátové DNA. Výhodou je výrazné snížení nákladů na jednu řetězovou reakci, neboť jich můžeme provádět více dohromady, čímž je možné ušetřit např. na ostatních reaktantech a na nákladech na práci. Naopak nevýhoda spočívá v náročné optimalizaci podmínek pro reakci, protože je třeba sjednotit reakční podmínky pro více různých primerů. Jedná se např. o optimální teploty u každé fáze cyklu, koncentrace jednotlivých primerů, dostatečně dlouhé řetězce DNA, rozdílné cílové sekvence pro primery atd.
5. Touchdown PCR byla vytvořena pro zamezení vzniku většího množství nespecifických amplifikací, tedy PCR produktů. Využívá principu, kdy pokud zvýšíme teplotu oproti té, která je optimální pro nasedání primerů na templát, primery budou nasedat na svá specifická místa sice obtížněji, zato s velkou přesností. V prvních cyklech tak bude vznikat pouze požadovaný produkt. Po přibližně pěti cyklech snížíme teplotu zpět na optimální pro zvolené primery. V prvních cyklech sice vznikne produktu méně, zato bude pouze specifický. Ve zbylých cyklech budou již primery nasedat snadněji a vytvoří tak dostatečný výtěžek. Přebytek požadovaného produktu, který je získán během prvních pěti cyklů tak zajistí, že celková reakce bude specifická a výsledky budou průkazné bez narušení nadbytkem nežádoucích nespecifických hybridizací.
6. Reverzní transkripce ve spojení s PCR je aplikována v případě, že je potřeba amplifikovat zkoumanou RNA. Důležitou složkou reakční směsi je reverzní 28
transkriptáza, která převede RNA na DNA. Poté může následovat běžná polymerázová řetězová reakce. Metoda je využívána v genovém inženýrství pro syntézu DNA z RNA (přesněji syntézu cDNA z mRNA). Analýza amplifikované cDNA pak slouží například k odhalování genetických a infekčních onemocnění, ke zkoumání exprese genetické informace a při zkoumání retrovirů, které mají svou genetickou informaci uloženou právě ve formě RNA a zpětnou transkripci využívají k jejímu začlenění do chromozomů buněk hostitele, což je možné pouze ve formě DNA. Nevýhodou metody je značná degradovatelnost RNA vlivem ribonukleáz. Ty jsou totiž v prostředí běžně přítomné a vzhledem k jejich termostabilnosti a odolnosti vůči denaturačním činidlům je není možné odstranit. Jedinou možností jak degradaci RNA zabránit je tak přidání inhibitorů ribonukleáz do reakční směsi. Tím dojde k jejich inaktivaci a RNA zůstane neporušená pro reverzní transkripci. 2.3.2 Fragmentační analýza
Tato metoda využívá analýzu mikrosatelitů. Ty jsou součástí satelitní DNA, tedy nekódující sekvence DNA bez konkrétní známé funkce. Jsou to opakující se motivy jednoho až deseti bazických párů, většinou v počtu 10-50 kopií. Mohou to být dinukleotidy, trinukleotidy nebo tetranukleotidy podle délky opakovaného motivu. Další dělení je možné podle toho, jestli motivy následují hned po sobě nebo jsou přerušované. Lze je využít jako genetické markery, což jsou známé sekvence DNA, které jsou snadno identifikovatelné. Jedná se o určitý druh variace, tedy změny. Ta může být zapříčiněna změnou původní sledované sekvence nebo její mutací. Analýza mikrosatelitů je využívána na vnitropopulační i mezidruhové úrovni. Uvnitř populací je pomocí mikrosatelitů určována například paternita, příbuznost jedinců nebo velikost populace, mezi jednotlivými populacemi je pak sledován tok jednotlivých genů, diferenciace populací, nebo fylogeneze, tedy historický vývoj jednotlivých druhů organismů od jednodušších ke složitějším formám.
29
2.3.2.1 Průběh reakce
Ke genotypování mikrosatelitů je třeba produkt izolace DNA a následná polymerázová řetězová reakce. K DNA je přimíchán mastermix, který obsahuje pufr, polymerázu, nukleotidy, hořčík a další složky. Směs je promíchána a v uzavřených zkumavkách vložena do termocykléru. Následně probíhá PCR. Po jejím skončení jsou zkumavky prudce zchlazeny a jejich obsah je smíchán s příslušným velikostním standardem, markerem. Poslední složkou je formamid, což je denaturant. Je namíchán příslušný počet vzorků, ty jsou zhomogenizovány pomocí centrifugy a vloženy na pět minut do termocykléru vyhřátého na 95 °C. Po skončení denaturace jsou zkumavky prudce zchlazeny uložením na led. Po uplynutí pěti minut jsou vzorky po jednom vkládány do sekvenátoru, kde probíhá kapilárová elektroforéza.
2.3.2.2 Vyhodnocení fragmentační analýzy - kapilárová elektroforéza
Fragmentační analýza slouží ke sledování mutací a polymorfismů mikrosatelitů pomocí zjišťování délky jednotlivých alel u produktů polymerázové řetězové reakce (PCR). To je možné provést pomocí speciálního přístroje zvaného sekvenátor. Další možností vyhodnocení je využití elektroforézy a následné vyhodnocení snímků gelu. Předpokladem pro vyhodnocení PCR produktu v sekvenátoru je použití flurorescenčně značených primerů během PCR reakce. V sekvenátoru probíhá kapilárová elektroforéza, během které přečte laser jednotlivé fragmenty a naměřené délky alel, tedy požadované výsledky, odešle přes operační software do počítače. Využívané softwary se nazývají Genemapper a Genotyper. Na obrazovce se pak objeví výsledky ve formě elektroforetogramu. Zpracování jednoho vzorku s DNA trvá v sekvenátoru přibližně 30 minut.
30
3
CÍLE PRÁCE Cíle této práce jsou:
1. Zmapovat současné postupy využívané v oblasti dohledatelnosti a ověřování autenticity hovězího masa v České republice a popsat současné metody využívané v oblasti analýzy DNA.
2. Vytvořit databázi vzorků hovězího masa.
3. Ověřit autenticitu vzorků hovězího masa prostřednictvím podrobné analýzy DNA a porovnat zjištěné výsledky s údaji, které jsou veřejnosti k dispozici v Ústřední evidenci hospodářských zvířat a farmového chovu.
4. Zhodnotit funkčnost využívaných metod dohledatelnosti původu hovězího masa s ohledem na výsledky laboratorních analýz. 31
5. Na základě zjištěných výsledků navrhnout případné vylepšení systému dohledatelnosti a ověřování autenticity hovězího masa používaného v České republice.
4
METODIKA Běžný konzument hovězího masa má k dispozici pouze omezené možnosti,
jak si dohledat původ zakoupeného hovězího masa. Pravdivost údajů uváděných na etiketách a při výsekovém pultovém prodeji není pro něj nijak ověřitelná. Musí důvěřovat tomu, že všechny složky prodejního řetězce, kterými maso prošlo, dodržely zákony předepsané postupy. Nemá možnost jak si ověřit, že bylo zvíře řádně označeno a zaregistrováno chovatelem, u kterého se narodilo, že byl v registru správně zaznamenán každý pohyb tohoto zvířete, zaneseno správné evidenční číslo posledního chovatele, využitých jatek nebo bourárny. Koncový zákazník nemá jistotu, že maso nemohlo být zaměněno během převozů do meziskladů nebo že během balení dostalo etiketu se správnými údaji. Z výše uvedených důvodů bylo přistoupeno k otestování autenticity prostřednictvím laboratorního ověření odpovídajícími genetickými metodami. Analýza DNA je jediná zaručeně spolehlivá metoda, jak zjistit, zda údaje uváděné při prodeji odpovídají skutečnosti. Účelem tohoto ověřování nebylo následně soudit případnou nepravdivost předkládaných údajů o původu masa nebo to, zda byly zjištěné nesrovnalosti způsobeny 32
záměrně za konkrétním účelem, nebo pouhým nedopatřením či nedbalostí na některém ze stupňů prodejního řetězce. Jediným cílem laboratorní analýzy bylo získat data potřebná k objektivnímu posouzení fungování systému, který je k dohledatelnosti původu hovězího masa zaveden a využíván v České republice.
Práce byla řešena jako součást projektu „Biotechnologické metody pro inovace hodnocení zpracovatelské a spotřebitelské kvality hovězího masa jako potravinového zdroje živočišných proteinů“, který byl realizován Agronomickou fakultou Mendelovy univerzity v Brně, konkrétně týmem pracovníků Laboratoře agrogenomiky, ve spolupráci s Výzkumným ústavem pro chov skotu, s.r.o. Jedná se o projekt VaVaI Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy v programu 2B - Zdravý a kvalitní život (20062011) a byl řešený v letech 2008-2011. Identifikační kód projektu je 2B08037. Jeho řešitelským cílem bylo stanovení vztahů mezi markery asociovanými s významnými kvalitativními vlastnostmi JUT skotu a jakostními charakteristikami hovězího masa a zpracování a ověření postupu vyhledatelnosti zdroje masa.
Předpokladem pro laboratorní ověření autenticity hovězího masa prodávaného na českém trhu bylo vytvoření databáze vzorků, které byly podrobeny genetickému rozboru. Analýza DNA u testovaného masa by měla potvrdit nebo naopak vyvrátit pravdivost údajů o původu masa, které jsou konečnému zákazníkovi při prodeji předkládány. Bylo tedy žádoucí zvolit jak balené hovězí maso, tak na druhou stranu i porcované maso z pultového prodeje. Byly vyhledány takové balené a nebalené masné produkty, u nichž bylo prodejcem uváděno, že pocházejí ze stejného zvířete. K vytvoření databáze bylo zvoleno hovězí maso, zakoupené v jednom z hypermarketů v Brně. Výběr obchodu nebyl zcela náhodný. Jedná se o hypermarket nadnárodní obchodní sítě, který využívá vlastní bourárnu a balírnu a ke zpracování masa dochází krátce předtím, než je předloženo zákazníkům ke koupi v rámci pultového prodeje. Měla by tím být tedy zajištěna nejen čerstvost masa, ale také záruka původu kupovaného masa. V neposlední řadě by mělo být snazší tento původ dohledat, neboť je v jeho cestě ke koncovému zákazníkovi vynechaná cela řada kroků, které to mohou kompliko33
vat. Protože hypermarket uvádí, že odebírá zpracovaná jatečná těla přímo od producentů a zajišťuje si celou řadu zpracovatelských činností sám, odpadají například subdodavatelé, externí bourárna, balírna, mrazírna, chladírna nebo jiné mezisklady a tudíž se díky menšímu počtu manipulací výrazně snižuje šance špatného označení tohoto masa.
Pro zařazení do databáze bylo zakoupeno celkem deset vzorků hovězího masa z pultového prodeje a to konkrétně:
1. hovězí pečeně z krku, balená; 2. hovězí žebro s kostí, balené; 3. hovězí maso mleté, balené; 4. hovězí guláš krájený, balený; 5. hovězí pečeně z kýty, balená; 6. hovězí žebro bez kosti, balené; 7. hovězí hrudí bez kosti, balené; 8. hovězí pečeně z krku, porcovaná; 9. hovězí pečeně z kýty, porcovaná; 10. hovězí pečeně z krku, porcovaná.
Identifikační údaje o původu masa byly na balených výrobcích totožné s údaji uvedenými na prodejním pultu s porcovaným masem. Mělo by se tedy dle poskytnutých informací jednat o maso z jednoho zvířete: − pohlaví: býk, − stáří 16 měsíců, − registrační číslo zvířete: CS 575154081, − evidenční číslo posledního chovu: 8104317401, − zvíře narozeno, vykrmeno, poraženo v České republice, − bouráno v České republice, přímo v bourárně hypermarketu.
34
4.1 Ověření původu masa z pohledu zákazníka Prvním krokem bylo ověření údajů uvedených na etiketách způsobem, který má k dispozici běžný konzument hovězího masa. Takto zjištěné informace posléze sloužily k porovnání s laboratorními výsledky analýzy DNA. V České republice může široká veřejnost zajímající se o původ hovězího masa využít přístup ke speciální vyhledávací aplikaci, která je k dispozici na internetových stránkách Ministerstva zemědělství a také Českomoravské společnosti chovatelů a.s. Po zadání údajů získaných z etikety či při nákupu v řeznictví může každý zjistit, z jakého konkrétního kusu skotu jím zakoupené maso pochází. Zobrazená informace by měla pocházet z oficiální databáze Ústřední evidence hospodářských zvířat a farmového chovu. Podle registračního čísla zvířete byly tímto způsobem vyhledány informace o konkrétním zvířeti, ze kterého mělo veškeré maso zakoupené ve zvoleném hypermarketu pocházet.
4.2 Ověření autenticity masa genetickými metodami Pro potvrzení pravdivosti zobrazených informací bylo přistoupeno k ověření pomocí laboratorních postupů. Z každého zakoupeného vzorku bylo v laboratoři odebráno přibližně 20 mg masa pro provedení následné izolace DNA z tkáně. Dalším krokem byla analýza DNA pomocí genotypování 18 mikrosatelitů pro potvrzení, že všechny vzorky masa pocházely ze stejného zvířete. Poslední fází testování DNA bylo genotypování mikrosatelitů pro determinaci pohlaví zkoumaného jedince aby bylo potvrzeno, že se jedná o maso z jedince samčího pohlaví, jak uváděly etikety.
4.2.1 Izolace DNA z tkáně
Izolace DNA z deseti vzorků hovězího masa byla provedena podle uživatelského manuálu firmy Genomed. Byla použita sada pro získání DNA JetQuick® Genomic 35
DNA, která je určena pro získání genomické DNA z krve, savčích buněk a tkání, tělesných tekutin, bakterií, kvasinek a pevných tkání.
4.2.1.1 Postup izolace DNA
Pomocí sterilních nástrojů a ve sterilním prostředí bylo odebráno přibližně 20 mg tkáně z každého vzorku masa a vloženo do označených zkumavek. Po promíchání s 200 µl lyzačního pufru T1 a 20 µl proteázy byly zkumavky uzavřeny a vloženy na 24 hodin do termostatu nastaveného na 60 °C. K takto vzniklému lyzátu byl druhý den přimícháno 200 µl lyzačního pufru B3 a zkumavky byly vloženy na 15 minut do termostatu při teplotě 70 °C. Po přilití 200 µl 100% ethanolu následovalo přelití celé směsi do zkumavky s kolonkou a centrifugace. Po jejím skončení zůstane DNA zachycena na membráně kolonky a je možné vylít zbytek směsi, který protekl membránou do zadržovací zkumavky. Po důkladném promytí izolované DNA bylo přes membránu prolito 500 µl promývacího pufru BW a opět zcentrifugováno. Po vylití obsahu ze zkumavky byl vymývací postup zopakován tentokrát s 600 µl promývacího pufru B5. Po skončení centrifugace a vylití zkumavky byla provedena centrifugace ještě jednou, ale bez vymývacího pufru, tedy „na prázdno“. Kolonka se zachycenou DNA byla vložena do čisté označené zkumavky a k ní dodáno 100 µl elučního pufru zahřátého na 70 °C. Ten zajistí uvolnění DNA z kolonkové membrány. Směs byla ponechána krátce odstát a zcentrifugována. Na závěr byla vyjmuta již nepotřebná kolonka a zkumavka s uvolněnou DNA důkladně uzavřena. Pro vyhodnocení úspěšnosti izolace DNA pomocí elektroforézy byl uvařen 1,5% agarózový gel. V 50 ml TAE pufru bylo rozvařeno 1,5 g agarózy. Po uvaření bylo přimícháno 2,5 µl etydiumbromidu (ETBr) pro obarvení DNA na gelu. Gel byl po zatuhnutí ve vaničce vložen do přístroje na elektroforézu a zalit roztokem TAE pufru. Z každé zkumavky s izolovanou DNA bylo odebráno 5 µl DNA a promícháno s roztokem sacharózy a barviva. Sacharóza je určena k tomu, aby stáhla DNA v gelu ke dnu a ta tak v průběhu elektroforézy volně neplavala v pufru, ale putovala gelem. 36
Získaná směs byla vložena pipetou do připravené jamky v gelu a byl spuštěn elektrický proud. Po skončení elektroforézy byl celý gel i s DNA vyfocen a podle záření byla určena úspěšnost izolace DNA u každého vzorku.
4.2.2 Genotypování 18 mikrosatelitů
Pro následnou identifikaci DNA byl dodržen pracovní manuál firmy Finnzymes Diagnostics, konkrétně byla použita laboratorní sada, neboli kit, s názvem Bovine GenotypesTM Panel 3.1, F-900. Ta je určena pro testování mikrosatelitů za účelem identifikace DNA skotu a určování rodičovství u skotu.
4.2.2.1 PCR
Během předchozí izolace DNA bylo získáno dostatečné množství genetického materiálu pro následující laboratorní testy. Vzhledem k tomu, že izolace byla nadmíru úspěšná a vzorky získané DNA byly silné, bylo třeba je před identifikací naředit. Naředění bylo provedeno destilovanou vodou. Do nových zkumavek bylo odebráno 0,5 µl DNA a promícháno s 4,5 µl destilované vody. Do dalších nových a řádně označených zkumavek byla odebrána naředěná DNA a k ní byl dle návodu nadávkován optimalizovaný mastermix F-841 s obsahem Phusion a Hot-start polymerázy, nukleotidů, MgCl2 a dalších látek, který byl součástí kitu. Předpokladem pro odlišení 18 mikrosatelitů ve výsledku bylo použití fluorescenčně značených primerů ve více různých barvách. Zkumavky byly pečlivě uzavřeny a vloženy do cykléru. Následně byla spuštěna polymerázová řetězová reakce (PCR) s následujícími parametry jednotlivých fází:
1. Denaturace: teplota byla nastavena na 98 °C, úvodní denaturační fáze trvala 37
po dobu jedné minuty, v ostatních cyklech již pouze 20 sekund. 2. Annealing: teplota v cykléru byla snížena na 60 °C na dobu 75 sekund. 3. Elongace: mírné zvýšení teploty na 72 °C bylo udržováno 30 sekund.
Celé cykly se třemi uvedenými základními fázemi byly během reakce opakovány celkem 29krát.
4.2.2.2 Fragmentační analýza
Po doběhnutí poslední elongace v termocykléru byly zkumavky prudce zchlazeny vložením do chladničky. Během chlazení byl připraven marker LIZ 500 a nové zkumavky. Po vyjmutí PCR produktů z chladničky bylo odebráno 0,5 µl každého z nich a přeneseno do nové označené zkumavky. K produktu bylo doplněno 0,5 µl markeru a 11,5 µl formamidu, který posloužil jako denaturant. Zkumavky se směsí byly po uzavření vloženy do termostatu vyhřátého na 95°C, kde probíhala denaturace po dobu pěti minut. Následovalo zchlazení zkumavek jejich uložením na led, přesněji na namražené plastové platíčko. Chlazení vzorků ve zkumavkách trvalo taktéž pět minut. Zchlazené zkumavky byly po jedné vkládány do sekvenátoru, kde probíhala kapilárová elektroforéza, jejíž výsledky byly promítány na obrazovku počítače. Vyhodnocení jednoho vzorku v sekvenátoru trvalo přibližně půl hodiny a výsledky byly v počítači převáděny na elektroforetogram na obrazovce pomocí speciálních operačních softwarů Genetyper a Genemapper.
4.2.3 Genotypování mikrosatelitů pro determinaci pohlaví
Ke zjištění pohlaví je využíván lokus amelogenin. Bílkovina amelogenin je v těle produkována buňkami, které jsou primárně určeny pro tvorbu zubní skloviny. Gen 38
pro amelogenin se nachází na pohlavních chromozomech X a Y. Princip určování pohlaví spočívá v detekci různě dlouhých sekvencí pro amelogenin u samčích a samičích chromozomů. Pro sledování těchto rozdílů slouží specifické oblasti na úseku DNA. Detekce probíhá při vyhodnocení polymerázové řetězové reakce kapilárovou elektroforézou. Ve výsledku je u samičího pohlaví zjištěn pouze jeden produkt amplifikace o kratší délce, protože na chromozomu X se nachází v sekvenci amelogeninu delece o délce šesti bazických párů oproti běžné délce úseku pro tento gen. Naproti tomu u samčího pohlaví jsou zjištěny produkty dva o různých délkách, tedy různých počtech bazických párů, s delecí v sekvenci genu pro X a bez delece pro Y chromozom. K této analýze byl využit taktéž produkt z předchozí izolace DNA. Byla provedena PCR s drobnými funkčními úpravami a fragmentační analýza.
4.2.3.1 PCR
Reakční směs v každé zkumavce byla složena z 0,5 µl vyizolované DNA smíchané s 4,17 µl destilované vody a 0,75 µl pufru s obsahem hořčíku. Dále z primerů A a B po 0,3 µl, z 0,125 µl nukleotidů a 0,105 µl Taq polymerázy. Jednotlivé kroky reakce byly následující:
1. Počáteční denaturace: teplota 95 °C, fáze trvala deset minut. 2. Denaturace: teplota byla nastavena na 95 °C, délka trvání 30 sekund. 3. Annealing: teplota v cykléru byla snížena na 60 °C na dobu 30 sekund. 4. Elongace: mírné zvýšení teploty na 72 °C bylo udržováno 60 sekund. (Fáze 2-4 byly opakovány celkem 30krát.) 5. Teplota v cykléru byla udržována na 72 °C po dobu jedné hodiny. 6. Posledním krokem bylo zchlazení reakční směsi na 4 °C. 39
4.2.3.2 Fragmentační analýza
Po zchlazení směsi bylo odebráno 0,5 µl PCR produktu a vloženo do nové označené zkumavky spolu s 0,5 µl markeru LIZ a 11,5 µl formamidu. Následovalo pět minut denaturace při teplotě 95 °C v termocykléru a poté chlazení na ledu trvající stejnou dobu. Vychlazené zkumavky byly po jedné vkládány do jednokapilárového sekvenátoru. Konkrétně se jednalo o typ ABI PRISMTM 310 Genetic Analyzer. Pomocí softwarů Genetyper a Genemapper byly laserem naměřené hodnoty převáděny v počítači do výsledného elektroforetogramu.
5
VÝSLEDKY Přehled zjištěných údajů je řazen ve stejné posloupnosti, ve které probíhala meto-
dická část práce.
5.1 Veřejně dostupné informace Vyhledání původu zakoupeného masa bylo provedeno zadáním registračního čísla zvířete získaného z etikety (CZ575154081) do speciálních aplikací na internetových stránkách Ministerstva zemědělství a Českomoravské společnosti chovatelů a.s. Oba portály, které jsou veřejnosti k dispozici, byly využity z důvodu kontroly propojenosti těchto systémů mezi sebou a také s registrem skotu. Byly zjištěny informace následujícího znění: 40
Ministerstvo zemědělství: − datum narození zvířete: 13. 6. 2009; − datum porážky: 10. 11. 2010; − pohlaví: samec; − převažující plemeno: Holštýnské černostrakaté; − podrobná plemenná skladba: - Černostrakaté holštýnské: 79 %; - České strakaté: 21 %.
Českomoravská společnost chovatelů a.s.: − datum narození zvířete: 13. 6. 2009; − datum porážky: 11. 11. 2010; − pohlaví: býk (nebo vůl); − převažující plemeno: Holštýnské; − podrobná plemenná skladba: - Holštýnské: 79 %; - České strakaté: 21 %.
Rozdílný údaj byl nalezen v datech porážky námi vyhledaného zvířete, které se lišily o jeden den. Ostatní údaje o původu masa byly na obou využitých portálech totožné a stejně obsáhlé.
5.2 Výsledky izolace DNA Provedená izolace DNA proběhla u všech deseti vzorků masa úspěšně. Ověření této skutečnosti proběhlo pomocí elektroforézy na agarózovém gelu a izolovaná DNA je jasně viditelná na výsledné fotografii gelu:
41
5.3 Výsledky genotypování 18 mikrosatelitů Výsledky z této analýzy byly vyhodnoceny souhrnně ve formě tabulky: Mikrosatelit
1)Hov.peč.z krku-bal.
2)Hov.žebro s k.-bal.
3)Hov.mleté-bal.
4)Hov.guláš kráj.-bal.
5)Hov.peč.z kýty-bal.
BM2113
133
135
127
135
127, 131, 133, 135
131
135
133
135
ETH10
215
221
217
217
215, 217, 221
217
217
215
221
SPS113
283
295
283
285
283, 285, 295, 297
295
295
283
295
SPS115
248
248
248
258
248
252
256
248
248
TGLA227
89
97
81
97
89, 97
81
83
89
97
BM1818
266
266
262
266
266
262
266
266
266
INRA23
214
214
206
214
206, 210, 214
218
218
214
214
RM067
102
102
92
92
90, 102
90
102
102
102
TGLA122
143
143
141
151
143, 151, 161
151
151
143
143
TGLA126
117
121
115
117
117, 119, 121
115
115
117
121
CSRM60
98
102
92
104
92, 98, 102
96
102
98
102
CSSM66
187
195
183
185
187, 189, 195
183
183
187
195
42
ILSTS006
294
294
296
296
294, 296
296
300
294
294
MGTG4B
135
147
137
151
135, 139, 147, 153
135
151
135
147
BM1824
182
182
182
182
182, 188
182
188
182
182
ETH225
148
148
140
148
138, 148, 150
140
148
148
148
ETH3
117
119
125
125
117, 119
117
125
117
119
Mikrosatelit 6)Hov.žebro bez k.-bal.
7)Hov.hrudí bez k.-bal. 8)Hov.peč.z krku-porc.
9)Hov.peč.z kýty-porc.
10)Hov.peč.z krku-porc.
BM2113
133
135
125
139
131
135
127
135
131
135
ETH10
215
221
217
219
217
217
217
217
217
217
SPS113
283
295
291
297
295
295
283
285
295
295
SPS115
248
248
248
252
256
248
258
252
256
TGLA227
89
97
87
89
81
83
81
97
81
83
BM1818
266
266
262
270
262
266
262
266
262
266
INRA23
214
214
202
206
218
218
206
214
218
218
RM067
102
102
92
106
90
102
92
92
90
102
TGLA122
143
143
143
153
151
151
141
151
151
151
TGLA126
117
121
115
121
115
115
115
117
115
115
CSRM60
98
102
102
104
96
102
92
104
96
102
CSSM66
187
195
183
193
183
183
183
185
183
183
ILSTS006
294
294
290
296
296
300
296
296
296
300
MGTG4B
135
147
137
141
135
151
137
151
135
151
BM1824
182
182
178
180
182
188
182
182
182
188
ETH225
148
148
150
150
140
148
140
148
140
148
ETH3
117
119
117
121
117
125
125
125
117
125
5.3.1 Vysvětlivky − Ve sloupcích jsou vypsány jednotlivé vzorky masa, každý se dvěma výslednými alelami vyjádřenými číslem, jednou od matky a druhou od otce. Pokud je zjištěných alel více, znamená to, že se ve vzorku nacházela DNA více jedinců. − Řádky tabulky jsou vyhrazeny pro údaje vztahující se k jednotlivým mikrosatelitům. − Barevně shodně označené vzorky znamenají, že pocházejí dle všech ukazatelů ze stejného jedince.
43
5.3.2 Shrnutí
Celkem byla ve vzorcích spolehlivě zjištěna DNA pocházející ze čtyř různých kusů skotu. Shodná DNA byla zjištěna u vzorku č. 1, 5 a 6. Další zvíře bylo identifikováno ve vzorcích č. 2 a 9, ze třetího zvířete bylo maso vzorků č. 4, 8 a 10. Vzorek č. 7 se s žádným jiným neshodoval, jednalo se o čtvrté odlišné zvíře. Maso vzorku č. 3, hovězí mleté balené, pocházelo z více než jednoho zvířete.
5.4 Výsledky genotypování mikrosatelitů pro determinaci pohlaví Provedená fragmentační analýza a výsledky sekvenování zobrazené operačním softwarem prokázaly, že se u všech deseti zkoumaných vzorků jednalo o maso z jedince samčího pohlaví, tedy z býka nebo vola.
44
6
DISKUSE Jak již bylo dříve zmíněno, cílem práce bylo ověřit funkčnost a spolehlivost zave-
dených postupů, které mají v České republice sloužit k zajištění dohledatelnosti původu hovězího masa a k zaručení jeho autenticity. Zjištěné výsledky však poukazují na to, že informace, ke kterým má přístup konzument hovězího masa, rozhodně nemusejí odpovídat skutečnosti. 45
6.1 Veřejně dostupné informace Nejen laboratorní metody poukázaly na nesrovnalosti v uváděném původu masa. Dvě vyhledávací aplikace, které jsou veřejnosti v České republice k dispozici, zobrazily rozdílné údaje o zakoupeném mase. Nestejná hodnota se objevila u data porážky zvířete, ze kterého mělo maso pocházet. Portál Ministerstva zemědělství uváděl jako den porážky 10. 11. 2010, zatímco ve vyhledávači Českomoravské společnosti chovatelů a.s. se objevilo datum porážky 11. 11. 2010. Důvody tohoto rozdílů není možné spolehlivě zjistit, ale lze předpokládat, že chyba vznikla lidskou chybou při přepisování údajů z hlášení o porážce v papírové formě do elektronické podoby.Je tedy možné soudit, že vyhledávací aplikace nejsou přímo propojeny s Ústřední evidencí skotu, ale data jsou do jejich databáze přepisována zvlášť. Kromě této skutečnosti je zarážející ještě fakt, že nejsou propojeny ani vzájemně mezi sebou. Pokud by totiž propojeny byly, musela by být nesrovnalost v datech porážky odhalena, nebo by se spíše vůbec neobjevila. Je zřejmé, že největším praktickým problémem Ústřední evidence skotu a vyhledávacích aplikací vedených Ministerstvem zemědělství a Českomoravskou společností chovatelů a.s. a poskytovaných na jejich internetových stránkách, je převádění informací o chovaných zvířatech z papírových formulářů do elektronické podoby. V dnešní době mají chovatelé stále ještě dvě možnosti hlášení událostí ve spojitosti s chovanými zvířaty. Kromě hlášení elektronickou cestou jsou jim k dispozici i tradiční papírové formuláře, které musí po vyplnění a odeslání do registru přepsat odpovědný pracovník. Pověřenou osobou, která odpovídá za informace uvedené v Ústřední evidenci skotu je pro Českou republiku právě Českomoravská společnost chovatelů a.s. Je logické, že při využívání papírové formy povinných hlášení všech událostí v průběhu života zvířete, dochází k časové prodlevě mezi událostí samotnou, vyplněním a odesláním formuláře pro její oznámení a okamžikem, kdy je formulář obdržen druhou stranou a nové údaje se skutečně objeví v evidenci. 46
Na internetových stránkách Ministerstva zemědělství, na tzv. Portálu farmáře mají přitom chovatelé skotu možnost nejen hlásit veškeré události elektronickou cestou, ale také vést v elektronické podobě i celý svůj stájový registr. Již od počátku, tedy od narození každého zvířete, je možné mít veškerou jeho dokumentaci vedenou bez využívání papírových formulářů. Program stájového registru vedeného „on-line“ byl vyvinut ve spolupráci s Českomoravskou společností chovatelů a.s. a je provozován přímo Ministerstvem zemědělství. Z těchto skutečností vyplývá, že je plně schváleným programem pro vedení stájového registru a je uznáván jako plnohodnotný způsob vedení evidence chovaných zvířat také při kontrolách prováděných Státní veterinární správou nebo Českou potravinářskou inspekcí v chovatelských provozech. Rozdílná data u porážky zvířete mohou v námi zkoumaném případě pouze klamat spotřebitele. Je možné jen spekulovat, které z uvedených dat je správné a u kterého způsobila lidská chyba desinformaci. Doufejme, že do Ústřední evidence skotu byl zapsán správný údaj. Je to nesmírně důležité pro případ, kdy by bylo potřeba dohledat původ masa při zjištění možného ohrožení zdraví lidí. Při vyskytnutí se potenciálního zdravotního rizika probíhá pátrání zpětně. Tedy jde se od posledního stupně obchodního řetězce k prvnímu a průběžně jsou vylučovány jednotlivé provozy jako zdroj možné nákazy. Je postupováno od prodejce zpět, přes subdodavatele, balírnu, uvedenou bourárnu, jatka, k poslednímu chovateli, případně přes všechna místa pobytu zvířete až k chovateli, u kterého se sledované zvíře narodilo. V průběhu vyšetřování jsou prováděny příslušné laboratorní testy. Pokud by byly za zdroj nákazy označeny právě jatka, v jejichž prostorách došlo k porážce zvířete, je třeba znát přesné datum porážky, aby bylo možné dohledat veškeré maso, které toho dne jatkami prošlo, neboť by mohlo být také zdrojem ohrožení zdraví obyvatel.
6.2 Genotypování mikrosatelitů Zjištění, že prodávané maso nepocházelo z jednoho zvířete, je díky použitým metodám analýzy DNA nezpochybnitelné. Tvrzení o původu masa, které proklamovaly etikety na balených porcích hovězího masa i cedule u pultového prodeje, bylo tedy nepravdivé. Nejen, že se nejednalo o maso z jediného zvířete, ale pocházelo nejméně 47
ze čtyř odlišných jedinců. Je nemožné zjistit, zda byla klamná informace uvedená u prodávaného masa úmyslně, nebo došlo například k chybě z nedbalosti. Stejně tak není možné zjistit, na kterém stupni obchodního řetězce k záměně údajů došlo, neboť v zavedeném systému neexistuje zpětná kontrola pravdivosti uváděných informací. Uvedeno na konkrétním příkladě, například v balírně zatím neexistuje způsob, jak dohlédnout na to, že jsou aktualizovány informace na etiketách vždy po té, co je dobaleno maso z jednoho zvířete a začnou být baleny a štítkovány produkty z druhého jedince. Spoléhá se pouze na to, že jsou provozovateli a jejich zaměstnanci dodržovány zákonné předpisy. Během obchodního řetězce, kterým konkrétní hovězí maso projde, je celá řada stupňů, kdy záleží předání pravdivých informací pouze na lidském faktoru. V první řadě se jedná již o nahlášení údajů do registru skotu po narození telete samotným chovatelem. Pokud bylo uskutečněno prostřednictvím papírového formuláře, následuje přepsání tohoto ohlášení do elektronické formy registru odpovědnou osobou. Každému teleti jsou na základě hlášení o narození k jeho údajům vydány ušní známky, jejichž číslo je propojeno s evidenčními údaji zanesenými do registru. Následuje zaslání známek chovateli a ten má na starosti označení telete právě tou konkrétní ušní známkou s jeho registračním číslem. Dalšími body, kdy může dojít k záměně informací, jsou například povinná hlášení o veškerém pohybu zvířete a opětovné přepisování příslušných papírových formulářů do registru. Snad nejméně kontrolovatelné procesy v celém systému probíhají během a po porážce zvířete. Jednak se jedná o řádné zaznamenání data porážky a identifikačního čísla zvolených jatek pověřenými pracovníky a také označení jatečného těla odpovídajícími identifikačními údaji zvířete. Pod správným registračním číslem zvířete by mělo jatečně upravené tělo putovat dále do bourárny. Zde je třeba, aby bylo registrační číslo přiřazeno všem částem jatečného těla, které jsou získány. Maso putuje do balírny nebo k dalšímu zpracování a výsledný produkt musí mít při prodeji na etiketě registrační číslo původního zvířete. Všechny tyto dílčí procesy, během kterých je identifikační číslo propojeno s masem, jsou z velké míry odkázány na poctivost a důslednost provozovatelů jednotlivých provozů a jejich pracovníků a na případné kontroly dodržování předpisů ze strany Státní veterinární správy nebo České potravinářské inspekce. 48
Je však patrné, že v celém zmíněném produkčním procesu je velké množství momentů, kdy není možné neustále kontrolovat dodržování příslušných zákonů. Provádění kontrol je možné pouze namátkově a návštěvy kontrolorů bývají předem ohlášeny. Často k nim také dochází až po zjištění určitých nesrovnalostí, zdravotního rizika, nebo na základě ohlášení podezření ze strany třetí osoby. Jednotlivé subjekty potravinářské produkce hovězího masa tak nad sebou vlastně nemají trvalou kontrolu a je pouze na jejich poctivosti, zda si v konečné fázi obchodního řetězce konzument skutečně zakoupí hovězí maso, které si podle údajů na etiketě zvolil. V dnešní době, kdy poptávka po kvalitním hovězím mase z masných plemen narůstá, tato nemožnost soustavnější kontroly a vidina možného přivýdělku přímo svádí například k zaměňování kvalitnějšího a dražšího masa masných býků za maso z býků mléčných plemen, které nemůže dosahovat takových kvalit. Tyto tendence souvisí s tím, že s rostoucí poptávkou po hovězím mase narůstá taktéž určitá informovanost konzumentů. Pokud mají možnost volby, dávají přednost masu z býků a ti, kteří si mohou dovolit zaplatit více, vyhledávají maso z masných plemen a to často i zahraničního původu. Přitom jediné informace, kterými se mohou při svém výběru řídit, jsou údaje uváděné na prodejním pultu nebo přímo na etiketách výrobků. Další reálnou možností jak zhodnotit méně kvalitní hovězí maso je vzhledem k těmto skutečnostem předkládání masných produktů získaných z masa vyřazených krav s mléčnou užitkovostí konzumentům s tím, že se jedná o produkty z masa býků. Starší dojnice po několika laktacích mají maso nezpochybnitelně nižší kvality než býci například masného plemene, kteří navíc bývají poráženi ve výrazně mladším věku. Nejatraktivnější kategorií hovězího masa je ta s označením „mladý býk“. Takto smí být označováno pouze maso z jedinců samčího pohlaví do věku 24 měsíců. Jedná se pak o produkt vyšší kategorie, což umožňuje prodejci odpovídajícím způsobem navýšit i jeho cenu. Běžný konzument však nemá šanci pouhým pohledem při nákupu tento rozdíl v kvalitě poznat. Je tomu tak také proto, že existuje celá řada postupů, které umožňují prodejci maso opticky zatraktivnit. Tyto nenápadné finty na konzumenty mohou být od těch nezávadných až po ty minimálně sporné. Jedná se například o vydávání masa ze zahraničí za maso českého původu. Přitom dle platné legislativy stačí, aby bylo maso v České republice zpracováno nebo zabaleno a již lze uvést domácí původ. Problematičtějším zásahem do kvality 49
masa je například přidávání vody pro zvýšení váhy a následně i dodávání chemických látek, které tuto vodu v mase zadrží. Stále častější prodej již ochuceného mletého masa nebo masa naloženého v marinádách nebo jiných kořenících směsích přímo nahrává k podezření, že se jedná o méně kvalitní maso nebo dokonce o produkt s prošlým datem trvanlivosti, který je takto částečně zakonzervován a lze ho prodávat déle, neboť má na obale datum, kdy bylo maso vloženo do posledního balení, tedy naloženo do směsi koření, soli a konzervantů. Pro laboratorní ověření, zda nedošlo u hovězích produktů zakoupených pro účely této diplomové práce k vydávání masa z krávy za maso býka, byl určen další postup genotypování mikrosatelitů. Jednalo se o metodu založenou na detekci sekvencí genu amelogeninu, které vykazují u samčích a samičích chromozomů nestejnou délku. Takto získané výsledky determinace pohlaví však tuto možnost zcela vyvrátily. U všech deseti zkoumaných vzorků byl výsledek jednoznačný a jednalo se tedy zaručeně o maso z býka. Informace o pohlaví zvířete na etiketě, byla tedy pravdivá.
6.3 Návrhy na zlepšení systému dohledatelnosti Z předchozích zjištění vyplývá, že největší slabinou současného systému dohledatelnosti je poměrně rozsáhlá administrativa spojená jak s chovem skotu, tak se zpracovatelským průmyslem obecně. Ve spojení se značně omezenými možnostmi pravidelné 50
kontroly dodržování předpisů na jednotlivých stupních obchodního řetězce zde vzniká poměrně velký prostor pro jejich případné porušování. Dalším nedostatkem je absence dílčích kontrolních bodů v systému, které by umožňovaly průběžně kontrolovat správnost postupů a pravdivost předávaných informací.
6.3.1 Elektronická evidence
Současná možnost podávat hlášení do Ústřední evidence skotu vedle elektronické také v papírové verzi vede k prodlevám mezi ohlášením dané skutečnosti a okamžikem, kdy se v evidenci reálně objeví. Musí totiž dojít kromě vyplnění formuláře také k jeho odeslání, doručení, převzetí odpovědnou osobou a finálně k ručnímu přepsání uvedených informací do registru. Zavedením čistě elektronické formy by odpadla významná část administrativy, která je dnes s chovem skotu spojená. Chovatelé mají od roku 2009 možnost vést své stájové registry „on-line“ přímo v aplikaci Integrovaný zemědělský registr. Aplikace je k dispozici na Portálu farmáře spravovaného na internetových stránkách Ministerstva zemědělství. Nespornou výhodou tohoto způsobu dokumentace je přímá provázanost stájového registru s ústřední evidencí. To znamená, že veškeré změny, které chovatel do svého registru o zvířatech zaznamená, jsou okamžitě převedeny také do evidence. Jedná se o narození, přesuny, rozmnožování, kastrace či úhyn konkrétního jedince. Elektronicky lze také objednávat ušní známky s registračními čísly telat a generovat průvodní listy skotu. Časová reálnost a aktuálnost informací je velice důležitá například pro Systém rychlého varování (RASFF) v případě dohledávání zdroje zdravotního rizika. Kromě záznamů z chovů skotu je žádoucí, nahradit papírové záznamy elektronickými i u ostatních provozů, kterými zvíře a následně maso z něj prochází. Zejména u pohybu zvířat jako je jejich odprodej jinému chovateli nebo převoz na jatka, jsou papírové formuláře stále ještě využívány ve velkém množství případů, čímž dochází nejen ke zmiňovanému zpoždění při aktualizaci záznamů v evidenci, ale také 51
k dalšímu nárůstu objemu administrativy s tím spojené. I v této oblasti je již elektronická verze k dispozici. Integrovaný zemědělský registr, který byl vyvinut firmou Aquasoft na objednávku Ministerstva zemědělství, obsahuje kromě stájového registru celou řadu dalších aplikací, díky kterým je možné obsáhnout také veškerou doprovodnou agendu spojenou s chovem skotu. Je možné zde elektronicky zadat datum a místo porážky zvířete a také jeho následné zařazení do potravinového řetězce. Tyto údaje jsou do registru zadány jak chovatelem, který zvíře na jatka odesílá, tak provozovatelem jatek. V registru pak dojde ke spárování informací, tedy vlastně k jejich kontrole a potvrzení, což je velice důležitá změna oproti papírovým formulářům. Papírová dokumentace vyplněná chovatelem a ta, která vznikne v provozu jatek, se jinak setkávají až po doručení k odpovědné osobě Ústřední evidence skotu, která informace převádí do elektronického registru. Ke kontrole shodnosti údajů tak dochází až se zpožděním mnohdy několika dní a je otázkou, zda ke spárování a kontrole uvedených informací skutečně dochází, protože její provádění pro každé zvíře nahlášené chovatelem k porážce by bylo nesmírně časově a administrativně náročné. Data z Integrovaného zemědělského registru lze v případě potřeby využít jednak pro kontrolu bezpečnosti potravin, tedy například pro dohledávání dat v rámci Systému rychlého varování, ale zpracovaná data jsou využívána také jako podklady pro vyhodnocování žádostí zemědělských subjektů o dotace jak ze strany státu, tak z fondů Evropské unie. Registr totiž obsahuje ještě celou řadu souvisejících aplikací, které usnadňují práci nejen chovatelům a provozovatelům zpracovatelských a potravinářských provozů, ale také odpovědným úředníkům. Jednou z nich je například kalkulačka pro výpočet intenzity daného chovu, která slouží jednak samotným chovatelům, ale také poskytuje jedny z důležitých údajů právě pro proces schvalování zemědělských dotací. Vzhledem k tomu, že fungující systém elektronické evidence již v našich podmínkách funguje, nebo je alespoň k dispozici, bylo by na místě ho provázat s pravidly pro elektronické označování zvířat, které výhledově plánuje zavést legislativa Evropské unie. Jako nejvhodnější forma elektronického označování skotu se jeví elektronické ušní známky. Není to samozřejmě jediný způsob této bezdotykové identifikace, ale bolus, tedy keramické pouzdro s čipem, by musel být zaváděn až po dokončení vývoje předžaludků telat, čímž by došlo k pozdějšímu označení zvířete, než se děje nyní a musel by 52
tak být doplněn ještě jinou formou označení, ke které by došlo ihned po narození. Další zvažovanou možností je zavádění mikročipu. Tato technologie je již u některých druhů zvířat využívána poměrně běžně. Jeho využití je zatím uvedeno do praxe spíše u domácích zvířat, jako jsou psi, kočky, fretky, anebo u koní. Vzhledem k dalšímu využití masa zvířat v potravinovém řetězci by mohly čipy představovat potenciální zdravotní riziko. Již dnes jsou elektronické ušní známky využívány například v Kanadě, Austrálii, na Novém Zélandě nebo ve Spojených státech Amerických. Přičemž v některých státech je systém povinný, v jiných je chovateli dobrovolně využívaný. Mezi členskými státy Evropské unie je využívání elektronické identifikace skotu zatím na bázi dobrovolnosti. Výjimkou je Dánsko, kde je od roku 2010 povinné. Jako druhou ušní známku ji pak používají například chovatelé ve Velké Británii nebo v Itálii. V podmínkách České republiky však zatím nebyla upravena příslušná legislativa a chovatelé, kteří chtějí elektronickou ušní známku používat, ji tudíž musí uvést jako třetí, dodatečné označení zvířete vedle dvou klasických ušních známek pro každé zvíře. Zajímavostí je, že u ovcí a koz již systém zaveden je. Pro členské státy Evropské unie, u nichž přesahuje domácí populace ovcí a koz 600 000 kusů, je dle příslušných nařízení elektronická identifikace těchto druhů hospodářských zvířat povinná pro všechna zvířata narozená po 9. 7. 2005. Druh označení je pak přesně definován. Jedná se o klasickou ušní známku v kombinaci s elektronickým identifikátorem. Volit lze mezi bolusem a elektronickou ušní známkou. Je tedy na příslušných vládních orgánech, aby byla upravena legislativa tak, aby elektronická evidence byla v oblasti chovu skotu a souvisejících agend jedinou přípustnou a povinnou formou komunikace. Od této změny je pak velmi blízko k zavedení pravidel pro povinné využívání elektronických ušních známek pro skot, čímž by došlo k takřka úplnému odbourání současné administrativní zátěže.
6.3.2 Genetická banka
I přes případné zavedení nových opatření, které by umožnily usnadnění dílčích procesů administrace chovu skotu a zavedly by v průběhu celého obchodního řetězce spo53
jeného s hovězím masem dílčí kontrolní body, zůstává nejspolehlivější metodou ověřování autenticity hovězího masa využití genetických analýz. Výsledky získané z rozboru DNA jsou nezpochybnitelné a jediné tak mohou spotřebiteli zaručit, že nedošlo k záměně masa nebo jinému podvodu. Pokud by byla analýza DNA zavedena jako součást systému dohledatelnosti skotu, bylo by potřeba navrhnout nejen odpovídající postup, ale také vyhovující zázemí technické a vědecké podpory. Ať již by byl zvolen jako nejvhodnější moment odebírání DNA okamžik označování narozených telat nebo by byla DNA odebírána až po porážce, zůstávají větším problémem právě procesy, které by následovaly. Je to zejména bezchybné přiřazování vzorků k registračním číslům zvířat, přeprava vzorků k laboratornímu zpracování a samotná analýza DNA. Dále se pak jedná o zaznamenání výsledků rozborů do centrálního registru k ostatním identifikačním údajům zvířete a jejich archivace po nezbytnou dobu.
Odběry, analýzy a archivace by měly spadat do působnosti jednoho subjektu. Jako ideální řešení se jeví zřízení nezávislého úřadu ve formě jakési genetické banky speciálně pro tento účel s tím, že pokud by byla metoda časem aplikována i na jiné druhy zvířat, měl by mít úřad kapacitu pojmout větší množství procedur a materiálů k archivaci. Pro účel zajištění co největší nezávislosti a minimální ovlivnitelnosti, by byla banka samostatnou neziskovou institucí, jež by se ze své činnosti zodpovídala přímo vládě v zastoupení Ministerstva zemědělství.
6.3.2.1 Podmínky pro zřízení genetické banky
Zřízení instituce výše uvedeného zaměření vyžaduje především vhodné prostory 54
a vybavení. Podle konečného rozsahu zvolených funkcí by banka sídlila buď v samostatné budově, nebo v prostorách jiné instituce podobného zaměření. Pokud by byla zvolena samostatná budova, ideální by samozřejmě byla budova zcela nová, aby byla navržena podle požadavků na používání nejmodernějších technologií v provozu instituce, tedy přímo potřebám genetické banky „na míru“. Levnější variantou by pak bylo využití či přestavba starší budovy, která by prostorové nároky a požadavky vyplývající z využitých technologií splňovala. Jako organizačně, ekonomicky i provozně nejvýhodnější varianta se jeví funkční propojení genetické banky s některou ze vzdělávacích institucí v zemi. Ideálně s vysokou školou zemědělského nebo biologického zaměření. Aby bylo dosaženo nezávislosti banky, bylo by vhodné, aby stát sponzoroval pouze její zřízení a dále již byla během provozu co nejvíce finančně soběstačná. I investice do založení úřadu by bylo možné pokrýt například z dotací Evropské unie, přičemž právě propojení funkce hospodářské a vzdělávací by mohlo získání těchto dotací usnadnit. Finanční soběstačností není ovšem myšlena pouze nezávislost na státních financích, ale také striktní odmítnutí jakýchkoliv forem sponzorských darů, zejména od subjektů působících v oblasti zemědělství, zpracovatelského nebo potravinářského průmyslu. Jedině tak bude zajištěna nestrannost celé organizace. Zdrojem příjmů genetické banky by vzhledem k charakteru její činnosti mohlo být poskytování odborných laboratorních služeb na objednávku. Ty by byly nabízeny chovatelům, či jiným subjektům zainteresovaným v obchodním řetězci souvisejícím s hospodářskou produkcí a odpovídajícím způsobem zpoplatněny. Jednalo by se konkrétně o služby jako detailní analýzy DNA, vyhledávání konkrétních genů pro významné užitkové vlastnosti, ověřování původu zvířat, určování rodičovství, sestavování rodokmenů, nebo například o dohledávání původu masa zakoupeného koncovým zákazníkem. Při všech těchto činnostech by bylo možné doplňovat výsledky také o údaje z ústředí evidence, se kterou by byla databáze genetické banky přímo propojena. Jako nezisková organizace by měla být schopna tato instituce pokrýt veškeré své náklady vlastní výdělečnou činností. Kromě poskytování laboratorních služeb by k tomu mohlo dopomoci poskytování poradenských služeb v oblasti šlechtění zvířat. Konkrétně asistence při určování šlechtitelských cílů, při volbě vhodných plemen 55
pro požadavky chovu, při výběru nejvhodnějších rodičovských párů, sestavování chovných stád, zpětná kontrola přenosu genetické informace a další. V neposlední řadě by pak propojení genetické banky se zvolenou vzdělávací institucí poskytlo odpovídající prostory a celkově ideální podmínky pro pořádání různých vzdělávacích kurzů a seminářů pro laickou i odbornou veřejnost nebo konání vědeckých konferencí i na mezinárodní úrovni. S těmito aktivitami by byla propojena publikační činnost pro potřeby těchto akcí. Na druhou stranu by genetická banka poskytovala zázemí s odbornými pracovníky a plně vybavenými laboratořemi na vysoké technické úrovni, které by mohla využít spolupracující zemědělská či přírodovědecká vysoká škola pro hlubší vzdělávání svých studentů a pedagogů v oblasti genetiky a šlechtění zvířat. Jako nezisková instituce by musela mít příjmy i výdaje v rovnováze. Tržby ze zpoplatněných služeb, kurzů, seminářů a konferencí by byly obratem využity na platy zaměstnanců, nákup potřebného materiálu pro laboratoře a investice do nových technologií a potřebného vybavení. Pokud by byl provoz i přes doplňkovou výdělečnou činnost ztrátový, rozdíl by byl pokryt částečně nebo zcela granty či dotacemi z fondů Evropské unie nebo státu. Každoročně vypracovávané projekty a žádosti o finance na jejich realizaci by zároveň zajistily, aby byla genetická banka v rámci svého působení mezi předními pracovišti a nezaostávala za světovým vývojem v oblasti genetických technologií. I přes poměrně širokou škálu možností, jak získat finanční prostředky by mohlo dojít k situaci, kdy bude muset na provoz instituce přispívat stát. Podle účetní uzávěrky za předchozí rok by byl vždy pro ten následující vypracován detailní rozpočtový plán. Jeho plnění by bylo dokládáno kvartálně. Pro případ nevyčerpání celé výše státních dotací by byly tyto peníze převedeny do dalšího roku a bude o ně snížena plánovaná dotace na následující účetní období. Při ročním zúčtování by účetní uzávěrka neměla končit v ideálním případě finanční ztrátou ani ziskem. Samozřejmostí by mělo být zveřejnění výsledků hospodaření tak, aby činnost genetické banky byla zcela transparentní, což by přesvědčilo veřejnost o nezávislosti a neovlivnitelnosti instituce a o pravdivosti prezentovaných výsledků její činnosti. Je zjevné, že první roky po spuštění činnosti by banka pravděpodobně nebyla finančně soběstačnou. Souvisí to s počáteční investicí na technické vybavení laboratoří, na specializované přístroje, počítačovou technologii a softwary. V neposlední řadě by 56
byly vybavovány také kanceláře a zázemí pracovníků a nezanedbatelné náklady by přineslo i zaměstnání pracovní síly s odpovídající kvalifikací a odborností. Aby se situace výhledově mohla zlepšit, část vstupních nákladů by putovala také na propagaci instituce a tudíž získání zákazníků pro nabízené služby. Bylo by tedy nezbytné na spuštění činnosti genetické banky získat finance ze státního rozpočtu. Přispět ke schválení investice v takovém rozsahu by mohla optimalizace provozu, tedy maximální využití laboratoří, případného archivu i pracovní síly. Jedním ze způsobů jak ušetřit státní finance by mohlo být funkční spojení genetické banky s Ústřední evidencí skotu. Údaje v registrech těchto dvou organizací by musely být tak jako tak od počátku samozřejmě propojeny, takže by neměl být problém svěřit jejich správu jedné pověřené osobě. Dále je otázkou, zda by bylo nutné uchovávat i samotné vzorky DNA po jejich zanalyzování. Pravdou je, že jejich fyzická archivace by značně navýšila požadavky a finanční náklady na případné úložné prostory. Bylo by třeba zajistit nejen klimatizované prostory, ale také velké množství speciálních chladicích boxů, ve kterých by bylo možné uchovávat odebranou DNA v neporušeném stavu po požadovanou dobu. Samozřejmě dokonale systematicky rozřazenou tak, aby bylo možné konkrétní vzorek okamžitě dohledat. Zejména z důvodů značné finanční a organizační náročnosti takového systému by bylo vhodnější zvolit druhou, jednodušší variantu, kdy by byly archivovány pouze výsledky genetické analýzy, které by tak byly kdykoliv k dispozici pro porovnání s později zkoumaným vzorkem. Genetické metody analýzy DNA by v takovém případě musely být zvoleny tak, aby byly jejich výsledky nezaměnitelné, nezpochybnitelné a aby poskytovaly dostatek relevantních informací, aby bylo možné z nich vycházet při případném porovnávání. Další výhodou archivování výstupů laboratorních analýz místo vzorků samotných je fakt, že je lze uchovávat v elektronické formě. Výsledky analýz jsou zpracovávány speciálními operačními softwary a převáděny do počítače. Tudíž je logické, že by archiv v žádném případě nemusel naplňovat představu o původním významu tohoto slova, ale jednalo by se spíše o elektronickou knihovnu propojenou s laboratořemi a daty v ústřední evidenci. Odebírání genetických vzorků a zejména jejich analýza jsou v současné době ná57
kladnou záležitostí. Nákup potřebného vybavení do laboratoří by byl nejvyšší položkou v investičním plánu při zakládání genetické banky. Materiál na provádění analýz DNA by pak představoval největší objem každoročně vydaných financí. I v této oblasti ovšem platí pravidlo, že čím větší objem, tím nižší cena. Stejně tak lze předpokládat, že by se i zde projevilo působení tržního prostředí, a že při vypsání veřejné zakázky na vybavení a dodávky laboratorního vybavení, by bylo možné stlačit cenu výrazně směrem dolů.
6.3.2.2 Začlenění genetické banky do systému Evropské unie
V případě propojení databáze banky s Ústřední evidencí skotu by nebylo třeba měnit postupy České republiky v rámci celoevropského Systému rychlého varování. Došlo by však ke značnému zkvalitnění a zrychlení dohledávání informací a jejich poskytování evropským úřadům. Lze předpokládat, že pokud by k podobnému zefektivnění došlo i v jiných zemích, Systém rychlého varování by plnil svoji funkci mnohem snáze a nedocházelo by již k podobným aférám, jako bylo například zdlouhavé vyšetřování původu nákazy BSE, zatímco se dále šířila Evropou nebo dioxinový skandál, který nakonec zasáhl mnohem více zemí než Německo. Pro případ vzniku podobných institucí jakou by byla genetická banka i v jiných členských státech Unie by bylo vhodné, aby byla jejich činnost zastřešena a koordinována nadřazenou organizací s totožnou oblastí působnosti. Mohlo by se jednat například o Evropský úřad pro bezpečnost potravin (European Food Safety Authority, EFSA). Tento úřad byl zřízen roku 2002 jako nezávislá instituce Evropské unie pro oblast bezpečnosti potravin a krmiv. Prostřednictvím Systému rychlého varování je propojen s Evropskou komisí a příslušnými státními institucemi ve členských zemích Evropské unie. Kontaktní místo RASFF v České republice funguje od vstupu do Evropské unie v roce 2004 při Státní zemědělské a potravinářské inspekci v Brně a jsou s ním propojeny dozorové orgány a subjekty, jejichž činnost souvisí s bezpečností potravin a krmiv. Pro komunikaci s koncovými spotřebiteli, tedy s veřejností není RASFF primárně určen. 58
Tuto úlohu by mohla mít právě genetická banka, jejíž databáze by byly veřejně přístupné.
7
ZÁVĚR 59
Nedokonalosti odhalené ve fungování systému dohledatelnosti zavedeného v současnosti v České republice, by měly být důvodem k přehodnocení stávajících postupů, případně i legislativy. Oboje totiž, jak bylo prokázáno, poskytují jednotlivým účastníkům obchodního řetězce velký prostor pro manipulaci s uváděnými daty. Kontrolování dodržování předpisů není snadné a je vzhledem k nutnosti ohlašování kontrol dopředu a rozsáhlé papírové administraci v provozech poměrně těžkopádné. Stejně tak ověřování autenticity masa není spolehlivé. Ani koncový zákazník nemá jistotu, že data, která si osobně zjistí prostřednictvím vyhledávacích aplikací Ministerstva zemědělství nebo Českomoravské společnosti chovatelů, budou pravdivá. Už jen proto, že se mezi sebou mohou lišit. Těžko odhadovat, jaká data by pak byla odpovědnými orgány předávána do evropského Systému rychlého varování v okamžiku potenciální hrozby ohrožení zdraví obyvatel České republiky nebo celé Evropské unie.
Poměrně snadným krokem ke zjednodušení a zdokonalení dosavadních postupů a kontrol je převedení příslušné administrativy do výlučně elektronické formy. Pro podmínky České republiky je nyní také aktuální zavedení povinného označování skotu elektronickými identifikátory, nejlépe elektronickými ušními známkami. V rámci Evropské unie je nyní tento systém převážně na bázi dobrovolnosti, jeho zavedení je ponecháno na rozhodnutí každého členského státu. Nicméně výhledově je v plánu, že do několika let bude takové značení povinné, stejně jako je dnes pro ovce a kozy. V případě skotu je však pravděpodobné, že množstevní hranice chovaných kusů, od které již musí stát pro domácí chovatele elektronické známky zavádět jako povinnost, bude výrazně nižší než u ovcí a koz, kdy je podmínkou celková populace těchto zvířat chovaných na území státu přesahující 600 000 kusů.
Výše popisovaná genetická banka by mohla být nástrojem, jak vyzdvihnout českou produkci skotu a hovězího masa nad ostatní státy z pohledu bezpečnosti potravin. Nejen elektronické značení a evidence skotu, ale také analýza DNA jako nástroj pro zaručení původu masa se již v Evropě i ve světě pomalu rozšiřují. V některých zemích již působí v této oblasti komerční subjekty, které mají značný potenciál na ovládnutí příslušných technologií. Každá členská země Unie bude mít zanedlouho na výběr ze dvou možností. 60
První z nich je, že se daná vláda postará o schválení příslušných zákonů a opatření sama s předstihem, čímž získají domácí producenti v budoucích letech výraznou výhodu nad konkurencí. Druhá možnost je, že domácí zákonodárci počkají, až bude Evropská unie nucena přizpůsobit celoevropskou legislativu nevyhnutelnému vývoji a požadavkům trhu a pak budou nuceni přizpůsobit své zákony novým evropským nařízením. V té době již ale bude vývoj příslušných technologií v komerční sféře natolik daleko, že z pozice potenciálního prodejce se stane zákazník, který nebude mít na vybranou, než nakoupit patenty a technologie, které budou nařízením vyhovovat.
Při zavádění nových postupů je tedy nutné mít na paměti, že snahou by nemělo být pouze splnění již daných požadavků nadřízených institucí ale samotný pokrok v technologiích. Jedině tak je možné vyzdvihnout produkci domácích chovatelů skotu a producentů hovězího masa nad produkty z ostatních zemí Evropy i světa. Přitom je však také důležité koordinovat import a export tak, aby většina domácí produkce nešla do zahraničí a tuzemský trh nebyl sycen z většiny dovozovými produkty. Soběstačnost na domácím trhu by měla být hlavní prioritou u všech potravin.
POUŽITÁ LITERATURA 61
EVROPSKÁ KOMISE, 2000: Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č.1760/2000 o systému identifikace a evidence skotu, o označování hovězího masa a výrobků z hovězího masa a o zrušení nařízení Rady (ES) č. 820/97, v platném znění, [cit. 26. 4. 2012]. Dostupné na: http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CELEX:32000R1760:CS:HTM L.
EVROPSKÁ KOMISE, 2002: Nařízení Evropského parlamentu a Rady č. 178/2002, kterým se stanoví obecné zásady a požadavky potravinového práva, zřizuje se Evropský úřad pro bezpečnost potravin a stanoví postupy týkající se bezpečnosti potravin, v platném znění, [cit. 26. 4. 2012]. Dostupné na: http://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2002:031:0001:01:CS:HT ML.
EVROPSKÁ KOMISE, 2002: Nařízení Komise (ES) č.765/2002: „o odběru vzorků a přijetí některých pravidel v souvislosti s fyzickou kontrolou vykostěných kusů hovězího masa, pro které jsou poskytovány vývozní náhrady“, [cit. 26. 4. 2012]. Dostupné na: http://eurlex.europa.eu/Notice.do?mode=dbl&lang=en&ihmlang=en&lng1=en,cs&lng2 =bg,cs,da,de,el,en,es,et,fi,fr,hu,it,lt,lv,mt,nl,pl,pt,ro,sk,sl,sv,&val=273513:cs&page=
MINISTERSTVO VNITRA ČR, 1999a: Zákon č. 110/1999 Sb. o potravinách a tabákových výrobcích a prováděcí vyhlášky, ve znění pozdějších předpisů, [cit. 26. 4. 2012]. Dostupné na: http://portal.gov.cz/wps/portal/_s.155/701?number1=&number2=&name=z%C3%A1ko n+o+potravin%C3%A1ch+a+tab%C3%A1kov%C3%BDch+v%C3%BDrobc%C3%AD ch&text=.
MINISTERSTVO VNITRA ČR, 1999b: Veterinární zákon č. 166/1999 Sb., ve znění pozdějších předpisů, [cit. 26. 4. 2012]. Dostupné na: http://portal.gov.cz/wps/portal/_s.155/701?number1=&number2=&name=veterin%C3% 62
A1rn%C3%AD+z%C3%A1kon&text=. MINISTERSTVO VNITRA ČR, 2000: Plemenářský zákon č. 154/2000 Sb., ve znění pozdějších předpisů, [cit. 26. 4. 2012]. Dostupné na: http://portal.gov.cz/wps/portal/_s.155/701?number1=&number2=&name=plemen%C3 %A1%C5%99sk%C3%BD+z%C3%A1kon&text=.
IDENTIGEN: DNA TraceBack [online]. [cit. 26. 4. 2012]. Dostupné na: www.identigen.com.
MINISTERSTVO ZEMĚDĚLSTVÍ, EAGRI: Portál farmáře: Původ hovězího masa [online]. 2009-2011 [cit. 26. 4. 2012]. Dostupné na: http://eagri.cz/public/app/HoveziMaso/HoveziMaso/Vyhledat.aspx
ČESKOMORAVSKÁ SPOLEČNOST CHOVATELŮ, a.s.: Informace o skotu: Vyhledávání [online]. 2006-2010, 26. 4. 2012 [cit. 26. 4. 2012]. Dostupné na: www.hovezimaso.cz
AQUASOFT, Ministerstvo zemědělství: Integrovaný zemědělský registr: Případová studie [online]. [cit. 26. 4. 2012]. Dostupné na: http://www.aquasoft.eu/upload/1245328660.pdf
PÁRALOVÁ, Viktorie: Genetika zpětné dohledatelnosti u skotu, Bakalářská práce, nepubl., Brno, 2010, 48 s. Dostupné na: http://is.mendelu.cz/zp/index.pl?podrobnosti=31392;zpet=0;vzorek_zp=Viktorie%20P %E1ralov%E1;dohledat=Dohledat;kde=autor;stav_filtr=3;typ=1;typ=1;fakulta=14;fakul ta=14;prehled=vyhledavani;zpet=0
63
