MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
BRNO 2013
VOJTĚCH NOVÁK
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin
Mikrobiální kontaminace strukových násadců u mléčného skotu Bakalářská práce
Vedoucí práce: Ing. Jaroslav Záhora, CSc.
Vypracoval: Vojtěch Novák
Brno 2013
Mendelova univerzita v Brně Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin
Agronomická fakulta 2012/2013
ZADÁNÍ BAKALÁŘSKÉ PRÁCE Autor práce: Studijní program: Obor: Název tématu: Rozsah práce:
Vojtěch Novák Zootechnika Zootechnika Mikrobiální kontaminace strukových násadců u mléčného skotu 30 stran
Zásady pro vypracování: 1. Student v literárním přehledu shromáždí dostupné informace o mikroorganismech kolonizujících prostředí, které je v kontaktu se snadno vstřebatelnými organickými látkami a které může být vektorem přenosu nebezpečných mikroorganismů, přežívajících v podobě mikrobiálního biofilmu na daném nosiči. 2. Na základě shromážděných informací zformuluje student pracovní hypotézu (hypotézy), které se pokusí doložit či vyvrátit modelovým laboratorním pokusem. Práce bude vycházet z běžně zaužívaných technik manipulace se strukovým násadcem. 3. Získané poznatky student ve stručném závěru a doporučení vyhodnotí.
Seznam odborné literatury: MARENDIAK, D. -- KOPČANOVÁ, Ľ. -- LEITGEB, S. Poľnohospodárska mikrobiológia. 1. vyd. Bratislava: Príroda, 1987. 433 s. Schuiling, H.J. , Neijenhuis, F. 2004: Optimal cleaning of equipment Effectiveness of optimised teat cup cleaning in the prevention of mastitis pathogens transfer, 2. Animal Sciences Group, Wageningen UR, Lelystad, The Netherlands (zdroj: http://www.automaticmilking.nl/projectresults/reports/DeliverableD18.pdf) Silva, N., Costa, G.M. 2001: An outbreak of acute bovine mastitis caused by 3. Klebsiella pneumoniae in a dairy herd : ARQUIVO BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINARIA E ZOOTECNIA Volume: 53 Issue: 4 Pages: 401-405 1.
Zadoks, R.N., van Leeuwen, W.B.,; Kreft, D., Fox, L.K., Barkema, H.W., Schukken, Y.H., van Belkum, A. 2002: Comparison of Staphylococcus aureus isolates from bovine and human skin, 4. milking equipment, and bovine milk by phage typing, pulsed-field gel electrophoresis, and binary typing JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY Volume: 40 Issue: 11 Pages: 3894-3902
Datum zadání bakalářské práce:
říjen 2011
Termín odevzdání bakalářské duben 2013 práce:
Vojtěch Novák Autor práce
Ing. Jaroslav Záhora, CSc. Vedoucí práce
prof. Ing. Jaroslav Hlušek, CSc. Vedoucí ústavu
prof. Ing. Ladislav Zeman, CSc. Děkan AF MENDELU
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Mikrobiální kontaminace strukových násadců u mléčného skotu vypracoval(a) samostatně a použil(a) jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a ředitelky vysokoškolského ústavu ICV Mendlovy univerzity v Brně.
Brno, dne …..………………………………
Podpis studenta ……………………………
PODĚKOVÁNÍ Chtěl bych poděkovat vedoucímu mé bakalářské práce Ing. Jaroslavu Záhorovi, CSc. za pomoc, cenné rady a připomínky a trpělivost při psaní mé práce. Dále pak Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph. D. za pomoc s metodikou, odborné vedení a poskytnutí cenných materiálů a rad. Ing. Lence Dostálové za pomoc a dozor nad vypracováním vlastního pozorování. Ing. Dufkové, zootechničce Školního zemědělského podniku Žabčice za ochotu a poskytnutí strukových gum k pokusu. A dále samozřejmě mé rodině, která mne v úsilí podporovala a umožnila mi studium na vysoké škole.
ABSTRAKT Tato bakalářská práce se zabývá problematikou mikrobiologického znečištění strukových násadců u mléčného skotu v prvovýrobě mléka. Úvodní část je zaměřena na výčet základních druhů mikroorganismů, které se mohou reálně vyskytovat v přítomnosti nativního mléka na používaných strukových gumách. Je zde rovněž popsána problematika bakteriálních biofilmů. Druhá část je věnována samotnému strukovému násadci. Jeho popisu, funkci, životnosti a výměně. Třetí část se zabývá hygienou dojnic a pracovníků. Popisuje různé způsoby očisty vemene před samotným dojením, jejich výhody, popřípadě nevýhody. Krátce zmiňuje hygienické požadavky na pracovníky a některá jejich onemocnění. Ve čtvrté části je popsána sanitace dojicího zařízení. Co je to sanitace, její průběh a postupy. V této kapitole je rovněž zmíněno, jakými metodami se může stanovit účinnost sanitaci a její kontrola. V poslední kapitole je uvedeno vlastní pozorování na základě stěrů, výtřepů a kultivací mikroorganismů v kravském mléce z pozorovaných strukových gum, získaných ze Školního zemědělského podniku Žabčice. Klíčová slova: strukový násadec, mikrobiologická kontaminace, mléčný skot, sanitace, hygiena, mléko
ABSTRACT This bachelor thesis deals with issue of microbiological pollution of dairy cattle teat cups in primary production of milk. Opening part is focused on listing essential species of microorganisms which are really be occured in present of native milk on used teat cup rubbers. There is also described problems of microbiological biofilms. Second part is dedicated to teat cups. Its description, function, service life and replacement. Third part deals with hygiene of dairy cows and workers. It describes many ways how to clean the udder before milking, advantages or disadvantages. Shortly describes hygienic requirements on workers and some their illnesses. In fourth part is described sanitation of milking machine. What is the sanitation, its process and procedures. In this chapter is also mentioned, by how methods can be determined effectiveness of sanitation and its control. In the last chapter is indicated my own experiment based on bacterial smear, shake outs and cultivation of microorganisms in cow milk from tested teat rubbers received from School agricultural company in Žabčice. Keywords: teat cup, microbiological contamination, dairy cattle, sanitation, hygiene, milk
OBSAH 1
ÚVOD ..................................................................................................................... 10
2
CÍL PRÁCE ............................................................................................................ 11
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED ........................................................................................ 12 3.1 Mikroorganismy.............................................................................................. 12 3.1.1 Streptokoky ............................................................................................. 12 3.1.1.1 Streptococcus agalactiae .................................................................... 13 3.1.1.2
Streptococcus uberis ........................................................................... 13
3.1.1.3
Streptoccocus dysgalactiae................................................................. 13
3.1.2 Stafylokoky ............................................................................................. 13 3.1.2.1 Staphyococcus aureus......................................................................... 14 3.1.3 Enterobakterie ......................................................................................... 15 3.1.3.1 E. coli .................................................................................................. 15 3.1.4 Enterokoky.............................................................................................. 16 3.1.5 Bacily ...................................................................................................... 17 3.1.5.1 Bacilllus cereus................................................................................... 17 3.1.6 Listeria monocytogenes .......................................................................... 17 3.1.7 Salmonella spp. ....................................................................................... 18 3.1.8 Mykoplazmy ........................................................................................... 19 3.1.9 Leuconostoc ............................................................................................ 19 3.1.9.1 Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris .......................................... 19 3.1.9.2
Leuconostoc lactis............................................................................... 19
3.1.10 Lactococcus............................................................................................. 20 3.1.10.1 Lactococcus lactis ssp. lactis .............................................................. 20 3.2 Mikrobiální biofilmy....................................................................................... 20 3.2.1 Proč biofilmy vznikají?........................................................................... 21 3.2.2 Vznik a vývoj biofilmu ........................................................................... 21 3.3 Strukový násadec ............................................................................................ 23 3.3.1 Struková guma ........................................................................................ 23 3.3.2 Životnost strukové gumy ........................................................................ 24 3.4 Hygiena prvovýroby mléka............................................................................. 25 3.4.1 Hygiena dojnic ........................................................................................ 26 3.4.1.1 Čištění na sucho .................................................................................. 26 3.4.1.2
Čištění mokré ...................................................................................... 27
3.4.1.3
Omytí teplou vodou a mýdlem ........................................................... 27
3.4.1.4
Vlhká utěrka s desinfekčním prostředkem.......................................... 27
3.4.1.5
Plamen................................................................................................. 27
3.4.1.6
Pre-Dipping......................................................................................... 28
3.4.1.7
Post-Dipping ....................................................................................... 28
3.4.2
Hygiena pracovníků ................................................................................ 28
3.4.2.1
Lidská onemocnění způsobená stafylokoky ....................................... 28
3.4.2.2
Lidská onemocnění způsobená streptokoky ....................................... 29
3.4.2.3
Lidská onemocnění způsobená koliformními bakteriemi................... 29
3.5 Sanitace dojicího zařízení ............................................................................... 29 3.5.1 Čištění ..................................................................................................... 30 3.5.1.1 Průběh čištění...................................................................................... 30 3.5.2 Desinfekce............................................................................................... 31 3.5.3 Voda........................................................................................................ 31 3.6 Kontrola účinnosti sanitace............................................................................. 31 3.6.1 Senzorické metody.................................................................................. 31 3.6.2 Fyzikálně –chemické a chemické metody .............................................. 31 3.6.3 Mikrobiologické metody......................................................................... 32 3.6.3.1 Stěrová metoda.................................................................................... 32 3.6.3.2
Metoda otisku na živnou půdu............................................................ 32
3.6.3.3
Výplachová metoda ............................................................................ 32
3.6.4 Komerčně vyráběné testovací sady......................................................... 32 3.6.4.1 ATP test bioluminescence................................................................... 32
4
3.6.4.2
Hygicult............................................................................................... 33
3.6.4.3
Otiskový MIKROBITEST .................................................................. 33
3.6.4.4
Petrifilm destičky ................................................................................ 34
3.6.4.5
Direct epifluorescence method – DEM............................................... 34
MATERIÁL A METODIKA.................................................................................. 35
4.1 Charakteristika Školního zemědělského podniku Žabčice ............................. 35 4.2 Vlastní materiál a metodika ............................................................................ 35 4.3 Složení použitých živných půd ....................................................................... 37 5 VÝSLEDKY ........................................................................................................... 39 6
ZÁVĚR ................................................................................................................... 47
7
POUŽITÁ LITERATURA ..................................................................................... 48
8
SEZNAM TABULEK ............................................................................................ 52
9
SEZNAM OBRÁZKŮ............................................................................................ 53
1
ÚVOD Mléko a mléčné výrobky dnes patří mezi nejsledovanější a nejkontrolovanější
potraviny vůbec. Mléko svým složením představuje vhodné prostředí (bílkoviny, mléčný tuk, laktóza, vhodné pH) pro růst a množení nejrůznějších mikroorganismů, včetně těch patogenních, jak pro člověka, tak pro zvíře. Mikroorganismy a jejich metabolity mohou rovněž nepříznivě ovlivnit kvalitu samotného mléka a následně případný proces zpracování do mléčných výrobků. I přes to, že u nás několik posledních let klesá spotřeba mléka i mléčných výrobků, je třeba stále dbát na vysoké hygienické standardy a to zejména v prvovýrobě mléka. Musíme se zabývat zejména zdravotním stavem dojnic, dostatečnou péčí o mléčnou žlázu před i po dojení, o perfektní stav dojicího zařízení, jako je jeho seřízení a čistota a v neposlední řadě i o zdravotní stav a hygienu pracovníků.
10
2
CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce je stručně popsat vybrané mikroorganismy, schopné
růstu a množení v podmínkách výskytu nativního mléka. Seznámit se s průběhem a postupy čištění a desinfekce dojicího zařízení a následné kontroly účinnosti této sanitace, se zaměřením na strukové násadce. V neposlední řadě také na základě vlastního pokusu stanovit přítomnost mikroorganismů ve vyřazených strukových gumách a využít tak získaných znalostí v praxi.
11
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1 Mikroorganismy V následujícím přehledu je uvedeno několik vybraných zástupců mikroorganismů, kteří se mohou reálně vyskytovat ve strukových násadcích po jejich běžném používání. Patří mezi ně mikroorganismy prospěšné, ale i některé podmíněné patogeny. Ty mohou být nebezpečné jak v potravním řetězci a pro zaměstnance dojíren, tak pro následné zpracování do mléčných výrobků a pro samotná zvířata, například v podobě mastitid. Výzkum syrového kravského mléka dle Seydlové a Snášelové (2010) potvrdil přítomnost mikroorganismů jako je Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Streptococcus agactiae, Streptococcus uberis a Enterococcus spp. 3.1.1
Streptokoky Streptokoky zahrnují velkou skupinu bakterií s rozmanitými vlastnostmi. Jsou to
grampozitivní koky, které se shlukují do dvojic či do řetízků. Některé mohou být patogenní, jiné saprofytické. Patogenní dokáží vyvolat různá onemocnění lidí a zvířat, mnohdy i vážná.
Významnou morfologickou vlastností streptokoků je jejich růst v řetízcích, v nichž jsou jednotlivé buňky spojeny tenkým můstkem původem z buněčné stěny. Řetízky se obvykle skládají z osmi až deseti buněk. Průměrná velikost jedné buňky je za optimálních podmínek 1 mikrometr. Řetízky proto mohou dosahovat délky 8 – 10 mikrometrů. Streptokoky jsou poměrně náročné na podmínky prostředí pro svou kultivaci (Boddie et al. 1993). Vyžadují mnoho růstových faktorů, bílkoviny a optimální teplotu 37 °C. Méně náročné jsou enterokoky, jež jsou odolné vůči teplotě a hypertonickému prostředí. Některé streptokoky tvoří v mladých kulturách pouzdro z hyaluronové kyseliny, která později zaniká vlivem vlastní hyaluronidásy. Podle antigenních vlastností skupinové C substance lze rozdělit streptokoky do 16 skupin, označovaných písmeny A až Q (Patočka et al. 1972).
12
3.1.1.1 Streptococcus agalactiae Patří do B skupiny streptokoků a dříve hrál klíčovou roli jako původce mastitid u krav. Na rozdíl od jiných streptokoků potřebuje ke svému přežití mléčnou žlázu (Kudláč et al. 1977). Mimo vemeno přežívá jen krátkou dobu (Schuiling et al. 2004), zpravidla 4 – 7 dní a to hlavně díky čistému prostředí. V hygienicky závadných provozech se dokáže ve vnějším prostředí udržet až 21 dní, ale i déle. 3.1.1.2 Streptococcus uberis Tento mikrob se vyznačuje větším počtem lokalit, kde může být na těle skotu nalézán. Je součástí běžné mikroflóry gastrointestinálního traktu a nachází se jak v obsahu střev, tak i v bachoru (Kudláč et al. 1977). Do vnějšího prostředí se dostává společně s výkaly. Sekundárně se tedy může nacházet na sliznici v okolí rekta, na kůži zadních končetin a na mléčné žláze. Streptococcus uberis se rovněž vyznačuje dobrou schopností odolávat vysychání ve vnějším prostředí. Tato vlastnost mu umožňuje přežívat na kůži a v srsti po několik týdnů. 3.1.1.3 Streptoccocus dysgalactiae Pyogenní (vyvolávající hnisání) streptokok, který je svou existencí více vázán na svého hostitele. Vyskytuje se na mnoha místech těla, například na sliznici vagíny, hltanu a ve tkáni tonsil – krčních mandlí. Není tedy běžným obyvatelem obsahu střevního traktu, což se projevuje zejména odlišným způsobem kolonizace jedinců. K jeho přenosu dochází přímým i nepřímým kontaktem, díky čemuž dochází především ke kolonizaci sliznic. Z toho vyplývá, že výskyt S. dysgalactiae není přímo spjat se stájovou hygienou a k jeho přenosu dochází zejména mezi zvířaty pomocí dojícího zařízení. 3.1.2
Stafylokoky Stafylokoky jsou převážně nebezpečnými původci hnisavého onemocnění člověka
(Šilhánková 2005) a proto jsou stejně jako streptokoky řazeny v důležitosti sledování na prvních místech. Stafylokoky jsou grampozitivní koky, často uspořádané do menších či větších shluků, které mohou připomínat hrozny. Své morfologické vlastnosti ovšem mohou v organismu ztrácet a to zejména vlivem antibiotik (Patočka et al. 1972). Vzhledem k podmínkám růstu, jsou stafylokoky poměrně málo náročné. Dobře rostou v teplotním rozmezí od 10 °C do 42 °C a dobře snášejí i přídavek 10 % NaCl
13
(Patočka a Schindler 1972). Na agarové půdě vytvářejí nerozpustný žlutý až zlatožlutý pigment, jímž se zabarvují kolonie. Dokáží růst i za anaerobních podmínek. Jejich mukoidní pouzdro je tvořeno mukopeptidem, který obsahuje aminokyseliny, glukosamin a redukujícími sacharidy. Toto pouzdro je rozpustné a uvolňuje se do prostředí během růstu.
Stafylokoky mikroorganismů.
můžeme
řadit
V zaschlém
mezi hnisu
jedny zůstávají
z nejodolnějších živé
po
nesporulujících několik
týdnů
(Patočka a Schindler 1972). Při teplotě 60 °C až 70 °C umírají za 1 hodinu. Tyto bakterie do prostředí dokáží produkovat řadu toxických antigenů a enzymů. Některé z nich mohou mít i význam pro vznik onemocnění. V souvislosti s mlékem může být pro člověka nebezpečný stafylokokový enterotoxin. Ten způsobuje po požití potravin, v nichž se stafylokokus pomnožil, alimentární choroby. Mezi prvními příznaky se objevuje slinění, zvracení, křeče v oblasti břicha a průjem. Při těžším průběhu se k příznakům přidává ještě velmi silná bolest hlavy a pocení. Onemocnění není zpravidla smrtelné a postižený člověk se velmi rychle uzdravuje. Nepřehlédnutelný
faktor,
napomáhající
vzniku
onemocnění
stafylokokem
je
přecitlivělost. Jedná se zejména o oběhové změny i s poškozením buněk. Takto poškozená tkáň umožňuje stafylokokům snadné uchycení, produkování toxických látek a jejich další šíření. Může se tedy jednat například o traumatizaci mléčné žlázy nesprávnou technikou dojení. Do rodu Staphylococcus patří více druhů, mezi nejvýznamnější zařazujeme Staphyococcus aureus, Staphylococcus pyogenes a Staphylococcus epidermidis. 3.1.2.1 Staphyococcus aureus Je klasickým zástupcem původců mastitid u mléčného skotu, jejichž četnost závisí zejména na úrovni stájové hygieny a veterinární péče. Velikost buňky je 0,7 – 0,9 mikrometrů. Běžně se v menších počtech vyskytuje na sliznici hltanu a ve tkáni tonsil. Riziko zvýšení frekvence výskytu a následné šíření, jež je spojeno s rizikem vzniku mastitid, je závislé na predispozičních faktorech (Boddie et al. 1993).
14
3.1.3
Enterobakterie Dle Schöna a Patočky (1972) jsou definovány jako aerobní, gramnegativní a
nesporulující tyčinky. Pokud jsou pohyblivé, jsou vybaveny bičíky (skupina peritricha). Na podmínky růstu jsou poměrně málo náročné, kultivace je možná i na běžných kultivačních půdách. Optimální teplota pro růst se až na výjimky pohybuje okolo 37 °C, teplota 80°C je ničí do 5 minut a 100 °C je bezpečně likviduje do 1 minuty. Ideální reakce prostředí je v rozmezí pH 6,8 – 7,2. Ve vnějším prostředí jsou poměrně odolné. 3.1.3.1 E. coli Patří ke zcela běžné a fyziologické mikroflóře střev teplokrevných živočichů, které osidluje bezprostředně po narození. Jsou to gramnegativní, nesporulující tyčinky. Jejich tvar je značně variabilní. Velikost se obvykle pohybuje v rozmezí 1,1 – 1,5 x 2 - 6 mikrometrů (Jičínská a Havlová 1995). Rostou v rozmezí 7 °C – 46 °C, ideálně pak při 20 °C až 40 °C. Teplota 60 °C je ničí již za 30 minut. E. coli jsou poměrně odolné vůči vlivům vnějšího prostředí. Mimo organismus vydrží velmi dlouho ve vlhkém prostředí, odpadních vodách, výkalech, ale i pitné vodě (Šilhánková 2005). Proto jsou vhodnými indikátory fekálního znečištění pitné vody. Ideální pH je 4,4 – 9, aktivita vody nad 0,96. Nesnáší 8,5 % NaCl. E. coli je možným původcem průjmových onemocnění, infekcí močových cest, žlučových cest, případně zápalu plic. Kmeny, které vyvolávají průjmová onemocnění, můžeme rozdělit do 4 hlavních skupin: EPEC (Enteropatogenní E. coli), které způsobují průjmy u novorozenců a kojenců. ETEC (Enterotoxické E. coli), způsobující průjmy hlavně v rozvojových zemích a u turistů. EIEC (Enteroinvazivní E. coli), vyvolávající onemocnění podobné bacilární úplavici. EHEC (STEC, VTEC, Enterohemoragická E. coli), která je nejrizikovější pro zdravotní nezávadnost mléka. EAggEC (Enteroagregativní E. coli)
15
E. coli kontaminující syrové mléko je častou příčinou gastroenteritid, zejména na farmách. Pití syrového mléka na farmách a v mlékárenských provozech jejími zaměstnanci, může být příčinou vzniku nových bacilonosičů a šíření infekcí (Kalhotka 2009). Výskyt E. coli v mléce a mléčných výrobcích je rovněž ukazatelem nepříliš dobré úrovně sanitace a hygieny v prvovýrobě mléka (Jičínská a Havlová 1995). 3.1.4
Enterokoky Jsou to grampozitivní koky ovoidního tvaru, fakultativně anaerobní, vyskytující se
v celé škále prostředí, jako je voda, půda či rostliny a jsou to běžní obyvatelé trávicího traktu lidí i zvířat. Nacházejí se buď jednotlivě, ve dvojicích, ve shlucích nebo v krátkých řetízcích. Jsou nesporulující a netvoří pouzdra. Některé mohou být pohyblivé. Rostou v rozmezí teplot 10 °C – 45 °C, teplotní optimum je 35 °C (Facklam et al. 1999). U dojnic se nacházejí jak v bachoru, tak i v tenkém a tlustém střevě. To je způsobeno jejich vysokou odolností zejména vůči působení žlučových kyselin, osmotického tlaku, střevních enzymů a pH až do hodnoty 9,6 (Smola a Haas 2003). Do vnějšího prostředí se dostávají spolu s výkaly, kde dokáží přežívat týden až měsíce, jelikož mají výbornou schopnost přežívat jak v suchém, tak i ve vlhkém prostředí. Enterokoky mohou být infekčním agens mnoha nemocí. Pro člověka jsou nebezpečné zejména vysoce odolné kmeny, způsobující nosokomiální infekce. Mohou se však využívat i jako startovací kultury masných a mléčných výrobků. Enterokoky byly izolovány z mnoha mléčných výrobků, například zrajících sýrů (Snášelová 2011)., másla, zmrzliny, smetany, výrobků s jogurtovou kulturou, ale především z pasterovaného, sušeného, ale i čerstvého mléka. Právě mléko je pro enterokoky výborným růstovým substrátem. Dostávají se do něj díky znečištěné vodě, nedostatečně sanitovaným zařízením ve výrobě a v prvovýrobě přímo z dobytka. Z enterokoků jsou známi především dva zástupci a to Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium. Jako původce mastitid byly prokázány druhy Enterococcus gallinarum a Enterococcus casseliflavus.
16
3.1.5
Bacily Rod Bacillus zahrnuje tyčinkovité aerobní bakterie, většinou grampozitivní, mající
velmi často schopnost pohybu. Mají schopnost vytvářet vysoce odolné endospory. Je to schopnost vytvořit sporu uvnitř mateřské buňky, která se následně rozpustí. Až na několik
výjimek
žijí
bacily
v povrchových
vrstvách
půdy
a
ve
vodě
(Patočka et al. 1972). 3.1.5.1 Bacilllus cereus Je tyčinkovitá, grampozitivní bakterie, mající schopnost pohybu. Velikost se pohybuje v rozmezí 1 x 3 – 10 mikrometrů. Náleží do čeledi aerobně a fakultativně anaerobních bakterií Bacillaceae. Optimální teplota pro růst je 28 °C – 35 °C, roste však i v rozmezí od 10 °C do 48 °C. Jsou to pohyblivé tyčinky, jež se mohou vyskytovat jednotlivě, ve dvojicích či řetízcích. Významným znakem je tvorba jedné endospory, která je charakteristická velkou odolností k vysokým teplotám, jedům, záření a jiným nepříznivým podmínkám (Kolář 2001). Dokáže produkovat řadu enzymů a toxinů, mezi než patří například fosfolipáza C, hemolysyny, cereolysiny. Způsobuje těžké enterotoxikózy. Je to běžně rozšířený mikroorganismus, který se vyskytuje v půdě, prachu i vzduchu, roste na rozkládajících se zbytcích rostlin, hnoje, krmivech (Jičínská a Havlová 1995). Jako zdroj mohou působit i dojnice, u kterých B. cereus může vyvolat mastitidu. Přenos je uskutečněn pomocí požití infikované potraviny, která nebyla vhodně uskladněná. Může se jednat například o mléko, rýži, těstoviny, zeleninu ale i masné výrobky. Je považován za jednoho z nejrizikovějších bakteriálních kontaminantů mléka. Ke kontaminaci nejčastěji dochází během dojení ze znečištěných vemen. Rovněž musíme brát v úvahu vzdušnou kontaminaci sporami, zvláště pokud dojení probíhá přímo ve stáji (Kalhotka 2009). 3.1.6
Listeria monocytogenes Jsou grampozitivní tyčinky o velikosti 1 – 2 mikrometry. Jsou fakultativně
anaerobní až aerobní, nesporulující (Patočka et al. 1972). Druh monocytogenes roste při
17
teplotách 5 °C – 45 °C, ale odolává i 0 °C. Není příliš náročná na kultivační podmínky. Snáší 10 – 20 % NaCl. Optimální pH je v rozmezí 5 – 10. Vystavení teplotě 58 °C po dobu 10 minut nepřežívá, proto ji likviduje běžná pasterace mléka. Rezervoárem Listeria monocytogenes je nejčastěji člověk, vyskytuje se rovněž na sliznicích domácích, ale i divokých savců. Byl popsán v prachu, vodě, půdě, v kanalizaci, na rostlinách i v krmivech. Rovněž se může vyskytovat v trávicím traktu volně žijících zvířat. Přenáší se nedostatečně tepelně upravenou potravou, ale i z matky na plod. Inkubace trvá 3 – 70 dní. Jako nejčastější zdroj infekce u hospodářských zvířat se považují nekvalitní siláže, díky těmto infekcím může docházet ke kontaminaci mléka a rovněž díky chronickým mastitidám (Jičínská a Havlová 1995, Kalhotka 2009).
3.1.7
Salmonella spp. Jsou gramnegativní tyčinky o velikosti 0,7 – 1,5 x 2 – 5 mikrometrů, fakultativně
anaerobní. Růstově jsou salmonely poměrně málo náročné. Množí se při teplotách 15 °C – 40 °C a tepelné optimum je 37 °C. Velmi dobře se množí v pasterovaném mléce, vaječné melanži i mletém mase za vhodných teplot. Varem se ničí během 1 minuty, 80 °C ji usmrcuje za 5 minut. Jsou však poměrně rezistentní proti chladu, při teplotě pod bodem mrazu vydrží virulentní několik měsíců (Patočka et al. 1972). pH pod 4 a nad 8 působí inhibičně. Mezi nejčastější původce onemocnění u lidí v Evropě patří Salmonella enterica subsp. enterica sv. Enteritidis. Ta způsobuje gastroenteritidy, dokonce i u zvířat. Druhým nejčastějším původcem gastroenteritid je S. enterica subsp. enterica sv. Typhimurium. Rezervoárem kontaminace v prvovýrobě mléka salmonelou jsou zvířecí přenašeči, mezi něž patří hospodářská i volně žijící zvířata a ptáci. Přenáší se zpravidla prostřednictvím
potravy nebo
pitné vody,
infikované fekálním
znečištěním.
K vylučování salmonel do mléka může docházet i vlivem salmonelové mastitidy (Jičínská a Havlová 1995, Kalhotka 2009).
18
3.1.8
Mykoplazmy Jsou nejmenší prokaryotické buňky, které postrádají buněčnou stěnu. To je dáno
tím, že nedokáží syntetizovat peptidoglykan. Z toho vyplývá, že buňky mohou zaujímat různý tvar, nejčastěji však můžeme pozorovat různě dlouhá vlákna. Nebarví se dle Grama a netvoří endospory. Jsou nepohyblivé, fakultativně anaerobní. S výjimkou saprofytických druhů jsou růstově velmi náročné a jejich nároky se liší s druhem. Nejčastěji se vyskytují na sliznicích respiratorního a urogenitálního ústrojí. Jsou známi zejména jako extracelulární parazité, těsně nasedající na hostitelskou buňku, ze které získávají přes stěnu energii potřebnou pro vlastní metabolismus (Snášelová 2011). Jak uvádějí Smola a Haas (2003), u případů mastitid, kde nebyl prokázán „klasický bakteriální“ původce při kultivaci na běžných půdách, se můžeme domnívat, že na nich mohou mít podíl některé druhy mykoplazmat. Úspěšným použitím antibiotik při terapii se tato domněnka potvrdila. Jelikož se jedná o mikroorganismus zcela závislý na svém hostiteli, je zřejmé, že k infekci mléčné žlázy dochází kontaktem. Takto získané mastitidy tedy mají typicky infekční charakter. Jako hlavního zástupce mykoplazmat s afinitou k mléčné žláze můžeme uvést Mycoplasma bovis. Je jedním z nejvirulentnějších druhů mykoplazmat skotu a vyvolává těžké mastitidy. 3.1.9
Leuconostoc Tento rod zahrnuje kokovité, fakultativně anaerobní, grampozititivní bakterie,
uspořádané v párech. Jsou nepohyblivé a netvoří spory. Přirozeně se vyskytují na pastvinách a v trávnících a posléze v mléce. Zde působí jako kultura vytvářející aroma (Suková 2011). Patří mezi bakterie mléčného kvašení. 3.1.9.1 Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris Ze všech leukonostoků je nejméně aktivní, ale nejnáročnější na růstové faktory s ohledem na vitamin B a aminokyseliny. Přirozeně se nachází v mléce a mléčných výrobcích. Je přítomný i v mezofilních smetanových kulturách (Görner a Valík 2004). 3.1.9.2 Leuconostoc lactis Fermentuje laktózu rychleji, než ostatní druhy. Snáší teplotu 60 °C až po dobu 30 minut. Bývá izolován jen zřídka a to zejména z mléka a mléčných výrobků (Görner a Valík 2004).
19
3.1.10 Lactococcus Rod Lactococcus patří do mléčné skupiny streptokoků. Zahrnuje několik druhů, například Lactococcus lactis ssp. cremoris, Lactococcus raffinolactis, Lactococcus lactis ssp. hordniae, Lactococcus plantarum, Lactococcus garviae a Lactococcus lactis ssp. lactis (Görner a Valík 2004). 3.1.10.1 Lactococcus lactis ssp. lactis Je v mlékařství nejrozšířenějším mikroorganismem. Množí se v čerstvě, hygienicky čistě nadojeném mléce, kde také způsobuje kvašení. Buňky zaujímají vejčitý tvar o velikosti 0,5 – 1 mikrometrů. Nacházejí se většinou v párech nebo krátkých řetízcích. Je součástí běžně používaných mlékařských kultur, k výrobě sýrů a zakysaných smetan (Görner a Valík 2004).
3.2 Mikrobiální biofilmy V následující kapitole je popsána problematika bakteriálních biofilmů, které mohou představovat značná zdravotní rizika. Mezi mikroorganismy, které jsou schopny tvořit biofilmy v provozech výroby nebo zpracování mléka patří například Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, koaguláty-pozitivní stafylokoky a čeleď Enterobacteriaceae (Kunová et al. 2010) a Leuconostoc spp. Bakterie v přírodních populacích vykazuje zřetelnou tendenci přisedat k různým povrchům. Existence bakterií v biofilmu je pro ně z mnoha důvodů výhodnější a v mnoha prostředích je to také způsob jejich přirozeného výskytu. Kromě přírodního prostředí se biofilmy vyskytují také v mnoha humánních prostředích. Zde mohou způsobovat problémy v podobě znečištění povrchů či korozí, nebo se stávají zdrojem patogenní infekce (Rulík et al. 2011). Jedna
z definic
z mikroorganismů
biofilmu
(bakterií,
řas
zní:
„Je
hub,
aktivní prvoků,
biologická
vrstva
mnohobuněčných)
složená a
jejich
extracelulárních polymerních produktů, která je přichycena na povrchu nejrůznějších podkladů, které jsou v kontaktu s vodou.“ (Rulík et al. 2011). Právě přítomnost vody je klíčová pro vznik biofilmu.
20
3.2.1
Proč biofilmy vznikají? Růst mikroorganismů ve formě biofilmu je pro ně výhodný. Oproti planktonní
formě (nepřisedlé, rostoucí či suspendované v tekutém médiu) poskytuje biofilm bakteriálním buňkám ochranu, udržuje určitý stupeň homeostázy a vytvořená biofilmová vrstva obklopující mikroorganismy představuje bariéru, která izoluje buňky od okolí. Ty mají například vyšší odolnost vůči toxickým látkám, mechanickému poškození, UV záření, bakteriofágům či antibiotikům. Dle Rulíka (2011) se v současnosti hovoří o 4 důvodech, proč bakterie tvoří biofilmy: 1. ochrana před nepříznivými vlivy hostitele 2. usazení se do prostředí bohatého na živiny (kolonizace) 3. využití výhod kooperace (společenstva) 4. biofilmy normálně rostou jako biofilmy a planktonní kultury jsou pouze in vitro artefakty 3.2.2
Vznik a vývoj biofilmu Vznik, vývoj a stabilizace biofilmů probíhá v následujících krocích, které lze
stručně popsat jako: (1) transport a adsorpce organických molekul substrátu na povrchu nosiče („conditioning“), (2) transport buněk k povrchu nosiče, transformace těchto buněk z reverzibilních na ireverzibilní adsorpci, (3) zachycení mikroorganismů na povrchu, replikace sesilních buněk (pevně přirostlých) a produkce extracelulární matrice a jiných metabolitů, (4) vývoj biofilmu na povrchu nosiče – odumírání některých buněk, kontinuální replikace částí biofilmu, (5) odtrhávání a disperze některých buněk biofilmu zpět do kapaliny (Rulík et al. 2011).
21
Obrázek 1 - Fáze vývoje biofilmu (Rulík et al. 2011)
Zachycování buněk substrátu na nosič je rychlý proces. Bakterie používají k adhezi povrchově aktivní molekuly, zvané adheziny. To mohou být látky různé povahy, může se jednat o bílkoviny, glykopeptidy či polysacharidy. Po přichycení se buňky začnou dělit a tvoří tzv. „primární biofilm“, na kterém se mohou zachytávat a akumulovat další buňky, tvořící „sekundární biofilm“. Na vývoj biofilmu působí celá řada faktorů, mezi nejdůležitější patří povrch nosiče a okolní podmínky. Drsné a porézní povrchy pozitivně ovlivňují tvorbu biofilmu. Vhodná teplota pro růst biofilmu je v rozmezí od 25 °C do 55 °C. Dalším faktorem, který souvisí s rychlostí tvorby biofilmu je přítomnost a množství nutrientů v médiu.V nutričně bohatém prostředí se formuje rychle, zatímco hladovění je jedním ze spouštěcích signálů pro odpoutávání buněk z povrchu (Rulík et al. 2011). Ideální teplota, přítomnost vody a nutričních látek zvyšuje pravděpodobnost vzniku mikrobiálního biofilmu na strukových násadcích a v celém dojicím zařízení. Jeho rizika spočívají ve vysoké odolnosti vůči čisticím a desinfekčním prostředkům a v oddělování jednotlivých fragmentů biofilmu, které se mohou dále usazovat a tím šířit infekci.
22
Odstranění již existujícího biofilmu je poměrně obtížné. Samotné působení mikrobicidního prostředku není vždy plně účinné, jelikož buňky chrání vrstva extracelulárních produktů. Je proto nutné nejprve mechanicky tuto vrstvu narušit a zajistit tak přístup biocidního přípravku. Účinnost však může být omezena zhoršeným příjmem a výdejem látek z prostředí (biocidního přípravku) těmito strádajícími buňkami.
3.3 Strukový násadec Strukový násadec se skládá z pouzdra a strukové gumy. Válcovité pouzdro strukového násadce má vzduchový nátrubek, kterým se přivádí pulzující tlak. Pouzdra mohou být kovová nebo plastová. Dle Přikryla (1997) se násadec sestaví tak, že se struková guma vloží do pouzdra a zajistí, například pomocí vrubů v dolním zúženém otvoru pouzdra. Jednotlivé typy strukových násadců se různí provedením podle výrobců a firem zabývajících se mechanizací dojení. Průměry pouzdra a strukových gum jsou řešeny tak, aby se daly použít i u mléčné žlázy, na níž jsou struky blízko u sebe. Po nasazení strukového násadce na struk, vzniknou dvě vzduchotěsně oddělené komory. Komora podstruková je spojena přes sběrač s konví nebo s mléčným potrubím mléčnou hadičkou a hadicí. Komora mezistěnná, která leží mezi strukovou gumou a pouzdrem je spojena přes rozdělovač s pulsátorem. Pulzátor vzduch z komory odsává a následně zpět vpouští atmosférický tlak v pravidelných intervalech. Tím dochází ke střídání tlaků mezi podstrukovou a mezistěnnou komorou, díky čemuž dochází k deformaci strukové gumy a díky stálému podtlaku v podstrukové komoře k samotnému dojení. Vlastní kontakt mezi strukem a strukovým násadcem se uskutečňuje pomocí strukové gumy (Přikryl 1997). 3.3.1
Struková guma Je to nejnamáhanější součást dojicí soupravy. Skládá se z hlavice a z pracovní
válcové, vrubové části a krátké mléčné hadičky. Pomocí vrubové části se napíná struková guma v pouzdru. Její pružnost má při stisku umožňovat správné dolehnutí stěn gumy v části pod strukem těsně k sobě a tím odlehčit strukovému kanálku a tkáni mléčné žlázy od působení podtlaku. Tvar strukových gum zajišťuje přilnavost a nesmí způsobovat poranění struků. Ideální je její nízká hmotnost a to z důvodů minimalizace zatížení strukových násadců a
23
omezení rizika spadnutí nebo sklouznutí ze struků. Jejím opotřebováním se snižují její mechanické vlastnosti (Přikryl 1997). Tím se nejen zhoršuje působení dojicího zařízení na mléčnou žlázu, ale opotřebované porézní strukové gumy mohou snadněji odolávat čištění a desinfekci a tím umožňovat přežívání choroboplodných zárodků.
Obrázek 2 – Princip činnosti strukového násadce (upraveno dle Javic a Conroy 2001)
3.3.2
Životnost strukové gumy Struková guma je denně vystavena extrémním podmínkám. Pracuje až
200 000-krát měsíčně, pulzuje ideálně jednou za sekundu a díky tomu se může její délka zvýšit až o 20 %, oproti své původní délce (Přikryl 1997). Drobné prodloužení je znázorněno na obrázku 2. Jedná se o strukovou gumu firmy DeLaval, která se za dobu své činnosti (3 měsíce) prodloužila o 6 mm.
24
Obrázek 3 – Nepoužitá struková guma (a.) a guma vyměněná po 3 měsících (b.) (Archiv autora 2013)
Svým opotřebením ztrácí struková guma pružnost a efektivnost dojení se snižuje. Dle Přikryla (1997) mezi faktory ovlivňující opotřebení strukových gum patří: mechanické opotřebení, narušení mléčným tukem, vodou, detergenty, desinfekční prostředky, vzduch, sluneční záření a vysoké teploty. Hrubý povrch poskytuje možnost kontaminace širokému spektru bakterií, které mají negativní vliv jak na zdraví dojnice, tak i kvalitu mléka a mléčných výrobků. Takto se mohou uplatnit například koliformní bakterie (E. coli, rod Enterobacter) (Mikulová 2012). Životnost strukové gumy se liší zpravidla dle výrobce. Například Spaggiari Italiano uvádí u svých strukových gum životnost 850 hodin nebo 2500 cyklů. GEA farm technologies garantuje 750 provozních hodin. Životnost strukových návleček DeLaval, jejíž výrobky jsou používány i ve školním zemědělském podniku Žabčice, je rovněž 850 – 1000 hodin nebo 2500 cyklů. Pravidelná výměna strukových gum se ve školním zemědělském podniku Žabčice provádí 1 krát za 3 měsíce.
3.4 Hygiena prvovýroby mléka Mléko je velmi nestálá surovina, jeho složení, výživná a biologická hodnota a smyslové vlastnosti mohou být velmi snadno ovlivnitelné činností mikroorganismů. Proto je důležité během celého procesu získávání a ošetřování mléka dbát na splnění dvou hygienických zásad. Omezit na co nejmenší míru možnost infekce mléka
25
mikroorganismy z vnějšího prostředí a zabránit množení a projevům aktivity mikroorganismů, které do mléka pronikly v průběhu jeho získávání a zpracování (Hökl a Štěpánek 1962). Některé změny, které choroboplodné zárodky v mléce způsobují, jsou totiž nevratné, jako například rozklad některých cenných složek mléka (mléčné bílkoviny, mléčný tuk a laktóza). Závisí tedy především na způsobu získávání a ošetřování v místě produkce mléka. 3.4.1
Hygiena dojnic Existuje vztah mezi čistotou dojnice, mléčnou žlázou a mikrobiologickým
obrazem nadojeného mléka. Bylo prokázáno, že mléko od znečištěných dojnic obsahuje po nadojení více než pětinásobné množství zárodků, než mléko získávané od čistých dojnic ve stejných podmínkách. Zvířata se při pobytu ve stáji velmi snadno znečistí prachem, stelivem a výkaly (Hökl a Štěpánek 1962). S ohledem na požadavky hygienického získávání mléka nás zajímají především oblasti zadních končetin, boků a samotné
mléčné
žlázy,
které
bývají
znečištěné
nejvíce.
Bohatým
zdrojem
mikroorganismů jsou právě nečistoty ulpívající na srsti dojnice. Velký význam v hygieně dojnic a mléka má očištění vemene bezprostředně před zahájením dojení. Hlavní hygienické závady spočívají převážně v omývání vemen znečištěnou, nedostatečně temperovanou vodou bez desinfekčních přípravků, otírání vemen vlhkými a znečištěnými utěrkami, bez jejich výměny při velkém počtu dojnic. Ideálně se na každou dojnici používá nová utěrka. Dále pak v nedostatečném čištění a desinfekci strukových násadců a dalšího příslušenství používaného během procesu dojení. Ještě před ošetřením struků před dojením je vhodné provést kontrolní odstříknutí mléka, ideálně do nádobky s černým dnem. Tímto postupem zkontrolujeme senzoricky stav mléka (vločky, zbarvení) a navíc uvolníme a promyjeme strukový kanálek, který může být zdrojem silné mikrobiální kontaminace. 3.4.1.1 Čištění na sucho Vemeno i struky se otřou suchou čistou utěrkou nebo jednorázovým papírovým ubrouskem. Takto se odstraní větší částice a nečistota, která na vemeni a strucích pevně nelpí. Je to ideální způsob pro jedince, jejichž mléčná žláza je udržovaná ve vzorné
26
čistotě. Dle Seydlové (2007) čištěním na sucho snížíme mikrobiologickou kontaminaci o 4%. 3.4.1.2 Čištění mokré Musí se vždy provádět temperovanou vodou a čistou utěrkou. Teplota vody navíc pomáhá reflexu spouštění mléka (Bruckmaier et al. 2001). Je nepřípustné omývat vemeno vodou studenou. Výhodou mokrého čištění je, že odstraní i ulpívající nečistoty. Nevýhodou je však neuspokojivý mikrobiologický efekt. Mokrou utěrkou se zárodky homogenně rozplaví po mléčné žláze a mohou infikovat strukový kanálek. Navíc, pokud bychom takto umyté vemeno neotřeli jednorázovým papírovým ubrouskem či utěrkou, došlo by ke znečištění a infekci nadojeného mléka stékající vodou po struku do strukového násadce. Dalším faktorem je množství použité vody a její kvalita. Jednou použitá voda k čištění se již znovu nesmí použít k omytí mléčné žlázy jiné dojnice. Díky vlhké utěrce se však mikrobiální kontaminace může snížit až o 40% (Seydlová 2007). 3.4.1.3 Omytí teplou vodou a mýdlem Dříve se tato metoda používala u silně znečištěných mléčných žláz. Výhodou je snadnější odstranění nečistot a působí zde i mírný desinfekční účinek. Po opláchnutí vemene mýdlem je opět nutné použít jednorázové suché ubrousky nebo utěrky, aby nedocházelo k již zmíněnému znehodnocení nadojeného mléka. Nevýhodou je pracnost a časová náročnost. 3.4.1.4 Vlhká utěrka s desinfekčním prostředkem Desinfikuje se buď celý povrch mléčné žlázy, nebo jen konce struků. Vzhledem ke snadnosti změny smyslových vlastností nadojeného mléka je třeba vyloučit všechny desinfekční přípravky s intenzívním aroma. Zároveň ale musíme volit takové, které nedráždí citlivou pokožku vemene. Účinnost této metody je až 85 % (Seydlová 2007). 3.4.1.5 Plamen Na amerických farmách se používá také plynový hořák k očištění a desinfekci vemene. Dojič těsně před dojením velmi rychle opálí mléčnou žlázu, čímž se suchou cestou zbaví mikroorganismů a plamen zároveň opálí drobné chloupky, na kterých by mohly ulpívat nečistoty. Přestože by se mohlo zdát, že je tato procedura poněkud drastickým opatřením, pro dojnice je však nebolestivá a dosahuje velmi dobrých hygienických výsledků.
27
3.4.1.6 Pre-Dipping Je namočení celého struku, nebo té části, která je v bezprostředním styku se strukovou gumou do desinfekčního prostředku, jako součást ošetření struků před dojením. Důležitým faktorem je doba působení desinfekčního prostředku na struku. Ta musí být dostatečně dlouhá, aby stačila eliminovat patogenní mikroorganismy. Podle Seydlové (2007) po takto ošetřeném struku a jeho následném otření jednorázovým ubrouskem je účinnost až 85 %. 3.4.1.7 Post-Dipping Je desinfekce struků ponořením do desinfekčního roztoku po dojení. Tento roztok navíc pomáhá uzavírat ještě otevřený strukový kanálek, který by nechráněn mohl sloužit jako vstupní brána pro infekci. Čistota a desinfekce povrchu vemene je zároveň i preventivním opatřením proti šíření infekčních zánětů mléčné žlázy (Mottram 1997). Navíc proces čištění mnohdy pomáhá spustit reflex spouštění mléka (Bruckmaier et al. 2001). 3.4.2
Hygiena pracovníků Zaměstnání dojiče se stalo vysoce odpovědnou prací, která vyžaduje nejen bohaté
znalosti, ale i zkušenosti. Je třeba, aby byl seznámen s fyziologií laktace, nemocemi mléčné žlázy a hygienickým získáváním mléka. Hygiena pracovníka v dojírně má nezanedbatelný význam pro mikrobiologickou kvalitu mléka, ale i pro zdraví jeho a dojnic. Před samotným dojením si dojič musí obléci čistý ochranný oděv k tomu určený, používaný výhradně a jen během dojení v dojírně. Vhodná je i pokrývka hlavy. Těsně před dojením si pracovník očistí, případně ostříhá nehty a umyje ruce, nejlépe za pomocí kartáče až k loktům. Ruce by si měl ideálně mýt i po každém vydojení dojnic, kvůli šíření infekčních nemocí ve stáji (Hökl a Štěpánek 1962). 3.4.2.1 Lidská onemocnění způsobená stafylokoky Stafylokoky u lidí nejčastěji vyvolávají hnisavá onemocnění, která postihují kůži, podkoží, mléčnou žlázu a kosti. Poměrně četná jsou onemocnění dýchacího traktu, onemocnění urogenitálního traktu, sepse a meningitidy. Jsou však primárně citlivé na většinu antibiotik. V některých oblastech u populace stafylokoků, u níž se k léčbě dříve masivně používaly tetracykliny a penicilin, došlo ke zvýšené rezistenci na tato
28
antibiotika. Jestliže se v takto ovlivněných oblastech penicilin vysadil, začal se po nějaké době počet rezistentních kmenů opět snižovat. Počet takto rezistentních kmenů je odvislý od regionů a oblastí. Například v nemocnicích je vyšší než v prostředí. 3.4.2.2 Lidská onemocnění způsobená streptokoky Streptokoky jsou příčinou mnoha onemocnění jak u člověka, tak u zvířat. Patří sem zcela běžná onemocnění respiračního traktu, hnisavé kožní infekce, sepse, meningitidy a sekundární onemocnění. Vůbec nejčastějšími onemocněními jsou streptokokové záněty krčních mandlí a faryngitidy, neboli zánět hrtanu. 3.4.2.3 Lidská onemocnění způsobená koliformními bakteriemi Většina kmenů Escherichia coli je za normálních podmínek nepatogenní, nacházejí se totiž běžně ve střevním traktu jak lidí, tak zvířat. Naopak, zde tvoří užitečnou mikroflóru komenzálů. K onemocnění vlivem E. coli, s ohledem na problematiku bakteriální kontaminace dojicího zařízení, může dojít díky konzumaci syrového mléka nebo mléčných výrobků ze syrového mléka. Onemocnění se zpravidla projevuje vodnatými průjmy, rychlým úbytkem tělesné váhy, zvracením, horečkou a následnou dehydratací.
3.5 Sanitace dojicího zařízení Kvalita získaného mléka dojením pomocí dojicího zařízení je značně závislá na stupni čistoty a hygieny tohoto zařízení. A to zejména na těch součástech, které přicházejí do bezprostředního kontaktu s mlékem a mléčnou žlázou. Sanitace by měla proběhnout bezprostředně po dojení. Před dojením se obvykle jen proplachuje. K čištění se používá studená a horká voda, desinfekční a čisticí prostředky. V současnosti se pro čištění a desinfekci používají naprogramovaná a plně automatizovaná zařízení. A to jak ve stáji, tak v dojírnách. Mléko, jakožto emulze s vysokým obsahem tuku si žádá aktivní čištění. Dříve se používaly upravené kartáče za podpory vody a desinfekčního roztoku, což je ale velmi náročné na ruční práci a tento způsob je vhodný spíše u konvových dojicích zařízení. V dojírnách se více používá takzvané hydraulické čištění. Jedná se o silný proud kapaliny a jeho účinnost závisí na způsobu proudění. Nejefektivnější je proudění turbulentní, které nejsnadněji uvolňuje
29
nečistoty na stěnách. Vhodný podtlak, který vede k vyšším turbulencím se pohybuje nad hodnotami 45 kPa (Přikryl 1997). 3.5.1
Čištění Pod pojmem čištění rozumíme mechanickou očistu, během níž se odstraní všechny
nánosy a usazeniny z povrchu, který byl ve styku s mlékem nebo mléčnou žlázou. V první řadě jde o odstranění cizorodého materiálu, jakým jsou soli a organický materiál. Čištění by se mělo provádět po každém dojení a to co nejdříve (Kulovaná 2001). 3.5.1.1 Průběh čištění Nejdříve se celé dojicí zařízení propláchne temperovanou vodou, zpravidla okolo 35 °C. Voda nesmí být horká, aby nedocházelo k vysrážení mléka. Tento proplachovací cyklus by měl odstranit 90 – 95 % zbytkového mléka. Poté se přidá roztok detergentů a desinfekce a celý proces se ukončí závěrečným proplachem pitné vody. Podmínky, které by mělo splňovat každé čištění jsou následující: Mechanický – představuje působení mechanického tlaku na vnitřní části dojicí soustavy na ulpívající nečistoty. Toho je dosahováno cirkulací vody s turbulentním prouděním. Chemický – chemické látky podílející se na chemické očistě můžeme jednoduše rozdělit na detergenty a desinfekční látky. Detergenty můžeme rozdělit na alkalické a kyselé. Alkalické pomáhají odstraňovat nečistoty organického původu.
Alkalické
detergenty
se
používají
zejména
pro
odstranění
anorganických látek, jako jsou usazeniny vodního a mléčného kamene. Kyselého detergentu se obvykle neužívá každý den, pokud je v dané oblasti měkká voda, podle Kulované (2001) postačí jen třikrát do týdně. Alkalické a kyselé detergentní roztoky by se neměly smíchat, jelikož by došlo k vytvoření soli, jež by poškodila dojicí soustavu. Detergenty rovněž napomáhají udržení nečistot v mycím roztoku a zabraňují jejich opětovnému usazování. Teplota – teplota je důležitým faktorem jak pro snadné rozpuštění detergentu, tak pro účinnější emulgaci látek, jako je například mléčný tuk. Ten se při vyšších teplotách snadněji uvolňuje z povrchu dojicího zařízení.
30
Čas – všechny předchozí podmínky účinného čištění by nebyly účinné, pokud by se nedodržela správná doba jejich působení. Ta je odvislá jak od výrobce, tak od metody čištění. 3.5.2
Desinfekce Výsledkem účinné desinfekce je mikrobiální čistota. Snažíme se o redukování
počtu choroboplodných zárodků (Mottram 1997). Při zanedbání nebo při nedostatečné sanitaci dochází k silnému pomnožení mikroorganismů, které dojicím zařízením proudí a tím dochází ke kontaminaci a znehodnocování mléka. Desinfekční prostředky jsou velmi často na bázi chlóru. Na trhu existují i detergenty s desinfekčními účinky a proto není třeba používat desinfekci odděleně. 3.5.3
Voda Kvalita vody je velmi důležitým faktorem úspěšné sanitace dojicího zařízení. Měla
by být samozřejmě čistá a pitná. Její kvalita by se měla pravidelně kontrolovat. Sleduje se zejména její tvrdost, čistota a mikrobiologie. V prvé řadě se musí zabránit její kontaminaci, která by mohla významně snížit kvalitu mléka. Usazeniny vodního kamene mohou napomáhat rozvoji bakteriálních biofilmů. Příliš tvrdá voda může negativně reagovat s detergenty a snižovat tak účinnost sanitace systému.
3.6 Kontrola účinnosti sanitace 3.6.1
Senzorické metody Zahrnují jednoduché vyhodnocení účinnosti sanitace. Zrakem lze určit tvorbu
usazenin, vodního a mléčného kamene, koroze materiálů, povlaků, změny barvy materiálů. Čichem zjišťujeme rozklad organické hmoty na nedostatečně vyčištěných plochách a ve zbytcích výplachových vod (Janštová et al. 2012). Hmatem lze zjistit přítomnost mazu, poruch povrchu, zdrsnění. Změny barvy materiálů, inkrustace a filmy nečistot jsou zpravidla důsledkem špatně zvoleného detergentního přípravku, nebo celého sanitačního procesu. Zbytky vody rovněž zvyšují riziko kontaminace zařízení. 3.6.2
Fyzikálně –chemické a chemické metody Dle Janštové (2012) se kontrola zaměřuje na tyto aspekty:
31
stanovení aktivní látky v desinfekčním prostředku stanovení koncentrace aktivní látky v používaném desinfekčním prostředku průkaz chemického desinfekčního prostředku na povrchu desinfikovaných předmětů 3.6.3
Mikrobiologické metody
3.6.3.1 Stěrová metoda Je založena na jednoduchém principu, kdy se pomocí sterilního vlhkého tamponu provede stěr testovaného povrchu. Takto odebraný vzorek se převede na ředící roztok nebo na živnou půdu a kultivuje se za vhodných podmínek. 3.6.3.2 Metoda otisku na živnou půdu Mikroorganismy přítomné na vyšetřovaném povrchu se přímo otisknou na vhodnou živnou půdu, na níž se dále kultivují. K tomuto účelu se používají mikromisky s nalitou živnou půdou, která převyšuje okraje této misky a tvoří otiskový polštářek (Janštová et al. 2012). 3.6.3.3 Výplachová metoda Kontrolovaný prostor nebo nádoba se vypláchne sterilním univerzálním ředidlem nebo sterilním tekutým mediem a tento výplach se kultivuje. Pokud v systému zůstává výplachová voda, je možno ke kultivaci použít ji. 3.6.4
Komerčně vyráběné testovací sady
3.6.4.1 ATP test bioluminescence Tato metoda byla vyvinuta pro zhodnocení kvality čistoty povrchů. Jedná se tedy o systém monitoringu úrovně hygieny a úspěšnosti sanitace. Test ukazuje přítomnost organické hmoty, která může sloužit jako substrát pro zachycení mikroorganismů a jako živná půda pro jejich růst. Dnes je díky své jednoduchosti použití a dobré citlivosti běžně používanou kontrolní metodou. Touto metodou lze zároveň kontrolovat úroveň provozní vody. Výhodou ATP testu je také jeho rychlost. Jedna zkouška trvá do 1 minuty. Proto je vhodné zařadit tento test ke kontrole zařízení používaného v mléčné prvovýrobě. Mezi tato zařízení patří zejména strukové násadce, mléčné potrubí a sběrné nádoby (Vilar et al. 2008).
32
3.6.4.1.1 Princip testu ATP neboli adenosintrifosfát je obsažen ve všech živých organismech, včetně mikroorganismů. Při reakci ATP s luciferinem a luciferázou, což je enzym získaný ze světlušek, dochází k uvolňování světelné energie. Tato energie je poté zachycena pomocí luminometru. Výsledek se vyjadřuje v jednotkách RLU (Janštová et al. 2012). ATP + luciferin + O2
luciferáza
oxyluciferin + AMP + PP + záření
3.6.4.1.2 Postup testu Postup je velmi jednoduchý a rychlý. Vlhčeným stěrovým tamponem, který je v testovacím roztoku, se provede stěr z kontrolovaného povrchu. Ten může být suchý nebo vlhký. Standardní plocha stěru je zpravidla 10 x 10 centimetrů. Použitý tampon se aktivuje a protřepe. Luminiscence se změří příslušným přístrojem – luminometrem. V případě, že se nedá provést stěr pomocí tamponu, jako například uvnitř trubek, je možné využít výplachové vody, která po čištění odkapává. Ta se odebere pomocí odběrové špičky, která bývá součástí testovacího kitu. Další postup kontroly je poté stejný jako u testu s tamponem. Rovněž se takto může kontrolovat i kvalita provozní vody. 3.6.4.2 Hygicult Je testovací souprava určená primárně pro kontrolu mikrobiální kontaminace v potravinářských závodech. Jedná se o plastikovou destičku oboustranně pokrytou kultivačním médiem VRB, které podporuje růst koliformních bakterií. Růst grampozitivních bakterií inhibuje. Tato destička je součástí víčka sterilní nádobky. Odběr vzorku se provádí přímým ponořením nebo otiskem do testovacího materiálu. Výsledky se po inkubaci vyhodnocují pomocí srovnávacích tabulek. 3.6.4.3 Otiskový MIKROBITEST Klasická kultivace na Petriho miskách zde byla nahrazena kultivací na proužcích papíru. Jejich komerční název je Mikrobitest. Tyto proužky papíru jsou nasyceny živnou půdou, obvykle s přídavkem indikátoru a selektivních činidel. Slouží k určení základních skupin mikroorganismů při mikrobiologické kontrole v potravinářském průmyslu. Jsou chráněny polyetylénovým sáčkem, který zároveň tvoří kultivační
33
prostředí. Proti slunečnímu záření se ukládají papírové obálky. Odebrané vzorky se nechají kultivovat za vhodné teploty, dle sledovaného mikroorganismu. Jeho výhodou jsou nižší náklady na rozbor, možnost provádět vyšší počet testů najednou a kontrolu mohou provádět i nespecializovaní pracovníci. Ke stanovení koliformních bakterií slouží MIKROBITEST CA, ke stanovení koliformních bakterií ve vodě se využívá MIKROBITEST CA-4. 3.6.4.4 Petrifilm destičky Petrifilmy jsou
destičky pro
mikrobiologickou
kontrolu
potravin
nebo
potravinářských provozů. Skládají se ze dvou vrstev filmů, obsahujících živná média, gel rozpustný ve vodě a indikátor, který zvýrazní narostlé kolonie mikroorganismů. Tyto destičky se očkují 1 mililitrem naředěného vzorku a inkubují (Janštová et al. 2012). Využívají se pro stanovení celkového počtu mikroorganismů, počtu koliformních bakterií, E. coli, plísní a kvasinek. 3.6.4.5 Direct epifluorescence method – DEM Speciální testovací destičky jsou vyrobeny ze stejného materiálu, jako je testovaná část zařízení. Ty se vkládají na určitá místa, například do potrubí apod., po stanovené době se vyjmou a zjišťuje se počet adherujících mikroorganismů na ploše destičky epifluorescenční mikroskopií (Janštová et al. 2012).
34
4
MATERIÁL A METODIKA Strukové gumy, použité pro mikrobiologickou analýzu, byly získány s pomocí
Ing. Dufkové ze Školního zemědělského podniku Žabčice 28. 3. 2013, jakožto odpad po pravidelné čtvrtletní výměně strukových gum v dojírně.
4.1 Charakteristika Školního zemědělského podniku Žabčice Živočišná výroba je zaměřena na chov černostrakatého Holštýnského mléčného plemene v uzavřeném stádu. Původní kruhová dojírna byla v 90. letech nahrazena tandemovou dojírnou 2 x 5 od firmy DeLaval. Dojivost dosáhla hodnoty 8 293 litrů na každou dojnici s průměrnou tržní produkcí 94 %. Mléko je dodáváno v kvalitě Q. Významným opatřením bylo vybudování nové stáje pro 300 ks dojnic v závěru roku 2005, která výrazně zlepší hygienické podmínky a wellfare zvířat. Živočišná výroba je nenahraditelným stabilizačním faktorem ekonomiky celého podniku.
4.2 Vlastní materiál a metodika Pro rozbor byly použity vzorky strukových gum o celkové ploše 38,75 cm2 získané 28. 3. 2013 ve Školním zemědělském podniku Žabčice. Pro odečtení kolonií na misce byl použit následující vzorec:
Odběr vzorků – výtřep Vzorky byly sterilně odebrány pro sledování počtů kolonií koliformních bakterií, enterokoků, bakterií mléčného kysání a celkový počet mikroorganismů. U výtřepu pro stanovení koliformních bakterií bylo použito ředění 100 a 10-1. Pro enterokoky ředění 100, 10-1 a 10-2. Pro celkový počet mikroorganismů 100, 10-1 a 10-2. U bakterií mléčného kysání bylo použito ředění 100 a 10-1. Každé ředění bylo provedeno 2x. 3 sterilně získané vzorky strukové gumy (plocha 1 vzorku byla 38,75 cm2) byly rozstříhány na menší dílky a vloženy do Erlenmeyerovy baňky se 180 ml fyziologického roztoku. Poté byly vloženy do třepačky Heidolph PROMAX 1020 na 35
15 minut. Z takto připraveného roztoku bylo odpipetováno po 1 ml vzorku a přidáno do ředících zkumavek s 9 ml fyziologického roztoku. Po zředění na požadovanou hodnotu byl ze zkumavky odpipetován 1ml vzorku do sterilní Petriho misky. Ta byla poté zalita příslušnou živnou půdou a kultivována v termostatu. Odběr vzorků – stěrová metoda Vzorky byly sterilně odebrány pro sledování počtů kolonií koliformních bakterií, enterokoků, bakterií mléčného kysání a celkový počet mikroorganismů. U stěrové metody pro stanovení koliformních bakterií bylo použito ředění 100 a 10-1. Pro enterokoky ředění 100 a 10-1. Pro celkový počet mikroorganismů 100, 10-1 a 10-2. U bakterií mléčného kysání bylo použito ředění 100 a 10-1. Každé ředění bylo provedeno 2x.
Pomocí sterilních tamponů byl proveden stěr uvnitř strukové gumy v místě styku se strukem dojnice. Stěr byl proveden v jednom místě pouze jedním obtažením vnitřního prostoru v rozsahu 360°. Takto získaný vzorek s tamponem byl odlomen do sterilní zkumavky s 10 ml fyziologického roztoku. Poté bylo v laboratoři odpipetováno po 1 ml vzorku a přidáno do ředících zkumavek s 9 ml fyziologického roztoku. Po zředění na požadovanou hodnotu byl ze zkumavky odpipetován 1ml vzorku do sterilní Petriho misky. Ta byla poté zalita příslušnou živnou půdou a kultivována v termostatu. Odběr vzorků – kultivace v mléku Vzorky byly sterilně odebrány pro sledování počtů kolonií koliformních bakterií, enterokoků, bakterií mléčného kysání a celkový počet mikroorganismů. U kultivace v mléce pro stanovení koliformních bakterií bylo použito ředění 10-1 a 10-2. Pro enterokoky ředění 10-1 a 10-2. Pro celkový počet mikroorganismů 10-3, 10-4 a 10-5. U bakterií mléčného kysání bylo použito ředění 10-1 a 10-2. Každé ředění bylo provedeno 2x. 3 sterilně získané vzorky strukové gumy (plocha 1 vzorku byla 38,75 cm2) byly rozstříhány na menší dílky a vloženy do Erlenmeyerovy baňky s 200 ml kravského mléka ošetřeného metodou UHT a inkubovány 24 h při laboratorní teplotě. Z takto
36
připraveného roztoku bylo odpipetováno po 1 ml vzorku a přidáno do ředících zkumavek s 9 ml fyziologického roztoku. Po zředění na požadovanou hodnotu byl ze zkumavky odpipetován 1ml vzorku do sterilní Petriho misky. Ta byla poté zalita příslušnou živnou půdou a kultivována v termostatu.
4.3 Složení použitých živných půd Půda VRBL na 1 litr media Použití: ke stanovení koliformních bakterií Složení: pepticky natrávené maso (7g), kvasniční extrakt (3g), laktosa (10g), žlučové soli (1,5g), NaCl (5g), neutrální červeň (0,03g), krystalová violeť (0,002g), bakteriologický agar (12g). Výrobce: Biokar Diagnostics, Francie Příprava: 38,5g dehydrovaného živného media se smíchá s destilovanou vodou a ponechá několik minut stát, poté se směs důkladně promíchá a upraví pH, aby jeho hodnota po uvaření činila 7,4 při 25 °C. Směs se přivede k varu za občasného míchání. Vaří se 2 minuty, poté se půda ochladí ve vodní lázni na 45 °C. Použije se do 3 hodin od její přípravy. Půda PCA M agar na 1 litr media Použití: ke stanovení mezofilních aerobních a fakultativně anaerobních mikroorganismů Složení: trypton (5g), kvasniční extrakt (2,5g), glukóza (1g), sušené odstředěné mléko (1g), bakteriologický agar (12g). Výrobce: Biokar Diagnostics, Francie Příprava: 21,5g dehydrovaného živného media se smíchá s destilovanou vodou. Poté se zahřívá k varu do úplného rozpuštění za častého míchání. pH se upraví na 7 ± 0,2 při 25 °C a sterilizuje při 121 °C 15 minut. Půda COMPASS ENTEROCOCCUS AGAR na 1 litr media Použití: ke stanovení počtu enterokoků Složení: pepton (27,5g), kvasniční extrakt (5g), NaCl (5g), tween 80 (1g), X-glykosid (0,1g), selektivní činidlo (0,3g), bakteriologický agar (14g). Výrobce: Biokar Diagnostics, Francie
37
Příprava: 52,9g dehydrovaného živného media se smíchá s destilovanou vodou. Poté se zahřívá k varu do úplného rozpuštění za častého míchání. pH se upraví na 7,5 ± 0,2 při 25 °C a sterilizuje při 121 °C 15 minut.
Půda MRS agar na 1 litr media Použití: ke stanovení počtu bakterií mléčného kysání Složení: polypepton (10g), masový extrakt (10g), kvasniční extrakt (5g), glukóza (20g), tween 80 (1,08g), dipotassum phosphate (2g), acetát sodný (5g), citrát amonný (2g), magnézium sulfát (0,2g), mangan sulfát (0,05g), bakteriologický agar (15g). Výrobce: Biokar Diagnostics, Francie Příprava: 70,3g dehydrovaného živného media se smíchá s destilovanou vodou. Poté se pomalu zahřívá k varu a pomalu míchá, dokud se úplně nerozpustí. pH se upraví v závislosti na druhu analýzy. Sterilizuje se při 121 °C 15 minut.
38
5
VÝSLEDKY
Tabulka 1 - stanovení koliformních bakterií po výtřepu [KTJ/ml] Výtřep Vzorek 1v 2v 3v Průměrně
Koliformní b. 0 180 0 60 KTJ/ml
Tabulka 2 - stanovení enterokoků po výtřepu [KTJ/ml] Výtřep Vzorek 1v 2v 3v Průměrně
Enterokoky 360 0 180 1,8 x 102
Tabulka 3 - stanovení BMK po výtřepu [KTJ/ml] Výtřep Vzorek 1v 2v 3v Průměrně
BMK 4,2 x 103 1,4 x 104 5,7 x 103 8,3 x 103
Tabulka 4 - stanovení CPM po výtřepu [KTJ/ml] Výtřep Vzorek 1v 2v 3v Průměrně
CPM 8,6 x 105 3,6 x 106 1,7 x 106 2,1 x 106
39
Tabulka 5 - stanovení koliformních bakterií ze stěrů [KTJ/ml] Stěr Vzorek 1s 2s 3s Průměrně
Koliformní b. 10 10 0 7
Tabulka 6 - stanovení enterokoků ze stěrů [KTJ/ml] Stěr Vzorek 1s 2s 3s Průměrně
Enterokoky 10 0 10 7
Tabulka 7 - stanovení BMK ze stěrů [KTJ/ml] Stěr Vzorek 1s 2s 3s Průměrně
BMK 20 10 10 13
Tabulka 8 - stanovení CPM ze stěrů [KTJ/ml] Stěr Vzorek 1s 2s 3s Průměrně
CPM 3,2 x 103 3,4 x 103 1,6 x 103 2,8 x 103
40
Tabulka 9 - stanovení koliformních bakterií po kultivaci v mléce [KTJ/ml] Kult. v mléce Vzorek 1a 2a 3a Průměrně
Koliformní b. 5,9 x 107 6,4 x 107 6,6 x 107 6,3 x 107
Tabulka 10 - stanovení enterokoků po kultivaci v mléce [KTJ/ml] Kult. v mléce Vzorek 1a 2a 3a Průměrně
Enterokoky 3,9 x 106 1,1 x 107 1,0 x 107 8,4 x 106
Tabulka 11 - stanovení BMK po kultivaci v mléce [KTJ/ml] Kult. v mléce Vzorek 1a 2a 3a Průměrně
BMK 8,1 x 105 7,6 x 105 2,4 x 106 1,3 x 106
Tabulka 12 - stanovení CPM po kultivaci v mléce [KTJ/ml] Kult. v mléce Vzorek 1a 2a 3a Průměrně
CPM 3,4 x 108 4,1 x 108 5,2 x 108 4,2 x 108
41
Tabulka 13 - celkový počet mikroorganismů ve Školním zemědělském podniku Žabčice dle Dufkové (2013) Leden Únor Březen Duben
6.1. 5 x 103 6.2. 2,6 x 104 7.3. 1,7 x 104 4.4. 1,3 x 104
22.1. 28.1. 4 2,9 x 10 2,1 x 104 14.2. 21.2. 4 1,6 x 10 1,8 x 104 13.3. 21.3. 4 1,3 x 10 3,3 x 104 -
Tabulka 14 - celkový počet mikroorganismů ve Školním zemědělském podniku Žabčice dle Kalhotky (2013) Leden
-
Únor
-
Březen
-
Duben
9.4. 1,3 x 104
-
-
12.2. 27.2. 4 3,6 x 10 2,3 x 103 12.3. 4 2,7 x 10 -
Výsledky ukazují, že Školní zemědělský podnik Žabčice splňuje dle nařízení ES 853/2004, limit o celkovém počtu mikroorganismů v syrovém kravském mléce, který činí maximálně 100 000 CPM/ml (tj. 1,0 x 105).
42
Obrázek 4 - kolonie koliformních bakterií (Archiv autora)
Obrázek 5 - kolonie koliformních bakterií (Archiv autora 2013)
43
Obrázek 6 - kolonie enterokoků (Archiv autora 2013)
Obrázek 7 - kolonie BMK (Archiv autora 2013)
44
Obrázek 8 - CPM (Archiv autora 2013)
Obrázek 9 - CPM (Archiv autora 2013)
45
Vysvětlivky: BMK – bakterie mléčného kysání CPM – celkový počet mikroorganismů KTJ/ml – kolonii tvořící jednotka v mililitru
46
6
ZÁVĚR Mléko, ale i mléčné výrobky představují vhodné prostředí pro růst různých
mikroorganismů a to zejména díky vysokému obsahu nutričních látek (bílkoviny, mléčný tuk, laktóza), dalšími faktory, podporující růst mikroorganismů, jsou podmínky v dojírnách a v prvovýrobě mléka obecně. Patří sem zejména vhodná teplota a přítomnost vody. To vše může nepříznivě ovlivňovat mikrobiologickou úroveň dojicího zařízení, s čímž souvisí zdravotní stav dojnic i dojičů, kvalita nadojeného mléka a jeho následné zpracovávání. V neposlední řadě se také zvyšuje potenciální nebezpečí vzniku onemocnění z kontaminovaných potravin. Z výsledků vyplívá, že ačkoli sanitace není vždy stoprocentní zárukou zneškodnění
všech
přítomných
mikroorganismů,
výrazně
však
počty těchto
potenciálních kontaminantů redukuje. U koliformních bakterií se jedná o 7 KTJ/ml u výtřepu a rovněž 7 KTJ/ml ze stěrů. Enterokoků bylo 1,8 * 102 KTJ/ml z výtřepu a pouze 7 KTJ/ml ze stěrů. Bakterií mléčného kysání 8,3 * 103 KTJ/ml z výtřepu a ze stěrů jen 13 KTJ/ml. Celkový počet mikroorganismů činil 2,1 * 106 KTJ/ml ve výtřepu a 2,8 * 103 KTJ/ml ze stěrů. I přesto, že se v čištěných strukových gumách mohou nacházet určité počty mikroorganismů, nesmíme zapomínat, že než se čerstvé mléko dostane ke konečnému spotřebiteli, prochází procesem pasterace, která rovněž výrazně omezí jejich životaschopnost. Na druhou stranu, kultivace v mléce, která může simulovat nečištěné prostředí, napomohla masivnímu pomnožení sledovaných mikroorganismů. U koliformních bakterií byl průměrný počet kolonií stanoven na 6,3 * 107KTJ/ml, enterokoků na 8,4 * 106 KTJ/ml, bakterií mléčného kysání 1,3 * 106 KTJ/ml a celkový počet mikroorganismů dosáhl až 4,2 * 108 KTJ/ml. Věnovat pozornost zdravotnímu stavu dojnic, správné technice dojení a dodržovat všechny zásady hygieny v prvovýrobě mléka je skutečně důležité. Klíčem k úspěchu je rovněž pravidelné provádění sanitace dojicího zařízení a vyměňování strukových gum dle pokynů výrobců a kontrola účinnosti této sanitace. Myslím, že Školní zemědělský podnik Žabčice má dobrou úroveň hygieny a kontaminaci mléka úspěšně předchází, čemuž odpovídají i celkové počty mikroorganismů, které dle nařízení ES 853/2004 splňují požadavek maximálního počtu 100 000 CPM/ml v syrovém kravském mléce.
47
7
POUŽITÁ LITERATURA
BODDIE, R. L., NICKERSON, S. C., ADKINSON, R. W., 1993. Evaluation of teat germicides of low iodine concentrations for prevention of bovine mastitis by Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae [online]. [cit. 10.2.2013] Amsterdam: Elsevier Science Publishers B.V. Preventive Veterinary Medicine, 16 ( 1993 ) 111-117 BRUCKMAIER, R. M., MACUHOVA, J., MEYER, H. H. D., 2001. Specific aspects of milk ejection in robotic milking: a review [online]. [cit. 12.12.2012] Germany: Institute of Physiology, Technical University of Munich, Weihenstephaner Berg 3, D-85350 Freising-Weihenstephan FACKLAM, R.R., SAHM, D.F., TEIXEIRA, L.M., 1999. Enterococcus. In: Manual of Clinical Microbiology. ASM Press, Washington D.C. GÖRNER, F., VALÍK L´., 2004. Aplikovaná mikrobiógia požívatín. Bratislava: Malé centrum, 528 s. ISBN 80-967064-9-7 HÖKL, Jan, ŠTĚPÁNEK, Mirko, 1962. Hygiena potravin II Mléko a mléčné výrobky. Praha: Státní zemědělské nakladatelství v Praze. 426 s. JANŠTOVÁ, Bohumíra, VORLOVÁ, Lenka, NAVRÁTILOVÁ, Pavlína, KRÁLOVÁ, Michaela, NECIDOVÁ, Lenka, MAŘICOVÁ, Eva, 2012. Technologie mléka a mléčných výrobků [online]. 1. vyd. Brno: Veterinární a farmaceutická univerzita Brno. [cit. 23.2.2013] Dostupné z http://cit.vfu.cz/ivbp/wp-content/uploads/2011/07/Janstovaskripta-web.pdf JAVIC, Keith, CONROY, Nikky, 2001. How the milking system works [online]. [cit. 10.2.2013]. Dostupné z http://cal.vet.upenn.edu/projects/fieldservice/dairy/mastitis/milkmac.htm JIČÍNSKÁ, Eva. HAVLOVÁ, Jana, 1995. Patogenní mikroorganismy v mléce a mlékárenských výrobcích. 1. vyd. Praha: Ústav zemědělských a potravinářských informací. 106 s. ISBN 80-85120-47-X
48
KALHOTKA, Libor, 2009. Mikrobiální rizika ze syrového mléka a jejich prevence. In: Farmářská výroba sýrů a kysaných mléčných výrobků VI. Sborník referátů ze semináře s mezinárodní účastí. Brno: Mendelova univerzita. ISBN 978-80-7375-300-9 KOLÁŘ, Jiří, 2001. Bacillus cereus [online]. 4.10.2001 [cit. 9.11.2012]. Dostupné z http://kolar-jiri.sweb.cz/ KUDLÁČ, Eduard. ELEČKO, Ján, 1977. Veterinární porodnictví a gynekologie. 1. vyd. Praha: Státní zemědělské nakladatelství Praha. 776 s. KULOVANÁ, Eliška, 2001. Účinná sanitace (čištění a dezinfekce) dojicího zařízení [online]. 19.2.2001 [cit. 2.12.2012]. Dostupné z http://www.agroweb.cz/Ucinnasanitace-cisteni-a-dezinfekce-dojiciho-zarizeni__s45x9521.html KUNOVÁ, Gabriela, PECHAČOVÁ, Marta, JAGLIČ, Zoran, PAZLAROVÁ, Jarmila, 2010. Detekce a určení kritických míst výskytu biofilmů v mlékárenských provozech [online].[cit. 14.3.2013]. Dostupné z http://www.milcom-as.cz/vum-a-laktoflora/vyzkum/metodiky.html MIKULOVÁ, Magda, 2012. Psychrotrofní lipolytické bakterie a obsah volných mastných kyselin v bazénových vzorcích syrového kravského mléka. České Budějovice. Doktorská disertační práce. Jihočeská univerzita v Českých Budějovicích. Fakulta zemědělská. MOTTRAM, Tobby, 1997. Requirements for teat inspection and cleaning in. automatic milking systéme [online]. [cit. 13.1.2013] United Kingdom: Silsoe Research Institute, Wrest Park, Silsoe, Bedford PATOČKA, František, 1972. Lékařská mikrobiologie. 2. vyd. Praha: Avicenum, zdravotnické nakladatelství. 968 s. PŘIKRYL, Miroslav, 1997. Technologická zařízení staveb živočišné výroby. Praha: nakladatelství TEMPO PRESS II. ISBN 80-901052-0-3 RULÍK, Martin, HOLÁ, Veronika, RŮŽIČKA, Filip, VOTAVA, Miroslav a kolektiv, 2011. Mikrobiální biofilmy.1. vyd. Olomouc: Univerzita Palackého v Olomouci. ISBN 978-80-244-2747-9 49
SEYDLOVÁ, Růžena, 2007. Environmentální mastitidy v zemědělských provozech [online]. 1.11.2007 [cit. 12.2.2013]. Dostupné z http://www.viamilkcz.cz/documents/prezentace/ing-Ruzena_Seydlova.pdf SEYDLOVÁ, Růžena, SNÁŠELOVÁ, Jana, 2010. Současný stav mikrobiologické a bakteriologické kvality syrového mléka. In: Mlékařské listy 121. Praha: MILCOM a.s. Výzkumný ústav mlékárenský v Praze, Českomoravský svaz mlékárenský, Český národní komitét IDF. ISSN 1212-950X SCHUILING, H. J., NEIJENHUIS, F., 2004. Optimal cleaning of equipment Effectiveness of optimised teat cup cleaning in the prevention of mastitis pathogens transfer [online]. 1.5.2004 [cit. 14.1.2012]. The Netherlands: Animal Sciences Group, Wageningen UR, Lelystad. Dostupné z http://www.automaticmilking.nl/projectresults/reports/DeliverableD18.pdf SMOLA, Jiří, HAAS, Dušan, 2003. Nové aspekty v etiologii mastitid [online]. 3.5.2003 [cit. 16.1.2013]. Dostupné z http://www.buiatrie.cz/attachments/032_Mastitidy_03052003.pdf SNÁŠELOVÁ, Jana, 2011. Vybrané poznatky v oblasti mikrobiologie syrového kravského mléka v ČR. In: Mlékařské listy 125. Praha: MILCOM a.s. Výzkumný ústav mlékárenský v Praze, Českomoravský svaz mlékárenský, Český národní komitét IDF. ISSN 1212-950X SUKOVÁ, Irena, 2011. Nežádoucí bakteriofágy leukonostoku v mlékárnách [online]. 24.6.2011 [cit. 20.3.2013]. Dostupné z http://www.agronavigator.cz/service.asp?act=print&val=111887 SystemSURE: Jednoduché a rychlé provozní ATP testy na kontrolu čistoty po sanitaci, 2013 [online]. SKA-TEC [cit. 26.2.2013]. Dostupné z http://www.atptest.cz/index.html ŠILHÁNKOVÁ, Ludmila, 2005. Mikrobiologie pro potravináře a technology. 2. vyd. Praha: nakladatelství VICTORIA PUBLISHING a. s. ISBN 80-85605-71-6
50
VILAR, M. J., RODRÍGUEZ-OTERO, J. L., DIÉGUEZ, F. J., SANJUÁN, M. L., YUS, E., 2008. Application of ATP bioluminescence for evaluation of surface cleanliness of milking equipment [online]. [cit. 20.2.2013] Spain: Instituto de Investigación y Análisis Alimentarios, Facultad de Veterinaria. Universidad de Santiago de Compostela, Campus Universitario s/n. 27002
51
8
SEZNAM TABULEK
Tabulka 1 - stanovení koliformních bakterií po výtřepu [KTJ/ml] ................................. 39 Tabulka 2 - stanovení enterokoků po výtřepu [KTJ/ml] ................................................. 39 Tabulka 3 - stanovení BMK po výtřepu [KTJ/ml] .......................................................... 39 Tabulka 4 - stanovení CPM po výtřepu [KTJ/ml] .......................................................... 39 Tabulka 5 - stanovení koliformních bakterií ze stěrů [KTJ/ml]...................................... 40 Tabulka 6 - stanovení enterokoků ze stěrů [KTJ/ml]...................................................... 40 Tabulka 7 - stanovení BMK ze stěrů [KTJ/ml] ............................................................... 40 Tabulka 8 - stanovení CPM ze stěrů [KTJ/ml] ............................................................... 40 Tabulka 9 - stanovení koliformních bakterií po kultivaci v mléce [KTJ/ml] .................. 41 Tabulka 10 - stanovení enterokoků po kultivaci v mléce [KTJ/ml] ................................ 41 Tabulka 11 - stanovení BMK po kultivaci v mléce [KTJ/ml].......................................... 41 Tabulka 12 - stanovení CPM po kultivaci v mléce [KTJ/ml].......................................... 41 Tabulka 13 - celkový počet mikroorganismů ve Školním zemědělském podniku Žabčice dle Dufkové (2013).......................................................................................................... 42 Tabulka 14 - celkový počet mikroorganismů ve Školním zemědělském podniku Žabčice dle Kalhotky (2013)......................................................................................................... 42
52
9
SEZNAM OBRÁZKŮ
Obrázek 1 - Fáze vývoje biofilmu (Rulík et al. 2011) ..................................................... 22 Obrázek 2 – Princip činnosti strukového násadce (upraveno dle Javic a Conroy 2001)24 Obrázek 3 – Nepoužitá struková guma (a.) a guma vyměněná po 3 měsících (b.) (Archiv autora 2013) .................................................................................................................... 25 Obrázek 4 - kolonie koliformních bakterií (Archiv autora) ............................................ 43 Obrázek 5 - kolonie koliformních bakterií (Archiv autora 2013) ................................... 43 Obrázek 6 - kolonie enterokoků (Archiv autora 2013) ................................................... 44 Obrázek 7 - kolonie BMK (Archiv autora 2013)............................................................. 44 Obrázek 8 - CPM (Archiv autora 2013) ......................................................................... 45 Obrázek 9 - CPM (Archiv autora 2013) ......................................................................... 45
53
