MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
BRNO 2010
Jan Pazdera
1
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat
Metody studia vyjádření (exprese) genů Bakalářská práce
Vedoucí práce: prof. RNDr. Aleš Knoll, Ph. D.
Vypracoval: Jan Pazdera
Brno 2010
2
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma ,,Metody studia vyjádření (exprese) genů“ vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana AF MZLU v Brně.
dne………………………………………. podpis…………...……………………….
3
PODĚKOVÁNÍ Tímto bych chtěl poděkovat panu prof. RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D. za cenné rady, trpělivost při konzultacích a odborné vedení při zpracovávání této bakalářské práce.
4
ABSTRAKT Cílem této práce je zpracovat a zhodnotit metody studia exprese genů. Metody vyjádření genetické informace se dělí dle úrovně studia, na úroveň mRNA a proteinů. Z hlediska molekulární podstaty dělíme expresi genů na dvě fáze, a to transkripci a translaci. Chceme-li studovat první fázi exprese genu, měli bychom se zaměřit na RNA transkript. Metody, které se zaměřují na analýzu genové exprese na úrovni RNA, se zabývají také studiem transkripce a její regulace. Můžeme je rozdělit na metody, kterými se stanovuje transkripční aktivita daného genu a dále na metody, analyzující množství určitého transkriptu, který je přítomen ve vzorku v daném čase. Metody používané ke studiu exprese na úrovni proteinu slouží k získání, identifikaci a kvantifikaci byť jen malého počtu specifických proteinů. Mezi nejvýznamnější metody na úrovni mRNA patří northernový přenos, DNA mikroarray, DD, RACE, FISH a mezi metody na úrovni proteinů SDS-PAGE, ELISA, 2-DE, IEF a MALDI-TOF a mnoho dalších metod. V práci jsou diskutovány a zhodnoceny nejvýznamnější vybrané metody, přičemž nejlepších výsledků dosáhneme při současném monitorování exprese genů na úrovni tvorby mRNA a následně proteinu.
Klíčová slova Exprese, transkripce, mRNA, protein
5
ABSTRACT The goal of this thesis is to process and evaluate options of gene expression studies. Methods of genetic information expression can be categorised according to the level of study – into mRNA and protein levels. In term of molecular basis we recognise two stages of gene expression – transcription and translation. If we want to study the first stage of gene expression, we should focus on the RNA transcript. The techniques that focus on the analysis of gene expression on the RNA level also deal with the study of transcription and its regulation. There are two kinds of methods: methods used to determine the transcription activity of the given gene and methods used to analyse the amount of a certain transcript presented in a sample at the given time. The techniques used to study expression on the protein level are used to determine, identify and quantify even a small amount of specific proteins. The most important techniques on the mRNA level include northern blotting, DNA microarray, DD, RACE and FISH. The most important techniques on the protein level include SDS-PAGE, ELISA, 2-DE, IEF, MALDI-TOF and many more. The thesis discusses and evaluates the most important selected techniques. The best results shall be achieved by simultaneous monitoring of gene expression on the mRNA and protein level.
Key words Expression, transcription, mRNA, protein
6
OBSAH 1. ÚVOD ..................................................................................................................... 10 2. REGULACE GENOVÉ EXPRESE V JÁDŘE ...................................................... 11 3. REGULACE GENOVÉ EXPRESE V CYTOPLAZMĚ........................................ 14 4. VÝZNAM STUDIA EXPRESE GENŮ................................................................. 16 4. 1. Význam studia exprese genů .......................................................................... 16 4. 1. 1. 4. 1. 2. 4. 1. 3. 4. 1. 4.
Zkoumání transkriptů klonovaného genu .............................................. 16 Elektronová mikroskopie molekul nukleových kyselin......................... 16 Analýza transkriptu pomocí prodlouženého primeru ............................ 17 Význam exprese genů ............................................................................ 18
4. 2. Význam studia funkční genomiky .................................................................. 19 4. 2. 1. 4. 2. 2. 4. 2. 3. 4. 2. 3. 1. 4. 2. 3. 2. 4. 2. 3. 3.
Identifikace genů v sekvenci genomu.............................................. 19 Hledání otevřených čtecích rámců (open reading frames) .............. 20 Studie transkriptomu a proteomu..................................................... 21 Studium transkriptomu .................................................................... 21 Studium proteomu............................................................................ 22 Význam genomiky ........................................................................... 23
5. CÍL PRÁCE ............................................................................................................ 25 6. MOLEKULÁRNÍ PODSTATA EXPRESE GENŮ............................................... 26 6. 1. Transkripce ..................................................................................................... 26 6. 1. 1. 6. 1. 2. 6. 1. 3. 6. 1. 4.
Iniciace............................................................................................. 26 Prodlužování (elongace) transkripce................................................ 27 Ukončení (terminace) transkripce.................................................... 28 Posttranskripční úpravy ................................................................... 28
6. 2. Translace ......................................................................................................... 29 6. 2. 1. 6. 2. 2. 6. 2. 3. 6. 2. 4.
Aktivace aminokyselin .................................................................... 29 Iniciace translace.............................................................................. 30 Elongace (prodlužování) proteinu ................................................... 30 Ukončení translace........................................................................... 31
7. SOUHRN METOD PRO STUDIUM EXPRESE GENETICKÉ INFORMACE NA ÚROVNI STUDIA mRNA .............................................................................. 32 7. 1. Hybridizační metody....................................................................................... 32 7. 1. 1. 7. 1. 2. 7. 1. 3. 7. 1. 4.
Southernova hybridizace.................................................................. 33 Northernová hybridizace.................................................................. 34 Analýza transkriptu pomocí prodlouženého primeru ...................... 35 Sekvenování RNA ........................................................................... 36
7
7. 1. 5. 7. 1. 6. 7. 1. 7. 7. 1. 8. 7. 1. 9.
Test ochrany před účinkem RNázy (RPA) ...................................... 36 Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) ........................................ 37 Branched DNA assay....................................................................... 38 DNA mikroarray .............................................................................. 39 Subtraktivní hybridizace .................................................................. 41
7. 2. PCR metody .................................................................................................... 41 7. 2. 1. 7. 2. 2. 7. 2. 3. 7. 2. 4. 7. 2. 5.
Reverzní transkripce PCR (RT-PCR) .............................................. 42 Rychlá amplifikace cDNA konců (RACE)...................................... 43 Real-time PCR ................................................................................. 43 Diferenciální display (DD) .............................................................. 45 PCR arrays ....................................................................................... 46
7. 3. Ostatní metody ................................................................................................ 47 7. 3. 1. 7. 3. 2. 7. 3. 3. 7. 3. 4.
Sériová analýza genové exprese (SAGE) ........................................ 47 Reportérské geny ............................................................................. 48 Test prodlužování primerů (PEA).................................................... 49 Celogenomové sekvenování RNA................................................... 50
8. SOUHRN METOD PRO STUDIUM EXPRESE GENETICKÉ INFORMACE NA ÚROVNI STUDIA VZNIKAJÍCÍCH PROTEINŮ ......51Chyba! Záložka není definována.
Odstraněno: 7. 1. 10. Celogenomové sekvenování RNA 41¶ Odstraněno: 7. 2. PCR metody 42 Odstraněno: 7. 2. 1. Reverzní transkripce PCR (RTPCR) 43 Odstraněno: 7. 2. 3. time PCR 44
Real-
Odstraněno: 7. 2. 4. Diferenciální display (DD) 46 Odstraněno: 7. 2. 5. arrays 47
PCR
Odstraněno: 7. 3. Ostatní metody 48 Odstraněno: 7. 3. 1. Sériová analýza genové exprese (SAGE) 48 Odstraněno: 7. 3. 2. Reportérské geny 49 Odstraněno: 7. 3. 3. Test prodlužování primerů (PEA) 50 Odstraněno: 8. SOUHRN METOD PRO STUDIUM EXPRESE GENETICKÉ INFORMACE ¶ NA ÚROVNI STUDIA VZNIKAJÍCÍCH PROTEINŮ 52Chyba! Záložka není definována.
8. 1. Gelová retardace komplexů DNA-protein ...................................................... 51
Odstraněno:
8. 2. „Footprinting“ pomocí DNázy I ..................................................................... 52
Odstraněno: 8. 1. Gelová retardace komplexů DNAprotein 52
8. 3. Test modifikované interference ...................................................................... 52 8. 4. Identifikace kontrolní sekvence pomocí deleční analýzy ............................... 53 8. 4. 1.
Provedení deleční analýzy ............................................................... 54
8. 5. Identifikace a studium translačního produktu klonovaného genu .................. 54 8. 5. 1. 8. 5. 2. 8. 5. 3. 8. 5. 3. 1. 8. 5. 3. 2. 8. 5. 3. 3. 8. 5. 3. 4. 8. 5. 3. 5. 8. 5. 4. 8. 5. 5. 8. 5. 5. 1. 8. 5. 5. 2. 8. 5. 6. 8. 5. 7. 8. 5. 8.
Metody HRT a HART (identifikace transl. produktu klon. genu)... 55 Analýza proteinů pomocí mutageneze in vitro ................................ 56 Westernová hybridizace................................................................... 56 Elektroforéza.................................................................................... 56 Blotování.......................................................................................... 57 Reakce proteinů s protilátkou .......................................................... 57 Vyvolání blotu ................................................................................. 57 Výsledek .......................................................................................... 58 ELISA .............................................................................................. 58 SDS-PAGE ...................................................................................... 59 SDS-elektroforéza............................................................................ 59 Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (PAGE).......................... 60 Izoelektrická fokusace (IEF)............................................................ 61 Dvojrozměrná elektroforéza (2-DE) ................................................ 62 Hmotnostní spektrometrie (MALDI-TOF) ...................................... 63
8
Odstraněno: 8. 2. ... [1] „Footprinting“ pomocí DNázy Odstraněno: 8. 3. Test ... [2] modifikované interference 53 Odstraněno: 8. 4. Identifikace ... [3] kontrolní sekvence pomocí deleční Odstraněno: 8. 4. 1. ... [4] Provedení deleční analýzy 55 Odstraněno: 8. 5. Identifikace a ... [5] studium translačního produktu Odstraněno: 8. 5. 1. ... [6] Metody HRT a HART Odstraněno: 8. 5. 2. ... [7] Analýza proteinů pomocí Odstraněno: 8. 5. 3. ... [8] Westernová hybridizace 57 Odstraněno: 8. 5. 3. 1. ... [9] Elektroforéza 57 Odstraněno: 8. 5. 3. 2. ... [10] Blotování 58 Odstraněno: 8. 5. 3. 3. ... [11] Reakce proteinů s protilátkou 58 Odstraněno: 8. 5. 3. 4. ... [12] Vyvolání blotu 58 Odstraněno: 8. 5. 3. 5. ... [13] Výsledek 59 Odstraněno: 8. 5. 4. ... [14] ELISA 59 Odstraněno: 8. 5. 5. SDS... [15] PAGE 60 Odstraněno: 8. 5. 5. 1. ... SDS[16] elektroforéza 60 Odstraněno: 8. 5. 5. 2. ... [17] Elektroforéza Odstraněno: 8. 5. 6. ... [18] Izoelektrická fokusace (IEF) 62 Odstraněno: 8. 5. 7. ... [19] Dvojrozměrná elektroforéza (2Odstraněno: 8. 5. 8. ... [20] Hmotnostní spektrometrie
Odstraněno: 9. DISKUZE
9. DISKUZE .............................................................................................................. 65
Odstraněno: ¶ ¶
9. 1. Studium exprese na úrovni mRNA ................................................................. 65
Odstraněno: 9. 1. Studium exprese na úrovni mRNA 66
9. 2. Studium exprese na úrovni proteinu ............................................................... 67
Odstraněno: 9. 2. Studium exprese na úrovni proteinu 68
10. SEZNAM ZKRATEK POUŽITÝCH METOD ................................................... 69
Odstraněno: 10. SEZNAM ZKRATEK POUŽITÝCH METOD 70
11. POUŽITÁ LITERATURA .................................................................................. 70
Odstraněno: 11. POUŽITÁ LITERATURA 71
9
66
1. ÚVOD Exprese genů je v podstatě komplexní proces, jímž je genetická informace (GI) uložena ve formě deoxyribonukleové kyseliny (DNA) přeměněna v konkrétní buněčné struktury. Produkty exprese genů jsou molekuly proteinů, jsou jimi však i ribonukleové kyseliny (RNA). Exprese strukturních genů obecně sleduje schéma, kdy je určitý úsek DNA (gen) přepsán mediátorovou RNA (mRNA) a ta slouží jako matrice pro syntézu bílkoviny. Syntézy bílkovin se také mimo rRNA účastní ještě ribosomální (rRNA) a transferová RNA (tRNA). V eukaryotických buňkách je ve skutečnosti vše daleko komplikovanější a zmíněná exprese genetické informace (GI) se děje v mnoha na sebe navazujících krocích. Produktem transkripce ještě není mRNA, ale její prekurzor, primární transkript či heterogenní jaderná RNA (hnRNA). hnRNA jestě musí v jádře projít řadou úprav, než se z ní stane zralá mRNA, jež pak může být translatována. Zralá mRNA pak je pak transportována z jádra do cytoplazmy a tam za příznivých podmínek může dojít k translaci. Ještě je nutné zmínit, že molekula RNA se v buňce nikdy nevyskytuje nahá, ale vždy v asociaci s řadou RNA-vazebných a dalších bílkovin. RNA s bílkovinami pak tvoři ribonukleoproteinový komplex či částici, zkráceně RNP. Bílkovinná složka RNP komplexu se je zodpovědná jednak za ochranu reaktivní a méně stabilní RNA, dále plní i řadu úloh při dozrávání primárního transkriptu v jádře a konečně se podílí i na určování osudu RNA v cytoplazmě. RNP komplexy zralých mRNA se nazývají mRNP částice, komplexy jejich nezralých forem pak hnRNP. Je zřejmé, že proces genové exprese musí být velice pečlivě regulován na všech zúčastněných úrovních. Této regulace se mimo bílkovin účastní i řada regulačních, nekódujících a většinou malých RNA, jež tak dotvářejí obrovskou variabilitu typů RNA vyskytujících se v eukaryotické buňce. Jedná se například o malé jaderné RNA (snRNA, z angl. „small nuclear RNA“) účastnící se sestřihu hnRNA či editační gRNA (z angl. guide – vést). Patří sem i stále se rozrůstající rodina protismyslných RNA, které se podílejí na umlčování genů.
2. REGULACE GENOVÉ EXPRESE V JÁDŘE Exprese genetické informace (GI) je u eukaryot poměrně komplikovaná a do značné míry neprobádaná. Základní kroky, do kterých ji můžeme rozdělit, jsou pak transkripce, zrání neboli posttranskripční modifikace hnRNA, transport z jádra do cytoplazmy, translace a posttranslační úpravy nově syntetizovaných bílkovin. Přestože regulace na úrovni transkripce představuje hlavní kontrolní bod exprese většiny genů, každý z následných kroků představuje atraktivní hladinu, na které může být a velice často i je genová exprese také regulována. K tomu je nutné přiřadit i další aktivity v cytoplazmě, například regulaci stability mRNA, přesnou lokalizaci v cytoplazmě, kontrolu translatovatelnosti jednotlivých transkriptů, eventuálně vytváření zásobních mRNP. Prvním krokem exprese strukturních genů je transkripce, jejímž produktem je molekula
hnRNA.
multienzymovým
Syntéza
komplexem
hnRNA RNA
je
katalyzována
polymerazy.
dle
matrice
V eukaryotických
DNA
buňkách
rozeznáváme tři evolučně spřízněné enzymy: RNA polymeráza I katalyzuje syntézu většiny rRNA, RNA polymeráza II se uplatňuje při syntéze mRNA (mediátorová RNA) a většiny malých jaderných RNA (snRNA) a konečně RNA polymeráza III je rodpovědná za syntézu transferových RNA, 5S rRNA a řady dalších malých a často regulačních molekul RNA. Protože aktivita RNA polymerazy II je nejprecizněji regulována a její produkty podstupují největší množství posttranskripčních modifikací, má tento enzymový komplex nejsložitější strukturu a sestává z nejvíce podjednotek. Z hlediska osudu primárního transkriptu je důležitou součástí Cterminální doména, tzv. CTD platforma. Tato doména lokalizovaná v místě, kde nově syntetizovaná RNA opouští komplex RNA polymerazy, slouží jako platforma pro formování hnRNP a dále pro asociaci bílkovinných komplexů zodpovědných za posttranskripční modifikace primárního transkriptu. Většina tzv. posttranskripčních modifikací vlastně vůbec neprobíhá po ukončení transkripce, ale ještě v jejím průběhu a přesnější označení pro tuto skupinu reakcí by mělo být kotranskripční modifikace (ROSYPAL, S. a kol., 1999). První „postranskripční“ modifikací primárního transkriptu je přidání čepičky na jeho 5´-konec. K tomu dochází záhy po iniciaci transkripce prostřednictvím několika čepičkujících enzymů. Struktura čepičky (7-methylguanosin) a hlavně její
11
připojení k primárnímu transkriptu prostřednictvím atypické 5´-5´ trifosfátové vazby představují účinnou ochranu nově syntetizované RNA před aktivitou buněčných exonukleas. Čepička se dále účastní sestřihu pre-mRNA a podílí se i na zprostředkování exportu zralé mRNA do cytoplazmy a při vlastní translaci. Úpravou prochází i opačný konec molekuly hnRNA. Touto úpravou je nejčastěji polyadenylace, tedy endonukleolytické rozštěpení primárního transkriptu v přesně definovaném místě a následné dosyntetizování poly(A) řetězce různé délky. Vyjímečné je, že tato syntéza probíhá bez templátu a za vydatné spoluúčasti bílkovin PABP. Bílkoviny PABP specificky rozpoznávají poly(A) řetězec, k němuž se váží a jehož délku ovlivňují.Ribonukleoproteinová částice, na které k polyadenylaci dochází, se někdy nazývá poly(A)osom. Poly(A) řetězec, mimo stabilizace 3’-konce mRNA, hraje spolu s čepičkou významnou roli při zprostředkování fyzického kontaktu obou konců mRNA, které je důležité zejména při iniciaci translace a při recyklaci ribosomálních podjednotek a translačních faktorů po jejím ukončení. V mRNA eukaryotických organismů jsou kódující oblasti (exony) většinou přerušovány nekódujícími intervenujícími sekvencemi (introny). Počet intronů v jednom genu může být značně variabilní a kolísá od žádného či jednoho až po mnoho desítek. Také jejich délka se pohybuje od několika desítek nukleotidů až po desetitisíce basí. Můžeme však říci, že průměrný eukaryotický gen obsahuje 3-10 intronů, každý o délce 100-200 nukleotidů (HONYS, D., 2009). Sestřihem nazýváme vyštěpení intronu v přesně definovaných pozicích (5’- a 3’-místo sestřihu) a následnou ligaci odpovídajících exonů. Je zřejmé, že precizní rozpoznání správných míst sestřihu je klíčovým předpokladem úspěšného vystřižení intronu. Reakčním mechanismem sestřihu je energeticky neutrální transesterifikace. To je jedna z reakcí, která může být katalyzována ribozymy. K sestřihu dochází na spliceosomech (z anglického splicing – sestřih), což jsou ribonuleoproteinové částice, komplexy hnRNA (ve formě hnRNP), malých jaderných RNA (snRNA, ve formě snRNP) a dalších bílkovin. Spliceosom je během sestřihového cyklu postupně formován kolem hnRNP, a to postupnou asociací jednotlivých snRNP kolem obou míst sestřihu. Jedna ze snRNA pak s největší pravděpodobností tvoří i katalytické místo spliceosomu. Ne všechny introny jsou vyštěpeny vždy – důležitým a často využívaným regulačním mechanismem genové exprese eukaryot je fenomén alternativního sestřihu. Při něm dochází k vystřižení jen některých potenciálních
12
intronů či jejich kombinací a je tak umožněna syntéza několika různých bílkovin z jednoho primárního transkriptu. Zvláštní skupinu pak tvoří introny schopné samosestřihu. Tyto introny, vyskytující se převážně v semiautonomních organelách eukayrotických buněk, obsahují vše potřebné pro své úspěšné vystřižení a do určité míry ani nevyžadují asistenci bílkovin, jsou to typické ribozymy. Podle mechanismu sestřihu rozeznáváme dvě základní skupiny, z nichž jedna sdílí způsob svého vystřižení se spliceosomálními introny popsanými výše. Jsou to tzv. introny II. typu. Tyto introny jsou také považovány za evoluční předchůdce „klasických“ intronů, o nichž se soudí, že spolu se spliceosomálními snRNA vznikly rozpadem intronů II. typu. Poslední
a
také
nejméně
prozkoumanou
skupinu
posttranskripčních
modifikací – editaci– zmíníme jen stručně. Jedná se o řadu úprav, jejichž společnou vlastností je místně specifická změna sekvence RNA odchylující jí od sekvence DNA (RNA) templátu, avšak s výjimkou dříve popsaných úprav sestřihu a polyadenylace. Konkrétně se zejména jedná o místně specifickou deleci či inserci nukleotidů, případně o jejich konverzi. V některých případech je nezralá RNA editována podle templátu, kterým je malá, nezávisle transkribovaná molekula gRNA (z anglického guide – vést). Analogicky dalším typům modifikací, k alespoň některým typům editace dochází na RNP částicích nazvaných editosomy. Podobně jako sestřih, i editace umožňuje expresi různých variant RNA bez nutnosti změn v genomové DNA. Jednotlivé formy editace byly popsány ve všech typech RNA, a to ve všech říších v jaderném, mitochondriálním i plastidovém genomu. Typickým příkladem mimo mRNA je obecně rozšířená editace prekurzorů tRNA, kde její působení vede ke konverzi běžných basí v base netypické, vyskytující se přednostně či výhradně v tRNA. Těchto netypických basí v tRNA bylo dosud popsáno téměř sto. Produktem posttranskripčních modifikací primárního transkriptu je zralá molekula mRNA. Ta je ve formě mRNP exportována do cytoplasmy, kde již může být translatována (HONYS, D., 2009).
13
3. REGULACE GENOVÉ EXPRESE V CYTOPLAZMĚ
Každá buňka klade rozdílné nároky na potřebu jednotlivých bílkovin jak z hlediska časování a místa syntézy tak z hlediska potřebného množství. Tyto faktory nejsou často zcela zohledněny na úrovni transkripce, ale jsou průběžně dolaďovány až na místě určení, v cytoplasmě, na úrovni translace. Buněčný aparát zde má možnost kontrolovat a měnit stabilitu jednotlivých mRNA, jejich přesnou lokalizaci v cytoplasmě a účinnost, s jakou budou translatovány (translatovatelnost). Všechny tyto faktory určují, jaké množství konkrétní bílkoviny bude v buňce v daný moment syntetizováno. Proces translace, který probíhá ve třech fázích (iniciace, elongace a terminace), dokonce nemusí být regulován jen na logicky nejpochopitelnější úrovni iniciace, ale i v pozdějších obdobích, během probíhající elongační fáze. Všechny uvedené regulační úrovně spolu velice úzce souvisejí a žádná z nich nemůže být brána v potaz bez zohlednění úrovní ostatních. Například stabilita či translatovatelnost řady mRNA kódujících často regulační bílkoviny se významně mění v závislosti na jejich lokalizaci či vývojovém stádiu příslušné buňky. Příkladem může být mRNA kódující histony. Potřeba histonů výrazně fluktuuje během buněčného cyklu - počet všech typů histonů musí být koordinovaně zdvojnásoben během syntetické fáze (replikace DNA), jinak zůstává přibližně konstantní. S ohledem na množství histonů v jádře, které hmotnostně odpovídá množství přítomné DNA, je zřejmé, že náhlý extrémní nárůst syntézy histonů a zejména její stejně náhlý konec nemůže být regulován jen na transkripční úrovni. Podílí se na něm řada mechanismů, mimo transkripce i forma modifikace 3’-konce všech histonových mRNA odlišná od polyadenylace. Ta pak souvisí se selektivní stabilizaci a destabilizací těchto molekul v závislosti na probíhající fázi buněčného cyklu. Specifická struktura na 3’-konci histonových mRNA je zodpovědná za náhlou destabilizaci do té doby stabilních transkriptů v okamžiku, kdy již opadla potřeba dalších histonových bílkovin (HONYS, D., 2009). Stabilita, lokalizace i translatovatelnost mRNA je určována přítomností specifickýchsekvenčních elementů nalézajících se většinou v nepřekládaných oblastech mRNA a interagujících se specifickými regulačními bílkovinami či molekulami RNA. Zmíněné strukturní motivy se mohou nacházet i v kódující oblasti,
14
to je však jev méně častý. Příkladem regulační RNA uplatňující se mimo jiné v cytoplasmě je protismyslná RNA (angl. antisepse RNA), která se s postupujícím výzkumem ukazuje být jedním z čím dál důležitějších regulačních fenoménů. Popsaný přístup, využívající schopnost RNA tvořit dvouvláknové struktury, umožňuje cílené umlčování genů a stále častěji nalézá své uplatnění při výzkumu i v terapeutické praxi. Obecně můžeme říci, že sekvenční elementy ovlivňující stabilitu mRNA se častěji nacházejí blíže 3’-konci molekuly, lokalizační elementy a motivy regulující translatovatelnost zase na opačné straně, existuje však řada výjimek. Jednotlivé strukturní elementy většinou nefungují samostatně, ale při jejich působení se uplatňuje aditivní efekt. V jednom transkriptu je často přítomno více aktivních motivů, jejichž počet a poloha spolu s přítomností vazebných bílkovin či regulačních RNA pak určuje konečný stav. Zmíněné strukturní elementy se také často překrývají, což dále zvyšuje možnosti kontroly. Je patrné, že u eukaryot je cesta od transkribovaného genu k syntéze odpovídající bílkoviny dlouhá a složitá a že se na ní nachází celá řada kontrolních bodů. Některé z popsaných či nepopsaných regulačních mechanismů jsou výjimečně zajímavé a komplikované a jejich vymyšlení by jistě vyžadovalo notnou dávku fantazie. Většina regulačních kroků se děje za spoluúčasti RNA a bílkovin. Prakticky neustále
dochází
k
přeskupování
dočasně
formovaných
specifických
ribonukleoproteinových komplexů a jejich nahrazování jinými s jinou funkcí. To mimo jiné předpokládá existenci precizních mechanismů zajišťujících koordinovanou expresi regulovaných a regulačních molekul. Úzká spolupráce RNA a bílkovin také potvrzuje, že genová exprese eukaryot a zejména její regulace není neměnným lineárním sledem událostí, který je odstartován signálem pro transkripci určitých genů. Daleko spíše se jedná o řadu paralelních procesů a komplexní síť interakcí na mnoha vzájemně se prolínajících úrovních, které jsou postupně dolaďovány ještě v průběhu exprese konkrétního genu. To buňce umožňuje účinněji a operativněji reagovat na měnící se podněty okolí, ale také napravovat chyby nutně se vyskytující v tak komplikovaném systému. Jednotlivé kroky také proto nemohou probíhat nezávisle a odděleně od ostatních, existuje zde kontinuum světa RNA a bílkovin v eukaryotické buňce (HONYS, D., 2009).
15
4. VÝZNAM STUDIA EXPRESE GENŮ
Geny mohou být funkční jen tehdy, pokud se exprimují. První fází exprese je transkripce genu do komplementárního vlákna RNA. U některých genů, např. u genů kódujících transferovou RNA (tRNA) a ribozomální RNA (rRNA), je samotný transkript funkčně důležitou molekulou.
4. 1. RNA transkript Chceme-li se něco dozvědět o studiu exprese genu, měli bychom se zaměřit na RNA transkript. Molekulární biology bude především zajímat, zda je transkript věrnou kopií daného genu nebo jestli v něm některé genové segmenty chybí. Chybějící části se nazývají introny a jejich struktura a potenciální funkce je předmětem značné pozornosti. Vedle intronů jsou důležité také přesné pozice výchozích a koncových bodů transkripce. Transkripty nejsou většinou jen kopiemi samotného genu, ale také nukleotidových oblastí, které gen lemují. I když zatím nebyly signály určující začátek a konec transkripčního procesu uspokojivě vysvětleny, musíme je lokalizovat, abychom se mohli expresí genu dále zabývat. 4. 1. 1. Zkoumání transkriptu klonovaného genu Metody transkripční analýzy jsou nejčastěji založeny na hybridizaci mezi RNA transkriptem a fragmentem DNA obsahujícím příslušný gen. K hybridizaci nukleových kyselin dochází velmi snadno jak mezi komplementárními vlákny DNA a RNA, tak mezi jednovláknovými molekulami DNA. Výsledný DNA-RNA hybrid analyzujeme elektronovým mikroskopem či pomocí nukleáz specifických pro jedno vlákno (BROWN, T. A., 2006). 4. 1. 2. Elektronová mikroskopie molekul nukleových kyselin Molekuly
nukleových
kyselin
můžeme
pozorovat
elektronovým
mikroskopem, pokud jsme předtím polynukleotidy ošetřili chemickými látkami, které zvětšují jejich průměr (světlost). Neošetřené molekuly nemůžeme pozorovat, protože jsou příliš tenké.
16
K molekulám DNA se obvykle přidává protein, např. cytochrom c, jež se váže k polynukleotidovým řetězcům a potahuje vlákna tlustým pouzdrem. Viditelnost preparátu zvýšíme tak, že obalená vlákna obarvíme uranyl acetátem nebo jiným materiálem s velkým počtem elektronů. Získáme tak poměrně výrazný obraz molekul nukleové kyseliny. Elektronová mikroskopie dříve sloužila k analyzování hybridizace mezi různými molekulami DNA, postupně se však stále častěji uplatňovala také při studiu hybridů DNA-RNA. Používá se především ke zjištění přítomnosti intronů v genu. Představme si, že mezi vláknem DNA obsahujícím gen a jeho RNA transkriptem dojde k hybridizaci. Pokud gen obsahuje introny, nebudou tyto úseky DNA odpovídat RNA transkriptu a jejich base se nespárují. Stočí se do „smyčky“, což jim dává onen charakteristický vzhled pozorovatelný v elektronovém mikroskopu. Počet a poloha těchto smyček koresponduje s počtem a polohou intronů daného genu. Další informace získáme tak, že gen sekvenujeme a hledáme charakteristické znaky vyznačující hranice intronů. Máme-li k dispozici cDNA klon, porovnáme jeho sekvenci – přirozeně bez intronů – se sekvencí daného genu a tak přesně zjistíme polohu intronů. 4. 1. 3. Analýza transkriptu pomocí prodlouženého primeru Analýza pomocí S1 nukleázy reprezentuje velmi výkonnou metodu umožňující identifikovat jednak 5´a 3´konce transkriptu a jednak hranice mezi exony a introny. Poslední metoda transkripční analýzy, o které bych se chtěl zmínit, prodloužení primeru (primer extension), není tak účinná, protože identifikuje pouze 5´ konec RNA. Nicméně je také poměrně důležitá a často se jí používá k ověření výsledků analýzy s S1. Prodloužení primeru lze použít jen tehdy, když máme alespoň část sekvence transkriptu. Krátký oligonukleotidový primer se totiž musí k RNA připojit na známém místě, nejlépe do 100-200 nukleotidů od 5´ konce transkriptu. Když se primer připojí, prodloužíme jej reverzní transkriptázou, která kopíruje vlákno RNA, dokud nenarazí na 5´ konec transkriptu. 3´ konec nově syntetizovaného řetězce DNA tedy odpovídá konci 5´ konci transkriptu. Na sekvenci DNA tento konec lokalizujeme
17
tak, že délku jednovláknové molekuly DNA porovnáme s místem připojení primeru Odstraněno: ,
(SMITH in BROWN, T. A., 2006).
Odstraněno: C.P., 2001
4. 1. 4. Význam exprese genů Analýza exprese genů na úrovni RNA má velký význam v obecně biologicky orientovaném
základním
i
aplikovaném
výzkumu,
zvláště
lékařském
a
farmaceutickém. Určování přítomnosti RNA některých diferenciálně exprimovaných genů a patogenů má vysokou vypovídací hodnotu diagnostickou. V současné době jsou časově náročné tradiční metody identifikace přítomnosti studované mRNA nahrazovány metodou RT-PCR, která spočívá v reverzní transkripci RNA na cDNA, amplifikaci cDNA fragmentu pomocí PCR a detekci amplifikovaného fragmentu. Pozdější výzkumy vedly k poznání, že RNA je schopna, ale v omezeném rozsahu, zastávat funkce DNA i bílkovin, a to zejména v základních procesech exprese genetické informace (GI) a její regulace. V tomto směru byl klíčový objev určitých katalytických schopností některých specializovaných molekul RNA, jež v polovině 80. let učinil Američan českého původu Thomas R. Cech. Nadšení z popsaných objevů dokonce vedlo ke zformulování konceptu „světa RNA“, jež měl v raných dobách počátků života přecházet dnešnímu komplexnímu světu DNA, RNA a bílkovin a ve kterém měla uchovávání i expresi genetické informace (GI) zajišťovat právě RNA (KMOCH, S., 2008).
18
4. 2. Význam studia funkční genomiky Na začátku 21. století se pozornost molekulární biologie přesunula od studia jednotlivého genu ke studiu celého genomu. Tuto změnu v 90. letech 20. století urychlil vývoj metod umožňujících sekvenování velkých genomů. V roce 2000 už bylo sekvenování bakteriálního genomu zcela běžné a projekty zacílené na eukaryotní genomy vypadají mnohem reálněji, než tomu bylo o několik let dříve. K tomu, abychom pochopili genom, je zapotřebí tří specifických typů analýz. 1)
Genomika (genomics) je technika získávání dat o sekvencích genomů. Data mají zprvu podobu mnoha jednotlivých sekvencí o délce 500-800 bp, které musíme sestavit do jedné souvislé genomové sekvence. Musíme tedy navrhnout strategii, která povede ke správnému řazení sekvencí.
2)
Postgenomika neboli funkční genomika je analýza genomových sekvencí zahrnující lokalizaci genů, řídicích sekvencí a dalších znaků, které jsou předmětem našeho zájmu. Po ní následují experimenty, jež mají za úkol zjistit funkci nalezených, dosud neznámých genů.
3)
Bioinformatika je metodika práce s počítačovými systémy, které se uplatňují v genomickém
a
postgenomickém
výzkumu.
Bioinformatika
zahrnuje
počítačově zpracované skupiny sousedních bloků sekvencí DNA, zjišťování přítomnosti genů v sekvencích, předjímání funkce genů a uchovávání obrovského množství dat generovaných v průběhu genomického projektu (BROWN, T. A., 2006). 4. 2. 1. Identifikace genů v sekvenci genomu Lokalizovat gen je snadné, pokud známe aminokyselinovou sekvenci proteinu, jež umožňuje předpovědět nukleotidovou sekvenci genu, a nebo pokud byla už dříve sekvenována odpovídající cDNA nebo EST. Většinou však žádné předchozí informace umožňující určit správnou DNA sekvenci nemáme. Za těchto okolností může být lokalizace genu obtížná, a to i přesto, že máme k dispozici mapu. Mapy jsou většinou pouze omezeně přesné a pozici genu vyznačí jen přibližně, takže k tomu, abychom jej nalezli, musíme často prohledat další desítky, či dokonce stovky kilobazí. Mapa řadu genů vůbec nezachycuje, protože se jejich existence neočekává.
19
Jak tedy tyto geny na sekvenci genomu lokalizujeme? 4. 2. 2. Hledání otevřených čtecích rámců (open reading frames) Sekvence DNA genu je otevřený čtecí rámec (open reading grame, ORF). Je to řada nukleotidových tripletů počínající iniciačním kodonem a končící terminačním kodonem (u většiny genomů TAA, TAG či TGA). Nalezení ORF v genomové sekvenci pouhým zrakem, ale častěji elektronicky, je prvním krokem v lokalizaci genu. Je důležité prohledat všech šest čtecích rámců (reading frames), protože geny mohou vést oběma směry podél dvoušroubovice DNA. U bakteriálního genomu je typickým výsledkem hledání identifikace dlouhých ORFs, jež jsou téměř jistě geny, a mnoha kratších ORF, které jsou částečně či úplně obsaženy uvnitř genů, ale leží v různých čtecích rámcích. Tyto krátké sekvence jsou kombinacemi nukleotidů, které náhodou tvoří ORF, ale nejsou geny. Pokud jeden z těchto krátkých ORF leží celý mezi dvěma geny, může být mylně považován za skutečný gen, ale u většiny bakteriálních genomů je mezi geny jen velice málo místa, takže tento problém nastává jen velmi zřídka. Lokalizace genu u eukaryot je mnohem složitější. Eukaryotické geny nejsou na sebe tak nahuštěny jako geny bakteriální a mezery mezi geny jsou mnohem větší. Znamená to tedy, že důkladným ohledáním sekvence zjistíme mnoho krátkých ORF, které nemůžeme brát na lehkou váhu jen proto, že se nepřekrývají se skutečnými geny. U člověka a jiných vyšších eukaryotů je hledání genů navíc komplikováno tím, že mnoho z nich je rozděleno na exony a introny. Určité nukleotidové sekvence se vyskytují vždy na hranicích exonu a intronu, ale vyskytují se také uvnitř exonů a uvnitř intronů. Zjistit, které z těchto sekvencí opravdu tvoří hranici exon-intron, může být velmi obtížné, a vývoj algoritmů, jež by toto přesně prováděly, je jedná z hlavních výzev bioinformatiky (BROWN, T. A., 2006).
20
4. 2. 3. Studie transkriptomu a proteinu Dosud jsme se zabývali aspekty postgenomického výzkumu, které se zaměřují na studium jednotlivých genů. Posun v zaměření výzkumu od genů ke genomu vedl ke vzniku nových typů analýz, které se snaží porozumět aktivitě genomu jako celku. 1)
Transkriptom označuje veškerou mediátorovou RNA (mRNA) v buňce. Tento pojem také vyjadřuje celkový obraz genové exprese v dané buňce.
2)
Proteom označuje obsah proteinů v buňce a odráží např. její biochemický potenciál (BROWN, T. A., 2006).
4. 2. 3. 1. Studium transkriptomu Techniky pro studium transkriptomu byly poprvé vyvinuty jako součást kvasinkového post-genomického projektu. Ve své podstatě jsou tyto techniky založeny na složitém typu hybridizační analýzy. Každý z celkového počtu 6000 kvasinkových genů byl získán jako individuální klon a vzorky byla naneseny na mikroskopické sklíčko v řazení 80x80 bodů. Tomuto uspořádání se říká mikroerej (microarray). Aby bylo možné určit, které geny jsou v kvasinkových buňkách kultivovaných za určitých podmínek aktivní, byla z buněk izolována mRNA, transformována na cDNA, označena a hybridizována s klony na mikroarray. Bylo použito fluorescenčního značení a hybridizace byla detekována prohlížením mikroarray konfokálním mikroskopem. Body, které dávaly signál, indikovaly geny, jež byly za daných podmínek aktivní. V případě, že jsou kvasinky přeneseny do jiných růstových podmínek (např. nedostatek kyslíku), změny v expresi genů lze monitorovat opakováním experimentu s dalším preparátem cDNA. Mikroarray se používá nyní k monitorování změn v transkriptomech mnoha organizmů. V některých případech je strategie stejná jako u kvasinek, tzn. že mikroarray reprezentuje všechny geny genomu. To je však možné provést pouze u těch organizmů, které mají relativně málo genů. Pro mikroarray všech genů člověka by stačilo 10 sklíček o rozměrech 18x18 mm, obrovskou práci by však znamenala příprava klonů každého z 30 000-40 000 lidských genů. To ale naštěstí není nutné. Například ke studiu změn v transkriptomu způsobených rakovinou by mikroarray byl připraven z cDNA knihovny zdravé tkáně. Hybridizace s označenou cDNA
21
z rakovinové tkáně by odhalila geny, jejichž regulace je zvýšena či snížena jako projev rakovinového stavu. Alternativou k mikroarray jsou DNA čipy (DNA chips), což jsou tenké silikonové membrány nesoucí mnoho různých oligonukleotidů. Tyto oligonukleotidy jsou syntetizovány přímo na povrchu čipu a lze jej připravit v hustotě 1 milion na cm2, což je výrazně více než u klasických mikroarray. Hybridizace mezi oligonukleotidem a probou je detekována elektronicky. Protože jsou oligonukleotidy syntetizovány de novo pomocí speciálních automatických procedur, je relativně snadné připravit čip nesoucí oligonukleotidy, jejiž sekvence jsou specifické pro každý Odstraněno: ,
lidský gen (GRANJEAUD et al. in BROWN, T. A., 2006).
Odstraněno: S. a kol.,1999
4. 2. 3. 2. Studium proteomu Proteom je soubor proteinů v buňce. Studium proteinu (= proteomika) poskytuje další informace, které bychom nezískali pouhým vyšetřením transkriptomu, protože jednotlivá mRNA (a odtud gen) dává vznik více než jednomu proteinu, a to díky posttranslačním úpravám. K těm dochází u všech eukaryotů, kde je většina polypeptidů, jež jsou syntetizovány translací, dále upravována přidáním chemických skupin. Každé jednotlivé přidání určuje přesnou funkci proteinu. Například fosforylace je důležitou modifikací používanou k aktivaci některých proteinů. Pro studium proteomu je celý proteinový obsah buňky či tkáně nejprve separován dvourozměrnou elektroforézou. Proteiny nadávkujeme do jamky na jedné straně čtvercového polyakrylamidového gelu a separujeme na základě molekulární hmotnosti. Čtverec pootočíme o 90° a provedeme další elektroforézu, při níž tentokrát separujeme proteiny vedle náboje. Výsledkem je dvourozměrný obraz bodů různých velikostí, tvarů a intenzit, přičemž každý bod reprezentuje odlišný protein či skupinu proteinů. Pokud srovnáme dva gely, jsou rozdíly mezi proteiny zřejmé z odlišného uspořádání bodů. Chceme-li identifikovat protein v určitém bodě, purifikujeme z gelu vzorek, který ošetříme proteinázou stříhající polypeptid ve specifické aminokyselinové sekvenci (podobným způsobem jako restrikční endonukleáza). Výsledné peptidy dále analyzujeme hmotnostní spektrometrií. Tato technika byla původně vyvinuta k identifikaci látek na základě poměrů hmoty k náboji ionizujících forem, jež jsou
22
Naformátováno: Zarovnat do bloku
produkovány v případě, když je látka vystavena vysokoenergetickému poli. Pro peptidy se používá specializovaná verze hmotnostní spektroskopie nazývaná matrixassisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF). Pro ionizaci je pro peptid v hmotnostním spektrofotometru stanoven poměr hmoty k náboji, a to na základě „času letu“ (time-of-flight) v okamžiku, kdy projde od ionizačního zdroje k detektoru. Poměr hmoty k nábojí umožní stanovit molekulovou hmotnost, což na druhé straně dovolí určit aminokyselinové složení každého peptidu. Pokud je ve dvourozměrném gelu z jednoho proteinového spotu analyzován velký počet peptidů, pak výsledná informace o složení může být porovnána s genomovou sekvencí, a tak je možno identifikovat gen, jež specifikuje daný protein (MANN et al. in BROWN, T. A., 2006). 4. 2. 3. 3. Význam genomiky a)
Projekt Lidský genom Nejdůležitějším projektem genomiky je ovšem projekt „Lidský genom“, jehož
cílem je přečíst si naši vlastní genetickou informaci (GI).Lidský genom se skládá z molekul DNA o celkovém obsahu asi 3 miliard nukleotidů. Tyto molekuly DNA jsou uloženy v jádře lidské buňky ve 23 chromosomech. Vlastně párech chromosomů, protože každá tělní buňka obsahuje jeden chromosom původně pocházející od otce a k němu do páru chromosom od matky. Koncem roku 2003 byla publikována nukleotidová sekvence lidského chromosomu 22. Unikátní část tohoto chromosomu se skládá z 34,4 miliónů nukleotidů. Ty tvoří 545 genů. 97% DNA nenese žádnou smysluplnou zprávu. Jen přibližně 3% lidské DNA a DNA mnoha dalších vyšších organizmů kóduje vznik funkčních molekul, zejm. proteinů. Z genetických studií se ví, že nejméně 35 dědičných chorob je spojeno s poruchou genů lokalizovaných na chromosomu 22. Nyní nastává důležité období projektu Lidský genom, a sice podrobná analýza nukleotidových sekvencí nástroji bioinformatiky a funkční genomiky (na modelu tkáňových kultur).
23
Odstraněno: , Odstraněno: M. a kol., 2001
Tak by se měla postupně objasnit funkce všech lidských genů, charakterizovat jejich případná poškození a studovat mechanismy regulace jejich „zapínání“ a „vypínání“ (tzv. exprese) (PAČES, V., 2008).
b)
Genomika v zemědělství V budoucnosti genomika umožní křížení dobytka a rostlin tak, aby se plně
využily jejich přirozené genetické variace. Zřejmě se budou šlechtit živočichové a rostliny také dle specifických požadavků trhu. V živočišné produkci hovězího, vepřového a drůbežího masa genomika využije informací o funkcích genů při křížení. Pro zdraví zvířat je důležitá odolnost vůči onemocněním. Genomika znalostmi genomů zvířat přispěje k vyšlechtění odolných zvířat a k vývoji účinnějších veterinárních léčiv (nedávno byly objeveny geny zodpovědné za odolnost drůbeže vůči salmonelóze). Genomika bude schopna do genomů rostlin zavádět geny, jež ovlivňují výživnou hodnotu, chuť a další vlastnosti. Bude možno také odstranit geny, Odstraněno: 2009
jež jsou odpovědné za určité alergeny či toxiny v rostlinách (BÍNA, J., 1976).
c)
Genomika a životní prostředí Genomika může vyřešit některé zásadní a obtížné problémy životního
prostředí a ekologie, jako jsou otázky „jak ekosystémy fungují“, „co je biodiverzita a jak ji lze ovlivnit“, „jak se organizmy chovají ve svém přirozeném prostředí“. Znalost mikroorganizmů získaná z genomiky může významně přispět k rozvoji biotechnologií šetrných k životnímu prostředí.
Genomické projekty
mikroorganizmů umožní určit, jak jsou skupiny mikroorganizmů v půdě a ve vodě ovlivňovány změnami klimatu či lidskou činností (umělé hnojení, znečištění atd.)
d)
Důsledky pro zdraví Genomický výzkum bude mít v budoucnosti zásadní dopad na naše znalosti
lidských onemocnění. Studium lidského genomu umožní lépe porozumět, jak naše geny ovlivňují vnímavost našeho organizmu vůči určitým onemocněním (vč. infekčních). Další výzkum zřejmě povede ke zdokonalení diagnostiky, prevence a Odstraněno: 2009
samotného léčení (BÍNA, J., 1976).
24
5. CÍL PRÁCE Cílem předložené bakalářské práce bylo zjistit význam studia exprese genů a funkční genomiky (postgenomiky). Dále bylo naším úkolem zhodnotit metody pro studium exprese genetické informace na úrovni studia mRNA a na úrovni studia vznikajících proteinů. Samozřejmě nemůžeme opomenout zhodnocení jednotlivých metod, jejich klady, zápory a vhodnost pro využití v genetice hospodářských zvířat.
25
6. Molekulární podstata exprese genů Z hlediska molekulární podstaty můžeme expresi genů rozdělit do 2 fází: 1)
Transkripce
2)
Translace
6. 1. Transkripce Transkripce, neboli syntéza RNA dle předlohy DNA za pomoci RNA polymerázy. Stavebními kameny jsou ribonukleosid trifosfáty (ATP, GTP, UTP a CTP). Proces prodlužování řetězce a směr syntézy je stejný jako při replikaci DNA. Na rozdíl od replikace je přepis do RNA nesymetrický. V určitém segmentu DNA je přepisován jen jeden řetězec DNA (3´ --- 5´) označovaný jako negativní (antikódující, -DNA). Druhý nepřepisovaný řetězec (5´ --- 3´, pozitivní, kódující, +DNA) má stejnou sekvenci nukleotidů jako primární produkt transkripce (transkript) s tím, že thymin je nahrazen v RNA uracilem. Ten většinou podléhá posttranskripčním úpravám, aby vznikla „zralá“ RNA (ROSYPAL, S., 2001). Podle typů primárních transkriptů se rozlišují tři typy transkripčních podjednotek, které jsou u prokaryot transkribovány jedním enzymem RNA polymerázou a u eukaryot jsou čtyři typy RNA polymerát závislých na DNA: ● transkripční jednotka strukturních genů, ● transkripční jednotka genů pro rRNA (ribozomální RNA), ● transkripční jednotka genů pro tRNA (transferová RNA).
Proces transkripce je možno rozdělit do čtyř fází: 6. 1. 1. Iniciace Transkripce začíná ve specifických sekvencích nukleotidů na úseku DNA, který se nazývá promotor. Přepisovaná část DNA řetězce se označuje jako skriptor. První přepisovaný nukleotid se čísluje +1, takže promotorové sekvence jsou proti směru transkripce. U bakterií i eukaryontů jsou v této oblasti promotoru dvě evolučně konzervované sekvence, bližší je označována zjednodušeně jako TATA box (syn.
26
Hognesův box, ve vzdálenosti -10 u bakterií a -30 u eukaryont). Vzdálenější sekvence eukaryontů je označena jako CAT box (cca -100). Tyto boxy regulují intenzitu transkripce (sílu promotoru).Bakteriální RNA polymeráza se náhodně pohybuje po DNA, slabě navazuje a zase se uvolňuje, v případě, že narazí na odpovídající promotor, pevně se naváže a rozvine krátký segment dvoušroubovice a v místě nukleotidu
+1
zahájí
transkripci.
RNA
polymerázy
zahájí
syntézu
bez
oligonukleotidivého primeru, ale jen od ATP nebo GTP. Spouštění a zastavení transkripce a vyhledávání promotoru je regulováno jak funkcí a specifičností samé RNA polymerázy, tak vazbou různých proteinů (transkripčních faktorů) na promotory. U eukaryontů je celý proces zahájení transkripce složitější a komplikovaný tím, že DNA duplex je v chromozomech složitě svinut a seskládán do různých kliček a je vázán na komplexy proteinů. Transkribovaný úsek musí být přechodně rozvinut, zpřístupněn regulační, proteinům a DNA dvoušroubovice rozpletena pro činnost RNA polymeráz. 6. 1. 2. Prodlužování (elongace) transkripce RNA polymeráza syntetizuje RNA řetězec dle předlohy, přičemž kolem 12 nukleotidů nového vlákna zůstává ještě připojeno v místě transkripce. Za tímto segmentem se řetězec RNA odděluje od matrice a přepsaný úsek DNA se opět svinuje do dvoušroubovice. Natažení dvoušroubovice ruší enzym swiveláza. U prokaryontů volný transkribovaný začátek RNA zasahuje přímo do ribozomů, kde začne translace, přičemž transkripce z DNA nemusí být ukončena. Oba děje probíhají kontinuálně až do ukončení transkripce, tj. zastavení činnosti RNA polymerázy a uvolnění konce RNA. U prokaryontů je výsledným transkriptem polycistronová neboli mnohogenová mRNA, která má informaci pro sled několika po sobě jdoucích genů, přičemž během translace existuje mechanizmus, který tandem těchto informací rozdělí. Výsledkem je řada jednotlivých a různých polypeptidů. U eukaryontů je transkripce většinou unicistronová (jednogenová), tzn. že pro každý strukturní gen existují jednotlivé mRNA, které teprve po úpravě prochází z jádra do cytoplazmy na ribozomy. Pokud má některá mRNA eukaryontů oligocistronovou strukturu, oddělení jednotlivých funkčních polypeptidů nastává až v posttranslačních úpravách (BEDNÁŘ, J. a kol., 2006).
27
6. 1. 3. Ukončení (terminace) transkripce Ukončení transkripce je dobře prostudováno u prokaryontů, kde RNA polymeráza postupuje až do místa zvaného terminátor. V tomto místě nastává nejčastěji situace, kdy jsou v DNA dva shodné, ale sekvenčně obrácené sledy nukleotidů bohaté na C a G, které jsou uprostřed přerušené jedinečnou sekvencí. Protože RNA transkript je volný jednořetězec, v místě jedinečné sekvence se ohne a na základě komplementarity vytvoří vlásenkovitý ohyb. Komplementarita G ≡ C končí smyčku a syntéza řetězce RNA pokračuje v úseku DNA bohatém na adenin (oligo-A), který je přepsán do oligo-U v RNA. Hybridní segment DNA-RNA (komplementární oligo-A s oligo-U) je labilnější než vlásenka se smyčkou bohatá na páry G ≡ C. Tím se transkript uvolní. Existují však i jiné nechanizmy ukončení. 6. 1. 4. Posttranskripční úpravy Přepisem sekvencí DNA strukturních genů eukaryont do mRNA vzniká primární transkript neboli hnRNA (heterogenní RNA), která podléhá nejméně třem posttranskripčním úpravám. ●
Připojení čepičky – jde o napojení metylguaninového nukleotidu na 5´ konec . Čepička chrání 5´ konec před naštěpením exonukleázami. Čepička po navázání specifické bílkoviny (CBP – cap binding protein) funguje jako navádějící struktura pro vazbu ribozom.
●
Sestřih hnRNA – většina strukturních genů nejsou souvislé kódující sekvence, ale jsou přerušovány segmenty, které nejsou součástí funkční mRNA. Tyto úseky nazýváné introny jsou z hnRNA vyštěpeny a zbývající kódující úseky zvané exony jsou propojovány, aby daly vznik funkční mRNA. K vyštěpení dochází tvorbou lasovitých smyček na hnRNA a to tak, že každý intron začíná dubletovou sekvencí GU a končí AG. 3´ konec jednoho exonu se přiblíží k 5´ konci následujícího exonu. Konce mohou být vzdáleny stovky nukleotidů, přičemž dojde ke spojení
28
s přesností na jeden nukleotid. Proces vystřižení (angl. splicing) umožňuje ribonukleotidový a enzymový komplex zvaný spliceosom (SESTŘIH, 2009). ●
Polyadenylace – u eukaryontů je většina mRNA ukončena sekvencí kolem 250 adeninových nukleotidů tvořících ocas, který je připojený enzymem polyA-polymerázou na konec transkriptu. Smysl této úpravy je, podobný jako tvorba čepičky, při ochraně mRNA před rozštěpením exonukleázami.
I primární transkripty ostatních ribonukleových kyselin (pre rRNA a pre tRNA) podléhají obdobným posttranskripčním úpravám jako hnRNA jejichž výsledkem jsou funkční ribonukleové kyseliny (rRNA a tRNA) (BEDNÁŘ, J. a kol., 2006).
6. 2. Translace Proces
překladu
sekvence
nukleotidů
do
pořadí
aminokyselin
v polypeptidovém řetězci neboli translace probíhá v buněčných organelách – ribozomech. Oproti replikaci a transkripci je to proces daleko složitější. Do syntézy vchází upravené mRNA molekuly, ribozomy, dvě desítky aminokyselin, řada transferových tRNA přenášejících aminokyseliny, desítka enzymů a regulačních proteinů, které zprostředkují jak tvorbu polypeptidu dle instrukce zakódované v mRNA, tak i řadu dalších úprav primárního proteinu (ROSYPAL, S., 2001). Translaci je možné rozdělit podobně jako transkripci do čtyř fází: 6. 2. 1. Aktivace aminokyselin Tvorba peptidové vazby (-CO-NH-) začíná aktivací aminokyselin a to tak, že aminokyseliny navážou na 3´ konec tRNA. Všechny tRNA jsou sestaveny z jednoduchého polynukleotidového řetězce, který je dlouhý cca 80 nukleotidů. Tento řetězec je svinut do konfirmace, která zjednodušeně může připomínat „list jetele“. 5´ konec je fosforylován a na 3´ konci je vždy sekvence ACC představující tzv. akceptorové rameno, na které se váže aminokyselina. Aktivace aminokyseliny, tzn. tvorba esteru aminoacyl-transferové RNA (aa~tRNA) katalyzována aminoacyl-
29
tRNA-syntetázami, které jsou substrátově striktně specifické. Při chybě kombinace tRNA s aminokyselinou by se do polypeptidového žetězce zařadila nesprávná aminokyselina. Kromě akceptorového ramene, tRNA má dvě boční ramena (dihydrouracilová klička a pseudouridylová klička) obsahující minoritní baze a má další, tzv. antikodonovou smyčku. Toto antikodonové rameno se páruje s příslušným kodonem na mRNA. Tím je zabezpečen překlad genetické informace z mRNA do proteinů. Enzym aminoacyl-tRNA syntetázy rozpoznávají příslušnou tRNA ne podle sekvence nukleotidů na antikodonu, ale podle konfirmace povrchové struktury: antikodonového, pseudouridylového a hydrouracilového ramena. 6. 2. 2. Iniciace translace Vlastní syntéza proteinů probíhá na buněčných organelách ribozomech. Tyto organely plní současně vazbové, katalytické a regulační funkce. Ribozomy jsou složeny ze dvou podjednotek ribozomové RNA (velkých a malých), které dále obsahují několik typů rRNA lišících se hmotností, tvarem a funkcí. Kromě rRNA obsahují přes 50 různých proteinů. Syntéza peptidového řetězce je zahajována tvorbou iniciačního komplexu. Jeho podstatou je vazba aktivované tRNA pro methionin na iniciační kodon AUG na mRNA. Před tímto iniciačním kodonem je na mRNA krátká sekvence, která je komplementární s částí ribozomové rRNA, takže pomáhá ke správnému umístění na ribozomu. Při syntéze vchází do interakce několika dalších tzv. iniciačních proteinů (IF1, IF2, IF3), které umožňují vazbu na ribozom (BEDNÁŘ, J. a kol., 2006). 6. 2. 3. Elongace (prodlužování) proteinu Na aminoacylové místo ribozomu se navazuje další aa~tRNA, která je vybrána dle sekvence kodonu na mRNA, která se v tomto místě nachází. Další aa~tRNA jsou na ribozom umisťovány tzv. elongační proteiny (EF-Tu, EF-Ts a EFG), které kromě transportní funkce mají schopnost kontroly správnosti zařazených aa~tRNA. Vznik peptidové vazby je katalyzován enzymem peptidyltransferázou, která je součástí větší ribozomové podjednotky. V tomto kroku se – NH2 skupina připojované aminokyseliny (připojené na aa~tRNA) váže na uhlík karboxylové skupiny Met-tRNA za vzniku peptidové vazby, přičemž esterová vazba mezi
30
aminokyselinou a tRNA se rozštěpí. Vznikne peptidy tRNA, tzn. že peptidy je přenesen z předcházející tRNA na – NH2 skupinu následující aa~tRNA. Řetězec se prodlouží o jednu aminokyselinu ve směru od N-konce k C-konci. Transferová tRNA rozpojená od aminokyseliny se uvolní a mRNA se posune o jeden kodon (tři nukleotidy). Na volné místo se naváže další aa~tRNA a cyklus se opakuje. mRNA se posune po ribozomu a současně se z něj opačným směrem uvolňuje rostoucí proteinový řetězec. 6. 2. 4. Ukončení translace Překládaná mRNA se postupně posunuje až do dosažení místa terminační sekvence (UAA, UAG a UGA). Tyto terminační sekvence na mRNA jsou rozpoznány proteinovými terminačními faktory (RF1, RF2 a RF3) lokalizovanými na ribozomu a způsobení zastavení translace (hydrolytické uvolnění řetězce od tRNA). Syntéza proteinů je na ribozomech zefektivněna a urychlena tak, že na jednu molekulu mRNA dosedá v určitém odstupu více ribozomů, na nichž probíhá zvlášť tvorba jednoho typu polypeptidu. Tento útvar je označován jako polyribozom. Jednotlivé složky translačního systému mohou vcházet do reakce opakovaně. Vzniklý a uvolněný proteinový řetězec podléhá posttranslačním modifikacím: úpravám štěpením, připojováním dalších chemických skupin nebo je spojován s dalšími proteiny a je transportován do místa svého funkčního určení (BEDNÁŘ, J. a kol., 2006).
31
7. SOUHRN METOD PRO STUDIUM EXPRESE GENETICKÉ INFORMACE NA ÚROVNI STUDIA mRNA Metody, které se zaměřují na analýzu genové exprese na úrovni RNA, se zabývají také studiem transkripce. Můžeme je rozdělit na metody, kterými se stanovuje transkripční aktivita daného genu a dále na metody, analyzující množství určitého transkriptu, jež je přítomen ve vzorku v daném čase. Je nutné si uvědomit, že množství mRNA v buňce není dáno jen výsledkem transkripční aktivity daného genu, ale také stabilitou transkriptu. Silně se transkribující gen může, ale i nemusí vytvářet mnoho transkriptů. V případě, kdy je silně se transkribující gen poskytovatelem velmi nestabilních transkriptů a slabě se přepisující gen vytváří silné a stabilní produkty, může dojít k tomu, že množství transkriptů slabě se přepisujícího genu bude mnohem vyšší, než-li je tomu u aktivněji se přepisujícího genu. Množství proteinového produktu mRNA nemusí být nutně v korelaci s množství mRNA, jelikož translační účinnost může velmi kolísat. Metody pro analýzu exprese genů na úrovni RNA mají široké využití. Dělíme je na metody hybridizační, metody odvozené od PCR na metody ostatní (založené na jiných principech).
7. 1. Hybridizační metody Jedná se nejstarší metody, které nám slouží k detekci specifické mRNA. Vychází se schopnosti mRNA, která se bude hybridizovat se specificky značenými sondami. V podstatě jde o proces, kdy se z jednořetězcových DNA či RNA vytváří dvouřetězcové molekuly, a to za předpokladu, že jejich sekvence vykazují úplnou či alespoň částečnou komplementaritu. V případě tohoto postupu tedy neprovádíme amplifikaci příslušné nukleové kyseliny vůči jejímu množství, které předpokládáme, nýbrž používáme specifické fragmenty nukleové kyseliny (sondy), jež jsou vázány na cílovoi sekvenci. Značené jednořetězcové sekvence RNA či DNA jsou vlastně hybridizační sondy. K označování se nejčastěji používají radioaktivní izotopy jódu, síry, vodíku nebo fosforu. Jelikož je signálem radioaktivní záření, můžeme je detekovat
32
autoradiograficky.
U
neradioaktivního
značení
sondy
přímo
označujeme
fluorescenčními barvivy (signál lze pozorovat ihned po hybridizaci s takto označenou sondou) nebo do sekvence sondy začleňujeme chemicky modifikované nukleotidy, nesoucí molekulu biotinu či digoxigeninu vázanou na dUTP (deoxyuridintrifosfát), jež se váže místo thyminu. Detekovat sondu tak lze specifickou protilátkou, která je konjugována s enzymy nebo fluorescenčními barvivy (fluorochromy). Enzymatickou reakcí (změna barvy substrátu, změna rozpustnosti, emise světla) můžeme pak detekovat množství navázané sekundární protilátky. Obvykle sondy představují sekvence genů příbuzných organismů, uměle syntetizované oligonukleotidy či sekvence genové DNA nebo cDNA, která je klonována ve vektoru, a nebo amplifikovaná pomoí PCR. Hybridizační metody provádíme v roztocích, na membráně, na filtrech, v gelu, na čipech a in situ na mikroskopických preparátech. Postupy se ale u každé z jednotlivých metod trochu liší.
7. 1. 1. Southernova hybridizace Slouží k přenesení molekul DNA z gelu na membránu, ke které je pak lze různými způsoby přichytit. Jde o velmi jednoduchý postup, používající kapilárního vzlínání tzv. přenosového pufru. Membrána je přiložena na horní plochu gelu, dolní plocha gelu je prostřednictvím houby nebo jiného savého materiálu spojena se zásobníkem přenosového pufru. Horní plocha membrány je poté pokryta větším množstvím buničité vaty nebo jiného savého materiálu. Pro lepší kontakt všech vrstev je soustava přiměřeně zatížena závažím. Přenosový pufr vzlíná kapilární silou nahoru přes houbu, gel a membránu do buničité vaty. Přitom vymývá z gelu molekuly DNA a přenáší je na membránu. Ta je pro molekuly DNA nepropustná, takže tyto ulpí na dolní ploše membrány, přiléhající ke gelu, v přesně stejných polohách, v jakých se nacházely v gelu po roztřídění gelovou elektroforézou.
Přenosový pufr obsahuje chemikálie, které narušují stabilitu vodíkových můstků v molekule DNA, takže dochází k její denaturaci (tzv. denaturační pufr). DNA je proto během přenosu denaturována (je jednovláknová) a připravená k hybridizaci se sondou. Přenos podle Southerna (Southernův přenos, angl. „Southern“ blot) byl nazván podle výzkumníka, který ho vyvinul. Postup byl později
33
upraven pro přenos molekul RNA a jako slovní hříčka nazván „Northern blot“. Analogický postup pro přenos bílkovin z gelu byl nazván westernový přenos a dle staré anektody pracují na vývoji Eastern blotu intenzivně na přísně tajném místě ruští vědci (SOUTHERN, 2009).
Přichycení nukleové kyseliny na membránu K přichycení nukleových kyselin se nejčastěji používají nitrocelulózové nebo nylonové membrány. Nevýhodou nitrocelulózy je její lámavost, takže se s ní musí pracovat opatrně a není vhodná pro dlouhé příp. opakované hybridizace. Navíc neváže účinně fragmenty DNA menší než cca 500 párů bází. Nukleové kyseliny lze k nitrocelulóze přichytit velmi jednoduše tzv. "vypékáním" - při vyšší teplotě se molekuly na membránu přichytí poměrně pevnými, i když nekovalentními vazbami. Výhodou nylonové membrány je oproti nitrocelulóze téměř neomezená životnost, komerčně dostupné membrány jsou navíc kladně nabité, takže záporně nabité molekuly nukleových kyselin na ně bezprostředně dobře přilnou, i když jsou menší než 500 párů bazí. K nylonové membráně lze navíc nukleové kyseliny přichytit i kovalentně, tzv. cross-linkingem. Působením UV-záření totiž vznikají mezi strukturou nukleové kyseliny a nylonem kovalentní vazby (SOUTHERN, 2009).
7. 1. 2. Northernová hybridizace V současné době již méně používaný northernový přenos je metoda používaná v molekulárně biologickém výzkumu ke studiu genové exprese. Název metodiky pochází (parafrázováním) z podobnosti s provedením tzv. "Southern blot" metodiky, která byla nazvána po biologovi Edwinu Southernovi a užívá se ke studiu DNA. To je hlavní rozdíl, neboť northernový přenos se věnuje, pomocí gelové elektroforézy a detekce hybridizační sondou, analýze RNA. Tato metodika byla vyvinuta Jamesem Alwinem a Georgem Starkem na univerzitě ve Stanfordu. Významným rozdílem v proceduře (ve srovnání se Southern blotem) je přídavek formaldehydu do agarózového gelu, kde funguje jako denaturační činidlo.Naopak stejně jako v Southern blotu, hybridizační sondou může být DNA nebo RNA (MIČUDA, S. a kol., 2006).
34
Odstraněno: 9
Podstatou northernového přenosu je elektroforéza RNA (resp. RT-PCR produktu) v denaturačním agarózovém gelu. Následně je rozdělený vzorek přenesen na membránu - blotován. Principem je kapilární vzlínání tzv. přenosového pufru. Membrána je přiložena na horní plochu gelu, dolní plocha gelu je prostřednictvím houby nebo jiného savého materiálu spojena se zásobníkem přenosového pufru. Horní plocha membrány je poté pokryta větším množstvím buničité vaty nebo jiného savého materiálu. Pro lepší kontakt všech vrstev je soustava přiměřeně zatížena závažím. Přenosový pufr vzlíná kapilární silou ve směru šipek na obrázku nahoru přes houbu, gel a membránu do buničité vaty. Přitom vymývá z gelu molekuly RNA a přenáší je na membránu. Ta je pro molekuly RNA nepropustná, takže tyto ulpí na dolní ploše membrány, přiléhající ke gelu, v přesně stejných polohách, v jakých se nacházely v gelu po roztřídění gelovou elektroforézou. Existuje také zřídka používaná varianta celé procedury známá jako "reverzní northern blot". V této proceduře jsou substrátovou nukleovou kyselinou fragmenty DNA fixované k membráně a sondu tvoří RNA extrahovaná z tkáně a radioaktivně Odstraněno: 9
označená (MIČUDA, S. a kol., 2006).
7. 1. 3. Analýza transkriptu pomocí prodloužení primeru Analýza pomocí S1 nukleázy reprezentuje velmi výkonnou metodu umožňující identifikovat jednak 5´ a 3´ konce transkriptu a jednak hranice mezi exony a introny. Poslední metoda transkripční analýzy, prodloužení primeru (primer extension), není tak účinná, protože identifikuje pouze pouze 5´ konec RNA. Nicméně je také poměrně důležitá a často se ji používá k ověření výsledků analýzy s S1. Prodloužení primeru lze použít jen tehdy, když známe alespoň část sekvence transkriptu. Krátký oligonukleotidový primer se totiž musí k RNA připojit na známém místě, nejlépe do 100 – 200 nukleotidů od 5´ konce transkriptu. Když se primer připojí, prodloužíme jej reverzní transkriptázou, jež kopíruje vlákno RNA, dokud nenarazí na 5´ konec transkriptu. 3´ konec nově syntetizovaného řetězce DNA tedy odpovídá 5´ konci transkriptu. Na sekvenci DNA tento konec lokalizujeme tak, že délku jednovláknové molekuly DNA porovnáme s místem připojení primeru. Odstraněno: ,
(SMITH in BROWN, T. A., 2006).
Odstraněno: C. P., 2001
35
7. 1. 4. Sekvenování RNA Sekvenování RNA obvykle úspěšně provedeme sekvenční analýzou produktu RT-PCR. Existují sice metody přímého sekvenování RNA molekul, ale ty nejsou tak účinné, a navíc před vlastní sekvenační reakcí vyžadují purifikaci RNA. Čisté vzorky virových RNA genomů nebo vysoce abundantních buněčných RNA, jako jsou molekuly ribozomální RNA, sice lze získat, ale purifikace jednotlivé mRNA je velmi náročná. Pokud se nám však podaří správně navrhnout primery pro RT-PCR, kopíruje se pouze jediná, cílová mRNA, a její sekvenci zjistíme sekvenční analýzou produktu RT-PCR (BROWN, T. A., 2006).
7. 1. 5. Test ochrany před účinkem RNázy (RPA) Smyslem tohoto testu je identifikace určité specifické molekuly RNA ze směsi izolované z biologického vzorku. Provádí se v roztoku. Vyizolované molekuly mRNA z buněk se nechají hybridizovat se značenými sondami. Protismyslná RNA se používá jako sonda (v opačné orientaci nekódující RNA) a připravuje se pomocí plazmidových klonovacích vektorů. Příslušný gen se začleňuje mezi dva opačně orientované promotory, na které se váží odlišné RNA polymerázy. Po přidání jedné vzniká ve směru od 5´ ke 3´ terminálu normální kódující RNA sonda, zatímco v opačném směru a za pomoci druhé RNA polymerázy se tvoří protismyslná nekódující RNA sonda. Jsou spolu vzájemně komplementární a mohou hybridizovat (IWASAKI, Y. K. et al., 2006). Sondy se přidají do vzorku molekul mRNA a následuje zpravidla denaturace při 95 °C, trvající obvykle 5 minut. Hybridizace se provádí zhruba 12 hodin při teplotě 48-52 °C. Nespecifické molekuly mRNA zůstanou v jednořetězcové podobě a jsou následně rozloženy RNázou při 37 °C po dobu asi 30 minut. Před účinkem RNázy jsou dvouřetězcové formy chráněny. RNázu je třeba spolu s rozloženými jednořetězci odstranit dříve, než-li budou naneseny na denaturující polyakrylamidový gel. V případě, že výsledek stanovujeme chemiluminiscenčně, je RNA po proběhlé elektroforéze přenesena na nylonovou membránu, která je napuštěna protilátkami, konjugovanými s peroxidázou a zafixována UV zářením. Následně probíhá detekce fragmentů chemiluminoforem. Výsledek může být zviditelněn za použití biotinu či autoradiograficky. V současné době se stále nejvíce využívá radioaktivní značení,
36
ačkoli má nepříznivý vliv na zdraví a zdlouhavou expoziční dobu (MAŘÍKOVÁ, H., 2008). Test ochrany před účinkem RNázy je metoda do značné míry podobná Northern blotu a má oproti němu některé výhody, ale i nevýhody. Může vycházet z celkové buněčné RNA nebo i z částečně degradované RNA a je poměrně citlivá. Tato výhoda se může stát i nevýhodou, poněvadž oproti northernovému přenosu neumožňuje určení velikosti transkriptu. Pohyblivost proužků, které získáme po elektroforéze autoradiograficky, je částečně ovlivněna velikostí sondy. Na druhou stranu je ale příprava sond pracnější než u northernového přenosu. Přes všechny své výhody i nevýhody se tato metoda využívá ke studiu exprese a identifikace určitých specifických genů (pomáhá např. s identifikací genů indukujících tvorbu estrogenu) (MAŘÍKOVÁ, H., 2008).
7. 1. 6. FISH Fluorescenční in situ hybridizace (FISH) slouží k detekci genetických změn u biologického materiálu. Metodou FISH jsou vyšetřovány pacientské vzorky (cytospiny, otisky, krevní nátěry, parafinové řezy) nebo buněčné linie (mitotické preparáty, cytospiny). Parafinové řezy jsou v CP uchovávány ve vyhrazeném prostoru (pořadač skel), nativní preparáty jsou fixací uchovávány v mrazícím boxu ve vyhrazeném zásobníku. Metoda je založena na komplementárním párování vyšetřované DNA a fluorescenčně značené sondy (proby). Sonda může být genová (představující sekvenci vyšetřovaného
genu), chromozomová
neboli
paintingová
(sekvence
celého
chromozomu) či alfasatelitní (obsahuje centromerické nebo telomerické oblasti). Hybridizace vyšetřované DNA a sondy probíhá po předchozí denaturaci teplem či působením roztoků za určených podmínek. Poté nenavázanou sondu odmyjeme a po podbarvení pomocí DAPI roztoku hodnotíme vzorek fluorescenčním mikroskopem. Parafinové řezy je třeba před FISH deparafinizovat (FISH, 2009). Pomocí FISH lze lokalizovat sekvence DNA na roztlakových preparátech, na preparátech připravených nakapáváním izolovaných protoplastů nebo na tříděných frakcích jednotlivých chromozómů z flow cytometru. Materiál, jež použijeme pro přípravu roztlakových a protoplastových preparátů by měl obsahovat dostatečné
37
množství buněk, které se nacházejí v metafázi. Pro daný úsek DNA, který chceme lokalizovat, si připravíme sondy. Sondy připravujeme pomocí PCR se značeným nukleotidem a primery pro daný úsek, většinou tandemovou repetici. Pokud chceme lokalizovat neznámý úsek DNA, např. BAC klon použijeme pro značení nicktranslační kit či random priming. V současné době je komerčně dostupná široká paleta sond pro celé chromozomy či jejich části, centromery i mnohé geny. Jejich pomocí můžeme blíže určit numerické i strukturální změny chromozomů v různých typech buněk a tkání, na chromozomech i v nedělících se buňkách. FISH metoda posunula kupředu cytogenetickou diagnostiku, protože umožnila nahlédnout až na submikroskopickou úroveň chromozomů, tj. zviditelnit malé chromozomální přestavby, jež nejsou viditelné a hodnotitelné v mikroskopu při rutinní cytogenetické analýze. Pomocí FISH metody můžeme odhalit či upřesnit drobné delece, duplikace, translokace, určit původ marker chromozomů a diagnostikovat buněčné linie, které jsou v tkáni či krvi zastoupeny jen v malém procentu (např. malé mozaiky pohlavních chromozomů X a Y u osob a zvířat s poruchami reprodukce) (ANDROGEOS, 2009).
7. 1. 7. Branched DNA assay Branched DNA assay představuje techniku, jež využívá amplifikaci signálu a provádí se na mikrodestičce. Začneme provedením izolace a denaturace nukleové kyseliny (např. z krevní plazmy) a následně hybridizujeme pár komplementárních záchytných hybridizačních sond, které obsahují dva specifické úseky nukleové kyseliny (KERN, D. et al., 1996). Na polystyrenové mikrodestičce dochází k imobilizaci hybridizačních sond. Na další dva odlišné úseky nukleové kyseliny se provádí hybridizace dvou párů komplementárních sond. Takovéto sondy nazýváme extendery, protože mají na svých koncích extenze, jež umožňují, aby se napojil větvený zesilovací multimer (PAVLÍK, E.). Nejdříve napojíme nosič větveného zesilovacího multimeru (PreAmplifier), následně se napojuje větvený zesilovací multimer a konečně oligonukleotidy, které přisedají na multimer a jsou značeny alkalickou fosfatázou. Tímto způsobem můžeme na každou molekulu nukleové kyseliny navázat téměř 3 000 molekul enzymu.
38
V podstatě můžeme průběh branched DNA assay rozdělit na 3 fáze. V první fázi probíhá izolace a denaturace, druhá fáze představuje přidání reagencií a následné simultánní hybridizace.V závěrečné fázi dochází k vymývání nenavázaných reagencií, přidávání substrátu a měření chemiluminiscence. Branched DNA assay lze poměrně přesně kvantifikovat homogenní materiál. Značné může nastat i u agens, neboť se vyznačují relativně velkou mírou sekvenční heterogenity na základě toho, že záchytné sondy i extendery bývají navazovány v párech. Díky tomu detekujeme cílovou nukleovou kyselinu, ačkoli chybí v jednom z úseků komplementarita bazí. Zaznamenáme sice signál, ten je ale slabší (PAVLÍK, E.). Využít branched DNA assay můžeme i pro monitorování účinku antivirové terapie u hepatitidy B a C, u HIV (přesnější ELISA) a cytomegalovirů.
7. 1. 8. DNA mikroarray Tzv. DNA čipy nebo DNA mikroarray (DNA mikrosoubory) jsou dosud nejpozoruhodnějším výsledkem vývoje metod molekulární genetiky. Na nosiči (zpravidla na podložním skle) je naneseno velké množství vzorků (sond) DNA. RNA z testované tkáně se nechá se vzorky hybridizovat a vazba se prokazuje fluorescenčně či radiograficky (POSPÍŠILOVÁ, Š. a kol., 2005). Na podložní sklo se nanesou vzorky jednopramenné DNA (delší cDNA či 25 párů bazí dlouhé oligonukleotidy). cDNA sond lze nanést na sklo až 10 000, oligonukleotidů až 250 000. cDNA sondy jsou na skla nanášeny roboticky ve formě nepatrných teček, každá o velikosti kolem 100µm. Při hledání vhodných oligonukleotických sond se vychází z dat, které získáme při analýze a čtení lidského genomu. Testovaná RNA pochází z tkáně, která byla biopticky odebrána. Vzhledem k tomu, že je tkáň směsí různých druhů buněk, lze u heterogenních vzorků odebrat jen vybrané buňky metodami laserové mikrodissekce. RNA se reverzně transkribuje na cDNA a vzniklá cDNA je označena fluochromem (či radioaktivním izotopem fosforu, zejm. u mikroarray s oligonukleotidy) (SONDY, 2009). Označená cDNA se nechá reagovat se sondami na skle. Pro vyhodnocení používáme snímače, jež jsou založeny na laserovém konfokálním mikroskopu. Obrazy, které získáme, hodnotíme speciálním analytickým softwarem vyhledávajícím
39
pozitivně reagující sondy. Struktura sond je známa, souřadnice každé mikrotečky s cDNA sondou je známa. Výsledky jsou analyzovány statisticky metodami shlukové analýzy a tak je možné sledovat přítomnost a stav genů genů, které kódují nejrůznější celulární struktury (receptory, enzymy, regulátory) a nález korelovat s chorobou, jejím typem a aktivitou (POSPÍŠILOVÁ, Š. a kol., 2005). Jak je uvedeno výše, tradičně se nukleová kyselina vyšetřuje na přítomnost určité sekvence sondou tak, že se vyšetřovaná nukleová kyselina přichytí na pevný podklad a provede se hybridizace s konkrétní sondou, následovaná detekcí sondy. Takto lze vyšetřit přítomnost jedné konkrétní sekvence v každém vyšetřovaném vzorku nukleové kyseliny. Zda je vyšetřovaná nukleová kyselina dobře přichycena k podkladu (membráně), je sice možné postup opakovat, ale efektivita je i tak velmi nízká. DNA čipy fungují na opačném principu – k pevnému podkladu je přichycena jednovláknová sonda, se kterou je možné hybridizovat vzorek nukleové kyseliny. Analogie s počítačovými čipy, ve kterých je na malou plochu směstnáno mnoho prvků mikroprocesoru, je v tom, že lze takto na malou plochu pevného podkladu vedle sebe připevnit různé sondy. DNA čip je tedy zjednodušeně řečeno malá destička, na které je vedle sebe připevněno mnoho sond současně. Když na čip naneseme vzorek vyšetřované DNA, můžeme současně provést mnohonásobné vyšetření s celým souborem různých sond (DNA mikroarrays = DNA mikrosoubory). Systém je vylepšen ještě tím, že speciální vícevrstevná struktura umožňuje odečítat intenzitu vazby vyšetřované nukleové kyseliny na automatizovaných čtečkách (angl. microarray reader). Detekce vazby je relativní a zobrazuje se odlišnou barvou jednotlivých „skvrn“ v místě hybridizace (SONDY, 2009). DNA mikroarray se dnes používají především ke sledování exprese genů, jelikož umožňují velmi elegantně sledovat rozdíly v intenzitě exprese (v množství různých mRNA) při různých funkčních stavech buněk. Budoucnot DNA mikroarray je ale hlavně v lékařské diagnostice, poněvadž by měly umožnit velmi efektivní současné vyšetření přítomnosti různých alel genů (chorobných) v jediném vzorku DNA od pacienta.
40
7. 1. 9. Subtraktivní hybridizace Subtraktivní hybridizace je taková metoda, která se používá hlavně pro tvorbu genových knihoven. Pomocí hybridizace srovnáváme dva vzorky, z nichž jeden obsahuje hledaný transkript a druhý nikoli. Díky této skutečnosti se označují jako tester a driver s tím, že driveru je vždy nadbytek a neobsahuje hledaný transkript. Nevýhodou této metody je, že je potřeba dodat velké množství mRNA, avšak metody kombinující subtraktivní metody s PCR jsou schopny tento nedostatek částečně eliminovat (HUGROUP). Supresivní subtraktivní hybridizace (SSH) je metodou, která je založena na potlačení PCR efektu. Používá se k selektivní amplifikaci cílového cDNA fragmentu a zároveň potlačuje amplifikaci necílové cDNA. Nutné jsou oligonukleotidy, které vytváří cDNA primery, adaptory a PCR primery. Driver ds cDNA je vytvářen dle mRNA ze vzorku tkáně a z cDNA primeru. Driver bude vytvořen z výsledné cDNA, která je rozštěpena restrikčními enzymy. Poté je extrahována fenolem, precipitována ethanolem a rozpuštěna v neionizované H2O. Pro tvorbu testeru je cDNA upravena stejným způsobem. Výsledný tester cDNA je zředěn a zligován s dvěma adaptory pomocí DNA ligázy, v separační ligační reakci probíhající celou noc při teplotě 16 °C. Po zahřátí směsi, na teplotu 70 °C po dobu 5 minut, je ligáza inaktivována (HUGROUP).
7. 2. PCR metody Polymerázová řetězová reakce (dále jen PCR) byla objevena v roce 1985 Kary B. Mullisem, kterému za její objev byla roku 1993 udělena Nobelova cena. Princip Odstraněno: .
PCR je založen na replikaci nukleových kyselin (van GELDER, R. N., 2001). Probíhající enzymatická syntéza nových řetězců vyznačených úseků dvouřetězcové DNA, ve směru 5´ → 3´ za pomoci termostabilní DNA polymerázy, je cyklická a tvoří podstatu PCR. Pár primerů, jež se navazují na protilehlé řetězce nukleové kyseliny a jejichž 3´ konce směřují proti sobě, se užívá k vymezení požadovaných úseků. Abychom mohli primery vytvořit, musíme se řídit mnoha pravidly, mezi které náleží: specifičnost primerů, absence vnitřních sekundárních struktur, délka optimálně 18-25 nukleotidů či absence komplementárních sekvencí
41
v primerech. Hořečnaté ionty přidáváme do reakční směsi jako kofaktor. Rozpustný komplex, vytvořený hořečnatými ionty s jednotlivými nukleotidy, lze rozpoznat pomocí DNA polymerázy (SNUSTAD, P. D. et al, 2009). Za optimální počet cyklů se považuje rozmezí od 25 do 35, během kterých můžeme získat až 250 milionů amplikonů. Vyšší počet cyklů by mohl zvýšit riziko vzniku nespecifických produktů. Musíme si uvědomit, že postačí i jedna molekula cizorodé DNA k tomu, aby došlo ke kontaminaci. Takto bychom dosáhli zisku falešného signálu. Provádění PCR reakcí se uskutečňuje v termocyklech, ve kterých automaticky dochází ke změně teploty pro připojení primerů (53-70 °C) a teploty pro vznik nových řetězců (65-74 °C). Pro denaturaci řetězců se užívá teplota okolo 95 °C. Amplifikují se většinou úseky o velikosti 3-5 kb, ale dnes je již možné, za pomoci nových technik, amplifikovat úseky delší než 20 kb.V reakční směsi prokazujeme amplikony různými způsoby, např. kvantitativním měřením množství produktu v reálném čase, sekvence DNA, stanovením jejich velikosti elektroforézou v agarázovém gelu, hybridizací na DNA čipech či pomocí ELISY. PCR má širokou škálu využití, v medicíně, kriminalistice, archeologii, aplikovaném genetickém výzkumu, ale i v klinické a prenatální diagnostice. Spektrum biologických materiálů, které můžeme pro PCR použít, je velmi široké (krev, kultury mikroorganismů, buňky z tkáňových kultur atd.). Pomocí PCR detekujeme a typizujeme patogeny a nádory, identifikujeme onkogeny, detekujeme Odstraněno: l
mutace v genech, monitorujeme terapii rakoviny (DORIAN, J. et al., 2007).
7. 2. 1. Reverzní transkripce PCR (RT-PCR) Díky této metodě lze použít RNA jako templát pro PCR. Nejdřív pomocí reverzní
transkriptázy
transformujeme
molekulu
RNA
na
jednovláknovou
komplementární DNA (cDNA). Potom teprve přidáme PCR primery a Taq polymerázu a dále pokračujeme, jako by šlo o standardně prováděnou PCR. Některé termostabilní polymerázy syntetizují DNA z předlohy RNA i DNA (znamená to, že současně vykazují aktivitu reverzní transkriptázy i aktivitu DNA polymerázy závislé na DNA), takže všechny kroky RT-PCR probíhají v rámci jedné reakce. Produktem RT-PCR je velké množství dvouvláknových komplementárních kopií DNA (cDNA) RNA templátu, i když pravděpodobně nikoliv celé RNA molekuly, protože místa, na
42
nichž se primery připojují, leží většinou uprostřed transkriptu, a ne na jeho nejvzdálenějších koncích. Pomocí RT-PCR se často zjišťuje, jestli RNA vzorky pocházející z různých tkání obsahují určitý transkript, aby bylo možné zjistit expresi příslušného genu (BROWN, T. A., 2006).
7. 2. 2. Rychlá amplifikace cDNa konců (RACE) Standardní proces RT-PCR poskytuje kopii vnitřního úseku molekuly RNA, ale neposkytuje žádnou informaci o koncích této molekuly. Modifikovaná verze RTPCR se nazývá rychlá amplifikace cDNA konců (rapid amplification of cDNA dnes, RACE), a používá se k identifikaci 5´ a 3´ konců molekul RNA, může být využita k mapování konců transkriptů, stejně jako analýza S1. Existuje několik modifikací RACE metody. Budeme se zabývat tím, jak zmapovat 5´ konec molekuly RNA. V této metodě se využívá primeru, který je specifický pro vnitřní část oblasti molekuly RNA. Primer se připojí k RNA a provede se nejprve první fáze procesu katalyzovaná reverzní transkriptázou, během které se vytvoří jednovláknová cDNA. 3´ konec cDNA koresponduje přesně s 5´ koncem RNA. Nyní použijeme terminální deoxynukleotidyl transferázu k připojení série A nukleotidů k 3´ konci cDNA. Tím se vytvoří místo pro druhý PCR primer, který je plně tvořen T nukleotidy, a proto se připojí k poly(A) převisu vytvořenému terminální transferázou. Nyní začíná standardní PCR, kdy se nejprve jednovláknová cDNA změní na dvouvláknovou molekulu, která se v průběhu pokračování PCR amplifikuje. PCR produkt pak osekvenujeme, a tím zjistíme přesnou polohu startu transkriptu Odstraněno: ,
(FROHMAN et al. in BROWN, T. A., 2006).
Odstraněno: M. A. Odstraněno: a kol., 1988
7. 2. 3. PCR v reálném čase (real – time PCR)
Odstraněno:
PCR v reálném čase (dříve kinetická) je metoda, která je schopna detekce prodůktů PCR ihned po jejich syntéze. Zpočátku byl k detekci využíván ethidium bromid. Později se ale přišlo na to, že lze použít 5´ nukleázovou aktivitu Taq polymerázy. V současnosti se využívají sondy, které využívají přenos energie fluorescenční rezonancí, molekulární majáky, fluorogenní sondy či fluorescenční kyanidová barviva. Existuje více druhů real – time PCR, ale všechny jsou založeny na amplifikačním systému detekce a kvantifikace nukleové kyseliny, jež je značena
43
fluorescenčně. Nejčastější použití real – time PCR se vyskytuje u reverzně transkripční PCR (RT-PCR). Real – time PCR je prováděno v cyklerech. Cyklery mají schopnost cyklicky měnit teplotu a následně detekovat fluorescenci po každém cyklu, který proběhl. V případě, že má nukleová kyselina pouze jeden řetězec, nezaznamenáme na přístroji žádný signál (REAL-TIME PCR). Na základě toho, že se vytvoří dvouřetězec mezi komplementární sondou a templářem, dojde k emisi záření. Celý tento proces se uskutečňuje po amplifikaci. Amplikony poskytují natolik silný signál, jež je přístrojem zachycen a vyhodnocen pouze tehdy, zda-li se produktu vytvoří dostatečné množství. S přibývajícím počtem cyklů bude míra fluorescence narůstat, čímž bude docházet ke kvantifikaci. Za detekční limit považujeme množství, jež můžeme detekovat, a které protlo základní linii. Označení cycle threshold (Ct) představuje cyklus, při němž došlo k detekčnímu limitu. V případě, že je na počátku reakce množství templátu vyšší, budeme potřebovat méně cyklů k tomu, abychom vytvořili detekovatelné množství produktu. Oligonukleotid mající na 5´ konci navázáno fluorogenní barvivo (reportér) a na 3´ konci quencher (tlumení záření emitované reporterem u inaktivní sondy), představuje fluorogenní sondu. Na komplementární úsek nukleové kyseliny s jedním řetězcem se sonda váže. Primer, zajišťující elongaci, se váže na tentýž řetězec nukleové kyseliny, ale na jiný úsek. Postup elongace je veden až k sondě, přičemž dojde k ozáření a energie je předána excitovanou fluorescenční barvou quencheru. Po zreplikování místa s navázanou sondou dojde k odštěpení reportéra a následně quencheru. Takto se reportér z vlivu quencheru vymaní a záření je reportérem emitováno do okolí. Množství signálu je úměrné množství produktu, jež se vytvoří. Začneme izolací RNA z kultury buněčné. Dále RNA denaturujeme přibližně 5 minut při 80 °C, pak teplotu snížíme o 20 °C a po dalších 5 minut je přidáván protismyslný primer, primer pro interní kontrolu a značené sondy. Primery vytváříme počítačovými programy, které na základě zadaných parametrů vyhodnotí primer, jež bude nejvhodnější. Pro vytvoření vazeb mezi mRNA a primery je důležitá inkubace, trvající přibližně 5-6 minut. Poté směs ochladíme a po přidání reakčních činidel (pufr, RNA inhibitor, hořečnaté ionty, reverzní transkriptáza, nukleotidy) je zahájena reverzní transkripce. Při teplotě kolem 50 °C tato reakce probíhá 30-35 minut. Po zvýšení teploty na 95 °C dojde k inaktivaci transkriptázy a uložení roztoku na led, než
44
bude zahájena amplifikace. Kontrolní syntézou provozního genu si ověříme správnost průběhu izolace a reverzní transkripce (REAL-TIME PCR). Následně přidáme potřebné reakční složky a amplifikujeme užitím klasické PCR. Abychom ověřili, že se dimery netvoří, musíme roztok inkubovat při 50 °C po dobu 2-3 minut. DNA polymeráza je aktivována před amplifikací tak, že směs budeme zahřívat na 95 °C po dobu 10 minut. Pak proběhne nanejvýš 40 cyklů, u nichž je pro denaturaci nutná teplota 95 °C v délce trvání 15 sekund a na připojení primeru a vznik nových řetězců teplota 60 °C na dobu 1 minuty. Poslední krok představuje detekování a kvantifikování fluorescenčního signálu. Kvantifikace, při níž stanovujeme přesný počet kopií daného genu, může být absolutní. Pro absolutní kvantifikaci musíme pro každou analýzu naměřit kalibrační křivku, z níž je pak odečteno přesné množství templátu. Dalším typem je kvantifikace relativní, popisující relativní změnu exprese k expresi cílového genu, k tzv. housekeeping genu. Hladina housekeeping genu je za daných podmínek experimentu konstantní. Přesné srovnání koncentrace templátu v každém ze vzorku je poskytnuto právě relativní kvantifikací. Amplifikace následuje ihned po inkubaci s primery a sondou v případě, že pracujeme s DNA (REAL-TIME PCR). Real – time PCR se používá i v medicíně, pro svůj jednodušší postup a lepší výsledky často nahrazuje RT-PCR.
7. 2. 4. Diferenciální display (DD) Diferenciální display je metodou odvozenou od PCR, kterou srovnáváme dvě populace cDNA. Diferenciální display pracuje systémem amplifikace 3´ poly (A) terminální části mRNA. Nejprve se reverzní transkripcí převede izolovaná sekvence mRNA na cDNA a následně se amplifikuje. Jak revezní transkripce, tak i amplifikace jsou prováděny s primery, které jsou stejné. Na denaturujícím polyakrylamidovém gelu provádíme inkubaci výsledných produktů se značenými sondami a jejich vizualizaci autoradiograficky (IKEMATSU, K. et al.,2007). Následně jsou z gelu izolovány PCR fragmenty, které reamplifikujeme. Výsledné klony cDNA, které jsme získali po reamplifikaci, můžeme potvrdit Northern blotem, po němž následuje sekvencování. Po sekvenaci je třeba výsledné fragmenty identifikovat GenBank databází. Dnes se využívají spíše fluorescenčně značené sondy a potvrzovaní Northern blot je nahrazován kompetitivní RT-PCR. Jeden z primerů je vázán vždy na
45
náhodné místo mRNA a druhý specificky rozeznává poly (A) terminál (GENHUNTER). Po provedení polymerázové řetězové reakce za stejných podmínek, v obou populacích cDNA, jsme schopni na denaturujícím polyakrylamidovém gelu získat po elektroforéze takové druhy cDNA, jež se vyskytují u obou vzorků v různé míře. Gen lze identifikovat pomocí genové knihovny v případě, že dojdeme k výsledku zatím nepopsané sekvence. Takovéto druhy cDNA se ve vzorku vyskytují náhodně, tudíž jejich výskyt vyplývá ze stupně příbuznosti její sekvence se sekvencí primerů. Proto pracujeme s různými s různými kombinacemi velkého množství primerů a není velmi pravděpodobné, že by tato analýza byla schopna poskytnout úplný seznam genů, diferenciálně exprimovaných (GENHUNTER).
7. 2. 5. PCR array Pomocí PCR array můžeme provádět analýzu exprese více genů najednou. Metoda vznikla vlastně kombinací kvantitativní real – time PCR a mikroarray. Amplifikace 80 či 370 odlišných, genově specifických fragmentů bez přítomnosti sekundárních produktů, může být umožněna velmi vysokou kvalitou primerů a ostatních složek. Na množství celkové RNA není PCR array nijak náročná, postačuje jí jen 5-25 ng celkové RNA. Tato nadměrná citlivost, specifita a reprodukovatelnost mnoha fragmentů vyžaduje co nejpřesnější vyhodnocení pomocí real – time PCR. Abychom mohli RNA izolovat, připravíme si experimentální vzorek. Z RNA vzorku pomocí reverzní transkripce vytvoříme cDNA. PCR Master Mix, s obsahem primeru (SYBR Green) a barviva, přidáme k cDNA. Vzniklou směs naneseme na mikrodestičky a provedeme daný počet terminálních cyklů, jako hraniční počet se uvažuje 35. Každý důlek mikrodestičky obsahuje genově specifický primer. Stejně jako real – time PCR, tak i PCR array zaznamenává změny koncentrací amplikonů. Data jsou vyhodnocována specializovaným softwarem. Nedílnou součástí reakce je detekce případné kontaminace genomové DNA, kontrola kvality RNA z analyzovaného vzorku, reverzně transkripční kontrola, pozitivní kontrola všech elementů pro správnou normalizaci dat a správné provedení reakce (SNUSTAD, D. P. et al., 2009).
46
7. 3. Ostatní metody 7. 3. 1. Sériová analýza genové exprese (SAGE) Sériová analýza genové exprese byla vyvinuta proto, abychom mohli provést kvantitativní a simultánní analýzu rozsáhlých počtů transkriptů. Metodou SAGE můžeme také srovnat genové exprese normálních, diferencujících se, ale i poškozených buněčných linií. Odlišnosti v expresi genů, pouze u dvou typů buněk, mohou srovnávat techniky založené na cDNA (DD, subtraktivní hybridizace). Naopak techniky, které využívají RNA (test ochrany před účinkem RNázy, RT-PCR), mohou srovnat i více populací, avšak jejich počet je omezen. Srovnání tisíců transkriptů umožňuje právě SAGE (ŠMARDA, J. a kol., 2005). SAGE vychází ze dvou principů, jež si stručně shrneme. V prvním principu bývají využívány krátké nukleotidové značené sekvence (9-10 párů bazí), které obsahují dostatečnou informaci o tom, abychom mohli identifikovat transkript. Značené sekvence také zajišťují izolaci tohoto transkriptu ze stanovené pozice, jež má transkript
uvnitř. 4-9 transkriptů, které tvoří náhodné kombinace nukleotidů ve
značeném místě, může být rozlišováno sekvencí o délce 9 párů bazí. Druhý princip, řetězením krátkých a značených sekvencí umožní účinnou analýzu tak, že budeme sekvenovat mnohonásobně značené transkripty, jež se nachází uvnitř jednoho klonu (KOČÁREK, E., 2005). Z mRNA vzniká dvouřetězcová cDNA, která je rozštěpena restrikčními endonukleázami (tzv. kotvící enzymy). Pomocí restrikčních endonukleáz jsme schopni rozpoznat specifické nukleotidové sekvence, jejichž délka čítá čtyři páry bazí. Dále provedeme imobilizaci na streptavidinu na poly (A) 3´terminálu. Po imobilizaci se cDNA rozštěpí na dvě skupiny a restrikční místo restrikční endonukleázy je doplněno ligací. Následně dochází k tomu, že je štěpena další endonukleáza, oddělena od streptavidinu a tyto konce se spojí v jeden řetězec. Za tepmlát, sloužící pro PCR se specifickými primery na obou koncích, považujeme vzniklý výsledný řetězec. Sekvence ligačního linkeru zde slouží jako primery. Ligační linker se však ve výsledných klonech neobjeví. Ve výsledných amplifikačních produktech nalezneme dvě odlišné sekvence, které jsou svými konci vzájemně spojeny. Tyto úseky jsou ohraničeny místy pro kotvící enzym.
47
Tímto způsobem vznikne konkatemer obsahující mnoho klonů, jež mají odlišné spojené sekvence. Dostatečné izolace dvou sekvencí dosáhneme právě konkatemerem s kotvícím enzymem. Dvě sekvence jsou takto lépe a přesněji štěpeny. Eliminaci potenciální deformace způsobenou PCR (např. tvorba duplexů mezi stejnými dvěma sekvencemi), zajišťuje analýza dvou sekvencí, jež byly vytvořeny před amplifikací (SNUSTAD, D. P. et al., 2009).
7. 3. 2. Reportérské geny Reportérskými geny, využívanými při identifikaci promotorových regulačních elementů a proteinů vážících DNA, při tvorbě transgenních organismů a při analýze transkripčních
faktorů,
jsme
schopni
při
studiu
buněčné
diferenciace
v mnohobuněčném organismu zjistit, ve kterých buňkách či tkáních probíhá za daných podmínek exprese sledovaných genů. Reportérské geny lze využít i pro studium úrovně transkripce vybraných genů v buňkách či tkáních, které jsou vystaveny daným podmínkám. Pokud by však byla exprese určitého genu pouze přechodně aktivována, detekce mRNA by probíhala obtížně. Tímto se dostáváme k využití takových reportérských genů, které jsou v těchto podmínkách stabilnější a mohou určit, kdy exprese začala. Z technologie rekombinantní DNA vychází tvorba reportérských genů, jelikož je cílem tvorba takového reportérského genu, ve kterém je sekvence DNA, pocházející z promotorové oblasti určitého genu, uměle spojena s jiným genem (NUSSBAUM, R. L., 2004). Tento gen velmi snadno kóduje detekovatelný produkt – reportér. Mezi nejčastěji používané reportéry patří beta-glukuronidáza, zelený fluorescenční protein (GFP - přirozeně fluoreskuje), beta-galaktozidáza a luciferáza. Výhodou GFP je to, že jím můžeme provést detekci exprese reportérského genu snadněji v živém zvířeti, než-li ve fixovaném preparátu. Mezi další výhody GFP patří: lokalizace proteinů, buněčná identifikace, vizualizace buněčných a fyziologických procesů a používá se i při detekci cis regulačních oblastí. Míru exprese genu, jehož promotorové sekvence jsou reportérskému genu nadřazeny, odvodíme právě dle míry exprese reportérského genu. Aktivitu studovaného genu můžeme odhadnout na základě množství produktu reportérského genu. Reportérské geny můžeme využít k lokalizaci sekvence, které jsou nutné pro aktivitu promotoru a také pro studium regulačních funkcí oblastí DNA, které jsou 48
umístěny proti směru transkripce od promotoru. Abychom mohli identifikovat promotor daného genu, musíme klonovat fragmenty DNA před místem počátku transkripce do vektoru, který nese reportérský gen, ale nikoliv promotor (SNUSTAD, D. P. et al., 2009).
7. 3. 3. Test prodlužování primerů (PEA) Testem prodlužování primerů (primer extension assay, PEA) jsme schopni zjistit, kde přesně exprese genu začíná a kde končí. Analýza 3´ konce eukaryotických molekul mRNA vesměs není problematická, a to především proto, protože se na poly (A) úseky mRNA, jež jsou vždy pro syntézu cDNA využity, vážou oligo (dT) primery používané k syntéze cDNA. Zpětná transkripce obvykle neprobíhá až na 5´ konec templátu mRNA, a proto 5´ konce nebývají přepsány do cDNA. Částečná degradace templátu či přítomnost sekundárních struktur a proteinů, které váží RNA, způsobují zástavu zpětné transkripce a to je důvod, proč zpětná transkripce neprobíhá až na 5´ konec templátu mRNA. Test prodlužování primerů, jež používáme k přesnému mapování 5´ konců mRNA, za nás tento problém vyřeší. Pro PEA používáme vzorky tkání či suspenze buněk, o nichž víme, že daný gen exprimují, a že se z nich izoluje mRNA. Nejdříve musíme převést směs různých mRNA na cDNA a vzniklé produkty následně imobilizovat. Ve směru k 5´ konci mRNA, po smíchání s radioaktivně značenými oligonukleotidy majícími funkci primerů, probíhá reverzní transkripce do cDNA. Primer o velikosti od 20 do 40 nukleotidů můžeme považovat za ideální primer. Se studovanými transkripty primery specificky hybridizují a také jsou k oblasti v blízkosti 5´ konce hledané sekvence komplementární. Produkty PEA by neměly být delší než 500 nukleotidů, jelikož ideální vzdálenost od 5´ konce činí zhruba 150 nukleotidů. Denaturující polyakrylamidový gel, na nějž se v paralelních drahách nanáší také ostatní produkty sekvenčních reakcí stejného genu, vycházející ze stejného primeru, slouží k analýze velikosti syntetizovaného radioaktivního produktu (ŠMARDA, J. a kol., 2005). Polynukleotid kinázu mají jako sondu T4 navázanou radioaktivně značené primery. K označení primerů můžeme použít i fluorescenční barviva, analýzu provádíme automatickým sekvencováním či luminiscencí. Správný začátek nemají produkty vyznačující se velmi slabým signálem. Podmínkou vzniku pyrofosfátů, jakožto výsledku specifické aktivity DNA polymerázy, je rychlá a tedy i správná 49
tvorba nového řetězce. Na ATP, jež je detekován luciferinem, konvertují pyrofosfáty. Tímto způsobem můžeme identifikovat počátek transkripce, a to dokonce s přesností na 1 nukleotid (SNUSTAD, D. P. et al, 2009). Množství primeru a analyzované RNA, teplota pro prodlužování primerů a hybridizaci představují nejdůležitější parametry, které bychom měli optimalizovat. Přítomné množství analyzované RNA by mělo být vždy nižší než koncentrace primerů. Množství RNA určíme dle toho, zda použijeme poly (A+) RNA či celkovou RNA, které je vždy více potřeba.
7. 3. 4. Celogenomové sekvenování RNA Mezi nejnovější metody studia exprese patří přístupy založené na nové generaci sekvenování („next generation sequencing“ - NSG) využívajících přístroje na celogenomové sekvenování. Tímto přístupem je možné analyzovat kvalitativně i kvantitativně prakticky celý transkriptom digitální cestou. Předpokládá se, že tato metoda bude v nejbližší době velmi perspektivní alternativou k microarray. Metoda se označuje též jako celogenomové sekvenování RNA (RNA-Seq) (WANG et al., 2009) a nebo někdy též „digitální genová exprese“. Méně nákladná je modifikace, při které se sekvenují jen 3´konce transkriptů u (tzv. 3´SAGE).
50
Odstraněno: Wang
8. SOUHRN METOD PRO STUDIUM EXPRESE GENETICKÉ INFORMACE NA ÚROVNI STUDIA VZNIKAJÍCÍCH PROTEINŮ Identifikace vazebných míst pro proteiny na molekule DNA Řídící sekvence je oblast DNA, ke které se váže regulační protein. Řídící sekvence nacházející se v přední části genu bychom tedy měli identifikovat tak, že budeme hledat náležitou oblast pro vazebná místa proteinu.
8. 1. Gelová retardace komplexů DNA-protein Proteiny jsou poměrně velké struktury, a když se nějaký naváže na molekulu DNA, podstatně se zvětší celková molekulová hmotnost. Pokud se nám podaří nárůst detekovat, identifikovali jsme tím DNA fragment obsahující vazebné místo pro protein. V praxi se DNA fragment nesoucí navázaný protein identifikuje pomocí gelové elektroforézy, protože je méně pohyblivý než molekula DNA bez proteinu. Tato metoda se nazývá gelová retardace (zpožďování). Při gelovém zpožďování rozštěpíme 5´ oblast DNA zkoumaného genu restrikční endonukleázou a smícháme s regulačním proteinem a nebo – pokud jsme zatím relevantní protein neizolovali – s nefrakcionovaným extraktem jaderného proteinu (regulace genu probíhá v jádře). Restrikční fragment obsahující řídicí sekvenci vytváří s regulačním proteinem komplex a ostatní fragmenty setrvávají jako tzv. „obnažená“ DNA. Řídící sekvenci lokalizujeme tak, že na restrikční mapě najdeme polohu fragmentu, jež je během gelové elektroforézy retardován. Přesnost, s jakou budeme schopni řídicí sekvenci lokalizovat, bude záviset na tom, jak podrobnou restrikční mapu budeme mít k dispozici, a na tom, jak budou restrikční místa rozložena. Jedna kontrolní sekvence může být i kratší než 10 bp, takže gelová retardace ji de facto nemůže zjistit úplně přesně. K tomu, abychom v rámci fragmentu identifikovaného gelovou retardací vymezili pozici řídící sekvence, musíme použít Odstraněno: ,
přesnější techniky (FRIED et al. in BROWN, T. A., 2006).
Odstraněno: M. Odstraněno: a kol., Odstraněno: 1981
51
8. 2. „Footprinting“ pomocí DNázy I Metoda známá jako „footprinting“ umožňuje stanovit umístění řídicí oblasti v rámci restrikčního fragmentu, který jsme identifikovali pomocí gelové retardace. Tato metoda funguje na bázi toho, že interakce DNA s regulačním proteinem chrání DNA oblast řídící sekvence před degradačním působením endonukleázy, např. deoxyribonukleázy (DNázy) I. Vazebné místo pro protein na molekule DNA tedy najdeme právě díky tomuto úkazu. Zkoumaný fragment DNA nejprve na jednom konci označíme radioaktivním markerem a potom spojíme s regulačním proteinem. Přidáme DNázu I, ale jen v omezeném množství, aby nedošlo k úplné degradaci DNA fragmentu, protože cílem je každou molekulu rozstřihnout právě v místě jediné fosfodiesterové vazby. Jestliže na fragmentu DNA není navázaný protein, dostaneme skupinu označených fragmentů, které se budou lišit délkou vždy o jeden nukleotid. Provedeme separaci na polyakrylamidovém gelu a skupina fragmentů se na autoradiogramu ukáže jako škála proužků. Pokud však na fragmentu DNA je navázaný protein, některé fosfodiesterové vazby před štěpením DNázou I ochrání, takže skupina fragmentů nebude úplná, budou ji chybět fragmenty vytvořené štěpením uvnitř řídící sekvence. Jejich absence se na autoradiogramu objeví jako „footprint“ (stopa). Oblast molekuly DNA s řídící sekvencí zjistíme podle velikosti Odstraněno: , D. J.
fragmentů po obou stranách „footprintu“ (GALAS et al. in BROWN, T. A., 2006).
Odstraněno: a kol., Odstraněno: 1978,
8. 3. Test modifikované interference Obě výše uvedené metody, gelové zpožďování a „footprinting“, umožňují lokalizaci řídící sekvence, ale neposkytují informaci o interakci mezi vazebným proteinem a DNA molekulou. „Footprinting“, jenž je přesnější, ukáže nanejvýš DNA oblast chráněnou navázaným proteinem. Ve srovnání s dvoušroubovicí DNA jsou proteiny poměrně velké, a když se navážou na řídící sekvenci čítající pouze několik párů bazí, chrání až několik desítek párů bazí. Proto tedy „footprinting“ nezjistí vlastní řídící oblast, ale jen úsek, ve kterém se tato oblast nachází. Nukleotidy, které jsou s navázaným proteinem spojené, identifikujeme pomocí testu modifikované interference (modification interference assay). Tak jako při vytváření otisků musíme fragmenty DNA na jednom konci označit. Aplikujeme 52
látku, která určité nukleotidy modifikuje, např. dimetylsulfát, který metyluje guaniny. Podmínky, za kterých modifikace probíhá, zabrání tomu, aby se modifikoval víc než v průměru jeden nukleotid na každý DNA fragment. S tímto proteinovým extraktem smícháme DNA. Test předpokládá, že se vazebný protein k DNA pravděpodobně nenaváže, bude-li uvnitř řídící oblasti některý guanin modifikovaný, protože metylace nukleotidu blokuje specifickou vazbu s proteinem. Jak můžeme absenci proteinové vazby monitorovat? Při elektroforetické analýze směsi DNA a proteinu na agarózovém gelu se objeví dva pruhy, jeden obsahuje DNA-proteinový komplex a druhý obsahuje DNA bez navázaného
proteinu – v této části procedury se v podstatě jedná o test gelové
retardace. Z gelu izolujeme pruh nenavázané DNA a působíme piperidinem, tj. chemikálií štěpící DNA molekulu v místě metylovaných nukleotidů. Produkty piperidinové manipulace separujeme na polyakrylamidovém gelu a výsledky autoradiograficky vizualizujeme. Velikost proužku, resp. proužků, které se objeví na autoradiogramu, odpovídají pozici guaninů na DNA fragmentu, jejichž metylace zabránila vazbě proteinu. Tyto guaniny leží uvnitř kontrolní sekvence. Přesnou pozici řídící sekvence zjistíme tak, že modifikační test zopakujeme s chemikáliemi zacílenými na nukleotidy A, T nebo C (HENDRICKSON et al. in BROWN, T. A., 2006).
8. 4. Identifikace kontrolní sekvence pomocí deleční analýzy Gelové zpožďování, „footprinting“ a test modifikované interference sice lokalizují pravděpodobně řídící sekvence v přední části genu, ale o funkci jednotlivých sekvencí už informace neposkytují. Zcela odlišný přístup představuje deleční analýza, která nejenže řídící sekvence lokalizuje (ačkoli jen s přesností odpovídající gelové retardaci), ale v prvé řadě indikuje jejich funkce. Metoda je založena na předpokladu, že delece řídící sekvence povede ke změně regulace exprese klonovaného genu. Tak například delecí sekvence, která genovou expresi potlačuje, by se měla exprese daného genu zvýšit. Podobně identifikujeme kontrolní sekvence specifické pro určité tkáně, protože delece těchto sekvencí povede k expresi daného genu v jiných tkáních, než je obvyklé.
53
Odstraněno: , W. a kol., Odstraněno: 1985
8. 4. 1. Provedení deleční analýzy Pokud jsme signální zvolili správně a vytvořili nezbytný konstrukt, je provedení samotné deleční analýzy snadné. Delece můžeme v přední oblasti konstruktu provést v podstatě kteroukoli z několika strategií. Účinek delece analyzujeme tak, že konstrukt s delecí klonujeme do hostitelského organismu a zjistíme způsob a sílu exprese signálního genu. Zvýšená exprese implikuje odstranění sekvence, která expresi snižuje nebo ji tlumí. Snížená exprese potom indikuje odnětí aktivátoru nebo zesilovače a změna tkáňové specifičnosti povede k identifikaci řídící sekvence citlivé na specifickou tkáň. Výsledky deleční analýzy musíme velmi pozorně interpretovat. Komplikace nastávají, když jednoduchá delece odejme dvě těsně spojené řídící sekvence, a nebo, což je poměrně běžné, dvě odlišné řídící sekvence spolupůsobí na jednu reakci. Deleční analýza v současnosti se studiem proteinových vazebných míst i přes tyto možné komplikace poskytuje důležité informace o regulaci exprese individuálních genů a doplňuje a rozšiřuje genetickou analýzu diferenciace a vývoje, postavenou na širších základech.
8. 5. Identifikace a studium translačního produktu klonovaného genu V posledních několika letech se klonování genů stále častěji používá nejen při studiu genů samotných, ale také při studiu proteinů kódovaných klonovanými geny. Výzkumy zabývající se strukturou bílkovin a jejich funkcemi významně těžily z technik umožňujících vnášení mutací do určitých míst klonovaného genu a vedoucích k řízeným změnám struktury kódovaného proteinu. Než se zaměříme na samotné postupy, měli bychom se věnovat mnohem prozaičtějšímu problému, a tím je izolace proteinu kódovaného klonovaným genem. V mnoha případech není taková analýza vůbec nutná, protože v okamžiku, kdy přistupujeme ke klonování, je už protein charakterizován a máme k dispozici jeho čisté vzorky. Na druhé straně však existují případy, kdy translační produkt klonovaného genu dosud identifikován nebyl. Tehdy přichází na řadu izolace proteinu (BROWN, T. A., 2006).
54
8. 5. 1. Metody HRT a HART umožňující identifikaci translačního produktu klonovaného genu K identifikaci translačních produktů kódovaných klonovanými geny slouží dvě příbuzné techniky: translace z uvolněného hybridu (hybrid-release translation, HRT) a translace z upoutaného hybridu (hybrid-arrest translation, HART). Obě jsou založeny na schopnosti čisté mRNA řídit syntézu proteinů v bezbuněčných translačních systémech. Jde o buněčné extrakty obvykle připravované z klíčících pšeničných zrn nebo z králičích retikulocytů (jak klíčící zrna, tak retikulocyty jsou při syntéze proteinů vysoce aktivní), které obsahují ribozomy, tRNA a další molekuly potřebné pro syntézu bílkovin. K translačnímu systému přidáme vzorek mRNA spolu se směsí dvaceti aminokyselin nacházejících se v bílkovinách, ale předtím jednu z nich označíme (nejčastěji se užívá
35
S-methionin). Molekuly mRNA jsou
překládány do směsi radioaktivních bílkovin, které pak oddělíme elektroforézou a autoradiograficky zviditelníme. Každý proužek reprezentuje jeden protein kódovaný jednou molekulou mRNA. Metody HRT a HART jsou nejúčinnější tehdy, pokud byl studovaný gen získán jako klon cDNA. V případě HRT cDNA denaturujeme, imobilizujeme na nitrocelulózové či nylonové membráně a inkubujeme se vzorkem celkové mRNA. Molekula mRNA hybridizuje se specifickým protějškem z cDNA a zůstává přichycena k membráně. Po vyřazení nenavázaných molekul je hybridizovaná mRNA shromážděna a přeložena v bezbuněčném translačním systému. Tak získáme čistý vzorek proteinu kódovaného cDNA. Translace z upoutaného hybridu se liší tím, že se denaturovaná cDNA přidává přímo ke vzorku mRNA. Opět dochází k hybridizaci mezi cDNA a jejím mRNA protějškem, ale v tomto případě nejsou nenavázané molekuly mRNA odstraněny a celý vzorek je přeložen v translačním systému mimo buňku. Hybridizovaná mRNA nemůže řídit translaci, a tak dojde k syntéze všech proteinů s výjimkou proteinu kódovaného klonovaným genem. Translačním produktem klonovaného genu potom bude protein, který na autoradiogramu chybí.
55
8. 5. 2. Analýza proteinů pomocí mutageneze in vitro HRT a HART sice translační produkt klonovaného genu identifikují, ale o samotných proteinech nám nesdělují prakticky nic. Otázky molekulární biologie se dnes soustředí především na vztah mezi strukturou proteinu a jeho aktivitou. S těmito otázkami se nejlépe vyrovnáme tak, že v genu, který daný protein kóduje, indukujeme mutaci a potom zjistíme, jak změna pořadí aminokyselin účinkuje na vlastnosti translačního produktu. Za běžných okolností se mutace vyskytují nahodile a často se stává, že k tomu, abychom nalezli tu pravou, která nám poskytne potřebnou informaci, jich musíme prověřit velké množství. Řešení tohoto problému nabízí mutageneze in vitro, technika, která umožňuje provádět řízené mutace ve specifických místech klonovaného genu (BROWN, T. A., 2006).
8. 5. 3. Westernová hybridizace (Western blot) Westernová hybridizace je technika na bázi elektroforézy a enzymatické reakce, hojně využívaná v imunologii, molekulární biologii a medicíně k detekci specifických protilátek. Touto metodou se v praxi diagnostikuje řada infekčních onemocnění člověka a zvířat. Oproti běžným sérologickým metodám jako je ELISA, je Western blot sice časově náročnější a dražší, ale za to přesnější (větší specifičnost). 8. 5. 3. 1. Elektroforéza Vlastnímu Western blotu předchází elektroforéza, nejčastěji SDS-PAGE (elektroforéza na polyakrylamidovém gelu v přítomnosti SDS). Vzorek může obsahovat buď přímo směs proteinů a nebo se může jednat o vzorek tkáně či buněčné kultury – v těchto dvou případech musíme „rozmixovat“ tyto velké části před tím, než je naneseme na gel (buď homogenizérem, sonifikací či jiným způsobem). Tyto vzorky se pak označují jako lyzáty (vznikly lýzou buněk a přitom se uvolnily proteiny). Je dobré přidat do lyzační směsi inhibitory proteze, protože jinak by hrozilo nebezpečí, že lýzou uvolněné proteasy by naši XXasu rozcupovaly ještě před elektroforézou.
56
8. 5. 3. 2. Blotování Protože práce s gelem je dosti nepříjemná, je nutné proteiny přenést (přeblotovat) na membránu - nejčastěji na nitrocelulosovou, popř. na PVDFmembránu. Přístroj ("blotátor") je realizován jako soustavy anoda (spodní díl) a katody (horní díl = víko). Na anodu se položí papír namočený do pufru (vlhkost je nutná, jinak by se gel a membrána spálila díky průchodu el. proudu), na papír membrána, pak gel a nakonec zase namočený papír. Vznikne nám hezký sendvič a po zaklapnutí víkem a spuštění musíme doufat, že záporně nabité proteiny se účinkem el. pole přenesou z gelu na membránu umístěnou pod gelem (přitahuje je kladně nabitá anoda tvořící dno přístroje) (TOMAN, M. a kol., 2000). 8. 5. 3. 3. Reakce proteinů s protilátkou Po přenosu proteinů na membránu můžeme pracovat dále - nejdříve se membrána nechá inkubovat s něčím, co blokuje nespecifické navázaní protilátky na membránu. Např. při použití BSA obsadí molekuly BSA všechna místa na membráně, kam se nepřenesly proteiny při přenosu a kam by se potenciálně mohla vázat primární protilátka nespecifickou interakcí s membránou. Poté se přidá primární protilátka, tj. protilátka proti našemu proteinu, která s našim proteinem specificky interaguje. Opět necháme spolu inkubovat. Po promytí se přidá sekundární protilátka, tj. protilátka proti oné primární protilátce. tato sekundární protilátka je nějakým způsobem značena, např. je spojena s křenovou peroxidasou (HRP = horseradish peroxidase), která poté katalyzuje určitou enzymatickou reakci (FERENČÍK, M. a kol., 1981). 8. 5. 3. 4. Vyvolání blotu Spočívá v tom, že ona křenová peroxidasa je použita ve spojení s chemiluminiscenční látkou - produkt reakce (katalýza peroxidasou) vykazuje luminiscenci, která může být detekována použítím fotografického papíru anebo speciální CCD kamery.
57
8. 5. 3. 5. Výsledek Lumiscence
vychází
z
míst,
kde
se
uskutečňuje
přeměna
chemiluminiscenčního činidla. Ta je katalyzována peroxidasou, která je spojena se sekundární látkou, která je navázaná na primární protilátku, která se specificky navázala na náš hledaný protein. Tedy v místě, kde je luminiscence, je i náš protein.
8. 5. 4. ELISA ELISA (z angl. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), někdy také označovaná jako EIA (Enzyme Immunoassay) je jednou z nejpoužívanějších imunologických metod sloužících k detekci protilátek. Metoda funguje na bázi imunoenzymatické reakce a lze s ní rovněž detekovat i antigen. ELISA využívá dvou základních vlastností imunoglobulinů. Zaprvé je to schopnost proteinů (tedy imunoglobulinů) vázat se na povrch umělých hmot (např. polystyrenu) a v druhé řadě pak schopnost vázat enzymy na Fc fragmenty (krystalizující fragment, tzv. Fc fragment) imunoglobulinových molekul. Tyto Fc fragmenty imunoglobulinů se váží na Fc receptory na leukocytech (ELISA, 2009).
a)
Nepřímá kompetitivní ELISA
Princip této metody je založen na tom, že antigen zakotvený na pevný nosič soutěží se stanovovaným antigenem ve vzorku o omezený počet vazebných míst na molekulách protilátky. Čím více antigenu obsahuje analyzovaný vzorek tím méně protilátky se naváže na zakotvený antigen. Nenavázané složky se odstraní a následně se přidá enzymem značená sekundární protilátka proti navázané protilátce. Konečná detekce je uskutečněna enzymovou reakcí, kdy vzniká barevný produkt. Intenzita zbarvení je měřena spektrofotometricky. Výhodou tohoto stanovení je možnost použití komerčně připravených značených protilátek (např. prasečí IgG proti králičím IgG).
58
b)
Přímá nekompetitivní ELISA – „Sandwich“
Nejčastěji využívané uspořádání enzymové imunoanalýzy na pevné fázi (ELISA) pro stanovení patogenů je přímý nekompetitivní (tzv. „sendvičový“) formát. V prvním kroku jsou na pevnou fázi imobilizovány protilátky. Poté je přidán antigen, který interaguje s navázanými protilátkami. Po odstranění nenavázaných složek následuje aplikace protilátky značené enzymem (nejčastěji peroxidasa, alkalická fosfatasa, b-galaktosidasa a glukosa oxidasa). K detekci je využita enzymová reakce, kdy je bezbarvý substrát přeměněn na barevný.
c)
ELISA na dipsticích
Dipstik je plastová tyčinka vyrobená ze stejného materiálu, který se používá pro výrobu mikrotitračních destiček. Obal dipstiku, jenž zároveň slouží jako mikrozkumavka umožňující dávkování vzorků, konjugátů a průběh reakce, je naopak vyrobena z nesorpčního polypropylenu.
Průběh interakce na dipstik v podstatě odpovídá jedné jamce mikrotitrační destičky, lišící se pouze enzymovou reakcí. Zatímco při ELISA v jamkách mikrotitračních destiček jsou substrát i produkt ve vodě rozpustné látky, v případě dipstik je rozpustný substrát přeměňován na nerozpustný produkt, způsobující barevné
změny
pouze
v místě
imobilizované
protilátky.
Vyhodnocení
je
semikvantitativní, určované podle intenzity zbarvení. Výhody dipstik uspořádání spočívají především v rychlosti a jednoduchosti provedení a ve skutečnosti, že nevyžaduje žádné přístrojové vybavení. Na rozdíl od mikrotitrační destičky je dipstik vhodný pro testování menšího počtu vzorků (ELISA, 2009).
8. 5. 5. SDS-PAGE 8. 5. 5. 1. SDS-elektroforéza Elektroforéza v polyakrylovém gelu s dodecylsulfátem sodným ( SDS ) je další elektroforetický způsob separace na základě velikosti molekul separovaných látek, jehož použití však je vymezeno specielně pro bílkoviny. SDS je anionaktivní detergent, který nese poměrně vysoký náboj, a proto ve vazbě na bílkovinu 59
vyrovnává nábojové rozdíly bílkovin a ty se pohybují v gelu jen podle velikosti. Všechny bílkoviny totiž váží SDS v konstantním poměru, asi 1,4g SDS na 1g bílkoviny, a tím charakteristicky mění svou konformaci. Výsledné komplexy SDSbílkovina pak mají stejnou hodnotu povrchového náboje a jejich konformace se do té míry unifikuje, že relativní molekulová hmotnost bílkoviny odpovídá velikosti jejího komplexu s SDS. Experimentálně byla prokázána přímá úměrnost elektroforetické pohyblivosti komplexů SDS-bílkovina v polyakrylamidovém gelu a logaritmu relativní molekulové hmotnosti. Takto stanovené hodnoty rel.mol.hmotnosti se obecně uznávají pro účely charakterizace bílkovinného preparátu. Je však třeba počítat s tím, že SDS obvykle inaktivuje biologicky aktivní látky, zejména enzymy, a proto po elektroforetické separaci již nelze enzym specifickým způsobem ( tj. na základě své katalytické aktivity ) prokázat (KRAJHANZL, A. a kol., 1991). 8. 5. 5. 2. Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu ( PAGE ) Elektroforéza
v
polyakrylamidovém
gelu
patři
v
současnosti
k
nejoblíbenějším elektroforetickým technikám. PAGE se velice hojně využívá především v analytice bílkovin, a to ke zjištění homogenity preparátu a různých stupních isolačního postupu a k částečně fyzikálně-chemické charakterizaci bílkoviny. Úspěšnost elektroforetické separace ve značné míře závisí na volbě vhodných podmínek pro provedení procesu, zejména na použitém pH. Rozhodující vliv na stupeň disociace skupin separovaných látek a tedy i na velikost jejich náboje, má pH prostředí. Látky, které se nacházejí v izoelektrickém stavu nenesou žádný vnější náboj a nebudou se proto v elektrickém poli pohybovat. Naopak látky nesoucí náboje se budou pohybovat ve směru elektrody s opačným nábojem, tedy kationty ke katodě a anionty k anodě. Velice důležitým faktorem při elektroforéze na nosičích, a tedy i při PAGE, je koncentrace gele, resp. stupeň zesítění gelu. Gel s většími či menšími póry se totiž mechanickou překážkou pro molekuly určité velikosti. Má-li se tedy separovaná směs dělit pouze na základě velikosti nábojů, nesmí gel bránit molekulami v jejich průchodu. V případě různé velikosti separovaných molekul se pak vhodně zvolená koncentrace gelu ( vlastně porosita ) stává dalším faktorem ovlivňující separaci (PAGE, 2009). Experimentální uspořádání elektroforézy gelem je dvojího typu. V obou případech se elektroforéza provádí ve speciálních aparátech, v nichž se nosič se
60
vzorkem k separaci umístí mezi dvě elektrody, mezi nimiž prochází stejnosměrný proud. Rozdíl mezi oběma typy je v umístnění vzorku. Starší metoda umisťuje gelový nosič se vzorkem vertikálně v trubičkách, v novějším je gel rozprostřen v tenké vrstvě horizontálně na destičkách ( plošná elektroforéza ). Plošné uspořádání má oproti uspořádání v trubičkách několik výhod: je citlivější, lze ho snáze kvantifikovat pomocí tzv. denzitometrů a na destičku lze nanést více vzorku ( do trubičky pouze jeden ), takže proces je efektivnější a jednotlivé vzorky lze lépe porovnávat. Přes tyto výhody nevytlačila dosud plošná elektroforéza zcela elektroforézu v trubičkách, a to zejména proto, uspořádání v trubičkách je jednodušší a gely je možno velice snadno připravit i málo zkušeným uživatelem, takže lze snadno dosáhnout dobrých výsledků. Nemalý význam pro oblibu elektroforézy v trubičkách má i fakt, že zařízení pro tento typ elektroforézy je jednodušší a proto i podstatně levnější než pro elektroforézu plošnou. Větší problém je, má-li být elektroforéza na sloupci použita pro preparativní účely. Pak je totiž nutno separované látky z kolony eluovat, což se při analytickém způsobu nedělá. Na sloupec či spíše prstenec gelu se nanese směs separovaných látek. Elektroforetické podmínky se uspořádají tak, aby separované látky postupovaly shora dolů (pH, poloha obou elektrod). Dolní část gelu zasahuje do žlábku, jímž kontinuálně velmi pomalu protéká pufr nebo jiný eluent. Ten odvádí látky, které postoupily až na konec gelového prstence, do zkumavek na automatickém jímači frakcí. Tímto způsobem dojde k oddělenému jímání jednotlivých frakcí. Dobrého výsledku separace lze dosáhnout pouze tehdy. jsou-li jednotlivé zóny látek na koloně dostatečně vzdáleny ( několik centimetrů ) (KRÁLOVÁ, B. a kol., 1995).
8. 5. 6. Izoelektrická fokusace (IEF) Izoelektrická fokusace je elektromigrační separační metoda proteinů. Dělení touto metodou probíhá na základě migrace proteinů v prostředí proměnlivého pH. V zásaditém prostředí mají proteiny záporný náboj a putují tedy k anodě. V kyselém prostředí naopak mají celkový náboj kladný a putují ke katodě. V pH rovném izoelektrickému bodu, pI, je molekula neutrální. Izoelektrická fokusace probíhá na gelu (polyakrylamidový, agarosový, atd.) se pH gradientem. Po aplikaci napětí pak putuje protein do místa svého izoelektrického bodu a na tomto místě se fokusuje, neboť průchodem tímto bodem se bílkovina
61
přepóluje a putuje pomaleji do protisměru, dokud se nezastaví v pI. Izoelektrickou fokusací je možné dosáhnout separace bílkovin, které se liší v hodnotách izoelektrických bodů i o 0,01. Gradient pH je vytvářen směsí polyamfolytů (například malých polymerů s jinými hodnotami pI). Póry gelu bývají voleny velké, aby nedocházelo k narušování separace síťovým jevem. Je nutné, aby se gradient aplikací elektrického proudu neničil. Používají se poměrně vysoké hodnoty napětí v řádech desítek kilovoltů (IEF, 2009).
8. 5. 7. Dvojrozměrná elektroforéza (2-DE) V současné době je dvojrozměrná elektroforéza proteinů metodou volby pro separaci proteinů. Tato metoda umožňuje rozlišení až 10000 proteinů. Podstatou metody je využití dvou odlišných fyzikálně chemických vlastností proteinů: nejdříve jsou proteiny rozděleny podle jejich izoelektrického bodu (pI), což je hodnota pH, při které je součet nábojů proteinu nulový. Toho docílíme tak, že na proužek gelu, ve kterém je vytvořen gradient pH, naneseme protein a aplikujeme elektrické napětí. Proteiny pak migrují ke katodě či anodě dle svého celkového náboje až do chvíle, kdy pH místa v gelu odpovídá pI proteinu. Podle zvoleného rozsahu pH můžeme měnit škálu proteinů, které rozdělíme, často se právě této vlastnosti využívá pro "zaostření" (zooming) na proteiny s pI v úzkém rozsahu pH. Po separaci v prvním rozměru je provedena běžná elektroforéza na polyakrylamidovém gelu (PAGE), kdy ovšem napětí aplikujeme kolmo vzhledem k původní orientaci elektrod. Proteiny poté migrují v druhém rozměru gelem čistě v závislosti na jejich velikosti. Po proběhnutí obou fází 2D elektroforézy je třeba proteiny vizualizovat některou z barvících či značících metod (chemických nebo radioaktivních). Výsledné "mapy" proteinů lze porovnávat např. mezi experimentálním a kontrolním vzorkem nebo mezi vzorky odebranými od pacientů s konkrétním onemocněním oproti zdravým kontrolám a identifikovat tak odlišně exprimované proteiny, které mohou mít souvislost s patogenezí daného onemocnění (2-DE, 2009). Proto je třeba ověřit identitu těchto odlišně exprimovaných proteinů, nejčastěji pomocí "vyříznutí" oblasti gelu vykazující odlišnost a její následnou analýzu pomocí hmotnostní spektrometrie. Metoda 2D elektroforézy má samozřejmě i své nevýhody patří mezi ně omezená reprezentativnost vzorku (problematické jsou velmi zásadité
62
proteiny, proteiny málo rozpustné ve vodné fázi a membránové proteiny), sensitivita (proteiny přítomné ve velmi nízkých koncentracích vyžadují speciální typy barvení), reproducibilita a ve srovnání s obdobnými technikami pro nukleové kyseliny špatná automatizovatelnost (2-DE, 2009).
8. 5. 8. Hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF Hmotnostní spektrometrie je založena na rozdělení nabitých částic podle jejich molekulových hmotností v elektrickém/magnetickém poli. Dosavadní způsoby ionizace a detekce umožňovaly analyzovat látky jen s nízkou molekulovou hmotností (do tří tisíc). Jak generovat ionty u látek s vyšší molekulovou hmotností? Po dvou desetiletích studia se zjistilo, že k ionizaci vzorku laserem je třeba zajistit efektivní a kontrolovatelný přenos energie na vzorek a zároveň zamezit jeho tepelnému rozkladu. Obě podmínky jsou splněny v těchto případech: a)
Molekula rezonančně absorbuje při vlnové délce laseru, to znamená, že energie fotonů
laseru je rovna energii potřebné k vybuzení dané
molekuly a tím i k její ionizaci, b)
Přenos energie se děje ve velmi krátkém čase, řádově v jednotkách až desítkách nanosekund.
Jsou-li molekuly vzorku ionizovány laserem přímo, většinou se štěpí nežádoucím způsobem. Proto se začala používat matrice – látka, jejímž prostřednictvím se ionizační energie laseru přenáší na molekuly vzorku a tím brání jejich štěpení. Ionizace laserem přes matrici umožňuje měřit molekulové hmotnosti více látek v tomtéž vzorku, což dosud nešlo. V měření ani tak nepřekáží běžné pozadí biologických a biochemických vzorků jako například pufrační roztoky (HAVLIŠ,J., Odstraněno: 8
1999). K stanovení vyšších molekulových hmotností se používá ionizace laserem za přítomnosti
matrice
(MALDI,
matrix
assisted
laser
desorption/ionization)
v kombinaci s detektorem doby letu (TOF, time-of-flight). Detektor umožňuje změřit dobu průletu a z ní lze vypočítat rychlost částice.
63
Směs matrice a vzorku v pevném stavu a na vhodném nosiči, například na nerezové destičce, je zasažena nanosekundovým pulzem laseru. Matrice energii pulzu absorbuje a její rozklad ionizuje molekuly vzorku. Touto ionizací se rozumí adice kationtu (H+, Na+) či aniontu na molekulu vzorku, disociace H+ z molekuly vzorku, vznik radikálu odštěpením elektronu, popřípadě cílené rozkouskování (vysokou energií laseru) molekuly vzorku a opět spojení kousků. Ionty analyzované látky jsou urychleny silným elektrickým polem (25–30 kV) a přes uzemněnou mřížku vstupují do vakua v trubici detektoru letu, kde se pohybují rychlostí danou jejich hmotností a nábojem. Zde se měří doba letu částice, z níž se pak vypočte poměr molekulové Odstraněno: 8
hmotnosti a náboje částice (HAVLIŠ, J., 1999).
64
9. DISKUZE A ZHODNOCENÍ METOD 9. 1. Studium exprese na úrovni mRNA Hlavní význam detekce mRNA konkrétního genu tkví v možnosti posouzení prvního kroku exprese, tj. trankripce z DNA. Pro analýzu jednotlivých genů/mRNA segmentů lze použít starší northernový přenos či jednoduchou kvantitativní PCR v reálném čase (real-time PCR). Ke komplexním analýzám exprese mRNA 100 000 a víc znaků jsou vhodné mikročipy. Mezi výhody exprese mRNA patří, že z tkání můžeme izolovat celkovou RNA. Metody pro studium mRNA posuzujeme z hlediska kvantity, tzn. množství analyzovaných transkriptů. Z tohoto hlediska je nejvhodnější použití mikroarray, protože ta umožňuje detekovat řádové deseti až statíce transkriptů současně. Z hlediska přesnosti je vhodnější použití používaných metody kvantitativní PCR v reálném čase, neboť je přesnější než-li mikroarray. Při výběru jednotlivých metod bychom se vždy měli zamyslet nad tím, jaké množství genů as kolik vzorků (tkání atp.) jimi můžeme detekovat, jaká bude kvalita měření, pracnost provedení (náročnost na přístrojové vybavení) a v neposlední řadě také cena jednotlivé analýzy.
Obecně můžeme říci, že používané metody jsou rychlé a s vysokou senzitivitou, ale je nutné drahé vybavení a cena vyšetření je vysoká.
Klady a zápory vybraných metod 1) Northernový přenos (Northern blot) Mezi hlavní nevýhody northernového přenosu patří neumožnění poskytnutí údajů o absolutním množství mRNA, nutnost použití relativně většího množství mRNA, a nižší citlivost ve srovnání s PCR v reálném čase. Northernovým přenosem také nemůžeme studovat neznámé geny či jejich větší počet najednou. Můžeme sledovat pomocí homologních sond i expresi genů jiného druhu. Výhodou northernového přenosu je naopak možnost určení velikosti specifického transkriptu a přítomnosti jiných transkriptů daného genu.
65
2) RT-PCR Nevýhodou RT-PCR, vzhledem k neexistující spolehlivé souvislosti mezi počátečním množstvím templátu a konečným množstvím produktu PCR při pevném počtů cyklů, je obtížnost získat kvantitativní údaje o účinnosti transkripce. Detekce množství produktu po každém cyklu by bylo velice nákladné, proto se používá kombinace RT-PCR s PCR v reálném čase.
Ve srovnání s northernovým přenosem má PCR v reálném čase vysokou citlivost, tudíž je umožněna detekce specifické mRNA i z jediné buňky. Díky této vysoké citlivosti nám poskytuje výborné výsledky při identifikaci specifických změn v sekvenci DNA. 3) Diferenciální display (DD) Mezi výhody DD patří její jednoduchost, kdy je založena na PCR a sekvenování DNA gelovou elektroforézou, dále vysoká citlivost, univerzálnost (současně můžeme srovnávat dva vzorky RNA) a také rychlost a náklady (do dvou dnů můžeme získat strukturu mRNA). Ve srovnání s mikroarray je DD méně technicky náročný a také cenově příznivější. Výhodou je to, že není třeba znát sekvence transkriptů, neboť metoda slouží především k vyhledávání diferenciálně se exprimujících genů. 4) DNA mikroarray Zásadním rozdílem mezi DNA mikroarray a DD je, že rozdíl zobrazení vizualizuje mRNA v sadách přímo bez normalizace dat po jejich zesílení a označování buď izotopy či fluorescenčními barvivy. Hlavními nevýhodami DNA mikroarray jsou nedostatek citlivosti a možnost nespecifické hybridizace.
Výhodou DNA mikroarray však je, že technika mikročipů umožňuje v krátké době vyhodnocení velkého množství transkriptů.
66
5) Celogenomové sekvenování RNA Podle současných znalostí se v budoucnu bude tato metoda pravděpodobně nejvíce uplatňovat. Výhodou celogenomové sekvenování RNA je získání informací o celém transkriptomu, a to jak z hlediska kvantitativního, tak i kvalitativního.
Za nevýhodu naopak považujeme vysoké pořizovací náklady přístrojů.
9. 2. Studium exprese na úrovni proteinů Metody používané ke studiu exprese na úrovni proteinu slouží k získání malého počtu proteinu a protilátek. Ke sledování proteomu používáme hmotnostní spektrometrie (MS) např. MALDI-TOF, ke studiu jednotlivých proteinů např. Western blot (imunoblot) nebo ELISU (přímá nekompetitivní – „Sandwich“).
Sendvičová ELISA je založena na použití dvou protilátek. První protilátka, imobilizovaná na povrch nosiče, interaguje s antigenem. Druhá, enzymem značená protilátka reaguje s jinými determinantními skupinami na odlišné části molekuly antigenu. Po přidání chromogenního substrátu nebo substrátu a chromogenu je výsledná enzymová reakce vyhodnocena fotometricky.
Cílem dynamicky se vyvíjející proteomiky je mapovat a charakterizovat genovou expresi na úrovni proteinů, jejich posttranslačních modifikacích a interakcí. Hmotnostní spektrometr, pro přesné určení hmotnosti proteinů, je schopen během hodiny analyzovat tisíce fragmentačních spekter peptidů, vzniklých štěpením proteinů rozdělených dvourozměrnou elektroforézou.
Metody založené na detekci proteinu (imunologické a enzymové) - detekují produkt transgenu nebo metabolity, jejichž produkce je ovlivněna vloženým genem. Tyto metody mají dva významné limity, které je vyřazují z použití jako rutinních detekčních metod. První nevýhodou je dispozice jen mála protilátek specifických proti proteinům produkovaným expresí vloženého genu a druhou nevýhodou pro aplikaci těchto analys je degradace proteinů.
67
Klady a zápory vybraných metod 1) Westernová hybridizace (Western blot) Pomocí Western blotu můžeme poměrně jednoznačně identifikovat protein ve směsi. Nepřímá virologická diagnostika se zaměřuje na průkaz specifických protilátek HIV, jež se objevují přibližně po prvním až třetím měsíci po expozici. Diagnostika těchto protilátek slouží jako základ pro určení diagnózy HIV infekce. Tuto metodu využívá jak Western blot, tak i ELISA.
Na druhou stranu je za nevýhodu považována nutnost mít primární protilátku. Bez ní je totiž Western blot neuskutečnitelný. Testy Western blot jsou více technicky náročné, ale také vysoce specifické a slouží zejména jako ověřovací testy pro reaktivní testy ELISA. 2) ELISA Mezi výhody ELISY patří automatizace, rychlost vyšetření a současně vyšetření velkých sérií vzorků. Co se týče nákladů, patří ELISA k cenově dostupnějším metodám. ELISU můžeme využít i k detekci bakteriálních toxinů a patogenů. 3) MALDI-TOF Výhodou MALDI-TOFu je extrémně citlivá detekce, jednoznačná identifikace proteinů i barviv a nízká spotřeba vzorku.
V podstatě můžeme říci, že nejpřesnějších výsledků dosáhneme, když budeme zároveň monitorovat geny na úrovni exprese mRNA a následně proteinu. Samozřejmě musíme vzít k úvahu dostupnost materiálu pro studium, někdy bude snadnější získat kvalitní mRNA, jindy zase vyizolovat protein.
68
10. SEZNAM ZKRATEK POUŽÍVANÝCH METOD DD – diferenciální display 2 - DE – dvojrozměrná elektroforéza ELISA – analýza s enzymem navázaným na immunosorbent, tj. protilátku FISH – fluorescenční in situ hybridizace HART – translace z upoutaného hybridu HRT – translace z uvolněného hybridu IEF – izoelektrická fokusace MALDI–TOF – hmotnostní spektrofotometrie NSG – celogenomové sekvenování RNA (nová generace sekvenování) PAGE – elektroforéza v polyakrylamidovém gelu PCR v reálném čase (real – time PCR) PEA – test prodlužování primerů RACE – rychlá amplifikace cDNA konců RPA – test ochrany před účinkem RNázy RT-PCR – reverzně transkripční PCR SAGE – sériová analýza genové exprese SDS – elektroforéza v polyakrylovém gelu s dodecylsulfátem sodným
69
11. POUŽITÁ LITERATURA
Naformátováno: Písmo: Kurzíva Naformátováno: Písmo: Kurzíva
BÍNA, J. (1976): Malá encyklopedie chemie, SNTL, Praha BEDNÁŘ, J., KUCIEL, J., VYHNÁNEK, T. (2006): Genetika, s. 148, MZLU, Brno, ISBN 80-7157-862-2
Naformátováno: Písmo: Kurzíva Naformátováno: Písmo: Kurzíva Naformátováno: Písmo: Kurzíva
BROWN, T.A. (2006): Klonování a analýza genů, Tiskservis, Olomouc, ISBN 978-80-244-1719-6 DORIAN, J., KORF, B. R. (2007): Základy lékařské genetiky, s. 182, GALÉN 2007, ISBN 978-80-7262-449-2 FERENČÍK, M., ŠKÁRKA, B. (1981): Biochemické laboratórne metódy, Alfa, Bratislava, 1. vydání, s.852 IKEMATSU, K., TSUDA, R., TSURUYA, S., NAKASONO, I. (2007): Identification of novel genes expressed in hypoxic brain condition by fluorescence differential display, Forensic Science International, Vol. 169, Issue 2, Pages 168-172, ISSN: 0379-0738 IWASAKI, Y.K., YAMASHITA, T., SEKIGUCHI, A., HATANO, S., SAGARA, K., IINUMA, H., FU, L.T., KOBAYASHI (2006): A method for the simultaneous analysis of mRNA levels of multiple cardiac ion channels with a multi-probe RNase protection assay, Europace, ISSN 1011 – 1015 KERN,D., COLLINS, M., FULTZ, T., DETMER, J., HAMREN, S., PETERKIN, J.J., SHERIDAN, P., URDEA, M., WHITE, R. (1996): An enhanced-sensitivity branched-DNA assay for quantification of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma, Journal of clinical microbiology, Washington, DC,Vol. 34, pp. 3196-3202, ISSN 0095-1137 KOČÁREK, E. (2005): Genetika, s. 212, SCIENTIA, ISBN 80-7183-326-6
Odstraněno: ¶ FISHER, P. B.(2007): Cancer genomics and proteomics, Humana Press, ISBN 978-1-58829-504-0 ¶ ¶ FRIED, M., CROTHERS, D.M. (1981): Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis, Nucleic Acids Research, 9, p. 6505-25.¶ ¶ FROHMAN, M.A., DUSH, D.K., MARTIN, G.R. (1988): Rapid production of full lenght cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 85, p. 8998-9002¶ ¶ GALAS, D., SCHMITZ, A.... [21] (1978): DNase footprinting: a Naformátováno: Písmo: Kurzíva Naformátováno: Písmo: Kurzíva Naformátováno: Písmo: Kurzíva Odstraněno: ¶ Naformátováno: Písmo: Kurzíva Odstraněno: ¶ Naformátováno: Písmo: Kurzíva
KRAJHANZL, A., HLADÍK, J. (1991): Biochemické metody: návody k pokročilým cvičením, Karolinum, Praha, s. 75-83, ISBN 80-7066-496-5
Naformátováno: Písmo: Kurzíva
KRÁLOVÁ, B., FUKAL, L., RAUCH, P. (1995): Bioanalytické metody, Vysoká škola chemicko-technologická, Praha, s. 266, ISBN 80-7080-234-0
Naformátováno: Písmo: Kurzíva Odstraněno: ¶
NUSSBAUM, R.L. (2004): Klinická genetika, s. 492, TRITON, ISBN 80-7254-475-6 ROSYPAL, S.(1999): Úvod do molekulární biologie, Grafex, Brno, II. díl, s. 591, ISBN 80-902562-1-X
Odstraněno: MANN, M., HENDRICKSON, R. C., ... [22] PANDEY, A. (2001): Analysis of Naformátováno: Písmo: Kurzíva Naformátováno: Písmo: Kurzíva
ROSYPAL, S., DOŠKAŘ, J., PANTŮČEK, R., KAILEROVÁ, J., RELICHOVÁ, J., RŮŽIČKOVÁ, V., ŠMARDA, J., ŠTĚPÁN, J. (2001): Terminologie molekulární biologie, S. Rosypal, Brno, 1. vydání, s. 300, ISBN 80-902562-3-6
Naformátováno: Písmo: Kurzíva Naformátováno: Písmo: Kurzíva Odstraněno: ¶
70
SNUSTAD, D.P., SIMMONS, M. J. (2009): Genetika, s. 894, MU, Brno, ISBN 97880-210-4852-2 ŠMARDA, J., DOSTÁL, J., PANTŮČEK, R., RŮŽIČKOVÁ, V., KOSTÍKOVÁ, J. (2005): Metody molekulární biologie, s. 194, MU, Brno, ISBN 80-210-3841-1 TOMAN, M. (vedoucí autorského kolektivu) (2000): Veterinární imunologie, s. 413, GRADA, Praha, ISBN 80-7169-727-3 van GELDER, P.(2001): Applications of the Polymerase Chain Reaction to Diagnosis of Ophthalmic, Disease1, Survey of Ophthalmology, Vol. 46, Issue 3, Pages 248-258
Odstraněno: ¶ SANCHÉZ-PESCADOR, R. et al. (1988): Rapid chemiluminescent nucleic acid assays for detection of TEM-1 beta-lactamase-mediated penicillin resistance in Neisseria gonorrhoeae and other bakteria, J. Clin Microbiol., ISSN 1934-1938¶ ¶ SMITH, C.P. (2001) Transcript mapping. In.: Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, Vol. 2 (ed. T.A.Brown), 2nd edn, pp. 223-43¶ ¶ Naformátováno: Písmo: Kurzíva
WANG, Z., GERSTEIN, M., SNYDER, M.: RNA-Seq: a revolutionary tool for
Naformátováno: Barva písma: Automatická
transcriptomics, Nat Rev Genet, 2009 Jan., 10(1):57-63
Naformátováno: Písmo: Kurzíva
HONYS, D.: Regulace genové exprese – úloha a osud RNA v eukaryotické buňce, [cit. 2009-10-18], dostupné z:
KMOCH, S.: Nové technologie v analýze DNA, RNA a proteinů, [cit. 2008-09-16], dostupné z: PAČES, V.: Genomika – věda pro 21. století, [cit. 2008-11-04], dostupné z: SESTŘIH, [cit. 2009-11-12], dostupné z:
Naformátováno: Písmo: Kurzíva Odstraněno: TANIGUCHI, M., MIURA, K., IWAO, H., YAMANAKA, S. (2001): Quantitative Assessment of DNA Microarrays-Comparison with Northern Blot Analyses, Elsevier, San Diego, p. 34-39, ISSN 08887543 ¶ ¶ Naformátováno: Písmo: Kurzíva Naformátováno: Písmo: Kurzíva Naformátováno: Písmo: Kurzíva Odstraněno: ¶ van HALL, N.L.W., VORST, O., van HOUWELINGEN, A., M. (2000): The application of DNA microarrays in gene expression analysis, Journal of Biotechnology, 78, p. 271-280¶ Naformátováno: auth_list, Vpravo: 0,31 cm, Řádkování: Nejméně 21,6 b. Odstraněno: ¶ Naformátováno: Písmo: Kurzíva Odstraněno: http:// Odstraněno: 209.85.135.132/se arch?q=cache:olzRoei1t9QJ:www. otevrenaveda.cz/ov/users/Image/default/C1 Kurzy/Biolog/2Honys.pdf+co+je+ ... [23] exprese+genu+obecn%C4%9B&c Naformátováno: Písmo: Kurzíva
MIČUDA, S. a kol. (2006): Molekulárně biologické metodiky ve farmakologii, [cit. 2010-01-10], dostupné z: SOUTHERN, [cit. 2010-01-03], dostupné z:
Odstraněno: , Odstraněno: Naformátováno
71
... [24]
HAVLIŠ, J. (1999): Hmotnostní spektrofotometrie MALDI TOF, [cit. 2009-03-15], dostupné z:
Naformátováno: Písmo: Kurzíva Naformátováno: Písmo: (výchozí) Times New Roman, 12 b., není Tučné
ELISA, [cit. 2009-08-10], dostupné z: PAGE, [cit. 2008-11-09], dostupné z: IEF, [cit. 2009-04-23], dostupné z: 2-DE, [cit. 2010-01-07], dostupné z: Odstraněno: ¶
FISH, [cit. 2010-01-15], dostupné z: ANDROGEOS, [cit. 2010-02-02], dostupné z: MAŘÍKOVÁ, H. (2008): Využití onkonázy v medicíně, [cit. 2010-02-05], dostupné z: PAVLÍK, E.: Molekulárně biologické techniky pro mikrobiologickou diagnostiku, [cit. 2010-02-01], dostupné z: SONDY, [cit. 2010-01-10], dostupné z:
HUGROUP, [cit. 2010-01-20], dostupné z:
GENHUNTER, [cit. 2009-11-08], dostupné z:
72
REAL-TIME PCR: Základní principy kvantitativní real-time PCR, [cit. 2009-09-25], dostupné z:
Odstraněno: , Naformátováno: Písmo: Kurzíva Odstraněno: ¶
POSPÍŠILOVÁ, Š., MAYER, J. (2005): DNA čipy – moderní metodika analýzy diferenciální genové exprese a její význam pro diagnostiku a léčbu nádorových onemocnění, [cit. 2009-11-01], dostupné z:
73
74
75
76
Stránka 8: [1] Odstraněno
Jan Pazdera
20.4.2010 17:09:00
8. 2. „Footprinting“ pomocí DNázy I......................................................................53 Stránka 8: [2] Odstraněno
Jan Pazdera
20.4.2010 17:09:00
8. 3. Test modifikované interference.......................................................................53 Stránka 8: [3] Odstraněno
Jan Pazdera
20.4.2010 17:09:00
8. 4. Identifikace kontrolní sekvence pomocí deleční analýzy................................54 Stránka 8: [4] Odstraněno
8. 4. 1.
Jan Pazdera
20.4.2010 17:09:00
Provedení deleční analýzy................................................................55
Stránka 8: [5] Odstraněno
Jan Pazdera
20.4.2010 17:10:00
8. 5. Identifikace a studium translačního produktu klonovaného genu...................55 Stránka 8: [6] Odstraněno
8. 5. 1.
Stránka 8: [7] Odstraněno
8. 5. 2.
Jan Pazdera
20.4.2010 17:10:00
Jan Pazdera
20.4.2010 17:10:00
Jan Pazdera
20.4.2010 17:11:00
Blotování ..........................................................................................58
Stránka 8: [11] Odstraněno
8. 5. 3. 3.
20.4.2010 17:10:00
Elektroforéza ....................................................................................57
Stránka 8: [10] Odstraněno
8. 5. 3. 2.
Jan Pazdera
Westernová hybridizace ...................................................................57
Stránka 8: [9] Odstraněno
8. 5. 3. 1.
20.4.2010 17:10:00
Analýza proteinů pomocí mutageneze in vitro ................................57
Stránka 8: [8] Odstraněno
8. 5. 3.
Jan Pazdera
Metody HRT a HART (identifikace transl. produktu klon. genu) ...56
Jan Pazdera
20.4.2010 17:11:00
Reakce proteinů s protilátkou...........................................................58
Stránka 8: [12] Odstraněno
Jan Pazdera
20.4.2010 17:11:00
8. 5. 3. 4. Vyvolání blotu..................................................................................58 Stránka 8: [13] Odstraněno
Jan Pazdera
20.4.2010 17:11:00
8. 5. 3. 5. Výsledek...........................................................................................59 Stránka 8: [14] Odstraněno
8. 5. 4.
Stránka 8: [15] Odstraněno
8. 5. 5.
20.4.2010 17:11:00
Jan Pazdera
20.4.2010 17:11:00
Jan Pazdera
20.4.2010 17:12:00
Jan Pazdera
20.4.2010 17:12:00
Dvojrozměrná elektroforéza (2-DE) ................................................63
Stránka 8: [20] Odstraněno
8. 5. 8.
Jan Pazdera
Izoelektrická fokusace (IEF) ............................................................62
Stránka 8: [19] Odstraněno
8. 5. 7.
20.4.2010 17:11:00
Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu (PAGE)..........................61
Stránka 8: [18] Odstraněno
8. 5. 6.
Jan Pazdera
SDS-elektroforéza ............................................................................60
Stránka 8: [17] Odstraněno
8. 5. 5. 2.
20.4.2010 17:11:00
SDS-PAGE.......................................................................................60
Stránka 8: [16] Odstraněno
8. 5. 5. 1.
Jan Pazdera
ELISA...............................................................................................59
Jan Pazdera
20.4.2010 17:12:00
Hmotnostní spektrometrie (MALDI-TOF) ......................................64
Stránka 70: [21] Odstraněno
Jan Pazdera
23.4.2010 11:43:00
FISHER, P. B.(2007): Cancer genomics and proteomics, Humana Press, ISBN 978-1-58829504-0 FRIED, M., CROTHERS, D.M. (1981): Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis, Nucleic Acids Research, 9, p. 6505-25. FROHMAN, M.A., DUSH, D.K., MARTIN, G.R. (1988): Rapid production of full lenght cDNAs from rare transcripts: amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 85, p. 8998-9002 GALAS, D., SCHMITZ, A. (1978): DNase footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specifity, Nucleic Acids Research, 5, p. 3157-70 GRANDJEAUD, S., BERTUCCI, F., JORDAN, B.R. (1999): Expression proffiling: DNA arrays in many guises. BioEssays, 21, p. 781-90. HENDRICKSON, W., SCHLEIF, R. (1985): A dimer of AraC protein contacts three adjacent major groove regions at the Ara I DNA site. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 82, p. 3129-33 Stránka 70: [22] Odstraněno
Jan Pazdera
23.4.2010 11:00:00
MANN, M., HENDRICKSON, R. C., PANDEY, A. (2001): Analysis of proteins and proteomes by mass spektrometry, Annual Rewiew of Biochemistry, 70, 437-73 NEELIMA, P.S., RAO, A.J. (2008): Gene expression profiling during Forskolin induced differentiation of BeWo cells by differential display RT-PCR, Molecular and cellular endocrinology, Elsevier, Vol. 281, pp. 37-46, ISSN 0303-7207 Stránka 71: [23] Odstraněno
Jan Pazdera
20.4.2010 18:30:00
209.85.135.132/search?q=cache:olzRoei1t9QJ:www.otevrenaveda.cz/ov/users/Image/default/C1Kurzy/Biolog/2Honys.pdf+co+je+exprese+genu+obecn%C 4%9B&cd=1&hl=cs&ct=clnk&gl=cz&lr=lang_cs Stránka 71: [24] Naformátováno
Jan Pazdera
20.4.2010 18:40:00
Písmo: (výchozí) Times New Roman, 12 b., Kurzíva, Barva písma: Automatická, Čeština
