MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
BRNO 2013
KAROLÍNA WERNEROVÁ
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat
Kandidátní geny pro výkonnost u koní Bakalářská práce
Vedoucí práce: Ing. Libor Stehlík, Ph.D.
Vypracovala: Karolína Wernerová
Brno 2013
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma ,, Kandidátní geny pro výkonnost u koní “ vypracovala samostatně a použila jen prameny, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářké práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne …………………………………. podpis studenta …………..………….
PODĚKOVÁNÍ
Děkuji Ing. Liboru Stehlíkovi, Ph.D., za odborné připomínky, konzultace a odborné vedení při vypracování bakalářské práce. Také děkuji své matce za podporu během celého studia.
Abstrakt Cílem bakalářské práce je popsat současný stav znalostí o vlivu kandidátních genů na výkonnost koně. První část je věnována charakteristice výkonnosti koní, ze které je zřejmé, jaká genetická výbava je u koně důležitá pro dosažení optimálního požadovaného výkonu. Potom jsou uvedeny základy molekulárně genetických metod, využitých při určování kandidátních genů pro výkonnost koně. V další části je podán přehled dosud zkoumaných kandidátních genů, s podrobnějším popisem vlivu genu myostatinu (MSTN) a mitochondriální DNA na výkonnost koně.
Klíčová slov: kandidátní geny, výkonnost koní, myostatin, mitochondriální DNA
Abstract The aim of this bachelor thesis is to describe the current state of knowledge of the influence of candidate genes on horse performance. Firstly, the characteristics of horse performance are described from which it is apparent what genetic predispositions are important to reach the desired optimal performance. Secondly, the essentials of molecular-genetic methods, which are employed for determination of the candidate genes for horse performance, are explained. Further, an overview of candidate genes already studied is given with a detailed description of the influence of myostatin gene (MSTN) and mitochondrial DNA on horse performance.
Keywords: candidate genes, horses performance, myostatin, mitochondrial DNA
OBSAH 1
Úvod ................................................................................................................... 7
2
Cíl práce ............................................................................................................. 8
3
Literární přehled ................................................................................................. 9 3.1
Výkonnost koní ........................................................................................... 9
3.1.1
Historie ................................................................................................ 9
3.1.2
Charakteristika výkonnosti ................................................................ 10
3.1.2.1 Maximální výkonnost .................................................................... 10 3.1.2.2 Výkon ............................................................................................ 10 3.1.2.3 Užitkovost...................................................................................... 10 3.1.2.4 Definice výkonnosti ....................................................................... 11 3.1.2.5 Dostihová výkonnost ..................................................................... 12 3.1.2.6 Sportovní jezdecká výkonnost ....................................................... 15 3.1.2.7 Výkonnost v lehké zápřeži ............................................................ 17 3.1.2.8 Výkonnost v tahu ........................................................................... 18 3.2
Genetika koně ........................................................................................... 19
3.2.1
Genom koní ....................................................................................... 19
3.2.2
Způsob zjišťování genetické informace ............................................ 20
3.2.2.1 Odběr genetického materiálu ......................................................... 20 3.2.2.2 Izolace DNA .................................................................................. 21 3.2.2.3 Amplifikace DNA ......................................................................... 22 3.2.2.4 Sekvenční analýza DNA................................................................ 25 3.2.2.5 Minisekvencování .......................................................................... 27 3.2.2.6 Detekce repetitivních mikrosatelitových markerů (SSR) .............. 28 3.2.2.7 SSCP – konformační polymorfismus jednořetězcové DNA ......... 28 3.2.3
Genetické testování koní v ČR .......................................................... 29
3.2.4
Kandidátní geny................................................................................. 31
3.2.4.1 Charakteristika ............................................................................... 31 3.2.4.2 Svalová síla a složení svalu ........................................................... 31 3.2.4.3 Myostatin ....................................................................................... 32 3.2.4.4 Svalový metabolismus a tréninková intolerance ........................... 36 3.2.4.5 Hemodynamická a aerobní kapacita metabolismu ........................ 37 3.2.4.6 Fyziologie šlach a vazů.................................................................. 38 3.2.4.7 Mitochodnriální DNA ................................................................... 39 3.2.5
Pojmy................................................................................................. 41
4
Závěr ................................................................................................................ 43
5
Seznam použité literatury ................................................................................. 44 5.1
Seznam obrázků ........................................................................................ 45
1 ÚVOD
Koně byli pro svoji velkou fyzickou výkonnost po tisíciletí využíváni k práci jako je tah, nošení břemen i jezdců na delší vzdálenosti. Během posledního století díky vzniku motorových vozidel se koně k práci využívají stále méně, ovšem výrazně se zvýšilo sportovní využití koní. Proto se šlechtění koní začalo zaměřovat jiným směrem, a to ke zdokonalování vlastností koní pro využití ve specifických sportovních disciplínách. V dnešní době jsou vyšlechtěna odlišná plemena pro skok, zápřah, drezuru, vytrvalostní závody apod. Ovšem největší pozornost ve šlechtění je věnována zlepšování vlastností anglického plnokrevníka. Již v 17 století začalo panstvo pořádat dostihy koní, kde šlo především o vyvinutí maximální rychlosti na krátký úsek, nejčastěji míli. V dnešní době je do jezdeckého sportu investováno nemálo peněz, a to díky jeho popularitě nejen v Anglii, ale i arabských zemích a také kvůli široce rozšířeným sázkám. Díky tomu je také genotyp těchto koní postupně vědecky zkoumán. Majitelé koní finančně podporují výzkum genetické výbavy koně a dědičných zákonitostí, které ovlivňují výkonnost jejich nejlepších koní tak, aby jedinci s kombinací genů vhodných pro vrcholový sport mohli své geny cíleně předávat na potomstvo. Vzhledem k tomu, že u anglického plnokrevníka není povolena inseminace, je v méně rozvinutých zemích pokrok v chovu jen velmi pomalý. V zemích, kde jsou investice do dostihového sportu velké, začíná být pokrok v chovu koní opravdu značný, a to i díky využití znalostí genetiky koní. Vždy však na výkonnost jedince působí současně více vlivů, jako je chovatelské zázemí, způsob tréninku, výživa apod. Genetická výbava je jedním z mnoha faktorů, ovlivňujících sportovní jedince.
7
výkonnost
2 CÍL PRÁCE
Cílem této bakalářské práce je: •
analyzovat zdroje literatury zaměřující se na kandidátní geny, které ovlivňují fyzickou výkonnost koní
•
vyhledat a popsat polymorfismus mitochondriálních genů ve vztahu k výkonnosti u koní
•
charakterizovat vliv vybraných genetických markerů.
8
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Výkonnost koní
3.1.1
Historie
Využití koní v jezdectví, tahu a nošení břemen bylo dříve tak rozšířené, že tato zvířata byla na několik tisíciletí významným faktorem pro hospodářský i společenský rozvoj mnoha zemí. Pro různé oblasti pracovního využití byly postupně vyšlechtěny typy koní vhodných pro vojsko, dopravu, ceremoniál a zemědělství. Pro výběr jedinců se formovala posuzovací kritéria a tím se vytvářely základy budoucí systematické testace koní. Již ve středověku byla věnována velká pozornost výběru plemeníků, kteří byli velmi ceněni. Velký zvrat v kvalitě koní a jejich testování nastal v 18. a hlavně 19. století z důvodu velkého rozvoje průmyslu a nástupu společensko-ekonomických změn. Bylo vyžadováno rychlé zvýšení výkonnosti koní v zemědělství, které muselo zvýšit produktivitu práce a také zlepšit kvalitu koní v rozšiřujícím se sportovním ježdění, které v té době mělo společenský charakter. V chovu jednotlivých plemen byla stanovena výkonnostní kritéria, jejich objektivita však byla velmi rozdílná. To dalo impuls k počátku chovu řízeného státem a vzniku chovatelských svazů. Teprve v druhé polovině 20. století se propojuje systém testace koní s cíli živočišné výroby, tedy dosažením maximální ekonomické užitkovosti v chovu teplokrevných a chladnokrevných koní, u kterých byly zavedeny systematické výkonnostní zkoušky. Vzhledem k nižší dědičnosti výkonnosti se ukázalo prověřování potomstev plemeníků a chovných klisen jako velmi účelné (Dušek a kol., 2007).
9
3.1.2
Charakteristika výkonnosti
3.1.2.1 Maximální výkonnost
Je největší výkon za časovou jednotku, kterého jedinec dosáhne při mobilizaci tělesných energetických rezerv (přibližující se hranici vyčerpání organismu), ovšem u koní se tento krajní fyziologický stav nepožaduje. Výkonnost je tedy výsledek dosažený při vysokém pracovním úsilí, aniž by však docházelo k poškození organismu (Dušek a kol., 2007).
3.1.2.2 Výkon
Je pracovní úkon nedefinovaný veličinou času. U výkonnosti jde tedy z určitého hlediska o výkonnost absolutní, zatímco u výkonu se v běžné terminologii v chovu koní hovoří o výkonnosti relativní, a to obecně u práce dlouhodobější (Dušek a kol., 2007).
3.1.2.3 Užitkovost
Je komplex vlastností, z nichž hlavní je charakterizována poskytováním svalové síly k přemístění břemene v tahu nebo nesením. Hodnocení je složité, protože užitková hodnota je vytvářena nejen přímými výkonnostními vlastnostmi, ale i vlastnostmi ovlivňujích výkonnost (konstituce, temperament, pracovní charakter a krmitelnost, plodnost atd.) (Dušek a kol., 2007).
10
3.1.2.4 Definice výkonnosti
Kůň se typem své užitkovosti výrazně liší od ostatních hospodářských zvířat. Ostatní zvířata jako skot, drůbež, prasata apod. produkují potraviny, nebo suroviny, tj. mají užitkovost masnou, mléčnou apod. Oproti nim je výkonnost koně jeho vlastní užitkovost, tj. fyzická síla poskytnutá v zájmu potřeby majitele nebo uživatele. Koně využíváme pro různé druhy prací, a proto i rozdílně využíváme jejich fyzickou sílu. Dle využití zvířete rozdělujeme výkonnost na: - dostihovou výkonnost (rychlost ve cvalu, v klusu), - sportovní jezdeckou výkonnost (ve skoku, v drezúře a ve všestrannosti), - výkonnost v lehké zápřeži (vozatajský sport, zápřež v kočáru), - výkonnost v tahu (lehký a těžký tah), - výkonnost soumarů (nošení břemen). Výkonnost prověřujeme výkonnostními zkouškami, jejichž kritéria jsou odlišná pro daný typ využití zvířete. Počet a obtížnost prověřovaných kritérií rozdělují výkonnostní zkoušky do 3 skupin: - všestranné výkonnostní zkoušky, - sportovní výkonnostní zkoušky, - speciální výkonnostní zkoušky. Při všestranných výkonnostních zkouškách se prověřuje více vlastností, ale žádná nesmí být preferována, protože by potlačila význam ostatních a tím změnila podstatu všestrannosti zkoušky. Sportovními výkonnostními zkouškami jsou oficiální jezdecké i vozatajské soutěže různého stupně obtížnosti. Při nich je prověřována pouze jedna konkrétní vlastnost
11
(skok, drezura), u nejobtížnějších soutěží se výkon přibližuje k hranici požadavků speciálních výkonnostních zkoušek (především ve skokových soutěžích). Speciální výkonnostní zkoušky mají jediné kritérium, u kterého je požadován maximální výkon, patří sem maximální rychlost ve cvalu, maximální rychlost v klusu, maximální síla v tahu, maximální vytrvalost apod. Nejrozšířenějšími speciálními výkonnostními zkouškami jsou rovinové dostihy (Kulovaná, 2002).
3.1.2.5 Dostihová výkonnost
Dostihy jsou speciální výkonnostní zkouškou klusáků a anglických plnokrevníků. Jejich jediným selekčním kritériem je rychlost buď v klusu nebo ve cvalu. Cílem tohoto kritéria je prověřit vytrvalost koní a její vývoj, konstituci tj. odolnost koní proti negativním vlivům extrémní námahy a charakter tj. chuť koně vložit maximum úsilí do požadovaného výkonu (Dušek a kol., 2007). •
Cvalové dostihy
V roce 1750 byl v Anglii založen Jockey Club, který dal základ dnešní podobě cvalových dostihů. Sjednotil propozice dostihů za účelem pozitivního vývoje selekce koní pro rychlost. V druhé polovině 18. století by založeny základní klasické dostihy pro tříleté koně Derby a Oaks, do první poloviny dvacátého století byly stanoveny další srovnávací dostihy. Dále byly vytvořeny kategorie mezinárodních dostihů Graded a Listed, aby nedocházelo ke kumulaci termínů pořádání nejdůležitějších dostihů. Rovinové dostihy se dělí na: 1) Dostihy koní stejného věku a) Klasické dostihy Jedná se o nejvýznamnější dostihy koní stejného věku. Všichni koně nesou v dostihu stejnou váhu, bez ohledu na titul jezdce. Pouze klisny mají úlevu pokud běží v dostihu společně s hřebci. Tyto dostihy jsou ohodnoceny velmi vysokými dotacemi. Hlavní funkcí těchto dostihů je pozitivní selekce nejvýkonnějších koní. Mezi klasické dostihy patří Velká jarní cena, Derby a St. 12
Ledger, pokud kůň vyhraje všechny tři dostihy získává tzv. trojkorunu a zpravidla je vždy zařazen do chovu. Dalšími dostihy speciálně pro klisny jsou Jarní cena klisen a Oaks. b) Dostihy koní stejného věku s penalizací a úlevami V těchto dostizích nesou koně s horší výkonností nižší váhu a tím jsou v dostihu zvýhodněni a naopak koně s lepší výkonností nesou vyšší váhu a tím jsou znevýhodněni. Tyto dostihy nemají selekční funkci, ale spíše funkci ověřovací. c) Handicapy V těchto dostizích nosí koně váhu určenou podle jejich předešlých výkonností handicaperem (tj. odpovědným funkcionářemJockey Clubu). Cílem je stanovení nesené váhy tak, aby měli všichni stejnou šanci zvítězit. 2) Dostihy koní rozdílného věku a) Srovnávací dostihy Jejich účelem je srovnání výkonností dvou a více ročníků koní. Každému ročníku je určeno zatížení, čím mladší ročník, tím menší zatížení. Tyto dostihy mají velkou pozitivně selekční funkci. b) Dostihy s penalizací a úlevami c) Handicapy
Dostihy jsou také děleny do pěti výkonnostních kategorií značených I – V. Koně jsou do kategorií rozdělováni podle výsledků v předešlých dostizích. V kategorii I. jsou nejvýkonnější koně, naopak v V. kategorii jsou koně s nejslabší výkonností.
13
Obrázek
1
Age
of
Jape,
držitel
české
trojkoruny
z roku
2009.
(http://www.equichannel.cz/vii-den-metropolitni-sezony-88-velka-jarni-cenaholdingu-rabbit-cz)
Dále existují i překážkové dostihy, a to proutěné překážky, steeplechase a steeplechase crosscountry, ovšem tyto dostihy nejsou selekčním kritériem pro chov anglického plnokrevníka, protože skoky podstatně snižují rychlost koní a také délka dostihů bývá velmi dlouhá. •
Klusácké dostihy
Klusácké dostihy vznikly později než cvalové a využily existence propozic cvalových dostihů. Díky tomu mají podobný princip, ale odlišné handicapování. Klusáci v dostizích většinou startují v sulkách, tj. v dvoukolých vozících o váze asi 15 kg. Na rozdíl od cvalových dostihů zde není uvedena váha. Penalizace a handicap nejsou vyjádřeny hmotnostní zátěží, ale prodloužením dostihu v metrech. Dostihy s nejvyšší selekční funkcí jsou pro čtyřleté koně. Některé dostihy se startují opakovaně v jednom dostihovém dni, jsou to tzv. heaty. Podle všech výsledků za den se pak určí
14
celkový vítěz i další pořadí. Přepočtený kilometrový čas je nejdůležitějším dokladem výkonnosti klusáka (Dušek a kol., 2007).
3.1.2.6 Sportovní jezdecká výkonnost
•
Drezura Základní drezurní principy byly známé již ve starém Řecku, v období renesance
začíná historie moderní drezury. V r. 1532 založil FredericomGrisone academii, ve které se koně učili předvádění složitých a nápadných pohybů. V r. 1912 byla drezura zařazena do olympijských sportů. Cílem drezury je co nejvíce zdokonalit pohyby koně (Hermsen, 1998). Drezurní kůň by měl být korektní tělesné stavby, s dlouhým dobře nasazeným krkem, vynikající mechanikou pohybu. Předností je kůň líbivý, který je dobře vyvážený a chápavý. Drezurní obdélník má rozměry 20 x 40 m pro základní úlohy, pro obtížnější úlohy má rozměr 20 x 60 m (Dušek a kol., 2007). Drezurní kategorie se dělí dle obtížnosti cviků, které kůň vykonává: •
Z základní
•
L lehká
•
S střední
•
T těžká
Nová dvojice musí poprvé startovat v kategorii Z a podle platných pravidel se může postupně propracovat do vyšších kategorií. Drezurní úlohy jsou sestaveny z několika po sobě jdoucích cviků, které se hodnotí známkou od 0 (nebyl předveden) do 10 (vynikající). Pro hodnocení je nejdůležitější provedení daného drezurního cviku. Mezi drezurní cviky patří např. kontra cval, překroky, couvání, přeskok ve cvalu, obrat kolem zádě, zastavení, piruety, pasáž, piafa. V každé úloze se udělují známky za pravidelnost a čistotu chodů, kmih, sed a účinnost pobídek jezdce, za pozornost a důvěru koně a za celkový dojem startující dvojice (Hermsen, 1998).
15
Speciálním druhem drezury je Vysoká škola španělská, která byla založena ve Vídni roku 1729 v areálu Hofburgu. Jedná se o nejstarší jezdeckou školu, ve které se trénují pouze lipičtí hřebci podle klasických zásad. Tito koně se učí speciální a fyzicky velmi náročné prvky jako je leváda, kapriola, kurbeta apod. (Hermsen, 1998).
•
Parkur
První parkurové soutěže byly pořádány v Dublinu roku 1864. V roce 1912 se tento sport stal olympijskou disciplínou. Koně s dobrým skokem byli využívání především pro honební ježdění a v kavalerii. Momentální parkurové skákání probíhá na kolbištích o minimálních rozměrech 3200 m2 (v halách 1200 m2) a hodnotí se především výška skoku a rychlost projetí daného parkuru. Základní soutěžní kategorie se dělí dle maximální výšky překážek: •
ZM 90 cm
•
Z (základní) 100 cm
•
ZL 110 cm
•
L (lehké) 120 cm
•
S (střední) 130 cm
•
ST (středně těžké) 140 cm
•
T (těžké) 150 cm
•
TT 160 cm
Dále existují i další speciální soutěže, např. skok mohutnosti, kde se parkur postupně zvyšuje a kůň je po shození břevna skoku ze soutěže vyřazen, nebo štafetové skákání (Hermsen, 1998).
•
Všestrannost
Soutěže se může účastnit nejméně čtyřletý kůň, v těžkých soutěžích by neměl startovat kůň mladší sedmi let a vrcholovou formu mívají koně obvykle ve věku 9 – 14 let. Kůň by měl být silný, vysoký, dobře osvalený, korektní tělesné stavby, s velmi dobrou mechanikou pohybu, skokovým potenciálem a musí být také odvážný, tvrdý, 16
nebojácný a s dobrým charakterem. Nejlepší bývají koně s vysokým podílem krve anglického plnokrevníka, nebo přímo anglický plnokrevník. Závod trvá tři dny a je dělen do částí: o 1. den drezurní zkouška o 2. den terénní zkouška (1. klusový úsek, 2. steeplechase, 3. klusový úsek) o 3. den parkur (Dušek a kol., 2007)
3.1.2.7 Výkonnost v lehké zápřeži
Závody se pořádají v jednospřežích, dvojspřežích a čtyřspřežích. Koně musí mít dobrou mechaniku pohybu, velmi dobrý charakter, musí být odvážní a pracovití. Soutěž trvá tři dny a skládá se z: •
Drezurní zkoušky na obdélníku
•
Terénní zkoušky (maratonu)
•
Vozatajského parkuru (Dušek a kol., 2007)
Na počátku drezurní zkoušky rozhodčí zhodnotí celkový dojem spřežení, tj. koně, vozataje, přísedící, postroje a kočár. Drezurní zkouška se jezdí na obdélníku 30 x 60 m (pro jednospřeží a dvojspřeží) nebo 40 x 80 m (tandemové zápřeže a čtyřspřeží). Během úlohy se hodnotí správné provedení cviků, čistota a pravidelnost chodů, zručnost a držení těla vozataje, celkový klid a harmonie spřežení. Pokud vozataj zkoušku nedokončí z důvodu závady na kočáře nebo výstroji, je ze soutěže vyloučen. Terénní zkouška se jede druhý den. Jedná se o těžkou terénní jízdu, ve které se slučují drezurní i parkurové prvky. Trať je dlouhá kolem 25 km a je rozdělena na pět úseků s předepsanou rychlostí a rozdílnou náročností terénu a parkuru. Třetí, poslední den se jede parkur, ve kterém se testuje poslušnost koní a zručnost vozataje. Trať je dlouhá 500 – 800 m a obsahuje do dvaceti překážek, které musí spřežení splnit v určeném pořadí. Překážky jsou tvořeny z kuželů nebo sloupků se shazovatelnými díly, které spadnou při nárazu. Šířka mezi dvojicí kuželů je šířka stopy kočáru + 30 až 60 cm. Parkur se jede na čas a musí být minimálně absolvován v předem stanoveném časovém limitu. Konečné pořadí
17
je určeno dle součtu trestných bodů, které se sečtou za všechny tři části závodu (Hermsen, 1998).
3.1.2.8 Výkonnost v tahu
•
Jednotka výkonnosti
V technické soustavě měr je koňská síla vyjádřena v kgm za sekundu (75 kgm/s = 1k) (Dušek a kol., 2007) K hodnocení výkonnosti tažných koní lze použít několik vzorců: P=Q.f
L=P.s
N=L/t
P … tažná síla koně, Q … hmotnost taženého břemene, L … pracovní výkon, N … výkonnost f … koeficient odporu (tření), s … délka dráhy, t … čas(http://jezdectvi.ic.cz/clsport-vykonnost.html 6.4.2013) Normální tažná síla je 13 – 14% živé hmotnosti koně, ve voze se zvyšuje až na 40%(Dušek a kol., 2007). •
Normální tažná síla
Jedná se o takovou sílu, kdy kůň při určitém pracovním efektu vynakládá úměrné svalové vypětí a organismus se udržuje fyziologicky v rovnovážném stavu, přitom kůň může v takovémto stavu pracovat dlouhodobě. Jedná se o relativní tažnou sílu, vypočítá se poměrem k tělesné hmotnosti koně Prel.= P absol. . 100 / hmotnost koně. Lehká práce je do 12 %, střední 13 – 14%, těžká 15 – 18%. Normální síla tahu je 13 – 14%, ovšem při zabrání ve voze se může zvýšit až na 40 %. Pro dlouhodobé pracovní nasazení by měla být nejvyšší hranice 18%. Také z tohoto poměru vyplývá, že hmotnost koně má v tahu velký význam (Dušek a kol., 2007).
18
•
Maximální tažná síla
Je maximální dosažená hodnota v tahu. Hodnotí se při zkušebních testech, kdy se mezi postupným zvyšováním váhy dělají pauzy a kůň tak musí pokaždé při zvýšení tažné síly znovu zabrat a táhnout břemeno dál. K měření se dříve používaly siloměry, např. Sackův siloměr, Amslerův siloměr. Nyní se používají minisiloměry, které byly vyvinuty na ČVUT (Dušek a kol., 2007). •
Normotažná síla
Je dána poměrem hmotnosti koně k normované tažné síle 75 kg (Dušek a kol., 2007). •
Obtížnost práce
Vyjadřuje se v kgm : 700 000 – 1 490 000 … lehká práce 1 500 000 – 1 990 000 … střední práce 2 000 000 – 2 990 000 … těžká práce 3 000 000 a více … velmi těžká práce (Kulovaná, 2002). Toto hodnocení není zcela objektivní a umožňuje pouze srovnání podobných prací. Pracovní výkon tažného koně je velmi individuální. Záleží na věku, temperamentu, stupni výcviku, schopnostech a zkušenostech kočího (Dušek a kol., 2007).
3.2 Genetika koně 3.2.1
Genom koní
Koně (Equus caballus) byli domestikováni před 4000 až 6000 let ve stepích centrální Asie. Koňský genom obsahuje v haploidním stavu asi 2,7 miliardy párů bází.
19
Genom koně tvoří 64 chromozomů (32 párů), které obsahují 20449 kódujících genů a 2142 nekódujících genů (ensembl.org).
Obrázek 2
Standardní karyotyp koně definovaný v International Systém for
Cytogenetic Nomenclature of the Domestic Horse (ISCNH 1997)
3.2.2
Způsob zjišťování genetické informace
3.2.2.1 Odběr genetického materiálu
•
krev – 1-5 ml plné nesrážlivé krve se odebírá do jednorázové, plastové, odběrové zkumavkys antikoagulačním roztokem (citrát sodný, K3EDTA, K2EDTA, Na2EDTA), krev nesmí zmrznout. Pokud zvíře pochází z dvojčat, nelze krevní vzorek použít z důvodu chimérismu, je nutné dodat sperma nebo vzorek tkání (ušní chrupavky). 20
•
žíně, chlupy -
20-30 žíní/chlupů je potřeba zvířeti vytrhnout tak, aby
obsahovaly chlupové cibulky (pro kontrolu je třeba je prohlédnout proti světlu). DNA není možné stanovit z žíní ustřižených, vhodný není ani materiál sebraný z obojku, plochy stání, vyčesaný apod., protože jde většinou o chlupy bez cibulek nebo je vzorek kontaminován (Anonym).
3.2.2.2 Izolace DNA
První fází většiny použitých metod je izolace a purifikace DNA a její oddělení od ostatních buněčných složek odebraného vzorku. Vstupní materiál by měl být čerstvý, zamražený nebo lyofilizovaný, aby se zabránilo degradaci DNA enzymy přítomnými ve vzorku. Metody izolace DNA využívají různých principů, výběr závisí na způsobu následné analýzy DNA. Využívá se rozdílné rozpustnosti biologických makromolekul, adsorpce na pevný podklad nebo ultracenrrifugace v gradientních roztocích. Kvalita izolované DNA často rozhoduje o úspěšnosti dalšího postupu. 1) Lyze buněk a tkání – lyzi živočišných buněk lze vyvolat neiontovými detergenty, po lyzi vzorek obsahuje směs DNA, RNA, proteinů, lipidů, sacharidů a uhlovodíků. K zamezení fragmentace DNA je nutno postupovat šetrně, udržovat lyzační směs v pufrovaném médiu a chladu. 2) Přečišťování enzymy – odstranění RNA dosáhneme působením ribonukleázy, zamezení působení deoxyribonukleázy dosáhneme zahřátím vzorku na 65 C. K odstranění proteinů používáme protázy (pektináza K, pronáza E) 3) Extrakce směsí fenol-chloroform – tato směs se nemísí s vodou, používá se k odstranění
proteinů z buněčných lyzátů jejich denaturací a vysrážením a
následnou centrifugací . 4) Srážení nukleových kyselin alkoholem – po extrakci fenolem vznikne naředěný vodný roztok nukleové kyseliny zbavený proteinů, ale kontaminovaný fenolem a chloroformem. Přidáním alkoholu za přítomnosti solí dosáhneme převedení 21
DNA do malého objemu a jejího přečištění. Soli pak odstraníme promytím 70% etanolem. DNA se pak rozpustí ve vodném roztoku s pufrem Tris-HCl a EDTA (inhibitor nukleáz). Uchování nukleové kyseliny závisí na její velikosti, konformaci a dalším využití. Obvykle se uchovává při 4 C, mražení není vhodné pro lineární DNA o velikosti přesahující 20 kb, při rozmrazování se mohou lámat řetězce DNA. Pro dlouhodobé skladování roztoku DNA ve zmrazeném stavu je vhodné jej předem rozdělit do několika alikvotů. 5) Purifikace
nukleových
kyselin
chromatografií
–
lze
použít
gelovou
chromatografii, kdy se v koloně zadržují malé molekuly a DNA prochází rychleji, je možno ji použít místo purifikace DNA srážením alkoholem. Nebo lze použít afinitní chromatografii, kdy se v koloně zachycuje DNA, která se následně uvolní promytím pufrem. Nukleové kyseliny izolované pomocí chromatografických technik mají vysoký stupeň čistoty. 6) Detekce a kvantifikace nukleových kyselin – pokud je izolovaná DNA dostatečně čistá, lze odhadnout její koncentraci spektrofotometrií při vlnové délce 260 nm, kontaminace ale zkresluje výsledky. Další možností je reakce DNA
s barvivem
etidiumbromidem;
výsledný
produkt
je
detekován
fluorescenčně po ozáření ultrafialovým světlem (Šmarda a kol., 2005).
3.2.2.3 Amplifikace DNA
• Je
PCR enzymatická
amplifikace
fragmentu
DNA,
umístěného
mezi
dvěma
oligonukleotidovými primery.. (Thompson a Thompson, 2004). Primery jsou malé úseky DNA o známé sekvenci, které jsou komplementární a specifické ke zvolenému úseku DNA a jsou tvořeny zpravidla 20-25 nukleotidy. Kromě primerů je k provedení PCR třeba DNA-polymeráza a dostatečná zásoba deoxyribonukleosidtrifosfátu. (Kočárek, 2004). Tím můžeme připravit neomezené množství vyšetřovaných sekvencí DNA v násobcích miliardy kopií během několika hodin v zařízení zvaném termocycler.
22
Obrázek 3 Princip
PCR (Thompson a Thompson, 2004).
Jak je znázorněno na obrázku 3, jsou primery orientovány tak, že zahajují biosyntézu dvou nových řetězců DNA, jež jsou navzájem komplementární. Opakované cykly tepelné denaturace, hybridizace primerů a enzymové syntézy vedou k exponenciálnímu zmnožování cílové sekvence DNA (Thompson a Thompson, 2004). PCR sestává ze tří základních kroků: 1) denaturace vyšetřované dvouřetězcové DNA působením zvýšené teploty (zpravidla 92-96 °C) 2) hybridizace primerů, tj. navázání primerů na cílové sekvence vyšetřované DNA (za teploty 45-65 °C), tím je vymezen úsek DNA, který bude v dalších cyklech PCR amplifikován 3) prodlužování neboli elongace DNA působením DNA-polymerázy (při 72 °C) 23
Tyto tři kroky se cyklicky opakují, zpravidla 20-40 x. (Kočárek 2004). PCR je velmi citlivá metoda, která umožňuje provést vyšetření z velmi malého množství materiálu - např. z jediné buňky získané z kořínku chlupu (Thompson a Thompson, 2004). •
Elektoforéza
V závěru PCR získáme směs obsahující velké množství amplifikovaných fragmentů. K oddělení od zbytku DNA se využívá nejčastěji elektroforéza, založená na izolaci molekul o rozdílné hmotnosti nebo elektrickém náboji na gelu za působení stejnosměrného elektrického proudu. Z jamek na elektroforetickém gelu (agaróza, polyakrylamid) jsou záporně nabité fragmenty přitahovány ke kladné elektrodě, neboť obsahují aniontové skupiny PO4 3-. Původní neamplifikovaná DNA zůstává v jamce. Pokud se vytvoří fragmenty o rozdílné délce (reprezentující dvě různé alely), dojde na elektroforetickém gelu k jejich oddělení. Kratší úseky DNA procházejí gelem rychleji než delší. Po skončení elektroforézy se zviditelňuje poloha fragmentů DNA na gelu přidáním fluorescenčního barviva a pozorováním v UV světlu (Kočárek, 2004).
Obrázek
4
Elektroforéza
-
DNA
PCR
(http://papillomavirus.cz/diagnostika_sety_gentech.html) 24
test
firmy
GENTECH
-
Analýza PCR produktů může být provedena i jinými metodami – analýzou polymorfismů konfirmace jednořetězcových forem DNA (SSCP), hybridizací s neradioaktivně
značenou
sondou
komplementární
k části
sekvence
amplifikovaného úseku a detekcí enzymoimunoanalýzou v mikrotitrační destičce (PCR-EIA/ELISA), imobilizací PCR produktů na membráně s tečkovou hybridizací se značenými alelově specifickými oligonukleotidy (ASO), hybridizací na DNA-čipech nebo stanovením sekvence DNA (Šmarda a kol., 2005). • PCR-RFLP Při této modifikaci PCR štěpíme DNA panelem restrikčních endonukleáz. Bodovou mutaci v restrikčním místě rozpoznáme vznikem fragmentů DNA, které se separují na agarózovém gelu. Vizualizaci provádíme pomocí ethidiumbromidu. Metoda je vhodná pro geny s větším polymorfismem nebo analýzu nekódujících sekvencí (intronů). Vysoké účinnosti lze dosáhnout kombinací sesekvenací daného PCR produktu, tak lze určit i přesnou lokalizaci polymorfního místa (Knoll a Vykoukalová, 2002).
3.2.2.4 Sekvenční analýza DNA
Jednou z nepoužívanějších současných metod stanovení sekvence, neboli pořadí nukleotidů v molekule DNA, je modifikace PCR dle Sangera. Méně často se používá modifikace dle Maxama a Gilberta (Šmarda a kol., 2005, Kočárek, 2004). K sekvenaci dle Sangera se používá jen jeden ologonukleotidovýprimer, který je komplementární k počáteční oblasti sekvenovaného úseku DNA. Reakční směs obsahuje
dále
DNA-polymerázu,
deoxynukleosidtrifosfáty
(dNTP)
a
dideoxynukleosidtrifodfáty (ddNTP). Tyto syntetické nukleotidy (ddATP, ddGTP, ddCTP a ddTTP) jsou označeny fluorescenčním barvivem, každý druh jiným. Následná reakce probíhá v termocycleru – sekvenátoru obdobným způsobem jako PCR, pouze s tím rozdílem, že při začlenění ddNTP do nově tvořeného řetězce DNA se tvorba příslušného řetězce DNA v daném místě zastaví. Tak se při reakci vytvoří velký počet 25
fragmentů DNA o různé délce. Následnou elektroforézou získáme spektrum těchto úseků, které se délkou liší vzájemně o jeden nukleotid. V sekvenátoru proběhne i vyhodnocení výsledků – přesné seřazení fragmentů podle velikosti a následné automatické odečtení sekvence zkoumané DNA speciálním počítačovým programem pomocí laserového detektoru (Kočárek, 2004, Šmarda a kol., 2005).
¨) Obrázek 5 Enzymové sekvencování
DNA podle Sangera (Šmarda a kol., 2005).
Sekvenace dle Maxama-Gilberta je založena na specifickém rozštěpení molekuly DNA chemickými činidly v místech, kde je lokalizována báze určitého typu. Jako chemické činidlo se používá dimetylsulfát, hydroxid sodný, kyselina mravenčí nebo hydrazin. Poté je DNA vystavena působení piperidinu. Tak vznikají opět fragmenty lišící se v délce o jednu bázi, detekce se provádí elektroforeticky a autoradiograficky. Poslední fáze sekvencování spočívá ve vyhodnocení získaných sekvencí.
26
Provádí se: -
vyhledáním otevřených čtecích rámců, které mohou být potenciálními geny
-
vyhledáním exonů a intronů
-
vyhledáním známých motivů na DNA, charakteristických pro regulační oblasti
-
vyhledáním repetitivních sekvencí
-
vyhledáním rozpoznávacích míst pro restrikční enzymy
-
srovnáním
stanovené
sekvence
nukleotidů
se
sekvencemi
uloženými
v databankách (Šmarda a kol., 2005).
3.2.2.5 Minisekvencování
Jetechnologie určená pro ověření jednonukleotidových polymorfizmů (SNP) v sekvencích DNA a umožňuje spolehlivě odlišit jednotlivé alely genů. Principem metody je hybridizace značeného vzorku s DNA o známé sekvenci. Automatizaci metody umožňuje provádění na DNA-čipech s fluorescenčně značenými nukleotidy (microarrays) (Šmarda a kol., 2005, Knoll a Vykoukalová, 2002).
27
Obrázek 6
Varianty minisekvencování prováděné na DNA-čipu (Šmarda a kol.,
2005).
3.2.2.6 Detekce repetitivních mikrosatelitových markerů (SSR)
Častým polymorfismem nacházejícím se v genomu jsou mikrosateltovélokusy, což jsou úseky DNA tvořené opakováním jednotky o délce dvou, tří nebo čtyř nukleotidů, např. (TG )n, (CA)n, (CAA)n apod. Různé počty opakování jednotky v určitém mikrosatelitu tvoří alely tohoto lokusu – četnost je až 80 repeticí. V důsledku mutací nebo rekombinací se počet těchto repetic může zvýšit nebo snížit. K detekci se využívá SSLP-PCR
s primery
komplementárními
k unikátním
sekvencím
lemujícím
mikrostaelit(Šmarda a kol., 2005, Thompson a Thompson, 2004).
3.2.2.7 SSCP – konformační polymorfismus jednořetězcové DNA
Vzorek (produkt PCR) se nanese po denaturaci na nedenaturační polykrylamidový gel. Jednořetězcová DNA v tomto prostředí získá v závislosti na složení nukleotidů určitou specifickou konformaci, která ovlivńuje mobilitu DNA v gelu. Tak můžeme 28
separovat DNA lišící se v délce o jeden nebo více nukleotidů. Konformace DNA závisí na tepepných vlastnostech elektroforetického gelu. Metoda se hodí pro kratší fragmenty DNA. Vizualizace fragmentů se neprovádí autoradiograficky nebo barvením stříbrem (Knoll, 2002).
3.2.3
Genetické testování koní v ČR
Genetické testování koní v České republice se řídí následujícími právními normami: Podle plemenářského zákona (č. 154/2000 Sb.) provádí kontrolu zdraví a kontrolu dědičnosti zdraví vyjmenovaných hospodářských zvířat orgány státní veterinární správy podle zvláštních předpisů, tj. zákona o veterinární péči (č. 166/1999 Sb). Zákon 154/2000Sb. přikazuje stanovovat genetický typ a ověřovat původ některých kategorií zvířat. Vyhláška MZe 357/2001Sb. vyžaduje pro označení koní slovní a grafický popis ve spojení s výžehem nebo se stanovením genetického typu. Výsledek ověření původu nebo stanovení genetického typu se vyjadřuje podle par. 29, odstavce (2), vyhlášky č. 471/2000Sb. V České republice jsou oprávněna provádět stanovení genetického typu a ověřování původu koní tato tři pracoviště: - ČMSCH a.s., Laboratoř imunogenetiky, Hradištko pod Medníkem - Mendelovauniverzita v Brně, Laboratoř agrogenomiky LAG - GENSERVICE s.r.o., Brno
Laboratoř imunogenetiky ČSMCH Hlavní náplní práce laboratoře imunogenetiky ČMSCH je ověřování původu zvířat. Od roku 1968 je členem mezinárodní společnosti ISAG (International Society for Animal Genetics) s kódem laboratoře CS/H. Tato společnost pořádá každé dva roky mezinárodní srovnávací testy, původně pro testování krevních skupin, dnes mikrosatelitů, kterých se pravidelně účastní. Od roku 2004 také v mezinárodním testu 29
vyhodnocují i bodové mutace, ovlivňující zdraví a užitkovost zvířat (BLAD, CVM, SCID). Stanovení genetického typu Pro stanovení genetického typu skotu a koní platí mezinárodní "minimální“ standardní sada mikrosatelitů. Tyto mikrosatelity povinně testují všechny laboratoře, takže výsledky jsou mezinárodně porovnatelné. Je-li tedy zvíře importováno ze zahraničí, kde již bylo testováno, je jeho test použitelný pro potřeby ověřování původů i v ČR a není nutné jej přetestovávat. Laboratoř imunogenetiky ČSMCH v současné době testuje pro přesnější ověření původu ještě další mikrosatelity nad rámec povinných u skotu i koní. Testované mikrosatelity pro koně: AHT4, AHT5, ASB2, HMS3, HMS6, HMS7, HTG4, HTG10, VHL20, HMS1, HMS2, HTG6, HTG7(Anonym). V laboratoři LAG testují cekem 17 druhů mikrosatelitů.
Obrázek 7
Stanovení 17 MS lokusů koní – ukázka výstupu z automatického
analyzátoru DNA (http://www.lamgen.cz/publikace/) 30
3.2.4
Kandidátní geny
3.2.4.1 Charakteristika
Kůň představuje velmi efektivní živočišný druh stvořený k pohybu velké tělesné hmoty s velkou rychlostí a vytrvalostí nebo k vyvinutí velké tažné síly pro přepravu zboží. Navíc koňská práce, jízda, závodění a vytrvalostní výkon byla od jejich domestikace zlepšována. Koně mají řadu funkčních a strukturálních adaptací pro výjimečný atletický výkon, včetně rozvoje svalové hmoty, vysoký podíl IIA a IIB typu svalových vláken, vysokou objemovou hustotu mitochondrií, schopnost zvýšit kyslíkovou kapacitu krve, skladovací a přepravní kapacitu pro CO2, intramuskulární skladování energetických substrátů (zejména glykogenu), odbourávací kapacitu laktátu v játrech a svalech a účinné využití odpařování pro termoregulaci. Porovnáním genomu koně a lidského genomu bylo vytipováno 28 kandidátních koňských výkonnostních genů, jejichž polymorfismus je asociovaný s geny pro lidskou sportovní výkonnost. Nejvíce kandidátních genů bylo nalezeno na koňských chromozomech 4 a 12. Tyto geny se účastní dráhy regulace a adheze cytoskeletárního aktinu, interakce ligand-receptor a metabolismu vápníku. Tím mají vliv na svalovou sílu a složení, svalový metabolismus, výdrž při tréninku, hemodynamickou a aerobní metabolickou kapacitu, šlachovou a vazovou fyziologii a sportovní motivaci. Gu et al (2009) uvádí kandidátní geny pro sportovní výkon u plnokrevníků užitím populačního mapování na koňském genomu Equ2.0 (Schröder, Klostermann, Distl, 2010).
3.2.4.2 Svalová síla a složení svalu
Obecně lze říci, že nejlepších výsledků koně vykazují s velkým objemem celkové kosterní svalové hmoty v kombinaci s nízkým podílem tělesného tuku v poměru k velikosti těla. Výhodou jsou dlouhé svalové svazky a vysoký podíl rychlých a středních svalových vláken (Kearns et al., 2002). Za to zodpovídají čtyři kandidátní geny: o Acetin binding protein (alpha) actin 3 – hraje klíčovou roli při rychlé kontrakci svalových vláken ve vysokém tempu. Zdá se, že koním a lidem je společný 31
nulový polymorfismus v kódující sekvenci genu ACTN3 (R577X), kterým lze odlišit vytrvalostní sportovce od vynikajících sprinterů o Myosinelightchainkinase gen (MYLK) kóduje kalcium kalmodulin dependentní multifunkční enzym, jeho funkce není přesně známa, homozygozita u lidí v alelách 49T a 3788A způsobuje zvýšení hladiny kreatinkinázy a myoglobinu o Insulin-likegrowthfactor a myostatin Insulin-likegrowthfactor 1 (IGF1) a růstový a diferenciační faktor 8 (GDF8) také známé jako myostatin (MSTN) geny jsou v korelaci se vzrůstem svalové hmoty a sílou. IGF1 kóduje polypeptidový proteinový hormon podobný v molekulární struktuře inzulínu, který hraje velkou roli v růstu dětí a v anabolickém efektu u dospělých. GDF8 geny limitují růst tkání a zabraňují jejich nekontrolovanému růstu. Nositelé 19-CA repetice v promotorové oblasti IGF1 genu mají zvýšenou svalovou sílu. Působení GDF8/MSTN genu se projevuje jako dvojí osvalení u skotu, ovcí, psů a dalších zvířat. SNP polymorfismus v koňském MSTN genu nám umožňuje rozlišit plnokrevníky vhodné ke sprintu od jedinců vhodných pro vytrvalostní disciplíny. Plnokrevníci homozygotní pro C/C jsou lepší na krátké vzdálenosti, heterozygoti pro střední vzdálenosti a T/T homozygoti mají nejlepší vytrvalost a hodí se pro dlouhé tratě. Plemeno Quarterhorse vykazuje převahu C-alely, zatímco arabští plnokrevníci přebytek T-alely (Schröder, Klostermann, Distl, 2010).
3.2.4.3 Myostatin
Bílkovina myostatin byla objevena v r. 1997 dr. Alexandrou C. McPherron a dr. SeJin Lee (Rodgers, 2010).Myostatin je produkován svalovou tkání, která v momentu, kdydosáhne velkého objemu zvýší produkci myostatinu a tím zabrání přerůstání svalů. U několika plemen skotu, např. belgické modré a charloais, byla v šlechtění využití mutace, kdy byla část genu pro myostatindeletována a tím se stal myostatinnefunkčním. Takoví jedinci mají abnormálně vekou svalovinu zvanou též dvojí osvalení. Vliv myostatinu na růst svalů byl laboratorně prokázán na myších, kterým byly uměle upraveny geny tak, aby se myostatin plnohodnotně netvořil (Petr, 2006). 32
U whippetů, tj. plemene psů využívaných k dostihům, bylobjevena delece dvou nukleotidů myostatinu.
Heterozygoti jsou označováni jako „bullywhippets“, mají
výrazně větší osvalení a lepší výkony na dráze oproti ostatním psům. Ovšem veřejností jsou považováni za týrané psy, protože nadměrné osvalení těchto psů je spojeno s rizikem ochrnutí (Rodgers, 2010).
Z identifikačního čísla myostatinu g.66493737C>T SNP byla zjištěna DNA sekvence: ATACTGTCTTTAGAGCCAGGCTGTCATTGTGAGCAAAATCACTAGCAAT TTCTTTTATTTTGGTTCCCCAAGATTGTTTATAAATAAGGTAAATCTACTCCA GGACTATTTGATAGCAGAGTCATAAAGGAAAATTA
T/C
TTGGTGCATTATAACCTGATTACTTAATAAGGAGAACAATATTTTGAAACTG TTGTGTCCTGTTTAAAGTAGATAAAGCACTGGGTAAAGCAGGATCGCAGAC ACATGGCACAGAATCTTCCGTGTCATGCCTTCTCTGTGAAGGTGTCTGTCTC CCTTTCCT U plnokrevných dostihových koní bylo zjištěno, že zvířata mající dobré výsledky na krátkou vzdálenost, tj. pod 1400 m, mají 2x častější přítomnost alely C než jedinci s větší výdrží výborní na dlouhých distancích, tj. nad 1 600 m. Vyplývá z toho, že jedinci vhodní ke sprintům, tj. 1200 m, by měli mít alely C a C, na 1800 m C a T, nad 2100 m T a T. Také jedinci s alelami C a C měli ve dvou letech větší hmotnost než koně s alelami T a T. Ve výzkumu bylo použito 148 anglických plnokrevníků, kteří byli s ohledem na podíl svalové hmoty rozděleni do dvou skupin, a to vítěze na tratích do 1600 m a nad 1600 m (Hillet al., 2010).
33
Obrázek 8
Genotyp MSTN - C/C(modrá), C/T (červená) a T/T (zelená) ve skupině
179 zvítězivších plnokrevníků (Hill et al., 2010) Výzkum byl také prováděn u dalších plemen koní. U Quaterhorse, kteří kromě westernového využití běhají v USA sprinty na velmi krátké tratě, bylo zjištěno velké množství alel C a C, oproti tomu u 38 koní běhajících v Anglii NationalHunt bylo zjištěno veké množství alel T a T a téměř žádný výskyt alel C a C. Byl tak prokázán vliv těchto alel na rychlost a vytrvalost koní v dostizích. Byl také zjištěn vliv alely myostatinu na tělesnou stavbu koní. U jednoho trenéra bylo zhodnoceno 97 jedinců, kdy se spočítal poměr tělesné hmotnosti (kg) a výšky v kohoutku (cm). Nejvýraznější zjištění bylo, že samci s alelami C a C byli vyšší než samci s alelami T a T (Hill et al., 2010). Během analýzy DNA 12 významných hřebců, kteří běhali v letech 1764 až 1930, bylo zjištěno, že alelu C vnesla do chovu plnokrevníků jediná klisna z Velké Británie, a to před 300 lety, kdy se plemeno anglického plnokrevníka teprve utvářelo, a chovatelév Anglii spojovali ušlechtilé hřebce s místními klisnami. V 18. a 19. století alela nebyla četná, ovšem ve 20. století se začala rychle rozšiřovat, a to díky hřebci 34
Nearctic (1954 až 1973) a především díky jeho synovi NorthernDancer (1961 až 1990), kteří oba nesli variantu alely C (redakce ČRo Leonardo, 2013). V České republice působí jejich potomek Scyris, který nejen svou výkonností, ale i stavbou těla (krátkým trupem a výrazným ovalením) odpovídá alele typu C, její přítomnost u něj ovšem není prokázána. V dnešní době je možné koně nechat otestovat na Dublinské univerzitě, díky jejich projektu Koňský genom (redakce ČRo Leonardo, 2013).
Obrázek 9
Northern Dancer (http://www.farmtoysonline.co.uk/northern-dancer-
horse-19/p2415)
35
Obrázek 10
Scyris, potomek Northern Dancera působící v českém chovu. Nejlepší
sprinter historie českého turfu, 5 x získal titul Nejlepší sprinter ČR, 4x Nejlepší sprinter SR, držitel 5 časových rekordů (Bratislava (1000 m za 00:56,98), (1200 m za 01:09,36), (2200 m za 02:16,41), Velká Chuchle (1200 m za 01:09,11), Ebreichsdorf (1200
m
za
01:09,20))
(http://www.napajedlastud.cz/pdf_plemenici/scyris.pdf)
http://jearandeli.webnode.cz/products/scyris-pol-/
3.2.4.4 Svalový metabolismus a tréninková intolerance
U koní je svalový metabolismus charakterizován hustotou mitochondriální distribuce v kosterním svalu, schopností skladování glykogenu a lipidů a přenosu kyslíku. Svaly a krev koně mají vlastnosti, které zvyšují jejich toleranci k laktátu, který je nejdůležitějším faktorem způsobujícím únavu při svalů při vysoké intenzitě zátěže. Byl studován polymorfismus těchto genů: o Bradykinin beta2 receptor (BDKRB2) Bradykinin je vasodilatátor, který hraje roli při zánětu, regulaci krevního tlaku, koagulaci krve a příjmu glukózy ve svalu při zátěži.. Byla nalezena významná asociace mezi 9-bp dlouhou repeticí v exonu 1 genu BDKRB2 a 36
efektivitou svalové kontrakce u lidí a délkou běžecké tratě. Absence této tandemové repetice vede ke zvýšení aktivity tohoto genu. o Hypoxia-inducible factor-1alfa (HIF1A) o Beta2-adrenergic receptor (ADRB2) o Sceletalmuscle kreatine kinase gene (CKM) kóduje protein, který reverzibilně katalyzuje transfer fosfátu mezi ATP a kreatinem a mezi fosfokreatinem a ADP. Svalová vlákna typu I mají nižší aktivitu CKM než svalová vlákna typu II, což je výhodou pro vytrvalostní atlety. Jedinci s A/G genotypem mají lepší běžeckou efektivitu, větší adaptaci na zátěž než G/G a A/A homozygoti. o Skeletalmuscle glykogen synthase (GYS1) – ovlivňuje ukládání přebytku glukózy do polymerních řetězců glykogenu. V koňském genu GYS1 byla detekována funkční mutace, způsobující polysacharidovou myopatii (PSSM) u koní. o Vitamin D receptor gene (VDR) – kóduje receptor jádra pro vitamín D3 a také receptor pro žlučovou kyselinu. Receptor má vliv na metabolismus minerálů a regulaci mnoha buněčných cyklů, včetně imunitní odpovědi a svalové síly. Byl nalezen polymorfismus, který ovlivňuje transaktivační kapacitu, C-homozygoti mají zvýšenou transaktivační kapacitu a slabší kvadricepsy než jiné genotypy (Schröder, Klostermann, Distl, 2010).
3.2.4.5 Hemodynamická a aerobní kapacita metabolismu
Ve srovnání s jinými živočišnými druhy podobné velikosti, aerobní kapacita a příjem kyslíku u koně je vyšší díky pozoruhodné schopnosti přenosu kyslíku usnadněné strukturní a funkční adaptací koně, jako je poměrně velké srdce, vysoké hodnoty VO2max, velký srdeční výkon a vysoká koncentrace hemoglobinu. Byly studovány polymorfismy genů pro vascular endothelial growth factor, endothelial PAS domain protein-1, angiotensin I converting enzyme, haemochromatosis
37
protein, muscarinic acetylcholine receptor M2, adenosine monophosphatedeaminase 1 (Schröder, Klostermann, Distl, 2010).
3.2.4.6 Fyziologie šlach a vazů
Zatímco extensor šlachy snese pouze nízké zatížení, flexor šlachy je uzpůsoben k tomu, aby vydržel vysoké zatěžování. Šlachy a vazy koně efektivně zajišťují rychlý pohyb a přenášejí energii dlouhého kroku
končetin. Zranění šlach a vazů jsou
limitujícím faktorem pro vrcholový sportovní výkon. Byly studovány geny pro kolagen typ 1 a 5, matrix metalloproteinaázu 3 a tenascinC, dopamin-receptor, serotonin transporter, a neurotrofické faktory (Schröder, Klostermann, Distl, 2010). Kolagen je protein, který posiluje a chrání mnoho druhů tkání v těle – chrupavky, kosti, šlachy, vazy a kůži. U lidí je s rizikem zranění Achillovy šlachy asociován SNP polymorfismus genu COL5A1 a polymorfismus GT-tandemové repetice genu TNC. Nosiči alel obsahujících 12 a 14 GT-repetic jsou rizikovější pro zranění Achillovy šlachy než jedinci s alelou obsahující 13 a 17 repetic. U plnokrevníků byla nalezena pozitivní selekce genů pro různý typ kolagenu a tenascin a byly studovány SNP polymorfismy genu MMP3. Znalost polymorfismu SNP COL5A1 současně s MMP3 umožňuje odhadnout riziko ruptury šlach u konkrétního koně (Schröder, Klostermann, Distl, 2010). Bodová mutace v DRD4 genu pro dopamin receptor 4 vykazuje asociaci s mírou zvídavosti a opatrnosti u koně – nosiči alely A jsou více zvídaví než nosiči alely G, proto jsou DRD geny studovány jako kandidátní geny pro chování koní (Schröder, Klostermann, Distl, 2010).
38
3.2.4.7 Mitochodnriální DNA
Koně mají ve svalové buňce kolem 10 000 mitochondrií a každá obsahuje sadu 13 genů, které se přímo podílejí na řízení akumulace a uvolnění energie při buněčném dýchání. Vědecké poznatky z genetiky byly u anglického plnokrevníka jen velmi málo využívány a stále se spoléhalo na intuitivní meziliniové křížení, které ale chovatelům často přineslo zklamání. V dnešní době však nové objevy pozměňují tradiční plemenářskou práci a zajímavé výsledky přinesla jedna z prvních systematických studií mitochondriální DNA u plnokrevníka, která byla publikována pod názvem „ Mitochondriální DNA – důležitý mateřský příspěvek k výkonnosti plnokrevníka“ autorů S. Harrisona a Turrion-Gomeze. Autoři mohli vycházet z výsledků získaných u lidských atletů, kde byl prokázán významný vliv mitochondriálních genů na vlastní výkonnost, ale také na některé patologické projevy degenerativních onemocnění kosterních svalů, srdce i nervového systému. Pro studium mitochondriálních genů u plnokrevníka si autoři vybrali 13 nejdůležitějších pro buněčné dýchání a bylo vybráno 1000 koní pokrývajících většinu současných linií v Evropě, USA a Austrálii. U osmi z třinácti genů byla zjištěna častá variace, zatímco pět genů bylo uniformních jak pro plnokrevníka, tak pro kontrolní koně jiných plemen. Na základě osmi variabilních genů bylo určeno 17 genetických skupin. Vzhledem k dědičnosti těchto sad genů po mateřské linii se dalo očekávat, že příslušníci stejné linie budou také shodní co do příslušného mitochondriálního typu. Ve skutečnosti se ale takto určené genetické členění nekrylo s příslušností k chovným liniím. U devatenácti z třiatřiceti studovaných linií se vyskytovala nepravidelnost vylučující správnost papírových rodokmenů. Prvním výsledkem studie bylo tedy potvrzení celkem tušené skutečnosti, že plemenné knihy vedené před zavedením genetické kontroly potomstva v 80. letech obsahují značné množství chyb a jejich hodnota je více estetická a historická než plemenářská. Od zavedení genetické kontroly tak můžeme doufat, že s přibývajícím počtem generací testovaných koní bude vliv dávných chyb v rodokmenech slábnout.
39
Ze studií mitochondriálních genů dále vyplynul důležitý závěr, že není možné přesně předpovědět charakter výkonnosti u jednotlivých chovných linií, vzhledem k jejich heterogennosti. V řadě linií se vyskytuje až pět haplotypů. Proto se v dalším studiu autoři zaměřili na odhalení možného vztahu určitých mitochondriálních haplotypů s prokázanou výkonností na určitých distancích. Použité metody umožnily přiřadit jednotlivé haplotypy vítězům většiny dostihů tříletých, které se konaly ve Velké Británii na tratích od 1400 m do 2900 m v letech 1945 – 2003. Pro každý dostih byl vypočítán Race Index (RI) jako poměr procenta vítězství dosažených koňmi určitého haplotypu a procenta zastoupení tohoto haplotypu v populaci. U pěti ze sedmnácti studovaných haplotypů byla nalezena významná korelace s RI, jak názorně ukazuje graf:
Graf 1 Korelace pěti haplotypů s Race Indexem. Koně s těmito pěti haplotypy představovaly 51,6% všech koní studovaných v daném období. Z tabulky vidíme, že koně s haplotypy označenými II, XV a XVI vyhrávají především na kratších distancích a naopak nositelé haplotypů XI a IV jsou výrazně lepšími vytrvalci. U ostatních haplotypů se distanční optimum pohybovalo mezi těmito extrémy. Z výsledků je také patrné, že není haplotyp, který by měl být vyloženě z populace eliminován, a pokud nějaký takový existoval, již byl pravděpodobně odstraněn dlouhodobou selekcí plnokrevníka na rychlost. Je tedy možné použít stanovené typy mtDNA pro účelné ovlivňování distančního optima výběrem matek s vhodným haplotypem, tzn. brát pro chovatelské záměry v úvahu skutečnou 40
genetickou konstituci a nespoléhat se jen na tradované vlastnosti jednotlivých linií, které jsou ve skutečnosti geneticky nejednotné (Časopis Turf, 3/2006).
3.2.5
Pojmy
Gen – jednotka dědičnosti, v molekulárním smyslu sekvence chromozomální DNA nutná k produkci funkčního produktu Genom – kompletní sekvence DNA obsahující veškerou genetickou informaci gamety, jedince, populace nebo druhu Karyotyp – charakteristická chromozomální výbava druhu, tzn. počet a morfologie chromozomů, termín se také používá pro obraz chromozomů jedince systematicky seřazených Lokus – pozice na chromozómu obsazená genem. V lokusu se můžou vyskytovat různé formy genu (alely) Mutace – stálá dědičná změna v sekvenci geonomové DNA Genová mapa – charakteristické uspořádání genů na chromozomech Genetický marker - lokus se snadno klasifikovatelnými alelami, který může být použit v genetických studiích. Může to být gen nebo restrikční místo nebo jakákoli charakteristika DNA umožňující, aby různé verze lokusu (nebo jeho produktu) byly vzájemně rozlišeny a sledovány (Thompson a Thompson, 2004) Molekulárně genetický marker – 1) kódující exprimovaný gen s nízkou hladinou polymorfismu, může být kandidátním genem pro QTL 2) vysoce variabilní sekvence DNA (mikrosatelity a minisatelity) s vysokým stupněm polymorfismu, vhodné pro vazebné mapování genů, mohou být ve vazbě s QTL, 3) jednonukleotidové polymorfismy (SNP) (Knoll, 2002) Kandidátní gen – při hledání genu zodpovědného za vznik určitého onemocnění se jedná o gen, jehož produkt má biochemické nebo jiné vlastnosti naznačující, že by mohl být genem, který je hledán (Thompson a Thompson, 2004) 41
Haplotyp – skupina alel ve fázi coupling silně vázaných lokusů, obvykle je děden jako jednotka Polymorfismus – současná existence dvou alternativních genotypů v populaci, každého ve vyšší frekvenci, než by mohla být dosažena pouze zpětnou mutací. Lokus je považován za polymorfní, má-li vzácnější alela frekvenci 0,01 a frekvence heterozygotů je alespoň 0,02 Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (RFLP) – polymorfní odlišnosti délky sekvencí DNA mezi jedinci, které mohou být rozpoznány restrikčními endonukleázami Genetická vazba – geny na stejném chromozómu jsou ve vazbě, jsou-li v meiotickém dělení častěji předávány společně, než by odpovídalo náhodě Genetická mapa – vzájemné pozice genů na chromozomech na základě vazebné analýzy (Thompson a Thompson, 2004) QTL – lokusy genů řídící komplexní kvantitativní vlastnosti (užitkovost, výnosnost, IQ) Polymorfismus v délce sekvence (SSLP – simple sequence length polymorphism) – zahrnuje mikrosatelity (též STR – short tandem repeats a SSR – simple sequence repeat) a minisatelity (též VNTR- single nukleotide polymorphism) (Knoll 2002) Polymorfismus krátkých tandemových opakování (STR) – polymorfní lokus sestávající z variabilního počtu tandemových opakování bi-, tri- nebo tetra-nukleotidových jednotek, různé počty jednotek vytvářejí různé alely, také nazývaný jako mikrosatelitový marker, nejčastěji se u savců vyskytuje motiv (AC)n (Thompson a Thompson 2004) Konformační polymorfismus – polymorfismus konformace DNA (např. metoda SSCP, tj. konformační polymorfismus jednořetězcové DNA) (Knoll, 2002)
42
4 ZÁVĚR
V bakalářské práci je popsáno hodnocení výkonnosti koní a současný stav znalostí genomu koně ve vztahu k požadavkům šlechtění koní pro zvyšování jejich výkonnosti. Na základě studií porovnávající lidský genom a genom koně bylo vytipováno a molekulárně genetickými metodami podrobně zkoumáno celkem 28 kandidátních koňských výkonnostních genů, jejichž polymorfismus je asociovaný s geny pro lidskou sportovní výkonnost. Jedná se o heterogenní skupinu genů, jejichž exprese má vliv na svalovou sílu a složení svalu, svalový metabolismus a tréninkovou intoleranci, hemodynamickou a aerobní kapacitu metabolismu a fyziologii šlach a vazů koní. Podrobněji je rozebrán vliv genu pro myostatin na výkonnost dostihových koní. Ukazuje se, že varianty SNP polymorfismu v koňském MSTN genu nám umožňují rozlišit plnokrevníky vhodné ke sprintu od jedinců vhodných pro vytrvalostní disciplíny. Dále je popsán vliv metabolismu mitochondrií na výkonnost koně. Mitochondriální DNA se účastní řízení akumulace a uvolnění energie při buněčném dýchání. Byl prokázán vztah určitých mitochondriálních haplotypů s výkonností koně na určitých distancích. Dalším výsledkem studie bylo potvrzení skutečnosti, že plemenné knihy vedené před zavedením genetické kontroly potomstva v 80. letech obsahují značné množství nepřesností. Z tohoto přehledu jasně vyplývá, že je velkým přínosem pro šlechtitele koní, když mohou brát pro chovatelské záměry v úvahu skutečnou genetickou konstituci koní a nespoléhat se jen na tradované vlastnosti jednotlivých linií, které jsou ve skutečnosti geneticky nejednotné. Věřím, že další výzkum v této oblasti v budoucnu povede ke zkvalitnění genofondu koní na vědeckém základě.
43
5 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
Dušek J. a kolektiv, 2007: Chov koní. Brázda, Praha 8, 404 s. Hermsen J., 1998: Encyklopedie koní.RebroProductions, Praha 1, 312 s. Knoll A., Vykoukalová Z., 2002: Molekulární genetika zvířat (Metody detekc polymorfizmů DNA genů). MENDELU, Brno, 168 s. Šmarda J., Doškař J., Pantůček R., Růžičková V., Koptíková J., 2005: Metody molekulární biologie.MU, Brno, 200 s. Nussbaum, Mclnnes, Willard, 2004: Thompson & Thompson Klinická genetika. TRITON, Praha, 426 s. Kočárek E., 2005: Genetika. Scientia, 211 s. Snustad P. – Simmons M. Genetika. Brno: Masarykova univerzita Brno, 2009. 871 s. ISBN 978-80-210-4852-2. Hill, E. W., McGivney , B. A., Gu, J., Whiston, R., MacHugh, D. E. (2010). A genome-wide SNP-association study confirms a sequence variant (g.66493737C>T) in theequinemyostatin (MSTN) gene as the most powerfulpredictorof optimum racing distance forThoroughbredracehorses. BMC Genomics 11, 552: 1-29. ISSN 1471-2164 Schröder, W., Klostermann, A., Distl, O. (2011) Candidategenesforphysical performance in thehorse. TheVeterinaryJournal 190: 39–48 Gu, J., Orr, N., Park, S.D., Katz, L.M., Sulimova, G., MacHugh, D.E., Hill, E.W.,( 2009). A genome scanfor positive selection in thoroughbredhorses. PLoSOne 4, e5767 Bowling A T. -- Ruvinsky A. Thegeneticsofthehorse. Wallingford: CABI Publishing, 2000. 527 s. ISBN 0-85199-429-6. Kulovaná E., 2002: Výkonnostní zkoušky – testace výkonnosti koní [cit. 2013-0405].
Dostupné
na:
testace-vykonnosti-koni__s45x8620.html˃ 44
redakce ČRo Leonardo, 2013: Původ sprinterského genu dostihových koní [cit. 2013-04-07]. Dostupné na: < http://www.rozhlas.cz/leonardo/zpravy/_zprava/puvodsprinterskeho-genu-dostihovych-koni--1009483˃ Anonym: Lboratoř imunogenetikykoní [cit. 2013-04-15]. Dostupné na: < http://www.cmsch.cz/laborator-imunogenetiky/˃ Rodgeres B. D., Garikipati D. K.,2008: Clinical, Agricultural, and Evolutionary Biology ofMyostatin: A ComparativeReview. EndocrineRewies [cit. 2013-04-09]. Dostupné na:
. Ensembl
release
2013:
[cit.
2013-04-29].
Dostupné
na:
<
http://www.ensembl.org/Equus_caballus/Location/Genome >. Petr J. 2006: Osvalení u ovcí plemene texel vyvolává zvláštní mutace. OSEL Objective
Source
E-Learning
[cit.
2013-04-12].
Dostupné
na:
.
5.1 Seznam obrázků
Obrázek 1Age of Jape, držitel české trojkoruny z roku 2009. ................................ 14 Obrázek 2Standardní karyotyp koně definovaný v International System for Cytogenetic Nomenclature of the Domestic Horse (ISCNH 1997) ................................ 20 Obrázek 3 Princip PCR (Thompson a Thompson, 2004)......................................... 23 Obrázek
4
Elektroforéza
-
DNA
PCR
test
firmy
GENTECH
(http://papillomavirus.cz/diagnostika_sety_gentech.html) ............................................. 24 Obrázek 5 Enzymové sekvencování DNA podle Sngera (Šmarda a kol., 2005). .... 26 Obrázek 6Varianty minisekvencování prováděné na DNA-čipu (Šmarda a kol., 2005). .............................................................................................................................. 28
45
Obrázek 7Stanovení 17 MS lokusů koní – ukázka výstupu z automatického analyzátoru DNA ............................................................................................................ 30 Obrázek 8 Genotyp MSTN - C/C (modrá), C/T (červená) a T/T (zelená) ve skupině 179 zvítězivších plnokrevníků (Hill et al., 2010) .......................................................... 34 Obrázek 9 Northern Dancer (http://www.farmtoysonline.co.uk/northern-dancerhorse-19/p2415) .............................................................................................................. 35 Obrázek 10Scyris, potomek Northern Dancera působící v českém chovu. Nejlepší sprinter historie českého turfu, 5 x získal titul Nejlepší sprinter ČR, 4x Nejlepší sprinter SR, držitel 5 časových rekordů (Bratislava (1000 m za 00:56,98), (1200 m za 01:09,36), (2200 m za 02:16,41), Velká Chuchle (1200 m za 01:09,11), Ebreichsdorf (1200 m za 01:09,20))
(http://www.napajedlastud.cz/pdf_plemenici/scyris.pdf)
http://jearandeli.webnode.cz/products/scyris-pol-/ ......................................................... 36
46
