MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

BRNO 2011

IVANA SUCHÁNKOVÁ

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat

Geneticky podmíněná onemocnění u skotu Bakalářská práce

Vedoucí práce: Ing. Kateřina Kaplanová

Vypracovala: Ivana Suchánková

Brno 2011

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci na téma Geneticky podmíněná onemocnění u skotu vypracovala samostatně a pouţila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a můţe být pouţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne ……………………………………....... podpis ……………...………………………

PODĚKOVÁNÍ Tímto bych chtěla poděkovat vedoucí mé práce Ing. Kateřině Kaplanové za umoţněné konzultace, cenné rady a připomínky při zpracování této práce.

SOUHRN Holštýnský skot je nejvýznamnějším plemenem mléčného uţitkového typu. Je to plemeno prakticky celosvětově rozšířené, s čímţ se pojí i některá úskalí v podobě geneticky podmíněných chorob, jenţ se v minulých dobách dostávaly do chovů pouţíváním vyspělých biotechnologických metod, hlavně tedy pomocí inseminačních dávek elitních býků, kterými se tak snadno rozšiřovaly do světových populací holštýnských dojnic. V posledních letech jsou v chovu holštýnského skotu nejvíce rozšířena onemocnění známá jako komplex vertebrálních malformaci (CVM), syndrom deficience adhezní schopnosti leukocytů (BLAD) a relativně novým onemocněním je brachyspina syndrom (BY). K detekci a eliminaci těchto onemocnění významně přispívají genetické metody jako je PCR a PCR-RFLP. Další nedílnou součástí je spolupráce šlechtitelských společností s chovateli a veterináři. Kvalita této spolupráce se odráţí na kvalitě kontroly dědičnosti zdraví skotu v kaţdém státě. Díky této spolupráci se daří drţet geneticky podmíněná onemocnění pod kontrolou a počty přenašečů jsou v populaci relativně v nízkých procentech. Klíčová slova: holštýnský skot, genetické vady, přenašeč

SUMMARY Holstein cattle breed is the most important commercial type of dairy cattle. It is a breed practically globally widespread which is associated with some of the difficulties in the form of genetic diseases. Genetic diseases in recent time getting into breeding using advanced biotechnological methods. Especially so with insemination doses of elite bulls, which are easily expanded to the world's population Holstein cows. In recent years, however, the most common disease known as complex vertebral malformation (CVM), bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD) and relatively new disease syndrome brachyspina (BY) occur in the Holstein cattle breed. The genetics methods like PCR and PCR-RFLP contribute significantly to detect and eliminate these diseases. Cooperation with breeders breeding companies and vets is another integral part. The quality of this collaboration is reflected in the quality of health heredity control animals in every state. Genetically determined diseases managed under the control thanks to this cooperation and number of carriers at a relatively low percentage in the population.

Keywords: Holstein cattle, genetic defects, carrier

OBSAH 1 ÚVOD ............................................................................................................................ 8 1.1 Termíny a definice .................................................................................................. 9 2 CÍL PRÁCE ................................................................................................................. 10 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED ............................................................................................. 11 3.1 Přehled a stručná charakteristika významných geneticky podmíněných onemocnění skotu ....................................................................................................... 11 3.1.1 Dwarfismus .................................................................................................... 11 3.1.1.1 Dexter.......................................................................................................... 11 3.1.1.2 Hereford ...................................................................................................... 12 3.1.1.3 Aberdeen angus........................................................................................... 12 3.1.2 Komplex vertebrálních malformací (CVM, Complex vertebral malformation) ................................................................................................................................ 14 3.1.3 Fawn calf syndrom (FCS) .............................................................................. 14 3.1.4 Deficiency of uridin Monophospate Synthese (DUMPS) ............................. 15 3.1.5 Myoklonus (ICM) .......................................................................................... 15 3.1.6 Perosomus elumbis (PE) ................................................................................ 16 3.1.7 Syndrom deficience adhezní schopnosti leukocytů (BLAD, Bovine leukocyte adhesion deficiency) ............................................................................................... 16 3.1.8 Hypoplazie a vodnatelnost plic (PHA) .......................................................... 17 3.1.9 Bovinní citrullinaemie (CIT) ......................................................................... 17 3.1.10 Syndaktylie .................................................................................................. 18 3.1.11 Brachyspina syndrom (BY) ......................................................................... 19 3.1.12 Tybiální hemimelia ...................................................................................... 20 3. 2Vybraná geneticky podmíněná onemocnění v populaci holštýnského skotu ....... 21 3.2.1 Komplex vertebrálních malformací (CVM, Complex vertebral malformation) ................................................................................................................................ 21 3.2.1.1 Historie CVM .............................................................................................. 21 3.2.1.2 Fenotypový projev CVM ............................................................................. 21 3.2.1.3 Genetická charakteristika CVM.................................................................. 22 3.2.2 Syndrom deficience adhezní schopnosti leukocytů (BLAD, Bovine leukocyte adhesion deficiency) ............................................................................................... 22 3.2.2.1 Historie BLAD ............................................................................................ 22 3.2.2.2 Fenotypový projev BLAD............................................................................ 23 3.2.2.3 Genetická charakteristika BLAD ................................................................ 23 3.2.3 Brachyspina syndrom (BY) ........................................................................... 24 3.2.3.1 Historie BY .................................................................................................. 24 3.2.3.2 Fenotypový projev BY ................................................................................. 24 3.2.3.3 Genetická charakteristika BY ..................................................................... 25 3.3 Genetické metody testování chorob skotu ............................................................ 26 3.3.1 Metoda polymerázové řetězové reakce (PCR , Polymerase chain reaction) . 26 3.3.1.1 Princip metody PCR ................................................................................... 26 3.3.2 Metoda polymorfismu délky restrikčních fragmentů (PCR- RFLP, Restriction fragment lenght polymorphism) ............................................................................. 27 3.3.2.1 Princip metody PCR- RFLP ....................................................................... 27 3.3.3 Detekce vybraných onemocnění .................................................................... 28 3.3.3.1 Detekce CVM .............................................................................................. 28 3.3.3.2 Detekce BLAD............................................................................................. 30

3.3.3.3 Detekce Brachyspina syndromu.................................................................. 30 3.4 Současný stav geneticky podmíněných onemocnění v populaci holštýnského skotu v České republice .............................................................................................. 31 3.5. Současný stav geneticky podmíněných onemocnění v populaci holštýnského skotu ve světě .............................................................................................................. 32 3.5.1 BLAD............................................................................................................. 32 3.5.2 CVM .............................................................................................................. 32 3.5.3 Brachyspina syndrom .................................................................................... 32 5 PŘEHLED POUŢITÉ LITERATURY ........................................................................ 34 6 SEZNAM OBRÁZKŮ ................................................................................................. 41 7 SEZNAM ZKRATEK ................................................................................................. 42 8 PŘÍLOHY .................................................................................................................... 43

1 ÚVOD Chov skotu je důleţitou součástí zemědělské, zejména ţivočišné výroby. Důleţitým kritériem pro ziskovost tohoto odvětví je i zdravotní stav populace skotu. Problémy se zdravotním stavem ve stádech mohou způsobovat i geneticky podmíněná onemocnění. V minulosti bylo hlavní příčinou rozšíření genetických chorob pouţívání inseminačních dávek elitních býků, převáţně zlepšovatelů významných ekonomicky zajímavých znaků, jenţ takto mohli snadno šířit svůj genetický potenciál. Genetické poruchy se vyskytují u různých plemen skotu a jsou rozšířena po celém světě. Onemocnění se obvykle v jednotlivých chovech vyskytují s velmi nízkou frekvencí. Dědičnost většiny těchto onemocnění je totiţ autozomálně recesivní, coţ znamená, ţe se dědičnost neváţe na pohlaví a tudíţ je pravděpodobnost narození jedince s genetickou poruchou 25%. Z tohoto hlediska vyvstává hrozba, ţe by se během několika let, mohly recesivní alely pouţíváním heterozygotů (přenašečů) v chovech masivněji rozšířit a způsobit nejenom škody ekonomické, ale také chovatelské. Ekonomické škody zahrnují zmetání (většinou ve druhé polovině březosti), porod mrtvého nebo postiţeného telete a s tím související i zhoršení reprodukčních ukazatelů. Chovatelské škody mohou zahrnovat zaniknutí vynikajících linií, v nichţ by bylo onemocnění dobře ukotveno. Takovéto opatření bylo například jiţ pouţito u onemocnění dwarfismus u plemene hereford v USA. Většinu chorob se však jiţ daří za pomoci chovatelů a veterinárních lékařů úspěšně eliminovat. Tato práce popisuje vybraná geneticky podmíněná onemocnění jako je: dwarfismus, fawn calf syndrom (FCS), vrozený myoklonus (ICM, původním názvem dědičný neuroaxiální edém), perosomus elumbis (PE), hypoplazie a vodnatelnost plic (PHA), syndaktylie, tybiální hemimelie, deficience of uridine monophosphate synthese (DUMPS), bovinní citrullinaemie (CIT). A podrobněji se zabývá onemocněními komplex vertebrálních malformací (CVM), deficience adhezní schopnosti leukocytů u skotu (BLAD) a brachyspina syndrom (BY) v populaci holštýnského skotu.

8

1.1 Termíny a definice  Alely jsou konkrétní varianty genu, kterými se gen projevuje ve fenotypu. Kaţdý gen v populaci můţe existovat ve formě jedné i více alel, alely potom tvoří alelickou sérii. V tělní buňce je gen zastoupen dvěma alelami, kaţdé na párovém chromozomu. Dominantní alela převládá ve svých účincích, svou bílkovinou či enzymem v buňce. Recesivní alela ustupuje ve svých účincích, svou bílkovinou, či enzymem v buňce.  Dusíkaté báze u kyseliny DNA jsou to Adenin, Thymin, Guanin a Cytosin. U RNA jsou totoţné, pouze kromě Adeninu je zde Uracil. Dusíkaté báze jsou součástí nukleotidů a jejich pořadí ve vlákně DNA či RNA je podstatou genetické informace (LORENC, 2002).  Endonukleáza je enzym, který štěpí fosfodiesterovou vazbu nukleotidového řetězce.  Exon je segment nerozděleného úseku genu, který se při postranskripční úpravě sestřihem nevyštěpuje a zůstává přítomen v mRNA (mediátorová RNA).  Fenotyp je vnější projev genotypu, na jehoţ vytváření se v různé míře podílí vliv vnějšího prostředí (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002).  Genová frekvence udává procentické zastoupení alel jednoho genu v populaci (LORENC, 2002).  Genetické markery jsou alely genů nebo polymorfismy DNA pouţívané jako experimentální sondy k zjištění informací o jedinci, tkáni, buňce, jádře chromozomu nebo genu.  Genotyp vyjadřuje genetický základ jedince.  Lokus je místo v chromozomech, kde je umístěn určitý gen (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002).  Mutace je náhlá a neusměrněná změna genotypu. Např. genová nebo chromozomová.  Nukleotid je základním článkem genetické informace, který je tvořen cukrem deoxyribózou nebo ribózou, kyselinou fosforečnou a jednou s dusíkatou bází (LORENC, 2002)  Primer je oligonukleotid skládající se obvykle z 18-22 nukleotidů. Zahajuje syntézu při PCR (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002).

9

2 CÍL PRÁCE Cílem mé bakalářské práce je zpracovat literární přehled o dosud známých poznatcích vybraných geneticky podmíněných onemocnění (komplex vertebrálních malformací, syndrom deficience adhezní schopnosti leukocytů a brachyspina syndrom) v populaci holštýnského skotu. Přiblíţit morfologické znaky onemocnění, původ onemocnění, metody eliminace a testování těchto onemocnění a současný stav přenašečů onemocnění v České republice a ve světě.

10

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Přehled a stručná charakteristika významných geneticky podmíněných onemocnění skotu Geneticky podmíněná onemocnění bývají často s autozomálně recesivní dědičností, coţ znamená, ţe nejsou vázána na pohlaví a aby se choroba projevila musí být oba rodiče přenašeči, tudíţ heterozygoty. Je tedy 25 % pravděpodobnost ţe se choroba u potomka projeví (LORENC, 2002).

3.1.1 Dwarfismus Dwarfismus se vyskytuje u mnoha druhů savců, včetně několika plemen skotu. Je to autozomálně recesivní onemocnění, které bylo popsáno u aberdeen anguse, dextera, hereforda, shorthorna, japonského hnědého skotu, švýcarského hnědého skotu, dánského červeného skotu a holštýnského skotu. Ačkoli jsou fenotypové projevy variabilní, tak se všechny případy vyznačují zkrácením a deformitou končetin, hlavy a páteře. Zakrslost je u těchto plemen způsobena genetickou mutací, ale nemusí být příčinou všech bovinních zakrslostí. Z tohoto důvodu by měla být prováděna pečlivá vyšetření nebo pitvy, aby se vyloučila moţná negenetická příčina. Například v severovýchodní

Victorii

byla

zakrslost

skotu

zapříčiněna

dyschondroplazií

způsobenou vrozeným nedostatkem manganu u skotu (WHITLOCK et al., 2008). Dyschondroplazie je vývojové onemocnění projevující se špatnou osifikací chrupavek, deformací kostí a poruchou růstu postiţeného jedince a proto bylo zaměněno s dwarfismem (KUMMER, FALDÍKOVÁ, 2002). Také přetrvávající infekční průjmy mohou být příčinou zakrslosti telat, která můţe být chybně diagnostikována jako dwarfismus.

3.1.1.1 Dexter U plemene dexter je toto onemocnění známé jiţ od počátku 19. století. Jedinec plemene dexter, který je recesivním homozygotem představuje tzv. buldočí fenotyp, který je neţádoucím projevem onemocnění. Naproti tomu heterozygoti, zvířata středně zakrslá jsou z chovatelského hlediska ţádoucí. Chovatelé tedy tímto poţadavkem udrţují letální alely v populaci ve vysoké frekvenci. Recesivní homozygotnost je tedy

11

pro plemeno dexter letální a březost obvykle bývá ukončena v 7. měsíci ţivota plodu. Klinickými příznaky postiţení jsou nepřiměřená zakrslost, krátká páteř, velké břišní kýly, poměrně velká hlava, rozštěp patra a vyčnívající jazyk. U plemene dexter se jedná o mutaci v ACAN genu (aggrecan) (WHITLOCK et al., 2008). Aggrecan je hlavní strukturální součást extracelulárního matrix chrupavky a konkrétním produktem genu diferencovaných chondrocytů (DOEGE et al., 1994). Screening odhalil, ţe první mutace se nachází v exonu 11, ta je častější a druhou, která se nalézá v exonu 1 (CAVANAGH et al., 2007).

3.1.1.2 Hereford U plemene hereford bylo do populace toto onemocnění zavlečeno v roce 1900 prostřednictvím býka St. Louis Lad. V té době ještě nebylo jasné, jaký dopad bude mít St. Louis Lad a jeho 222 potomků na plemeno v Americe, Kanadě, Mexiku a Austrálii. O několik desítek let později bylo na American Hereford Association (AHA) hlášeno stále více případů zakrslých jedinců tohoto plemene. Poté vyšlo najevo, ţe recesivní alela, odpovědná za dědičnou formu zakrslosti byla nesena St. Louis Ladem a v chovu je jiţ dobře fixována. Recesivní homozygoti jsou popisováni jako krátká a hranatá zvířata s deformovanými nosními cestami, výsledkem je stlačený vzhled hlavy a typické zvuky při dýchání. V roce 1956 bylo v USA identifikováno na 50 000 zvířat postiţených tímto onemocněním. V dnešní době je však prostřednictvím důkladné rodokmenové analýzy a chovatelských opatření dwarfismus prakticky vyloučen z chovu hereforda. Vzhledem k tomu, ţe je defekt obtíţné prokázat, byly v chovu tohoto plemene odstraněny celé linie.

3.1.1.3 Aberdeen angus Dwarfismus u plemene aberdeen angus byl poprvé popsán v roce 1951. American Angus Association (AAA) zvládla problém stejně jako AHA. Po veterinárněchovatelských opatřeních vedoucích k odstranění zakrslosti nebyly od roku 1970 do roku 2002 u registrovaných zvířat plemene aberdeen angus hlášeny ţádné případy tohoto onemocnění. Na počátku 21. století však bylo několik abnormálních telat nahlášeno ve státech na západě USA. Na rozdíl od předchozí formy zakrslosti se telata po narození jevila na první pohled normální. Avšak špatně rostla a po několika měsících se zjistilo, ţe mají abnormálně krátké nohy a silné orgány. Všechna postiţená telata

12

měla v rodokmenu stejnou plemenici, která byla pouţívána k embryotransferu. Čtyři telata byla poslána do veterinární diagnostické laboratoře k pitvě. Dvě na univerzitu v Nebrasce a dvě na univerzitu do Washingtonu. Hrubá a histopatologická zkoumání potvrdila sníţenou endochoriální osifikaci a další projevy dwarfismu. Obě tyto univerzity charakterizovaly telata jako zakrslá zvířata s prodlouţenou nosní částí (viz Obr.1). V roce 2002 Dr. James Reecy, genetik na Státní univerzitě v Iowě, získal DNA od tří generací předků postiţených telat, coţ slouţilo jako výchozí bod pro identifikaci vadného genu. Byly vybrány přenašečky dwarfismu (kráva a jalovice) a byly zapuštěny spermatem býka High Valley (narozen 1997), který je také přenašečem tohoto onemocnění. Byl proveden embryotransfer, který měl za úkol vyprodukovat zakrslá telata. To umoţnilo, aby byl Dr. Reecy schopen určit, ţe onemocnění u plemene aberdeen angus nezpůsobuje stejná mutace jako např. u dextera. Skot měl vadný gen protein kinázu (PRKG2), jehoţ normální funkce umoţňuje zrání chondrocytů. Takto postiţený jedinec mezi svými vrstevníky neroste. Má zkrácené končetiny, ale tělo je normální velikosti. Je to způsobeno nesprávnou endochoriální osifikací a předčasnou kalcifikací chondrocytů (WHITLOCK et al., 2008).

Obr.1 Dwarfismus u plemene aberdeen angus. Foto: Dr. J. Reecy

13

3.1.2 Komplex vertebrálních malformací (CVM, Complex vertebral malformation) Komplex vertebrálních malformací spolu se syndromem deficience adhezní schopnosti

leukocytů

(BLAD)

jsou

významnými

geneticky

podmíněnými

onemocněními v chovu holštýnského skotu. CVM je zaloţeno na jednonukleotidovém polymorfismu. Testování přenašečů tohoto onemocnění se provádí ve většině populací holštýnského skotu, avšak četnost přenašečů je ve světovém měřítku stále poměrně vysoká (SCHUTZ et al., 2008). Tato genetická porucha bude podrobněji popsána v dalších kapitolách.

3.1.3 Fawn calf syndrom (FCS) Fawn calf syndrom je nedávno popsané onemocnění u plemene aberdeen angus (viz Obr.2). Poprvé bylo zaznamenáno v Austrálii, USA a několika dalších zemích. Jako fawn syndrom bylo onemocnění nazváno kvůli pozici zadních nohou u telat po narození. Genetický charakter onemocnění poprvé připustil Carel Teseling z Australské angus společnosti (ASA). Od roku 2001 se provádějí vyšetření zahrnující ověření parentity, rodokmenovou analýzu, fyzikální vyšetření, pitvu a kvantitativní analýzu počítačovou tomografií skenující postiţená telata a jejich normální vrstevníky. Hlavním rysem FCS je vrozená svalová kontraktura, jenţ vede k omezení pohybu proximálního kloubu především na pánevních končetinách. Abnormální svalová kontraktura výrazně klesá s rostoucím věkem telete, ale vývoj svalů zůstává špatný. Australští vědci popisují tyto jedince v dospělosti jako vysoké a hubené. Váţně postiţená telata mohou mít skoliózu vedoucí k oboustranně asymetrické konformaci pánevních končetin. Takto postiţená telata v raném věku umírají nebo jsou vyřazena. Méně závaţné případy mohou přeţít do dospělosti se zjevně normální plodností. Toto onemocnění má pravděpodobně jednoduchý recesivní způsob dědičnosti. Přestoţe pitva můţe poskytnout další informace, stanovit diagnózu FCS je moţné po pečlivém klinickém vyšetření. Charakteristickými znaky je jiţ zmíněná vrozená svalová kontraktura proximálního kloubu na pánevních končetinách, dále kyfózy aţ skoliózy, arachnodaktylie a svalová hypoplazie. Všechna FCS telata s rodokmenem narozená v Austrálii jsou spojována v souvislosti se čtyřmi býky z USA, jejichţ sperma bylo do Austrálie dovezeno. Aktuální výskyt FCS v populaci aberdeen angus v USA není znám (WHITLOCK et al., 2008).

14

Obr.2 Fawn calf syndrom u telete plemene aberdeen angus. Foto: Australian FCS group.

3.1.4 Deficiency of uridin Monophospate Synthese (DUMPS) Nedostatek uridin monofosfát syntázy je recesivní genetická porucha. Uridin-5monofosfát syntáza (UMP) je nezbytná pro novou syntézu pyrimidinových nukleotidů, které jsou součástí DNA a RNA (MEYDAN et al., 2010). Růst a vývoj plodů homozygotně recesivních telat je zastaven, coţ vede k embryonální úmrtnosti zhruba 40 dní po zapuštění (SHANKS a ROBINSON, 1990;. ROBINSON et al, 1993). V USA bylo testování býků na DUMPS zahájeno v roce 1988. Bylo zjištěno, ţe všichni přenašeči tohoto onemocnění jsou potomky elitního amerického býka Skokie Sensation Ned narozeného v roce 1957 (SCHWENGER et al., 1994).

3.1.5 Myoklonus (ICM) Onemocnění myoklonus, původně známé jako dědičný neuroaxiální edém je autozomálně recesivní porucha, popsaná u telat plemene hereford a jejich kříţenců. Postiţená telata trpí neovlivnitelnými záškuby svalu nebo skupiny svalů, které vznikají buď spontánně, nebo jsou vyvolány hmatovými, vizuálními nebo sluchovými podněty. Telata se rodí předčasně, ale tyto svalové záškuby se mohou u telat vyskytovat jiţ v děloze. Záškuby mohou v děloze s velkou pravděpodobností způsobovat zlomeniny stehenních kostí nebo dokonce vazu. Telata, která přeţijí toto prenatální období jsou po porodu ostraţitá, ale neschopná se postavit. Takto postiţené jedince je doporučené utratit. U porodů bez dozoru telata do několika hodin umírají. ICM skotu je přičítáno váţnému narušení zprostředkování neurotransmise glycinu v míše. V Austrálii se odhaduje frekvence přenašečů (heterozygotů) na 1-2 %. Bohuţel 15

v současné době DNA test pro ICM není komerčně dostupný (WHITLOCK et al., 2008).

3.1.6 Perosomus elumbis (PE) Perosomus elumbis se nejčastěji vyskytuje u skotu (viz Obr.3). Onemocnění bylo však také popsáno i u malých přeţvýkavců a prasat. Ekvivalent se vyskytuje také u lidí jako syndrom kaudální regrese. Je to soubor vrozených vad zahrnující agenezi bederních obratlů a míchy, artrogrypózou, ztuhlost zadních končetin, vady měkkých tkání dutiny břišní, urogenitálního a anorektálního systému. Postiţená telata se rodí mrtvá nebo umírají jiţ v prenatálním vývoji. Etiologie této nemoci není známa. Avšak Dr. H. Leipold ověřil, ţe je toto onemocnění dědičné, tedy alespoň u holštýnského plemene, kde se během let 1986- 1992 setkal s 25 případy (WHITLOCK et al., 2008).

Obr.3 Perosomus elumbis u holštýnského telete. Foto: Dr. Dean Percy 3.1.7 Syndrom deficience adhezní schopnosti leukocytů (BLAD, Bovine leukocyte adhesion deficiency) Syndrom deficience adhezní schopnosti leukocytů je, stejně jako komplex vertebrálních malformací, zaloţen na jednonukleotidovém polymorfismu. Je také stejně jako komplex vertebrálních malformací velkým problémem ve světové populaci holštýnského skotu (SCHUTZ et al., 2008). Onemocnění bude podrobněji popsáno v dalších kapitolách.

16

3.1.8 Hypoplazie a vodnatelnost plic (PHA) Hypoplazie a vodnatelnost plic je letální autozomálně recesivní onemocnění charakterizované zejména dystokií, vodnatelností, smrtí telete a nezřídka smrtí nebo onemocněním krávy. Nejviditelnějším příznakem nemoci je vodnatelnost, telata jsou velká, coţ vyţaduje porod císařským řezem (viz Obr.4). Dále je porucha charakterizována

nepřítomností

plicní

tkáně

(plicní hypoplazie),

chybějícími

lymfatickými uzlinami a cévami a athymií. Toto onemocnění popsal Dr. Chuck Hannon, který identifikoval tři různé typy deformací telat. Původně bylo onemocnění identifikováno u plemen maine-anjou, shorthorn a jejich kříţenců. Zjevná souvislost je se třemi plemennými býky maineanjou. Býci Draft Pick (narozen 1989), Stinger (narozen 1985) a Chianina (narozen 1992) (WHITLOCK et al., 2008).

Obr.4 Hypoplazie a vodnatelnost plic, Foto: Dr. Lana Kaiser

3.1.9 Bovinní citrullinaemie (CIT) Bovinní citrullinaemie je autozomálně recesivní porucha metabolismu močoviny v důsledku nedostatečné činnosti argininosukcinátsyntetázy syntázy (ASS). Postiţená homozygotní telata nejsou schopna vylučovat amoniak a vykazují neurologické symptomy, které se postupně zhoršují, coţ vede k úmrtí telat zhruba do jednoho týdne po porodu (GRUPE et al., 1996). Tato porucha byla poprvé popsána v populaci holštýnského skotu v Austrálii. Telata vypadají bezprostředně po porodu zcela normálně. Avšak druhý den po porodu jsou skleslá a špatně přijímají mlezivo. Třetí den jsou telata často pozorována, jak bloumají po kotci nebo stojí s hlavou přitlačenou

17

na plot nebo zeď. Mezi 3. a 5. dnem nemoc postupuje velmi rychle. Pokud jsou jedinci recesivními homozygoty, obvykle umírají během 7 dnů ţivota. Bovinní citrullinaemie je způsobena přechodem cytosinu na thymin v 86. kodonu genu, který kóduje ASS a vede k poškození metabolismu močoviny. V australské populaci holštýnského skotu bylo onemocnění rozšířeno dovozem spermatu z USA od býka Linmack Kriss King (MEYDAN et al., 2010).

3.1.10 Syndaktylie Syndaktylie u skotu se vztahuje ke srůstu prstů paznehtu (viz Obr.5). Tato porucha nejčastěji postihuje pravou přední končetinu. Proximální část končetiny můţe být také postiţena, coţ se projevuje sníţením počtu sezamských kostí. Syndaktylii lze u embrya diagnostikovat jiţ 37.- 40 den březosti. Toto onemocnění je autozomálně recesivní s neúplnou penetrací (79% u holštýnského skotu) a variabilními projevy. Experimenty v kříţení plemen aberdeen angus a holštýn přinesly potomstvo se syndaktylií, coţ naznačuje společné místo odpovídající za poruchy obou plemen. V roce 1996 byl u skotu nalezen lokus syndaktylie na chromozomu 15 a je patrný v mutaci nízké hustoty lipoproteinového receptoru souvisejícího proteinu LPR4. Výskyt tohoto onemocnění vrcholil v roce 1970 u zvířat selektovaných na vyšší produkci mléka a mléčného tuku. Vývoj a pouţívání genetického testování výrazně sníţil výskyt syndaktylie. Bohuţel v dnešní době se syndaktylie ještě občas vyskytuje v chovech holštýnského skotu a některá zvířata přenášející toto onemocnění jsou stále zařazena v chovu. Vymýcení syndaktylie bude vyţadovat přesnou metodu pro detekci kauzální genetické mutace. Dvě nejčastější mutace jsou specifická mutace exonu 33 u plemene holštýn a mutace exonu 37 u aberdeen angus. Protoţe ne všechny kauzální mutace byli zjištěny, tak je genetické testování přenašečů stále obtíţné (WHITLOCK et al., 2008).

18

Obr.5 Pazneht postižený syndaktylií. Foto: B.K. Whitlock 3.1.11 Brachyspina syndrom (BY) Brachyspina syndrom je poměrně novým a stále častěji hlášeným geneticky podmíněným onemocněním v populaci holštýnského skotu (WHITLOCK et al., 2008) (viz Obr.6). Etiologie tohoto onemocnění není doposud známa, ale její výskyt v chovech geneticky příbuzných, avšak fenotypově normálních zvířat můţe naznačovat ţe se jedná o autozomálně recesivní onemocnění. Brachyspina můţe být novou hrozbou pro celosvětovou populaci holštýnského skotu (ARGEHOLM, PEPPERKAMP, 2007). Brachyspina syndrom bude podrobněji popsán v dalších kapitolách.

Obr.6 Holštýnské tele postižené brachyspina syndromem. Foto: J.S. Agerholm

19

3.1.12 Tybiální hemimelia Onemocnění bylo poprvé popsáno v roce 1951 ve Skotsku, v chovu skotu plemene galloway. Je to smrtelná autozomálně recesivní porucha projevující se deformací skeletu, především zkrácenou nebo chybějící holení, břišní kýlou, kryptorchismem, hirsutismem. Telata se rodí mrtvá nebo umírají krátce po narození (viz Obr.7). Fenotyp heterozygota (dlouhá chundelatá srst a rovné končetiny) je ţádoucí a tak časté pouţívání populárních plemeníků vedlo k inbreedingu a zvýšení frekvence alely selektivním tlakem. Defektní mutace byla dohledána k irskému býkovi Deerpark Improver (narozen 1972), který byl dovezen ze Severní Ameriky. Deerpark Improver byl v USA značně pouţíván a u Americké Shorthorn asociace bylo registrováno 635 přímých potomků (WHITLOCK et al., 2008).

Obr.7 Tybiální hemimelia u telete plemene galloway. Foto: Dr. Chuck Hannon

20

3. 2Vybraná geneticky podmíněná onemocnění v populaci holštýnského skotu 3.2.1 Komplex vertebrálních malformací (CVM, Complex vertebral malformation) 3.2.1.1 Historie CVM Toto onemocnění bylo poprvé popsáno v roce 1999 v populaci holštýnského skotu v Dánsku. Zanedlouho byla přítomnost CVM zaregistrována i ve Spojených státech amerických (DUNCAN et al, 2001), Spojeném království (REVELL, 2001), Nizozemsku (WOUDA et al, 2000) a v Japonsku (NAGAHATA et al, 2002). Mutace CVM byla zpětně dohledána k americkému plemeníkovi Carlin- M Ivanhoe Bell, posléze bylo zjištěno ţe přenašečem byl jiţ jeho otec Penstate Ivanhoe Star (ČÍTEK, et al.,2006). Carlin-M Ivanhoe Bell byl elitním holštýnským býkem, který byl po dvě desetiletí pouţíván v chovu mléčného skotu po celém světě především z důvodu vyšší uţitkovosti jeho dcer (WHITLOCK et al., 2008). Důsledkem je velmi vysoký počet příbuzných zvířat na tohoto býka (PETERSEN, 1999). Z tohoto případu je zřejmé, ţe pouţití relativně malého počtu kvalitních býků sice můţe zvyšovat uţitkové vlastnosti ve stádě, ale tato strategie zvyšuje riziko výskytu recesivních mutací (THOMSEN et al., 2006). Přenašeči CVM se v dnešní době vyskytují po celém světě (WHITLOCK et al., 2008).

3.2.1.2 Fenotypový projev CVM CVM je provázeno větším mnoţstvím fenotypových abnormalit. Typické znaky CVM jsou zkrácený krk a hrudní končetiny, bilaterální mírné staţení zápěstních kloubů, váţné zkrácení a mírná laterální rotace nártových spojů. Pánevní končetiny vykazují bilaterální symetrické kontrakce nártových kloubů s mediální rotací pánevních končetin. U všech končetin bylo pozorováno prodlouţení nártu. Vertebrální abnormality zahrnují fůzi posledních dvou krčních obratlů a distorzi prvních tří obratlů, coţ vede v tomto místě k mírné skolióze (viz.Obr.8). Srdeční vady byly popsány asi u 50% postiţených telat (např. intervertikulární defekty septa, dextropozice aorty, hypertrofie pravé komory) (AGERHOLM et al, 2001, 2004;. DUNCAN et al, 2001. REVELL, 2001) Genetická etiologie onemocnění je známa, protoţe k výskytu CVM docházelo po kříţení geneticky příbuzných jedinců. Telata se rodí předčasně, zpravidla mezi 250. 21

a 280. dnem březosti. Chovatelské statistiky prokázaly sníţenou plodnost plemenic zapouštěných přenašeči tohoto onemocnění. Sníţená plodnost je nejspíš důsledkem zvýšené úmrtnosti plodů s CVM (AGERHOLM et al., 2001).

Obr.8 Komplex vertebrálních malformací u holštýnského telete. Foto: J.S. Agerholm

3.2.1.3 Genetická charakteristika CVM Způsob dědičnosti CVM je autozomálně recesivní (KANAE et al., 2005). Pomocí porovnávání sekvencí zdravých a postiţených telat byla odkryta bodová mutace produktu

genu

SLC35A3

(solute

carrier

family

35

member

3,

UDP-N-

acetylglukosamine transporter) na pozici 559 v podobě transverse guaninu na thymin, kde je ve výsledném proteinu BTA3 tohoto genu valin nahrazen fenylalaninem. Produkt genu SLC35A3 je nosičem Golgiho komplexu, který rozhoduje o vzniku glykoproteinů a vývoji axiálního skeletu (WHITLOCK et al., 2008). Gen SLC35A3 je sloţen ze 6 exonů (SCHUTZ et al., 2008). Specifická mutace se nachází na exonu 4 (KANAE et al., 2005).

3.2.2 Syndrom deficience adhezní schopnosti leukocytů (BLAD, Bovine leukocyte adhesion deficiency) 3.2.2.1 Historie BLAD Molekulárně biologické příčiny vzniku onemocnění byly poprvé popsány v roce 1992. Zavlečení mutace do celosvětové populace holštýnského skotu lze zpětně dohledat ke slavnému plemeníkovi Osborndale Ivanhoe, který uhynul roku 1963

22

(SCHUSTER et al., 1992). Onemocnění BLAD však bylo ve vzorcích krve zjištěno aţ v roce 1977 (GILBERT, et al., 1993). V této době byly jiţ k dispozici jednoduché DNA testy (BATT et al.,1993, TAMMEN et. al., 1996), které začaly být pouţívány při rutinním testování v chovatelských programech a tím byla frekvence výskytu alely BLAD v chovu holštýnského skotu výrazně sníţena (SCHUTZ et al., 2008).

3.2.2.2 Fenotypový projev BLAD Neutrofily cirkulující v krvi se stahují do místa akutního zánětu. Nábor neutrofilů do místa zánětu vyţaduje, aby migroval přes kapilární endotel subendoteliální membrány. Přilnavost molekul vyjádřená jak neutrofily, tak endoteliálními buňkami je důleţitá při této adhezní interakci (NAGAHATA et al., 1993). Špatná přilnavost leukocytů vede k neudrţení imunity sliznic a vzniku onemocnění (NAGAHATA, 2004). Mezi nejvýznamnější projevy patří vředy na sliznici dutiny ústní, zánět dásní, vypadávání zubů (paradontóza), chronický zánět plic, zhoršené hojení ran, nechutenství, chronický průjem a chronické dermatitidy. Na tyto projevy onemocnění zvíře uhyne (SCHUTZ et al., 2008).

3.2.2.3 Genetická charakteristika BLAD BLAD je autozomálně recesivní onemocnění (viz Tab.1) vyznačující se sníţenou úrovní exprese β2 heterodimerického integrinu. Integriny jsou adhezní molekuly, které zprostředkovávají průchod neutrofilů přes membrány a ničí patogeny (KEHRLI et al., 1992). Porucha je způsobena bodovou mutací v genu ITGB2 (β2 integrin), kterou způsobuje aminokyselina na pozici 383 (β2 integrinu) nacházející se na výsledném proteinu BTA1 mezi pozicemi 131892340 a 131863180 skládající se ze 14 exonů (SHUSTER et al., 1992). Tato čísla odkazují na aktuální chromozomální umístění genové sekvence ITGB2 v genomu skotu (SCHUTZ et al., 2008). Tab.1- Příklad dědičnosti BLAD (LORENC, 2002)

otec BL (genotyp TLbl)

kráva BL (genotyp TLbl) alela TL alela bl TLTL TLbl TLbl blbl

alela TL alela bl

23

3.2.3 Brachyspina syndrom (BY) 3.2.3.1 Historie BY Genetická vada brachyspina byla poprvé popsána společně v Holandsku tamním veterinárním dozorem a v Dánsku univerzitou v Kodani. V roce 2007 popsal holandský patolog Peperkamp a jeho dánský kolega Agerholm anatomické změny při pitvách 4 mrtvě narozených telat- jednalo se o zkrácení míchy, prodlouţení končetin a jako nejvýraznější změny byly dále popsány patologické změny na vnitřních orgánech. Všem čtyřem pitvaným telatům byl dohledán společný předek. Dalším výzkumem mezinárodní šlechtitelské společnosti CRV se prokázalo, ţe přenašečem vady je býk Sweet Haven Tradition a také jeho velmi pouţívaný syn Bis- May Traditon Cleitus (ANONYM, 1999).

3.2.3.2 Fenotypový projev BY Brachyspina syndrom je charakterizován narozením mrtvého telete po mírně prodlouţené březosti. Hrubá morfologie je podobná letálnímu syndromu krátké páteře (SSLS). Porucha SSLS byla poprvé popsána u telat v Norsku v roce 1930. Argeholm et al., 2006 pouţívá termín brachyspina k popisu varianty SSLS. Telata s brachyspina syndromem jsou růstově retardovaná, s výrazným zkrácením celé páteře (viz Obr.9) a končetin, které se však jeví jako dlouhé a štíhlé (WHITLOCK et al., 2008). Po provedení radiografie a počítačové tomografie byly tyto malformace páteře prokázány. Kromě toho při pitvě byly zjištěny malformace, ledvin, varlat a srdce. Pomocí histologického vyšetření byly dále popsány chybějící nebo neúplně rozvinuté meziobratlové ploténky a úplné nebo částečné roztavení epifýz sousedních obratlů. Některé diafýzy přilehlých obratlů byly zničeny v důsledku nedostatku epifýzy a meziobratlových plotének (AGERHOLM et al., 2006).

24

Obr.9 Malformace páteře typické pro brachyspina syndrom. Foto: J.S. Agerholm

3.2.3.3 Genetická charakteristika BY Dědičnost tohoto onemocnění není dosud známa. Hypotézu autozomálně recesivní dědičnosti je moţné navrhnout, ale dosud nebyla prokázána. V norské studii byla podobná autozomálně recesivní porucha zjištěna (SSLS), coţ prokázalo, ţe tento typ malformace můţe být dědičný (AGERHOLM et al., 2006). Pokud je brachyspina autozomálně recesivní onemocnění tak je moţné, ţe se začne rozšiřovat v chovech holštýnského skotu po celém světě (WHITLOCK et al., 2008).

25

3.3 Genetické metody testování chorob skotu 3.3.1 Metoda polymerázové řetězové reakce (PCR , Polymerase chain reaction) 3.3.1.1 Princip metody PCR Metoda PCR slouţí k získání dostatečného mnoţství specifické DNA pro další analýzy a můţe v některých svých modifikacích slouţit i přímo k identifikaci polymorfismů (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002). Jedná se tedy o namnoţení DNA prováděnou in vitro. Stručně lze PCR metodu popsat jako denaturaci DNA, při které se uvolní vodíkové můstky a oddělí komplementární vlákna. Na komplementární vlákna se poté připojí primery (oligonukleotidy) a proběhne syntéza nového řetězce DNA (ČÍTEK, et al., 2005). Primery se váţou na oblast na začátcích úseku DNA jenţ se má namnoţit. Syntézu DNA řízenou templátem (matricovou DNA) katalyzuje teplotně rezistentní DNA polymeráza. Konkrétně termostabilní Taq polymeráza (Thermus aquaticus). Je to enzym syntetizující nové vlákno, které je komplementární k tomu původnímu. Cyklus PCR zahrnuje teplotní denaturaci DNA (90-95 ºC), připojení primerů (annealing, 40-60 ºC) a syntézu DNA (elongace, 72 ºC) (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002). Po kaţdém opakování tohoto cyklu se mnoţství DNA zdvojnásobí a tím se zdvojnásobí mnoţství templátu pro následující cyklus (ČÍTEK, et al., 2005). V praxi je však amplifikace limitována koncentrací substrátů a aktivitou enzymu. Účinnost amplifikace je odhadována mezi 60-85 %, ale můţe být sníţena přítomností většího mnoţství templátu. Zvyšuje se totiţ pravděpodobnost hybridizace templátu s komplementárním řetězcem DNA, místo s primerem. Pomocí PCR můţe být ve specifických případech přímo stanoven polymorfismus DNA. Reakční směs pro PCR obsahuje kromě DNA pufr pro DNA polymerázu, směs nukleotidů (dNTP), několik primerů specifických pro cílovou sekvenci, termostabilní DNA polymerázu (většinou se jedná o Taq polymerázu) a různá aditiva zvyšující účinnost nebo specifitu reakce. K dispozici je mnoho modifikací PCR, které umoţňují detailní studium sekvencí DNA. Příkladem můţe být alelově specifická PCR (AS-PCR), která probíhá pouze s primerem

o

sekvenci

unikátní

pro

příslušnou

variantu

genu

(KNOLL,

VYKOUKALOVÁ, 2002). Pro detekci bodových mutací v genomech je AS-PCR 26

prováděna ve dvou nebo více paralelních reakcích. V první reakci je jeden primer komplementární ke standardní sekvenci a v další reakci k mutantní nebo polymorfní sekvenci. Druhý primer je v obou reakcích stejný. Předpokládá se, ţe k elongaci dojde pouze tehdy, pokud jsou primer a cílová sekvence plně komplementární. V případě homozygotního stavu bude k amplifikaci docházet pouze v jedné z reakcí (ŠMARDA, et al., 2005). Metoda AS-PCR vyţaduje vybrané DNA polymerázy a přísně kontrolovaný průběh reakce, aby mohlo být dosaţeno spolehlivých výsledků (KANAE, et al., 2005).

3.3.2 Metoda polymorfismu délky restrikčních fragmentů (PCR- RFLP, Restriction fragment lenght polymorphism) 3.3.2.1 Princip metody PCR- RFLP Pomocí polymorfismu délky restrikčních fragmentů se identifikují alely určitého genu na základě přítomnosti nebo absence specifického restrikčního místa. Principem této metody je štěpení DNA restrikčními endonukleázami na specifických místech. Analyzuje se délka fragmentů vzniklých tímto štěpením. Fragmenty se detekují elektroforeticky. Restrikční endonukleázy (RE) jsou sekvenčně specifické enzymy, které rozpoznají určité sekvence nukleotidů (restrikční místo- RES). Tyto enzymy jsou rozděleny do tří skupin: endonukleázy typu I, II, III. V molekulární genetice se pouţívají endonukleázy typu II, které štěpí vţdy ve stejném místě (endonukleázy typu I a III nemají přesnou polohu štěpení, proto se nepouţívají) a nachází se v rozpoznávací sekvenci a nebo v její těsné blízkosti. Rozpoznávací sekvence jsou dlouhé čtyři, pět, nebo šest nukleotidů a jsou oboustranně symetrické (palindrom). Kaţdá z endonukleáz má specifický pufr (určité sloţky, aditiva, pH, atd.) a specifické teplotní podmínky pro štěpení. Za pomoci PCR se na základě genomové DNA namnoţí specifická sekvence. Tento fragment DNA se potom dále štěpí restrikčními endonukleázami. Kdyţ je v restrikčním místě přítomna bodová mutace, tak toto místo zaniká nebo naopak vzniká nové. To má za následek vznik fragmentů DNA různé velikosti, které jsou separovány na agarózovém gelu. Vizualizace fragmentů DNA se provádí ethidiumbromidem (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002).

27

Pomocí metody PCR-RFLP můţe být analyzován jakýkoliv gen, záleţí na volbě primerů (ŠMARDA, et al., 2005). Metoda se pouţívá k detekci polymorfismů DNA (detekce mutací) (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002).

3.3.3 Detekce vybraných onemocnění Znalost molekulárního

základu vady umoţňuje přímou detekci genů

heterozygotních přenašečů po porodu nebo dokonce v embryích. Při detekci geneticky podmíněných onemocnění byla Čítkem et al. v roce 2006 pouţívána DNA izolovaná z krve nebo spermatu (ČÍTEK, et al.,2006).

3.3.3.1 Detekce CVM Dle Čítka et al. z roku 2005 byla pro detekci CVM pouţita DNA izolovaná z periferní krve nebo ze spermatu z inseminačních dávek. Pro identifikaci recesivní alely byla pouţita metoda PCR k namnoţení určitého lokusu a následně metoda PCRRFLP k analýze polymorfismu (ČÍTEK, et al., 2005). Ve studii z roku 2005 Kanae et al. uvádí moţnost detekce CVM pomocí metod PCR-RFLP, AS-PCR a primerové polymerázové řetězové reakce (PCR-PIRA). PCRPIRA je metoda pro detekci jednonukleotidových mutací s umělým zavedením místa pro restrikční endonukleázy pomocí primerů. Pro tuto metodu byli pouţity restrikční endonukleázy EcoT22l pro recesivní alely a Pstl pro normální alely. Primery byly získány z genomové DNA normálních telat: CVMfor (5´cacaatttgtaggtctcatggca(t/g)3´) a CVMrev (5´cgatgaaaaaggaaccaaaaggg3´). Byla provedena amplifikace DNA pomocí metody PCR. Ve 30 µl reakční směsi bylo obsaţeno 10 mM Tris-HCl , 50 mM KCl, 0,001% (hm / vol) ţelatiny, 30 ng genomické DNA, 0,01 jednotky Taq polymerázy, 0,2 nM deoxynukleosid trifosfátu, 15mM chloridu hořečnatého a 0,5 µM kaţdého primeru. Amplifikace byla prováděna pomocí termálního cykleru. Po proběhnutí amplifikace byly produkty PCR klonovány do plazmidového vektoru. Klony obsahující 233 bp fragmenty z normální a CVM alely byly označené jako G-223 a T-223. Tyto fragmenty byly štěpeny restrikčními endonukleázami EcoT22l a Pstl (viz Obr.10) (KANAE et al.,2005). V plemenářské dokumentaci se dominantní homozygoti značí TV a heterozygoti (přenašeči) CV (WHITLOCK et al., 2008) (viz Obr.11).

28

Obr.10 Detekce CVM pomocí PCR-PIRA, Foto: Kanae, et al.

Obr.11 List z katalogu plemenných holštýnských býků. Býk ECONOM je přenašečem genetické vady CVM, v katalogu nese vedle jména označení CV. Zbylí dva býci jsou označeni TV, což znamená že nejsou přenašeči CVM. Foto: www.genoservis.cz

29

3.3.3.2 Detekce BLAD U onemocnění BLAD byly genotypy zjišťovány pomocí metody PCR-RFLP. Kvůli přesnosti analýzy byly pro BLAD pouţity tyto enzymy: TaqI a HaeIII (TAMMEN, 1996). Získané fragmenty byly vizualizovaný na agarózovém gelu ethidiumbromidem (ČÍTEK et al., 2006). Dle Schutze et al. bylo v roce 2008 onemocnění stanovováno také pomocí metody PCR-RFLP. Vzorky pro BLAD-RFLP byly vystaven aţ 35 cyklům PCR. V celkovém mnoţství vzorku 25 µL bylo dáno 1µL DNA, dále pak vzorek obsahoval 1 U TaqI polymerázy, 10 x PCR pufru, 0,8 nM dNTP, 2 mM chloridu hořečnatého, 1 µM primeru BLADfor- (5'-SCS GCA TCA TAT CCA CCA G-3 ') a 1 µM BLADrev-(5'GTT TCA GGG GAA GAT GGA G-3 '). Po PCR bylo 15 µL výsledného produktu podrobeno štěpení fragmentů pomocí 2 U TaqI po dvě hodiny při 65 ºC. Fragmenty byly analyzovány elektroforézou na agarózovém gelu a zviditelněny pod UV zářením pomocí obarvení ethidiumbromidem. Toto onemocnění bylo detekováno také metodou BLAD-FRET (SCHUTZ et al., 2008). V plemenářské dokumentaci se dominantní homozygoti značí TL a heterozygoti (přenašeči) BL (LORENC, 2002).

3.3.3.3 Detekce Brachyspina syndromu Dosud není známa genová mutace odpovídající za toto onemocnění tudíţ ani genový test, který by vadu analyzoval na 100%. Pod záštitou mezinárodní šlechtitelské společnosti CRV byl však jiţ vyvinut markerový test, jehoţ spolehlivost je kolem 95% (ANONYM, 1999). Analýzou genomické DNA zvířete je moţné zjistit jestli je testovaný jedinec přenašečem onemocnění. Tato analýza zahrnuje 3 kroky. Prvním krokem je získání genomické DNA skotu, druhým krokem je extrakce DNA ze vzorku a třetím krokem je genotypizace DNA pro jednonukleotidové polymorfismy. Tyto polymorfismy se nacházejí mezi pozicemi nukleotidů 20156961 a 22499122 na chromozomu 21. Primery by měly mít nejméně 14 nukleotidů (GEORGES, et al., 2010).

30

3.4 Současný stav geneticky podmíněných onemocnění v populaci holštýnského skotu v České republice Výskyt vrozených vývojových vad skotu sleduje pracoviště pro kontrolu dědičnosti zdraví při Výzkumném ústavu veterinárního lékařství v Brně. Snahou je evidovat co nejvyšší počet těchto vad, aby se při jejich dědičnosti mohlo zabránit šíření v populaci. Z tohoto důvodu je důleţitá přesná evidence všech vrozených vývojových vad, včetně původu jedince, neboť mnoho postiţených mláďat zatím evidenci uniká. Vzhledem k současné ekonomické situaci a s přihlédnutím k odborným znalostem chovatelů by se toto pracoviště pro kontrolu dědičnosti zdraví chtělo pokusit evidovat tyto vady bez přesné diagnózy veterinárního lékaře. K tomuto účelu slouţí elektronický formulář Hlášení o výskytu dědičných vad a dědičných poruch zdraví. Formulář obsahuje jednoduchý popis nejčastěji se vyskytujících vad včetně obrázků (ANONYM, 2011) – Příloha 1. V roce 2008 na základě výzkumu Čítka et al. z roku 2006 nebyl v populaci holštýnského skotu v České republice ţádný přenašeč genetických poruch DUMPS, bovinní citrullinaemie a BLAD. To znamená, ţe se v současné době zdá být situace týkající se těchto genetických poruch dobrá. Je to pozitivní výsledek i kvůli tomu, ţe BLAD byl v předchozích letech váţným problémem v populaci holštýnského skotu v České republice (HRADIL, 1994). V této době bylo z 377 testovaných býku zjištěno 65 pozitivních a z 61 krav 4 pozitivní na BLAD. Je tedy zřejmé, ţe opatření pro vymýcení BLAD byla efektivní. Během posledních deseti let byl zjištěn pozitivní pouze jeden mladý býk. CVM je váţným problémem v oblasti genetického zdraví od roku 2002. V České republice je omezeno uplatnění CVM pozitivních plemeníků. Ve studii Čítek et al., 2006 byli v analyzované skupině pouze 4 plemeníci vyhodnoceni jako přenašeči CVM. Testování se zaměřilo hlavně na plemenice. Bylo analyzováno 111 elitních holštýnských krav a jalovic z nejlepších stád. Z těchto plemenic bylo 21 heterozygotů. Genotypizace elitních plemenic umoţňuje sestavit optimální připařovací plán a pomáhá zlepšovat genetické zdraví v populaci holštýnského skotu v České republice. Všechny tyto plemenice byly testovány také na genotyp pro BLAD, DUMPS a bovinní citrullinaemii a nebyla mezi nimi analyzována ţádná přenašečka těchto onemocnění (ČÍTEK et al., 2006).

31

3.5. Současný stav geneticky podmíněných onemocnění v populaci holštýnského skotu ve světě 3.5.1 BLAD Ve světové populaci holštýnského skotu se výskyt přenašečů onemocnění BLAD pohybuje v relativně nízkých procentech. Dle Meydana, Yildize a Argeholma z roku 2010 se frekvence přenašečů pohybuje kolem 3-4 %. Například v Brazílii je to 2,8 %, v Japonsku 4 %, v USA 4 %, v Polsku 3 %, v Íránu 3,3 % a v Turecku 4%. 3.5.2 CVM CVM je hlášeno ze zemí jako je Česká republika, Dánsko, Polsko, USA, Velká Británie, Japonsko, Írán, Švédsko a také Turecko. Od roku 2000 má většina těchto zemí vyvinut šlechtitelský program jehoţ cílem je monitoring a omezení výskytu přenašečů tohoto onemocnění. Nicméně například v Polsku bylo 150 ze 605 testovaných plemeníků zjištěno přenašeči CVM. V další nedávno provedené studii u 200 holštýnských dojnic v Japonsku bylo zjištěno 26 přenašeček CVM. Proto se v některých zemích zdá být frekvence přenašečů stále velmi vysoká. V Turecku se dle studie Meydan et al. provedené v roce 2006 mutantní alela populaci dojnic holštýnského skotu vyskytuje u 0,017% krav. Výskyt přenašečů CVM byl zjištěn 3,4 %. Frekvence přenašečů CVM zjištěna v Turecku je velmi nízká ve srovnání s ostatními státy jako jsou Dánsko(31%), Polsko (24,8%), Japonsko (32,5 %), Švédsko (23%) a Německo (13,2%) (MEYDAN et al., 2010). 3.5.3 Brachyspina syndrom Z výzkumů mezinárodní šlechtitelské společnosti CRV vyplývá, ţe v populaci holštýnského skotu v Holandsku je 8 % přenašečů této vady. To znamená, ţe ve zhruba milionové populaci krav je to 80 000 zvířat, tudíţ je tu 8 % pravděpodobnost, ţe se zapouští býkem, který je přenašečem této vady. Výsledkem je tedy 6400 březostí ročně, u nichţ jsou oba rodiče nositeli vady. Celkově je tak brachyspina syndrom odpovědný za úmrtí plodu, zmetání nebo mrtvě narozená telata v 0,16 % z celkového počtu březostí. Navíc většina březostí končí zmetáním aţ v druhé polovině gravidity. Kromě holandských býků z testu společnosti CRV vyplývá, ţe také několik zahraničních býků s 95 % pravděpodobností tuto vadu v populaci rozšiřuje (ANONYM, 1999). 32

4 ZÁVĚR Cílem mé bakalářské práce bylo zpracovat dosud známé poznatky o vybraných geneticky podmíněných onemocněních (CVM, BLAD a BY) v populaci holštýnského skotu. Geneticky podmíněná onemocnění jsou pro populaci skotu stále aktuální hrozbou. Je důleţité pokračovat v selekci přenašečů mezi plemennými býky, monitoringu výskytu recesivních homozygotů a v případě podezření provádět testaci i u krav a pokud moţno výrazně omezovat připouštění plemennými býky, jenţ jsou přenašeči genetických chorob. Frekvence geneticky podmíněných chorob v České republice je na nízké úrovni, ve srovnání například s Dánskem. Velmi dobře si Česká republika poradila s vymýcením genetické poruchy BLAD-dnes se u nás prakticky nevyskytuje. Je důleţité takto postupovat i u onemocnění CVM, které je v současné době světově nejrozšířenějším genetickým podmíněným onemocněním u holštýnského skotu. A také brachyspina syndromu, coţ je onemocnění detekované teprve v nedávné době a jeho dopad na populaci holštýnského skotu se ukáţe aţ během několika dalších let. Pro eliminaci geneticky podmíněných chorob jsou také nutné základní znalosti chovatelů skotu, kteří by měli být schopni rozpoznat základní morfologické znaky a být ochotni se podílet se na monitoringu těchto chorob.

33

5 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY  AGERHOLM, J.S., BENDIXEN, CH., ANDERSEN, O., ARNBJERG, J. Complex vertebral malformation in Holstein calves. Journal of Veterinary

Diagnostic Investigation [online]. 2001, 13, [cit. 2011-04-12]. Dostupný z WWW: < http://jvdi.org/cgi/reprint/13/4/283.pdf >  AGERHOLM, J.S.; MCEVOY, F.; ARNBJERG, J. Brachyspina syndrome in a Holstein calf. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation [online]. 2006, 18, [cit. 2011-04-17]. Dostupný z WWW: .  ARGEHOLM, J.S.; PEPERKAMP, K. Familial occurrence of Danish and Dutch cases of the bovine. BMC Veterinary Research [online]. 2007, 3, [cit. 2011-0412]. Dostupný z WWW: < http://www.biomedcentral.com/1746-6148/3/8>.  BATT, C. A., WAGNER, K., WIEDMANN, M., LUO, J., GILBERT, R. Detection of bovine leukocyte adhesion deficiency by nonisotopic ligase chain reaction. Animal Genetics [online]. 1994, 25, [cit. 2011-04-17]. Dostupný z WWW: .  CAVANNAGH, J.A., TAMMEN, I., WINDSOR, P.A., BATEMAN, J.F., SAVARIRAYAN, R., NICHOLAS, F.W., RAADSMA, H.W. Bulldog dwarfism in Dexter cattle is caused by mutations in ACAN. Mamm genome [online]. 2007, 18, [cit. 2011-04-12]. Dostupný z WWW: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17952705>.  Českomoravská společnost chovatelů, a.s. [online]. 2011 [cit. 2011-04-18]. Hlášení vrozených vývojových vad. Dostupné z WWW: .  ČÍTEK, J., HÁJKOVÁ J., ŘEHOUT, V, HÁLA, K., KOŠVANEC, K., HRADECKÁ, E. Dědičné poruchy zdraví skotu. Národní agentura pro zemědělský výzkum [online]. 2005, QF3012, [cit. 2011-04-27]. Dostupný z WWW: <www.mze-vyzkum-infobanka.cz/DownloadFile/7535.aspx>.

34

 ČÍTEK, J., ŘEHOUT, V., HÁJKOVÁ, J., PÁVKOVÁ, J. Monitoring of genetic health of cattle in the Czech Republic. Veterinární Medicína [online]. 2006, 51, [cit. 2011-04-17]. Dostupný z WWW: .  DOEGE, K.J., GARRISON, K., COULTER, S.N., YAMADA, Y. The structure of the rat aggrecan gene and preliminary characterization of its promoter. The

journal of biological chemistry [online]. 1994, 269, [cit. 2011-04-12]. Dostupný z WWW: < http://www.jbc.org/content/269/46/29232.abstract>.  DUNCAN JR., R.B., CARRIQ, C.B., AGERHOLM, J.S., BENDIXEN, C. Complex vertebral malformation in a holstein calf: report of a case in the USA .

Journal of Veterinary Diagnostic Investigation [online]. 2001, 13, [cit. 201104-12]. Dostupný z WWW: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11478606 >.  GEORGES, M. , COPPIETERS, W., CHARLIER, C., AGERHOLM, J.S., FREDHOLM, M. Sumo Brain [online]. 2010 [cit. 2011-04-17]. A genetic marker test for brachyspina and fertility in cattle . Dostupné z WWW: .  GILBERT, R.O., REBHUN, W.C., KIM, C.A., KEHRLI Jr., M.E., SCHUSTER, D.E., ACKERMANN, M.R. Clinical manifestations of leukocyte adhesion deficiency in cattle: 14 cases (1977-1991). Journal of the American Veterinary

Medical Association [online]. 1993, 202, [cit. 2011-04-17]. Dostupný z WWW: .  GRUPE, S., DIETL, G., SCHWERIN, M. Population survey of citrullinemia on German Holsteins . Livestock Production Science [online]. 1996, 45, [cit. 201104-17]. Dostupný z WWW:
35

way&_origin=gateway&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1721277 521&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_ userid=10&md5=4a51eaae186b16845934a884bb25b014&searchtype=a>.  HRADIL, 1994 in ČÍTEK, J., ŘEHOUT, V., HÁJKOVÁ, J., PÁVKOVÁ, J. Monitoring of genetic health of cattle in the Czech Republic. Veterinární

Medicína [online]. 2006, 51, [cit. 2011-04-17]. Dostupný z WWW: .  KANAE, Y., ENDOH, D., NAGAHATA, H., HAYASHI, M. A method for detecting complex vertebral malformation in Holstein calves using polymerase chain reaction-primer introduced restriction analysis . Journal of Veterinary

Diagnostic Investigation [online]. 2005, 17, [cit. 2011-04-12]. Dostupný z WWW: < http://jvdi.org/cgi/reprint/17/3/258.pdf >.  KEHRLI, M.E., ACKERMANN, M.R., SCHUSTER, D.E., van der MATTEN, M.J., SCHMALSTIEG, F.C., ANDERSON, D.C., HUGHES, B. Animal Model of Human Disease : Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency. American Journal of

Pathology [online]. 1992, 140, [cit. 2011-04-17]. Dostupný z WWW: .  KNOLL, A.; VYKOUKALOVÁ, Z. Molekulární genetika zvířat: (Metody

detekce polymorfizmů). první. Brno : MZLU v Brně, 2002. 168 s.  KUMMER, V.; FALDÍKOVÁ, L. Agroweb [online]. 2002 [cit. 2011-04-12]. Účinky mykotoxinů na zdraví a reprodukci hospodářských zvířat. Dostupné z WWW: < http://www.agroweb.cz/Ucinky-mykotoxinu-na-zdravi-a-reprodukcihospodarskych-zvirat__s45x8358.html >.  LORENC, M. Šlechtitelská práce v chovu skotu aneb cesta do hlubin

genetiky skotu. Hradec Králové : CHOVSERVIS a.s. ve spolupráci s PLEMO a.s., 2002. 120 s.

36

 MEYDAN, H.; YILDIZ, M.A.; AGERHOLM, J.S. Screening for bovine leukocyte adhesion deficiency, deficiency of uridine monophosphate synthase, complex vertebral malformation, bovine citrullinaemia, and factor XI deficiency in Holstein cows reared in Turkey . Acta Veterinaria Scandinavica [online]. 2010, 52, [cit. 2011-04-12]. Dostupný z WWW: < http://www.biomedcentral.com/content/pdf/1751-0147-52-56.pdf >.  NAGAHATA, H., NOCHI, H., TAMOTO, K., TANIYAMA, H., NODA, H., MORITA, M., KANAMAKI, M., KOCIBA, K.J. Bovine leukocyte adhesion deficiency in Holstein cattle.. Canadian Journal of veterinary research [online]. 1993, 57, [cit. 2011-04-17]. Dostupný z WWW: .  NAGAHATA, H., OOTA, H., NITANAI, A., OIKAWA, S., HIGUCHI, H., NAKADE, T., KUROSAWA, T., MORITA, M., OGAVA, H. Complex vertebral malformation in a stillborn Holstein calf in Japan. The Journal of Veterinary

Medical Science [online]. 2002, 64, [cit. 2011-04-12]. Dostupný z WWW: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12520102>.  NAGAHATA, H. Bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD): a review. The

Journal of Veterinary Medical Science [online]. 2004, 66, [cit. 2011-04-18]. Dostupný z WWW: .  PETERSEN, A.H., 1999 in THOMSEN, B., HORN, P., PANITZ, F., BENDIXEN, E., PETERSEN, A.H., HOLM, L.E., NIELSEN, V.H, AGERHOLM, J.S., ARNBJERG, J., BENDIXEN, C. A missense mutation in the bovine SLC35A3 gene, encoding a UDP-N-acetylglucosamine transporter, causes complex vertebral malformation.. Genome research [online]. 2006, 97, [cit. 2011-04-17]. Dostupný z WWW: .

37

 REVELL, S. Complex vertebral malformation in a Holstein calf in the UK. The

veterinary record [online]. 2001, 149, [cit. 2011-04-12]. Dostupný z WWW: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11764332 >.  ROBINSON, J.L., POPP, R.G., SHANKS, R.D., OOSTERHOF, A., VEERKAMP, J.H. Testing for deficiency of uridine monophosphate synthase among holstein-friesian cattle of North America and Europe . Livestock

production science [online]. 1993, 36, [cit. 2011-04-12]. Dostupný z WWW: < http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T9B-49NP887J&_user=10&_coverDate=11%2F30%2F1993&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=gate way&_origin=gateway&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1721260 930&_rerunOrigin=google&_acct=C000050221&_version=1&_urlVersion=0&_ userid=10&md5=a044e8b187ba706b5cc03acef5d25bd5&searchtype=a >.  SCHUSTER, D.E., KEHRLI Jr, M.E., ACKERMANN, M.R., GILBERT, R.O. Identification and prevalence of a genetic defect that causes leukocyte adhesion deficiency in Holstein cattle.. Proceedings of the National Academy of

Sciences of the USA [online]. 1992, 89, [cit. 2011-04-17]. Dostupný z WWW: .  SCHÜTZ, E.; SCHARFENSTEIN, M.; BRENIG, B. Implication of complex vertebral malformation and bovine leukocyte adhesion deficiency DNA-based testing on disease frequency in the Holstein population. Journal of Dairy

Science [online]. 2008, 91, [cit. 2011-04-17]. Dostupný z WWW: .  SCHWENGER, B., TAMMEN, I., AURICH, C. Detection of the homozygous recessive genotype for deficiency of uridine monophosphate synthase by DNA typing among bovine embryos produced in vitro. Journal of reproduction and

fertility.[online]. 1994, 100, [cit. 2011-04-12]. Dostupný z WWW: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8021871 >.

38

 SHANKS, R.D.; ROBINSON, J.L. Deficiency of uridine monophosphate synthase among Holstein cattle. Cornell Vet. [online]. 1990, 80, [cit. 2011-0412]. Dostupný z WWW: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/2318037>.  Svaz chovatelů holštýnského skotu ČR [online]. 1999 [cit. 2011-04-17]. Brachyspina základní informace. Dostupné z WWW: .  ŠMARDA, J., DOŠKAŘ, J., PANTŮČEK, R., RŮŢIČKOVÁ, V., KOPTÍKOVÁ, J. Metody molekulární biologie. 1.vydání. Brno : Masarykova univerzita , 2005. 188 s.  TAMMEN, I., KLIPPERT, H., KUCZKA, A., TREVIRANUS, A., POHLENZ, J., STÖBER, M., SIMON, D., HARLIZIUS, B. An improved DNA test for bovine leucocyte adhesion deficiency. Research in veterinary science [online]. 1996, 60, [cit. 2011-04-17]. Dostupný z WWW: .  THOMSEN, B., HORN, P., PANITZ, F., BENDIXEN, E., PETERSEN, A.H., HOLM, L.E., NIELSEN, V.H, AGERHOLM, J.S., ARNBJERG, J., BENDIXEN, C. A missense mutation in the bovine SLC35A3 gene, encoding a UDP-Nacetylglucosamine transporter, causes complex vertebral malformation.. Genome

research [online]. 2006, 97, [cit. 2011-04-17]. Dostupný z WWW: .  WHITLOCK, B.K.; KAISER, L.; MAXWELL, H.S. Heritable bovine fetal abnormalities. Theriogenology [online]. 2008, 70, [cit. 2011-04-18]. Dostupný z WWW: .

39

 WOUDA, W., VISSER, I.J., BORST, G.H., VOS, J.H., ZEEUWEN, A.A., PEPERKAMP, N.H. Developmental anomalies in aborted and stillborn calves in The Netherlands. The veterinary record [online]. 2000, 147, [cit. 2011-04-12]. Dostupný z WWW: < http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11110484>.

40

6 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1- Dwarfismus u plemene aberdeen angus. Foto: Dr. J. Reecy.

Obr.2- Fawn calf syndrom u telete plemene aberdeen angus. Foto: Australian FCS group. Obr.3- Perosomus elumbis u holštýnského telete. Foto: Dr. Dean Percy.

Obr. 4- Hypoplazie a vodnatelnost plic. Foto: Dr. Lana Kaiser Obr. 5- Pazneht postiţený syndaktylií. Foto: B.K. Whitlock Obr.6- Holštýnské tele postiţené brachyspina syndromem. Foto: J.S. Agerholm Obr. 7- Tybiální hemimelia u telete plemene galloway. Foto: Dr. Chuck Hannon Obr. 8- Komplex vertebrálních malformací u holštýnského telete. Foto: J.S. Agerholm Obr. 9- Malformace páteře typické pro brachyspina syndrom. Foto: J.S. Agerholm Obr. 10- Detekce CVM pomocí PCR-PIRA, Foto: Kanae, et al. Obr. 11- List z katalogu plemenných holštýnských býků. Býk ECONOM je přenašečem genetické vady CVM, v katalogu nese vedle jména označení CV. Zbylí dva býci jsou označeni TV, coţ znamená ţe nejsou přenašeči CVM. Foto: www.genoservis.cz

41

7 SEZNAM ZKRATEK 

AAA- American Angus Association



ACAN- aggrecan gen



AHA- American Hereford Association



AS- PCR- alelově specifická polymerázová řetězová reakce



BLAD- Bovine leukocyte adhesion deficiency, Syndrom deficience adhezní schopnosti leukocytů



BY- Brachyspina syndrom



CIT- Bovinní citrulinaemie



CRV-

mezinárodní

šlechtitelská

společnost,

vznikla

spojením

dánské

společnosti CR Delta a vlámské společnosti VRV 

CVM- Complex vertebral malformation, Komplex vertebrálních malformací



DNA- Deoxyribonukleová kyselina, základ genetické informace



DUMPS- Deficiency of uridin Monophosphate Synthese



FCS- Fawn calf syndrom



ICM- Myoklonus



ITGB2- β2 integrin



PCR- Polymerase chain reaction, polymerázová řetězová reakce



PCR- RFLP- metoda polymorfismu délky restrikčních fragmentů



PE- Perosomus elumbis



PHA- Hypoplazie a vodnatelnost plic



PRKG- gen protein kináza



RE- restrikční endonukleáza



SLC35A3- Solute carrier family 35 member 3, UDP-N-acetylglukosamine transporter



SSLS- letální syndrom krátké páteře



Taq- polymeráza Thermus aquaticus



UMP- Uridin- 5- monofosfát syntéza

42

8 PŘÍLOHY PŘÍLOHA 1- Příklad formuláře pro hlášení výskytu vrozených geneticky podmíněných onemocnění vydaný Českomoravskou společností chovatelů H l á š e n í výskytu vrozených vad a dědičných poruch zdraví

OVS:

Datum:

Zemědělský podnik:

Farma:

Nacionále postiţeného telete: Datum narození:

Plemeno:

Pohlaví:

Délka gravidity:

St. reg. plemenného býka – otec postiţeného telete: Evid. číslo plemenice – matky postiţeného telete: St. reg. plemenného býka – otce matky postiţeného telete: Ţivotaschopnost telete (dobrá, slabá, mrtvě narozeno, zmetání):

Klinický nález, dg.:

Patologicko-anatomický nález :

Letální faktor /foto/: Poznámka:

43

razítko, podpis

ověřil /razítko, podpis/

44