MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

BRNO 2012

ALENA KŘÍŽOVÁ

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav Technologie potravin

Transmisivní spongioformní encefalopatie Bakalářská práce

Vedoucí práce:

Vypracovala:

prof. MVDr. Ing. Tomáš Komprda, CSc.

Alena Křížová

Brno 2012

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma TRANSMISIVNÍ SPONGIOFORMNÍ ENCEFALOPATIE vypracoval(a) samostatně a použil(a) jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne ………………………………………. podpis ……………………….

PODĚKOVÁNÍ Děkuji prof. MVDr. Ing. Tomáši Komprdovi, CSc za odbornou pomoc a čas, který mi věnoval při zpracování této bakalářské práce.

ABSTRAKT Transmisivní

spongiformní

encefalopatie

jsou

vzácná

neurodegenerativní

onemocnění mozku postihující člověka a řadu různých druhů zvířat. Za původce těchto onemocnění jsou považovány bílkoviny se změněnou strukturou tzv. priony. Priony se po dobu několika let hromadí v centrálním nervovém systému hostitele, kde způsobují patologické změny a následně u živočichů vždy končí smrtí. Tato bakalářská práce se zaměřuje na popis původce onemocnění, přítomnost prionů u kvasinek, klasifikaci onemocnění u člověka a zvířat, na jejich příznaky, diagnostiku, léčbu a prevenci. Klíčová slova: priony, PrPC, PrPSc, prionová onemocnění, BSE, CreutzfeldtJakobova nemoc

ABSTRACT Transmissible spongioform ecephalophaties are rare neurodegenrative brain disases affecting human and a variety of animal species. For agents of these diseases are treated proteins with altered structure called prions. Prions accumulate for a few years in the central nervous system of the host, where they causing pathological changes and than in mammals always end in death. This bachleor thesis is focoused on the description of the disease agent, the presence of prion in yeast, the classification of diseases in humans and animals, their symptoms, diagnosis, treatment and prevention. Key words: prions, PrPC, PrPSc, prion diseases, BSE, Ceutzfeldt-Jakob disease

OBSAH 1 ÚVOD............................................................................................................................ 8 2 CÍL PRÁCE ................................................................................................................... 9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED ............................................................................................. 10 3.1 Priony..................................................................................................................... 10 3.1.1 PrPC ................................................................................................................. 11 3.1.1.1 Funkce PrPC ............................................................................................. 12 3.1.2 Gen prionového proteinu − PRNP .................................................................. 14 3.1.3 PrPSc ................................................................................................................ 14 3.1.4 Prionová hypotéza........................................................................................... 15 3.1.5 Druhová bariéra .............................................................................................. 17 3.2 Priony kvasinek...................................................................................................... 17 3.2.1 Prion [PSI+] a [URE3] ................................................................................... 19 3.3 Prionová onemocnění zvířat .................................................................................. 20 3.3.1 Bovinní spongiformní encefalopatie.............................................................. 20 3.3.1.1 Etiopatogeneze......................................................................................... 20 3.3.1.2 Symptomy ................................................................................................. 21 3.3.1.3 Výskyt BSE v Evropě................................................................................ 21 3.3.1.4 Stanovisko a opatření EU ........................................................................ 23 3.3.1.5 Prevence BSE........................................................................................... 24 3.3.1.6 Diagnostika.............................................................................................. 26 3.3.2 Klusavka (Scrapie, drbavka).......................................................................... 27 3.3.2.1 Přenos onemocnění.................................................................................. 28 3.3.2.2 Klinické příznaky ..................................................................................... 28 3.3.2.3 Laboratorní diagnostika klusavky ........................................................... 29 3.3.2.4 Prevence klusavky.................................................................................... 30 3.3.3 Chronická katechizující choroba jelenovitých............................................... 31 3.3.4 Transmisivní encefalopatie norků.................................................................. 32

3.3.5 Felinní spongiformní encefalopatie ............................................................... 34 3.3.6 Encefalopatie exotických kopytníků.............................................................. 35 3.3.7 TSE subhumánních primátů.......................................................................... 35 3.3.8 TSE ostatních zvířat...................................................................................... 36 3.4 Humánní prionová onemocnění.......................................................................... 36 3.4.1 Historie.......................................................................................................... 36 3.4.2 Patogeneze .................................................................................................... 37 3.4.3 Epidemiologie............................................................................................... 38 3.4.4 Přehled humánních onemocnění ................................................................... 39 3.4.4.1 Creutzfeldt-Jakobova nemoc................................................................... 39 3.4.4.2 Gertsmann Sträussler-Scheinkerova choroba ........................................ 40 3.4.4.3 Kuru ........................................................................................................ 40 3.4.4.4 Alperův syndrom/Alperova nemoc.......................................................... 41 3.4.4.5 Fatální familiární insomnie .................................................................... 41 3.4.4.6 Familiární progresivní subkortikální glióza........................................... 42 3.4.4.7 Nová varianta Creutzfeldt-Jakobovy nemoci.......................................... 42 3.4.5 Diagnostika prionových infekcí.................................................................... 43 3.4.6 Terapie .......................................................................................................... 44 3.4.7 Protiepidemická opatření .............................................................................. 45 4 ZÁVĚR ........................................................................................................................ 47 5 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY........................................................................ 48

1 ÚVOD

Transmisivní spongioformní encefalopatie jsou degenerativní onemocnění mozku lidí a zvířat. Tato onemocnění způsobují podle současných dostupných vědeckých poznatků infekční patogenní agens tzv. pozměněné prionové proteiny. Výskyt těchto prionových proteinů byl zjištěn u kvasinek, zvířat a člověka. Pozměněný rionový protein se chová jako infekční částice, ale je menší než doposud známé nejmenší viry a vyznačuje se neobvyklou odolností proti běžným metodám asanace, dezinfekce a sterilizace. Priony se od virů odlišují zejména tím, že v nich nebyla zjištěna žádná nukleová kyselina, a že nevyvolávají protilátkovou odezvu, neboť jsou tvořeny bílkovinou hostitele. Všechny choroby způsobené priony mají společné histopatologické projevy degenerace ústředních neuronů a tyto projevy doprovázející houbovité změny mozku. Funkční poruchy centrální nervové soustavy (CNS) nakonec vyústí u člověka i zvířat v demenci. Také mají velice dlouhou inkubační dobu − měsíce, roky, desetiletí a pomalý, nezvratný průběh končící smrtí. U kvasinek priony nezpůsobují smrt, ale naopak jim mohou pomoci přežít v nepříznivých podmínkách. Onemocnění se dostala do popředí zájmu odborné i laické veřejnosti koncem osmdesátých let, kdy se ve Velké Británii objevily informace o novém onemocnění u skotu,

nazvaném

„nemoc

šílených

krav“,

později

„bovinní

spongiformní

encefalopatie“. Popularizaci tohoto onemocnění provázely také různé informace, které zdůrazňovaly především nebezpečí této choroby pro člověka.

8

2 CÍL PRÁCE

Cílem mé práce bakalářské práce je zpracovat literární rešerši na téma Transmisivní spongiformní encefalopatie, prostudovat dostupnou odbornou a vědeckou literaturu ohledně prionových onemocnění živočichů a člověka. Tato práce se zaměřuje především na klasifikaci, základní rysy, genetiku, hypotézu vzniku, epidemiologii a prevenci těchto onemocnění.

9

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED

3.1 Priony

Termín prion (proteinaeous infectious particles) označuje infekční patogenní bílkovinu, která je přenosnou infekční agens se zvláštní molekulární strukturou a doposud neznámými mechanizmy replikace a patogeneze (Mareš et al., 2003). Tato proteinová agens byla nazvána priony v r. 1982 (odvozeno od protein a infekční);

(Snustand, Simmons, 2009). Prionová bílkovina je sice infekční, avšak příliš jednoduchou substancí, než aby mohla být nazvána mikroorganismem, a nemá také všeobecně přijímané atributy života (Beneš et al., 2009). Oproti virům a viroidům nemají definovanou strukturu, nevedou k imunitní odpovědi, ani k zánětům a ani k produkci interferonu (Mumentheler, Mattle, 2001). Od virů se priony odlišují také tím, že v infekčních částicích nebyla zjištěna nukleová kyselina (Mareš et al., 2003). Infekční prion − pozměněný infekční protein způsobuje onemocnění spongiformní encefalopatii, nezměněné priony ale patří mezi fyziologicky se vyskytující bílkoviny (Mumentheler, Mattle, 2001). Funkce nezměněného prionového proteinu není zatím do detailu známa, podle studií se předpokládá, že souvisí s metabolizmem mědi v organismu (udržování homeostázy Cu2+), s cirkadiálními rytmy (spánek/bdění), apoptózou neuronů (programovanou smrtí nervových buněk), resp. s antioxidačními procesy v organismu (Komprda, 2004). Infekční prionový protein může do buňky vniknout exogenní cestou (většinou do těla přichází s potravou) nebo může sám vzniknout vlivem mutace nebo být zděděn (Mumentheler, Mattle, 2001). Pokud se do těla savců dostává nakaženou potravou, tedy trávicím traktem (což bývá nejčastějším případem způsobu vzniku onemocnění), pak putují po síti nervových buněk a přesunují se do mozku. Na svou přítomnost nemusí upozornit, protože se nemnoží tak rychle, jako viry nebo bakterie (Mareš et al., 2003). S latencí let dochází k zániku neuronů, tvorbě vakuol a amyloidních plak, což se u člověka a zvířete projevuje v charakteristickém neurodegenerativním obraze nemoci (Mumentheler, 10

Mattle, 2001). Nákaza priony se nemusí projevit léta. Odhaduje se, že priony mohou být v klidu i 40 let. Pro priony je také charakteristická vysoká rezistence k běžně používaným postupům desinfekce a sterilizace (Mareš et al., 2003).

3.1.1 PrPC

Objevitel prionů, americký neurolog Stanley Ben Prusiner (objev prionů – 1987, Nobelova cena – 1997) při bližším zkoumání zjistil, že existují dva druhy prionů. Těmi jsou: nezměněný prion a infekční pozměněný prion. První byl označen jako PrPC (C − celulární, buněčný), který se zcela běžně vyskytuje ve všech živočišných organismech. Druhý byl označen jako PrPSc. PrPC se nachází v živočišných neuronech, gliových buňkách, leukocytech a jiných tkáních a nevykazuje známky infekčnosti. Tento PrPC je kódován příslušným genem pro PrPC, tzv. PRNP (Mareš et al., 2003). Prionový protein PrPC je glykosylován dvěma cukernými složkami a nabývá konformace α-šroubovice (Komprda, 2004). Struktura PrPC je mezi živočišnými druhy geneticky vysoce zachována a po celou dobu evoluce zastává důležitou biologickou roli. PrPC se skládá ze sekvence 253 aminokyselin s nepatrnými mezidruhovými změnami, které závisí na počtu repeticí oktapeptidu. Repetitivní oktapeptid je opakující se proteinový fragment, který obsahuje osm aminokyselin spojených polypeptidickou vazbou (Moore, Herzog, Erret, 2006). PrPC může být rozdělen podle strukturálních funkcí na dvě poloviny: N-terminální část (nebo také NH2 PrPC), která je pružná a neuspořádaná, a C-terminální část, která je globulární. N-terminální část NH2 PrPC polovina se nachází mezi 23. − 125. aminokyselinou a může být rozdělena na čtyři po sobě jdoucí sféry: první shluk náboje neboli tzv. CC1; repetitivní oktapeptid; druhý shluk náboje neboli CC2; a hydrofobní část nazývaná HD. Každá z těchto čtyř částí reaguje s různými ligandy a je spojena s rozličnými funkcemi. 11

C-terminální část Spektroskopie a NMR analýza prokázala, že C-terminální globulární část obsahuje pět strukturních sfér: dvě β-vlákna a tři α-šroubovice. Nachází se mezi 126. a 231. aminokyselinou (Béland, Roucou, 2011; Abid, Soto, 2006). PrPC jako membránový protein vzniká na drsném endoplazmatickém retikulu. Během doby kdy zde protein PrPC zraje je vystaven různým změnám včetně výměny signálního

peptidu,

nacházejícího

se

mezi

232.

–

253.

aminokyselinou

za glykofosfatidylinositolovou (GPI) kotvu. Mezi tyto změny patří i glykosylace dvou asparaginů na aminokyselinách 181 a 197 a přidání jednoho disulfidického můstku mezi dva cysteinové zbytky na 179. a 214. aminokyselině. Glykosylace asparaginu určí rozdíly v biochemii zralého proteinu, což vede k vzniku di-, mono-, nebo neglykosylované formy (Prusiner, 1998; Harris, 2003). PrPC se projevuje hlavně v centrálním nervovém systému, ale široce působí i v různých somatických tkáních zahrnujících thymus, střeva, srdce, ledviny a kůži (Peralta, Eystone, 2009). Obvyklé buněčné umístění PrPC je připojení GPI kotvou k lipofilní doméně membrány bohaté na cholesterol a sfingolipidy, známou jako lipidový raft (Peralta, 2011).

3.1.1.1 Funkce PrPC

I přes intenzivní zkoumání v posledních letech zůstává přesná funkce PrPC dosud neobjasněna. Některé studie navrhují roli buněčné ochrany PrPC proti oxidačnímu stresu. Experimenty ukázaly, že neurony z PRNP z knockout myší (myši bez PrPC) kultivovány in vitro prokazují vyšší náchylnost k oxidačním látkám, jako je hydrogen peroxid, xantin oxidázy a měďnaté ionty. Navíc mozkové tkáně shromážděné z PRNP knockout myší ukázaly na biochemické změny včetně zvýšení hladiny karbonylů proteinu a produktů peroxidace lipidů, které svědčí o oxidačním poškození. Rozsáhlý soubor důkazů prokázal vazby Cu2+ iontů do PrPC repetitivní oktapeptidové oblasti. 12

Měď (Cu2+) je základním prvkem, který se podílí jako enzymatický kofaktor v biochemických drahách všech aerobních organismů. Nicméně Cu2+ může také katalyzovat tvorbu reaktivních forem kyslíku jako je hydroxylový radikál. Vazby Cu2+ na PrPC, tak mohou omezit schopnost katalyzovat tvorbu těchto toxických radikálů. Případně může PrPC modulovat činnost enzymu Cu/Zn superoxid dismutázy (Cu/Zn SOD), který prokázal buněčnou ochrannou funkci proti oxidačnímu stresu. Několik důkazů z experimentů ukázalo i cytoprotektivní roli PrPC proti vnitřním nebo vnějším vlivům okolního prostředí, které zahajují apoptózu. Tento anti-apoptický potenciál je v první řadě založen na schopnosti PrPC potlačit akci pro-apoptického proteinu Bax. Jiné studie uvádějí blízkou podobnost mezi homologovou doménou apoptického proteinu Bcl-2 a PrPC oktapeptidovou oblastí. Tato analogie v proteinové struktuře může dovolit, aby PrPC napodobil funkci Bcl-2 a vyvolal buněčné přežití. Kromě cytoprotektivní role byl PrPC

také uveden jako faktor proliferace a

diferenciace buněk. Nedávno bylo zjištěno, že knockout myši, prokázaly zhoršenou schopnost sebe-obnovy krvetvorby kmenových buněk po sériové transplantaci kostní dřeně. Potenciální mitogenní schopnost byla také podpořena studiemi, které prokazují snížení proliferace T-lymfocytů u myší postrádajících PrPC. Kapacita vazby PrPC na několik různých molekul otevřela myšlenku, že tento protein

může

uplatnit

v extracytoplasmatické

svou stěně

funkci lipidové

v souvislosti dvojvrstvy

s ligandy.

Umístění

omezuje

jeho

PrPC

interakce

s transmembránou a s vylučováním proteinů. Membránové asociace a interakce s ligandy naznačují hypotézu, že PrPC může aktivovat proces transmembránové signalizace spojený s nervovým přežitím a diferenciací (Peralta, 2011).

13

3.1.2 Gen prionového proteinu − PRNP

Gen prionu kódující strukturu PrPC má homology u všech obratlovců (ptáci a savci); (Premzl, Gamulin, 2007). Tento gen se nachází na druhém chromosomu u myší, na třináctém u krav a na dvacátém u člověka. PRNP člověka, skotu, ovcí, myší a krys mají tři exony a protein kódující pořadí aminokyselin je umístěn uvnitř třetího exonu. Použitím chloramfenikol transferázy plasmidů, byla propagátorská oblast genu skotu zjištěna v části mezi 88. a 30. amnokyselinou, tedy v části příbuzné začátku transkripce (Peralta, 2011).

3.1.3 PrPSc

Mutací

v PrPC

genu

nebo

autokatalytickým

působením

již

existujícího

pozměněného proteinu může dojít k destabilizaci α-helix a ke konverzi konformace na strukturu β-skládaného listu. Pozměněný prionový protein se označuje jako PrPSc (Sc – scrapie). Konformace β-skládaného listu není a priorí patologickou strukturou, velká část bílkovin živočichů včetně člověka zaujímá tuto strukturu zcela přirozeně (Komprda, 2004). PrPSc (scrapie) se vyznačuje bodovou mutací genu jedné z aminokyselin. Tento druh prionu se u lidí dále dělí na tři poddruhy podle bodové mutace, se kterou souvisejí i druhy chorob, které způsobuje: Creutzfeld-Jakobova nemoc, Gertsmann StrausslerScheinkerova choroba a fatální familiární insomnie. K přeměně PrPC na PrPSc u všech živočichů dochází pravděpodobně mutací v jedné z buněk, kdy vzniká PrPSc. Tento vzniklý PrPSc se následně naváže na PrPC a dosud neznámým způsobem jej přemění na PrPSc. Dochází tak k řetězovité reakci (dominový účinek). Priony se neintegrují do buněčných membrán, ale nahromadí se v buňkách a v mimobuněčném prostoru, kde se shlukují v masu (vytvoří tzv. amyloidní plak). 14

Krátký průběh nemoci s dlouhou inkubační dobou svědčí o tom, že se priony tvoří exponencionální řadou (Mareš et al., 2003). Změna konformace má za následek podstatnou změnu vlastností tohoto proteinu. Za prvé vysokou odolnost vůči působení chemických činidel (včetně specifického enzymu, který za normálních okolností PrPC v organizmu štěpí) a tepelnou rezistenci (Komprda 2004). A další, stejně významnou vlastností nové bílkoviny je skutečnost, že ji organismus nedokáže běžnými mechanismy rozložit. Nová bílkovina není sama o sobě toxická, pouze se v těle, a zejména v nervové tkáni, nahromadí natolik, že nakonec znemožní její normální funkci. Klinicky se tento stav projeví právě jako neurodegenerativní onemocnění. Prionové choroby tedy mají blízko k tzv. střádacím chorobám

čili

thesaurysmózám,

jako

je

Niemannova-Pickova

choroba,

metachromatická leukodystrofie, Gaucherova choroba a další. Zatím není dostatečně probádán způsob, jakým molekuly infekční bílkoviny zasahují do proteosyntézy, respektive do procesu druhotné úpravy bílkovinných řetězců (Beneš et al., 2009).

3.1.4 Prionová hypotéza

Prionová hypotéza předpokládá, že původcem zodpovědným za šíření prionů je vznik PrPSc patogenní izoformy autokatalytickou konverzí. Přeměna na PrPSc zahrnuje drastickou

změnu

v konfiguraci

bílkovin

i

v

biochemických

vlastnostech.

Krystalografické studie ukazují, že v normálním stavu se 47% PrPC struktury skládá z α-šroubovice a pouze z 3% ze sekundární konfigurace β-skládaného listu. V procesu konverze se konfigurace β-skládaného listu zvyšuje na 43 − 45% a α-helix struktura se snižuje na 17 − 30% (Obr. 1). Proto je nově vytvořená struktura PrPSc velmi pevná a stabilní, prokazuje silnou rezistenci vůči teplotě, pH, desinfekčním prostředkům a enzymatické degradaci. Patogeneze TSE včetně mechanismu neuronové degenerace nebyla zatím přesně zcela objasněna. Předpokládá se, že přítomnost pouze samotného PrPSc v nervových buňkách může vést k toxickým účinkům několika mechanismy, včetně blokování 15

axonálního transportu, zasahování do synaptické funkce, nebo spouštění apoptické dráhy. Potenciální souvislost mezi PrPSc a PrPC během patogenního procesu by mohla popřípadě vést ke ztrátě anti-apoptické aktivity PrPC, vedoucí k neuronální smrti. Další hypotéza tvrdí, že PrPC může působit jako membránová kotva signální transdukce, kterou infikuje PrPSc toxickým účinkem. Specifické umístění pro PrPSc přeměnu zatím ještě nebylo určeno, ale předpokládá se, že k tvorbě PrPSc dochází na vnější stěně plasmatické membrány. K endocytóze PrPSc pak možná dochází zprostředkovaně ubiquitinovými a klarithinovými molekulami v degradačním prostředí lysozomu. Důkazy podporující prionovou hypotézu pocházejí ze studií, které potvrzují rezistenci k prionovým infekcím u myší, jimž chyběl gen PRNP (Peralta, 2011).

Obrázek 1. Struktura PrPC a PrPSc isoforem (Peralta, 2011)

16

3.1.5 Druhová bariéra

Při výzkumu bylo nejkratší inkubační doby nebo intervalu mezi naočkováním a klinickými příznaky onemocnění dosaženo intracerebrální inokulací prionů se stejnou sekvencí, jako mělo hostitelské zvíře. Za těchto podmínek všechna zvířata vyvíjela prionovou chorobu v krátkém intervalu charakteristickém pro konkrétní dávku. Pokud dárce prionu pocházel z jiného druhu než hostitelské zvíře, to znamená, že se sekvence lišila mezi infikovaným PrPSc a hostitelským PrPC, pak byla inkubační doba prodloužena a výrazně se lišila mezi jednotlivými naočkovanými zvířaty. Často se u očkovaných zvířat onemocnění ani nevyvinulo. Tento interval je dán nejen odlišnou sekvencí aminokyselin prionu dárce a příjemce ale i odlišným prostorovým uspořádáním PrP. PrP skotu a ovcí se liší na sedmi místech, skotu a člověka více jak na třiceti místech. Tento jev se nazývá druhová bariéra a poprvé ji popsal Ian Pattison (Prusiner, Colby, 2011; Beneš et al., 2009).

3.2 Priony kvasinek

Kromě živočichů se priony vyskytují i u jednobuněčných organismů, jakými jsou kvasinky. Tyto nižší eukaryoty jich mají hned několik. V roce 1971 Francois Lancroute popsal neznámou mutaci kvasinek. Až v roce 1994 Reed Wickner popsal, že jde o priony – strukturální dědičné determinanty (True, Lindquist, 2000; Galkin et al., 2006). Do roku 2010 bylo identifikováno devět prionů Saccharomyces cerevisiae a jeden prion Podospora anserina (Tabulka 1); (IngeVechtomov, 2011).

17

Kvasinkové priony jsou stejně jako u savců pozměněné celulární bílkoviny bez své normální funkce. Existují mezi nimi ale odlišnosti. Na rozdíl od živočichů priony nezpůsobují onemocnění ani svého hostitele neusmrcují (Pazdera, 2009). Priony kvasinek nejsou chromozomálně dědičné (Inge-Vechtemov, 2011). Fakt, že kvasinkové priony mají mnoho společného s priony savců, je využíván v lékařských výzkumech. Prion se využívá jako modelový systém pro výzkum prionových chorob a amyloidóz. Výhodou pro studie je snadnost genetické manipulace a rychlé tempo růstu kvasinek (Prusiner, Colby, 2011). Nejlépe prostudovanými priony jsou [PSI+] a [URE3] (Inge-Vechtemov, 2011).

Tabulka 1. Priony kvasinek (Inge-Vechtemov, 2011) Prion (phenotype, product)

Structural gene

Species

Normal function

[PSI+] (nonsense suppression)

SUP35

Saccharomyces cerevisiae

Translation termination factor

Source Cox, 1965; Wickner, 1994

[URE3] (reido - succinate assimilation)

URE2

Saccharomyces cerevisiae

Nitrogen catabolite repressor

Wickner, 1994

RNQ1

Saccharomyces cerevisiae

Derkatch e t al., 2001

HET-s

Podospora anserina

Protein template factor Regulets heterokaryon incompability global transcriptional regulator chromatin remodeling trancriptional repressor

[PIN+] ([PSI] initiation)

[Het-s] (incompatibility factor) [ISP+] (transcription factor Sfp1)

Coustou et al., 1997 Rogoza et al., 2010 Du et al., 2008 Patel et al., 2009

[SWI+] (chromatin regulation)

SWI1/SNF5

[OCT+] (transcription factor)

CYC8/SSN6

Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

MCA1

Saccharomyces cerevisiae

putative yeast caspase

Nemecek et al., 2009

MOT3

Saccharomyces cerevisiae

nuclear transcription factor

Alberty et al., 2009

[MCA] (metacaspase) [MOT3] (transcription factor)

[GAR+] (resistance to glucose repression)

SFP1

PMA1/STD1

Saccharomyces cerevisiae

18

Brown and Lindquist, 2009

3.2.1 Prion [PSI+] a [URE3]

Kvasinkový fenotyp [PSI+] popsal v roce 1965 Brain Cox, jako dědičný cytoplasmatický faktor, který ovlivňuje přesnost terminace translace (Galkin et al., 2006; True, Lindquist, 2000). V roce 1992 se zjistilo, že prion [PSI+] je totožný s genem SUP35, který je spolu s genem SUP45 odpovědný za schopnost správně rozpoznat terminační signál pro translaci a odštěpení peptidu od tRNA, tzv. STOP-kodon.

Když jsou buňky

Saccharomyces cerevisiae ve stavu [PSI+] (na rozdíl od [psi–] – což je normální nezměněný stav), vzrůstá pravděpodobnost, že se aminokyseliny překládají i přes STOP-kodony, které normálně určují konec translace. Podobné signály vznikají též mutacemi (když se triplet, který původně kódoval aminokyselinu, změní ve STOPkodon), čímž je většinou znemožněna správná syntéza příslušného kompletního funkčního proteinu (Lindquist, True, 2000). Klíčem k prionovému chování prionu [PSI+] kódovaného genem SUP35-Sup35 je podobně jako u prionového proteinu obratlovců PrP primární struktura – tedy pořadí aminokyselin. V proteinech se vyskytují unikátní oktapeptidová opakování, která jsou odpovědná za prionové vlastnosti těchto molekul. Mezi priony kvasinek a obratlovců je však jeden zásadní rozdíl. Přeměna buněčné formy prionového proteinu PrPC na formu infekční PrPSc je jednosměrný proces, který končí neurodegenerativním onemocněním a smrtí postiženého savce. V případě SUP35 je přeměna vratná. Tato vratnost tvarové změny umožňuje (zhruba s pravděpodobností 105 na generaci) přepínání mezi fenotypy [PSI+] a [psi–]. Uplatňují se při tom některé skupiny proteinů teplotního šoku (HSP27 a HSP70), buněčné dělení a vlivy vnějšího prostředí. Změny mezi aktivními a neaktivními formami někdy umožňují kvasinkám přežít v drastických podmínkách (Pazdera, 2009). Fenotyp [URE3] je prionovou formou genu Ure2, který obstarává regulaci metabolismu dusíku. Mutantní kmeny Ure2 a kvasinkové kmeny obsahující prion [URE3] jsou schopny využívat ureidosukcinát i za přítomnosti substrátů bohatých na dusík, kterého kvasinky běžně za přítomnosti dusíku nevyužívají (Inge-Vechtemov, 2011). 19

3.3 Prionová onemocnění zvířat

3.3.1 Bovinní spongiformní encefalopatie

V roce 1986 veterinář Gerald Wellse rozpoznal novou spongiformní encefalopatii skotu, která později byla pojmenována jako bovinní spongiformní encefalopatie (bovined spongioform encephalopathy), se zkratkou BSE. Lidově je známá pod názvem „nemoc šílených krav“ (Petr, 2001).

3.3.1.1 Etiopatogeneze

Původcem onemocnění je patogenní protein prion. K infekci skotu dochází při zkrmování masokostní (kafilerní) moučky obsažené v jadrných krmných směsích nebo v mléčných krmných směsích. Zdrojem infekce může být i kafilerní tuk. Po vstřebání v tenkém střevě se infekční agens dostává centrálně podél nervů a přes ganglia do míchy a mozku, výjimečně do očí. Po mnohaleté inkubační době se plíživě objeví u zvířat, zpravidla starších pěti let, klinické příznaky (Hofírek et al., 2009). Trvání klinického onemocnění je od jednoho do dvou měsíců, průměrná inkubační doba trvá čtyři až pět let. Typickým patologickým nálezem v mozku, zejména v šedé hmotě jsou: vakuoální degenerace neuronů a spongiformní degenerace neuropilů, odumírání neuronů, akumulace amyloidních plaků, pozůstávajících z abnormálního prionového proteinu, který je zakódován v genetické výbavě hostitele (Belay, 2001). Žádné prionové onemocnění skotu zatím nebylo zaznamenáno v Pákistánu. Byly prováděny analýzy sedmi různých plemen a výsledky naznačují, že pákistánský dobytek je geneticky odolnější (Imran, Mahmood, 2011).

20

3.3.1.2 Symptomy

Po uplynutí inkubační doby se začínají objevovat první symptomy. Zprvu se objevují nespecifické, všeobecné příznaky v různém stupni intenzity. Ze všeobecných příznaků je to především ztráta hmotnosti a pokles užitkovosti. Dále se objevují příznaky jako: bázlivost a strach před překážkami, agresivita vůči lidem (např. při dojení), neposlušnost, skřípění zuby, chvění, záškuby svaloviny hlavy, krku a slabin. Mezi pozdní příznaky patří přecitlivělost na hluk, pohyb, světlo, olizování, hra uší, objevují se také poruchy lokomoce, toporná chůze, svalový tremor, ataxie – nízké držení hlavy, kolísavá chůze, paréza zadních končetin, pády, zlomeniny a ulehnutí. Klinické příznaky mohou ukázat pouze na podezření. K potvrzení diagnózy je nutné laboratorní vyšetření mozku, mozkového kmene nebo prodloužené míchy, případně mozkomíšního likvoru (Hofírek et al., 2009, Watson, 2001). Seznam orgánů, u kterých byla izolována patologická forma PrP proteinu: mozek, prodloužená mícha, sítnice, distální ileum, dorsální ganglia, kostní dřeň. Tkáně BSE, ze kterých se nepodařilo detekovat PrP: kosterní a srdeční svalstvo, mléko, některé lymforetikulární tkáně (Belay, 2001).

3.3.1.3 Výskyt BSE v Evropě

Masokostní moučka se používala jako proteinový doplněk krmiv skotu, zejména dojnic od roku 1940. Koncem 70. a začátkem 80. let se změnila technologie kafilérního zpracování jatečních odpadů a uhynulých zvířat. Z důvodů nebezpečí výbuchu a pro karcinogenitu se vyloučilo z používání organické rozpouštědlo k extrakci kafilérního tuku a proto inaktivace infekčního agens nebyla dostatečně účinná. Předpokládá se, že k prvním přenosům BSE krmivem došlo v zimě 1981 – 1982.

21

K prvnímu výskytu BSE ve Velké Británii došlo v roce 1986. Následným legislativním opatřením k zábraně šíření BSE ve Velké Británii bylo od roku 1988 povinné hlášení BSE. Od roku 1989 byl vyhlášen zákaz používání rizikových vnitřností na potravinářské účely. V roce 1990 byl vydán úplný zákaz používání vnitřností na výrobu krmiva pro zvířata. Ve Velké Británii výskyt BSE dosáhl vrcholu v roce 1996 – 168 000 pozitivních případů. Do konce roku 2000 stoupl na cca 180 000. Omezený počet případů BSE byl zaznamenán u místního skotu ve Švýcarsku (361), Irsku (490), Portugalsku (402); (Belay, 2001). V červnu 2001 byla v České republice poprvé potvrzena nákaza BSE. Pozitivní nález byl zjištěn u dojnice z Dušejova poražené na jatkách Kosteleckých uzenin. Ze 134 kusů poraženého dobytka (aby mohly být provedeny testy) byla pozitivní pouze původní jedna dojnice (Petr, 2001). Poslední případ v České republice byl registrován v roce 2009 (World organisation for animal healthy, 2012). Zatím poslední výskyt BSE ve světě se objevil ve Švýcarsku v dubnu 2011. Šlo o atypický případ BSE, kdy se nákaza objevila u jednoho kusu skotu narozeného v roce 2003. V lednu 2011 se nákaza zjistila rovněž v Nizozemí. V obou případech byla do 14 dnů zlikvidována. Dále tři případy ve Francii, jeden v Kanadě, tři v Irsku, pět v Portugalsku, šest ve Španělsku (World organisation for animal healthy, 2012).

Tabulka 1. Výskyt BSE v Evropě od roku 1989 do roku 2011 (World organisation for animal healthy, 2012)

Country/Year Belgium Canada Czech republic France Germany Poland Ireland Slovakia Italy Spain Portugal Switzerland Netherlands U.K.

89 0 0 0 0 0 0

90 0 0 0 0 0 0

91 0 0 0 5 0 0

92 0 0 0 0

15

14

17

18

0 0 0 0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 1 0 0 16 0 0 0

1

1

1

3

2 0

8 0

15 0

29 0

1

0

93 0 1

94 0 0 0 4 0

95 0 0 0 3 0 0

19

16

0

0 0 0 15 68 0

3

2

0 12 64 0

7228 14407 25359 37280 35090 24438 14562

96 0 0 0 12 0 0 73 0 0 0 31 45 0

97 1 0 0 6 2

98 6 0 0 18 0 0 83 0 0 0 127 14 2

99 3 0 0

0 9 0 0

1 2 3 4 46 38 15 11 0 0 2 1 2 2 4 7

5 2 1 8 31 162 274 239 137 54 31 0 7 125 106 54 65 32 0 0 0 4 5 11 19 91 149 246 333 183 126 69 0 0 5 6 2 7 3 0 0 48 38 29 7 8 0 2 82 127 167 137 98 159 149 110 86 133 92 46 50 33 42 24 21 3 3 2 2 20 24 19 6 3

6 2 5 3 8 16 10

0 80 41 0 0 0 7 0 68 30 33 38 5 2 2 22 8149 4393 3235 2301 1443 1202 1144 611 343 225 114

7 0 3 2 9 4 9

8 0 4 0 8 2 5

25 23

1 2 36 14 0 2

0 1 25 18 0 1

9 10 11 0 0 0 1 1 1 2 0 0 10 5 3 2 0 0 4 2 1 9 2 3 0 1 0 2 0 0 18 13 6 8 6 5 0 0 2 0 2 1

67 37 12 11

7

3.3.1.4 Stanovisko a opatření EU

Komise Evropské unie v listopadu 1999 navrhla, aby z jatečných těl skotu byly odstraněny části, které jsou nejrizikovější pro šíření infekce a jsou považovány za možné riziko i pro lidi z hlediska vzniku CJD. Tyto části už neměly být součástí potravinového řetězce. Na základě návrhu bylo na konci ledna 2000 vydáno Rozhodnutí komise EU, které nařizuje všem členským státům zajistit, aby se živočišné tkáně potenciálně infikované původcem BSE od 1. října 2000 nedostávaly do potravního a krmivového řetězce. Od toho data musí všechny jateční provozy, bourárenské provozovny a asanační zařízení v EU respektovat nové harmonizované předpisy. Podle nového rozhodnutí se ve všech členských státech na jatkách v bourárnách a asanačních ústavech odstraňovaly tkáně, považované za rizikový materiál. Ve Velké Británii a v Portugalsku, kde existuje zvýšené riziko BSE, musela jatky, bourárny a asanační ústavy odstraňovat navíc: celou hlavu (bez jazyka ale s mozkem, očima a tonzilami) brzlík slezinu, vnitřnosti skotu staršího 6 měsíců; páteř včetně spinálních ganglií skotu ve věku nad 30 měsíců. Rozhodnutí také zakazuje od 31. 12. 2000 jateční techniky, u kterých se může tkáň infikovaná původcem BSE dostat do krevního řečiště a kontaminovat krev. Odejmutý rizikový materiál se obarví a zcela zničí, buď spálením, nebo zahrabáním na schválených skládkách. Je povolena přeprava rizikového materiálu do jiných členských států za účelem spálení. Dále Evropská komise schválila za účelem posílení kontroly nad BSE návrh Rozhodnutí o zavedení monitorovacího programu, platící v členských zemích od 1. ledna 2001. V rámci programu se využívají testy post mortem. Dne 22. 5. 2001 přijala Evropská unie dokument Nařízení Evropského parlamentu a rady (ES) č. 999/2001, kterým se stanovila pravidla pro prevenci, tlumení a eridikaci některých transmisivních spongiformních encefalopatií, které doplňuje předchozí Rozhodnutí. Toto Nařízení je platné dodnes (Kolektiv pracovníků ÚZPI, 2000; Europa, 2012). 23

3.3.1.5 Prevence BSE

V rámci prevence byl stanoven program laboratorního vyšetřování zvířat podezřelých z nákazy a program monitoringu. Tento program v České republice definuje Metodika kontroly zdraví zvířat a specifické profylaxe nákaz. Metodiku zpracovává a každoročně aktualizuje Státní veterinární správa ČR a schvaluje Ministerstvo zemědělství ČR. Kromě kontrol povinných u všech zvířat, která vykazují příznaky vyvolávající podezření na BSE, musí být v rámci prevence zrychlené posmrtné vyšetření u: •

Veškerého skotu staršího 24 měsíců, určeného k lidské spotřebě, na který se vztahuje nucená porážka.

•

Veškerého skotu staršího 30 měsíců, poraženého za normálních podmínek k lidské spotřebě nebo v rámci kampaně na eradikaci BSE.

•

Veškerého skotu staršího 24 měsíců, který nebyl určen k lidské spotřebě nebo byl usmrcen či poražen, ale ne v rámci epizootie, jako je slintavka a kulhavka. Státy Evropské unie se mohou odchýlit od těchto ustanovení ve vzdálených oblastech s nízkou hustotou zvířat, kde se neorganizuje svoz mrtvých zvířat. Musí o tom však informovat Komisi. Výjimka se nesmí vztahovat na více než 10 % populace skotu v dotčeném členském státě.

•

Veškerého skotu staršího 24 měsíců prohlášeného za nakažený na základě vyšetření provedeného před porážkou.

Nařízení z roku 2001 v rámci prevence BSE zakazuje používání živočišných bílkovin a krmiv obsahujících tyto bílkoviny v krmivu přežvýkavců. V krmivu farmových zvířat (s výjimkou masožravých kožešinových zvířat) je zakázáno použití zpracovaných živočišných bílkovin, želatiny pocházející z přežvýkavců, krevních produktů, hydrolyzovaných bílkovin, difosforečnanu vápenatého a trifosforečnanu vápenatého živočišného původu. Specifickým rizikovým materiálem (SRM) skotu je: Lebka kromě dolní čelisti, ale včetně mozku a očí, a mícha zvířat starších 12 měsíců. Páteř kromě ocasních obratlů, trnových a příčných výběžků krčních, hrudních a bederních obratlů, hřeben kosti křížové a křídla kosti křížové, avšak včetně míšních nervových uzlin zvířat starších 24

30 měsíců a mandle, střeva od dvanácterníku ke konečníku a okruží zvířat jakéhokoli stáří. Specifikovaný rizikový materiál se odebírá na jatkách, v bourárnách u páteře skotu a v případě potřeby ve schválených zařízeních uvedených v nařízení (ES) č. 1069/2009 o vedlejších produktech živočišného původu, které nejsou určeny k lidské spotřebě. Veškerý specifikovaný rizikový materiál nebo vedlejší produkty se ihned při odstranění obarví a případně označí značkou. Nakládá se s ním a při jeho likvidaci se postupuje v souladu s nařízením (ES) č. 1069/2009. Členské státy musí provádět časté úřední kontroly, aby ověřily dodržování těchto ustanovení a zajistily, aby byla přijata opatření k prevenci kontaminace v celém odvětví. Členské státy zajistí, aby zaměstnanci příslušných orgánů, diagnostických laboratoří, zemědělských a veterinárních škol, úřední veterinární lékaři, praktičtí veterinární lékaři, zaměstnanci jatek, chovatelé zvířat byli vyškoleni v klinických příznacích a epizootologických šetřeních s ohledem na TSE. Součástí prevence BSE je také pokračovat ve výzkumu transmisivních spongiformních encefalopatií a zdokonalovat laboratorní diagnostické testy (Europa 2012; Státní veterinární správa, 2012).

Opatření při podezření nákazy BSE Zvířata podezřelá z nákazy TSE jsou úředně omezena v pohybu do doby, než jsou známy výsledky klinických a epizootologických vyšetření, nebo za úředního dohledu usmrcena pro laboratorní vyšetření. Všichni ostatní přežvýkavci z tohoto hospodářství jsou úředně omezeni v pohybu do doby, než jsou k dispozici výsledky vyšetření. Existují-li doklady, že hospodářství, kde bylo zvíře přítomno v době podezření z infekce TSE, pravděpodobně není hospodářstvím, kde mohlo být zvíře infikováno TSE, může příslušný orgán rozhodnout, že pouze zvíře podezřelé z infekce je úředně omezeno v pohybu, nebo může rozhodnout o úřední kontrole nad dalšími hospodářstvími (Europa, 2012; Státní veterinární správa 2012).

25

Opatření při potvrzení výskytu nákazy Je-li úředně potvrzen výskyt BSE, je třeba přijmout tato opatření: •

Provede se vyšetřování s cílem identifikovat možný původ nákazy a

všechna zvířata a vedlejší produkty, které mohly být kontaminovány. •

Při potvrzení výskytu BSE u skotu jsou všechna zvířata, která byla při

vyšetřování identifikována jako ohrožená, usmrcena a zlikvidována (zvláště zvířata patřící do kohorty dle narození nebo dle krmiva pozitivního zvířete). Členský stát se může rozhodnout odložit usmrcení a likvidaci zvířat do konce jejich produktivního života za předpokladu, že to jsou býci nepřetržitě chovaní v inseminační stanici a lze zajistit, že po smrti budou zcela zlikvidováni.

Než jsou známy výsledky vyšetření, je hospodářství, ve kterém bylo zvíře přítomno při potvrzení výskytu TSE, pod úředním dohledem, a veškerý pohyb zvířat vnímavých k TSE (a produktů živočišného původu) z hospodářství nebo do něj je přísně podmíněn schválením příslušného orgánu. Toto opatření zaručuje rychlou identifikaci a účinné vysledování dotyčných zvířat (nebo produktů živočišného původu). Pokud se zjistí, že hospodářství, kde bylo TSE potvrzeno, není to, kde bylo zvíře vystaveno původci TSE, orgány mohou uvalit kontrolu na další hospodářství vedle toho, kde bylo zvíře vystaveno nákaze. Z těchto obecných pravidel mohou být uděleny výjimky (Europa, 2012).

3.3.1.6 Diagnostika

Pro diagnostiku BSE se používají: Rychlé (tzv. screeningové) testy •

Imunoblotting test založený na principu Western blot pro detekci protézarezistentního fragmentu PrPRes.

26

•

Chemiluminescenční ELISA test zahrnující extrakční postup a metodiku ELISA, pro použití vylepšeného chemiluminiscenčního reagentu.

•

Sendvičová imunoanalýza pro PrPRes.

Konfirmační testy •

Imunohistochemická metoda (IHC) pro průkaz protéza-rezistentního prionového proteinu ve tkáních CNS.

Otatní testy •

Elektron mikroskopická metoda pro průkaz specifických fibril SAF (scrapie associated fibrils) v homogenizátu mozkomíšní tkáně. Ta se ale v běžné diagnostické praxi nevyužívá.

•

Histologická metoda pro průkaz charakteristických degenerativních změn v CNS.

K zajištění jednotného postupu vědeckých rozborů a spolehlivých výsledků testů jsou zřizovány národní a evropské referenční laboratoře. Národní referenční laboratoře zodpovídají hlavně za ověření diagnostických metod užívaných v regionálních laboratořích a jejich koordinaci v rámci členského státu. Spolupracují s evropskou referenční laboratoří. Pro diagnostiku TSE na území ČR jsou schváleny tři laboratoře Státních veterinárních ústavů: SVÚ Praha 6, SVÚ Jihlava, SVÚ Olomouc (Barták et al., 2002; Europa, 2012; Státní veterinární správa, 2012).

3.3.2 Klusavka (scrapie, drbavka)

Klusavka (scrapie-asssociated fibrilis) je chronicky probíhající onemocnění centrální nervové soustavy postihující převážně ovce a je přenosné i na kozy. Šíří se horizontálně mezi zvířaty i vertikálně z matky na plod. Inkubační doba je dva roky až pět let a průběh onemocnění trvá od šesti týdnů do půl roku. Klusavka byla poprvé popsána v roce 1732. Dlouhou dobu se etiologie dávala do souvislosti s poruchami ve 27

výživě nebo dědičností, pro kterou svědčí především různá plemenná vnímavost. První průkaz experimentálního přenosu z ovce na ovci se zdařil v roce 1936 a to po intrakonjuktivální aplikaci mozkové suspenze z nemocné ovce. V roce 1939 byla klusavka experimentálně přenesena na kozu. Navzdory těmto poznatkům se dlouhou dobu nedařilo infekční agens izolovat (Hofírek et al., 2002). Odlišnost jednotlivých TSE u ovcí je v podstatě dána různou fenotypickou expresí jednoho patogenetického procesu. Nejčastěji se onemocnění projevuje u ovcí plemen Suffolk, Leicester a Cheviot (Halouzka, Černík, 2002). Zeměmi, kde se klusavka vyskytuje, jsou: Rakousko, Bělorusko, Španělsko, Německo, Švýcarsko, USA, Ghana, Japonsko, Somálsko. V Austrálii a na Novém Zélandě doposud nebyl zaznamenán žádný případ tohoto onemocnění (Belay, 2001).

3.3.2.1 Přenos onemocnění

Přenos se děje zpravidla per os příjmem infikovaného krmiva, pitím kontaminované vody nebo pozřením částí plodových obalů. Zvířata jsou k infekci náchylná v každém věku. Jehňata se mohou nakazit intrauterinně, při porodu, při polknutí plodové vody nebo při olizování infikovanou matkou. V kontaminovaném prostředí je možná také pupeční infekce. Ovce se nakazí rovněž kontaktem. V rámci plemene je vnímavost k onemocnění ovlivněna geneticky, což se prakticky projevuje v délce inkubační doby, která je udávána od několika měsíců až po několik let (Hofírek et al., 2002).

3.3.2.2 Klinické příznaky

Ovce onemocní zpravidla ve věku dva až pět roků, výjimečně i mladší. Doba onemocnění se pohybuje od dvou týdnů do šesti měsíců v závislosti na infekčnosti 28

původce, případně genetické dispozici nebo rezistenci zvířete. Zvířata hynou bez výjimky. Nejčastěji se popisují následující příznaky: špatný výživný stav, neklid, plachost, bojácnost, zvláštní strnulý pohled, vzpřímené a chvějící se uši, chvění pysků, nutkavé pohyby žvýkacích svalů a nadměrné slinění, lekavost, pád a zhroucení, poruchy při pohybu, při běhu poklesávání pánevních končetin, klusavý pohyb hrudních končetin, kohoutí krok pánevních končetin s následnou nejistou a kolísavou chůzí, přiklekávání a otírání paznehtů o podložku, svědění, zvířata si otírají nebo okusují kořen ocasu, záď, stěny hrudníku a končetiny, při čemž dochází k poškození rouna a vypadávání vlny. Všechny uvedené příznaky nemusí být vždy vyjádřeny, může chybět svědění a také vysílení zvířat může být omezeno až na finální stadium onemocnění, které je charakterizováno ulehnutím, neschopností vstát a stupňujícími se neuromotorickými alteracemi (Hofírek et al., 2002). Výše uvedené symptomy jsou typické pro klasickou klusavku ovcí. Byly popsány také atypické případy klusavky ovcí a koz. U atypické klusavky jsou hlavími klinickými příznaky ataxie a poruchy koordinace, svědění bývá naopak neobvyklé (Imran, Mahmood, 2011).

3.3.2.3 Laboratorní diagnostika klusavky

Pro diagnostiku klusavky se používají jako u BSE Rychlé (screeningové) testy – imunoblotting test, western blot, chemiluminescenční ELISA test, sendvičová imunoanalýza. Konfirmační testy – imunohistochemická metoda (IHC), kterou lze u ovcí nebo i jelenovitých zachytit infekční prion v lymfatické tkáni (mandle, hlavové mízní uzliny, lymfatická tkáň třetího víčka) již o několik měsíců před výskytem prionu v nervové tkáni. Této metody lze tedy využít pro intravitální detekci ovcí nemocných scrapií, které ještě neprojevují typické klinické příznaky. Ostatní metody – hostologická metoda, elektron mikroskopická metoda (Barták et al., 2002; Europa, 2012).

29

3.3.2.4 Prevence klusavky

V rámci základních preventivních opatření je důležité zejména: Průběžně vzdělávat pracovníky, kteří se podílejí na prevenci nákazy i jejím zdolávání. To znamená vzdělávat chovatele, obchodníky, přepravce, veterinární lékaře a jiné osoby přicházející do kontaktu se zvířaty. Výše uvedená metodika Státní veterinární správy u BSE stanovuje také, že v ČR budou laboratorně vyšetřena: •

Podezřelá zvířata uhynulá nebo utracená starší 18 měsíců vykazující změnu chování nebo příznaky postižení nervového systému. Rozsah vyšetření určí Státní veterinární správa ČR.

•

V rámci monitoringu zvířata starší 18 měsíců uhynulá nevykazující změnu chování, nebo nutně poražená (chronicky chřadnoucí zvířata) podle rozpisu Státní veterinární správy ČR.

Opatření při podezření nákazy V případě, že veterinární lékař na základě klinických příznaků a průběhu léčby klusavku nevyloučí, je chovatel dle veterinárního zákona povinen společně se svým veterinárním lékařem nahlásit toto podezření příslušné okresní či městské veterinární správě. Její inspektor podezřelé zvíře vyšetří. V případě, že klusavku nevyloučí, nařídí předběžná veterinární opatření, včetně uzávěry chovu a utracení podezřelého zvířete. Současně zajistí odběr vzorku mozkové tkáně utraceného zvířete k laboratornímu vyšetření. V případě, že klusavka nebude laboratorně potvrzena, budou předběžná opatření odvolána a v chovu nadále nebudou platit žádná omezení. V případě jejího potvrzení budou vydána mimořádná veterinární opatření. Za případné neoznámení podezření z výskytu klusavky může příslušná OVS uložit pokutu.

30

Opatření po potvrzení nákazy Opatření při výskytu nákazy v evropských zemích ať už členských zemí či třetích zemích se orientují právě podle zásad obsažených v nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č.999/2001 (Holešovský, 2002; Europa, 2012).

3.3.3 Chronická katechizující choroba jelenovitých

Toto prionové onemocnění postihující vysokou zvěř se často nazývá také chronické vyčerpání (chronic wasting disease − CWD) a někdy lidově i „nemoc šílených jelenů“ (mad deer disease). Výskyt choroby je omezen na určité oblasti Severní Ameriky. Nemoc byla poprvé zaznamenána v roce 1967 v zoologické zahradě v Coloradu. Dále také v Zoo v jihovýchodním Wyomingu a v jižní Dakotě na farmě losů. Později byla zjištěna u volně žijících losů a tří dalších blíže nespecifikovaných druhů vysoké zvěře (Weisenbacher, 2002; Belay, 2001; Imran, Mahmood, 2011). Druhy, u kterých je možný přenos onemocnění, jsou: jelenec ušatý, jelenec běloocasý, jelenec černoocasý, Rocky-mountainský los, severoamerický los. Zatím je chronické chřadnutí jelenovitých jedinou známou TSE u volně žijících zvířat. Původ CWD zatím není známý, přestože byl prokázán intracerebrální přenos klusavky na losa. Epidemiologické a experimentální údaje prokázaly, že horizontální přenos chronického chřadnutí se může vyskytnout při kontaktu s postiženými zvířaty nebo prostřednictvím expozice životního prostředí. Avšak dodnes přírodní chronické chřadnutí nebylo zjištěno u lidí dlouhodobě vystavených místům s výskytem choroby a konzumovali zvěřinu, ani u hospodářských zvířat chovaných v postižených místech. Dlouhodobé ustájení skotu, ovcí a koz s infikovanými zvířaty nepotvrdilo přenos nákazy. Transgenní myši vyjadřující PrPC člověka, ovce nebo skotu nevyvinuly onemocnění po inokulaci původcem chronického chřadnutí vůbec (Imran, Mahmood, 2011; Belay, 2001).

31

Nicméně na jiné jelenovité jako jelena a soby je intracerebrálně a orální cestou přenosné. Citlivá zvířata mohou být infikována na svých stanovištích při spásání trávy nebo pití vody kontaminované prionem chronického chřadnutí (PrPCWD), který se do prostředí dostal v podobě výkalů, moči, slin, krve, placenty nebo těl mrtvých zvířat. Riziko nakažení může být zvýšeno odřeninami v dutině ústní a nosní po vystavení PrPCWD v kapičkách a aerosolech. PrPCWD mohou vázat také půdní částice, v nichž přetrvává celá léta a udržuje si svou infekčnost, přenos prostřednictvím orální cesty je pak ještě účinnější. To vysvětluje vysoký výskyt a efektivní přenos CWD mezi jelenovitými. Výskyt onemocnění v postiženém stádě se pohybuje od 0,1 – do 50 % někdy i 100 %. Chronické chřadnutí ale bylo zaznamenáno také v oblastech USA daleko od původní endemické oblasti. Na otázku, jak se mohlo onemocnění dostat i do tak vzdálených oblastí od původního ohniska nákazy, zatím nebyla nalezena uspokojivá odpověď. Klinickými příznaky chronického chřadnutí jsou: ochablé obličejové svaly, skřípání zuby, neustálá chůze podél plotů nebo ohrad, nadměrné slinění, obtížné polykání, dilatace jícnu, polyurie, polydipsie, aspirační pneumonie. CWD může také způsobit, že nemocná zvířata mají hrubou, suchou srst a nestejnorodé pokrytí zimní srstí. Inkubační doba je šestnáct měsíců až pět let, onemocnění postihuje jak samce, tak samice. Smrt nastává většinou během jednoho roku od nástupu klinických příznaků. Histopatologické vyšetření CNS z postižených jelenů ukazuje intraneuronální vakuolizaci, degeneraci, ztrátu neuronů a občasné amyloidní plaky. Spongioformní léze jsou pozorovány hlavně v hypotalamu, thalamu, středním mozku, prodloužené míše a mozkové kůře. Nejvíce konzistentní histologické léze a imunohistochemické skvrny PrPCWD jsou viditelné v dorsálních motorických jádrech bloudivého nervu, který je považován za první místo akumulace PrPCWD (Imran, Mahmood, 2011).

3.3.4 Transmisivní encefalopatie norků

Toto onemocnění u norků má zkratku TME podle anglického názvu Transmissible Mink Encephalophaty. Vyskytuje se výlučně u norků chovaných na farmách 32

(Weisenbacher, 2002; Belay, 2001). První případ byl zjištěn ve Wisconsinu a Minnesotě v roce 1947. Další záznamy pochází z 60. a 70. let, z různých míst v USA, ale byla také zaznamenána u norků chovaných v Kanadě, Finsku, Východním Německu a na území bývalého SSSR. K poslednímu případu vypuknutí epidemie TME došlo v roce 1985 v USA. Zatím nebyl přesně zjištěn původ nákazy, nejmladší studie ale popisují BSE L-typu jako nejpravděpodobnějšího kandidáta způsobujícího TME (Imran, Mahmood, 2011; Weisenbacher, 2002). Norci bývají chováni na farmách v relativně těsných podmínkách a jsou krmeni odpady z jatek a uhynulými kusy dojnic. Vzplanutí nákazy se objevuje zřídka, ale pokud k němu dojde, uhynou většinou všechna zvířata chovaná na farmě. TME je snadno přenosná parenterální, intracerebrální a orální cestou na mývaly. Může být přenesena intracerebrálně i na skunky, fretky, americké soboly, kuny, kozy, skot, ovce, křečky a subhumánní primáty − jako je makak rhesus nebo kotula veverkovitá. Non-transgenní myši nejsou k TME náchylné. Pokud sídlí norci ve stejné kleci, mohou se nakazit kanibalismem nebo vzájemným pokousáním. Jako příčina šíření infekce nebyl zjištěn vliv okolního prostředí ani vertikální přenos. TME bylo zaznamenáno jen u dospělých norků a způsobuje 60 − 90% dokonce i 100% úmrtnost během vypuknutí nákazy. Klinickými příznaky jsou: deprese, neklid, zanedbávání rodičovské péče a péče o srst. Pozdějším příznaky jsou: třes, svíravé křeče čelistí, zkroucení ocasu (do tvaru jaký mají veverky), nutkavé kousání objektů nebo sebe samých. Na konci průběhu onemocnění mohou být viděni s hlavou hodiny přitisknutou proti kleci. Inkubace onemocnění je 6 − 12 měsíců a smrt nastává během 2 − 8 týdnů (Imran, Mahmood, 2011).

33

3.3.5 Felinní spongiformní encefalopatie

První

případ

Felinní

spongiformní

encefalopatie

(Feline

spongioform

encephalophaty – FSE) byl zaznamenán v roce 1990, ve Velké Británii u 6 let staré kočky domácí. Od roku 1990 do současnosti bylo FSE diagnostikováno u téměř sta domácích koček převážně z Velké Británie. Po jednom případu bylo zaznamenáno i v Severním Irsku, Norsku, Lichtenštejnsku a Švýcarsku. Dále bylo zjištěno u 29 kočkovitých šelem chovaných v zajetí a to u: patnácti gepardů, čtyř lvů, tří ocelotů, pum, tygrů a tří asijských zlatých koček. Tyto kočkovité šelmy byly chovány v zoologických zahradách ve Velké Británii, Francii, Austrálii, Německu i Irsku. Všechny tyto šelmy však původem pocházely z Velké Británie s výjimkou jedné z Francie, která se nakazila nejspíše v Holandsku, kde se narodila. Všechny případy FSE byly pozorovány u koček starších dvou let. Protože k většině případů FSE došlo souběžně s BSE, byla považována BSE za původce encefalopatie koček. Díky zákazu používání sleziny a CNS tkáně skotu jako krmiva pro domácí zvířata epidemie FSE prudce klesla. V roce 1998 se však nakazila domácí kočka a její majitel. U muže byl zjištěn fenotyp podobný CJD více než vCJD a u kočky byl zjištěn odlišný fenotyp než u FSE. U žádné jiné kočky nebyl nikdy takový fenotyp FSE zjištěn. Zůstává dodnes neobjasněno, zda došlo k horizontálnímu přenosu mezi kočkou a člověkem nebo nákaza pochází z jednoho stejného neznámého zdroje. Mezi klinické projevy onemocnění patří: změny v chování, deprese, neklid, zanedbávání péče o srst. Změny chování se projevují strachem, netypickou agresivitou, bojácností a skrýváním se. Déle tyto kočky často vykazují špatný odhad vzdálenosti, hyperstezii na dotek nebo šum, nadměrné slinění, trpí polydipsií a mohou se také třást nebo zírat do prázdna. Ke konci průběhu choroby nastávají křeče a kočky trpí nadměrnou ospalostí. Smrt nastává po 3 − 8 nebo 8 − 10 týdnech (Imran, Mahmood, 2011).

.

34

3.3.6 Encefalopatie exotických kopytníků

Encefalopatie exotických kopytníků (Exotic ungulate ecephalophaty − EUE) je TSE exotických přežvýkavců chovaných v zoologických zahradách. Byla objevena v roce 1986. V období kdy vypukla epidemie BSE, byla diagnostikována encefalopatie exotických kopytníků ve Velké Británii u šesti kudu velkých, šesti antilop losích, dvou přímorožců arabských, dvou Watusi (Vahumský skot), jednoho přímorožce-oryx, jedny nyaly nížinné, jednoho přímorožce šavlorohého a jednoho bisona. Ve všech případech tato zvířata zemřela. Nakažená zvířata byla krmena masem a masokostní moučkou pocházející z přežvýkavců, původcem nákazy je tedy s největší pravděpodobností BSE. Myši s inokulovaným mozkovým homogenátem z kudu velkého a nyaly nížinné s EUE a myši s inokulovaným homogenátem z mozku skotu s BSE prokazovaly onemocnění TSE s podobnými profily neuropatologických lézí a inkubační dobou. Průběh EUE a klinické příznaky se liší podle druhu kopytníků, společnými příznaky ale jsou: změny chování, třes a slinění (Belay, 2001; Imran, Mahmood, 2011).

3.3.7 TSE subhumánních primátů

V letech 1996 − 1999 byla diagnostikována TSE u dvou lemurů bělohlavých, jednoho lemura běločelého, jednoho lemura mongoz, jednoho makaka rhesus a tří neuvedených primátů z Francie. Všichni primáti pocházeli ze zoologických zahrad. Postižená zvířata měla být nakažena krmivem, které bylo kontaminováno masem s BSE z Velké Británie. Neuropatologické léze, které se vyvinuly u lemurů experimentálně naočkovaných homogenátem BSE, byly podobné jako u přirozeně infikovaných lemurů (Imran, Mahmood, 2011).

35

3.3.8 TSE ostatních zvířat

V roce 1991 byla popsána TSE u pštrosů a byla nazvána jako: Bližší nespecifikované TSE pštrosů (Imran, Mahmood, 2011). TSE se vyskytují také u myší a křečků. Toho faktu se využívá při výzkumech transmisivních spongiformních encefalopatií (Beneš et al., 2009).

3.4 Humánní prionová onemocnění

3.4.1 Historie

Z historického hlediska je v lékařské literatuře popsána jako nejstarší choroba tohoto typu Creutzfeldt-Jakobova choroba (CJD), a to od dvacátých let 20. století (Mareš et al., 2003). O dvacet let později byla popsána Gertsmann StrausslerScheinkerova choroba (GSS); (Mareš et al., 2003). Do šedesátých let 20. století byly prionové choroby nazývány pouze jako degenerativní onemocnění, aniž by byl znám původce (Bednář et al., 1984). V roce 1954 islandský patolog Sigurdsson zavedl označení „pomalé infekce“ (atypically slow infections) pro původce pozvolna progredující onemocnění ovcí, které vždy vedlo ke smrti a poprvé bylo popsáno již v 18. století jako scrapie a maedi (Beneš et al., 2009). A proto byl až do osmdesátých let 20. století původce onemocnění považován za infekci „pomalými viry“ (Havlík, et al., 1990). V roce 1959 upozornil veterinární patolog Hadlow na podobnost histologických nálezů u scrapie a lidského onemocnění kuru. V roce 1965 prokázal Gajdůšek přenos nemoci kuru na šimpanze a v r. 1968 se mu podařil i přenos CJD na šimpanzici Daisy (Beneš et al., 2009). Degenerativní onemocnění od té doby byla nově pojmenována jako spongioformní encefalopatie, tedy neurodegenerativní onemocnění s převažujícími extrapyramidovými symptomy. Toto pojmenování se používá dodnes (Mareš et al., 2003). 36

V roce 1982 zavedl Prusiner označení prion pro původce zodpovědného za přenosná neurodegenerativní onemocnění (transmissible neurodegenerative diseases). Roku 1984 identifikoval Prusiner prionový gen a prokázal jej u zvířat i u lidí (Beneš et a.l, 2009). V osmdesátých letech byla také popsána prionová podstata u progresivní spastické paraparézy dolních končetin a u již déle známého onemocnění Alperův syndrom (Urbánek, 2000). V devadesátých letech 20. století se do seznamu prionových onemocnění připojila fatální familiární insomnie (FFI); (Mareš et al., 2003). Nejmladším prionovým onemocněním, je tzv. nová varianta Creutzfeldt-Jakobovy nemoci (vCJD), které bylo rozpoznáno v devadesátých letech 20. století (v roce 1996 ve Velké Británii). V roce 1997 obdržel profesor Prusiner za výzkum prionů Nobelovu cenu (Beneš et al., 2009).

3.4.2 Patogeneze

Typickým znakem pro všechna prionová onemocnění je odchylný metabolizmus a následné hromadění PrP. Existují tři možné způsoby vzniku choroby: dědičný, sporadický a infekční. V případě dědičných – hereditárních prionových chorob dochází k tvorbě patologického proteinu následkem mutace genu pro PrP. Při sporadických spongiformních encefalopatiích dochází ke spontánní konverzi fyziologického PrP na jeho patologickou formu. A v případě získaných neboli infekčních − iatrogeních prionových chorob se celulární prion dostává do kontaktu se získaným patologickým prionem, který navodí změnu jeho prostorového uspořádání. V těle hostitele se TSE agens šíří lymfatickou a nervovou tkání (mechanismus): Lymfatická tkáň: Peyerovy plaky (ileum) – intestinální lymfatické uzliny – slezina

37

Nervová tkáň: podslizniční pleteň stěny tenkého střeva – myenterická pleteň (mezi podélnou a kruhovou svalovinou stěny tenkého střeva) – mezenteriální uzlina – splanchnická (útrobní) část parasympatiku (n. vagus), resp. sympatiku (n. splanchnicus) – páteřní mícha – dorzální míšní ganglia – mozek (Komprda, 2004). Šíření patogenní izofoty v nervové tkáni postiženého organismu je pak zřejmě možné dvěma způsoby: •

PrPSc se váže na prionové receptory zdravých nervových buněk a

indukuje v nich změnu tvorby normálních PrP na produkci patogenních forem – tedy začne měnit prostorové uspořádání místního PrPC na PrPSc. •

Shluky molekul PrPSc vytvářejí krystalizační jádra (seed) kolem nich se

nabalují priony PrPC a mění se na PrPSc. Patogenní izofota prionu se neintegruje do buněčných membrán, ale hromadí se v mozku nemocných – v buňkách i mimo ně, shlukuje se v amyloidní fibrily a tvoří amyloidní plaky. Společným histologickým obrazem je tvorba vakuol, ukládání amyloidních mas a chybění známek zánětu. U žádné z těchto skupin nemoci nedochází k infiltraci mozkové tkáně jindy všudypřítomnými leukocyty, představiteli obrany organismu (Beneš et al., 2009).

3.4.3 Epidemiologie

U infekčních forem prionových chorob existují dva základní způsoby přenosu: Alimentární – způsobený požitím potravy obsahující infekční priony. Iatrogenní – zapříčiněný lidským růstovým hormonem či gonadotropiny získanými z hypofýz zemřelých osob, transplantací (dura mater, korneální transplantace), kontaminovanými stereotaktickými elektrodami a chirurgickými nástroji. Zvláštním případem iatrogenního přenosu je přenos krevní transfúzí. Existují totiž zprávy o experimentálním přenosu TSE krví u ovce a křečka (Beneš et al., 2009).

38

V případě vCJD se člověk (nejspíše) nakazí potravinami obsahujícími infekční prionový protein bovinního původu. Jednoznačný přímý důkaz však doposud chybí, ale nepřímé důkazy v následujících oblastech jsou přesvědčivé: Epidemiologie: vCJD se do dnešní doby vyskytla pouze v zemích s rozsáhlým výskytem BSE. Biochemie: velmi podobná glykosylace a obdobné štěpení enzymem proteázou K u osob zemřelých na vCJD a u skotu uhynulého na BSE. Neurohistopatologie: nervová tkáň v případě BSE a vCJD poskytuje stejný histologický obraz, zatímco neurohistopatologický obraz BSE a klasické formy CJD je odlišný (Komprda, 2004).

3.4.4 Přehled humánních onemocnění

3.4.4.1 Creutzfeldt-Jakobova nemoc

Celosvětově se Creutzfeldt-Jakobova nemoc (CJD) vyskytuje jen zřídka (v poměru 1:1 000 000). Postihuje především staré lidi kolem šedesáti pěti let, kteří mají dědičnou predispozici – mutovaný gen. Z 15 % je hereditárního původu (asi 30 subtypů s různou mutací), dále může vznikat iatrogenní CJD (v méně než v 5 % případů, vzniká především při transplantaci rohovky, implantaci dury mater, kontaminací chirurgických nástrojů a injekcí růstového hormonu) a sporadická CJD, jenž se vyskytuje v 85 % případů (asi 1/1 000 000 obyvatel/rok); (Mareš et al., 2003). Při zkoumání postižené mozkové tkáně jsou nalézány spongiformní degenerace s okrouhlými vakuolami v neuropilu a s patologickým zmnožením gliových buněk při mírné mozkové atrofii. Klinickým obrazem je stále klesající psychická a fyzická aktivita (Mamenthaler, Mattle, 2001). Zprvu se projevuje poruchami zraku, obvyklé je zamlžené, dvojité vidění 39

a poruchami paměti − běžný je pocit zastřené mysli. Časně narušena je i rovnováha a koordinace v důsledku mozečkové degenerace: vrávoravá chůze, závratě a pády, svalová slabost, rigidita, třes. Časté jsou rovněž i četné dysestézie, mravenčení, pocity znecitlivění, či lepkavé kůže, nebo tzv. myoklonus − mimovolné svalové záškuby. Souběžně se rozvíjejí i degenerativní změny osobnosti a poruchy chování: deprese, apatie, plačtivost, negativismus, halucinace, záchvaty strachu a křiku, rozbíjení věcí. Následuje období rychle progredující demence − týdny, až měsíce, končící stavem akinetického mutismu, nemocný je znehybněný, strnulý, neodpovídá na jakékoliv podněty, ačkoliv má otevřené oči; osobnost i vyšší nervová činnost je vymizelá, zachovány bývají pouze primitivní reflexy, následuje smrt (Capellari et al., 2010).

3.4.4.2 Gertsmann Sträussler-Scheinkerova choroba

Gertsmann Sträussler-Scheinkerova choroba (GSS) se vyskytuje u lidí s vrozenými predispozicemi, je tedy geneticky podmíněná a dědičná. Svým průběhem je podobná roztroušené mozkomíšní skleróze – manifestuje se ataxií a dalšími příznaky poškození mozku, jako je demence (Mareš et al., 2003; Wikipedia, 2012). Smrt následuje po dvou až šesti letech od projevu prvních příznaků, jimiž jsou: potíže při mluvení, ztráta paměti, poruchy vidění, dokonce i slepota nebo hluchota. Nemoc byla poprvé popsána u rodiny pocházející z Vídně a je pojmenována podle Josefa Gertsmanna, Ernsta Sträusslera a Ilji Scheinkera. Do současnosti bylo zaznamenáno přibližně padesát rodin s GSS, toto onemocnění je tedy velmi vzácné (Mareš et al., 2003).

3.4.4.3 Kuru

V padesátých letech 20. století bylo zjištěno onemocnění kuru, postihující výlučně kanibaly kmene Fore v Papui Nové Guineji, kteří jedli při rituálním pohřbívání mozek zemřelého. Americký neuropatolog slovenského původu Daniel Carleton Gajdůšek 40

rozpoznal její podstatu a tyto praktiky byly ukončeny. Tímto byla kuru prakticky vymícena. Kuru má v místní řeči dva významy: třas a smrtelné uřknutí. Někdy se této nemoci říká i „smějící se nemoc“. Choroba začíná bolestmi hlavy, kloubů a třesem končetin. V druhé fázi nastávají změny v chování, pokles intelektu, třes, který se stupňuje (např. světlem), pacienti trpí depresemi, ale může docházet i k nekontrolovatelným záchvatům smíchu, brzy dochází k demenci a svalovým atrofiím. Poté nastávají poruchy koordinace a řeči, ataxie, dysfagie. Po 3 − 9 měsících nastává smrt z kachexie. Morfologicky je kromě výrazné trofie pozoruhodný výskyt četných argyrofilních amyloidních plaků, zejména v mozečkové kůře. Výrazná je i gliosa a rudimentární perivaskulární kulatobuněčná reakce. V pozdějších letech bylo rozeznáváno několik variant této choroby, z nichž nejznámější je Heidenheinova varianta (s okcipitální lokalizací) s dominující optickou symptomatikou (Mareš et al., 2003; Petr, 2001).

3.4.4.4 Alperův syndrom/Alperova nemoc

Onemocnění

Alperův

syndrom

(progresivní

infantilní

poliodystrofie),

je

onemocnění, které se vyskytuje u malých dětí a projevuje se rychle progredující demencí, epileptickými záchvaty a myokloniemi (Urbánek, 2000).

3.4.4.5 Fatální familiární insomnie

V devadesátých letech se do seznamu prionových onemocnění připojila fatální familiární insomnie (FFI). Toto onemocnění bylo popsáno Lugaresim v severní Itálii, v Tyrolsku. Je pouze hereditárního původu. Vyskytuje se v poměru 1:1 000 000 a postihuje pacienty převážně ve středním věku života. Po stránce histopatologické jsou anatomické změny lokalizovány zejména v talamu a hypotalamu. Mimo insomnie se 41

FFI

projevuje dysautonomií a někdy i motorickými symptomy, zejména

extrapyramidového typu. Rychle vede k demenci a smrti postiženého (Mareš et al., 2003). Pacienti trpí nejčastěji komplexními halucinacemi a vykazují poruchy pozornosti a paměti, zřídka úplný obraz demence (Mumenthaler, Mattle, 2001).

3.4.4.6 Familiární progresivní subkortikální glióza

Familiární progresivní subkortikální glióza je ojedinělým prionovým onemocněním. Začíná ve vyšším věku pomalou progresí změn osobnosti, poruchami chování, psychózou, poruchami paměti nebo depresí (Mumenthaler, Mattle, 2001).

3.4.4.7 Nová varianta Creutzfeldt-Jakobovy nemoci

Nová varianta CJD (vCJD) oproti sporadické CJD postihuje pacienty nejčastěji ve věku 19 − 39 let. Spolu s ní se objevily první vážné signály o tom, že vzniká jako důsledek přenosu zvířecí prionové infekce – bovinní spongiformní encefalopatie (BSE), na člověka. Kromě epidemiologických souvislostí svědčí o určitém nebezpečí BSE pro člověka i výsledky molekulární analýzy původce vCJD. Ty poukázaly na odlišnost kmenové charakteristiky BSE od klasických typů CJD, původce vCJD však připomíná vlastnosti původce BSE (Pospíšil, 2001; Mareš et al., 2003). V naší republice zatím všechny klinicky pozorované případy CJD odpovídají klasické formě – sporadické familiární, nová varianta u nás dosud pozorována nebyla. Vzhledem k dlouhé inkubační době nelze předpokládat, že by se tato situace v budoucnu dramaticky měnila (za předpokladu možného přenosu BSE - první případy krav postižených BSE se objevily v roce 2000). Ve srovnání s množstvím postiženého dobytka ve Velké Británii a s počtem osob, které zemřely na vCJD (182 tisíc krav s BSE, 92 osob s definitivně potvrzenou diagnózou vCJD), však nelze předpokládat, že by se v našich zemích vyskytla epidemie této choroby. 42

Od klasické CJD se vCJD liší především tím, že postihuje mladší pacienty. Mezi psychické příznaky patří úzkost, deprese, apatie, deziluze – nejsou odlišné od symptomů klasické CJD, spíše je na ně kladen větší důraz. Dále se objevují dysestezie, různé druhy bolesti, ataxie, myoklonus, chorea, dystonie, demence. EEG nevykazuje typické nálezy pro CJD (což může být otázka časné fáze choroby – změny na EEG jsou prokazatelné až v pozdějších stádiích onemocnění). Z klinických příznaků je nejvíce ceněn myoklonus, který není specifický, neboť existuje u řady onemocnění nejrůznějšího druhu, ale postihne-li ležícího pacienta s poruchami vědomí v symetrické formě, lze s velkou pravděpodobností usuzovat na CJD. Důležitý je také postupný rozvoj symptomatiky v době trvání několika měsíců (Mareš et al., 2003).

3.4.5 Diagnostika prionových infekcí

Diagnostika prionových onemocnění u člověka se opírá o pomocná vyšetření – EEG, magnetické rezonance (MRI), CT, vyšetření likvoru, biopsie a genetické vyšetření. V EEG nálezu převládá periodická dysrytmie s komplexy ostrých vln a hrotů. Na MRI se objevuje hypersignální aktivita v T2 − vážených obrazech v oblasti bazálních ganglí a thalamu, méně často v mozečku a mozkovém kmeni. Novější metodou je stanovení 14-3-3 proteinu v likvoru, což je protein velmi blízký amyloidům, obecně dokazujícím degenerativní onemocnění. Další z nových možností diagnostiky prionových nákaz je tonzilární biopsie, neboť bylo zjištěno, že priony nejsou přítomny pouze v mozkové tkáni, ale také v lymfatické (Mareš et al., 2003). Centrum pro diagnostiku lidských transmisivních spongiformních encefalopatií bylo zřízeno ve fakultní Thomayerově nemocnici v Praze (Beneš et al., 2009).

43

3.4.6 Terapie

Řada terapeutických přístupů je zatím ve stádiu hypotéz a pokusů na zvířatech. Například profylaktické podávání Kongo červeně (barvivo vázající se na amyloid) inhibující konverzi, při podání při experimentální infekci scrapií a krátce po něm u křečků, oddálilo začátek onemocnění. Byly určeny i další sloučeniny s podobným účinkem např.: polysulfátové anionty, dextrany, oligonukleotidy a cyklické tetrapyroly. Transgenní myši, kterým chybí gen pro PrP, a které proto PrP nevytvářejí, jsou vůči infekci rezistentní. Dalším způsobem terapie jsou β sheet blokátory. Těmi jsou malé molekuly, které se vážou na α-helixy prionu, stabilizují je a brání přeměně celulárního prionu na patogenní s vyšším podílem β-struktury, která představuje strukturu PrPSc. Hledají se i další látky, které by blokovaly replikaci zásahem do glykosylace prionu, protože blokování konverzí PrPC na PrPSc se zdá jako nejpraktičtější terapeutický přístup (Beneš et al., 2009; Prusiner, Colby, 2011). S pozitivními výsledky zkouší S. B. Prusiner efekt bicyklických derivátů akridnu a fenothiazinu na tkáňových kulturách infikovaných priony, zatím však na nepatrném počtu pacientů. K dalším laboratorním experimentům patří provedení sympatektomie (chirurgické přetnutí sympatických nervových vláken), které vede k prodloužení inkubační doby, dále ovlivnění komplementového systému, které může vést ke zvýšení odolnosti organismu proti prionům, či aplikace látek prostupujících hematoencefalitickou bariérou – např.: antimalarikum quinecrin. Celkově je ovšem tato léčba velmi obtížná, jednak je obtížný přístup k CNS, a také z důvodu ztížené identifikace malých molekul (Mareš et al., 2003; Prusiner, Colby, 2011).

44

3.4.7 Protiepidemická opatření

U iatrogenní formy prionových onemocnění existuje riziko vzniku nákazy infekčními částmi těl. Pro stanovení protiepidemických opatření je důležité znát infekční materiál. Přidělení kategorií infekčnosti různým orgánům a tkáním: Vysoká infekčnost: mozek, mícha, oko. Nízká infekčnost: ledviny, játra, plíce, lymfatické uzliny, placenta. Bez zjistitelné infekčnosti: tuková tkáň, nadledvinky, střevo, kosterní svalstvo, štítná žláza, krev, stolice, nosní hlen, sliny, slzy, serózní výpotek, pot, moč, mléko, prostata, varlata. Preventivními opatřeními pro práci s tkáněmi s vysokou nebo nízkou infekčností z pacientů s potvrzeným TSE nebo podezřením na TSE jsou: • Vzorky jsou označeny jako „biologicky rizikové“, tyto vzorky zpracovávají laboratoře, které jsou zvyklé manipulovat s vysoce nebo nízce infekčními tkáněmi. • Používají se nástroje a vybavení na jedno použití, fixativa a odpadní tekutiny musí být dekontaminovány dekontaminačními metodami. Mezi obecná ochranná opatření patří: • Používaní laboratorní kombinézy, pláště, bezpečnostních brýlí, ochranných štítků před obličej. • Veškeré ochranné pomůcky na jedno použití, pracovní plochy se musí dekontaminovat po každém použití nebezpečného materiálu. Technické postupy dekontaminace

by měly být

provedeny tak,

aby se

minimalizoval vznik aerosolů a kapek. • Kontaminované vzorky a materiály se spalují. Rozbory a manipulaci s materiálem by měly provádět adekvátně proškolené osoby. • Z preventivních důvodů platí v ČR rovněž zákaz používání krve od dárců, kteří pobývali déle než půl roku ve Velké Británii v letech 1980 – 1996. 45

• Při velkých zubních zákrocích se používají jednorázových nástroje a vybavení, např. jehly. Zákroky zahrnujících neurovaskulární tkáň se plánují na konec dne, aby bylo možné po zákroku provést rozsáhlejší čištění a dekontaminaci (Polanecký, 2001; Giles et al., 2007; Giles et al., 2008; Sedlák, Tomšíčková, 2006). Pozměněný prionový protein je velmi rezistentní vůči obecně používaným dezinfekčním látkám, zde je uvedeno rozdělení dezinfekčních látek podle účinnosti proti prionovým infekcím: Neúčinné dezinfekční látky: • Chemické látky – alkohol, amoniak, formalin, fenoly, peroxid vodíku. • Plyny – etylen, formaldehyd - prion je po namočení ve formaldehydu, či jiných aldehydech ještě odolnější. • Fyzikální procesy − var, suché teplo (méně než 300°C) – infekční prion si ovšem dokáže zčásti uchovat své infekční vlastnosti i při působení suchého tepla při t 600°C, ionizace, UV nebo mikrovlnné radiace (Petr, 2001; Giles, 2007). Variantně nebo částečně efektivní dezinfekční látky: • Chemické látky − oxid chloričitý, glutaraldehyd, koncentrovaný NaOH, chlornan sodný, jodistan sodný, močovina (6M). • Fyzikální procesy − autoklávování při 121°C po dobu 15 minut nebo při teplotě maximálně 134°C při tlaku 3 bary (teplota se však nesmí zvýšit, jelikož prion se naopak stává odolnějším), var v 3% dodecylsulfátu sodném (SDS); (Polanecký, 2001; Petr, 2001, Giles 2007). Metodami dekontaminace platnými pro humanní transmisivní spongioformní encefalopatie jsou: spalování a autoklávování po ponoření do hydroxidu sodného nebo chlornanu sodného (Giles, 2007).

46

4 ZÁVĚR

Transmisivní spongiformní encefalopatie (TSE), neboli prionové choroby, jsou vzácná, neurodegenerativní onemocnění lidí i zvířat, způsobené nahromaděním patologicky změněného proteinu v mozkové tkáni. Mají velmi dlouhou inkubační dobu, projevují se progresivními poruchami centrální nervové soustavy a vždy končí smrtí postiženého jedince. Současná představa o původu spongiformních encefalopatií je následující: Buněčný prionový protein − PrPC je za normálních podmínek produkován převážně nervovými buňkami a je začleňován jako jeden z receptorů do buněčných membrán neuronů. U savce postiženého spongiformní encefalopatií vzniknou molekuly proteinů hostitelského původu, tedy PrP scrapie − PrPSc, které jsou infekční. Tento prion, rezistentní k proteinázám, se nezapojuje do buněčných membrán, ale hromadí se v nervových buňkách v podobě amyloidních plaků, v důsledku čehož dochází k vakuolární degeneraci neuronů. Molekuly PrPSc se váží na PrP receptory zdravých buněk a indukují v nich následnou tvorbu PrPSc. Prionózy se mohou vyskytnout ve formě získané, familiární či sporadické a jsou charakteristické rychlým průběhem choroby s následným úmrtím po dlouhé inkubační době. Doposud bohužel neexistuje včasná diagnostika těchto onemocnění ani účinná terapie. Nebyl zatím ještě ani přesně odhalen mechanizmus přeměny PrPC na PrPSc a jakou funkci vůbec PrPC v těle živočichů má. Těmito otázkami se stále zabývá řada odborných studií a výzkumů. Jedinou možností zábrany vzniku epidemie a šíření transmsivních encefalopatií je pouze prevence.

47

5 PŘEHLED POUŽITÉ LITERATURY ABID K., SOTO C., 2006: The intriguing prion disordes. Cellular and Molecular Life Sciences, Scopus, 63 (19−20): 2342−2351.

BARTÁK P., KOSTKA F., VÁVRA O., 2002: Laboratorní diagnostika klusavky, s.15 − 18. In: Klusavka ovcí (scrapie). Sborník referátů. LVF VFU, Brno, 21 s.

BEDNÁŘ B. (ed.), 1984: Patologie sv. III. Aviceum, Praha, 8 s.

BÉLAND M., ROUCOU X., 2011: The prion unstructurated N-terminal is a broadspectrum molecular sensor with diverse and contrasting potential functions. Journal of Neurochemistry, Scopus, 120 (6): 853−858.

BELAY G., 2001: Přehled TSE u zvířat, s.5 − 10. In: Transmisivní spongioformní encefalopatie - prionové choroby člověka a zvířat. Sborník ze semináře Noviko, Brno, 40 s., ISBN 80-902676-7-1.

BENEŠ J. (ed.), 2009: Infekční lékařství. Galén, Praha, 651 s., ISBN 978-80-7262-6441.

CAPELLAIRI S., STRAMMIELLO R., SAVERIONI D., KRETZSCHMAR H., PARCHI P., 2010: Genetic Creutzfeldt-Jakob disease and fatal familiar insomnia: insights into phenotypic variability and dinase pathogenesis. Acta Neuropathol, Springerlink, 121: 21−37.

48

EUROPA, 2012: Přenosné spongioformní encefalopatie. Přehledy právních předpisů, [online]. [cit 2012-04-03]. Dostupné na: http://europa.eu/legislation_summaries/food_safety/animal_nutrition/f83001_cs.htm

GALKIN A.P., MIRONOVA L.N., ZHURAVLEVA G.A., INGE-VECHTEMOV S.G., 2006: Yeast prions, mammalian amyloidoses and the problem of proteomic networks. Russian Journal of Genetics, Scopus, 42 (11): 1313−1323.

GILES K., SUPATTAPONE S., PERTZ B., GLIDDEN D.V., BARON H., PRUSINER S.B., 2007: Disinfection of prions. ACS Symposium Series, Scopus, 967: 52−74.

GILES K., GLIDDEN D.V., BECKWITH R., SEOANES R., PERETZ D., DEARMOND S.J., PRUSINER S.B., 2008: Resistence of bovine spongioform encephalophaty (BSE) prions to inactivation. PLoS Pathogens (USA), Scopus, 4 (11): art no. e1000206.

HALOUZKA R., ČERNÍK J., 2002: Postmorfologický nález při klusavce ovcí, s.19 − 20. In: Klusavka ovcí (scrapie). Sborník referátů. LVF VFU, Brno, 21 s.

HARRIS D.A., 2003: Trafficking turnover and membrane topology of PrP. British Medical Bulletin, Scopus, 66: 71−85.

HAVLÍK J. (ed.), 1990: Infektologie. Aviceum, Praha, 393 s., ISBN 80-201-0062-8.

HOFÍREK B. (ed.), 2009: Nemoci skotu. Noviko, Brno, 1149 s., ISBN 978-80-8654219-5. 49

HOFÍREK B., DVOŘÁK R., DRASTICH P., NOVOTNÝ L., 2002: Klinický obraz klusavky ovcí z hlediska diferenciální diagnózy, s. 8 − 12. In: Klusavka ovcí (scrapie). Sborník referátů. LVF VFU, Brno, 21 s.

HOLEŠOVSKÝ J., 2002: Preventivní, ochranná a zdolávací opatření proti klusavce ovcí, s. 20 − 21. In: Klusavka ovcí (scrapie). Sborník referátů. LVF VFU, Brno, 21 s.

IMRAN M., MAHMOOD S., 2011: Overview of animal prion diseases. Virology Journal, Scopus, 8, art no. 559.

INGE-VECHTEMOV S.G., 2011: Yeast prions as a model of neurodegenerative infectious amyloidoses in human. Russian Journal of Developmental Biology, Scopus, 42 (5): 293−300.

KOLEKTIV PRACOVNÍKŮ ÚZPI, 2000: Bovinní spongioformní encephalopathie – BSE (nemoc šílených krav). Ústav zemědělských a potravinářských informací, Praha, 12 s., ISBN 80-7271-074-5.

KOMPRDA T., 2004: Obecná hygiena potravin. 1. vydání Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 145 s., ISBN 80-7157-757-X.

MAREŠ J. (ed.), 2003: Neurologie. Triton, Praha, 383 s., ISBN 80-7254-431-4.

MOORE R.A., HERZOG C., ERRET J., 2006: Octapeptide repeat insertions increase the rate of protease-resistant prion protein formation. Protein science, Scopus, 15 (3): 609−619.

50

MUMENTHELER M., MATTLE H., 2001: Neurologie. Grada, Praha, 649 s., ISBN 807169-545-9.

PAZDERA J., 2009: Prionům vděčíme za šílenost i dobrý mok. [online]. [cit 2012-0330]. Dostupné na: http://www.osel.cz/index.php?clanek=4325

PERALTA O.A., 2011: Prion biology and bovine spongioform encefalophaty. Archivos de Medicina Veterinaria, Scopus, 43 (2): 99−109.

PERALTA O.A., EYSTONE W.H., 2009: Quantitative and qualitative analysis of cellular prion protein (PrPC) expression in bovine somatic tissues. Prion, Scopus, 3 (3).

PETR J., 2001: Nemoc šílených krav, hrozí?!. Ivo Železný, Praha, 139 s., ISBN 80-2373671-X.

POLANECKÝ V., 2001: Humanní TSE − protiepidemická opatření, s. 32 − 36. In: Transmisivní spongioformní encefalopatie − prionové choroby člověka a zvířat. Sborník ze semináře. Noviko, Brno, 40 s., ISBN 80-902676-7-1.

POSPÍŠIL Z., 2001: Etiologie klusavky ovcí, s. 12 − 15. In: Klusavka ovcí (scrapie). Sborník referátů. LVF VFU, Brno, 21 s.

PREMZL M., GAMULIN V., 2007: Comparatve analysis of prion genes. BMC genomics, Scopus, 8 art no. 1.

51

PRUSINER S.B., 1998: Prions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United states of America, Scopus, 95 (23): 13363−13383.

PRUSINER S.B., COLBY D.W., 2011: Prions. Nature Reviews Microbiology, Scopus, 9 (11): 771−777.

SEDLÁK K., TOMŠÍČKOVÁ M., 2006: Nebezpečné infekce zvířat a člověka. Scientia, Praha, 167 s., ISBN 80-86960-07-2.

SNUSTAND D.P., SIMMONS M.J., 2009: Genetika. K-public, Brno, 871 s., ISBN 978-80-210-4852-2.

STÁTNÍ VETERINÁRNÍ SPRÁVA, 2012: TSE – BSE, klusavka (scrapie), CWD. [online]. [cit 2012-03-22]. Dostupné na: http://www.svscr.cz/index.php?art=929

TRUE H.L., LINDQUIST S.L., 2000: Susan Lindquistová a její evoluční hereze. Časopis Vesmír, [online]. [cit 2012-03-30]. Dostupné na: http://www.vesmir.cz/clanek/susan-lindquistova-a-jeji-evolucni-hereze

URBÁNEK K., 2000: Neurodegenerativní onemocnění. Triton, Praha, 223 s., ISBN 807254-078-5.

WATSON V.M.D.Ch., 2001: BSE – pohled do zrcadla, s. 8 − 12. In: Transmisivní spongioformní encefalopatie – prionové choroby člověka a zvířat. Sborník ze semináře. Noviko, Brno, 40 s., ISBN 80-902676-7-1.

52

WEISSENBACHER M., 2002: BSE: nemoc šílených krav nebo nemoc šílené doby?. Humanatarian Technologies, Praha, 161 s., ISBN 80-86398-16-1.

WIKIPEDIA, 2012: Gertsmann Sträussler-Scheinkerova choroba. Encyklopedie online [cit 2012-03-26]. Dostupné na: http://pl.wikipedia.org/wiki/Zesp%C3%B3%C5%82_Gerstmanna-Str%C3%A4ussleraScheinkera

WORLD ORGANISATION FOR ANIMAL HEALTH, 2012: BSE portal, BSE specific data. Animal health in the world, [online]. [cit 2012-04-01]. Dostupné na: http://www.oie.int/animal-health-in-the-world/bse-portal/

53