MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

BRNO 2012

ANNA MALÍŘOVÁ

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat

Dědičné onemocnění krve u psů Bakalářská práce

Vedoucí práce:

Vypracovala:

Prof. RNDr. Aleš Knoll

Anna Malířová Brno 2012

1

2

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Dědičné onemocnění krve u psů vypracovala samostatně a použila jsem jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího práce a děkanátu AF MENDELU v Brně. Dne: ..................................................... Podpis: .................................................

3

PODĚKOVÁNÍ Velmi ráda bych poděkovala profesorovi RNDr. Aleši Knollovi, Ph.D. za vedení mé bakalářské práce, za jeho cenné rady a trpělivost. Děkuji také všem, kteří mi poskytli odborné rady a pomohli k vytvoření této práce. Poděkování patří i mým rodičům za podporu a trpělivost.

4

ABSTRAKT Náplní mé bakalářské práce je shrnutí aktuální problematiky dědičných onemocnění krve u psů. U jednotlivých nemocí jsem se zaměřila na klinické příznaky, mechanizmy působení, způsoby dědičnosti, konkrétní mutace daného genu a případnou terapii. Konkrétně jde o nemoci hemofilie, porucha přilnavosti býlích krvinek, deficit pyruvátkinázy, deficit fosfofruktokinázy a syndrom šedých kolií. Poukazuji také na důležitost prevence testováním chovných zvířat. Navrhuji vhodné schéma selekce, tak aby nedocházelo k rapidnímu zmenšení chovné základny, a to striktní selekcí postižených jedinců, a postupnou selekcí jedinců klinicky zdravých, ale přenášejících mutaci na potomstvo. Klíčová slova: CLAD, hemofilie, deficit pyruvátkinázy, deficit fosfofruktokinázy, syndrom šedých kolií, dědičné onemocnění krve u psů

ABSTRACT The scope of the presented work is an overview of the present state of the canine hereditary blood diseases research. The focus of the work were five particular diseases (canine leukocyte adhesion deficiency, pyruvatekinase deficiency, fosfofructokinase deficiency, haemophilia and grey collie syndrome) and their respective clinical symptoms, functioning mechanisms, heritability principles, specific gene mutations and prospective treatments. Subsequently, the importance of the prevention by testing of breeding animals is emphasized in the work and a suitable scheme of the animals selection is proposed so as to prevent unnecessary reduction of the breed base. Such scheme is based on a strict selection of diseased individuals and a subsequent selection of healthy, yet mutation-transferring animals. Key words: CLAD, haemophilia, pyruvatekinase deficiency, fosfofructokinase deficiency, grey syndrome collie, dog genetic diseases blood

5

OBSAH OBSAH ...................................................................................................................................... 6 1 ÚVOD .................................................................................................................................... 8 2 CÍL PRÁCE............................................................................................................................ 9 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED...................................................................................................... 10 3.1 Dědičné onemocnění krve u psů .................................................................................... 10 3.1.1 CLAD ...................................................................................................................... 10 3.1.1.1 Etiologie onemocnění....................................................................................... 10 3.1.1.2 Patologie........................................................................................................... 10 3.1.1.3 Diagnostika....................................................................................................... 11 3.1.1.4 Terapie.............................................................................................................. 14 3.1.2 Syndrom šedých kolií.............................................................................................. 14 3.1.2.1 Etiologie onemocnění....................................................................................... 14 3.1.2.2 Patologie........................................................................................................... 15 3.1.2.3 Diagnostika....................................................................................................... 15 3.1.2.4 Terapie.............................................................................................................. 16 3.1.3 Deficit pyruvátkinázy.............................................................................................. 16 3.1.3.1 Etiologie onemocnění....................................................................................... 17 3.1.3.2 Patologie........................................................................................................... 17 3.1.3.3 Diagnostika....................................................................................................... 17 3.1.3.4 Terapie.............................................................................................................. 18 3.1.4 Deficit fosfofruktokinázy PFK................................................................................ 18 3.1.4.1 Etiologie onemocnění....................................................................................... 18 3.1.4.2 Patologie........................................................................................................... 18 3.1.4.3 Diagnostika....................................................................................................... 19 3.1.4.4 Terapie.............................................................................................................. 19 3.1.5 Hemofilie................................................................................................................. 19 3.1.5.1 Etiologie onemocnění....................................................................................... 19 3.1.5.2 Patologie........................................................................................................... 20 3.1.5.3 Diagnostika....................................................................................................... 20 3.1.5.4 Terapie.............................................................................................................. 22 3.1.5.5 Von Willebrandova choroba ............................................................................ 22 3.2 Prevence geneticky podmíněných onemocnění ............................................................. 23 6

3.3 Metody detekce genetických onemocnění ..................................................................... 24 3.3.1 Izolace DNA............................................................................................................ 24 3.3.2 PCR – Polymerázová řetězová reakce .................................................................... 24 4 ZÁVĚR................................................................................................................................. 25 5 POUŽITÁ LITERATURA................................................................................................... 26 6 SEZNAM OBRÁZKŮ ......................................................................................................... 29

7

1 ÚVOD Od objevení struktury DNA zaznamenala genetika neuvěřitelný vývoj. Následné objevení prvních dědičných nemocí u lidí a zvířat s lokalizací jejich genů, byl jeden z mnoha pokroků v medicíně, ať už humální nebo veterinární. Veterinární i humální medicína jsou si v mnohém podobné a velmi často úzce spolupracují. Důkazem může být testování transplantace kmenových buněk u psů postižených dědičnou vadou CLAD, která je stejná jako LAD u lidí. Nebo léčba hemofilie B u psů pomocí kmenových buněk. Krev je pro život nepostradatelná, má mnoho důležitých funkcí pro organismus. Rozvádí pro život nepostradatelný kyslík, živiny, hormony, vitamíny, stará se o obranyschopnost organismu a čistí tělo od cizorodých látek a mnoho další. Proto je důležité těmto nemocím věnovat dostatečnou pozornost. Protože většina těchto nemocí je neslučitelná se životem. Naštěstí moderní medicína jde stále dopředu, a pro některé defekty máme účinnou terapii, ač zatím jen v rámci experimentů. Cílem mé práce je shrnutí problematiky dědičných onemocnění krve, která se vyskytují v psí populaci. Konkrétně jde o nemoci autozomálně recesivní – syndrom šedých kolií, deficit pyruvátkinázy, deficit fosfofruktokinázy a nedostatečnou přilnavost bílých krvinek u psů a jednu z nejrozšířenějších nemocí krve u psů – hemofilii, která je vázaná na pohlavní chromozom X. Do budoucna je důležité testovat pomocí moderních technik molekulární genetiky jedince, před zařazením do chovu a následným vhodným výběrem chovných párů. Jen tak můžeme dosáhnout populace prosté těchto defektů.

8

2 CÍL PRÁCE Cílem mé bakalářské práce bylo zpracovat dostupnou a aktuální literaturu o problematice geneticky podmíněných onemocnění krve u psů. Vytvořit přehled nejčastějších onemocnění v populaci psů, popsat jejich fenotypové projevy, způsoby dědičnosti, možnosti diagnostiky, testování pomocí metod molekulární genetiky a komerčních genetických testů. Zhodnotit jejich přínos pro chovatele, kynologickou veřejnost i populaci postižených plemen.

9

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Dědičné onemocnění krve u psů Geneticky podmíněná nemocnění krve jsou závažná a život ohrožující. V populaci psů se můžeme setkat s těmito pěti nejčastějšími onemocněními: •

CLAD (Canine leukocyte adhesion deficiency)

•

Syndrom šedých kolií

•

Deficit pyruvátkinázy

•

Deficit fosfofruktokinázy - PFK

•

Hemofílie

3.1.1 CLAD (Canine leukocyte adhesion deficiency, porucha přilnavosti býlích krvinek u psů) 3.1.1.1 Etiologie onemocnění CLAD byl poprvé popsán na konci 70.let 20.století u plemene irský setr v USA, krátce po objevení stejné nemoci (LAD – Leukocyte Adhesion Deficiency) u lidí. Později byla nemoc se stejnými příznaky i projevy objevena i u skotu. BLAD (Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency) byla popsána u plemene Red Holstein (Foureman et al., 2008). Podle výzkumu P.Fouremana, M. Whiteley a U Gigera je průkazné, že CLAD se vyvinul ještě před rozšířením irského setra po světě. Jejich výzkum testoval irské setry v USA, Švédsku a ve Velké Británii, kde je původ plemene, v každé testované populaci se gen pro CLAD objevil, ať už u přenašečů nebo u postižených jedinců. 3.1.1.2 Patologie Hlavní funkcí leukocytů je zabezpečení obranyschopnosti organismu. K tomu účelu jsou leukocyty vybavené řadou enzymů, schopností produkovat cytokiny a další mediátory (Doubek et al., 2003). Hlavním mechanismem leukocytů při obranyschopnosti organismu je fagocytóza, což je složitý děj skládající se z několika operací a vyžadující interakci mnoha proteinů. Mezi nejdůležitější částí patří přilnutí (adheze) leukocytu na cizorodou látku. (Anonym 1, 2012). Toto přilnutí je umožněno integriny, což jsou heterodimerické glykoproteiny složené z α a β částic a jsou umístěny na povrchu bílé krvinky (Anonym 2, 2012).

10

Jedinci postižení CLAD se vyznačují vrozenou vadou jednoho integtinu (β-2-integrinu), označovaného jako CD18, tato odchylka brání vytvoření komplexu CD11/CD18 (Creevy et al., 2003). Absence tohoto komplexu má za následek velmi špatnou obranyschopnost organismu a neschopnost organismu bojovat proti bakteriím, před kterými by se zdraví jedinec bez problému ubránil.

Obrázek č. 1 Schématické vyjádření vytvoření komplexu CD11/CD18 u zdravého jedince nahoře, a selhání tvorby komplexu CD11/CD18 u jedinců postižených CLAD (Creevy et al., 2003). 3.1.1.3 Diagnostika Klinická diagnostika je u CLAD značně nepřesná, zánětlivé projevy mohou být zaměňovány s jinými onemocněními. Jedinou jasně prokazatelnou diagnostikou je genetický test. Klinická diagnostika Průkaznost CLAD je velmi obtížný a běžná laboratorní vyšetření nepomohou. Možným upozorněním by snad mohl být zvýšený počet bílých krvinek, ke kterému ale dochází i u jiných chorob. Určitou možností jsou speciální testy zaměřené na fagocytární vlastnosti krvinek (Tichá, 2012). Všechna postižená štěňata se dostávají k veterinárním lékařům s těžkými, život ohrožujícími bakteriálními infekcemi ([Renshaw et al., 1975] a [TrowaldWigh et al., 2000] cit. podle Creevy et al., 2003). V klinických studiích z USA prováděných Kate E. Creevy a kol. je popsáno několik typických fenotypových projevů CLAD. Prvním ukazatelem, kterého si chovatel všimne je 11

špatný váhový přírůstek. Všechna novorozená štěňata u kterých se později CLAD prokázal měla problém s pupečními abscesy, které se zdlouhavě léčili antibiotiky (Creevy et al., 2003). Dalším typickým projevem pro CLAD jsou otoky kloubů, často diagnostikovány jako hypertrofická osteodystrofie (Creevy et al., 2003). Hypertrofická osteodystrofie je klinická diagnóza projevující se jako migrační metafyzální bolest, otok, bolestivost, horečka a kulhání ([Abeles et al., 1999] cit. podle Creevy et al., 2003). Nezřídka se objevují infekce kůže a kostní dřeně, zánětům mandlí a dásní, postiženým jedincům se velmi obtížně hojí rány a škrábance. Pro CLAD jsou typické opakující se infekce a snížená imunitní reakce organismu. Postižený jedinec nemusí jevit všechny popsané symptomy současně (Anonym 2, 2012).

Obrázek č. 2 Fenotypové projevy charakteristické pro CLAD. (A) velikostní rozdíl čtyřtýdenních štěňat, vlevo je jedinec postižený CLAD, vpravo normální. (B) pupeční absces u dva týdny starého štěněte. (C) pupeční absces u tři týdny starého štěněte. (D) metafyzální otok levého karpálního kloubu typické pro hypertrofickou osteodystrofii u tříměsíčního štěněte postiženého CLAD (Creevy at al., 2003). Laboratorní diagnostika a dědičnost Canine leukocyte adhesion deficiency je autozomálně recesivní onemocnění postihující psi plemen irský setr červený a irský setr červenobílý. CLAD je způsobena vrozenou

12

poruchou β-2-integrinu leukocytů (molekula bývá označována jako CD18), stejně tak jako LAD u lidí nebo BLAD u skotu (Anonym 2, 2012). β-2-integrin (CD18) je glykoprotein, který je kódován v genu ITGB2. Následná mutace v genu ITGB2 má za následek nedostatek β-2-integrinu (Kijas et al, 2000), který je způsoben mutací Guaninu na Cytosin v nukliotidové pozici 107 exonu pro β-2-integrinu ITGB2 genu (Foureman et al, 2008). To má za následek záměnu cysteinu za serin v pozici 36 (Cys36Ser) molekuly v β-2-integrinu (Foureman et al, 2008). Cystein se v této pozici normálně podílí na tvorbě difulsidové vazby. Mutací difulsidový můstek zaniká a tím dochází k narušení konformace a funkce celé molekuly (Anonym 2, 2012). Mutace Cys36Ser nebyla nalezena u jiných plemen než u irského setra a jejich kříženců (Foureman et al, 2008).

Obrázek č.3 Sekvenovací gel zobrazující oblast β-2-integrinu genu ITGB2 obsahující mutací CLAD. Šipky poukazují na pozici 107. Normální alela β-2-integrinu má Guanin na pozici 107, která je součástí kodonu vedoucího k cysteinu v pozici 36 výsledného proteinu. Postižená alela má Cytosin v této pozici, což vede k serinu v pozici 36 výsledného proteinu. Přenašeč (heterozygot) má obě alely (Foureman et al., 2008). CLAD se plně rozvine pouze u jedinců, kteří zdědí od obou svých rodičů mutovanou alelu (Anonym 2, 2012), tedy u recesivních homozygotů. Přenašeči mutované alely, heterozygoté, jsou klinicky zdraví, ale přenášejí nemoc na své potomky.

V případě spojení dvou

heterozygotních jedinců bude teoreticky 25% potomků zcela zdravích (dominantních

13

homozygotů), 50% přenašečů (heterozygotů) a 25% zdědí od obou rodičů mutovanou alelu a budou postiženi CLAD (recesivních homozygotů). Spojením zdravého jedince s přenašečem dostaneme 50% přenašečů a 50% zdravých jedinců. Spojením dvou dominantních homozygotů získáme pouze zdravé jedince. Spojování dvou nemocných jedinců, recesivních homozygotů se nepředpokládá, protože jen velmi malé procento postižených jedinců se dožívá reproduktivního věku. Stejně tak se nepředpokládá spojení postiženého jedince se zdravým jedincem nebo s přenašečem. Test přítomnosti mutace v genu spolehlivě odhalí genetické testy, takto můžeme odhalit nejen postižené jedince, ale hlavně i přenašeče, kteří nemají fenotypové projevy nemoci a mohou být hrozbou pro chov. Laboratorní genetické testy se mohou provádět v každém věku zvířete. 3.1.1.4 Terapie CLAD postihuje imunitní systém, prognóza bývá velmi nepříznivá. Projevy nemoci lze zmírnit podáváním antibiotik nebo antiflogistik, kterými zmírníme časté zánětlivé stavy. Bohužel i podávání antibiotik má pouze krátkodobý účinek (Anonym 3a, 2012). Jedinou možnou léčbou je transplantace kostní dřeně a krvetvorných kmenových buněk (Creevy et al., 2003). Ve veterinární medicíně slouží transplantace zatím zejména potřebám výzkumu. Jde o proceduru náročnou a nákladnou, která je v běžné veterinární praxi zatím spíše výjimkou (Doubek a kol., 2003). Bez včasné léčby nemá postižený jedinec šanci na přežití. Štěňata postižená CLAD, aniž by byla léčena, hynou většinou do několika týdnů po narození (Anonym 2, 2012). 3.1.2 Syndrom šedých kolií (Grey collie syndrome, syndrom šedých kolií) 3.1.2.1 Etiologie onemocnění Syndrom šedých kolií, nebo také cyclická neutropenie je autozomální recesivní onemocnění, které postihuje krátkosrsté i dlouhosrsté kolie. Cyklické neutropenie je způsobená defektem ve vývoji kmenových buněk kostní dřeně (Doubek et al., 2003). Poprvé byla cyklická neutropenie diagnostikována u lidí, později i u psů plemen krátkosrstá a dlouhosrstá kolie (Lund et al, 1967). Poslední výzkumy ukázali, že ač je cyklická neutropenie u psů recesivní, u lidí má dominantní projev (Horwitz et al., 2004).

14

3.1.2.2 Patologie Jde o charakteristické chronické cyklické opakování těžké neutropenie (Lund et al., 1967). Neutropenie je abnormální snížení počtu neutrofilních granulocytů v krvi pod spodní fyziologickou hranici. Neutrofilní granulocyty hrají roli v nespecifické imunitě – mají schopnost fagocytózy (Doubek et al., 2003), tím se snižuje i obranyschopnost organismu proti infekcím a bakteriím. Velmi často dochází i k celkovému selhání organismu a bez včasné antibiotické léčby postižený jedinec velmi brzo hyne (Dostál, 2007). Neutropenie se opakuje v přibližně 12ti denních cyklech a trvá od 3 do 10 dní (Lund et al., 1967). 3.1.2.3 Diagnostika Klinická diagnostika Klinická diagnostika bývá dosti obtížná. Prvními příznaky poukazujícími na možnost postižení bývá malá porodní váha štěňat, vleklé infekce pupeční rány a nápadné světlé šedostříbrné zbarvení srsti a velmi nevýrazní pigment nosní houby (Anonym 4, 2012). V prvních týdnech života u štěněte propukají opakující se vysoké horečky, kožní infekce, infekce respiračního a trávicího ústrojí, které vyžadují zdlouhavou antibiotickou léčbu (Lund et al., 1967). Průměrná délka cyklu je 10,6 v rozmezí 8-12dní (Lund et al., 1967). Při vyšetření krve je nápadné abnormální snížení počtu T a B leukocytů pod spodní mez v periferní krvi (Wyand a Yang, 1981).

Obrázek č.4 Vlevo jedinec postižený syndromem šedých kolií, vpravo srovnání se sourozenci, nápadná je malá váha, zbarvení a absence pigmentu nosní houby (Anonym, 2012). Laboratorní diagnostika a dědičnost

15

Syndrom šedých kolií nebo taky cyklická neutropenie je autozomálně recesivní, které způsobuje mutace genu AP3B1 v pozivi exonu 20 (Horwitz et al., 2004), testy na tuto mutaci se mohou provádět bez ohledu na věk zvířete. Syndrom šedých kolií je autozomálně recesivní onemocnění (Dostál, 2007), aby tedy nemoc u jedince propukla, musí od každého ze svých rodičů získat mutovanou alelu, být recesivní homozygot. Využití postiženého jedince v chovu se nepředpokládá, protože tito jedinci se většinou nedožívají produktivního věku. Riziko může nastat pouze za předpokladu spojení dvou přenašečů (heterozygotů), kteří jsou klinicky zdrávy, ale přenáší mutaci na své potomstvo. Tímto spojením získáme teoreticky 50% přenašečů, 25% zdravých jedinců bez mutace a 25% jedinců postižených cyklickou neutropenii. Nebo spojením přenašeče a zdravého jedince, kdy teoreticky dostaneme 50% zdravých jedinců a 50% přenašečů. 3.1.2.4 Terapie Prognóza bývá velmi nejasná, každý postižený jedinec reaguje odlišně. Většina jedinců umírá před prvním rokem života, i přes léčbu antibiotiky. Ostatní možnosti léčby jsou většinou v rámci výzkumu a v běžné praxi se neprovádí. Podle W.P.Hammonda a D.C. Dala je možnost zmírnit příznaky podáváním lithia, které předchází infekcím a vyrovnává množství počty krevních buněk. Avšak po přerušení aplikace lithium karbonátu se příznaky vrací do původní podoby a intenzity. Aplikace lithium karbonátu (uhličitan lithný, Li2CO3) by měla být následující: 2x denně perorálně dávku 22-25 mg/kg ž.h./den (Hammond a Dale, 1980). Další možnou léčbou je transplantace kostní dřeně. Kde se doporučuje příjemce štěpu supraletálně ozářit, aby se snížila pravděpodobnost negativní reakce příjemce na transplantovanou kostní dřeň ([Jones et al., 1975] cit. podle Bárty, 2008). Experimentálně bylo využito léčení pomocí Canine G-CFS (Canine granulocyte colonystimulating factor), získaného rekombinační technikou. Canine G-CFS je doporučeno dávkovat v množství 2,5g/kg ž.h. subkutánně třikrát denně po dobu 2-4dní, nebo 3-5dní po léčbě CPA. Takto můžeme urychlit zotavení, ale i velmi rapidně snížit závažnost neutropenie (Yamamoto et al., 2011). 3.1.3 Deficit pyruvátkinázy (canine pyruvatekinase deficiency, deficit pyruvátkinázy u psů)

16

3.1.3.1 Etiologie onemocnění Deficit pyruvát kinázy se vyskytuje nejen u psů, ale i u lidí a koček. U psů byla nejčastěji diagnostikována u plemen basenži, beagle, west highland white teriérů, špringlšpanělů, jezevčík a kern terierů (Anonym 5, 2009). Enzym pyruvát kinázy je velmi důležitý pro erytrocyty. Deficit tohoto enzymu má za následek nízké množství červených krvinek v krvi a tím způsobenou trvalou hemolytickou anémii (Dostál, 2007), která je spojena s dalšími doprovodnými nemocemi. 3.1.3.2 Patologie Pyruvátkináza je enzym působící při glykolýze katalýzou přenosu fosfátové skupiny z fosfofenolpyruvátu na ADP za vzniku ATP a pyruvátu (Anonym 6, 2012), v erytrocytech. Pokud erytrocyty nemají dostatek energie, nejsou schopné udržet normální buněčný metabolismus a předčasně nastává buněčná smrt (Anonym 7, 2012). 3.1.3.3 Diagnostika Klinická diagnostika je v tomto případě značně neurčitá, protože klinické příznaky jsou lehce zaměnitelné s jinými metabolickými poruchami. Jediným vhodným a prokazatelným testem je diagnostika pomocí molekulární genetiky, jen tak můžeme s jistotou určit zda daný jedinec má ve svém genotypu mutaci pro deficit pyruvátkinázy. Klinická diagnostika Nedostatek enzymu pyruvátkinázy způsobuje chronickou anémii, od které se odvíjí spousta dalších příznaků a nemocí. Anémie se projevuje výrazným poklesem množství erytrocytů v krevním řečišti pod fyziologickou mez (Doubek et al., 2003). Jde hlavně o slabost, zvýšenou srdeční činnost, srdeční šelesty, velmi bledé sliznice, poruchy jaterních funkcí a s tím způsobené problémy. Projev anemie bývá různorodý, od slabé až po neslučitelné se životem (Anonym 3b, 2012). Laboratorní diagnostika a dědičnost Deficit pyruvátkinázy je diagnostikován jako autozomálně recesivní onemocnění, postihující jeden či dva geny kodující většinou různé varianty enzymů, přesné mutace genů záleží na plemeni, ale jde o mutace změny čtecího rámce, označovanou jako frameshift (Anonym 7, 2012). Laboratorní genetické testy se provádí podle analýzy cDNA (Dostál, 2007), a mohou se provádět bez ohledu na stáří testovaného jedince.

17

Onemocnění je autozomálně recesivního charakteru, to znamená, že nemoc propukne v plném rozsahu pouze u jedince, který zdědí od obou svých rodičů mutovanou alelu. Protože je deficit pyruvátkinázy relativně závažné onemocnění, nepředpokládá se u postižených jedinců využití v chovu. Hrozbou pro chov jsou proto jen přenašeči, kteří působí klinicky bez příznaků onemocnění, ale ve svém genotypu nesou jednu mutovanou alelu, kterou předávají svým potomkům. Proto je důležité jedince testovat a odhalit tyto přenašeče mutovaných genů, takto se vyvarujeme spojením dvou přenašečů (heterozygotů), kde nám teoreticky může vzniknout 25% jedinců postižených deficitem pyruvátkinázy, 25% jedinců prostých mutovaného genu ve svém genotypu a 50% přenašečů – heterozygotů. Popřípadě spojení geneticky zdravého jedince s přenašečem, kde můžeme teoreticky očekávat rovnocenný poměr mezi přenašeči a geneticky zdravými jedinci. 3.1.3.4 Terapie Většina postižených jedinců umírají před 5tým rokem života na selhání funkce jater nebo kostní dřeně, popřípadě v prvním roce života u slabších jedinců. Nejistá terapie spočívá v transfuzi krve od zdravého dárce (Lamsal, 2009), jde ale o velmi nákladnou terapii a v běžné veterinární praxi se neprovádí. Podáváním léčiv na zmírnění zánětlivých projevů a podpory červených krvinek, můžeme zmírnit postup nemoci. Důležitá je i podpora celkového zdravotního stavu zvířete a imunitního systému (Anonym 3b, 2012). Nejúčinnější terapií je prevence v chovu psů, výběrem vhodných a testovaných jedinců. 3.1.4 Deficit fosfofruktokinázy PFK (canine fosfofructokinase deficiency, deficit fosfofruktokinázy u psů) 3.1.4.1 Etiologie onemocnění Deficit fosfofruktikinázy nalezneme u lidí, psů i jiných zvířat. U psů byla poprvé popsána u plemene špringršpaněl a kokršpaněl, nově i u ostatních plemen. U lidí je nemoc zvaná jako Tarui-Layzerův syndrom a má stejné příznaky jako u psů (Gultekin et al., 2012) 3.1.4.2 Patologie Fosfofruktokináza je enzym důležitý pro regulaci glykolýzy, katalyzuje se za spotřeby ATP fosforylací fruktosa-6-fosfátu (F6P) na fruktosa-1,6-bisfosfát (FBP), který je pak dále štěpen a vzniká 1,3-bisfosfoglycerát (1,3-BFG), který je metabolizován dále na 2,3bisfosfoglycerát (2,3-BFG), který uvolňuje afinitu kyslíku k hemoglobinu, čímž se výrazně

18

podílí na regulaci přenosu kyslíku. Deficit PFK způsobuje nedostatek 2,3-BFG a ovlivňuje tak správnou funkci erytrocytů (Anonym 2c, 2012). 3.1.4.3 Diagnostika Klinická diagnostika Hlavním příznakem je celková slabost s výraznou svalovou slabostí, zátěžová intolerance, hemolytická anemie, metabolická myopatie a postižený jedinec trpí svalovými křečemi při zvýšené námaze (Anonym 2c, 2012). Laboratorní diagnostika a dědičnost Deficit fosfofruktokinazy je způsoben jednobodovou mutací v 21 exonu genu M-PFK, kde se guanin vymění za adenin. Tato mutace způsobí zkrácení výsledného enzymu, který je následně nestabilní a velmi rychle degraduje (Anonym 2c, 2012). Deficit fosfofruktokinázy je autozomální recesivní onemocnění. Nemoc se plně rozvine pouze u recesivních homozygotů, kteří zdědili od obou svých rodičů mutovanou alelu. Přenašeči mutace jsou klinicky zdraví, ale přenáší nemoc na své potomky, proto se nedoporučuje spojení dvou přenašečů, kde nám teoreticky vznikne 25% nemocných jedinců, 50% přenašečů a jen 25% zdravých jedinců. Spojením přenašeče a zdravého jedince dostaneme teoreticky 50% přenašečů a 50% geneticky zdravých jedinců. Spojením dvou zdravých jedinců dostaneme 100% zdravých jedinců. Naopak spojením dvou postižených jedinců dostaneme zase jen postižené jedince. 3.1.4.4 Terapie Účinná terapie neexistuje. Jedinou možnou terapií je prevence v chovu. 3.1.5 Hemofilie Haemophilia, hemofilie 3.1.5.1 Etiologie onemocnění Hemofilie je nejznámější a nejčastější vrozenou poruchou srážlivosti krve. Existuje mnoho typů hemofilie, ale nejčastěji se vyskytuje hemofilie A a B. Způsobuje ji defekt faktoru VIII – Hemofile A, nebo faktoru IX – Hemofilie B. U všech savců je dědičnost většinou recesivně gonozomální, vázaná na pohlavní chromozom X (Doubek, 2003), samice jsou tedy jen přenašečkami a postižení bývají samci. Homozygotní samice se rodí jen velmi zřídka, poněvadž krátce po porodu hynou. Většinou uhynou již v době nitroděložního života (Dostál, 2007). 19

Hemofilie má několik druhů a byla prokázána téměř napříč všemi plemeny psů. 3.1.5.2 Patologie Hemofilie A je způsobena nedostatkem antihemofilického globulinu, jinak nazývaného jako faktor VIII, v důsledku mutace v genu pro tento faktor. Hemofilie B je způsobená nedostatkem nebo sníženou funkcí faktoru IX (Nichols, 2010). 3.1.5.3 Diagnostika Hemofilie má naprosto typické a jasné klinické příznaky, narozdíl od výše popisovaných chorob. Tak jako u většiny geneticky podmíněných nemocí, je pouze klinická diagnóza nedostačující. I když jsou pro hemofilii zcela typické a nezaměnitelné fenotypové příznaky, vždy je laboratorní diagnostika pomocí metod molekulární genetiky naprosto přesná a průkazná. Klinická diagnostika Klinické příznaky můžeme vypozorovat pouze u psů, feny jsou pouze přenašečkami bez klinických příznaků. Prvními symptomy, kterých si může chovatel všimnou je nadměrná krvácivost pupečního pahýlu po porodu, nadměrná krvácivost dásní při přezubování, tvorba hematomů i při sebemenším nárazu, velké otoky kloubů končetin, které většinou vedou k hemofilické artropatii, nápadné kulhání a neochota k pohybu, vleklé hojení ran s nápadně dlouhým krvácením. Problémy mohou nastat u operací, kdy dochází k hemoragickým komplikacím. Při šetrné péči, včasné léčbě poranění a zánětlivých stavů se postižený jedinec může dožívat i relativně vysokého věku (Anonym 2b, 2012, Doubek 2003).

Obrázek č. 5 Vlevo štěně irského setra postižené hemofilií s otoky kloubů předních končetin, způsobené krvácením do kloubního pouzdra, vpravo německý ovčák postižený hemofilií s hematomem svalů na zadní končetině (Anonym 8, 2012).

20

Mezi základní vyšetření patří APTČ (aktivovaný parciální tromboplastinový čas), který se prodlužuje při poklesu hladiny faktoru VIII a IX pod 25%, u citlivějších jedinců i pod 30%. Doplňujícím testem je vyšetření hladiny faktorů srážení (Doubek, 2003). Diferenciálně diagnosticky musí být vyloučeny inhibitory FF VIII nebo IX a jiné či kombinované defekty koagulačních faktorů. K odlišení krvácení v důsledku inhibitoru faktorů od krvácení v důsledku jejich defektu se používá směsné korekční testy. V případě defektu faktoru dochází ke korekci prodlouženého APTČ přidáním již ¼ plazmy zdravého dárce k plazmě testované. Hemofilie A od hemofilie B lze odlišit směsným testem s přidáním séra zdravého dárce. Přidání séra k vyšetřované plazmě koriguje prodloužený APTČ u hemofilie B, nikoliv u hemofilie A. Sérum neobsahuje FVIII (Doubek, 2003). Laboratorní diagnostika a dědičnost Hemofilie je různého druhu, dělí se podle toho, která součást krve je defektní. Pro názornost uvádím tabulku s rozdělením hemofilie. Tab. č.1 (Dostál, 2007) Genetický

klinické

symbol

choroba je způsobena

příznaky

genetická kontrola

Dpt

Dysprothrombianemia

četné

asi dominantní

he

deficit faktoru VII

mírné

recesivní

Hem-A

deficit faktoru VIII

různé

recesivní, vázaná na pohlaví

Hem-B

deficit faktoru IX

četné

recesivní, vázaná na pohlaví

Hf

deficit faktoru I

četné

asi dominantní

Pta

deficit faktoru XI

mírné

neúplně dominantní

Stf

deficit faktoru X

mírné

neúplně dominantní

Th

Thrombasthanemie

různé

dominantní

Vwd

Von Willebrandova choroba

různé

asi dominantní

Hemofilie se vyskytuje snad u všech plemen, přesné místo mutace není u všech plemen známo. Například u plemene rhodésky ridgeback je hemofile B způsobena mutací genu CFIX v exonu 7, což má za následek záměnu glycinu za kyselinu glutamovou (G244E) (Mischke et al., 2011). U labradorského retrívra jde o kompletní odstranění celého genu CFIX (Brooks et al., cit. podle Mischke et al., 2010). Hemofile A i B je recesivní onemocnění vázané na pohlavní chromozom X, kde nositelem genu jsou samice a nemoc propukne v plném rozsahu u samců.

21

3.1.5.4 Terapie Hemofilie A se léčí jen při krvácivých stavech. Hladina faktoru by měla být zvýšena minimálně na 25-30% referenční hladiny. Léčba hemofilie A u zvířat spočívá v aplikaci kryoprecipitátu, v dávkách 1µ/10-15kg ž.h. a to 2x denně do zástavy krvácení a antifibriolytik, v dávce 15-20mg/kg ž.h. 2x až 4x denně perorálně. Hemofilie B se může léčit transfuzemi plné krve nebo plazmy od zdravého dárce. Další možností je využití genové terapie, kdy se do buněk novorozených štěňat vloží funkční gen, místo genu poškozeného, experimentálně proběhli pokusy úspěšně u hemofilie A, v běžné veterinární praxi se ale nevyužívá. 3.1.5.5 Von Willebrandova choroba V populaci psů se častěji než hemofilie A nebo B, vyskytuje Von Willebrandova choroba. Někdy uváděna samostatně někdy jako poddruh hemofilie. Stejně jako hemofilie se projevuje poruchou krevní srážlivosti, podmíněnou von Willebrandovým faktorem (vWF), který ovlivňuje přilnavost trombocytů. Podle závažnosti postižení se dělí na tři typy, označovaného římskými číslicemi , a několik subtypů (Tichá, 2009). Typ I se dělí na dva subtypu Ia a Ib, vyznačuje se snížením vWF a tím ovlivňuje i množství trombocytů v krevním řečišti (Tichá, 2009). Postihuje hlavně plemen pudl, dobrman, bernský salašnický pes, coton de tulear, německý pinč, kerry blue teriér, manchester teriér a velškorgi pembroke (Anonym 9a, 2012). Typ II se rozděluje podle závažnosti ovlivnění kvality trombocytů na subtypy 2A, 2B, 2M a 2a (Tichá, 2009). Objevuje se u plemen kolií a u německé ohaře krátkosrstého, dlouhosrstého a drsnosrstého (Anonym 9b, 2012). Typ III je nejzávažnější, postižený jedinec nemá žádný vWF v krvi, což vede k velký krvácivým stavům a ohrožením na životě. Typ III se objevuje v populaci plemen šeltie, kooikerhondje a skotského teréra (Anonym 9c, 2012). Von Willebrandova choroba se vyskytuje u obou pohlaví, a často i křížence vyjmenovaných plemen. Postižený jedinec může mít různě silný projev nemoci, u slabých projevů si majitel nemusí ani ničeho povšimnout. Dochází k většímu krvácení z dásní, otokům kloubů a měkkých tkání, dlouhé krvácení po zastřihnutí drápků, opakující se krvavé průjmy, krvácení z nosu, v závažných případech může pes bez včasného zásahu veterináře uhynout (Wessely-Szponder, 1999).

22

Klinické testy může ovlivnit stres, hormonální nerovnováha a jiné souběžné onemocnění. Léčba zahrnuje infuzi krve nebo plazmy od zdravého jedince a podávání vhodných léků (Wessely-Szponder, 1999).

3.2 Prevence geneticky podmíněných onemocnění Nejúčinnější prevencí před geneticky podmíněnými chorobami je zodpovědný výběr chovných párů. Toto platí nejen pro dědičná onemocnění krve, ale pro všechna geneticky podmíněná onemocnění. Vhodný a zodpovědný výběr zvířat zařazených do reprodukce je zárukou produkce zdravých a životaschopných jedinců. Tuto skutečnost by si měli uvědomit všichni chovatelé. Bohužel stále se najdou chovatelé, kteří upřednostňují exteriér nebo finanční zisk oproti odchovu kvalitních zdravých a povahově vyrovnaných jedinců. Nejlepší prevencí je testování jedinců, pomocí metod molekulární genetiky, kteří mají působit v chovu. Tímto odhalíme přenašeče a zdravé jedince, dává nám to možnost vyhnout se spojování dvou přenašečů a tím omezit výskyt postižených jedinců. Důležitá je spolupráce chovatelských klubů s majiteli a chovateli. Vedení veřejných databází chovných i nechovných jedinců a zveřejňování zdravotních výsledků je správná cesta. Velmi pozitivní přístup mají některé chovatelské kluby, poskytují odborné informace pro své členy, pořádají různé akce, jako například hromadné odběry biologického materiálu pro testování, které zařazují do programu klubových výstav či soutěží. Ale zařazení povinnosti testovaní jedinců na nejzávažnější dědičné nemoci před působením v chovu je jako prevence nejúčinnější. Metody selekce by měli být voleny s ohledem na velikost chovné základny. Tak aby striktním vyřazením velkého počtu zvířat nedošlo k rapidnímu snížení chovné základy. Velmi opatrná selekce musí být u málopočetných plemen psů, jako například basenži nebo kooikerhondje. U těchto a podobných plemen stojí za úvahu využití inseminace mraženým spermatem, takto můžeme využít nepříbuzného geneticky zdravého chovného psa i stovky kilometrů daleko. A dává nám to možnost rozšířit genofond místní populace. Využití postižených jedinců v chovu by nemělo probíhat. Využití přenašečů je za dodržení určitých pravidel reálné. Nikdy by nemělo dojít ke spojení dvou přenašečů. Spojení geneticky zdravého jedince a přenašeče je možné, ale všechny potomky z tohoto spojení by jsme měli nechat opět geneticky otestovat. Tento způsob postupně eliminuje přenašeče a úplně eliminuje nemocné jedince. Výhodou je menší selekční tlak na chovnou populaci. Je to méně drastický způsob vymícení nemoci z populace, než úplný zákaz využívání i přenašečů v chovu. Kdy

23

sice mutaci odstraníme z chovu hned, ale zároveň masivně snížíme chovnou základnu. To by mohlo způsobit jiné vady, kterým se v současné době nevěnuje tolik pozornosti. Spojením dvou geneticky zdravých jedinců dostaneme opět jen geneticky testované jedince, které již testovat nemusíme. I tato skutečnost by mohla vést majitele k rozhodnutí nechat své jedince geneticky testovat a budoucím majitelům pomoci při výběru vhodné chovné stanice svého budoucího štěněte.

3.3 Metody detekce genetických onemocnění 3.3.1 Izolace DNA DNA lze teoreticky izolovat z jakékoliv živočišné tkáně obsahující nativní buňky (Zima et al., 2004), pro testování genetického profilu u psů se nejčastěji využívá krev a sliny. 3.3.2 PCR – Polymerázová řetězová reakce Polymerázová řetězová reakce je elegantní a jednoduchá metoda, která umožňuje amplifikovat in vitro požadovaný specifický úsek DNA prakticky v neomezeném množství, přičemž množství původního vzorku DNA může být extrémně malé. Navíc díky tomu, že syntetizovaná DNA obsahuje prakticky výhradně studovanou sekvenci, není ji zpravidla nutno dále purifikovat (Zima et al, 2004). PCR je založená na extenzi primerů a geometrickém namnožení molekul DNA, kdy se cyklicky opakují tři teplotně odlišné kroky. Teplotně rezistentní DNA polymeráza (nejčastěji používaná Taq) katalyzuje syntézu DNA. PCR umožňuje současnou syntézu obou komplementárních vláken prodlužováním dvou primerů připojených ke komplementárním řetězcům na protilehlých koncích templátu. Umístění obou primerů tak ohraničuje amplifikovaný úsek DNA (Knoll, Vykoukalová, 2002). Cyklus se skládá z těchto tří kroků, které se opakují (nejčastěji 30x). 1. Denaturace – zde se roztok zahřeje na teplotu 92-95 C a dochází k disociaci fragmentů DNA na jednotlivé řetězce. 2. Annealing – nejdůležitější krok, kde dochází ke zchlazení a navázání primerů, teplota je zde nižší, okolo 45-60 C, tento krok trvá velmi krátce, v průměru kolem 30 vteřin. 3. Elongace – zde dochází k vlastní syntéze nových řetězců, reakce je katalyzována polymerázou při teplotě 72 C, dostačující čas je okolo 30 vteřin. (Zima et al., 2004). V praxi se využívá ještě PCR Real Time, která umožňuje sledovat průběh PCR v reálném čase na základě sledování intenzity fluorescenčního signálu (Knoll a Vykoukalová, 2002).

24

4 ZÁVĚR Většina geneticky podmíněných onemocnění krve vyskytujících se v psí populaci mají charakter autozomálně recesivní – syndrom šedých kolií, nedostatečná přilnavost bílých krvinek, deficit pyruvátkinázy a deficit fosfofruktokinázy, jen hemofilie má, stejně jako u lidí, charakter gonozomálně recesivní (vázané na pohlavní chromozom X). Pro vhodnou eliminaci dědičných chorob je nutné, aby chovatelé měli základní znalosti, nejen o fenotypových projevech chorob, ale i o jejich způsobu dědičnosti. I když je výskyt dědičných onemocnění krve v populaci psů víceméně vzácností, neměla by se podceňovat. Moderní veterinární medicína zaznamenala v posledních letech značný vzestup. Ale i přes pokroky, stále na mnoho onemocnění neexistuje účinná terapie, nebo je její aplikování ve veterinární praxi značně finančně nákladné, nepřesné popřípadě s nejasnými výsledky. Jako například u CLAD nebo syndromu šedých kolií, kdy jako účinná terapie připadá v úvahu transplantace kostní dřeně, u které předem nemůžeme konstatovat, zda příjemce bude na transplantaci reagovat kladně. V chovu psů měla by se měla upřednostňovat účinná prevence před terapií. Pro většinu dědičných onemocnění spočívá prevence v odstranění postižených jedinců a přenašečů z chovu, toto platí i u geneticky podmíněných nemocí krve. Jen tak lze úspěšně eliminovat výskyt těchto nemocí. Základem je včasná diagnostika. Bohužel klinická diagnostika může objevit pouze postižené jedince u kterých nemoc propukne. Přenašeči zůstávají skryti, protože fenotypově se projevují jako zdraví jedinci a problém nastává, spojením dvou přenašečů. Proto je nejvhodnější včasná diagnostika pomocí molekulární biologie – genetických testů na dané mutace. Výsledek genetického testu nám jasně ukáže zda daný jedinec má v genotypu mutaci či nikoli a tím odhalíme i skryté přenašeče. Proto je tolik důležitá informovanost chovatelů, a jejich snaha testovat psy před zařazením do chovu. Snahou všech zodpovědných chovatelů by měla být produkce pouze zdravých jedinců, jen tak mohou jejich odchovy těšit své majitele nebo ukázat své přednosti na chovatelských a sportovních kynologických soutěžích.

25

5 POUŽITÁ LITERATURA ANONYM 1, Advanced Genetics [online]. [cit. 20.3.2012]. DNA test – Genetická postižení psů a koček. Dostupné z WWW: . ANONYM 2a, Genomia [online]. [cit.20.3.2012]. CLAD u irských setrů. Dostupné z WWW: . ANONYM

2b,

Genomia [online]. [cit.22.4.2012].

Hemofilie. Dostupné z WWW:

. ANONYM 2c, Genomia [online]. [cit.23.4.2012]. Deficit fosfofruktokinázy (PFK) u anglických špringršpanělů a amerických kokršpanělů. Dostupné z WWW: . ANONYM 3a, Laboklin [online]. [cit.20.3.2012]. CLAD. Dostupné z WWW: . ANONYM 3b, Laboklin [online]. [cit.20.3.2012]. Deficit pyruvátkinázy. Dostupné z WWW: . ANONYM 4, Ch. stanice Pennylane collies [online]. [cit.7.4.2012]. Grey collie syndrome. Dostupné z WWW: . ANONYM 5, American kennel club canine health foundation [online]. [cit.10.4.2012]. Genetic test for pyruvat kinase deficiency. Dostupné z WWW: . ANONYM 6, Velký lékařský slovník [online]. [cit.10.4.2012]. Pyruvátkináza. Dostupné z WWW: . ANONYM 7, PennGen [online]. [cit.10.4.2012]. Disease info – pyruvate kinase. Dostupné z WWW: . ANONYM 8, Animal Health Diagnostic Center [online]. [cit.22.4.2012]. Canine haemophilia. Dostupné z WWW: .

26

ANONYM 9a, VetGen [online]. [cit.22.4.2012]. vWD Type I. Dostupné z WWW: . ANONYM 9b, VetGen [online]. [cit.22.4.2012]. vWD Type II. Dostupné z WWW: . ANONYM 9c, VetGen [online]. [cit.22.4.2012]. vWD Type III. Dostupné z WWW: . BÁRTA, O., CODNER, E. C., PICKETT, J.P., SHELL, L.G., Veterinární klinická imunologie. Brno: Akademické nakladatelství, 2008, 322 s. ISBN 978-80-7204-553-2 CREEVY, K. E., BAUER, T. R., TUSCHONG, M. L., EMBREE, L. J., COLENDA, L., COGAN, K., STAROST, M. F., HASKINS, M. E., HICKSTEIN, D. D., Canine leukocyte adhesion deficiency colony for investigation of novel hematopoietic therapies. Veterinary Immunology and Immunopathology [online]. 2003, vol. 94 [cit.20.3.2012], s. 11-22. Dostupné z WWW <sciencedirect.com>. DOUBEK, J., a kol., Veterinární hematologie. Brno: Noviko, 2003, 464 s. ISBN 80-8654202-5. DOSTÁL, J., Genetika a šlechtění plemen psů. České Budějovice: Dona, 2007, 261 s. ISBN 978-80-7322-104-1. FOUREMAN, P., WHITELEY, M., GIGER, U., Canine Leukocyte Adhesion Deficiency: Presense of the Cys36Ser β-2 Integrin Mutation in an Affected US Irish Setter Cross-Breed Dog and in US Irish Red and White Setters. Journal of Veterinary Internal Medicine [online]. 2008, vol. 16, s. 518-523. Dostupné z WWW . GULTEKIN, G.I., RAK, K., LEHMAN, S., HILLSTROM, A., GIGER, U., Missense mutation in PFKM associated with muscle-type phosphofructokinase deficiency in the Wachtelhund dog. Molecular and Cellular probes [online] Available onlne 16.3.2012. Dostupné z WWW <sciencedirect.com>.

27

HAMMOND, W. P., DALE, D.C., Lithium therapy of canice cyclic hematopoiesis. Blood [online]. 1980, vol. 55, s.26-28. Dostupné z WWW . HORWITZ, M., BENSON, K. F., DUAN, Z., FENG-QIAN, L., PERSON, R. E., Hereditary neutropenia: dogs explain human neutrophil elastase mutations. Trends in Molecular Medicine [online]. 2004, vol. 10, s.163-170. Dostupné z WWW <sciencedirect.com>. KIJAS, J.M.H., JUNEJA, R.K., GAFVERT, S., ANDERSSON, L., Detection of the casual mutation for canine leukocyte adhesion deficiency (CLAD) using pyrosequencing. Animal Genetics [online]. 2008, vol. 31, s. 326-328. Dostupné z WWW . KNOLL, A., VYKOUKALOVÁ, Z., Molekulární genetika zvířat. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita Brno, 168s., ISBN 80-7157-616-6. LAMSAL, K.S., Clinical profile of patients with anemia. Journal of Institute of Medicine. [online]. 2009, vol. 31, s. 30-33. Dostupné z WWW . LUND, J.E., PADGETT, G. A., OTT, R.L., Cyclic Neutropenia in Grey Collie Dogs. Blood [online]. 1967, vol. 29, s.452-461. Dostupné z WWW . NICHOLS, T.C., RAYMER, R.A., FRANCK, H.W.G., MEERICKS, E.P., BELLINGER, D.A., DEFRIES, N., MARGARITIS, P., ARRUDA, V.R., KAY, M.A., HIGH, K.A., Prevention of spontaneous bleeding in dog with haemophilia A and haemophilia B. Haemophilia [online]. 2010, vol. 16, s.19-23. Dostupné z WWW . TICHÁ, V., Český pointer a setter klub [online]. [cit.20.3.2012]. CLAD – dědičně podmíněné onemocnění irských setrů. Dostupné z WWW: <pointer-setter.cz>. TICHÁ, V., Lovecký pes [online]. [cit.22.4.2012].Von Willebrandova choroba. Dostupné z WWW: . WYAND, R. C., YANG, T. J., T and B lymphocyte levels in the peripheral blood of dogs affected with cyclic neutropenia. Experimental Hematology [online]. 1981, vol. 9 [cit.19.4.2012], s. 52-62. Dostupné z WWW <scopus.com>.

28

YAMAMOTO, A., FUJINO, M., TSUCHIYA, T., IWATA, A., Recombinant canine granulocyte-stimulating factor accelerates

recovery from cyclophosphamide-induced

neutropenia in dogs. Veterinary Immunology and Immunopathology [online]. 2011, vol. 142 [cit.18.4.2012], s. 271-275. Dostupné z WWW <sciencedirect.com>. ZIMA, J., MACHOLÍN, M., MUNCLINGER, P., PIÁLEK, J., Genetické metody v zoologii. 2004, Nakladatelství Karolinum, Praha, 239s., ISBN 80-246-0795-6.

6 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1 – Schématické vyjádření vytvoření komplexu CD11/CD18 u zdravého jedince, a selhání tvorby komplexu CD11/CD18 u jedinců postižených CLAD (Creevy et al., 2003). . 11 Obr. 2 - Fenotypové projevy charakteristické pro CLAD. (A) velikostní rozdíl čtyřtýdenních štěňat, vlevo je jedinec postižený CLAD, vpravo normální. (B) pupeční absces u dva týdny starého štěněte. (C) pupeční absces u tři týdny starého štěněte. (D) metafyzální otok levého karpálního kloubu typické pro hypertrofickou osteodystrofii u tříměsíčního štěněte postiženého CLAD (Creevy at al., 2003). .............................................................................. 12 Obr. 3 - Sekvenovací gel zobrazující oblast β-2-integrinu genu ITGB2 obsahující mutací CLAD. Šipky poukazují na pozici 107. Normální alela β-2-integrinu má Guanin na pozici 107, která je součástí kodonu vedoucího k cysteinu v pozici 36 výsledného proteinu. Postižená alela má Cytosin v této pozici, což vede k serinu v pozici 36 výsledného proteinu. Přenašeč (heterozygot) má obě alely (Foureman et al., 2008). .............................................. 13 Obr. 4 - Obrázek č.4 Vlevo jedinec postižený syndromem šedých kolií, vpravo srovnání se sourozenci, nápadná je malá váha, zbarvení a absence pigmentu nosní houby (Anonym, 2012). ...................................................................................................................................... 15 Obr. 5 - Vlevo štěně irského setra postižené hemofilií s otoky kloubů předních končetin, způsobené krvácením do kloubního pouzdra, vpravo německý ovčák postižený hemofilií s hematomem svalů na zadní končetině (Anonym 8, 2012).................................................... 20

29