MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
BRNO 2010
DARINA WITTKOVÁ
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin
Ochratoxiny- účinky a výskyt v potravinách Bakalářská práce
Vedoucí práce: prof. MVDr. Ing. Tomáš Komprda, CS.c
Brno 2010
Vypracovala: Darina Wittková
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Ochratoxiny - účinky a výskyt v potravinách vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana AF MZLU v Brně.
Dne : 23. 4. 2010
podpis vypacovatele……………………….
PODĚKOVÁNÍ Děkuji mému vedoucímu bakalářské práce, panu prof. MVDr. Ing. Tomáši Komprdovi, CSc., za cenné poznatky, rady a za trpělivost.
Anotace Předmětem této bakalářské práce jsou ochratoxiny - účinky a výskyt v potravinách. Úvod práce se zabývá zavedením a vysvětlením pojmů NOAEL, ADI a NPM. Dále následuje obecná charakteristika mykotoxinů a jejich dělení, toxikologické
zhodnocení,
testování
toxicity,
vyjmenování
nejdůležitějších
mykotoxinů a popis jejich výskytu v potravinách a krmivech. Práce se také zmiňuje o problematice biopotravin. Následují kapitoly zaměřené na ochratoxiny a vymezení ochratoxinu A (OTA), jeho producenti, ale hlavně toxické účinky a výskyt OTA v potravinách. V závěru této bakalářské práce jsou uvedeny hygienické limity a možná eliminace OTA. Také je zde zmíněn systém rychlého varování pro potraviny a krmiva - RASFF. Bakalářská práce je doplněna grafy, tabulkami a obrázky. Ty se vyskytují pod danou tematikou.
Annotation The subject of the thesis is ochratoxins and their occurrence in food. The introductory part of the paper deals with introducing and explaining of the terms NOAEL, ADI and NPM. It continues with general characteristics of mycotoxins and their classification, with toxicological evaluation, testing of toxicity, enumeration of the most important mycotoxins and their occurrence in food and feed. The thesis mentions also the problematic of organic food. Following chapters are focused on ochratoxins and delimitation of ochratoxin A (OTA), on producers of OTA and primarily on toxicological effects and occurrence of OTA in food. In the conclusion of the thesis, there are stated hygienic limits and possible elimination of OTA. There is also mentioned the system of quick warning for food and feed RASFF. The thesis is supplemented with graphs, tables and pictures. These occur under the given subject matter. Klíčová slova Mykotoxiny, ochratoxin A, toxické účinky, výskyt OTA v potravinách, hygienické limity ochratoxinu A
Keywords Mycotoxin, ochratoxin, toxic effects, occurrence of OTA in food, hygienic levels of ochratoxin A
Obsah ÚVOD ........................................................................................................... 7 CÍL PRÁCE ................................................................................................. 8 LITERÁRNÍ PŘEHLED ............................................................................ 9 1
CHEMICKÉ NEBEZPEČÍ ................................................................. 9 1.1
2
Zavedení a vysvětlení pojmů NOAEL, ADI a NPM .................................... 9
MYKOTOXINY ................................................................................. 10 2.1
Obecná charakteristika ................................................................................ 10
2.2
Dělení mykotoxinů ..................................................................................... 10
2.3
Toxikologické zhodnocení mykotoxinů ..................................................... 11
2.4
Testování toxicity mykotoxinů ................................................................... 11
2.5
Nejdůležitější mykotoxiny .......................................................................... 12
2.6
Výskyt mykotoxinů v krmivech a potravinách ........................................... 13
2.6.1
3
Srovnání konvenčních potravin a biopotravin .................................... 15
OCHRATOXINY ............................................................................... 15 3.1
Ochratoxin A............................................................................................... 15
3.2
Události spojené s výskytem OTA ............................................................. 16
3.3
Producenti OTA .......................................................................................... 17
3.4
Toxické účinky OTA .................................................................................. 19
3.4.1
Nefrotoxicita ....................................................................................... 19
3.4.2
Vylučování OTA z organismu ............................................................ 21
3.4.3
Expoziční limit .................................................................................... 21
3.4.4
Hygienické limity OTA ...................................................................... 21
3.5
Výskyt OTA v potravinách ......................................................................... 23
3.5.1
OTA a mateřské mléko ....................................................................... 23
3.5.2
OTA a káva ......................................................................................... 24
3.5.3
Výskyt OTA ve víně a vinné révě ...................................................... 24
3.5.4
Obilniny a OTA .................................................................................. 26
3.5.5
Výskyt OTA v kukuřici ...................................................................... 27
3.6
Lze eliminovat obsah OTA? ....................................................................... 30
3.7
OTA a systém rychlého varování pro potraviny a krmiva.......................... 34
ZÁVĚR ....................................................................................................... 36 PŘEHLED POUŢITÉ LITERATURY................................................... 37
ÚVOD V současné době je kladen velký důraz na zajištění kvalitních a bezpečných potravin. V každém potravinářském podniku je již samozřejmostí zavedení systému HACCP (= analýza nebezpečí a kontrola kritických bodů), který zajistí zdravotní nezávadnost potravin během výrobního procesu, distribuce, během skladování, ve veřejném stravování atd. Pokud se ve výrobním procesu, nebo ještě před ním, stane chyba, například nedodržení teploty, zpracování surovin napadených plísní atd., představují takto vyrobené potraviny jisté nebezpečí. Typy nebezpečí jsou biologické (viry, parazité…), chemické (toxiny, kontaminanty, alergeny…), nebo fyzikální (sklo, dřevo,…). V této bakalářské práci budeme rozebírat téma mykotoxinů obecně a ochratoxinu A podrobněji. Tyto toxiny pro nás představují nebezpečí chemické. Přítomnost houbových mikroorganismů je běžným a nevyhnutelným problémem v agroekosystému a je nutné je eliminovat nebo úplně odstranit. Mykotoxiny, jako sekundární metabolity plísní, vstupují do potravního řetězce snadno, ale odstranění těchto toxinů již tak snadné nebývá. Jsou tepelně odolné a úplné odstranění není možné, je možná pouze snaha o jejich eliminaci. Negativní účinky, které mykotoxiny působí, budou v práci zmíněny. Na tomto místě je vhodné připomenutí skutečnosti, že ne všechny plísně produkují škodlivé toxiny, které mají špatný vliv na zdraví člověka. Za zmínku stojí například kulturní plísně využívané při výrobě fermentovaných potravin, plísňové sýry, salámy, ale také produkce antibiotik, kyseliny citrónové atd. Tato bakalářská práce je určena pro všechny čtenáře, které zajímá problematika ochratoxinů. Snažila jsem se srozumitelně zpracovat téma mé bakalářské práce a zda se mi to podařilo, zjistí čtenář po přečtení mé práce. Pokud čtenář problematice porozuměl a dokáže o ní diskutovat, má snaha nebyla marná.
7
CÍL PRÁCE Hlavním cílem mé bakalářské práce je shromáždění důvěryhodných materiálů a zpracování literární rešerše na téma Ochratoxiny - účinky a výskyt v potravinách. Při vypracování práce si položím několik otázek a budu se snažit co nejlépe na tyto otázky odpovědět. Například: Co jsou mykotoxiny? Jací zástupci patří do této skupiny? Jak se testuje toxicita mykotoxinů? V jakých potravinách se mykotoxiny vyskytují? Co jsou to ochratoxiny? Hlavní producenti těchto ochratoxinů? Jaké toxické účinky mohou ochratoxiny způsobit? V jakých potravinách se ochratoxiny vyskytují? Jaká jsou legislativní omezení ochratoxinů v potravinách? Na závěr bakalářské práce zhodnotím, jak úspěšně byly výše uvedené otázky zodpovězeny.
8
LITERÁRNÍ PŘEHLED 1 CHEMICKÉ NEBEZPEČÍ 1.1
Zavedení a vysvětlení pojmů NOAEL, ADI a NPM V úvodu bych se nejprve zastavila a rozebrala charakteristiku chemického
nebezpečí a to proto, že ochratoxiny patří mezi mykotoxiny a ty pro nás představují právě zmíněné chemické nebezpečí. Dalším krokem bude vymezení významných zkratek NOAEL, ADI a NPM, které jsou pro mykotoxiny důležité a charakterizují jejich limity. U chemických nebezpečí se při kvalifikaci vychází z metod obecné a speciální toxikologie, respektive toxikologie potravin, kde využíváme zvířecí modely a provádíme biologický pokus. Sledujeme přitom chronické projevy, tedy změny v organismu projevující se po dlouhodobém podávání nízkých dávek určité látky. Změny v organismu se projeví například alergickými reakcemi, karcinogenitou, neurotoxicitou, dochází ke změnám na orgánech (nejčastěji to bývají játra a ledviny), změnám hmotnosti, změnám plodu a dalším. Biologický pokus je prováděn tak, že pokusným hlodavcům se dlouhodobě a v různém množství podává testovaná látka. Po určité době je pokus ukončen a aby nedošlo k ovlivnění výsledků, hlodavci jsou usmrceni ustřižením hlavy. Výsledkem je hodnota NOAEL, tedy takové množství dané chemické látky, která při dlouhodobém podávání nevyvolá žádný měřitelný negativní zdravotní účinek (NoObserved- Adverse- Effect- Level). Hodnota NOAEL je udávána v μg/kg živé hmotnosti za den. Další hodnota ADI (Acceptable Daily Intake) nám udává tolerovaný denní příjem, což znamená množství, které při celoživotní denní konzumaci nevyvolá negativní zdravotní účinek. ADI je udávána v μg/kg tělesné hmotnosti za den a je to podíl hodnoty NOAEL a ochranného faktoru. Tento faktor zohledňuje mezidruhové rozdíly a rozdíly v citlivosti mezi lidmi, jeho hodnoty bývají nejčastěji 100. Poslední hodnota označená zkratkou NPM se nazývá nejvyšší přípustné množství a byla zavedena proto, že potravinářská legislativa zemí Evropské unie netabelizuje hodnoty ADI, ale dané toxické látce přiřazuje pro jednotlivé potraviny právě hodnotu NPM (Kroes a kolektiv, 2000).
9
2 MYKOTOXINY 2.1
Obecná charakteristika Mykotoxiny pro nás představují chemické nebezpečí a můžeme je zařadit do
skupiny látek vznikajících mikrobiální činností. Jsou tedy produkty některých plísní, respektive jejich sekundárními metabolity. Riziko mykotoxinů pro nás představuje především konzumace mykotoxinů v kontaminovaných potravinách rostlinného původu a jejich metabolitů a reziduí v živočišných produktech (Komprda, 2004). Název Mykotoxiny je odvozen od mykes, tedy houba a toxicum, jed. Tento název byl poprvé použit v roce 1955 pány Forgacz a Carll (Malíř, 2009). Podle odhadu FAO je až 25 % konzumovaných potravin kontaminováno mykotoxiny (Velíšek, 2002).
2.2 Dělení mykotoxinů Mykotoxiny lze dělit nejméně ze tří hledisek. První hledisko dělení mykotoxinů je podle jejich hlavních producentů: fuzáriové (Fusarium spp.), aspergilové (Aspergilus spp.) a peniciliové (Penicillium spp.). Druhé hledisko dělení je podle jejich chemické struktury: nejvýznamnější mykotoxiny jsou ochratoxiny, aflatoxiny, trichotecenové kyseliny, zearalenon, patulin a fumosiny. Poslední hledisko dělení zahrnuje nejdůležitější toxické účinky mykotoxinů, mezi něž patří hepatotoxické (poškozují játra) a nefrotoxické (poškozují ledviny) účinky. Hlavní producenti mykotoxinů se podle výskytu dělí na plísně polní, skladištní a polní i skladištní. Mezi polní patří již zmíněné Fusarium, které napadá plodiny již před sklizní. Skladištní plísně napadají již uskladněné plodiny, například obilí mající vlhkost 13 - 18 %, skladované při teplotě v rozmezí 10- 50 °C. Nebezpečí ve skladech představují tzv. vlhkostní kapsy, kde dochází ke kondenzaci vlhkosti, a to v místech styku uskladněné plodiny se stěnami nebo s podlahou skladiště. Hlavním zástupcem je rod Aspergillus. Spojením již zmíněných dvou skupin vzniká skupina, do které můžeme zařadit rod Penicillium, patří sem plísně polní i skladištní (Komprda, 2004). 10
2.3 Toxikologické zhodnocení mykotoxinů Toxicita mykotoxinů klesá v řadě: aflatoxiny, ochratoxiny > zearalenon, trichotheceny, patulin > fumonisiny. Toxické účinky mykotoxinů jsou sumarizovány v tabulce 1 (Komprda, 2004). Tab. 1 Srovnání legislativních limitů obsahu příjmu s hodnotami výskytu a příjmu zjišťovaných monitoringem u nejdůležitějších mykotoxinů (Komprda, 2004) Výskyt [μg/ kg]
Toxin
Aflatoxiny
Příjem[μg/ den]
NPMa
Skutečnost
ADIb
Skutečnost
Jednotky
jednotky-
Desetiny
setiny-
desítky
Ochratoxiny Zearalenon
desetiny
desítky- stovky
desítky- stovky
Desítky
Jednotky
103
104- 105
Desítky
Jednotky
Trichotheceny Patulin Fumoniziny
Legenda k tab. 1: a- nejvyšší přípustné množství b
- tolerovaný denní příjem
Z tabulky 1 plyne, že jelikož mykotoxiny dnes patří mezi nejvýznamnější chemická nebezpečí v potravinách, tak alimentární riziko, tedy pravděpodobnost, že se
setkáme
s určitým
nebezpečím
v potravině,
plynoucí
z konzumace
inkriminovaných potravin, je přijatelné (Komprda, 2004).
2.4 Testování toxicity mykotoxinů Biologické metody, které se pro testování toxicity mykotoxinů nejčastěji používají, jsou imunologické metody RIA a ELISA. Tyto dvě metody jsou založeny na imunitní reakci sledované látky s protilátkami. Mykotoxiny zpravidla nevyvolávají imunitní odezvu s tvorbou protilátek, ale působí jako hapteny (= po navázání na vhodný nosič, například bílkovinu, vyvolají tvorbu specifických protilátek). Protilátky se mohou získávat buď ze séra imunizovaného zvířete, nebo se jedná o monoklonální protilátky (= produkující buňky, jsou všechny potomky jediné buňky). Pro výrobu monoklonálních protilátek se užívá lymfocytů B 11
z imunizovaného zvířete. Výhodu metody ELISA oproti metodě RIA je jednodušší odečítání výsledku, v závěru stačí změření intenzity zabarvení roztoku jednoduchým fotometrem. Do reakce se však vnáší další citlivá bílkovinná molekula - enzym. Použití toxikologických metod je v současné době minimální, a to v souvislosti s akcemi tzv. "ochránců zvířat", kdy poklesla dostupnost a zvýšily se náklady. Mezi účinné testy patřily testy detekující estrogenní látky (zearalenon) na základě zvětšení dělohy u nedospělých samiček potkanů a myší, ale také testy na kuřecím embryu, zde se legislativa vztahuje až na vylíhnutá kuřata. V případě mykotoxinů se používají testy na bezobratlých, ze kterých je využívána žábronožka, ale také na prvocích Paramecium caudatum. Mikrobiologické metody jsou velmi nenáročné ze strany materiálního vybavení. Je možné detekovat blokádu růstu testovacího kmene kolem disků s obsahem mykotoxinu. Pokud se vyskytne podezření na konkrétní mykotoxin, je to dáno jednak postupem přípravy vzorku, který vyloučí přítomnost některých mykotoxinů na disku, ale také použitím kmene se selektivně vysokou citlivostí k určitému mykotoxinu (skupině mykotoxinů)(Šimůnek, 2003).
2.5 Nejdůleţitější mykotoxiny Aflatoxin má základ chemické struktury v kumarinu. Skupina aflatoxinů zahrnuje aflatoxin B1, B2, G1, G2, M1, M2. Hlavními producenty jsou Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus. Nejdůležitějšími toxickými účinky jsou hepatotoxicita, nádory jater u zvířat, gastritidy (zánět žaludku) a enteritidy (zánět střev). Další toxin, ochratoxin A, má opět základ chemické struktury v podobě kumarinu. Hlavními producenty jsou Aspergillus ochraceus a Penicillium verrucosum. Jejich toxické účinky jsou nefrotoxicita, nádory močového ústrojí u zvířat a teratogenita (vývojová vada). Zearalenon je toxin, jehož hlavním producentem je Fusarium spp a základ jehož chemické struktury tvoří lakton resorcilové kyseliny. Vyznačuje se svými estrogenními účinky (imitace přirozených lidských hormonů). Fusarium je rovněž hlavní producent toxinů nivalenol a deoxynivalenol. Základ chemické struktury tvoří sesquiterpenoidy (trichoteceny). Nejdůležitějšími toxickými účinky těchto toxinů 12
jsou: zánět trávicího traktu, poškození krvetvorby, anémie (chudokrevnost), aborty (potraty) a imunosuprese (stav snížené imunity) u zvířat. C2O alifatický řetězec se dvěma zbytky trikarballylové kyseliny se vyskytuje u fumonisinů. Plísně Fusarium moniliforme a proliferatum jsou hlavními producenty a účinky, které způsobují, jsou následující: hepatotoxicita, nádory jater a jícnu, plícní edémy (otok) u prasat a leukoencefalomalacie (degenerace bílé mozkové kůry) u koně. Poslední důležitý mykotoxin je patulin, základem jehož chemické struktury je furopyranon
a
hlavním
producentem
toxinu
je
Penicillium
expansum.
Nejdůležitějšími toxickými účinky jsou nefrotoxicita, inhibice syntézy bílkovin, genotoxicita u zvířat (poškození genetické informace), gastroenteritidy (zánět žaludeční a střevní sliznice), dermální iritace (podráždění) a imunotoxicita (Komprda, 2004).
2.6 Výskyt mykotoxinů v krmivech a potravinách Ke kontaminaci potravin a krmiv může dojít v různých fázích, které předchází konzumaci. Různé cesty průniku mykotoxinů do potravního řetězce a jejich další osud znázorňuje obr. č. 1. Ke kontaminaci nedochází pouze exogenně, ale i
v souvislosti
s cíleným
využíváním
plísní
v různých
potravinářských
a biotechnologických procesech. Souhrnný výčet zdrojů kontaminace je následující: plesnivé potraviny - zemědělské plodiny (primární infekce), tedy cereálie, olejniny, ovoce a zelenina, hotové produkty (sekundární infekce), nesmíme opomenout i krmné směsi pro hospodářská zvířata, rezidua v ţivočišných tkáních a produktech - mléko, mléčné výrobky, maso a masné výrobky, výrobky získávané s vyuţitím kulturních plísní - plísňové sýry, fermentované orientální a masné výrobky, produkty biotechnologií - mikrobiální proteiny, potravinová aditiva (vitamíny) a technické enzymy. Pokud dojde ke kontaminaci zemědělských plodin za polních podmínek, faktory, které podmiňují její rozsah, jsou následující: míra fyzického stresu napadené rostliny (nedostatek minerálií), 13
typ mykotoxinu, který je produkován, schopnost rostliny ničit mykotoxiny, interval, který je mezi sklizní a produkcí mykotoxinů (Velíšek, 2002). Zemědělská
Sklizeň
Skladování
plodina Růst plísní během skladování
Napadení plodin
Zemědělské
plísněmi
biocidy
Mikrobiální degradace
Poškození plodin
Interakce
hlodavci
s prostředím
Fyzikálně-
Mykotoxikosy zvířat
chemická degradace
a
Rezidua mykotoxinů
KRMIVA
Absorpce v
Metabolismus a
tkáních
vylučování
Maso
Mléko
Mykotoxikosy
POTRAVINY
lidí Obr 1. Faktory, které ovlivňují výskyt mykotoxinů v potravinách a krmivech, (Velíšek, 2002). a
- toxické syndromy, které vyvolávají mykotoxiny, produkované řadou druhů
mikroskopických hub. 14
2.6.1 Srovnání konvenčních potravin a biopotravin Biopotraviny jsou takové potraviny, které nesmějí být vyráběny s použitím umělých hnojiv, pesticidů a genových manipulací, bioprodukty nesmějí obsahovat umělá barviva a konzervanty a nesmějí být zpracovány chemickými a fyzikálními postupy.
Konzumenti
pokládají
biopotraviny
ve
srovnání
s konvenčně
produkovanými potravinami za nutričně hodnotnější, zdravotně nezávadné a chutnější. Pokud však srovnáme biopotraviny s konvenčními potravinami, v případě mykotoxinů nebyly zjištěny průkazné rozdíly v obsahu deoxynivalenolu mezi bio a konvenční pšenicí. Bio-mléko však obsahovalo ve srovnání s mlékem konvenčním průkazně vyšší koncentrace aflatoxinu M-1. Konzumace bio-vína je v celkovém hodnocení rizikovější než konzumace vína konvenčního a u bio-piva byla ve srovnání s pivy konvenčními zjištěna častější kontaminace ochratoxinem A i deoxynivalenolem (Komprda, 2009). Nelze tedy jednoznačně říci, že biopotraviny jsou zdravější než konvenční potraviny.
3 OCHRATOXINY 3.1 Ochratoxin A Ochratoxin A (OTA) patří mezi důležité mykotoxiny. V roce 1965 byl objeven v Jihoafrické republice a poté chemicky charakterizován při testování toxinogenity kmenů vláknitých mikroskopických hub Aspergillus ochraceus (Ostrý, Malíř, 2007). OTA je chlorovaný, což je neobvyklé pro přírodní produkty (obr.2) (Bayman, Baker, 2006). OTA není jediným zástupcem ochratoxinů, řadíme sem ještě ochratoxin A, C, D, α. (Ostrý, Malíř, 2007). Velíšek (2002) dále uvádí, že do skupiny ochratoxinů řádíme i ochratoxin B a β. OTB se liší od OTA absencí atomu chloru a je prakticky netoxický (Velíšek, 2002). OTC je ethyl esterem OTA. Tento ochratoxin je také netoxický a méně častý podobně jako OTB (Bayman, Baker, 2006). OTA je ale ve skupině zcela dominantní. Obecně lze OTA charakterizovat jako derivát 7- izokumarinu vázaný na aminoskupinu L- β- fenylalaninu (Ostrý, Malíř, 2007), se sumárním vzorcem C20H18ClNO6. OTA je bílá krystalická látka o molekulové hmotnosti 403, bodu tání 169 °C (xylen), 89 až 95 °C (benzen) (Adensam, Lebedová, 1993). 15
Obr. 2 Struktura ochratoxinu A, (převzato z commons.wikimedia.org/wiki/File:Ochratoxin_A.svg, 2007)
3.2 Události spojené s výskytem OTA OTA se pravděpodobně vyskytoval v potravinách již ve starém Egyptě. Několik archeologů nalezlo staré egyptské hrobky, ve kterých se nalézali mrtví, kteří zemřeli na náhlé a nevysvětlitelné příčiny. Úmrtí, které následovalo po akutním selhání ledvin, mohlo být způsobeno vdechnutím spor s obsahem OTA, přímý důkaz však neexistuje. Velký pokles úmrtnosti byl zaznamenán kolem roku 1750 ve Velké Británii a Francii. Tento pokles byl vysvětlen zvýšením spotřeby brambor, které jsou méně citlivé na kontaminaci mykotoxiny než pšenice, ječmen a žito. Před čtyři lety došlo k události, která vyvolala zájem italské veřejnosti o OTA. V lednu toho roku byl v Itálii zatčen majitel mlýnu a obviněn z dovozu 58 000 tun kontaminované kanadské pšenice 15 μg/kg OTA. Tato pšenice byla prodána pro zpracování potravin. Zpracovatelé i spotřebitelé těchto vyrobených potravin byli touto zprávou velice rozrušeni, avšak kontaminace lidského organismu OTA byla zanedbatelná (Bayman, Baker, 2006).
16
3.3 Producenti OTA Rod Aspergillus a Penicillium se uplatňují při produkci OTA. V tropických a subtropických oblastech je OTA v potravinách produkován mikroskopickými vláknitými houbami rodu Aspergillus. Patří sem A.ochraceus (obr. 3) a A. melleus. U zmíněného A.ochraceus byl zjištěn teplotní rozsah pro produkci OTA v rozmezí 15 - 37 °C, optimální teplota se pohybuje okolo 28°C (Malíř, Ostrý, 2007). OTA je taktéž produkován houbou zvanou Aspergillus carbonarius (Luchese, De Moraes, 2003). Také A. niger (obr. 4) patří mezi producenty OTA, avšak do jisté doby byl považován z hlediska produkce mykotoxinů za zcela bezpečný. A. niger byl poprvé identifikován v roce 1994 a kmeny A.niger jsou využívány v biotechnologiích při produkci různých hydrolytických enzymů a organických kyselin (kyselina citrónová) (Malíř, Ostrý, 2007). Penicillium je oproti rodu Aspergillus produkován v chladnějších oblastech. Jedná se opět o vláknité mikroskopické houby a patří sem P.verrucosum (obr. 5) a P.nordicum. Kmeny P.verrucosum produkují OTA v teplotním rozmezí 4 - 30 °C (Malíř, Ostrý, 2007). A. ochraceus a P. verrucosum jsou považovány za typické plísně produkující OTA, ale nejsou pravděpodobně významných zdrojem OTA v živné půdě (Romero et al., 2009).
Obr. 3 Aspergillus ochraceus, (převzato z www.coffee-ota.org/photo1_7.htm) 17
Obr. 4 Aspergillus niger, (převzato z http://www.doctorfungus.org/imageban/images/Dsutton_05feb/A_niger_1.jpg)
Obr. 5 Penicillium verrucosum, (převzato z http://www.univ-brest.fr/esmisab/sitesc/Myco/fiches/Pvirid.htm )
18
3.4 Toxické účinky OTA Toxicita OTA, akutní i chronická, je odvozena od schopnosti inhibice syntézy proteinů, a to na základě kompetice (soutěžení) s fenylalaninem v reakcích katalyzovaných fenylalanin-t RNA syntetázou. Hlavními toxickými účinky OTA jsou: nefrotoxicita, imunotoxicita, genotoxicita (škodlivé účinky na genetický materiál, např. znečištěné ovzduší), karcinogenita, teratogenita (schopnost látky vyvolat vrozenou vývojovou úchylku vyvíjejícího se plodu) a neurotoxicita. V neposlední řadě může byt toxický účinek OTA spojen s buněčným oxidativním působením, tzn. poškození DNA, dále s inhibicí mitochondriální respirace, tzn. poškození mitochondriálních funkcí a také může být toxický účinek vázán s tvorbou ATP. Dále bylo prokázáno zvýšení peroxidace lipidů, poškození metabolizmu cukrů a vápníku, a to při studiu mechanismů účinků OTA (Ostrý, Malíř, 2007). Mezinárodní úřad pro výzkum rakoviny IARC (International Agency for Research on Cancer) klasifikoval OTA jako možný karcinogen pro člověka, skupina 2B (Sage et. al, 2004).
3.4.1 Nefrotoxicita Nefrotoxicita patří mezi hlavní toxické účinky OTA, kdy cílovým orgánem poškození jsou ledviny a vylučovací systém. Dochází k akumulaci OTA ve tkáni ledvin a rozsah poškození je závislý na dávce a délce expozice. Nefropatie se vyskytuje jak u lidí, tak u zvířat, respektive u prasat a bylo prokázáno, že OTA by mohl hrát velkou roli právě v etiologii (nauka o příčinách vzniku nemocí) nefropatie (Malíř, Ostrý, 2007). Endemická nefropatie je onemocnění ledvin, které dosud nelze vysvětlit vědecky (Peraica a kolektiv, 2008). Nefropatie je rozšířena v určitých částech světa, přesněji v oblastech podél řeky Dunaje, v některých částech Bulharska, Rumunska a v zemích bývalé Jugoslávie a nazýváme ji Balkánskou endemickou nefropatií (BEN). Dochází již ke zmíněnému poškození ledvin a v horším případě k totálnímu selhání funkce tohoto orgánu. Tento proces je ireversibilní (nevratný) a končí terapií formou dialýzy nebo transplantací ledvin. Dosud nevyřešeným problémem u BEN je původ. Nabízí se hned několik hypotéz, které by měly vysvětlit vznik tohoto onemocnění a tumorů 19
močového traktu, které chorobu provází. Nefropatii mohou způsobovat polycyklické aromatické uhlovodíky a aromatické aminy, těžké kovy, aristolochové kyseliny (nitrofenantrenové kyseliny), genetické faktory a také mykotoxiny. U mykotoxinů se hypotéza opírá o skutečnost, že choroba může být způsobena intoxikací obyvatelstva daných oblastí dlouhodobým opakovaným příjmem malých dávek ochratoxinu A, ale také dalšího mykotoxinu citrininu. Při hlubším zkoumání zjistíme, že je zde nápadná podobnost mezi strukturálními změnami v ledvinách i změnami jejich funkce vyvolanými v experimentálních zvířatech ochratoxinem A a patologickými i klinickými příznaky Balkánské endemické nefropatie. U BEN dochází ke změnám struktur ledvinových tubulů, intesticiální fibrose (zhuštění vaziva ve tkáni) a poškození parenchymu vedoucímu k totální atrofii (ztenčení, zmenšení normálně vyvinutého orgánu) orgánu. S podobnými patologickými změnami se také setkáváme u nefropatie vyvolané OTA, tzn. intesticiální fibrose, atrofie tubulů, patologické změny v glomerulech. Další skutečností je, že u obyvatel postižených nefropatií se v sledovaných potravinách vyskytla větší koncentrace OTA oproti potravinám z jiných oblastí. Mezi sledované potraviny patřila kukuřice, ale také fazole, které se v postižené oblasti konzumují nejvíce. V letech 1981- 1991 byly tyto potraviny sledovány a bylo zjištěno, že až v 50 % vzorku se vyskytuje obsah OTA vyšší než 10 μg/kg. Naproti tomu v nepostižených oblastech, avšak lokalizovaných v blízkosti oblastí postižených, byl zjištěn obsah 10 μg/kg , ale jen u 10 % vzorků. OTA byl zaznamenán také u masných produktů, které byly distribuovány a konzumovány obyvatelstvem v postižených oblastech (Stiborová a spol, 2005). Také v krvi obyvatelstva postižených oblastí byla nalezena vyšší koncentrace OTA, přesněji 5- 50 ng/ ml krve, a to u více než 2 % obyvatelstva. Abychom si lépe dovedli představit tuto hodnotu, pro srovnání lze uvést koncentrace u obyvatel České republiky (Stiborová a spol, 2005). V rámci Monitoringu zdravotního stavu obyvatelstva ve vztahu k životnímu prostředí bylo vyšetřeno na obsah ochratoxinu A celkem 2206 vzorků lidského séra a zjistilo se, že OTA byl přítomen ve 2077 vzorcích. Procentuálně to lze vyjádřit jako 94 %, a to v průměrné koncentraci 0,28 ng/ml krve (Malíř, Ostrý et al, 2004). Závěrem charakterizace nefropatie lze uvést, že OTA je spojován s nádory ledvin a nádorovým onemocněním varlat (Malíř, Ostrý, 2007).
20
3.4.2 Vylučování OTA z organismu Doba, za kterou se vyloučí OTA z organismu člověka, činí pravděpodobně 35 dní. Za tento dlouhý biologický čas rozpadu toxinu může zčásti enterohepatální cyklus (určitá látka se dostává z jater žlučí do střeva, kde se vstřebává a vrací se zpět krví do jater), do kterého OTA vstupuje. OTA bývá označován jako kumulativní jed, v praxi to znamená, že se toxin rychle absorbuje, ale pomalu vylučuje. Mezi hlavní orgány zadržování toxinu patří: ledviny, játra, varlata, střeva. Rezervu pak tvoří svaly a tuková tkáň a krevní cestou je toxin distribuován (Ostrý, Malíř, 2007).
3.4.3 Expoziční limit Tento limit je důležitým kritériem pro stanovení hygienických limitů (Nedělník, 2004). JECFA FAO/WHO udává expoziční limit pro OTA 100 ng/ kg tělesné hmotnosti/ den (WHO, 2007).
3.4.4 Hygienické limity OTA Nařízení Komise (ES) č.1881/2006 stanovuje maximální limity OTA pro následující potraviny: sušené hrozny révy vinné (korintky, rozinky, sultánky) -10 μg/kg, rozpustná káva (instantní káva) - 10 μg/kg, pražená kávová zrna a mletá pražená káva kromě rozpustné kávy - 5 μg/kg, nezpracované obilniny - 5 μg/kg, všechny produkty pocházející
z nezpracovaných obilovin, včetně
zpracovaných výrobků z obilovin a obilovin určených k přímé lidské spotřebě - 3 μg/kg, víno (včetně šumivého vína, s výjimkou likérového vína a vína s obsahem alkoholu nejméně 15 % objemových) a ovocné víno - 2 μg/kg, aromatizovaná vína, aromatizované vinné nápoje a aromatizované vinné koktejly - 2 μg/kg, hroznová šťáva, rekonstituovaná koncentrovaná hroznová šťáva, hroznový nektar, rekonstituovaný hroznový mošt a rekonstituovaný koncentrovaný hroznový mošt určené pro lidskou spotřebu - 2 μg/kg, 21
obilné příkrmy a ostatní příkrmy určené pro kojence a malé děti - 0,50 μg/kg, dietní potraviny pro zvláštní léčebné účely určené speciálně pro kojence 0,50 μg/kg, zelená káva, sušené ovoce, jiné než sušené hrozny révy vinné, pivo, kakao, kakaové výrobky, likérová vína, masné výrobky, koření a lékořice - - μg/kg (Hajšlová, 2009). V zelené kávě, v sušeném ovoci, v sušených hroznech révy vinné, v kakau a kakaových výrobcích, v masných výrobcích včetně jedlých drobů, v krevních výrobcích a v likérových vínech nebylo nutné stanovit maximální limity OTA. Tyto výrobky nijak významně nepřispívají k expozici OTA, nebo v nich vysoké množství OTA bylo zjištěno pouze zřídka. V případě zelené kávy a piva je přítomnost OTA kontrolována již v jiném stadiu výrobního řetězce, tedy v pražené kávě a ve sladu. Nařízení Komise (EU) č. 105/ 2010 se zaměřilo na koření a lékořici. U těchto potravin bylo již několikrát zjištěno velmi vysoké množství OTA a z důvodu ochrany veřejného zdraví bylo vhodné neprodleně stanovit maximální limit OTA v koření a lékořici. Proto příloha nařízení (ES) č. 1881/ 2006 se mění takto: koření o Capsicum spp. (sušené plody, celé nebo mleté, včetně chili papriček, mletých chili papriček, kayenského pepře a papriky), Piper spp. /plody, včetně bílého a černého pepře) - 30 μg/kg od 1.7 2010 do 30. 6. 2012, o Myristica fragrans (muškátový oříšek), Zingiber officinale (zázvor), Curcuma longa (kurkuma) - 15 μg/kg od 1. 7. 2010. lékořice o kořen lékořice, složka bylinného čaje - 20 μg/kg, o výtažek z lékořice pro použití v potravinářských výrobcích, zejména v nápojích a cukrovinkách - 80 μg/kg (Nařízení komise, 2010).
22
3.5
Výskyt OTA v potravinách OTA se vyskytuje u potravin rostlinného i živočišného původu. Značné množství
níže uvedených potravin konzumujeme, v menší či větší míře, každý den, proto je snížení příjmu OTA problematické. Mezi potraviny rostlinného původu, ve kterých OTA nalezneme, patří zejména obiloviny a produkty z obilovin. Ty se řadí mezi hlavní zdroje OTA v potravinovém řetězci. Káva, kakao a výrobky z něj, pivo, luštěniny, koření, zelený čaj, sušené ovoce, nejvíce fíky a rozinky, dále také koření, lékořice, víno, šťávy grapefruitové a hroznové jsou minoritními zdroji OTA. V rámci potravin živočišného původu jsou hlavním zdrojem OTA vepřové maso, krev, vnitřnosti, nejvíce játra, ledviny a výrobky z krve. Za zanedbatelnou se považuje kontaminace OTA u kosterní svaloviny, vajec a mléka, i když po zkrmení krmiva s obsahem OTA se mohou rezidua OTA vyskytovat v krevním séru a vnitřnostech. (Malíř, Ostrý, 2007). U OTA dochází k rozsáhlému přenosu z krmiva do živočišných tkání, což se ale týká pouze monogastrů (prasata, drůbež), protože u skotu dochází k rozsáhlé degradaci OTA v předžaludku (Komprda, 2004).
3.5.1 OTA a mateřské mléko Mykotoxiny se mohou z lidského organismu vylučovat také mateřským mlékem. Z této skutečnosti vyplývá, že již v raném věku může docházet k zátěžím organismu novorozence ochratoxinem A. Autoři Čajdová a Dostál uvádí, že došlo k analýze vzorků mateřského mléka na Slovensku pro zjištění možné kontaminace mykotoxinem OTA. Byla použita vysoko účinná separační metoda kapalinové chromatografie (HPLC). Vzorky použité k této analýze poskytly matky dobrovolně a byly odebrány na dětské klinice. Podle zjištěných hodnot se došlo k závěru, že naměřené hodnoty nebyly alarmující. Nejvyšší obsah OTA v jednom litru mateřského mléka byl 47, 6 ng, přičemž z 32 analyzovaných vzorků byl OTA dokázán v 31 % (Čajdová, Dostál, 2008).
23
3.5.2 OTA a káva Za kontaminaci kávy OTA mohou být zodpovědné A. ochraceus, A. carbonarius a A.niger. Frisvada a kolektiv (2004) uvádějí, že nejdůležitějšími producenty OTA v kávě jsou A. ochraceus, A. westerdijkiae a A. steynii. Poslední dva nové druhy Aspergillus sekce Nigri byly nedávno určeny z kávy a popsány. Avšak i přes velké množství studií jsou autoři Bayman a Baker přesvědčeni, že stále není jasné, které druhy hub jsou nejvíce odpovědné za kontaminaci kávy OTA. Obecně však platí, že kávy z Afriky mají vyšší hladiny OTA než kávy z Latinské Ameriky nebo Asie (Bayman, Baker, 2006). Platí, že při konzumaci pěti šálků za den, tedy zhruba 30 g kávy, lze příjem OTA odhadnout na 0,03 μg/ den, což je podstatně méně, než je provizorní tolerovatelný denní příjem podle komise Codex Alimentarius, který činí 1μg/ den. (Komprda, 2004). V roce 2009 přijala komise Codex Alimentarius 30 nových mezinárodních standardů, zásad a pokynů pro zlepšení celosvětové bezpečnosti potravin a ochrany zdraví spotřebitelů. Mezi nové standardy přijaté komisí patřila i prevence před kontaminací OTA v kávě, kde každá země, která produkuje kávu, by si měla vypracovat své vlastní programy pro prevenci a snižovaní kontaminace OTA (Setiogi. 2009).
3.5.3 Výskyt OTA ve víně a vinné révě Vinná réva a víno obsahují řadu fenolových sloučenin. Specifické množství a typy fenolových sloučenin závisí na řadě faktorů, včetně druhu, zralosti, sezónních podmínek, skladování a zpracovatelských postupů. Byl prokázán účinek fenolových sloučenin na mléčné bakterie, které jsou důležité pro výrobu vína, ale existuje jen málo informací o účincích těchto sloučenin na populaci plísní v révě. Bylo zveřejněno, že čeleď plísně Aspergillus Nigri, je predominantní mykobiotou vinné révy z různých regionů. „Černé formy“ Aspergillus (především A. niger aggregate a A. carbonarius) nejsou zodpovědné za znehodnocení bobulí během doby před i po sklizni, ale jsou také schopny produkovat OTA. Nedávné průzkumy ukázaly, že OTA v hroznech vinné révy, víně a rozinkách pochází z Aspergillus čeledi Nigri a v rámci této skupiny je hlavním zdrojem OTA (Romero et. al, 2009). Zimmerli a Dick sledovali v roce 1995 v epidemiolgické studii ve Švýcarsku výskyt OTA v lidském krevním séru. Překvapivě zjistili, že muži a ženy žijící 24
v oblasti jižněji od Alp, tedy v kantonu Ticino, měli v krevním séru mnohem více OTA než muži a ženy, žijící severněji od Alp a také v jiných částech Švýcarska. Jak je to tedy možné? Je tady ovšem vysvětlení. Kanton Ticino je specifický v tom, že se zde mluví italsky a tedy i kuchyně je italská a k dobrému jídlu patří zajisté dobré pití, v tomto případě víno. Při vyhledávání dalších možných dietárních expozičních zdrojů OTA byl OTA poprvé stanoven ve víně a hroznové šťávě. Toto zjištění vyvolalo vlnu zájmu o možném výskytu OTA ve víně v zemích Evropy, ale i ve světě. Proto byl v EU v roce 2001 iniciován projekt „WINE-OCHRA RISK“. Hlavní cíle projektu byly: hodnocení zdravotního rizika OTA ve víně, ale zároveň minimalizace OTA ve víně. Do projektu se zapojily státy Středomoří, jmenovitě Francie, Itálie, Španělsko, Portugalsko, Řecko a Izrael. Díky tomuto projektu došlo k výzkumu a bylo zjištěno, že hrozny révy vinné jsou přirozeně osídleny vláknitými mikroskopickými houbami Aspergillus sekce Niger(A. N). Za nejvýznamnějšího producenta OTA byl stanoven Aspergillus carbonarius(A. c). V tabulce č. 2 jsou uvedeny jednotlivé země a daní producenti OTA (Ostrý, 2005). Tab. 2 Vláknité mikroskopické houby osídlené na hroznech révy vinné (Ostrý, 2005) Stát
Producenti OTA
Francie
A.c
Řecko
A.c, A.N
Izrael
A.c, A.N
Itálie
A.c, A.N
Portugalsko
A.c, A.N Aspergillus ochraceus
Španělsko
A.c Aspergillus ochraceus
Legenda k tab. 2: A.c- Aspergillus carbonarius A.N- Aspergillus Niger Ve vínech červených, rosé, bílých a dezertních byl potvrzen výskyt OTA a koncentrace OTA ve vzorcích nabývaly hodnot v rozmezí < 0,01 - 7,6 μg/l v závislosti na oblasti.
25
Projekt „WINE-OCHRA RISK“ byl podnětem k realizování pilotní studie v České republice. Opět se zkoumala produkce OTA vláknitými mikroskopickými houbami vyskytujícími se na hroznech révy vinné. Kromě produkce se zjišťoval také výskyt OTA v moštech, vínech a šťávách z hroznů révy vinné. V říjnu roku 2004 došlo k realizaci projektu a bylo vybráno 5 viničních tratí s 22 odrůdami révy vinné ve Znojemské vinařské podoblasti. Mezi odrůdy patřily například: Ryzlink rýnský, Rulandské modré, odebrány z viniční trati Volné pole, Frankovka, Pálava z trati Weinperky, viniční trať Šobes a odrůdy Rulanské bílé a šedé, Tramín ve viniční trati U Hájku a v poslední řadě viniční trať Frédy a zde odrůda Sauvignon a Ryzlink vlašský. Ve vzorcích byly přítomny tyto vláknité mikroskopické houby: Alternaria alternata,
Cladosporium
(C.
herbarum,
C.cladosporioides),
Penicillium
(P.expansum, P. aurantiogriseum, P.spinulosum, P.citrinum), Rhizopu nigricans, Aspergillus clavatus a Epicoccum nigrum. Mikroskopické vláknité houby, jmenovitě Aspergillus
carbonarius,
Aspergillus
sekce
Niger,
Aspergillus
ochraceus,
Penicillium verrucosum a Penicillium nordicum, však nebyly ve vzorcích hroznů révy vinné izolovány a lze tedy s jistotou říci, že OTA ve vzorcích hroznové šťávy, moštu a vína nebyl zjištěn, hodnoty byly pod mezí stanovitelnosti použité metody. Výsledek je získán ovšem jen z jedné sezóny a pro lepší přehled by měl být odběr vzorků prováděn i v dalších letech a ve více vinařských oblastech (Ostrý, 2005). Závěrem lze říci, že producenti OTA jsou dominantní v jižních částech světa, nejvíce ve Středomoří, jak je uvedeno výše. Vyskytují se zde ideální podmínky pro plísně, vysoké teploty a vlhkost. Směrem na sever se podmínky zhoršují.
3.5.4 Obilniny a OTA Spotřeba obilovin na celém světě je vysoká, tudíž obilniny zaujímají důležité postavení v lidské výživě. Kromě vysokého obsahu škrobu jako zdroje energie poskytují vlákninu, bílkoviny a výživné lipidy bohaté na esenciální mastné kyseliny. Odhaduje se, že globální spotřeba obilovin přímo zajišťuje asi 50 % bílkovin a energie nezbytné pro lidskou stravu, 25 % bílkovin a energie je zajišťováno prostřednictvím hospodářských zvířat. Kontaminované obiloviny mohou představovat přímé zdroje expozice člověka, jak přímou spotřebou, tak nepřímo při konzumaci produktů pocházející ze zvířat krmených kontaminovaným krmivem. Obiloviny mají širokou paletu použití jako 26
potraviny, například chléb vyráběný z pšenice, žita nebo kukuřice, který je jednou z nejvíce důležitých potravin. Mezi další potraviny patří snídaňové cereálie, ty jsou stále spotřebovávané na celém světě, stejně jako pekařské výrobky, například cookies a koláče. Obiloviny jsou také využívány při přípravě alkoholických nápojů jako whisky, pivo (ječmen, čirok), vodka (pšenice) a americký Bourbon (žito). Vzhledem ke globálnímu významu obilovin ve stravě je skutečnost jejich náchylnosti k produkci mykotoxinů, které mohou navíc přetrvávat i v konečných produktech, velmi podstatná. Navzdory mnohaletému výzkumu a zavádění správné zemědělské praxe ve výrobě potravin a správné výrobní praxe pro skladování a distribuci, jsou mykotoxiny nadále přetrvávajícím problémem. OTA byl původně označen jako sekundární metabolit A. ochraceus a později jako sekundární metabolit několika
dalších
Aspergillus
a
Penicillium
spp.
Avšak
každý
z těchto
ochratoxinogenních druhů hub vykazuje jiné nároky jak na podmínky prostředí, tak na substrát, to tedy znamená, že původ některých obilných plodin je velice důležitý (Duarte, 2010). Například u A.ochraceus byl zjištěn teplotní rozsah pro produkci OTA v rozmezí 15 - 37 °C, optimální teplota se pohybuje okolo 28°C. Naproti tomu kmeny P.verrucosum produkují OTA v teplotním rozmezí 4 - 30 °C. (Malíř, Ostrý, 2007). Závěrem lze dodat, že je zde namístě zavést náležité preventivní opatření proti výskytu mykotoxinů v potravinách. Tato opatření budou uvedena níže.
3.5.5 Výskyt OTA v kukuřici Mezi hlavní země, které se potýkají s kontaminací mykotoxiny v různých druzích potravin vyvážených, či přímo konzumovaných již od roku 1967, je Turecko. Tato potravina je velice náchylná k plísňovým infekcím na polích, během sklizně, transportu a skladování. V posledních 5 letech se produkce kukuřice pohybovala mezi 2,1 až 3 miliony tun, což odpovídá přibližně 10 % z celkové produkce cereálií v Turecku. Ačkoliv máme dostupná data ohledně hladiny mykotoxinů v různých potravinách konzumovaných a vyráběných v Turecku, studie OTA v obilninách se vyskytují v omezené míře. Proto byla provedena studie na určení hladiny OTA ve vzorcích kukuřice pěstované a konzumované v Turecku. Provedl se experiment, kdy bylo během roku 2005 sesbíráno z různých pouličních tržišť a obchodů v různých oblastech Turecka 47 vzorků kukuřice (200g). 27
Tyto vzorky byly podrobeny enzymatické imunoanalýze ke zjištění celkové hladiny OTA. Hladiny OTA zjištěné ve všech vzorcích kukuřice jsou shrnuty v tabulkách č. 3 a 4. Bylo pozorováno, že hladiny OTA pod 0,625 μg/kg se objevují ve 43 % vzorků, zatímco hladina nad povoleným limitem 3,00 μg/kg (3,362–8,572 μg/kg) byla zjištěna pouze ve 4 % všech analyzovaných vzorků. Kukuřice je jednou z nejdůležitějších potravin zejména v černomořské oblasti Turecka, kde se její produkce odhaduje na 45 % celé turecké produkce. Právě v tomto regionu bylo získáno 50 % analyzovaných vzorků v této studii, s výsledkem dokazujícím, že se OTA v tomto regionu vyskytuje nad 30 %. Navzdory vysoké vlhkosti pozorované v černomořské oblasti se hladiny OTA pohybovaly nad povoleným limitem v Turecku pouze v 8 % respektive v 5 % těchto vzorků. Na druhé straně, 35 % vzorků bylo získáno v západních a jižních oblastech Turecka (středomořská, egejská, marmarská) a bylo zjištěno, že počet vzorků nad prokazatelnou hranicí je vyšší, pravděpodobně díky horkému klimatu podporujícímu výskyt mykotoxinů. OTA je produkován množstvím druhů Aspergillus, jako je A. ochraceus, vyskytující se v teplejších oblastech světa. Tyto podmínky lze nalézt zejména ve středomoří a egejské oblasti. Procento kontaminovaných vzorků OTA v těchto regionech je ~ 85 %. U všech vzorků se hodnota OTA pohybovala pod 3,00 μg/kg. Ostatní vzorky (15 %) analyzované v této studii byly získány v oblasti centrální Anatolie se 100 % výskytem OTA s hladinou pod 1,295 μg/kg. Tab. 3 Celková hladina OTA v turecké kukuřici (Giray et al., 2009)
OTAa
C [μg/kg]
N
% vzorků
Minimum
Maximum
Průměr
<0,625
20
43
-
-
-
0,62525 53 1,080 1,511 1,226.9 3,00 >3,00 2 4 3,362 8,573 5,967 a Legenda k tab. 3: - množství celkové hladiny kontaminace OTA je 0,625 μg/kg kukuřice, přičemž povolený limit ministerstvem zemědělství v Turecku je 3,00 μg/kg
28
Tab. 4 Oblastní distribuce a hladiny AF a OTA ve vzorcích turecké kukuřice (Giray et al., 2009) Region
Počet vzorků
OTA [μg/kg] % pozitivních a vzorků 30
Rozmezí [μg/kg]
Černomořská 24 0,625- 8,57 oblast Středomořská 9 70 0,63- 1,51 oblast Marmarská a 7 100 1,08- 1,43 egejská oblast Centrální Anatolie 7 100 0,65- 1,295 Legenda k tab. 4: a- pozitivní vzorky s nepatrným množstvím OTA (<0,625 μg/kg) Kukuřice je primárně využívána k lidské konzumaci a je velmi podstatnou složkou potravy dětí v Turecku. Mimo jiné se používá také jako hlavní přísada do zvířecích krmiv. Existuje mnoho závažných zpráv o výskytu mykotoxinů v různých druzích potravin v Turecku. Nicméně studie koncentrací OTA v kukuřici a kukuřičných výrobcích nejsou příliš početné a jsou omezené zejména na oblast konzumace zvířaty, s daty prokazujícími nízkou míru kontaminace. A ačkoliv byl zjištěn jen málo četný výskyt mykotoxinů analyzovaných v rámci tohoto výzkumu, některé vzorky překračovaly přípustnou hranici. Jejich výskyt však nelze v rámci této oblasti podceňovat, stejně jako nutnost pravidelné kontroly vzorků kukuřice na OTA, aby se snížil pravděpodobný stupeň vlivu těchto nebezpečných složek, jimž je lidstvo vystaveno. Musí být zkoumán management těchto plísňových metabolitů, aby se minimalizovalo riziko vlivu na člověka. Toho lze dosáhnout zavedením stálých kontrolních a monitorovacích programů od produkce až do konzumace. Dále by měly být vyvinuty vzdělávací programy týkající se řešení problémů s mykotoxiny, zejména pro zemědělské výrobce, stejně tak by měla být podporována aplikace vědeckých poznatků do praxe a zdokonalování technik sklizně, zpracování a uskladnění. To by mohlo na jisté úrovni snížit riziko kontaminace mykotoxiny, což by zároveň snížilo hrozbu pro lidské zdraví i riziko ekonomické ztráty (Giray et al., 2009).
29
3.6 Lze eliminovat obsah OTA? Velký význam v boji proti ochratoxinům a mykotoxinům zaujímají hlavně preventivní opatření. Existuje zde integrovaný systém, který respektuje nároky plodin daného druhu, jak na výživu, tak na stanoviště a zamezuje tak napadení plodin patogenními organismy. Velký podíl na snížení potravin vyrobených ze zaplísněných surovin mají také pravidelné mykologické a toxikologické rozbory, které by se měly stát součástí každého posklizňového procesu. Dalšího snížení nadměrného růstu houbových mikroorganismů a následné tvorby mykotoxinů by se mělo dosáhnout aplikací vhodných „protiplísňových“ přípravků (Nědelník, 2004). Velice důležité je skladování potravin v suchých, ale zároveň dobře větraných prostorech, ochrana surovin a potravin před jejich zvlhnutím. Nezbytně nutné je nepodávat zvířatům ke zkrmování zaplísněná krmiva (Komprda, 2004). Pokud se podcení všechny předešlé kroky, obsah ochratoxinu A lze snížit tepleným zpracováním. Jak ukazuje tabulka č. 5, tepelné opracování vede vesměs k výraznému poklesu koncentrace OTA (Velíšek, 2002), avšak úplného odstranění nebylo nikdy dosaženo (Nedělník, 2004). Tab. 5 Změny obsahu OTA při zpracování kontaminovaných zemědělských plodin, (Velíšek, 2002) Produkt
Podmínky zpracování
Ztráty (%)
Káva
Pražení
10-20
Kávové boby
Pražení, 200°C, 5 min
0
Pivovarský rmut
Vaření
27- 28
Cereální výrobky
Autoklávování, 120°C, 3
30
hod Další alternativou, která nabízí snížení OTA, je využití fenolových sloučenin. V roce 2009 napsali Romero a kolektiv článek, v němž byl zkoumán vliv přírodně se vyskytujících fenolových sloučenin (sekundární metabolity rostlin) na růst Aspergillus carbonarius a produkci ochratoxinu A. Kyselina kávová a flavonoidy, rutin a kvercetin, byly přidány do agaru Czapekova kvasnicového extraktu v koncentraci mezi 50 a 500 mg/l. OTA byl určován po 7 dní a pak opakovaně třikrát, po 14, 21 a 28 dnech inkubace v každé fenolové sloučenině a v každé 30
zkoumané koncentraci. Účinek fenolových sloučenin na rychlost růstu, dobu po očkování a koncentraci OTA byl vyhodnocován pomocí analýzy shody (ANOVA) (statistická metoda). Při zvýšení koncentrace fenolových sloučenin, byl ve všech případech zaznamenán inhibiční účinek na růst a produkci OTA.
Graf 1a. Účinek různých koncentrací (mg/l) kyseliny kávové na růst (Romero et al., 2009)
Graf 1b. Účinek různých koncentrací (mg/l) kyseliny kávové produkci OTA plísní Aspergillus carbonarius (Romero et al., 2009) Účinek kyseliny kávové na růst A. carbonarius a produkci OTA byl vyhodnocen v rozmezí koncentrací 0 až 500 mg/l (Graf. 1). Statistická analýza shody (ANOVA) ukázala, že kyselina kávová má významný vliv na rychlost růstu a dobu po očkování (p<0.0001). Růst A. carbonarius byl zcela potlačen při 500 mg/l (graf 31
1a). Produkce OTA byla určována týdně po dobu 28 dní. Analýza shody ukázala významný účinek koncentrace kyseliny kávové a inkubační doby na produkci OTA (p<0.01). Značná redukce produkce OTA byla pozorována za přítomnosti kyseliny kávové v množství 250mg/l (graf 1b) ve srovnání se zkouškou. Mykotoxinová produkce poklesla na 63 a 60 % za 21 a 28 dní inkubace, respektive za přítomnosti 250 mg/l kyseliny fenolové. Při užití 50 mg/l byly pozorovány nevýznamné rozdíly.
32
Graf 2a, 2 b, 2c, 2d, 2e, 2f: Účinek různých koncentrací (mg/l) rutinu (a, c, e) a kvercetinu (b, d, f) na rychlost růstu plísně Aspergillus carbonarius, dobu po očkování média (Romero et al., 2009) Účinek flavonoidů, rutinu a kvercetinu, na růst A. carbonarius byl studován při koncentracích 50, 250, a 500 mg/l (Graf 2). Statistické zpracování dat metodou ANOVA ukázalo, že flavonoidy mají významný vliv na rychlost růstu a dobu po očkování média (p<0.0001). V grafu 2a, b lze vidět, že účinek obou fenolových sloučenin na rychlost růstu A. carbonarius byl podobný. Statisticky nevýznamné rozdíly byly pozorovány ve srovnání při zkoušce za přítomnosti 50 mg/l. Růst A. carbonarius byl zcela potlačen za přítomnosti 500 mg/l obou flavonoidů. Účinek na dobu po očkování byl pozorován při 250 mg/l, silněji byl ovlivněn zejména kvercetinem (graf 2c, d). Grafy 2e, f ukazují produkci OTA A. carbonarius během období 28 dní za přítomnosti rutinu a kvercetinu. Metoda ANOVA ukázala, že různé koncentrace a inkubační doba mají významný vliv na biosyntézu OTA (p<0.0001). Významný inhibiční účinek těchto flavoidních koncentrací na produkci OTA byl pozorován při množství 250 mg/l ve všech inkubačních dobách (graf 2e, f). Výsledky této současné studie potvrdily inhibiční účinek fenolových sloučenin (flavoidních a neflavoidních) na růst A. carbonarius a produkci OTA. Inhibiční účinek těchto přírodních fenolových sloučenin na růst plísní a produkce OTA by mohl být alternativou užívání chemických fungicidů. Ještě však nebyly zjištěny mechanismy, při kterých tyto sloučeniny mohou potlačit rozvoj mykotoxinů. Fenolové sloučeniny, které jsou účinnými antioxidanty a požírači volných radikálů, by mohly odvracet oxidační stres, který spouští a posiluje produkci toxinů plísněmi. Fenolové sloučeniny se nalézající v podstatě v každém rostlinném materiálu, poskytují akceptovatelný zdroj přirozených antimikrobiálních látek v prevenci kontaminace mykotoxiny v období před i po sklizni. Úspěšné využití inhibičního účinku fenolových sloučenin na růst plísní a na vytváření ochratoxinu A jak v této studii, tak i přirozený výskyt těchto sloučenin, poukazuje na možnosti jejich využití jako rostlinných fungicidů, zejména proti růstu ochratoxinových Aspergilli (Romero et al., 2009). Tento článek jsem si vybrala, protože mi přišel zajímavý z pohledu využití rostlinných metabolitů, jako přírodních fungicidů. Přesto, že zde uvádím statistickou 33
metodu ANOVA, předmět statistika jsme na VŠ ještě neměli. Tudíž mě můj vedoucí práce alespoň obecně se statistikou seznámil. A jelikož jsem článek měla již přeložený, některé údaje jsem použila. Závěrem této kapitoly lze podotknout, že pokud nechceme své tělo zatěžovat dávkami ochratoxinů a mykotoxinů, tak potraviny, které se rozhodneme koupit, by měly být známého původu. U potravin importovaných (káva, kakaové boby, sója) je důležitá kontrola země odkud potravina pochází. Dalším opatřením je nákup čerstvých výrobků, tedy s neprošlým datem minimální trvanlivosti či spotřební dobou. Potraviny, které jsou plesnivé, nebo jeví tyto známky, nekupovat a pokud se projeví plíseň u potravin, které máme již doma, je na místě takovéto potraviny vyhodit (Nedělník J., 2004). Pokud se budeme řídit těmito radami, otázkou eliminace ochratoxinů se nemusíme zabývat.
3.7 OTA a systém rychlého varování pro potraviny a krmiva Tento systém se zkratkou RASFF (Rapid Alert System for Food and Feed) slouží od roku 2002 k ohlašování rizikových potravin a krmiv za účelem zamezení jejich uvádění do oběhu. Uplatňuje se také na společném evropském trhu, kde při výskytu rizikových potravin a krmiv dochází k jejich stažení. Systém RASFF zasílá oznámení, pro něž platí základní kritérium a to jest poznatek, že daný výrobek představuje přímé nebo nepřímé riziko pro zdraví a bezpečnost spotřebitele. Pokud je v potravině nalezen OTA, musí být překročen limit, které je stanovený v platném Nařízení Komise (ES) č. 1126/2007 (Malíř, Ostrý, 2007). RASFF je vzájemně propojenou sítí, která spojuje členské země EU s Evropskou komisí a Evropským úřadem pro bezpečnost potravin (ESFA). V každé členské zemi EU existuje národní kontaktní místo, které soustřeďuje informace ze všech dozorových orgánů nad potravinami a krmivy v příslušné zemi (Kvasničková, 2009). V systému RASFF se uplatňují tři kategorie oznámení: varování (Alert notification), informace (Information notification) a novinka (News). U varování se jedná o zachycení OTA v potravinách vyskytujících se na trhu a je nutné okamžitě zajistit návazné kroky v souladu s právními předpisy a závaznými normami. V tabulce č. 6 je uveden příklad oznámení u této kategorie. Následující kategorie - informace, udává zachycení OTA v potravinách, které byly zadrženy na hranicích, v celním skladu, před proclením nebo došlo k záchytu 34
potravin náhodně. V posledním případě je nutné zabránit k vyvezení těchto potravin do jiného členského státu EU. Jako novinka je označován druh informací vztahujících se k bezpečnosti potravin, které nebyly klasifikovány jako varování nebo informace, ale jsou považovány za důležité pro dozorové orgány členských států (Malíř, Ostrý, 2007). Tab. 6 Oznámení členských států EU hlášená v RASFF v roce 2006 v 1. - 42. Týdnu (Kvasničková, 2006) Datum
Oznámeno z
Důvod oznámení
Země původu
14. 2. 2006
SRN
OTA v pohance
Litva
27. 2. 2006
Itálie
OTA v tvrdé pšenici
Kanada
22. 3. 2006
Holandsko
OTA v mleté červené paprice
Španělsko
23. 3. 2006
UK
OTA v mletém hřebíčku
Komorské ostrovy cestou Holandska
12. 4. 2006
Slovensko
OTA v instantní kávě
Slovensko, ČR
12. 4. 2006
ČR
OTA v rozinkách
Uzbekistán
11. 5. 2006
Maďarsko
OTA v paprice
Španělsko cestou Maďarska
24. 5. 2006
ČR
OTA v instantní kávě
Brazílie
24. 5. 2006
ČR
OTA v instantní kávě
Brazílie
15. 6. 2006
Dánsko
OTA v celozrnné žitné mouce
Dánsko
21. 6. 2006
Dánsko
OTA v žitné mouce
Dánsko
22. 6. 2006
Dánsko
OTA v žitě a žitné mouce
Dánsko
23. 6. 2006
ČR
OTA v rozinkách
Afganistán
29. 6. 2006
Dánsko
OTA v celých zrnech
Dánsko
v žitných výrobcích 17. 10. 2006 Belgie
OTA v pšeničném lepku
Belgie
Aktualizované, ale i starší hlášení ze systému RASFF nalezneme na stránkách www.bezpecnostpotravin.cz. Mimo OTA jsou zde uvedeny i další mykotoxiny. Ve velkém množství se v systému RASFF objevují aflatoxiny. Aflatoxiny jsou nejčastěji nalezeny v pistáciových oříšcích a společně s OTA jsou považovány za nejnebezpečnější mykotoxiny. 35
ZÁVĚR V závěru této bakalářské práce je důležité zhodnotit, jestli byl splněn cíl práce vymezený na jejím začátku. Literární rešerše byla díky důvěryhodným zdrojům vypracována. Hlavní kladené otázky byly zodpovězeny. Co jsou mykotoxiny? Jací zástupci patří do této skupiny? Jak se testuje toxicita mykotoxinů? V jakých potravinách se mykotoxiny vyskytují? Co jsou to ochratoxiny? Hlavní producenti těchto ochratoxinů? Jaké toxické účinky mohou ochratoxiny způsobit? V jakých potravinách se ochratoxiny vyskytují? Jaká jsou legislativní omezení ochratoxinů v potravinách? Závěry jednotlivých kapitol jsou vyhodnoceny na jejich koncích. Mezi zajímavé závěry, patřil například ten, že u OTA dochází k rozsáhlému přenosu z krmiva do živočišných tkání, ale týká se to pouze monogastrů (prasata, drůbež), protože u skotu dochází k rozsáhlé degradaci OTA v předžaludku. Také mě zaujala kapitola o nefropatii a skutečnost, že je rozšířena v určitých částech světa, přesněji v oblastech podél řeky Dunaje, v některých částech Bulharska, Rumunska, v zemích bývalé Jugoslávie a nazýváme ji Balkánskou endemickou nefropatií. Dále mě zaujalo zjištění, že můžeme využít inhibičního účinku fenolových sloučenin na růst plísní a na vytváření ochratoxinu A. Přirozený výskyt fenolových sloučenin poukazuje na možnosti jejich využití jako rostlinných fungicidů, zejména proti růstu ochratoxinových Aspergilli. Přínosů vypracování této bakalářské práce bylo mnoho. Mezi největší patří ten, že jsem se dozvěděla velmi zajímavé a důležité informace o ochratoxinech. Také jsem poprvé pracovala s odbornou anglickou literaturou, která je dostupná na databázích. Na těchto databázích se články o ochratoxinech vyskytují ve velkém počtu a jsou pravidelně aktualizovány.
36
PŘEHLED POUŢITÉ LITERATURY 1. Adensam L., Lebedová M., 1993, Stanovení ochratoxinu A v zelené kávě, Národní referenční laboratoř mykotoxinů v ČR, Plzeň, 210- 211 s.
2. Bayman P.,Baker J., 2006, Ochratoxins: A global perspective, Mycopathologia 162: 215–223 s. 3. Čajdová J., Dostál A., 2008, Prvé výsledky analýzy ochratoxínu A v materskom mlieku na Slovensku, School and Health 21, 3/2008, 263- 266s.
4. Duarte S. C, Pena A., Lino C. M., 2010, A review on ochratoxin A occurrence and effects of processing of cereal and cereal derived food products, Food Microbiology 27, 187- 198 s.
5. Frisvad JC, Frank JM, Houbraken J, Kuijpers AFA., 2004, New ochratoxin producing species of Aspergillus section Circumdati. Stud Mycol 2004; 50: 23– 43.(citují Bayman P.,Baker J., 2006, Ochratoxins: A global perspective, Mycopathologia 162: 215–223 s).
6. Giray B., Atasayar S. a Sahin G., 2009, Determination of ochratoxin A and total aflatoxin levels in corn samples from Turkey by enzyme-linked immunosorbent assay, Mycotoxin Research, 113- 116 s. 7. Hajšlová J., Zachariášová M., Malachová A., Kostelanská M., Kocourek V., 2009, Mykotoxiny, datum návštěvy 7. 4. 2010, dostupné na: http: //www.phytosanitary.org
8. JECFA, 2007, Summary and conclusions of the sixty- eighth meeting of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives, 1- 18 s, datum návštěvy: 17. 4.2010, dostupné http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/summaries/summary68.pdf
37
9. Komprda T., 2004, Látky vznikající mikrobiální činností, s. 23-28. In: Komprda T., Obecná hygiena potravin, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 148 s. 10. Komprda T., 2009, Srovnání jakosti a zdravotní nezávadnosti biopotravin a konvenčních potravin, Chemické Listy 103, 729- 732 s. 11. Kroes R., Galli C., Munro I., Schilter B., Tran L.-A., Walker R. a Würtzen G.,
2000, Food and Chemical Toxicology Threshold of Toxicological Concern of Chemical Substances Present in the Diet: A Practical Tool for Assessing the Need for Toxicity Testing, 255-312 s. 12. Kvasničková A., 2006, Hlášení v systému RASSF v 1. – 42. týdnu roku 2006, datum návštěvy: 15. 5. 2009, dostupné na: www.bezpecnostpotravin.cz
13. Luchese R. H., Paulino De Moraes M. H., 2003, Ochratoxin A on Green Coffee: Influence of Harvest and Drying Processing Procedures, Agricultural and Food Chemistry 51, 5824- 5828 s. 14. Malíř F., Ostrý V., Černá M., Kačerovský J., Roubal T., Škarková J., Brndiar M., Fixa P., 2004, Stav sledování významných biomarkerů mykotoxinů u populace v ČR, Časopis lékařů českých 143, 2004, 691- 696 s., datum návštěvy: 25.2.2010, dostupné na: http://www.prolekare.cz. 15. Malíř F., Ostrý V., 2007, Informace vědeckého výboru pro potraviny ve věci: Ochratoxin A v potravinách, datum návštěvy 16. 2. 2009, dostupné na http://www.chpr.szu.cz/vedvybor/vvp.htm. 16. Malíř F., Roubal T., 2009, Co jsou mykotoxiny a proč se sledují, 12. 4. 2010, dostupné na http://www.zupu.cz/index.php?pid=268
38
17. Nedělník J., 2004, Aktuální stav mykotoxinové kontaminace potravin a produktů rostlinného původu v Evropě v letech 2003- 2004 a komparace hygienických limitů, datum návštěvy 16. 2. 2009, dostupné na: http: //www.phytosanitary.org 18. Ostrý V., 2005, Informace vědeckého výboru pro potraviny ve věci: Výskyt mykotxinů ochratoxinu A ve víně, datum návštěvy 2. 2. 2010, dostupné na http://www.chpr.szu.cz/vedvybor/vvp.htm. 19. Peraica M., Domijan A., Miletic´-Medved M. a Fuchs R., 2008, The involvement of mycotoxins in the development of endemic nephropathy ,Wiener Klinische Wochenschrift 120/13–14, 402–407 s.
20. Romero M. S., Alberto M. R., Manca de Nadra M. C. a Vaamonde G., 2009, Inhibition of growth and ochratoxin A biosynthesis in Aspergillus carbonarius by flavonoid and nonflavonoid compounds , Mycotoxin Research and Springer 25, 165–170 s.
21. Sage L., Garon D., Seigle- Murandi F., 2004, Fungal Microflora and Ochratoxin A Risk in French Vineyards, Agricultural and Food Chemistry 52, 5764- 5768 s.
22. Setiogi S., Cohen S., 2009, More than 30 new food safety standards adopted, datum návštěvy,17. 4. 2001,dostupné na: http://www.who.int/mediacentre/news/releases/2009/food_standards_20090706/en/ 23. Stiborová M., Patočka J., Frei E., Schmieser H. H., 2005, Biochemické a toxikologické aspekty etiologie Balkánské endemické nefropatie, Chemické listy 99, 782- 788 s. 24. Šimůnek J., 2003, Mykotoxiny, 12. 4. 2010, dostupné na- http:// www. med. muni.cz/prelek/MYKOTW/mtanabi.htm 25. Velíšek J., 2002, Toxiny mikroorganismů, s. 205- 208, Ochratoxiny, s. 211- 212. In: Velíšek J., Chemie potravin 3, OSSIS, Tábor, 368 s. 39
Legislativa: Nařízení komise (EU) č.105/ 2010 ze dne 5. 2. 2010 Internetové zdroje: http://slovnik-cizich-slov.abz.cz http://lekarské.slovniky.cz http://www.bezpecnostpotravin.cz http://www.mze.cz http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Ochratoxin_A.svg, 2007 http://www.coffee-ota.org/photo1_7.htm http://www.doctorfungus.org/imageban/images/Dsutton_05feb/A_niger_1.jpg http://www.univ-brest.fr/esmisab/sitesc/Myco/fiches/Pvirid.htm
40
