MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
BRNO 2011
IVETA ŠOLCOVÁ
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav technologie potravin
Izolace vybraných skupin enzymů při kultivacích v laboratorním fermentoru Bakalářská práce
Vedoucí práce: Ing.Tomáš Gregor, Ph. D.
Vypracovala: Iveta Šolcová
Brno 2011
PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma „Izolace vybraných skupin enzymů při kultivacích v laboratorním fermentoru“ vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkanátem Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.
dne…………………………………… podpis bakaláře……………………….
PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala Ing.Tomáš Gregor, Ph. D. za odborné vedení mé bakalářské práce.
ABSTRAKT
Bakalářská práce je zaměřena na izolaci enzymů při kultivaci v laboratorním fermentoru. V literární rešerši se popisují možnosti využití enzymů v potravinářském průmyslu. Dále jsou zde rozděleny jednotlivé kultivační techniky a využití fermentorů. Tato práce obsahuje také jednotlivé metody pro izolaci a čištění enzymů. Poslední část se zabývá konkrétní izolací enzymů.
KLÍČOVÁ SLOVA: izolace, kultivace, enzymy, laboratorní fermentor
ABSTRACT The thesis is focused on the isolation of enzymes in cultivation in the laboratory fermenter. The literature search describes the possibility of using enzymes in the food industry. There are also divided into different cultivation techniques and the use of fermenters. This work also includes various methods for isolation and purification of enzymes. The last part deals with the cultivation and isolation of enzymes.
KEYWORDS: isolation, cultivation, enzymes, laboratory fermenter
1 ÚVOD............................................................................................................................ 8 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED ............................................................................................ 9 2.1 Enzymy .................................................................................................................. 9 2.1.1 Co jsou enzymy ............................................................................................... 9 2.1.2 Názvosloví ....................................................................................................... 9 2.1.3 Rozdělení skupin: ............................................................................................ 9 2.1.4 Zdroje enzymů ............................................................................................... 10 2.1.5 Využití enzymů v potravinářství.................................................................... 11 2.1.5.1 Oxidoreduktasy....................................................................................... 11 2.1.5.2 Hydrolasy................................................................................................ 12 2.1.5.3 Esterasy................................................................................................... 14 2.1.5.4 Isomerasy ................................................................................................ 15 2.2 Kultivace .............................................................................................................. 15 2.2.1 Kultivační techniky........................................................................................ 15 2.2.1.1 Povrchová kultivace.................................................................................... 15 2.2.1.2 Submerzní kultivace ............................................................................... 15 2.2.2 Kultivace extremofilních mikroorganismů .................................................... 16 2.3 Bioreaktory, fermentory .................................................................................... 17 2.3.1 Rozdělení ....................................................................................................... 17 2.3.2 Typy bioreaktoru podle způsobu provozu ..................................................... 18 2.3.2.1 Vsádkový fermentor ............................................................................... 18 2.3.2.2 Kontinuální fermentor............................................................................. 18 2.3.2.3 Fermentace s řízeným nástřikem (fed-batch).......................................... 19 2.4 Bioreaktory 2. generace...................................................................................... 19 2.4.1 Imobilizace enzymů....................................................................................... 19 2.4.1.1 Fyzikální adsorpce na inertním nosiči .................................................... 19 2.4.1.2 Okluze enzymů ....................................................................................... 19 2.4.1.3 Uzavření do mikroschránek .................................................................... 20 2.4.1.4 Zasíťované molekuly .............................................................................. 20 2.4.1.5 Kovalentní vazba mezi enzymem a matricí ............................................ 20 2.4.2 Membránové bioreaktory............................................................................... 20 2.4.3 Sterilizace....................................................................................................... 20 2.4.3.1 Sterilizace bioreaktoru ............................................................................ 20 2.4.3.2 Sterilizace média..................................................................................... 21 2.4.4 Míchání .......................................................................................................... 21 2.4.5 Odpěňování .................................................................................................... 21 2.4.6 Laboratorní fermentor.................................................................................... 21 2.5 Izolace a purifikace............................................................................................. 22 2.5.1 Srážení (precipitace) ...................................................................................... 23 2.5.2 Membránové separační metody ..................................................................... 23 2.5.3 Chromatografické metody ............................................................................. 23 2.5.3.1 Gelová chromatografie ........................................................................... 25 2.5.3.2 Iontově výměnná chromatografie ........................................................... 25 2.5.3.3 Afinitní chromatografie .......................................................................... 26 2.5.4 Elektromigrační techniky............................................................................... 27 2.5.4.1 Elektroforéza........................................................................................... 27 2.5.4.2 Izoelektrická fokusace (frakcionace) ...................................................... 28 2.5.5 Stabilizace enzymů ........................................................................................ 29 3 KONKRÉTNÍ IZOLACE ......................................................................................... 30
3.1 Separace a čištění keratinázy jako pesticid proti háďátku Melnidogyne inkognita .................................................................................................................................... 30 3.2 Izolace tolerantní proteázy z Aspergillus oryzae pro výrobu sojové omáčky ...... 30 3.3 Čištění a charakterizace xylanázy získanou z Chaetomium thermophile NIBGE 32 4 ZÁVĚR ....................................................................................................................... 36 5 POUŽITÁ LITERATURA........................................................................................ 37 5.1 Seznam tabulek ..................................................................................................... 40 5.2 Seznam obrázků a grafů........................................................................................ 40 5.3 Seznam symbolů a zkratek ................................................................................... 40
1 ÚVOD Nejstarší využití enzymové katalýzy spočívá v použití živých mikroorganismů. Používání enzymových procesů pomocí mikroorganismů k výrobě potravin a nápojů je staré několik tisíc let. Ve velkovýrobě byly enzymy v izolované formě, použity v roce 1890, kdy byla zvyšována rychlost hydrolysy škrobu přídavkem extraktu z plísní. K širokému zavádění do průmyslu dochází po 2. světové válce. Z celosvětového hlediska je asi 25-30 % produkce enzymů spotřebováno v rámci potravinářského průmyslu. Vyráběné enzymové preparáty se liší podle použití, aktivity, formy (granulované, práškovité, tekuté), stability a podle finální úpravy. Izolace enzymů je nákladná a cena enzymu musí být v souladu s charakterem jeho aplikace. Čisté enzymové preparáty jsou drahé, a proto se používají preparáty nižší čistoty, často kontaminované dalšími enzymovými aktivitami. Pro řadu aplikací je výhodné, použití kontaminující enzymové aktivity, které v dobrém poměru působí příznivě. (Vodrážka, Rauch, Káš, 1998) Pro přípravu čistých enzymů se využívá chromatografie (HPLC), preparativní elektromigrační techniky, bioafinitní chromatografie. Výchozím materiálem jsou rostliny, živočišné tkáně a mikrobiální zdroje. Široké spektrum mikrobů umožňuje najít druh, který obsahuje podobný enzym se stejnými vlastnostmi jako enzym z rostlinných nebo živočišných produktů. Enzymy jsou obecně citlivé na teploty, pH, atd. Denaturují a ztrácejí tak aktivitu, proto je musíme skladovat a pracovat s nimi za co nejšetrnějších podmínek. (Zehnálek, 1996)
Fermentačních technologií lze rozdělit do pěti období. První trvalo od starověku do roku 1886, tj. do období Pasteurových objevů, které postavili kvasnou technologii na přesném základu. Druhé období (1886-1940) otevřelo možnost výroby čistých biotechnologických produktů – etanolu, butanolu, citronové kyseliny aj. Třetí období (1940-1960) bylo érou antibiotik. Průmyslové procesy včetně izolace a purifikace produktů byly zaváděny na vysokém technickém a technologickém stupni. Čtvrté období (1960-1975) přineslo kultivaci buněk in vitro, přípravu vakcín, krmných mikrobiálních bílkovin, čistých aminokyselin, technických enzymů a bakteriálních polysacharidů. Páté období (po roce 1975) vzchází z převratných objevů molekulární biologie a genetiky. (Kadlec a kol, 2009)
8
2 LITERÁRNÍ PŘEHLED 2.1 Enzymy 2.1.1 Co jsou enzymy Enzymy jsou organické, vysokomolekulární katalyzátory bílkovinné povahy, které probíhají v živých organismech. Některé enzymy potřebují ke své aktivitě polypeptidový řetězec, jiné vyžadují nebílkovinnou složku tzv. kofaktor. (Mikušová, Kollárová, 2008)
Funkce kofaktoru spočívá v přenášení skupin jednotlivých atomů a elektronů. Je-li pevně vázána na bílkovinnou složku enzymu, můžeme jej nazývat prosthetická skupina. Někdy je vázán kofaktor s bílkovinnou složkou jen slabě a může se lehce oddělovat, takový kofaktor pak nazýváme koenzym. (Vodrážka, Rauch, Káš, 1998)
Enzymy fungují tak, že snižují aktivační energii chemických reakcí. Umožní tak, aby reakce v buňce proběhly bez vnitřního poškození prostředí. Enzymy obsahují ve své molekule aktivní místo, na které se specificky váže substrát enzymem katalyzované chemické reakce. Aktivní místo obsahuje aminokyseliny s pozitivně či negativně nabitými skupinami. (Votava, 2001) Enzymy v mnoha směrech převyšují umělé katalyzátory. •
Mají vyšší reakční rychlost
•
Pracují za mírných podmínek
•
Mají vyšší specifitu reakce
•
Snadnější regulace a netoxičnost (Klejdus, 2009)
2.1.2 Názvosloví Enzymy jsou rozděleny do skupin na základě typu reakce, kterou katalyzují. 2.1.3 Rozdělení skupin: 1. oxidoreduktázy: katalyzují přenos elektronů 2. transferázy: katalyzují přenos skupin (amino-, acyl-, methyl-, glykosyl-, fosforyl-, kinasy) Uplatňují se spíše v nepotravinářské sféře.
9
3. hydrolázy: katalyzují hydrolytické reakce 4. lyázy: katalyzují adiční reakci na dvojné vazbě nebo eliminační reakci mezi dvěma C atomy za vzniku dvojné vazby
5. izomerázy: katalyzují optické izomery nebo vytvářejí polohové izomery. 6. ligázy: katalyzují tvorbu vazeb mezi uhlíkem a jinými atomy spojené se štěpením ATP (Mikušová, Kollárová, 2008, Klejdus 2009) 2.1.4 Zdroje enzymů Biologickými zdroji enzymů jsou: •
Rostlinná pletiva
•
Živočišné tkáně a orgány
•
Mikroorganismy
•
Tělní tekutiny
Enzymy produkované mikroorganismy zastupují 90 % produkce enzymových preparátů. Jejich výhodou je možnost získat velké množství za krátkou dobu při tepelné stabilitě. Další výhodou je možnost produkovat rekombinační enzymy ale i upravené metodami genového nebo proteinového inženýrství. Mikrobiální technické enzymové preparáty jsou produkovány ve formě zahuštěných médii nebo jako celé buňky nebo hrubě přečištěné extrakty z buněk. Enzymy produkované kulturami mikroorganismů mohou být intracelulární nebo extracelulární, které se lépe izolují, protože není třeba rozrušovat buněčné stěny. (Kadlec, Voldřich, Mezloch a kol, 2009. Molík 1988)
Rostlinné enzymy zahrnují preparáty papinu, bomelainu, ficinu, amylolytické enzymy cereálií, sojovou lipooxygenazu a speciální enzymy z citrusových plodů.
Z živočišných se používají hlavně pankrolytické lipasy a proteasy, pepsin a syřidla. Tyto preparáty jsou mnohem nákladnější, protože doba produkce je nepoměrně delší než z mikrobiálních a rostlinných zdrojů.
10
Hydrolasy zaujímají 80 % průmyslové vyráběných enzymů, 40 % proteasy, glykosidasy pak představují druhou největší skupinu technických enzymů. (Vodrážka, Rauch, Káš, 1998)
2.1.5 Využití enzymů v potravinářství Enzymy se aplikují při senzorické úpravě potravin např. (celkový vzhled, barva, vůně, konzistence). Můžeme je přidávat pro zlepšení výtěžnosti surovin, pro zlepšení nekvalitní suroviny nebo jako konzervační prostředek. Také se používají pro výrobu speciálních potravin (instantní potraviny, dětské výživy). Aplikují se také pro enzymové zpravovaní škrobu, enzymovou hydrolýzu laktosy a bílkovin. (Káš, 1988)
2.1.5.1 Oxidoreduktasy •
Glukosaoxidasa
V přítomnosti kyslíku katalyzuje oxidaci β-D-glukosy na δ-D-glukonolakton. Je to mikrobiální enzym (Penicilin notatum, P. amagaskiense, Aspergillus oryzae aj.) Glukosaoxidasa je využívána tam, kde je třeba: odstranit glukosu, odstranit kyslík a připravit kyselinu glukonovou atd. V potravinářských
výrobách
je
nežádoucí
neenzymové
hnědnutí.
Průběh
Maillardovy reakce lze vyloučit eliminací jednoho z reaktantů. Při nízkých koncentracích glukosy se toho nejlépe dosáhne aplikací glukosaoxidasy. Stejná aplikace je i u výroby sušených vajec, vaječných žloutků (Při výrobě sušených vaječných žloutků je třeba snížit obsah glukosy na 0,1 %) nebo dehydratovaných brambor. Odstranění kyslíku se také provádí u piva, ovocných šťáv, vín atd.
Někdy je třeba odstranit reziduální kyslík, který způsobuje senzorické závady. Glukosaoxidasa je v kombinaci s katalasou dobrá k ochraně tuků před oxidací. Aplikace glukosa-katalásového systému se uplatnila u zvýšení stability emulzí (majonéz, stabilizaci džusů a bílých vín). Nebo byl také použit k zachování růžové barvy u krevet. Tvorba kyseliny glukonové při reakci katalyzované glukosaoxidasou může být užita k úpravě pH, chuti, snížení energetického obsahu potraviny i k vlastní výrobě kyseliny glukonové. (Vodrážka, Rauch, Káš, 1998, Káš, 1988)
11
•
Katalasa a peroxidasa
Katalasa štěpí peroxid vodíku na vodu a kyslík. Katalasy jsou vyráběny z hovězích jater a mikroorganismů (bakteriální z Micococcus lysodeikticus a plísňová z Aspergillus niger). Peroxidása
je
připravena
z křenu,
mléka
(laktoperoxidasa)
a
myelocytů
(myeloperoxidasa) tj. buněk hladkého svalstva (střeva, vnitřní orgány). Katalasa a peroxidáza jsou používané jako indikátorové enzymy blanšírování v konzervárenském průmyslu. (Vodrážka, Rauch, Káš, 1998) •
Lipoxygenasa
Vyskytuje se hlavně v sojových bobech, zeleném hrášku a kořenové zelenině. Katalyzuje peroxidaci nenasycených mastných kyselin. Vhodná pro korekci vůně u potravin. V pekárenství se používá sójová lipoxygenasa pro lepšení barvu střídy, ovlivnění aromatu a chuti výrobku. (Vodrážka, Rauch, Káš, 1998, Příhoda, Humpolíková, Novotná, 2003)
2.1.5.2 Hydrolasy Proteasy •
Živočišné proteasy
Chymozin je aspartamového typu a získává se ze žaludků sajících telat. Je termolabilní a v oblasti pH citlivý na autodigesci. Jeho použití je při výrobě sýřeniny pro sýrařský průmysl. Chymozin se může nahrazovat mikrobiálními enzymy.
Pepsin Izoluje se z vepřové nebo hovězí žaludeční mukosy. Optimální pH pro stabilitu enzymu je 5-5,5. Používá se k úpravě potravin (dětská výživa, instantní cereálie), k prevenci chladového zákalu nebo při výrobě sýrů.
Trypsin a chymotrypsin Jsou to serinové proteasy a jsou izolovány z hovězího pankreatu. Používají se při hydrolýze bílkovin. 12
•
Rostlinné proteasy
Používají se zejména k odstranění chladových zákalů piva.
Papain Jako papainový preparát je užíván sušený latex z papájových plodů (Carica papaya). Je stabilní kolem pH 5. Používá se jako enzymový stabilizátor piva nebo u tenderizace masa. Většinou se aplikuje po porážce tuhých částí porcovaného masa. Aplikace před tepelnou úpravou umožňuje zkrácení doby tepelné úpravy.
Ficin je sušený latex z rostlin rodu Ficus, používán ke stabilizaci piva. •
Plísňové proteasy
Používají se hlavně v pekárenském průmyslu, protože dobře ovlivňují vlastnosti těsta. Dále jsou používány v mlékárenském průmyslu a při odstraňováni masa z kostí. Používá se zejména A. oryzae nebo neutrální proteasa B. amyloliquefaciens. Jako náhradu živočišných syřidel můžeme použít mikrobiální. Hlavními producenti jsou Mucor mihei, Mucor rouxii, Mucor pusillus, Endothia parasitka. (Vodrážka, Rauch, Káš, 1998)
Glykosidasy •
Amylasy
Hydrolyzují škrob, glykogen a další polysacharidy, v nichž se vyskytují α-1,4glukosidové vazby. Nejčastějším zdrojem α-amylasy je sladová moučka z ječmene, dalším je také plíseň Aspergillus oryzae nebo bakterie Bacillus subtilit. β-amylasy jsou enzymy z rostlinných enzymů. Jsou i izolovány z mikrobiálních zdrojů kmenů Bacillus, Pseudomonas a Streptomyces.
Bakteriální amylasy se používají v kombinaci s jinými enzymy a s hydrolysou kyselin při zpracování škrobu na glukózu a maltosové sirupy. Dále nahrazují slad při výrobě piva, alkoholických nápojů a lihu. Funkce amylas je v pekařské technologii
13
využívaná pro zlepšení objemu, zpomalení stárnutí výrobku, ke zlepšení barvy a textury u střídy. •
Glukoamylasa
Je používána také na výrobu škrobových sirupů. Plísňová glukoamylasa je použita při výrobě piva k odbourávání zbytkových dexrinů ve sladině, což zvyšuje prokvašení. •
Invertasa
Hydrolyzuje glykosidickou vazbu sacharosy na straně fruktosy a uvolňuje α-Dglukosu. Technické preparáty se připravují z kvasinek. Je používána při výrobě invertního cukru. Použitím invertního cukru se zabrání krystalizaci. Dále slouží ke ztekucení náplní čokoládových bonbonů. •
β-Galaktosidasa
Hydrolyzuje laktosu na glukosu a galaktosu pro výrobu nelaktosového mléka, zabránění krystalizace u mléčných výrobků.
Celulasy Průmyslový význam mají pouze mikrobiální celulasy. Jsou vyráběné hlavně z Trichoderma viride a Aspergillus niger. Aplikují se při instantizaci produktů jako je káva či čaj, při úpravě konzistence hub a zeleniny. (Vodrážka, Rauch, Káš, 1998, Příhoda, Humpolíková, Novotná, 2003)
2.1.5.3 Esterasy •
Lipasy
Získávají se z rodu Aspergillus, Mucor, Rhizopus. Ovlivňují chuť a vůni potravin, zrání čokolády, prodlužováni trvanlivosti pečiva. Používá se pro enzymovou transesterifikaci. •
Pektolytické enzymy
Hlavní aplikací pektináz je čiření zákalů např. ovocných moštů. (Káš, 1988)
14
2.1.5.4 Isomerasy Významným zástupcem je glukosaoisomeráza, která je produkována rodem Streptomyces. Převádí glukosu na fruktosu, která je sladší než glukosa, nekrystalizuje a je také vhodná z dietetického hlediska. (Šilhánová, 1995)
2.2 Kultivace Kultivace je proces, při kterém mikroorganismy spotřebovávají pevný nebo kapalný substrát, rostou a přeměňují ho na produkt. Cílem kultivace je produkce s nejvyšší rychlostí, největšího množství a s nejméně nákladnou cestou. Faktory ovlivňující kultivaci: složení média, stav inokula, kultivační podmínky (teplota, pH, aerace, míchání, způsob živení), uspořádaní procesu (vsádkový, přítokový, kontinuální). (Anonym 2, Sylabus k předmětu kultivační techniky, VSCHT)
2.2.1 Kultivační techniky •
Povrchová
•
Submerzní 1) diskontinuální: mohou být vsádková nebo přítoková
(tuhé nebo tekuté médium)
2) kontinuální
2.2.1.1 Povrchová kultivace Mikroorganismy jsou kultivovány na povrchu kapalného nebo pevného media. Pro průmyslové účely je nevhodná. Mikroby rostou v plochých nádobách umístěných nad sebou v kontejnerech.
2.2.1.2 Submerzní kultivace Při této kultivaci mikroorganismy rostou v kapalném médiu (popř. i s nízkým zastoupením pevné fáze). Buňky jsou udržovány v kultivačních nádobách (bioreaktorech) mícháním. Submerzní technikou se provádí všechny významné průmyslové procesy.
1. Diskontinuální procesy mohou probíhat při konstantním objemu média (vsádkové způsoby) nebo při proměnlivém objemu (přítokové způsoby).
15
a) Vsádková - bioreaktor se naplní a zaočkuje mikrobiální kulturou. Buňky se množí a spotřebovávají médium. Po určité době se namnožená kultura zpracuje. (Vodrážka, 1996; Kadlec a kol, 2009)
Výhody a nevýhody vsádkové kultivace •
Jednodušší zařízení
•
Menší nebezpečí kontaminace
•
Snadná změna různých vsádek
•
Snadné oddělení fáze růstu a produkce
•
Časové ztráty- vyprazdňování, čištění, napouštění, sterilizace
•
Neproduktivní lag fáze
b) Přítoková kultivace Během kultivace se jeden nebo více živin dodává do reaktoru. Produkt zůstává v reaktoru, médium se neodvádí. (Anonym 2, Sylabus k předmětu kultivační techniky, VSCHT)
2. Kontinuální kultivace jsou charakterizovány neustálým přívodem média. Výhodou je vysoká produktivita systému. Typy kontinuálních kultivací •
chemostat
•
turbidistat
•
auxostat
(Kadlec, Mezloch, Voldřich a kol, 2009)
2.2.2 Kultivace extremofilních mikroorganismů Přežívají ve fyzikálních nebo chemických podmínkách nepříznivé pro běžné mikroorganismy. (vysoká nebo nízká teplota, pH, tlak, koncentrace solí, živin, vody, atd.). V biotechnologických aplikacích mají velký potenciál. Průmyslově se využívají extrémních MO a jejich enzymy (zvýšená teplota - vyšší rozpustnost reakčních komponentů, nižší riziko kontaminace, rychlejší reakce) v potravinářství, farmacii a
16
molekulární biologii. Lipázy v mlékárenském průmyslu, glukoizomeráza pro tvorbu glukoso-fruktózového sirupu.
Při vyšší inkubační teplotě je vyšší odpařování médií, nižší rozpustnost kyslíku, nestabilita složek média – karamelizace cukru, nestabilita agaru. Růst ve vodě 70 °C, vyšší teploty způsobují odpařování, proto by se měli použít kapaliny s vyšším bodem varu (např. glycerol), zvýšení tlaku při kultivaci. (Anonym 2, Sylabus k předmětu kultivační techniky, VSCHT)
2.3 Bioreaktory, fermentory Bioreaktory hrají důležitou úlohu při kultivaci mikroorganismů. Jsou to nádoby různého objemu, ve kterých probíhá mikrobiální proces. Jsou opatřeny vnějším a vnitřním chlazením, ohříváním, míchacím zařízením, přívodem vzduchu, odvodem výdechových plynů, mechanickým nebo chemickým odpěňováním, zařízením na odběr vzorků, měřením a regulací teploty, pH, měřením koncentrace rozpuštěného kyslíku, oxidu uhličitého, redox-potenciálu, obsah kyslíku a oxidu uhličitého v odcházejícím plynu, koncentrace biomasy, substrátu aj. Pro průmyslové kultivace se používají vsádkové míchané reaktory, kde se koncentrace živin, buněk a metabolických pochodů mění s časem. Bioreaktory rozdělujeme podle typu míchání na reaktory s mechanickým pneumatickým a hydraulickým mícháním. (Kadlec, Mezloch, Voldřich a kol, 2009)
2.3.1 Rozdělení
Bioreaktory rozdělujeme podle fází na:
Jednofázové systémy (kapalný substrát s rozpuštěným enzymem) Dvoufázové systémy (1. kapalina-částice nebo kapalina-mikroorganismus) (2. plyn-tuhé částice) Třífázové systémy (plyn-kapalina-mikroorganismy) Čtyřfázové systémy (plyn-kapalina-tuhý substrát- mikroorganismus) (Kaštánek, 2001, Perďoch, 2008) 17
Dále se mnou dělit na bioreaktory pro:
Aerobní procesy (konstrukčně jednodušší) Anaerobní procesy (konstrukčně složitější)
Podle typu míchání se rozdělují na:
Reaktory s mechanickým mícháním Reaktory s pneumatickým mícháním Reaktory s hydraulickým mícháním
Pro speciální účely se využívají: Membránové reaktory Reaktory s fluidní vrstvou Náplňové reaktory
Reaktory mohou být: Otevřené (anaerobní fermentace) Uzavřené (Kadlec, Mezloch, Voldřich a kol, 2009)
2.3.2 Typy bioreaktoru podle způsobu provozu
2.3.2.1 Vsádkový fermentor Tento typ reaktoru pracuje periodicky. Po vymytí nádoby reaktoru se vloží médium a inokulum. Reaktor se naplní do 3/5 výšky a vysterilizuje se. Pak se následně ochladí na provozní teplotu. Po dosažení určených parametrů nebo spotřebě substrátu se proces přeruší, reaktor se vyprázdní, vymyje a připraví na novou vsádku.
2.3.2.2 Kontinuální fermentor Tento reaktor pracuje v ustálených podmínkách velmi dlouhý čas. Do reaktoru se nepřetržitě přidávají substráty a živiny. Z reaktoru se nepřetržitě odvádí výstupní kapalina s biomasou. I tento způsob však vyžaduje občasné vypuštění náplně a vymytí,
18
pak se opět naplní a vysterilizuje. Po ustálení provozních podmínek převezme kontrolu nad fermentačním procesem řídící počítač.
2.3.2.3 Fermentace s řízeným nástřikem (fed-batch) Je to technika vedení mikrobiálního procesu, kdy jedna nebo více složek živin je dávkováno do fermentoru během kultivace a produkt zůstává v reaktoru až do konce procesu. Někdy mohou být živiny do reaktoru nastříkávány přerušovaně. (Kaštánek, 2001, Chriašteľ, Solte, 2003)
2.4 Bioreaktory 2. generace •
Reaktory s imobilizovanými enzymy
•
Membránové bioreaktory
2.4.1 Imobilizace enzymů Imobilizace enzymů nám dává možnost jej mnohonásobně použít.(Kaštánek, 2001) Zde nejsou enzymy ve vodném roztoku, ale jsou imobilizované různými způsoby: •
fyzikální adsorpcí
•
okluzí
•
uzavřením do mikroschránek
•
zasíťováním do bílkoviny
•
kovalentní vazbou
2.4.1.1 Fyzikální adsorpce na inertním nosiči Interakce mezi enzymem a povrchem nosiče, ke kterému dochází po smíchání koncertovaného roztoku enzymu s tuhým nosičem. Bývá jím aktivní uhlí, oxid hlinitý, celulóza, fosforečnan vápenatý, silikagel. Vazebné síly představují vodíkové můstky a Van der Waalsové interakce.
2.4.1.2 Okluze enzymů Obvyklou metodou je polymerizace hydrofilní matrice ve vodných roztocích enzymů a vytvoření pórů požadované velikosti. Jako monomer se používá akrylamid, škrobové gely stabilizované na polyuretanové podložce.
19
2.4.1.3 Uzavření do mikroschránek Uzavření malých objemů vodných roztoků enzymů do mikroschránek. Mikroschránky mají obal z tenké polopropustné membrány, které chrání enzymy před mechanickým napětím a případnou mikrobiální kontaminací.
2.4.1.4 Zasíťované molekuly Zesíťování molekul enzymů buď jinými bílkovinnými molekulemi nebo s funkčními skupinami nerozpustné matrice nosiče.
2.4.1.5 Kovalentní vazba mezi enzymem a matricí Je to jeden ze způsobů chemické modifikace enzymů, přičemž se vychází z poznatků o reaktivitě relativní koncentraci a přístupnosti aminokyselinových zbytků. (Chriašteľ, Solte, 2003)
2.4.2 Membránové bioreaktory Probíhá zde enzymaticky katalyzovaná reakce, kdy enzymy mikrobiální, živočišné nebo rostlinné buňky jsou působením membrán zadržovány. Zároveň může probíhat biokonverze a separace produktů.
2.4.3 Sterilizace Sterilizaci provádíme chemicky, UV zářením, a termicky. Vstupní proudy je možno sterilizovat filtrací.
2.4.3.1 Sterilizace bioreaktoru Je možno sterilizovat prázdný reaktor, ale obvyklejší je sterilizace s živým roztokem. Sterilizuje se nasycenou parou od 121 do 141 °C nebo přímou parou. Po určitý čas v reaktoru setrvává teplota a poté se ochladí.
Pro malé laboratorní
bioreaktory se používá sterilizace v autoklávu. Sterilizace vzduchu Vzduch je na vstupu do reaktoru sterilizován filtrací a na výstupu teplem nebo filtrací.
20
2.4.3.2 Sterilizace média Všechny kapaliny vcházející do reaktoru musí být sterilizovány termicky nebo přechodem přes membránu. Citlivá média na vysoké tepoty se mohou znehodnotit, a proto se používá filtrace se speciálními filtry.
Vsádkový fermentor se vyhřívá duplikátorem. Sterilizuje se při teplotě 121 °C 3060 min. Kontinuální fermentor používá dva způsoby sterilizace: injekční nebo výměníkovou. Při injekčním způsobu jde pára přímo do média a teploty rychle stoupají. Při výměníkovém způsobu, médium proudí systémem výměníku a během 20 sekund je vyhřáto na požadovanou teplotu.
2.4.4 Míchání Míchání zajišťuje homogenizaci kultivačních médií a stejnoměrné rozptýlení do všech částí kultury. Pro aerobní procesy musí být zajištěno neustálé větrání. Je zapotřebí zajistit co nejvyšší koeficient přístupu kyslíku do kapaliny. Tento parametr závisí na konstrukci, umístění míchadel, konstrukci fermentoru, rychlost otáčení míchadla, na vlastnostech kapaliny. Máme různě typy míchadel, jako jsou vrtulové nebo turbínové aj.
2.4.5 Odpěňování Proteiny v médiu vyvolávají při probublávání tvorbu pěn. Mnohdy se řeší tak, že se nechá dostatek prostoru v reaktoru pro tuto pěnu, což může vést k nebezpečí přechodu organismu ze submersní fáze do fáze o živiny ochuzené. K odpěňování se používají silikonové oleje nebo glykoly apod. Lze také použít mechanické odpěňování. (Kadlec a kol, 2009, Kaštánek, 2001)
2.4.6 Laboratorní fermentor Vytváří dobré podmínky pro růst a množení mikroorganismů a z jejich kultivace získáme mikrobiální biomasu a další látky. Pro výzkum a vývoj jsou používány bioreaktory s objemem kultivační nádoby od 500 ml do 200 litrů.
21
Laboratorní fermentor obsahuje: •
základní jednotku
•
řídící jednotku pro ovládání parametrů
•
kultivační nádobu z borosilikátového skla nebo nerez oceli s průhledem
•
motor pro míchání média
•
sondy pH, pO2 nebo Redox potenciál, AntiFoam (odpěňování), teplota
•
lahvičky pro reagencie (kyselina, zásada nebo médium pro doplňování v případě kontinuální kultivace)
•
peristaltické pumpičky pro dávkování reagencií
•
ovládací počítač
(Perďoch, 2010)
2.5 Izolace a purifikace Izolace čistých enzymů jsou doporučovány při teplotách okolo 0-4°C, při vyšších teplotách často nejsou stabilní. Hlavní částí čištění enzymů je odstranění nečistot z bílkovin. Často je používán síran amonný nebo gelová chromatografie. Frakcí obsahující enzym jsou dále čištěny např. iontově výměnnou chromatografií, gelovou elektroforézou nebo izoelektrickou fokusací. Dříve se provádělo úplné odstranění nečistot krystalizací enzymů. Dnes se primárně používají elektroforetické metody s vysokou separační schopnosti nebo HPLC. (Belitz, Grosch, Schiebrle, 2009)
Nejprve se provede homogenizace a následně centrifugace, která je důležitá pro následující metody rozpouštění bílkovin, je-li to nezbytné za použití detergentů. Diferenciální centrifugací se rozdělí vzorek do dvou frakcí. Oddělí se sediment a supernant, což je fáze, která není usazená. Tyto dvě fáze mohou být odděleny dekantací. Zvýšení rozpustnosti dosáhneme po přidání solí. Každý protein má charakteristický vysolovací bod. Toho můžeme využít pro separaci surového extraktu. Nejvíce používaný je síran amonný z důvodu vysoké rozpustnosti a je účinný při nižších
22
koncentracích. Dále mohou být vhodné alkoholy. Zbylé frakce se odstraní odstředěním. (Elliott 2005, Zubay a kol, 1995)
Metody isolace enzymů •
Srážení (precipitace)
•
Membránové separační procesy
•
Chromatografie
•
Elektroforéza
2.5.1 Srážení (precipitace) První metoda používaná k separaci bílkovin. Bílkoviny zůstávají v nativním stavu. Používá se síran amonný nebo etanol. Síran amonný je saturovaný roztok, umožňuje centrifugaci agregovaných bílkovin (hustota 1,29 g/cm3).
Srážení organickými rozpouštědly
Jsou kompletně mísitelné s vodou, nereagují s bílkovinou, musí mít dobrý precipitační efekt a srážení by mělo probíhat za nízké tepoty < 0 °C. Srážíme pomocí etanolu, acetonu, propanolu nebo dioxanu.
2.5.2 Membránové separační metody 1. Využití polopropustných membrán, které umožňují průchod malých molekul. 2. Membránová filtrace (ultrafiltrace), která rozdělí molekuly z roztoku na základě velikosti a dojde k odstranění nízkomolekulárních látek např. solí. 3. Dialýza: difúze nízkomolekulárních látek membránou (oddělení solí po vysolování bílkovin). (Anonym 1)
2.5.3 Chromatografické metody Chromatografie je proces separace látek. Principem je dělení látky mezi mobilní a stacionární fází, kde v mobilní fázi je kapalina nebo plyn (rozpouštědlo, které protéká kolonou) a stacionární fázi je sorbent na koloně a na něm mohou být navázané určité funkční skupiny. Princip je založen na afinitě (ochota sloučit se) k mobilní nebo stacionární fázi. (Komprda, 2003) 23
Během dělení dochází k opakovanému transportu látek do stacionární a zpět do mobilní fáze. Přitom se natolik blíží rovnováze, že rozdělení složky mezi dvě fáze popisujeme jako distribuční konstantu. (Zehnálek, 2001) •
rozdělení podle mobilní fáze - izotrafická - mobilní fáze nemění složení - gradientová - v průběhu analýzy můžeme změnit složení mobilní fáze, většinou se mění koncentrace organického rozpouštědla (acetonitril, methanol i voda)
Chromatograf •
přístroj, na kterém probíhá separace
•
skládá se z několika komponent; plynová bomba, ventil pro tlak, kolona a detektor
•
nebo zásoba kapalinové fáze, pumpa, nástřik, separační kolona, detektor, odkap
•
na silikonových Si kuličkách je navázána funkční skupina (Komprda, 2003)
Kapalinová chromatografie Klasická kapalinová (sloupcová) chromatografie Může být označován jako HPLC – hight pressure – vysokotlaká chromatografie, která je druhým stupněm klasické TLC, používá hodně velký tlak, čím větší průtok tím větší tlak. Výhodou HPLC je vysoké rozlišení, rychlost, vysoká citlivost, kapacita pro automatizaci. •
eluce – vymývání
•
eluent – mobilní fáze, kterou se vymývá
•
eluát – vymývaná látka
Při sloupcové chromatografii je materiál umístěn do kolony, které jsou buď skleněné, nebo kovové, kde probíhá dělení. Po aplikaci vzorku na kolonu dochází vlivem toku mobilní fáze k pohybu složek a k jejich separaci. (Zehnálek, 2001)
24
2.5.3.1 Gelová chromatografie Molekuly jsou zde od sebe odděleny podle jejich velikosti a tvaru. Stacionární fáze se skládá z hydratovaných materiálu obsahující póry. (Voet, 1990) Kolona je naplněna gelovými kuličkami, ve kterých jsou malé póry, po nastříknutí vzorku, který obsahuje malé i velké molekuly, velké molekuly budou proplouvat mezi kuličkami, ale ty malé se zamotají do kuliček a zdrží se. (Komprda, 2003) Jako první opouští kolonu složky s největšími molekulami, které do gelu nemohly vniknou a jsou mobilní fází nejvíce unášeny. Malé molekuly opouští kolonu jako poslední. Během průtoku pronikly kolonou bez zábran do obou fází, rovnováha jejich distribuce byla oproti ostatním posunuta ve prospěch gelu, což způsobilo jejich zabrzdění. (MIKEŠ, 1980)
Nejčastěji používané materiály pro výrobu chromatografických gelů jsou dextrany (s vysokou molekulovou hmotností polymeru glukózy vyrobené z bakterie Leuconostoc mesenteroides), agarozy (lineární polymer střídajících D-galaktózy a 3,6anhydrydo-Lgalaktózy z červených řas) a polyakrylamidy. Pórovité dextranové gely jsou známé pod obchodním názvem Sephadex (hranice mezi 0,7 a 800 kD). Sephadex se připravuje reakcí alkalického dextranu s epichlorhydrinem v emulzi. Vznikne nerozpustný polymer s trojrozměrnou strukturou, schopný přijímat vodu. Vyrábí se několik druhů, které se liší stupněm zesítění. Polyakrylamidové gely jsou dostupné pod komerčním názvem Bio-gel. (hranice mezi 0,2-400 kD). Vyrábějí se emulzní polymerací a dodávají se v práškové suché formě kuliček. (Voet 1990, Míkeš, 1980)
2.5.3.2 Iontově výměnná chromatografie Založeno na výměně iontů, stacionární fáze je ionex, přitahuje záporné nebo kladné částice na základě elektrostatických sil. (Komprda, 2003) R+A- + B- <=> R+B- + AR+A- aniontoměniče A- a B - představuje aniontů v roztoku Druhy iontoměniče Iontoměniče se skládají z nabité skupiny kovalentně připojené k matici. Chemickou podstatou nabité skupiny určují typy iontů, které se váží iontovou silou. Chemické a mechanické vlastnosti matice řídí tok vlastností, iontové dostupnosti a stabilitu iontů. 25
Pro iontové výměníky se používají tři třídy matricových materiálů: 1. Pryskyřice (polystyren zasítěný divinylbenzenem) 2. Celulóza 3. Celulóza zasítěná polyakrylamidovým nebo polydextranovým gelem
Katexy nesou záporně nabité skupiny, které reverzibilně vážou kationty. Anexy nesou kladně nabité skupiny, které vážou anionty. Mezi nejčastěji používané celulózové anexy patří diethylaminoethyl celulosa (DEAE) a nejpopulárnější celulózový katex je karboxymetylcelulóza (CM). Výhodou celulózových iontoměničů je větší propustnost makromolekulárních elektrolytů. To umožňuje přístup makromolekul k nabitým skupinám bez nutnosti použití velmi jemných částic, které drasticky brání toku elučního činidla. Další výhodou je nízká hustota nabitých skupin, což umožní eluci velkých polyelektrolytů za mírných podmínek. Gelové typy inonxů mohou mít stejné druhy nabitých skupin jako celulózové. Výhodou gelu typu ionexů je, že kombinují separační vlastnosti gelu filtrace s těmi iontové výměny. Vzhledem k jejich vysokému stupni substituce, které vyplývají z jejich porézní struktury, tyto gely mají vyšší nosnost než celulózové iontoměniče. (Voet, 1990)
Náboj bílkoviny závisí na pH prostředí a isoelektrickém bodu bílkoviny •
pH < pI → bílkovina nese kladný náboj → separace na katexu
•
pH > pI → bílkovina nese záporný náboj → separace na anexu
•
pH = pI → celkový náboj bílkoviny je nulový → nelze provést ionexovou chromatografii (Anonym 1)
2.5.3.3 Afinitní chromatografie Charakteristické pro mnoho proteinů schopné vázat specifické molekuly pevně, ale nekovalentně. Tato vlastnost může být použita k čištění těchto bílkovin afinitní chromatografií. Molekula známá jako ligand, který je vázán na bílkovinu, je kovalentně připojen na inertní a porézní matrici. Požadované proteiny se vážou na imobilizované ligandy, zatímco ostatní látky projdou kolonou. Požadovaný protein pak může být ve vysoce čisté formě změnou elucí tak, že je uvolňován z chromatografické matrice.
26
Chromatografické matrice v afinitní chromatografii, mají vysokou inertnost, velké množství funkčních skupin schopných kovalentní vazby s ligandy. Agarosy splňují kritéria a je tedy nejvíce používaný. Pokud ligand má primární amino skupinu, která je nezbytná pro vazbu na bílkoviny, ligandem můžou být spojeny s agarosou. Ligandy používané v chromatografické izolaci k určité bílkovině musí mít afinitu dostatečně vysokou, aby došlo k znehybnění proteinu na agrosovém gelu, ale ne tak vysoký, aby se zabránilo jeho následné uvolnění. Pokud je ligand substrátem pro enzym, chromatografické podmínky musí být takové, aby enzym nefungoval katalyticky, nebo ligand bude zničen. (Voet, 1990)
2.5.4 Elektromigrační techniky Vyznačují se pohybem částic v elektrickém poli, začnou se pohybovat konstantní rychlostí úměrnou velikosti nábojů, anionty putují k anodě a kationty ke katodě. (Zehnálek, 2001)
2.5.4.1 Elektroforéza Migrace iontů v elektrickém poli. Využití elektroforézy k oddělení proteinů byla poprvé popsána v roce 1937 švédským biochemikem Arne Tiselius. Mezi nejvýkonnější metody pro makromolekulární dělení patří gelová elektroforéza. Pohyb proteinu závisí na náboji proteinu a jeho molekulové hmotnosti, intenzitě pole, typu a porozitě gelu. Mezi běžné gely patří polyakrylamid a agarosy. Temed je stabilizátor volných radikálů, který je přidáván do směsi gelu. Fyzikální vlastnosti gelu a jeho velikost pórů jsou řízeny podle podílu akrylaminu v gelu a stupně zasítění. Nejčastější používané polyakrylamidové
koncentrace
jsou
v rozmezí
3-15
%
s množstvím
5
%
metylbisakrylamidu z celkového množství. ( Voet, 1990) Použití gelů umožňují separaci na principu síťového charakteru a na základě elektroforetické pohyblivosti dělených látek. (Zehnálek, 2001)
Gel polymeruje v prostoru mezi dvěma deskami a polymerace se urychluje přídavkem vhodného katalyzátoru. Pufr, který je stejný v obou nádržích má pH (obvykle pro bílkoviny 9) takové, že makromolekuly mají čistě záporné náboje, a proto migrují k anodě ve spodní nádrži. Makromolekulární materiálu se rozpustí v minimálním množství relativně hustého glycerolu nebo roztoku sacharózy, aby 27
zabránili smíchání pufru v horní nádrži. Gelem prochází stejnosměrný proud o 300 V na určitý čas 30-90 minut, aby se oddělili makromolekulární látky od samostatných skupin. pH pufru v horní nádrži, je upraveno tak, aby se blížilo pH v dolní nádrži. V horní nádrži je obvykle slabá kyseliny (glycin, pk2 = 9,6). Po dokončení elektroforetického dělení se zóny obarví roztokem barviva tak, že se barví celý gel ponořený do detekčního roztoku a přebytek barviva, kde se nenachází žádná složka směsi, se vymyje odbarvovacím roztokem. (Churáček, 1993, Voet, 1990)
PAGE elektroforéza Jako nosič je použit polyakrylamid o různé velikosti pórů. Proteiny jsou rozpouštěny v zásaditém pufru. V elektrickém poli se pohybují k anodě. SDS- PAGE elektroforéza Většina proteinů váže SDS ve stejném poměru 1,4 g SDS / g bílkovin (jedna molekula SDS na dva aminokyselinové zbytky). Vzorek se rozpustí v dodecylsulfátu sodném a nanesou se na destičku polyakrylamidového gelu. Do gelu se pustí elektrický proud a dojde k pohybu proteinů v elektrickém poli. SDS udělil molekule záporný náboj, takže bude putovat k anodě. Dochází k rozdělení molekul podle velikosti. (Komprda, 2003)
2.5.4.2 Izoelektrická fokusace (frakcionace) Dělení se provádí většinou v prostředí polyakrylamidového gelu. Je možno použít buď gelu připraveného mezi dvěma plošnými deskami, nebo se používá gelů připravených v kapiláře. Princip metody je založen na migraci biopolymerů v izoelektrickém bodě, který je nulový. Bílkoviny se od sebe liší hodnotou izoelektrického bodu, tj. velikostí pH, při němž jejich náboj nabývá nulové hodnoty. Jestliže se bílkovina dostane do oblasti nižšího pH, než je její izoelektrický bod, získává kladný náboj a pohybuje se v elektrickém poli jako kation. Vrací se do místa, kde náboj ztrácí, popř. kde je jako celek elektricky neutrální. V praxi se do gelu vpravuje amfoterní látka a elektrody jsou vloženy do kyselého a bazického pufru. V průběhu dělení se vytvoří podél gelu gradient pH, jednotlivé složky směsi postupují podle příslušných elektroforetických mobilit až do oblasti, která odpovídá jejich izoelektrickému bodu, kde se jejich migrace zastaví. (Churáček 1993, Mikeš 1980) 28
2.5.5 Stabilizace enzymů
Stabilita je limitujícím faktorem jeho použití. Stability enzymů lez dosáhnout: 1) Přídavkem nízko nebo vysoko molekulárních látek do prostředí. 2) Chemickou modifikací 3) Vytvoření příčných vazeb v molekule pomocí činidel 4) Rozvinutím a opětovným svinutím molekuly 5) Vazba na polymerní nosič (Vodrážka, 1996)
29
3 KONKRÉTNÍ IZOLACE
3.1 Separace a čištění keratinázy jako pesticid proti háďátku Melnidogyne inkognita Parazitární hlístice jsou hlavními limitujícími faktory výnosů mnoha plodin včetně brambor, cukrové řepy, sóji, rajčat a další. Mohou být použity pro ochranu proti háďátkům chemické látky, ale tyto sloučeniny mají sklon být vysoce toxické pro lidi a životní prostředí. Z Bacillus sp. byl izolován enzym keratinázy, který může zabít Melnidogyne inkognita. Pro srážení byl použit síran amonný a následně pak kapalinová chromatografie na DEAE-Sephadex-A-50. Výsledná čistota byla 46,5 %. Účinek čistoty byl stanoven pomocí SDS-PAG. Nedospělé Mebidogyne incognita byly vystaveny 50 pg/ml roztoku keratinázy. Úmrtnost byla 98,5 % Melnidogyne incognita po 24 hodinách. Výhodou pro získání keratinázy je jednoduché čištění a levné médium, které poskytuje vysoký výnos. (Xiao, a kol, 2011)
3.2 Izolace tolerantní proteázy z Aspergillus oryzae pro výrobu sojové omáčky Proteázy A. oryzae je považována za nejdůležitější enzym pro výrobu sojové omáčky a jako hostitel pro extracelulární produkci enzymů. Konvenční výrobní proces pro sojové omáčky jsou náročné a složité. Vysoké množství soli, používané pro výrobu sojové omáčky, zastavují růst mikroorganismů. Je tedy potřeba kyselé proteázy se silnou hydrolyzační aktivitou, aby se zkrátila doba zrání sojové omáčky. Tolerantní proteáza byla vyrobena z Aspergillus oryzae. Byla vyčištěna až na homogenitu srážením síranem amonným a DEAE-Septadex 50 a G-100 Septadex chromatografií. Optimální teplota proteázy byla 50 °C a pH 6,5. Relativně stabilní byla při 4,5-7,5 pH a teplotě 40 °C a až 10 % koncentrace.
30
Metodika AOLK-101
(Aspergillus
oryzae
LK-101
)
byla
kultivována
v 500
ml
Erlenmeyerovy baňky obsahující 200 ml 2 % odtučněné sójové mouky při 27 °C po dobu 4 dní. Byl přidán síran amonný k vysrážení bílkovin. Sraženina se rozpustila v pufru NAOAc, pH 6,5, dialyzovaných proti stejnému pufru při teplotě 4 °C po dobu 48 hodin a následně koncentrovaných ultrafiltrací. Koncentrát byl naložen na DEAESephadex iontově výměnné kolony (3,0 × 50.0 cm). Enzymy byly eluovány z kolony na základě použití NaOAc (pH 6,5), NaCl gradient v průtoku 0,4 ml / min při teplotě 4 °C. Další čištění bylo aplikované na Sephadex G-100 gelové chromatografie (1,6 × 70.0 cm) provedené pufrem NaOAc (pH 6,5) při teplotě 4 °C. Enzymy byly eluovány z kolony na základě použití stejného pufru při průtoku 0,3 ml / min. Elektroforéza SDSPAGE byla provedena s použitím 12 % polyakrylamidovém gelu v pH 8,8. Poměr čisté proteázy byla 2.301 jednotky / mg proteinu, který ukázal, že enzym byl čištěný o 11,6 krát s přibližně 6,8 % výnosem. (Si-Kzung, 2010)
Tabulka 1. Čištění tolerantní proteázy z A. oryzae LK-101 Čištění
Celková aktivita
Celková bílkovina
(Jednotka)
(Mg)
(U / mg)
Surové SNT
97,27
490.7
0, 198,2
100.0 0 1.00
Síran amonný
21,229
0 19.4
1,094.3
0 21.8 0 5.52
Ultrafiltrace
13,351
0 10.8
1,236.2
0 13.7 0 6.23
Sephadex-50
0 8,913
0 5.24
1,700.9
00 9.2 0 8.57
Sephadex G-100
0 6,581
0 2.86
2,301.0
00 6.8 11.59
31
Specifická činnost Výnos Čištění (%)
(Fold)
Obr. 1 SDS-PAGE (A) a stanovení molekulové hmotnosti Obr. 2 (B) A. oryzae LK-101 proteázy. M, molekulární marker; A. oryzae LK-101 proteázy.
3.3 Čištění a charakterizace xylanázy získanou z Chaetomium thermophile NIBGE Xylanázy se mohou aplikovat v odvětví papírenství, krmivářství, kvasném průmyslu a potravinářství. Nejběžnější je aplikace běleni celulosy, dále pro zlepšení nutričních vlastností siláží a v kombinaci s pektinasou pro vyjasnění ovocných šťáv. Bylo zjištěno, že NIBGE teplomilná houba je schopná produkovat termostabilní extracelulární enzym. Velké množství kultur vláknitých hub v pevném stavu v bioreaktoru ovlivňuje vlastnosti míchání, snižuje dostupnost kyslíku a může mít za následek adsorpci enzymu. Rychlost syntézy enzymu závisí na hydrolýze těchto pevných substrátů. Inokulum bylo připraveno v Erlenmeyerově baňce, kde bylo agarosové médium (Eggins a Pugh), které bylo sterilováno po dobu 15 minut. Jako zdroj uhlíku byla přidána glukosa. Kultivace inokula proběhla při teplotě 45 °C při 150 ot/48 hod. Do čtyř baněk bylo přidáno E a P médiem. Jako zdroj uhlíku a dusíku bylo přidáno 2 % pšeničné slámy a 0,15 % močoviny. Inokula ve výši 10 % byla převedena do každé 32
baňky a byly inkubovány při 45 °C při 150 ot/min po dobu 5 dnů. Kultura z každé baňky se odstředí (48000 · g) po dobu 10 minut při 25 °C. Supernatant obsahující surový enzym, který byl skladován při teplotě 4 °C. Pro zabránění kontaminace byl přidán azid sodný. Kapalinové chromatografie (FPLC) Kultura supernatantu (6000 ml) byla srážena síranem amonným. Sraženina byla odstředěna 48.000 · g za 30 min, rozpuštěna ethanol-amin-HCl pufrem při pH 9 a dialysovana stejným pufrem. Poté byl vzorek použit pro sériovou anion-výměnnou chromatografii na Hi-Load Q Sepharose, anion-výměnnou chromatografií na Mono-Q koloně a následně pro gelovou filtrační chromatografii. Vzorek byl vložen na zařízení Q-Sepharose (kolona 30 × 120 mm) při průtoku 2 ml/min. Lineární přechod z 0 do 0,6 M NaCl a v některých případech 0-2 mM Tris-HCl pufr při pH 5, 8 a 9,5 byly použity jako pufr pro eluci. Poté 10 ml dialyzované frakce bylo vloženo na Mono-Q kolonu (15 × 100 mm) při průtoku 1 ml/min a vymývá se lineárním gradientem 0-0,5 M NaCl v 20 mM ethanolaminem při pH 9,5. Nakonec vložen na kolonu Superose12 (15 × 300 mm). SDS-PAGE byla provedena s použitím 12 % polyakrylamidovém gelu. Gely byly obarveny R-250 (Bio-Rad). Molekulová hmotnost enzymu byla stanovena pomocí gelové filtrace na Bio-GelA-0.5. Standardní proteinové markery byly použity: fosforyláza b (94 kDa), transferin (76 kDa), glutamát dehydrogenázy (53 kDa), karboanhydrázy (29 kDa) a cytochrom c (12,4 kDa). První čištění vedlo k 1,34 násobku nárůstu činnosti xylanázy. Dvě různé xylanázy (Xyl a Xyl-B) byli získány anion-výměnnou chromatografií na Mono-Q koloně. Tento čistící krok měl nárůst 1,41 násobný pro Xyl-B. Hlavní xylanázová frakce Bll představuje 1,34 nárůst specifické činnosti. Kompletní čištění vedlo k 3,75 násobnému čištění xylanázy-BII.
33
Tabulka 2. Čištění teplomilnou C. NIBGE xylanázy-BII. Čištění
Specifické Celkový
Celková aktivita
Celková
Čištění aktivity
objem (ml)
(jednotky)
bílkovina (mg)
faktor (U / mg)
Surový extrakt
1000
28000
900
31
1.0
(NH 4) 2 SO 4 srážek
220
18920
452
41.5
1.34
Hi-Load anexu
120
12840
256
50.2
1.21
Mono-Q anexu
190
11960
169
70.77
1.41
Gelovou filtrací
276
5244
55
95.35
1.34
Obrázek 3. 12 % SDS-PAGE vyčištěné xylanáza-BII.M: Markery; X: Xylanázy-BII.
Byly získány různé skupiny frakce xylanázy-B . Tyto proteiny byly v rozmezí 2880
kDa. Hlavní
skupina
xylanázy-BII
byly
opakovaně
vkládány
na
SDS-
PAGE. Xylanázy BII bylo zjištěno, že je homogenní a ukazující jeden pruh na SDSPAGE s molekulovou hmotností 50 kDa.
34
Molekulová hmotnost xylanázy BII byla 50 kDa. Teplotní optima byli 70 °C a pH 6,5. Xylanázy z NIBGE teplomilnou C. mají zajímavé fyzikální, katalytické a lignocelulózové vlastnosti, které mohou být vhodné pro průmyslové bělení buničiny. (Farou, a kol, 2006)
35
4 ZÁVĚR Cílem mé bakalářské práce bylo popsání dostupné literatury, která se týká izolace enzymů. Enzymové technologie jsou zaměřeny na výrobu kvalitních, čistých enzymů a jejich neustálé zlepšování nejen v potravinářském průmyslu. Enzymatické procesy jsou daleko výhodnější ve srovnání s chemickým ošetřením. Výhodou jsou mírnější podmínky a vyšší produktivita. Moderní fermentace probíhají za aseptických podmínek ve fermentorech. Laboratorní fermentory nám mohou sloužit i jako vhodná metoda pro zavádění reaktoru pro velkovýrobu. V malém laboratorním fermentoru můžeme nastavit parametry tak, abychom získali časovou závislost růstu a tvorby produktů pro použití ve velkoobjemových fermentorech. Dnešním trendem pro izolace je použití mikrobiálních zdrojů. Tyto kultury se rychle množí, rostou a jejích široká škála umožňuje adekvátní náhradu za rostlinné či živočišné enzymy. Pro separaci enzymů je nejdříve použita centrifugace. Získáme tak supernant obsahující surový enzym. Kultura supernantu se nejčastěji sráží síranem amonným. Pro purifikaci se nejvíce využívá vysokotlaká chromatografie HPLC, která je rychlá, má vysokou citlivost a rozlišení. Nejběžnějším chromatografickým postupem je použití gelové a iontově-výměnné chromatografie. Pro kontrolu separovaného enzymu je vhodná gelová elektroforéza. Izolované enzymy mají v potravinářství velké uplatnění. Například použití rostlinných proteáz při tenderizaci masa, výroba fruktózových sirupů pomocí glukosaizomerázy. ztekucení a zcukření v pekařství umožní amylázy. Pektinázy pro čeření zákalů a glukosaoxidázy ke snížení koncentrace glukózy nebo odstranění kyslíku. Izolace enzymů je velmi složitý a nákladný proces. Proto je snaha použití například imobilizovaných enzymů, které se snadněji odstraňují z reakční směsi a umožňují opakované použití. Informace, které jsem získala z různých zdrojů o kultivaci, izolaci a čištění enzymů, by mohli být základem pro experimentální část, popřípadě pro průmyslové aplikace.
36
5 POUŽITÁ LITERATURA ANONYM 1: Enzymologie-Aplikace enzymů. Online [ cit. 2011. 3. 30 ] Dostupná na: www.nh.cas.cz/people/safarik/...na.../Enzymologie/aplikace-enzymu.ppt
ANONYM 2: Kultivační techniky-Sylabus k předmětu kultivační techniky, VŠCHT, Online [cit. 2011-4-6] Dostupnána: www eso.vscht.czcache_data1165www.vscht.czkch...kultivtech.pdf
BELITZ H. D., GROSCH W., SCHIEBERLE P., 2009: Food Chemismy. Le-tex publishing service oHG, Leipzig, 1070 s. IBSN 978-3-540-699354
ELLIOTT W. H, ELLIOTT D. H., 2005: Biochemistry and molecular biology. Oxford University Press, 582 s. ISBN 01-992-7199-2
FAROOG LATIF, MUHAMMAD ASGHER, RABIA SALEEM, AHMED AKREM AND R- L. LEGGE : Purification and Characterization of a Xylanase Produced by Chaetomium thermophile NIBGE, World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2006, Volume 22, Number 1, Pages 45-50 [cit. 2011-04-10]
CHRIAŠTEĽ L., SOLTES J., 2003: Bioreaktor. Slovenská technická univerzita, Bratislava, 176 s. IBSN 80-227-1843-2
CHURÁČEK J., 1993: Nové trendy v teorii instrumentaci analytických metod, Academia, Praha, 387 s. ISBN 80-200-0010-0
KADLEC P., MELZOCH K., VOLDŘICH M. a kol., 2009: Technologie potravin, Co byste měli vědět o výrobě potravin?. KEY Publishing, Ostrava, 536 s. ISBN 978-807418-051-4
KÁŠ J., 1988: Enzymové biokatalyzátory při výrobě potravinářských výrobků. Středisko technických informací potravinářského průmyslu, Praha, 42 s. ISBN 80-85120-03-8 37
KAŠTÁNEK K., 2001: Bioinženýrství. Academica, Praha, 334 s. ISBN 80-200-0768-7
MIKEŠ O., 1980: Laboratorní chromatografické metody: Technický průvodce 53, SNTL, Praha, 673 s.
MIKUŠOVÁ K., KOLLÁROVÁ M., 2008: Princípy biochemie. Univerzita Komenského Bratislava, 164 s. ISBN 978-80-223-2567-7
KLEJDUS B., Výukové prezentace - Biochemie. 2009
KOMPRDA T., 2003: Hygiena potravin-cvičení. Mendelova univerzita, Brno, 50 s. IBSN 80-7157-709-X
PERĎOCH R., 2008: Možnosti využití laboratorního biofermentoru v potravinářské praxi. Bakalářská práce (in MS, dep. Knihovna MENDELU v Brně), MZLU v Brně, Brno, 33s.
PŘÍHODA J., HUMPOLÍKOVÁ P., NOVOTNÁ D., 2003: Základy pekařské technologie, Pekař a Cukrář s.r.o. Odborné nakladatelství a vydavatelství, Praha, 364 s. ISBN 80-902922-1-6
SI-KZUNG LEE, JOO-YEON HWANG, SEUNG HWA CHOI AND SANG MOO KIM: Purification and characterization of Aspergillus oryzae LK-101 salt-tolerant acid protease isolated from soybean paste, Food Science and Biotechnology, 2010, Volume 19, Number 2, Pages 327-334 [cit. 2010-3-12]
ŠILHÁNOVÁ L., 1995: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Victoria publishing, Praha, 361 s. ISBN 80-85605-71-6
VODRÁŽKA Z., 1996: Biochemie. Academia, Praha, 192 s
38
VODRÁŽKA Z., RAUCH P., KÁŠ J., 1998: Enzymologie. Vydavatelství VŠCHT, 2. vydání, Praha, 171 s. ISBN 80-7080-124-7
VOET D., VOET J. G., 1990: Biochemistry. John Wiley & Sons, New York, 1223 s. IBSN 0-471-61769-5
VOTAVA M., 2001: Lékařská mikrobiologie obecná. Neptun, Brno, 247 s. ISBN 80902896-2-2
XIAO TU TUE, BIN ZHANG, DAN DAN JIANG, YAN JUAN LIU AND TIAN GUI NIU: Separation and purification of a keratinase as pesticide against root-knot nematodes, Word Journal of microbilogy and biotechnology, 2011 [cit. 2011-04-10]
ZEHNÁLEK J., 2001: Biochemie cvičení. Mendelova univerzita v Brně, 1.vyd, 72 s. ISBN 80-7157-522-4
ZUBAY G. L., PARSON .W., VANCE D. E., 1995: Principles of Biochemistry. Wm. C. Brown Publishers, ISBN 0-697-14275-2
39
5.1 Seznam tabulek Tab. 1 Čištění tolerantní proteázy z Aspergillus oryzae, str. 31 Tab. 2 Čištění xylanázy z Chaetomium thermophile NIBGE, str. 34
5.2 Seznam obrázků a grafů Obr. 1 SDA-PAGE a stanovení molekulové hmotnosti proteázy, str. 32 Obr. 2 Graf relativní mobility proteázy z Aspergillus oryzae, str. 32 Obr. 3 SDS-PAGE vyčištěné xylanázy-BII, str. 34
5.3 Seznam symbolů a zkratek HPLC – vysokotlaká kapalinová chromatografie FPLC – střednětlaká kapalinová chromatografie SDS – dodeclysulfát sodný SDS-PAGE – elektroforéza v polyakrylamidovém gelu v přítomnosti dodecylsulfátu sodného pH – jednotka kyselosti, záporná hodnota dekadického logaritmu molární koncentrace vodíkových iontů NAOAc – octan sodný DEAE – diethylaminoethyl celulóza CM – karboxymetylcelulóza MO – mikroorganismy ot/min – otáček na minutu pI – izoelektrický bod pk – disociační konstanta U/mg – jednotka na miligram pg/ml – pikogram na mililitr kDa – kilodalton
40
