MENDELOVA UNIVERZITA V BRNĚ AGRONOMICKÁ FAKULTA
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE
BRNO 2012
JAN JAVORSKÝ
Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výţivy rostlin
Kvasinky a jejich význam v potravinářství Bakalářská práce
Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D.
Vypracoval: Jan Javorský
Brno 2012
Zadání
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Kvasinky a jejich význam v potravinářství vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.
dne ………………………………………. podpis ……………………….
PODĚKOVÁNÍ Rád bych poděkoval Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za odborné vedení, konzultace, ochotu a čas při tvoření bakalářské práce. Dále děkuji celému Ústavu agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin.
Abstrakt Javorský J. Kvasinky a jejich význam v potravinářství. Bakalářská práce. Brno, 2012. Bakalářská práce se zabývá kvasinkami a jejich významem v potravinářství. Kvasinky jsou v této práci popsány od jejich objevení, výskytu, přes jejich cytologii, taxonomii, morfologii a rozmnožování. Dále je zde zmíněno chemické složení i následný metabolismus kvasinek. Další část práce se zabývá kvasinkami, které mají vliv na potraviny. Je zde popsán význam vybraných rodů a jednotlivých druhů, které působí na pivovarnictví, pekařství, vinařství, lihovarnictví, ovocné nápoje, mlékárenský průmysl apod. Práce se také věnuje mikrobiálnímu kažení potravin, na které mají kvasinky vliv. Další část se zabývá bojem proti nežádoucím mikroorganismům. Praktická část byla věnována stupni prokvašení vybraných odrůd sladiny, stanovení se provádělo denzitometrickou metodou. Dále byla stanovena analýza počtu mikromycet v syrovém kozím mléce a sýrech. Klíčová slova: kvasinky, mikroorganismy, Saccharomyces.
Abstract Javorský J. Yeasts and its importance in the food industry. Bachelor thesis. Brno, 2012. The bachelor thesis is focused on yeast and its importance in the food industry. In this thesis yeast is described since its discovery, development through: cytology, taxonomy, morphology and reproduction. Furthermore in the bachelor thesis, chemical structure and consequential metabolism of yeast are discussed. The sequel part of the thesis deals with yeast, which has influence on foodstuffs. It is stressed the importance of chosen genus and species, which influences brewery, viniculture, distillery, fruit beverages and dairy products. In the thesis there is also described microbic decay of food, which is influenced by yeast. The next part refers to the fight against undesirable micro-organisms. The practical part is focused on the grade of fermentation of chosen cultivars of sweeteners. Assignment has been conducted by the densitometric method. Further, the analysis determined the number of micromycetes in raw goat milk and cheeses. Key words: yeasts, microorganisms, Saccharomyces.
OBSAH
1
ÚVOD…………………………………………………………………………… 10
2
CÍL PRÁCE………………………………………………………………….…. 11
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED………………………………………………………. 12
3.1 Kvasinky………………………………………………………………………... 12 3.1.1
Výskyt kvasinek………………………………………………………….. 12
3.1.2
Taxonomie kvasinek……………………………………………………... 13
3.1.3
Cytologie kvasinek………………………………………………………. 14
3.1.4
Morfologie kvasinek……………………………………………………... 16
3.1.5
Chemické složení kvasinek……………………………………………… 16
3.1.6
Rozmnožování kvasinek…………………………………………………. 17
3.1.6.1
Vegetativní rozmnožování………………………………………… 17
3.1.6.2
Pohlavní rozmnožování…………………………………………… 17
3.1.6.3
In Vitro……………………………………………………………. 17
3.2 Metabolismus kvasinek………………………………………………………... 18 3.2.1
Dýchací řetězec…………………………………………………………... 18
3.2.2
Zdroje uhlíku…………………………………………………………….. 18
3.2.3
Zdroje dusíku…………………………………………………………….. 18
3.2.4
Kyslík…………………………………………………………………….. 19
3.2.5
Glykolýza………………………………………………………………… 19
3.2.6
Krebsův cyklus…………………………………………………………... 20
3.2.7
Teplota…………………………………………………………………… 20
3.3 Kvasinky v potravinářství……………………………………………………... 21 3.3.1
Saccharomyces cerevisiae……………………………………………….. 22
3.3.1.1
Využití při výrobě piva……………………………………………. 23
3.3.1.2
Využití při výrobě lihu……………………………………………. 24
3.3.1.3
Využití při výrobě vína……………………………………………. 24
3.3.1.4
Využití v pekařství………………………………………………… 25
3.3.2
Pichia…………………………………………………………………….. 26
3.3.3
Candida………………………………………………………………….. 26
3.3.4
Schizosaccharomyces……………………………………………………. 28
3.3.5
Zygosaccharomyces……………………………………………………… 28
3.3.6
Yarrowia…………………………………………………………………. 29
3.3.7
Brettanomyces…………………………………………………………… 29
3.3.8
Kluyveromyces………………………………………………………….... 29
3.3.9
Metschnikowia…………………………………………………………… 30
3.4
Působení kvasinek na kaţení potravin………………………………………... 30
3.4.1
Mlékárenský průmysl……………………………………………………. 31
3.4.1.1
Mléko……………………………………………………………… 31
3.4.1.2
Sýry………………………………………………………………... 31
3.4.1.3
Jogurty…………………………………………………………….. 32
3.4.1.4
Máslo……………………………………………………………… 32
3.4.2
Masné produkty………………………………………………………….. 32
3.4.3
Nápoje……………………………………………………………………. 33
3.4.4
Pochutiny………………………………………………………………… 33
3.5
Boj proti neţádoucím kvasinkám……………………………………………... 34
3.5.1
Mechanické prostředky…………………………………………………... 34
3.5.2
Fyzikální prostředky……………………………………………………... 35
3.5.3
Chemické prostředky…………………………………………………….. 35
3.5.4
Čištění……………………………………………………………………. 37
3.5.5
Dezinfekce……………………………………………………………….. 38
4
PRAKTICKÁ ČÁST…….…………………………………………………….. 40
4.1
Stanovení stupně prokvašení u vybraných odrůd…..……………………….. 40
4.2 Analýza počtu mikromycet v syrovém kozím mléce a sýrech………………. 42
5
ZÁVĚR…………………………………………………………………………. 45
6
SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY……………………………………........ 46
7
SEZNAM OBRÁZKŮ……………………………………….............................. 49
1 ÚVOD
Kvasinky jsou jednobuněčné mikroorganismy, využívané člověkem již několik tisíciletí, především kvůli jejich schopnosti kvašení, jsou však mezi nimi i původci nemocí a kažení potravin. Proces kvašení byl znám již ve starém Babylonu, kdy se pomocí dostupné techniky zhotovoval předchůdce dnešního piva. Později bylo objeveno zpracování vína a v egyptských ruinách byly objeveny pečící komory pro zhotovení kvašeného chleba. Význam kvasinek jako takových byl však zkoumán od dob poměrně nedávných, což způsobilo objevení mikroskopu. Kvasinky mají uplatnění zejména v potravinářství a biotechnologiích, např. při výrobě alkoholických nápojů, mléčných nápojů, v drožďárenském průmyslu a jinde. Dnes jsou používány i geneticky modifikované kvasinky pro farmakologické účely. V budoucnu můžeme počítat s využitím kvasinek v dalších průmyslových oblastech, např. v environmentální biotechnologii či v humánní medicíně. V medicíně se využívají pro léčbu nervových onemocnění, kožních chorob, dále pro léčbu poruch zažívacího traktu či jaterních chorob. V potravinářství jsou ceněny zejména pro velký obsah stravitelných bílkovin a dalších biologicky cenných látek, jako jsou uhlohydráty, lipidy a vitaminy skupiny B. Nejprostudovanější kvasinkou je Saccharomyces cerevisiae. Velmi lehce se kultivuje a svou strukturou buňky se podobá buňkám rostlin a živočichů. Říká se jí také pivní kvasinka, při kvasných procesech byla využívaná již v antice. Kvasinky mohou člověku způsobit i onemocnění, patogenních druhů je však jen několik. Většinou se jedná o různá kožní, slizniční a jiná onemocnění. Význam kvasinek v potravinářství je velmi rozmanitý, jsou to člověkem nejvíce využívané mikroorganismy.
10
2 CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce je zpracovat literární rešerši, v níž budou shrnuty poznatky o kvasinkách významných v potravinářství. Zaměřit se na kvasinky důležité při výrobě potravin a kvasinky působící na kažení potravin, charakterizovat významné druhy kvasinek a produkty jejich metabolismu a charakterizovat opatření v boji proti nežádoucím kvasinkám. Cílem praktické části je stanovit množství kvasinek ve vybraných vzorcích.
11
3 LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1 Kvasinky Kvasinky jsou heterotrofní eukaryotní mikroorganismy, náležící mezi houby (Fungi). Český název dostaly pro schopnost většiny druhů zkvašovat monosacharidy a některé disacharidy, případně i trisacharidy. (Šilhánková, 2002) Účastní se kvasných (fermentačních) procesů, při kterých jsou rozloženy cukry za vzniku alkoholu a oxidu uhličitého, např. kvasinka pivní (Saccharomyces cerevisiae) – kulturní kvasinka, využívaná k výrobě lihu, v pivovarnictví, v lékařství (obsahuje enzymy a vitaminy skupiny B) nebo kvasinka vinná (Saccharomyces elipsoideus) – způsobuje kvašení ovocných šťáv, kulturní kmeny jsou využívány při zkvašování moštu (šťáv z vinných hroznů) na víno. (Benešová et. al., 2003) Kvasinkové mikroby jsou pravděpodobně jedním z nejstarších domestikovaných organismů. Lidé využívají kvasinky pro kvašení a pečení v celé historii. Archeologové našli v egyptských ruinách pečící komory pro kvašený chléb, stejně jako kresby 4000 let staré pekárny a pivovary. Teprve v posledních 150 letech, od experimentů Louise Pasteura, začali vědci zkoumat, jak kvasinky pracují. (Phillips, Noever, 2011) Využití aktivity kvasinek v potravinářském a nápojovém průmyslu vyžaduje základní znalosti o jejich ekologii, fyziologii, biochemii a molekulární biologii. Tyto znalosti poskytují základ pro genetické vylepšení a objevování nových biokatalytických technologií, které pravděpodobně povedou další generace k vývoji dalších výrobků a procesů. (Querol, Fleet, 2006) 3.1.1 Výskyt kvasinek Kvasinky jsou rozšířeny po celém světě. Setkáváme se s nimi na povrchu sladkých plodů, na ovoci, na bobulích lesních rostlin, v nektaru květin, ve šťávách prýštících z poraněných stromů, v medu, na plodnicích vyšších hub, na povrchu suchých částí rostlin a jejich orgánů, v půdě, ve vodách, v prachu, v potravinách, na kůži lidí i ostatních živočichů, v jejich sliznicích, plicích, v mléce a jinde. (KockováKratochvílová, Kutková , 1961) 12
Velká většina kvasinek náleží mezi tzv. bílé kvasinky tvořící na kultivačních mykologických půdách bělavě zbarvené kolonie. Ovšem v přírodě se rovněž vyskytují kvasinky červené, např. rod Rhodotorula, jehož kolonie jsou zbarveny růžově až červeně karotenoidními barvivy. Nakonec se ještě rozlišují tzv. černé kvasinky s koloniemi tmavými až černými jako je rod Aureobasidium. Kolonie této kvasinky jsou na sladinovém agaru zpočátku dokonce bílé, ale později černají. Aureobasidium pullulans se často nachází na ovoci a může být i složkou tzv. černi na povrchu listů nebo plodů. (Klaban, 2001)
Obr. 1: Aureobasidium pullulans (WWW.ALOALLERGY.COM). Když kvasinky žijí na úkor rostliny nebo živočicha, rozmnožují se v těle hostitele, jsou parazitické; když žijí jen na rozkládajících se zbytcích rostlinného a živočišného původu, jsou saprofágové anebo se vyskytují jen ve formě přetrvávajících buněk (askospory, chlamydospory apod.) – jsou saprofytické. (Kocková-Kratochvílová, 1990)
3.1.2 Taxonomie kvasinek V systému hub (Fungi) patří kvasinky mezi Eumycota – vlastní houby, a to do dvou velkých pododdělení: Ascomycotina – vřeckovýtrusné houby a Basidiomycotina stopkovýtrusné houby. Anamorfní formy, tj. kvasinky, u nichž se neprokázalo sexuální rozmnožování, se zařazují do pomocného pododdělení Deuteromycotina. V rámci systému vřeckovýtrusných hub je velká skupina kvasinek zařazována do Endomycetes (Hemiascomycetes). (Janderová, Bendová, 1999)
13
3.1.3 Cytologie kvasinek Vegetativní kvasinková buňka se skládá ze silné a pevné buněčné stěny, jemné cytoplazmatické membrány, cytoplazmy, jež obsahuje řadu membránových struktur, a jádra, které je od cytoplazmy odděleno dvojitou jadernou membránou. (Šilhánková, 2002) V podmínkách přirozeného prostředí jsou buňky kvasinek vystaveny různým stresům a jejich různým kombinacím. Při použití v průmyslové výrobě, jako je např. pivovarství, je spektrum stresových faktorů rozšířeno o technologické stresy nebo dochází k zesílení přirozených stresových faktorů. (Sigler, Matoulková, 2011) Buněčná stěna Buněčná stěna kvasinek má, podobně jako u bakterií, silnou a pevnou strukturu, která dává buňce tvar a chrání ji před mechanickými vlivy a před osmotickým šokem. Velkými póry stěny mohou volně procházet všechny sloučeniny kromě sloučenin vysokomolekulárních, jako jsou polysacharidy a bílkoviny. (Šilhánková, 2002) Tloušťka buněčné stěny je asi 350 až 400 nm, skládá se hlavně z polysacharidů glukanu a mannanu, malého mnoţství chitinu a dalších sloţek. (Basařová et. al., 2010) Cytoplazmatická membrána Někdy nazývaná plazmalema, má obdobné složení i funkci jako cytoplazmatická membrána bakterií. Je poměrně tenká, tloušťky 7,5 až 8 nm, složená z lipidů a proteinů; vytváří četné vychlípeniny vybíhající do cytoplazmy. Je volně propustná pouze pro malé molekuly bez náboje, a tvoří proto osmotické rozhraní mezi buňkou a vnějším prostředím. Je sídlem transportních mechanismů, umožňujících jednak příjem určitých látek buňkou, jednak transport látek z buňky do prostředí. (Šilhánková, 2002)
Cytoplazma Cytoplazma je sloţitý koloidní roztok v nitru buňky obsahující nízkomolekulární i vysokomolekulární látky. Má pH a iontovou sílu odlišné od svého okolí. (Basařová et. al., 2010) Cytoplazma mladých buněk kvasinek se ve světelném mikroskopu jeví jako průhledná, homogenní hmota, u starších buněk se objevují zrníčka a jemná nebo větší 14
vakuolizace. V elektronovém mikroskopu je patrné, že cytoplazma kvasinek obsahuje systém dvojitých membrán, jenž se podobně jako u rostlin a živočichů nazývá endoplazmatické retikulum. Na vnějším povrchu obou membrán jsou četná zrníčka polynomů, tj. agregátů ribozomů, v nichž se syntetizují bílkoviny. Dále jsou v cytoplazmě kvasinek přítomny mitochondrie. Jsou to strukturální útvary velmi rozmanitého tvaru (kulovité, válcovité až vláknité, nebo laločnaté). (Šilhánková, 2002) Skládají se z vnější membrány, mezimembránového prostoru a vnitřní membrány, uvnitř mitochondrie je členitá membránová struktura s oxidačními
enzymy.
Mitochondrie se uplatňují při oxidačním metabolismu kvasničné buňky, při anaerobním metabolismu jsou neaktivní. Jsou sídlem enzymů dýchacího řetězce a dochází zde k oxidativní fosforylaci a syntéze některých enzymů odpovědných za biosyntézu mastných kyselin. (Basařová et. al., 2010) Další organely nacházející se v cytoplazmě kvasinek jsou ribozomy. Ribozomy jsou bílkovinná tělíska obsahující ribozomovou RNA (r-RNA), existují volné nebo vázané na endoplazmatické retikulum, jsou složeny ze dvou nestejných podjednotek, účastní se syntézy bílkovin (proteosyntézy). (Benešová et. al., 2003) Vakuola je nejnápadnější a nejvýraznější složka cytoplazmy. Obsahuje hydrolytické enzymy. (Klaban, 2001) Vnitřní obsah vakuoly je obklopen jednou membránou, označovanou jako tonoplast. Kvasinková vakuola je navzdory svému názvu metabolicky aktivní, esenciální organelou. Je zásobní organelou, obsahuje zásobu aminokyselin, bazí, fosfátu uspořádaného do polymetafosfátových granul, vápníku. Ve vakuole jsou lokalizovány významné proteolytické enzymy. (Janderová, Bendová, 1999) Dalším membránovým útvarem v cytoplazmě kvasinek je Golgiho aparát, který má tvar plochého měchýřku nebo několika propojených plochých měchýřků anebo cisteren uložených rovnoběžně vedle sebe. Předpokládá se, že funkcí tohoto aparátu je transportovat prekurzory (tj. stavební kameny) buněčné stěny z cytoplazmy přes cytoplazmatickou membránu. Podobně jako ostatní eukaryota obsahují kvasinky také tzv. cytoskelet, což je síť proteinových vláken, která se rozprostírá v cytoplazmě i v jádře a umožňuje vnitrobuněčný pohyb organel z jednoho místa na druhé. V cytoskeletu kvasinek hrají významnou roli mikrotubuly, což jsou poměrně málo ohebné trubice složené
15
z bílkoviny zvané tubulin. Mikrotubuly obvykle vycházejí z určitého centra a jejich volné konce se dle potřeby rozkládají a obnovují. (Šilhánková, 2002) Jádro Buněčné jádro (nucleus) je základním stavebním prvkem buňky a je zároveň nepostradatelnou součástí každé plnohodnotné buňky. Představuje centrum, které řídí a kontroluje činnost buňky, která je zakódována v chromozomech. (Sládek, 2007) Jádro kvasinek má v průměru asi 1,5 µm, je ohraničeno dvojitou membránou s póry a obsahuje intracelulární tubuly, které jsou spojené s cytosolickými mikrotubuly při dělení chromozomů mezi mateřskou a dceřinou buňku. Jádro obsahuje jadérko a hlavní část nukleoplasmy tvoří DNA a histony, organizované v chromozomech. (Basařová et. al., 2010) U nejlépe prostudované kvasinky, tj. Saccharomyces cerevisiae, bylo zjištěno 16 chromozomů v haploidním jádře. (Šilhánková, 2002) Od cytoplazmy je odděleno jadernou membránou označovanou také názvy karyolema nebo karyotéka. Ta je dvojvrstevná a mezi jednotlivými vrstvami se nachází tzv. perinukleární prostor vyplněný polotekutým obsahem. (Klaban, 2001)
3.1.4 Morfologie kvasinek Druhy kvasinek a kvasinkových mikroorganismů bývají tvarově značně rozmanité a nevyrovnané. Tvar a velikost buněk se mění podle vnějších podmínek kultivace a souvisí s funkcí buňky. Tvar buněk může být kulatý, elipsoidní, oválný, citrónový, ogivální, přetáhnutý, triangulární, válcovitý. (Minárik, Navara, 1986) Rozmanitost buněčných tvarů má někdy pravou genetickou povahu, jindy je však vyvolána pouze okamžitým vlivem prostředí. (Kocková-Kratochvílová, Kutková, 1961) Šířka buněk většiny kvasinek je v rozmezí 3-6 µm. (Šilhánková, 2002) 3.1.5 Chemické sloţení kvasinek V chemickém složení kvasinek převažuje jako v každém organismu s vlastním metabolismem voda, její obsah se pohybuje v širokém rozmezí, od 65 do 85 %. Asi tři čtvrtiny z toho tvoří voda intracelulární, vázaná uvnitř buněk, a zhruba čtvrtinu voda hydratační a volná, vázaná povrchovými silami. (Basařová et. al., 2010) Obsah vody závisí na druhu kvasinek, stáří buněk a kultivačních podmínkách. Také složení sušiny kvasinek závisí na těchto činitelích. Hlavní podíl sušiny kvasinek tvoří 16
bílkoviny (kolem 50 %) a dále glykogen (u Saccharomyces cerevisiae až 30 %). Nukleové kyseliny představují 10 % sušiny, strukturní polysacharidy kolem 5 % a popel kolem 8 %. Z organických sloučenin vyskytujících se v nízkých koncentracích mají z nutričního hlediska význam především vitaminy skupiny B (B1, B2, B6), provitamin D (ergosterol) a u některých rodů (např. Rhodotorula a Rhodosporidium) také provitamin A (tj. ß-karoten). Hlavní složkou popela je oxid fosforečný, jehož obsah v sušině lze rovněž do určité míry regulovat složením kultivačního prostředí. Z iontů kovů je v největším množství zastoupen K+, zatímco Mg2+, Ca2+ a Na+ je mnohem méně. (Šilhánková, 2002) 3.1.6 Rozmnoţování kvasinek 3.1.6.1 Vegetativní rozmnožování Většina rodů kvasinek se vegetativně rozmnožuje pučením. Při pučení je vznikající malá dceřinná buňka (pupen) spojena kanálkem s mateřskou buňkou. (Šilhánková, 2002) 3.1.6.2 Pohlavní rozmnožování Při pohlavním množení vznikne po redukčním dělení z diploidní buňky askus s haploidními askosporami. Askospory, čili gamety potom kopulují, čímž po karyogamii vznikne diploidní zygota (zygospora, kvasinky tvořící askospory, perfektní kvasinky, Endomycetes). (Görner, Valík, 2004) 3.1.6.3 In vitro Podmínkou rozmnožování kvasinek je kultivace v prostředí obsahujícím všechny potřebné živiny (glycidy, dusíkaté i minerální látky) a růstové faktory ve vyhovujícím množství. (Hlaváček, Lhotský, 1966)
17
3.2 Metabolismus kvasinek Soubor všech reakcí probíhajících v živých organismech, zahrnující přeměnu látek i energie, označujeme souhrnně jako metabolismus. Rozlišujeme metabolické procesy: - Katabolické (rozkladné), při kterých se za současného uvolnění energie štěpí složitější látky na jednodušší, jde o děje exergonické, probíhající většinou jako oxidace substrátu. - Anabolické (syntetické), při kterých za současného spotřebování energie vznikají z jednodušších látek látky složitější, jde o děje endergonické, probíhající většinou jako redukce substrátu. (Benešová et. al., 2003) 3.2.1 Dýchací řetězec Většina heterotrofních organismů získává hlavní podíl (asi 90 %) energie, uložené ve struktuře molekul živin, během procesu zvaného respirace neboli dýchání. Metabolický děj respirace se skládá z vlastního transportu elektronů, označovaného jako respirační řetězec, a ze spřaženého procesu oxidační fosforylace, tj. výroby adenosintrifosfátu (ATP). Aerobní respirace spočívá v transportu elektronů z organických substrátů, jako jsou glukosa nebo mastné kyseliny, na molekulový kyslík, jako terminální akceptor za vzniku vody. Aerobní dýchací řetězec je lokalizován v buněčných organelách mitochondriích. (Zehnálek, 1999) 3.2.2 Zdroje uhlíku Během kvašení kvasinky vytvářejí zásobní sacharidy glykogen a trehalosu. Glykogen představuje zdroj energie při hladovění kvasnic i pro počáteční fázi syntézy lipidů. Trehalosa se považuje za významný antistresový faktor pivovarských kvasinek, její obsah se proto může použít k stanovení vitality kvasnic. (Basařová et. al., 2010) 3.2.3 Zdroje dusíku Nejsnáze
využitelnými
zdroji
dusíku
pro
kvasinky jsou
amonné
ionty
a aminokyseliny, zejména kyselina glutamová a glutamin. Pouze některé kvasinky umí využívat také dusičnany či dusitany, vždy však pouze za nepřítomnosti výhodnějších zdrojů dusíku v prostředí. (Janderová, Bendová, 1999) 18
3.2.4 Kyslík Kvasinky jsou fakultativně anaerobní mikroorganismy, což znamená, že mohou sacharidy využívat oxidačním i fermentačním metabolismem. Z počátku je oxidační metabolismus blokován vysokou koncentrací sacharidů a kyslík mizí z mladiny během několika hodin. Protože většina kvašení probíhá anaerobně, je vliv i nepatrných stop kyslíku na kvašení dobře patrný. (Basařová et. al., 2010) 3.2.5 Glykolýza Glykolýza začíná fosforylací molekuly glukosy (polysacharidy se na glukosu nejprve štěpí) postupně až na difosfohexosu. Na to se spotřebují dvě molekuly ATP. Difosfohexosa se štěpí na dvě molekuly triosafosfátu. Při jejich přeměně na molekulu pyruvátu se uvolněným fosfátem fosforylují dvě molekuly ADP na ATP a uvolní se dva atomy vodíku, které redukují dvě molekuly NAD+. (Vacík et. al., 1999) Pyruvát následně vstupuje do dalších reakcí: - Za anaerobních podmínek je pyruvát dále zpracováván cestami souhrnně označovanými jako kvašení (fermentace), nejčastěji vzniká: Etanol – probíhá u některých mikroorganismů jako tzv. etanolové kvašení. (Benešová et. al., 2003) Kvasinky za anaerobních podmínek nejprve odštěpují oxid uhličitý z pyruvátu, tak vznikne acetaldehyd a ten je teprve redukován NADH. Konečným produktem těchto reakcí je etanol. (Vacík et. al., 1999) - Za aerobních podmínek (při dostatku kyslíku) podléhá pyruvát oxidační dekarboxylaci za vzniku acetylkoenzymu A (acetyl-CoA), který vstupuje do Krebsova cyklu. (Benešová et. al., 2003) Mezi fermentujícími mikroorganismy, patří kvasinky nepochybně k nejdůležitější skupině, využívané pro komerční účely. Fermentačními procesy mohou kvasinky využívané v potravinách změnit původní materiál organolepticky, fyzicky a nutričně a pro tyhle účely jsou využity již tisíciletí v pekárenství a výrobě alkoholických nápojů. (Querol, Fleet, 2006) Důležití činitele ovlivňující činnost kvasinek a tím i průběh kvašení jsou pH, teplota, koncentrace substrátu a přítomnost inhibičních látek. (Dudáš, Pelikán, 1989)
19
3.2.6 Krebsův cyklus Krebsův cyklus (cyklus trikarboxylových kyselin, citrátový cyklus) je sled reakcí, při kterých je acetylkoenzym A odbouráván na oxid uhličitý a redukované koenzymy (NADPH + H+, FADH2), které dále vstupují do dýchacího řetězce. Probíhá v matrix mitochondrií. Acetylkoenzym A se v Krebsově cyklu váže na oxalacetát za vzniku kyseliny citrónové, která v dalších krocích postupně ztrácí 2 uhlíky za vzniku 2 molekul CO2 (dekarboxylace) a vodíky (dehydrogenace) za vzniku NADPH + H+, FADH2 a obnovení oxalacetátu, který opět vstupuje do Krebsova cyklu. (Benešová et. al., 2003)
CO2 Přetlak CO2 inhibuje metabolismus kvasinek a jejich životaschopnost. S volnými aminoskupinami bílkovin vytváří karbamáty a ovlivňuje tím jejich strukturu a funkci. CO2 inhibuje některé enzymy a aktivuje jiné. Výtěžek buněk, růstová rychlost a konečná koncentrace mnoha senzorických aktivních látek se snižuje se stoupajícím množství CO2 během kvašení. Přetlak CO2 může být také příčinou zvětšení velikosti buněk. Různé koncentrace CO2 mohou ovlivnit fermentaci, protože existuje přímé propojení adenylátcyklázové aktivity a glykolýzy. Vysoké hladiny CO2 indukují u nerostoucích pivovarských kvasinek stresové odpovědi. Snížení koncentrace rozpuštěného CO2 při manipulaci s kvasinkami je tedy vhodné pro zachování jejich vitality. (Sigler, Matoulková, 2011)
3.2.7 Teplota Teplota patří k nejvýznamnějším vnějším faktorům ovlivňujícím mikroorganismy. Nízké teploty, blížící se 0 oC, zpomalují metabolismus a všechny životní projevy mikroorganismů a prodlužují tím životnost buněk při hladovění. Rychlé zmrazení buněk (na -30 oC a níže) a jejich udržování na této teplotě vede k zastavení veškerého metabolismu a prodlužuje životnost buněk na téměř neomezenou dobu. Teploty vyšší než optimální teplota růstu, také zpomalují metabolismus mikroorganismů, neboť poškozují buňku a její enzymy. Zvýšením teploty asi o 25 oC nad teplotu optimální se za poměrně krátkou dobu mikroorganismy usmrtí. (Šilhánková, 2002) Kvasinky rostou podle Görner, Valík (2004) v širokém rozmezí teplot (0 – 45 oC), určité druhy dokonce i při -10 oC.
20
Tab. č. 1: Teplotní limity pro růst kvasinek. (Querol, Fleet, 2006) Tepelné domény
Definice
Příklady kvasinek
Psychrofilní
Kvasinky schopné růst
Leucospiridium ssp. (e.g L.
mezi 5 až 18 oC. Obligátně
frigidum). Torulopsis spp.
psychrofilní dosahují
(e.g. T. psychrophila)
teplotních limitů nad nebo pod 20 oC Mezofilní
Kvasinky rostoucí v limitu Převážná od 0 oC do 48 oC
Termofilní
většina
druhů
kvasinek
Minimální teplota pro růst Candida sloofii, je od 20 oC
Cyniclomyces gluttulatus, Saccharomyces telluris, Torulopsis bovina
Thermorezistentní kvasinky jsou výhradně askosporogenní, tzn. tvořící askospory. Stupeň odolnosti těchto kvasinek závisí značně na počtu askospor v určitém substrátě, které se právě vyznačují odolností vůči vyšší teplotě. Patří k nim zejména druhy Saccharomyces bailii, S. cerevisiae, S. chevalieri, S. uvarum, Kluyveromyces bulgaricus a K. cicerisporus. (Klaban, 2001)
3.3 Kvasinky v potravinářství Kvasinky mají v potravinářské technologii dvojitý význam, jako technologicky využívané mikroorganismy ve fermentačním průmyslu při výrobě piva, vína, lihu, kvasnic; v potravinářském průmyslu při výrobě pekařských produktů, ale i jako škůdci masa, ryb, drůbeže, výrobků studené kuchyně, mléčných produktů, fermentovaných poživatin, výrobků s vysokým obsahem cukru apod. (Görner, Valík, 2004)
21
Tab. č. 2: Hlavní využití kvasinek. (Okafor, 2007) Využití
Druhy
Pekařství
Saccharomyces cerevisiae
Vaření piva
Sacch. uvarum (Sacch. cerevisiae), Sacch. cerevisiae
Potravinářské a krmné kvasinky
Candida tropicalis, Candida pseudotropicalis, Candida utilis, Sacch. cerevisiae, Kluyveromyces fragilis (Sacch. fragilis)
Krmné kvasinky
Candida lipolytica
Vinné kvasinky
Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoides
Vinné kvasinky (šumivá vína)
Sacch. bayanus
Alkoholový průmysl/lihový
Sacch. cerevisiae (Sacch. fragilis se syrovátkou)
Produkty kvasinek (biochemické)
Sacch. cerevisiae
3.3.1 Saccharomyces cerevisiae Je pivní, vinná, lihovarnická (pálenková) a pekařská kvasinka. Fermentuje glukózu, galaktózu, sacharózu, maltózu, rafinózu. Laktózu a dusičnan neasimiluje. (Görner, Valík, 2004) Tvoří většinou krátce elipsoidní, vejčité nebo protáhlé buňky. Spájení je izogamní a askospory jsou kulovité až elipsoidní a jsou po 1-4 v asku. Některé vinařské kmeny mají protáhlé elipsoidní buňky. U kmenů používaných pro výrobu pekařského droždí nebo piva se vyžaduje vyrovnanost tvaru (vejčitý nebo krátce elipsoidní) a velikost buněk a stálost jejich technologických vlastností. Stálé kmeny byly v průběhu let získány tím, že byly prakticky vyselektovány buňky s poškozenou sporulační schopností, neboť sporulace a pohlavní rozmnožování vůbec je největším zdrojem proměnlivosti kultur eukaryotních mikroorganismů. (Šilhánková, 2002)
22
Obr. 2: Saccharomyces cerevisiae (WWW.HARRISONMACSAM.PBWORKS.COM). 3.3.1.1 Využití při výrobě piva Pivovarské kvasinky používané k zakvašování mladiny musí být naprosto zdravé, biologicky čisté a fyziologicky v bezvadném stavu. Takové kvasinky se vyznačují velkou kvasivou mohutností, v mladině rychle rozkvašují, dobře ji zkvašují a zároveň potlačují rozvoj kontaminačních mikroorganismů. (Tvrdoň, 1976) Kvasinky ovlivňují chemické složení piva, jeho trvanlivost a organoleptické vlastnosti. Přestože je pivo nápoj s dávnou historií, byla souvislost mezi kvašením a kvasinkami prokázána teprve v 19. století. (Bendová, Kahler, 1981) Spodní pivovarské kvasinky S. cerevisiae (carlsbergensis), popř. (uvarum) se používají pří výrobě piva typu ležáků v teplotním rozmezí 7 až 15 oC se sedimentací kvasnic na dně kvasné nádoby. Svrchní pivovarské kvasinky S. cerevisiae se používají při výrobě piv typu Ale i dalších druhů piv s teplotním rozmezím 18 až 22 oC, často s vynášením kvasnic do kvasničné deky. Mezi základní rozdíly mezi spodními a svrchními kvasinkami patří: složení genetického materiálu; rozdílné složení buněčných stěn, zjištěné imunochemickými či biochemickými metodami; stupeň zkvašování α-rafinózy; obtížná sporulace spodních kvasinek; rozdílné technologicky významné vlastnosti; vyšší maximální teplota růstu u svrchních kvasinek; 23
vyšší tepelná odolnost svrchních kvasinek; (Basařová et. al., 2010) 3.3.1.2 Využití při výrobě lihu Od lihovarských kvasinek se očekávají velmi často rozličné vlastnosti, neboť i samo kvašení probíhá za velmi rozmanitých podmínek. Už substrát bývá různý – může jím být melasa, bramborová zcukřená zápara nebo i sulfitový výluh, dřevný hydrolyzát apod. Často se požaduje hluboké prokvašení i při vyšších teplotách, rychlé a hluboké prokvašování vysokoextraktivních substrátů apod. V sulfitových lihovarech a také v bramborových lihovarech se velmi často používá ke kvašení kvasinek z drožďáren. Hospodářské bramborové lihovary je nasazují jako prodejné droždí. Sulfitové lihovary je nejprve nasadí a po delší době pěstování, osvěžování a vracení se selekcí získávají kvasinky, které jsou dokonale přizpůsobeny tomuto prostředí. (Kocková-Kratochvílová, Kutková, 1961) Některé kvasnice whisky jsou kříženci mezi S. cerevisiae a S. cerevisiae var. diastaticus, které díky činnosti glukoamylózy umožňují hydrolýzu a fermentaci maltotetrózy a nízkomolekulárních maltodextrinů. Kmeny musí být odolné vůči stresu (především na etanol a teplotu) a produkovat žádoucí kongenery (estery, organické kyseliny, aldehydy, vyšší alkoholy atd.). (Walker, 1998) 3.3.1.3 Využití při výrobě vína Společenství kvasinek a kvasinkových mikroorganismů na hroznech ve značné míře závisí od ekologických podmínek vinohradnické oblasti. Je výsledkem dlouhodobého složitého procesu adaptace rozličných faktorů, např. půdními a klimatickými podmínkami v širokém smyslu a místními podmínkami pěstování révy v užším smyslu. Na kvalitativní a kvantitativní složení mikroflóry má vliv i biologický zásah člověka, např. aplikace pesticidů (fungicidů, herbicidů, insekticidů atd.) v ochraně révy. (Minárik, Navara, 1986)
24
Tab. č. 3: Koncentrace etanolu, glycerolu, acetaldehydu, kyseliny octové a kyseliny jantarové produkováno různými druhy kvasinek. (Doyle, Beuchat, Montville, 2001)
Kvasinky
Saccharomyces
Etanol
Glycerol
Acetaldehyd Kys.
Kys.
(%)
(mg/ml)
(µg/ml)
octová
jantarová
(mg/ml)
(mg/ml)
6-23
3.7-6.8
15-30
0.1-2.0
0.6-1.7
2-7
5.5-8,2
8-54
0.1-1.2
0.3
cererevisiae Kloeckera apiculata Candida stellata
6-7
1.08-1.3
Pichia anomala
0.5-5
0.2-2.2
3.2-8.1
1.6
Metschnikowia
2-4
2.7-4.2
23-40
0.1-0.2
0.2
pulcherrima Zygosaccharomyces 5-13
0.1-0.3
1.6
bailii Pichia
0.1-0.5
4.1-5.4
2.9
0.3
membranifaciens Brettanomyces
9-12
1-7
bruxellensis Kvasinky využívají šťávu z hroznů jako substrát pro jejich růst a tím vytvoří konečné metabolické produkty, které jsou vylučovány do vína. Hlavními produkty jsou oxid uhličitý a etanol, v menší míře pak glycerol a kyselina jantarová (viz. Tab. č. 3). Kromě toho jsou produkovány těkavé kyseliny a sekundární metabolity v malých částech, které společně přispívají k senzorické kvalitě vína. Tyto látky obsahují širokou škálu organických kyselin, vyšších alkoholů, esterů, aldehydů, ketonů, sloučenin síry a aminů. (Doyle, Beuchat, Montville, 2001) 3.3.1.4 Využití v pekařství Pekařské droždí se připravuje aerobní fermentací okyselených melasových zápar přiživených amonnými solemi a fosfátem. Zápary se provzdušňují sterilním stlačeným vzduchem přiváděným ke dnu kvasných tanků a aerobní metabolismus je zajištěn opakovanými přítoky melasové zápary, takže se buňky rozmnožují za nízkých 25
koncentrací cukrů v prostředí. (Šroubková, 1996) Přesto se při výrobě pekařského droždí produkuje i určité množství etanolu vzniklého v důsledku částečné hexosové represe dýchání. (Šilhánková, 2002) Ačkoliv se kmeny S. cerevisiae obvykle používají jako pekařské droždí, hledání alternativních druhů chleba pokračuje. Torulaspora Delbrueckii byla prohlášena za více tolerantní vůči mrazu než S. cerevisiae. (Deák, 2008)
3.3.2 Pichia Pichia je druhým největším rodem kvasinek, zahrnující více než 100 druhů. Jsou fylogeneticky i fenotypově různorodé, včetně druhů se sporami kulovitými nebo kloboukovitými, kvašení je buď silné, nebo žádné (Deák, 2008) Vyskytují se jako kontaminace piva a vína, hlavně ve špatně uzavřených lahvích, kde tvoří křís, tj. křehkou vzlínavou blanku na povrchu kapaliny. Tvoří velmi protáhlé vegetativní buňky s pseudomyceliem. Křísotvorný druh je také rod Hansenula, který je ale schopen využívat NO3- jako zdroj dusíku, kdežto Pichia dusičnany nevyužívá. (Šilhánková, 2002) Křísotvorné kvasinky často produkují ve větším množství různé estery, které jsou zdrojem cizích pachů. K tvorbě pachových produktů také přispívá vlastní rozklad kvasinkových buněk. Tím dochází k znehodnocení substrátu nebo výrobku po senzorické stránce. (Klaban, 2001)
3.3.3 Candida Candida je rod, který obsahuje na 160 druhů. Zahrnuje nekvasící druhy i druhy se silnými kvasnými schopnostmi. Na vhodných půdách tvoří pseudomycelium až pravé mycelium. Některé druhy slouží k přípravě krmného droždí, vyráběného z melasy i různých odpadních materiálů. K tomuto účelu se nejčastěji používá druh Candida utilis. Candida boidinii využívá metanol jako zdroj uhlíku a energie; byla navržena pro výrobu krmného droždí z tohoto substrátu, který lze získat poměrně levně chemickou oxidací methanu ze zemního plynu nebo bioplynu. Candida kefyr využívá také laktózu. Některé kmeny mohou být podmíněně patogenní. Mnohem nebezpečnější jsou však další patogenní druhy. V prvé řadě je to druh Candida albicans, který může způsobovat onemocnění (kandidózy) kůže a nehtů především u lidí pracujících s půdou nebo
26
s ovocem a cukernými nálevy. Může však zachvátit také vnitřní orgány a vést ke smrti, není-li včas rozpoznán. (Šilhánková, 2002) Je typickým druhem střevní a ústní mikroflóry. Zajímavou vlastností Candida albicans je nepravidelná délka a struktura jejích chromozomů. Příčinou je polymorfismus délky chromozomů, translokace některých částí, chybějící nebo naopak přebývající chromozomy (např. trizomie). Tyto změny chromatinu vedou k odchylkám v celkovém vzhledu, brání se tak proti imunitní odpovědi organismu. Tato kvasinka je odolná vůči nižšímu pH, které si vytváří při kvašení cukrů. Doposud není s jistotou znám žádný faktor odpovědný za virulenci kmenů C. albicans. Nejčastějším klinickým projevem kandidózy je moučnivka, vyznačující se splývajícími bílými povlaky na sliznici úst a jazyka. Druhou nejčastější infekcí je kandidóza vaginální. Postižené mohou být i sliznice zažívacího traktu. Na kůži se uplatňuje hlavně pod prsy, v podpaží, tříslech, mezi prsty a na zadečku nepřebalených kojenců. (Sládková, Hlaváčová, 2011) Nepatogenní druhy rodu Candida se vyskytují jako nežádoucí kontaminace pekařského droždí. (Šilhánková, 2002) Candida lipolyticum může občas zkazit pekařské smetany ke šlehání, kde byla přidána sacharóza. (Fernandes, 2009)
Obr. 3: Candida albicans (WWW.EN.WIKIPEDIA.ORG).
27
3.3.4 Schizosaccharomyces Jedná se o jediný rod, který se rozmnožuje dělením za tvorby přepážky a netvoří přitom mycelium. Vyznačuje se obdélníkovitými buňkami, dobrými kvasnými schopnostmi a nepřítomností hexosové represe dýchání. Významným druhem je Schizosaccharomyces pombe. Obsahuje homothalické a heterothalické kmeny a slouží jako modelový organismus pro genetické práce. Používá se v Africe pro přípravu alkoholického nápoje z prosa, nazývaného ,,pombe“. Ve vinařství slouží k odkyselení vín, neboť využívá přítomnou jablečnou kyselinu. (Šilhánková, 2002)
Obr. 4: Schizosaccharomyces pombe (WWW.SCIENCEBLOGS.DE).
3.3.5 Zygosaccharomyces Identifikované druhy Zygosaccharomyces způsobují kažení medu a dalších výrobků z cukru. Na základě porovnání deformace z jaderné DNA byly Z. bailii, Z. mellis a Z. rouxii identifikovány jako druhy z rodu Zygosaccharomyces odpovědné za kažení cukerných produktů. Ovocné šťávy jsou náchylné k znehodnocení velkým množství kvasinek, ale druhy Z. bailii, Z. rouxii, Z. mellis a Z. lentus jsou hlavními druhy, které se koncentrují v ovocných šťávách. Nicméně jiné druhy Zygosaccharomyces, stejně jako druhy Torulaspora (např. T. delbrueckii), byly izolovány z ovocné šťávy a tyto druhy lze nalézt také v jiných produktech obsahujících cukr. (Blackburn, Clive de W., 2006)
28
Obr. 5: Zygosaccharomyces bailii (WWW.UK.WIKIPEDIA.ORG).
3.3.6 Yarrowia Tento rod s jediným druhem Y. lipolytica byl úspěšně použit pro produkci biomasy z n-alkanů ropy pro krmivářské účely a pro biotechnologické čištění ropy. (Šilhánková, 2002)
3.3.7 Brettanomyces Tyto kvasinky produkují kyselinu z glukózy pouze za aerobních podmínek. Nejrozšířenější je B. intermedius, může růst při pH 1,8. Způsobuje kažení piva, vína, nealkoholických nápojů a okurek. (James, 2000)
3.3.8 Kluyveromyces Od rodu Saccharomyces se liší hlavně tím, že nemá hexosovou represi dýchání a že vegetativní fáze je převážně haploidní, takže spájení buněk většinou těsně předchází tvorbě asků. Obsahuje jak homothalické, tak heterothalické kmeny. Kluyveromyces marxianus se svými dvěma variantami, a to var. marxianus a var. lactis, zkvašují laktózu a jsou součástí tzv. kefírových zrn, tj. konglomerátu kvasinek a bakterií, používaného při výrobě kefíru. Jednotlivé varianty se liší tvarem askospor. (Šilhánková, 2002)
29
Obr. 6: kolonie Kluyveromyces marxianus (WWW.COMMONS.WIKIMEDIA.ORG).
3.3.9 Metschnikowia Tento rod tvoří velmi protáhlé až jehlovité askospory umístěné po 1-2 v asku, který je kyjovitě protáhlý. Některé jeho druhy mohou být parazity obratlovců, některé se vyskytují na rostlinách a ovoci. (Šilhánková, 2002)
3.4 Působení kvasinek na kaţení potravin Kvasinky a plísně mohou růst při pH pod 3.8. Proto se jedná o zdaleka nejdůležitější zdroje mikrobiálních vad. (Walstra et. al., 1999) Kažení potravin kvasinkami se projevuje produkcí slizových látek, kyselin (fermentací sacharidů), plynu, alkoholu, změnami chuti a vůně, pigmentací povrchu potravin. Růst a množení závisí na vnitřních charakteristikách potravin a způsobu jejího zpracování a skladování. Tyto různé parametry se vzájemně ovlivňují a celkový důsledek jejich kombinovaného působení je zpravidla vždy vyšší, než výsledek působení každého z jednotlivých parametrů. (Komprda, 1997) Mohou se vyskytovat v ovzduší výrobního závodu a do produktu se dostanou z rukou pracovníka. Vysoký počet znečišťujících látek se může vyskytovat na výrobním zařízení. Proto by měla být věnována zvláštní pozornost kontaminaci kvasinkami během celého řetězu zpracování 30
od surovin až po konečný výrobek, aby se zabránilo jeho znehodnocení a kontrolovalo se možné kažení během výrobního procesu. (Blackburn, Clive de W., 2006) 3.4.1 Mlékárenský průmysl 3.4.1.1 Mléko Mléko je jednou z nejrizikovějších potravin, ve které velice často dochází k mikrobiální kontaminaci. Má příznivé pH (6,4-6,8), vodní aktivitu (asi 0,99) a obsah živin. Ten je tvořen tukem (cca 3%), bílkovinami (cca 3,2%), laktózou (cca 5%) a minerálními látkami (cca 1%). Mléko je ideální živnou půdou pro řadu saprofytických i patogenních mikroorganismů. (Hrubý et. al., 1984) Čerstvé, syrové mléko obsahuje různé populace kvasinek, v závislosti na hygieně dojení. Syrové mléko umožňuje v mrazících teplotách růst psychrotrofních kmenů. Kvasinky v pasterovaném obchodním mléce pocházejí ze sekundární kontaminace. V průzkumu vzorků pasterovaného mléka, Fleet a Mian (1987) detekovali Db. hansenii, Klu. marxianus, Cry. flavus a Cry. diffluens. Cocolin a kolektiv (2002) použili molekulární techniku, identifikovali 12 druhů kvasinek v syrovém mléce: hlavními izoláty, v pořadí četnosti výskytu byly Klu. marxianus (20%), C. pararugosa (19%), C. parapsilosis (13%), Cry. curvatus (11%), C. catenulata (9%) a C. zeylanoides (9%). (Deák, 2008) U zahuštěného slazeného mléka způsobují zhoršení obvykle osmofilní kvasinky, z nichž většina patří do rodu Torulopsis. Kvasinky často způsobují formování plynu, ovocnou chuť a koagulaci z proteinu. Koagulace může vyplývat z tvorby etanolu. V důsledku toho se výrobek stává nepřijatelný. Kvasinky nezačnou růst snadno, zejména pokud je koncentrace cukru vysoká. Může tedy trvat i několik týdnů, než kvasinky postřehneme. (Walstra et. al., 1999) 3.4.1.2 Sýry Kvasinky mohou způsobit kažení čerstvých sýrů, jako tvaroh, během skladování, což vede k tvorbě plynu, příchutě a zápachu. Kvasinky se také mohou množit na povrchu zralých sýrů, zvláště pokud je povrch mokrý, začne se formovat sliz. Nejčastější druhy kvasinek působící kažení sýrů jsou Candida ssp., Yarrowia lipolytica, Pichia ssp., Kluyveromyces marxianus, G. candidum a Debaromyces hansenii. (Fernandes, 2009) 31
3.4.1.3 Jogurty Jogurt je jedním z nejdůležitějších mléčných výrobků s ohledem na znehodnocení kvasinkami, které jsou hlavní příčinou kažení konečného výrobku. Čerstvě fermentované jogurty jsou obvykle bez kvasnic, protože jeho složky jsou tepelně opracovány (vysoká pasterizace) před kvašením a kvasinky jsou působením tepla zničeny. Kvasinky v jogurtu můžou pocházet buď z kontaminované látky, jako je ovoce a ořechy přidané do jogurtu nebo z obalu či nehygienického zařízení. Převažuje Candida pulcherrima, Candida parapsilosis, Candida magnoliae a Candida krusei. (Lacroix, 2011) 3.4.1.4 Máslo Kvasinky mohou také způsobit kažení másla. Lipolytické druhy, jako Rhodotorula, mohou růst na povrchu v chladných teplotách a mohou snášet vysoké koncentrace soli. Mezi další kvasinky spojené se znehodnocením patří Candida lipolytica, Torulopsis a Cryptococus. (Fernandes, 2009) 3.4.2 Masné produkty Kvasinky jsou malou, ale trvalou součástí přírodní mikroflóry na mase. Schopnost některých kvasinek růst při nízkých teplotách, vysoké koncentraci soli a za sníženého kyslíku jim umožňuje množení v chlazeném, uzeném a vakuově baleném mase a masných výrobcích. Kvasinky však nicméně nejsou považovány za velmi významné při kažení těchto potravin. (Deák, 2008) Na mase se vyskytují nejčastěji kvasinky rodu Torulopsis, Saccharomyces a Debaromyces. Značně kontaminované bývají marinované rybí výrobky (někdy až miliónové hodnoty v 1 g), a to kvasinkami druhu Pichia fermentans (byla zaznamenána i lehká průjmová onemocnění), ale i jinými zástupci rodu Pichia, dále zástupci rodů Torulopsis, Saccharomyces a Candida. (Hrubý et. al., 1984) Výskyt kvasinek na mraženém mase je další známkou mezního skladování, nesmí mít nepříznivé senzorické změny, ale vizuální přijatelnost může být ohrožena výskytem kolonií, zvláště pak na povrchu tuku. Nevzhledné hnědé skvrny vznikají v důsledku
32
ukládání hnědých pigmentů hemu, jejich výskyt bývá hlášen v okolí kvasinkových kolonií na tuku z hovězího masa při skladování. (Fernandes, 2009) 3.4.3 Nápoje Znehodnocení výrobků z ovocných šťáv kvasinkami je způsobeno mnoha druhy, které zahrnují Brettanomyces, Kloeckera, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Torulopsis a Zygosaccharomyces. (Heredia et. al., 2009) Jako pivu škodící kvasinky jsou zjišťovány Sacch. diastaticus, Saccharomyces exiguus a různé druhy rodu Pichia, Hansenula a Candida. (Hrubý et. al., 1984) Ve víně by nemělo být více kvasinek než 100 . ml-1. Pokud se kvasinky vyskytují, jedná se o Saccharomyces cerevisiae, S. oviformis, S. carlsbergensis, Candida mycoderma, Torulopsis utilis, Brettanomyces sp., Pichia sp. a jiné. (Hrubý et. al., 1984) S kvašením nápojů, vyvolaným kvasinkami, je spojeno snížení obsahu cukru, zvýšení obsahu oxidu uhličitého a zvýšení etanolu. Při nadměrném zvýšení tlaku CO2 může dojít až k prasknutí láhve. Kromě toho mohou při rozvoji kvasinek vznikat produkty nepříjemné chuti a pachu. Při množení kvasinek může dojít ke vzniku zákalu a usazeniny. Kalné nápoje se mohou vyčiřit. Nápoje se znaky kvašení jsou nepoživatelné, dodatečná možnost odstranění této vady neexistuje. (Hrudková, Markvart et. al., 1989)
3.4.4 Pochutiny Majonéza,
salátové
dresinky a
kyselé
přísady jako
je
hořčice,
kečup,
jsou spotřebovány v různých formách. Nízké pH těchto výrobků, dosaženo použitím octa, citrónové šťávy nebo méně používaných složek, je hlavním faktorem, závisejícím na prevenci nebo zpomalení růstu většiny mikroorganismů. Kyselino-tolerantní kvasinky, zejména kmen Zygosaccharomyces bailii, jsou schopny metabolizovat benzoát. Pichia, Torulopsis, a Debaryomyces také přispívají ke znehodnocení těchto výrobků. (Heredia et. al., 2009)
33
3.5 Boj proti neţádoucím kvasinkám V boji proti činnosti nežádoucích mikroorganismů v potravinářském i kvasném průmyslu se používají fyzikální i chemické prostředky a jejich kombinace. Navíc je zapotřebí zachovávat přísné hygienické zásady, aby nedošlo ke kontaminaci potravin patogenními ani jinými mikroorganismy, ani k jejich pomnožení v potravinách. Pracovníci musí dbát na čistotu rukou a oděvu. Pokrývka hlavy – nebo alespoň čelenka – má zabraňovat padání vlasů a prachu z nich do zpracovaného materiálu. Základním předpokladem hygieny potravinářských provozů jsou četná, vhodně umístěná umyvadla s proudící teplou vodou, mýdlem, horkovzdušným osušovačem rukou nebo s často vyměňovanými ručníky. (Šilhánková, 2002) 3.5.1 Mechanické prostředky K mechanickým prostředkům boje proti mikroorganismům náleží odstraňování prachu, nečistot a zbytků organické materiálu z provozoven, strojů a ostatních zařízení, stěn i podlah. Důležité je dokonalé odstraňování zbytků organického materiálu také z méně přístupných míst (např. z ohybů potrubí), aby se tam nevytvořila ložiska, v nichž by se mikroorganismy silně pomnožovaly, a odtud distribuovaly do ostatních míst. Mechanické zákroky se kombinují s fyzikálními a chemickými prostředky: při omývání horkou vodou se používají detergenční prostředky (tenzidy), které mají vysokou smáčivost, emulgují odstraňované zbytky a ničí přítomné mikroorganismy. Důležitým mechanickým prostředkem je také ventilace provozních místností, jež odstraňuje zvířený prach nebo páru, která by jinak kondenzovala na stěnách, stropech i zařízeních a poskytovala možnost rozvoje mikroorganismů. Nejvhodnější je klimatizace, při níž do provozu přichází mikrobiologicky čistý vzduch, upravený na žádanou teplotu a vlhkost, za současného odsávání vzduchu znečištěného parami a prachem. (Šilhánková, 2002)
34
3.5.2 Fyzikální prostředky Z fyzikálních prostředků se nejvíce uplatňuje vlhké teplo, ať už do 100 oC při pasteraci, teplé konzervaci kyselých potravin (o pH ˂ 4,0), nebo vaření kyselých zápar v drožďárnách, nebo tlaková pára, používaná např. pro konzervaci nekyselých potravin, sterilací médií a propagačního zařízení v kvasném průmyslu (tj. v pivovarství, lihovarství a drožďářství). Filtrace slouží hlavně k odstranění mikroorganismů ze vzduchu používaného pro klimatizaci a také pro sterilaci vzduchu určeného k aeraci při fermentačních výrobách (drožďářství, výroba antibiotik). Vzduch zbavených prachu mechanickými filtry se vede válcovitými nádobami s filtračním materiálem, na němž se mikroorganismy zachycují. U klimatizačního zařízení je vzduch veden obyčejně přes filtry s plátěnými vložkami napuštěnými dezinfekčním prostředkem. Vzduch v provozovnách se také někdy čistí elektrostatickým sráţením částeček prachu a přítomných mikroorganismů tak, že aerosol vystaví vlivu silného elektrického pole. Ultrafialové záření se používá především pro povrchovou sterilaci a sterilaci prostorů, jež jsou z mikrobiologického hlediska zvlášť choulostivé, jako jsou očkovací boxy, prostory aseptického balení potravin (např. plnění moštů sterilovaných mimo obal) apod. K fyzikálním prostředkům boje proti činnosti mikroorganismů v potravinářském průmyslu náleží také sníţení vodní aktivity v potravinách a jejich surovinách sušením nebo odpařováním a dále také uchováním potravin a jejich surovin za nízkých teplot. (Šilhánková, 2002) 3.5.3 Chemické prostředky Chemické prostředky používané v potravinářském nebo kvasném průmyslu v boji proti nežádoucím mikroorganismům nesmějí nepříznivě ovlivňovat chuť potravin, výrobní
prostředí
(např.
zápachem),
zdraví
ani poškozovat výrobní zařízení. (Šilhánková, 2002)
35
zaměstnanců
nebo
konzumentů
Konzervanty Mezi nejčastější chemické konzervanty potravin řadíme slabé organické kyseliny, jako octová, mléčná, benzoová a sorbová kyselina. Ty mohou být vyrobeny buď chemickou syntézou nebo biologickou fermentací. (Lacroix, 2011) V potravinářském průmyslu se daleko více než samotná kys. benzoová používají její soli zvané benzoany čili benzoáty. Jsou vhodné k potlačení růstu kvasinek a plísní v prostředí s nižším pH než 4,0. Kyselina sorbová působí fungistaticky, také potlačuje růst kvasinek a plísní. Přidává se do kyselých potravin a to v koncentracích 200-800 mg kyseliny na 1 kg dané potraviny. (Klaban, 2001) Anorganické sloučeniny Z anorganických sloučenin mají mikrobicidní účinek jak silné kyseliny, tak i silné zásady (NaOH, KOH), neboť poškozují buněčnou stěnu i cytoplazmatickou membránu buněk. Pro svůj agresivní účinek na zařízení se však uplatňují velmi vzácně. Častěji se používá hašené vápno (Ca(OH)2), hlavně pro dezinfekci stěn, kvasných kádí apod. Zásaditou reakcí působí také uhličitan sodný (Na2CO3) nebo fosforečnan sodný (Na3PO4) a polyfosfáty přidávané do horkých mycích roztoků hlavně k odstranění zbytků tuků a bílkovin. (Šilhánková, 2002) Z anorganických kyselin se nejčastěji používá kyselina dusičná, fosforečná, sírová, amidosírová a chlorovodíková. Kyselina dusičná se používá často, je relativně laciná a dobře čistí. Nevýhodou je poměrně značná agresivita vůči řadě čištěných povrchů. Kyselina fosforečná má vynikající čistící schopnosti a je podstatně méně agresivní. Kyselina sírová je často používána k neutralizaci hydroxidu přeneseného do vodních zón myček lahví, ale vyskytuje se i ve formulacích kyselých přípravků pro CIP-sanitaci. Další anorganické kyseliny se používají méně, většinou pro speciální úkoly. (Basařová et. al., 2010) Organické sloučeniny Klasickými baktericidními prostředky jsou fenol a kresoly. Jsou účinné v 2,5 až 5% roztoku. Pro svůj pronikavý zápach jsou však v potravinářském průmyslu nevhodné i pro dezinfekci prostor a podlah. (Šilhánková, 2002) Organické kyseliny mají řadu vynikajících vlastností vhodných pro moderní sanitační přípravky. Mají výrazně nižší korozní účinky než anorganické kyseliny, ale jsou dražší. Hydroxykyseliny se používají 36
jako kyselé sekvestrační přísady a jsou plně biologicky odbouratelné. (Basařová et. al., 2010) 3.5.4 Čištění Čistící přípravky odstraňují z povrchů kromě organických a anorganických nečistot i mikroorganismy. Jejich účinnost však nebývá stoprocentní, proto se k dosažení sterility používá ještě následný dezinfekční krok. (Basařová et. al., 2010) Podle moţnosti odstranění lze nečistoty rozdělit do tří skupin: - Rozpustné ve vodě: např. mléčný cukr, různé soli. - Rozpustné v roztoku čisticího prostředku; při tom může probíhat určitá chemická reakce: - v kyselém prostředí dochází k odstranění nečistot na bázi minerálních látek - v alkalickém prostředí nečistot na bázi tuků, mastných kyselin nebo bílkovin. - Nerozpustné. Z hlediska technického provedení probíhá proces čištění ve třech fázích: - Oddělení nečistot
mechanicky
chemicky (spolu s oddělením nečistot dochází ke změně jejich chemických vlastností; např. mastná kyselina → mýdlo)
interakcí s povrchově aktivními látkami (chemické vlastnosti dané nečistoty se nemění).
- Dispergace (disperzní soustava je tvořena dvěma nebo více látkami, z nichž některá tvoří spojitou fázi, disperzní prostředí, ve kterém jsou rozptýleny, dispergovány, látky ostatní). - Zábrana zpětného usazení dispergovaných částic na vyčištěném povrchu; k tomu, aby se částice nečistot, které se dostaly do roztoku, opět neusazovaly zpět, napomáhá pohyb čisticího prostředku (míchání). Kvalitní čisticí prostředek musí mít kromě své čistící schopnosti další nezbytné vlastnosti: - nesmí vykazovat korozivní účinky na čištěné materiály, - musí být dobře rozpustný ve vodě a dobře vodou oplachovatelný, - při skladování se nesmí rozkládat, - musí být snadno analyticky stanovitelný, 37
- musí být ekonomicky dostupný. (Komprda, 2004)
3.5.5 Dezinfekce Veškeré dezinfekční postupy lze rozdělit na fyzikální a chemické. Fyzikální metody dezinfekce využívají biocidních účinků tepla za sucha i za vlhka (dezinfekce horkou vodou nebo parou) a různých typů záření (UV, γ apod.) V pivovarství se fyzikální metody používají např. při horkovodní sterilizaci propagačních tanků, některých typů filtrů, propařování KEG-sudů nebo UV-záření při sterilizaci korunek. Chemické metody dezinfekce využívají biocidní účinky některých chemických sloučenin, které usmrcují mikroorganismy narušením jejich buněčných struktur nebo metabolických pochodů. Účinnost chemické dezinfekce závisí především na: - optimálním výběru dezinfekčního prostředku, - koncentraci aplikačního roztoku, - teplotě, - době působení, - stupni znečištění, - obsahu Ca + Mg, - pH. (Basařová et. al., 2010) Obdobně jako v případech čisticích prostředků i dezinfekční prostředky musí vykazovat některé obecné vlastnosti: - co nejrychlejší devitalizace přítomných, především patogenních mikroorganismů, - široké spektrum účinnosti, - při aplikaci musí být odolné, tedy účinné i v přítomnosti zbytků nečistot, různých iontů a při různém pH prostředí, - optimum účinnosti by měly mít při teplotě 20 – 40 oC, - musí mít současně dobrou čistící schopnost, - nesmí být toxické ani dráždivé, - musí být co nejšetrnější vůči dezinfikovaným materiálům, - nesmí vykazovat nepříjemný zápach, - musí být dobře rozpustné ve vodě, 38
- musí být snadno aplikovatelné a také snadno analyticky stanovitelné, - při skladování by měly být stabilní, - musí mít relativně nízkou cenu. Čištění a dezinfekce musí tvořit logickou souslednost následujících kroků: hrubé očištění povrchu → oplach vodou → aplikace detergentu → oplach vodou → dezinfekce → závěrečný oplach. (Komprda, 2004)
39
4 PRAKTICKÁ ČÁST V rámci odborné praxe byl na Sladařském ústavu Brno proveden pokus na stanovení stupně prokvašení u vybraných odrůd ječmene. V dalším pokusu byly stanoveny počty mikromycet (kvasinek a plísní) v syrovém kozím mléce a sýrech.
4.1 Stanovení stupně prokvašení u vybraných odrůd Charakteristika materiálu Analýza byla provedena u sladinových odrůd Tolar a AF Lucios, uskutečněno ve Sladařském ústavu Brno. Stanovován byl dosažitelný stupeň prokvašení vybraných odrůd denzitometricky.
Princip metody Sladina (mladina, pivo) se zakvasí pivovarskými kvasinkami a nechá se prokvasit způsobem předepsaným pro danou metodu. V procentech se vyjádří rozdíl mezi extraktem původní sladiny (mladiny, piva) a extraktem po prokvašení. Běžné hodnoty dosažitelného stupně prokvašení kongresní sladiny z plzeňského sladu se pohybují v rozmezí 78,0 až 82,0 %. Rozšířená relativní nejistota metody činí 1,3 %. Přístroje a zařízení Buchnerova nálevka (porcelánová) s odsávačkou třepačka denzitometr
40
Chemikálie, roztoky, materiály
kvasnice teploměr Erlenmayerova baňka odměrný válec filtr Schleicher-Schull, průměr 320 mm, 597 1/2 Zpracování vzorku 170 – 200 ± 2 ml kongresní sladiny se odměří do baňky o objemu 250 – 500 ml a zahřeje se na teplotu 90 ± 1 oC, aby se inaktivovaly enzymy a sladina se sterilizovala. Po dosažení požadované teploty se sladina ochladí na laboratorní teplotu (vodovodní vodou) a stanoví se hustota. Odměří se 150 ± 2 ml a přidá se 2,5 ± 0,5 g odsátých kvasnic. Baňka se uzavře kvasnou zátkou, obsah se promíchá a nechá kvasit 72 hodin v termostatu při teplotě 20 oC. Během kvašení se baňka alespoň 1 – 3 krát za den protřepe. Po třech dnech se sladina opatrně slije na filtr, filtrát se 20 ± 1 minutu třepe na třepačce a z filtrátu se stanoví relativní hustota. Výpočet a vyhodnocení
𝐷𝑆𝑃 =
E − 𝐸𝑘 E
.100
kde je DSP – dosažitelný stupeň prokvašení (%) E – hmotnostní zlomek extraktu sladiny před prokvašením (%) Ek – hmotnostní zlomek extraktu sladiny po prokvašení (%) Výsledky se udávají s přesností na 1 desetinné místo. Stupeň prokvašení u vybraných odrůd byl:
Tolar
80,2 %
AF Lucios 75,7 %
41
Pro srovnání, běžné hodnoty dosažitelného stupně prokvašení kongresní sladiny z plzeňského sladu se pohybují v rozmezí 78,0 až 82,0 %. (Ústní sdělení Sladařský ústav Brno) Odrůda Tolar se tedy jeví jako vhodnější pro výrobu sladu.
4.2 Analýza počtu mikromycet v syrovém kozím mléce a sýrech Charakteristika materiálu Pro mikrobiologické analýzy byly použity vždy dva vzorky syrového kozího mléka a čerstvých sýrů ze dvou faremních chovů.
Princip metody Ve vzorcích byly standardními metodami stanovovány počty kvasinek a plísní na Chloramphenicol Glucose Agar (Biokar Diagnostics, France) při 25 °C za 120 h. Pro mikrobiologickou analýzu sýrů byla navážka spolu s fyziologickým roztokem homogenizována 1 min. na homogenizátoru typu STOMACHER. Z homogenizovaných vzorků sýrů a ze vzorků mléka byla následně připravena řada desetinného ředění. 1 ml příslušného ředění byl pak inokulován do sterilních Petriho misek a zalit příslušnou živnou půdou. Po ukončení kultivace byly na jednotlivých Petriho miskách odečteny narostlé kolonie a výsledek vyjádřen v KTJ/g. Pouţité ţivné médium Agar s kvasničným extraktem, glukózou a chloramfenikolem (Biokar Diagnostics, Francie) Složení: kvasničný extrakt 5,0 g, glukóza 20,0 g, chloramfenikol 0,1 g, agar 12,0 g, dest. voda 1000 ml.
42
Příprava: Všechny složky se smíchají s dest. vodou a ponechají několik minut stát, pak se směs zahřívá k varu za častého promíchávání do úplného rozpuštění agaru. Upraví se pH, aby po sterilizaci 121°C 15 min. jeho hodnota činila 6,6 při 25 °C. Vyjádření výsledků Po kultivaci byly z Petriho misek odečteny počty kolonií (KTJ). Výsledné počty mikroorganismů byly poté uvedeny v KTJ/ml, g vzorku. Výsledky a diskuse V tabulce č. 4 jsou uvedeny výsledky analýz počtů mikromycet (kvasinek a plísní) v syrovém kozím mléce a sýrech ze dvou faremních chovů (1- farma Šošůvka, 2 – farma Ratibořice). Tab. č. 4: Počty mikromycet ve vzorcích kozího mléka a sýrů. Kvasinky a plísně celkem
plísně
kvasinky
celkem Geotrichum syrové kozí mléko
kozí sýr
1a
1,1 x 104 9,8 x 103 1,6 x 103
1,1 x 103
1b
3,2 x 103 2,7 x 103 5,0 x 102
ND
2a
5,7 x 102 4,6 x 102 1,1 x 102
1
2b
5,1 x 102 4,5 x 102
68
15
14
ND
1a
32
1b
ND
18 ND
ND
ND
2a
3,9 x 10
3
ND
ND
2b
7,5 x 103 7,5 x 103
ND
ND
3
3,9 x 10
Vysvětlivky 1,2 - faremní chovy, a, b – opakování, ND – nedetekováno Z výsledků je patrné, že počty kvasinek v mléce i sýrech dominovaly nad plísněmi. Ve vzorcích mléka byly zjištěny vyšší počty kvasinek u farmy Šošůvka, a to až 9,8 x 103 KTJ/ml; počty kvasinek v mléce z farmy Ratibořice byly o řád nižší. Opačný 43
trend byl zjištěn u čerstvých kozích sýrů vyrobených z tohoto mléka po jeho pasterizaci. Výrazně vyšší počty kvasinek v sýrech z farmy Ratibořice (až 3,9 x 103 KTJ/g) svědčí o sekundární kontaminaci při výrobě a skladování sýrů. Hlavní příčinou výskytu kontaminujících kvasinek a jiných mikroorganismů na povrchu sýrů je nadměrná vlhkost jejich povrchu. Tento případ může nastat z více příčin. Při zrání sýrů probíhá proteolýza bílkovin, přičemž se může ze sýra uvolňovat voda původní bílkoviny. Z teplotních příčin může u sýrů docházet k "pocení". Vlhkost na jejich povrchu stoupá, netvoří ji jen voda, ale obsahuje řadu živin pro mikroorganismy jako kyselinu mléčnou, rozpustné peptidy, aminokyseliny, minerální látky. Když se tyto látky nahromadí mezi povrchem sýra a jeho obalovým materiálem vzniká ideální prostředí pro růst kontaminujících mikroorganismů, mezi jinými i pro kvasinky. (Johnson, 2001; Görner, Valík, 2004)
44
5 ZÁVĚR Kvasinky jsou významné mikroorganismy, které v potravinářství mají jak pozitivní, tak negativní úlohu. Člověk jejich schopnosti využíval již celá tisíciletí, jejich skutečný význam však poznal až s objevením mikroskopu. Z hlediska potravinářství má pro nás největší význam druh Saccharomyces cerevisiae. Jedná se o nejprostudovanější kvasinku, využívanou hlavně v odvětví pivovarském, lihovarnickém, pekařském a vinařském. Kvasinky se však využívají i
v dalších
potravinářských
výrobách.
Dále
se
mohou
uplatnit
kvasinky
v biotechnologiích, geneticky upravené se využívají i pro farmakologické účely. Negativní vliv kvasinek souvisí především s kažením potravin, patogenních druhů není mnoho a jejich vliv na zdraví člověka souvisí především s kožním či slizničním onemocněním. Při kažení se mohou projevit jako škůdci masa, mlékárenských výrobků, studené kuchyně, fermentovaných výrobků nebo výrobků s vysokým obsahem cukru. V praktické části zaměřené na zjištění stupně prokvašení vybraných sladinových odrůd ječmene byly zjištěny následující výsledky: Tolar 80,2 %, AF Lucios 75,7 %. Pro srovnání, běžné hodnoty dosažitelného stupně prokvašení kongresní sladiny z plzeňského sladu se pohybují v rozmezí 78,0 až 82,0 %. Odrůda Tolar se tedy jeví jako vhodnější pro výrobu sladu. Při mikrobiologické analýze byl stanovován počet mikromycet (kvasinek a plísní) u syrového kozího mléka a sýrů. Z výsledků jsme zjistili, že počet kvasinek převažoval nad počtem plísní v mléce i sýrech. Vyšší počet kvasinek byl zjištěn ve vzorcích mléka z farmy Šošůvka, a to až 9,8 x 103 KTJ/ml; počty kvasinek v mléce z farmy Ratibořice byly o řád nižší. Opačný trend byl zjištěn u čerstvých kozích sýrů vyrobených z tohoto mléka po jeho pasterizaci. Výrazně vyšší počty kvasinek v sýrech z farmy Ratibořice (až 3,9 x 103 KTJ/g) svědčí o sekundární kontaminaci při výrobě a skladování sýrů.
45
6 SEZNAM POUŢITÉ LITERATURY BASAŘOVÁ et. al., 2010: Pivovarství. Vydavatelství VŠCHT Praha, Praha, 863 s. ISBN 978-80-7080-734-7. BENDOVÁ, KAHLER, 1981: Pivovarské kvasinky. SNTL – nakladatelství technické literatury, Praha, 272 s. BENEŠOVÁ et. al., 2003: Odmaturuj z biologie. Didaktis, Brno, 224 s. ISBN 8086285-67-7. BLACKBURN, CLIVE de W., 2006: Food Spoilage Microorganisms. Woodhead Publishing, Boca Raton, 753 s. ISBN 978-1-85573-966-6. DEÁK T., 2008: Handbook of food spoilage yeasts – 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, 325 s. ISBN 978-1-4200-4493-5. DOYLE, BEUCHAT, MONTVILLE, 2001: Food microbiology: fundamentals and frontiers. American Society for Microbiology, Washington, D. C., 872 s. ISBN 1-55581-208-2. DUDÁŠ, PELIKÁN, 1989: Využití produktů rostlinné výroby. Ústřední knihovna Vysoké školy zemědělské Brno, Brno, 182s. FERNANDES R., 2009: Dairy products. Leatherhead Food International Ltd, Cambridge, 175 s. ISBN 978-1-905224-62-3. FERNANDES R., 2009: Meat products. Royal Society of Chemistry, Cambridge, 297 s. ISBN 978-1-905224-66-1. GÖRNER, VALÍK, 2004: Aplikovaná mikrobiológia požívatín. Malé centrum, Bratislava, 528 s. ISBN 80-967064-9-7. HEREDIA et. al., 2009: Microbiologically safe foods. John Wiley and Sons, Hoboken, 667 s. ISBN 978-0-470-05333-1. HLAVÁČEK, LHOTSKÝ, 1966: Pivovarství. SNTL – nakladatelství technické literatury, Praha, 484 s. HRUBÝ S. et. al., 1984: Mikrobiologie v hygieně výživy. Avicenum/Zdravotnické nakladatelství, Praha, 208 s. HRUDKOVÁ A., MARKVART J. et. al., 1989: Nealkoholické nápoje. SNTL nakladatelství technické literatury, Praha, 560 s. JAMES M., 2000: Modern Food Microbiology (6th Edition). Aspen Publishers, Gaithersburg, 679 s. ISBN 978-0-8342-1671-6. 46
JANDEROVÁ B., BENDOVÁ O., 1999: Úvod do biologie kvasinek. Nakladatelství Karolinum, Praha, 108 s. ISBN 80-7184-990-1. JOHNSON, M. E. (2001): Cheese Product. In: Marth, E. H., Steele, J. L., (eds): Applied Dairy Microbiolgy. Marcel Dekker, Inc. New York, 744 s. KLABAN, 2001: Svět mikrobů. Gaudeamus, Hradec Králové, 416 s. ISBN 80-7041687-4. KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ A., 1990: Taxonómia kvasiniek a kvasinkovitých mikroorganizmov. Alfa, Bratislava, 699 s. ISBN 80-05-00644-6. KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ A., KUTKOVÁ M., 1961: Atlas kvasinek a kvasinkovitých mikroorganismů. Státní nakladatelství technické literatury, Praha – Bratislava, 348 s. KOMPRDA T., 2004: Obecná hygiena potravin. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 146s. ISBN 80-7157-757-X. KOMPRDA T., 1997: Hygiena potravin. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 180 s. ISBN 80-7157-276-4. LACROIX, 2011: Protective Cultures, Antimicrobial Metabolites and Bacteriophages for Food and Beverage Biopreservation. Woodhead Publishing, Oxford, 537 s. ISBN 978-1-84569-669-6. MINÁRIK, NAVARA, 1986: Chémia a mikrobiológia vína. Príroda, Bratislava, 560 s. OKAFOR N., 2007: Modern industrial microbiology and biotechnology. Science publishers, Enfield, 530 s. ISBN 978-1-57808-434-0 (HC), ISBN 978-1-57808-513-2 (PB). PHILLIPS T., NOEVER D., 2011: Planets in a bottle – More about yeast. Databáze online [cit. 2011-11-9]. Dostupné na: http//www. science.nasa.gov QUEROL A., FLEET G., 2006: Yeasts in food and beverages. Springer, Berlin, 453 s. ISBN 3-540-28388-9. SIGLER, MATOULKOVÁ, 2011: Pivovarské kvasinky a reakce na stres. Kvasný průmysl, ročník 57/2011 – číslo 7-8, 324 s. SLÁDEK Z., 2007: Buněčná biologie. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 108 s. ISBN 978-80-7375-086-2. SLÁDKOVÁ, HLAVÁČOVÁ, 2011: Speciální mikrobiologie. Mendelova univerzita v Brně, Brno, 90 s. ISBN 978-80-7375-558-4.
47
ŠILHÁNKOVÁ L., 2002: Mikrobiologie pro potravináře a biotechnology. Academia, Praha, 363 s. ISBN 80-200-1024. ŠROUBKOVÁ E., 1996: Technická mikrobiologie. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 149 s. ISBN 80-7157-226-8. TVRDOŇ M., 1976: Základní mikrobiologická kontrola v kvasném průmyslu. SNTL – nakladatelství technické literatury, Praha, 144 s. VACÍK et. al., 1999: Přehled středoškolské chemie. SPN – pedagogické nakladatelství, a. s., Praha, 365 s. ISBN 80-7235-108-7. WALKER G., 1998: Yeasts – Physiology and Biotechnology. John Wiley and Sons, Chichester, 350 s. ISBN 978-0-471-96446-9. WALSTRA P. et. al., 1999: Dairy technology. Marcel Dekker, New York, 727 s. ISBN 0-8247-0228-X. ZEHNÁLEK J., 1999: Biochemie. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, Brno, 168 s. ISBN 80-7157-366-3.
48
7 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1: Aureobasidium pullulans (WWW.ALOALLERGY.COM). Obr. 2: Saccharomyces cerevisiae (WWW.HARRISONMACSAM.PBWORKS.COM). Obr. 3: Candida albicans (WWW.EN.WIKIPEDIA.ORG). Obr. 4: Schizosaccharomyces pombe (WWW.SCIENCEBLOGS.DE). Obr. 5: Zygosaccharomyces bailii (WWW.UK.WIKIPEDIA.ORG). Obr. 6: kolonie Kluyveromyces marxianus (WWW.COMMONS.WIKIMEDIA.ORG).
49
