10
MATERI DAN METODA
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Terpadu FKH-IPB, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor dari bulan Juni 2010 sampai Juli 2011. Bahan dan Alat Penelitian Hewan Percobaan Hewan yang digunakan pada penelitian ini adalah ayam jantan petelur jenis white leghorn berumur dua minggu. Jumlah ayam yang diamati sebanyak 100 ekor. Ayam tersebut dibagi kedalam 2 kelompok yaitu AV (diberikan vaksin AIND) dan AK (tidak diberikan vaksin/kontrol). Masing-masing kelompok terdiri dari 50 ekor ayam. Vaksin AI-ND Vaksin AI-ND yang digunakan merupakan vaksin AI-ND inaktif (killed vaccine). Pakan Pakan yang digunakan pada pemeliharaan ayam penelitian ini adalah pakan konsentrat komersial yang diberikan setiap pagi. Air minum diberikan secara ad libitum. Kandang dan Perlengkapannya Pada penelitian ini digunakan dua kandang litter berukuran 2x3 meter yang terbuat dari tembok yang dibatasi oleh kawat ram. Lantai dan tembok tersebut diberi kapur dan lantai diberi sekam padi. Tempat minum dan tempat makan terbuat dari plastik yang dibersihkan setiap hari. Kandang juga dilengkapi dengan lampu listrik. Bahan dan Peralatan Perlengkapan Uji Laboratorium Bahan yang digunakan adalah virus AI dan virus ND standar dengan titer 4 HAU, suspensi RBC 1%, serum kebal AI, es batu, larutan Phospate Buffer Saline (PBS) pH 7,2. Alat yang digunakan yaitu syringe 1 ml, syringe 3 ml, inkubator, lemari pendingin bersuhu 4 oC, mikroplate V bottom, mikropipet 100 l, tissue, kapas,
11
kantung plastik, alat sentrifuse, tabung reaksi, marker (spidol), botol kecil, termos es, cawan petri, tabung mikro. 2. Metode Penelitian Pemeliharaan Hewan Coba Populasi ayam pejantan yang diamati secara keseluruhan yaitu 100 ekor. Ayam ini dibagi dalam 2 kelompok. Kelompok ayam ini dipelihara di kandang yang terletak di kandang uji coba. Ayam diberi pakan dengan standar komersial dan diberi minum ad libitum. Rancangan percobaan Pada penelitian ini dilakukan vaksinasi dengan vaksin AI-ND inaktif. Rute vaksinasi melalui subkutan dan dosis yang diberikan adalah 0.5 ml/ekor. Vaksinasi dilakukan sebanyak 2 kali. Pengambilan darah sampel dilakukan dengan metode penarikan contoh acak (random sampling) sebanyak 10 ekor ayam pada masing-masing kelompok ayam. Perlakuan masing-masing kelompok disajikan pada Tabel 1. Tabel 1 Rancangan percobaan penelitian yang dilakukan Kelompok
AV
AK
Perlakuan (minggu ke-) 4 6
0
2
8
10
Awal DOC datang dan pengambilan serum darah
Vaksinasi AIND ke-1 dan Pengambilan serum darah
Pengambilan serum darah (2 minggu setelah vaksinasi ke-1)
Vaksinasi AIND ke-2 dan pengambilan serum darah (4 minggu setelah vaksinasi ke-1)
Pengambilan serum darah (2 minggu setelah vaksinasi ke-2)
Pengambilan serum darah (4 minggu setelah vaksinasi)
Pengambilan serum darah
Pengambilan serum darah
Pengambilan serum darah
Pengambilan serum darah
Pengambilan serum darah
Pengambilan serum darah
12
Pengambilan Darah dan Evaluasi Titer Antibodi Pengambilan sampel darah ayam dilakukan menggunakan syringe 3 ml di daerah sayap yaitu pada vena brachialis. Darah tersebut selanjutnya dibawa ke Laboratorium Terpadu bagian Mikrobiologi Medis FKH-IPB. Darah dibiarkan tetap berada di dalam syringe dan disimpan dalam lemari pendingin dengan suhu 4 oC selama satu malam. Selanjutnya serum yang terpisah dari darah diambil dan disimpan sampai saat dilakukan evaluasi titer antibodi dengan uji HI. Pembuatan RBC (Red Blood Cell) Darah utuh (whoole blood) yang didapat dari ayam dewasa sehat kemudian dicampur dengan antikoagulan Na Sitrat dengan perbandingan 4:1, darah dipisahkan dengan Na Sitrat dengan cara disentrifuse 2000 rpm (Heareus) selama 10 menit. Hasi sentrifuse dibuang supernatannya dan diambil endapannya. Endapan tersebut merupakan sel darah merah. Selanjutnya endapan dicuci dengan menambahkan NaCl fisiologis kemudian disentrifuse pada kecepatan dan waktu yang sama seperti di atas. Pencucian dilakukan sebanyak tiga kali, hasil pencucian sel darah merah di buat menjadi suspensi 1% untuk digunakan pada uji haemaglutinasi mikrotitrasi. Uji HA mikrotitrasi Uji HA ini digunakan untuk membuat virus AI standar (4 HAU). Adapun prosedur uji HA mikrotitrasi yaitu (OIE 2008) :
PBS sebanyak 25 l dimasukkan kedalam sumur microplate berbentuk V (V bottom microplate).
25 l suspensi virus dimasukkan pada lubang pertama dan dilakukan pengenceran menggunakan micropipette dengan cara menghisap dan mengeluarkan campuran sebanyak 5 kali lalu memindahkan 25 l campuran ke sumur kedua. Pengenceran dilakukan hingga sumur ke 12. Pada sumur ke 12, campuran sebanyak 25 l dibuang.
PBS sebanyak 25 l dimasukkan lagi kedalam sumur yang telah berisi suspensi virus dan dihomogenkan lalu diinkubasikan pada suhu 4 oC selama 40 menit.
Tambahkan RBC 1% sebanyak 25 l dimasukkan ke semua sumur.
13
Microplate digoyang (untuk menghomogenkan) kemudian diinkubasikan pada suhu 4 oC selama 40 menit.
Hasil diamati seteleh sumur kontrol positif tampak mengendap.
Pembacaan dilakukan dengan cara sebagai berikut : pada lubang yang menampakkan terjadinya endapan seperti pada lubang kontrol negatif dinyatakan negatif HA, sedangkan yang menunjukkan terjadinya aglutinasi (penggumpalan RBC) dinyatakan positif HA. Untuk memudahkan pembacaan, microplate dimiringkan 45o . Uji HI mikrotitrasi Titer antibodi ayam terhadap virus AI dilakukan dengan uji Hambat Aglutinasi (HI Test) mikrotitrasi (OIE 2008). Prosedur uji HI mikrotitrasi :
PBS sebanyak 25 l dimasukkan ke dalam sumur microplate berbentuk V (V bottom microplate).
25 l serum ayam dimasukkan pada lubang pertama dan dilakukan pengenceran menggunakan micropipette dengan cara menghisap dan mengeluarkan campuran sebanyak 5 kali lalu memindahkan 25 l campuran ke sumur kedua. Pengenceran dilakukan hingga sumur ke 12. Pada sumur ke 12, campuran sebanyak 25 l dibuang.
Suspensi virus AI standar (4 HAU) sebanyak 25 l dimasukkan kedalam sumur berisi serum yang telah diencerkan lalu di homogenkan dan inkubasi pada suhu 4 oC selama 40 menit.
Tambahkan RBC 1% sebanyak 25 l dimasukkan ke semua sumur.
Plate digoyang selama 10 detik untuk menghomogenkan larutan dan inkubasi pada suhu 4 oC selama 40 menit.
Hasil diamati seteleh sumur kontrol positif tampak adanya reaksi penghambatan aglutinasi.
Pembacaan dilakukan dengan cara sebagai berikut : pada lubang yang menampakkan terjadinya endapan RBC seperti yang terdapat pada lubang kontrol negatif dinyatakan positif HI, sedangkan pada sumur yang menunjukkan terjadinya aglutinasi (penggumpalan RBC) dinyatakan negatif HI. Untuk memudahkan pembacaan, microplate dimiringkan 45o.
14
Rataan titer antibodi dihitung dengan rumus : Log2 GMT = (log2 t1)(S1) + (log2 t2)(S2) + ..........+ (log2 tn)(Sn) N N
= jumlah contoh serum yang diamati
t = tinggi titer antibodi pada pengenceran tertinggi S = jumlah contoh serum yang bertiter t n = sampel ke-n
