MASARYKOVA UNIVERZITA ÚSTAV FYZIKY KONDENZOVANÝCH LÁTEK. Bakalářská práce BRNO 2013 PAVEL VEVERKA

MASARYKOVA UNIVERZITA ˇ ˇ P RÍRODOV EDECKÁ FAKULTA Ú STAV FYZIKY KONDENZOVANÝCH LÁTEK

Bakaláˇrská práce

B RNO 2013

PAVEL V EVERKA

MASARYKOVA UNIVERZITA ˇ ˇ P RÍRODOV EDECKÁ FAKULTA Ú STAV FYZIKY KONDENZOVANÝCH LÁTEK

Interakce CTD-interakˇcních domén s C-teminální doménou RNA polymerázy II Bakaláˇrská práce

Pavel Veverka

Vedoucí práce: Mgr. Karel Kubíˇcek, PhD

Brno 2013

Bibliografický záznam Autor:

Pavel Veverka Pˇrírodovˇedecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav fyziky kondenzovaných látek

Název práce:

Interakce CTD-interakˇcních domén s C-teminální doménou RNA polymerázy II

Studijní program:

Fyzika

Studijní obor:

Biofyzika

Vedoucí práce:

Mgr. Karel Kubíˇcek, PhD

Akademický rok:

2012/2013

Poˇcet stran:

48 + 6

Klíˇcová slova:

RNA polymeráza II; CTD; CID; fosforylace; NMR; 5D; nelineární vzorkování; uhlíková detekce; Sparky; YSPTSPS

Bibliographic Entry Author:

Pavel Veverka Faculty of Science, Masaryk University Department of Condensed Matter Physics

Title of Thesis:

Interaction of CID domains with CTD or RNA Pol II

Degree Programme:

Physics

Field of Study:

Biophysics

Supervisor:

Mgr. Karel Kubíˇcek, PhD

Academic Year:

2012/2013

Number of Pages:

48 + 6

Keywords:

RNA polymerase II; CTD; CID; phosphorylation; NMR; 5D; non-linear sampling; carbon detection; Sparky; YSPTSPS

Abstrakt Tato bakaláˇrská práce se vˇenuje studiu a urˇcení struktury posttranslaˇcnˇe modifikované CTD RNA Polymerázy II pomocí NMR spektroskopie. C-terminální doména neboli karboxyl terminální doména (CTD) RNA Polymerázy II má speciální biologické funkce bˇehem r˚uzných fází transkripˇcního cyklu, determinované zmˇenami, jako je napˇríklad posttranslaˇcní fosforylace, což vede k ovlivnˇení afinity CTD k proteinovým faktor˚um, zejména CTD-interagujících domén (CID). CTD je ve své volné formˇe velmi flexibilní proteinovou doménou, jejíž strukturu není možné urˇcit tradiˇcními pˇrístupy at’ už rentgentové krystalografie nebo nukleární magnetické rezonance. V této bakaláˇrské práci je aplikován pomˇernˇe nový a rozvíjející se pˇrístup ke studiu flexibilních a nestrukturovaných biomolekul pomocí nukleární magnetické rezonance. Experimentální cˇ ást se tedy zabývá mˇeˇrením NMR dat pro pˇriˇrazení rezonanˇcních frekvencí páteˇrových atom˚u CTD. Dále je v experimentální cˇ ásti uvedeno mˇeˇrení NMR titraˇcních dat pˇri studiu interakce mezi CTD a CID doménami proteinu Nrd1.

Abstract This thesis deals with study and determination of the structure of post-translationally modified RNA polymerase II CTD using NMR spectroscopy. C-terminal domain or the carboxyl terminal domain (CTD) of RNA polymerase II has a special biological function during the various phases of the transcription cycle, determined by its changes, such as post-translational phosphorylation, which leads to influence of the affinity of the CTD to various protein factors, especially the CTD-interacting domain (CID). Free form of CTD is highly flexible protein domain whose structure cannot be determined by traditional attitudes approaches such as X-ray crystallography or tradicional nuclear magnetic resonance. In this work it is applied a fairly new and evolving approach to the study of flexible and unstructured biomolecules using nuclear magnetic resonance wiht non-linear sampling and carbon detection. Experimental part therefore deals with the measurement of NMR data for the assignment of resonance frequency of CTD backbone atoms. The experimental section summarizes acquision of NMR titration data in the study of interactions between CTD and the CID domain protein of Nrd1.

Masarykova univerzita

{M

Příro dovědecká fakulta

ZADÁNÍ BAKArÁŘsrÉ pnÁcr : Pavel Veverka Studijní program : Fyzika : Biofyzika Studijní obor

Student

Ředitel Ústavu fyziky kondenzovaných látek PřF MU Vám ve smyslu Studijního a zkušebníhořádu MU určuje bakalářskou práci s tématem: .J-

Interakce CTD-interakčních domén s C-teminální doménou RNA polymerázy II Interaction of CID domains with CTD or RNA Pol II Zás ady pro vyprac ov ání: c-terminalni aoňeny (rovněŽ karboxyl terminální domény, CTD) někteých proteinů mají speciální biologické funkce. C-terminální doména RNA polymeráry II, sestávající z aŽ 52 opakovánl heptadu YSPTSPS, sloužík navázánirůzných proteinů (faktoru), které ovlivňují polymerazovou akÍivitu. CTD doména RNA polymerázy II se účastnínupi. ini"iu"" transkripce DNA, ''cappingu' RNA transkriptu a pod. Cílem této bakalařské práce bude studium intérakcí mezi CTD-interagujícími doménami (CID) růzrých proteinů s CTD doménou RNA polymerázy II. cID domény interagují s posttranslačně modifrkovanou CTD. Tyto modifikace zahrnují např' iosřo.ytuci ubiquitinaci, a pod. natalánt bchenl své]práce nawhne vhodné CID-CTD partnery a pomocí jedno-, dvou- a třidiměnzionálních spekter nukleární magnetické rezonance bude sledovat průběh tvorby komplexů mezi těmito partnery. Bakalant se během své práce'seznámí s problematikou CTD RNA polymeráry-II, osvojí si zák|ady nukleární magnetické rezonance a to jak měření spekter, tak jejich zpracovéní a vyhodnocoffi1 u -.t a spart
,

modelu mezi interagujícími partnery

Doporučenó literatura JAšN7VID7VA, olga a Richard ŠTEFL.The CTD code

of RNA polymerase II: a structural view. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA, 20I2, od s. "nestránkováno",1ós. 1SSď l757-70l2. 2012. dol: I0. ] 002/wrna.1 ] 38., KUBÍčEK,Karel a Hana ČERNÁ a Peter H)LUB a Josef PASULKA a Dominika HRoŠŠoVÁa Frank L)EHR a Ctirad H)FR a Štepánka v,eNÁČovÁ a Richard ŠTEFL. Serine phosphorylation and proline isomerization in RNAP II CTD control recruitment of Nrdl. Genes & Devólopment, Spojené stáý americké: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 26, l7, od s. ]891-1896' ó s. 1SS1/ 0890-9

3

69.

20I

2. doi : I 0. I

1 0 I

/gad. I 927 8 L

1I

2.

: Mgr.Karel Kubíček,PhD. í b akal ář s ké pr ác e : záÍí20I2 Datum zadóní bakalářské práce Datum odevzdání bakalářske práce : dle harmonogramu ak. roku Ve douc

j

-:

prof. RNDr. josef Hunilíčefš€Sc. ředitel Ústavu fyzíky kondenzovaných látek PřF MU

V Brně dne 06.02.2013

Zadáníbakalářské prácepřevzal

20I2l20I3

dne:

} ? 2ol3

Podpis studenta

Vfu-Ň*

Podˇekování Na tomto místˇe bych chtˇel podˇekovat Mgr. Karlu Kubíˇckovi, PhD. za vedení a usmˇernˇ ování jak pˇri samotných mˇeˇreních, tak pˇri psaní této bakaláˇrské práce. Dále bych chtˇel podˇekovat doktorandce Olze Jasnovidové, M.Sc. za pˇrípravu vzork˚u k mˇeˇrení, Mgr. Jiˇrímu Nováˇckovi za osvˇetlení principu a generování dat 5D NMR. A v neposlední ˇradˇe také všem, kteˇrí mi pomáhali s korekcemi textu.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakaláˇrskou práci vypracoval samostatnˇe s využitím informaˇcních zdroj˚u, které jsou v práci citovány.

Brno 22. kvˇetna 2013

.......................... Pavel Veverka

Obsah Úvod . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

ix

Pˇrehled použitého znaˇcení . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

x

Kapitola 1. RNA Polymeráza II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.1 Struktura RNA Pol II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2 Transkripce . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.3 CTD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.4 Struktura CTD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.5 Fosforylace CTD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.6 Izomerace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.7 Další chemické modifikace CTD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.7.1 WW vazebné domény . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.7.2 FF vazebné domény . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.7.3 Výˇcet dalších modifikací . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.8 CID . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1 1 2 3 5 6 7 8 8 8 8 8

Kapitola 2. NMR spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1 Teorie mˇeˇrení . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.1 Larmorova frekvence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.1.2 Stínˇení jader elektrony . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Postup mˇeˇrení . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3 T1 a T2 relaxace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4 Struktura pˇrístroje . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.1 Field frequency lock . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.2 Systém shimovacích cívek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.4.3 Pulzní gradienty magnetického pole . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.5 Chemický posun . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.6 H2 O a vliv D2 O . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.7 Metody NMR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.7.1 HSQC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.7.2 TROSY . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.8 NMR titrace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.9 Strukturované vs. nestrukturované proteiny . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

11 11 11 11 12 13 13 13 14 14 14 15 15 15 16 16 16

– vii –

2.10 5D NMR . . . . . . . . . . . . . 2.11 Použité softwarové vybavení 2.11.1 Bruker Topspin . . . . 2.11.2 Sparky . . . . . . . . . . 2.11.3 NMRPipe . . . . . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

. . . . .

17 17 17 18 18

Kapitola 3. Experimentální cˇ ást . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1 Pˇríprava vzorku . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.1 Pˇríprava vzorku pro NMR mˇeˇrení . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2 Mˇeˇrení NMR spekter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.1 Manipulace se vzorkem . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.2 Inicializaˇcní procesy mˇeˇrení . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.3 Ladˇení sondy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.4 Kalibrace 90◦ 1 H pulzu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.2.5 Spuštˇení NMR experimentu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.3 NMR titrace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.4 Pˇriˇrazování sekvence aminokyselin v CTD pomocí 5D NMR experimentu . 3.4.1 Zpracování dat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

21 21 22 22 22 22 22 25 26 26 28 29

Závˇer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

32

Pˇríloha . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

34

Seznam použité literatury . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

40

Úvod RNA Polymeráza II obsahuje zvláštní C-terminální doménu (CTD) sestávající z mnoha (26 v kvasinkách, 52 v lidských buˇnkách [2]) repetic heptapeptidu Tyr – Ser – Pro – Thr – Ser – Pro – Ser, pomocí kterého je ˇrízen transkripˇcní cyklus. Tento heptapeptid m˚uže být modifikován a díky p˚usobení rozliˇcných vazebných partner˚u CID (CDT interakˇcní domény) nabývat mnoha konformaˇcních zmˇen. Konformaˇcní zmˇeny jsou pˇrevážnˇe zp˚usobeny fosforylací cˇ i izomerací prolylové vazby (viz. dále) v ˇretˇezci CTD. Fosforylována m˚uže být více jak polovina aminokyselin z heptapeptidu: Tyr1 , Ser2 , Tyr4 , Ser5 a Ser7 , pˇriˇcemž každá fosforylace v urˇcitém místˇe a její kombinace vedou k navázání rozdílných faktor˚u, které hrají d˚uležitou roli v ˇrízení transkripˇcního cyklu. Izomeraci podléhají peptidové vazby Ser2 -Pro3 a Ser5 -Pro6 , které zp˚usobují ještˇe vˇetší konformaˇcní zmˇeny. Mezi tyto konformaˇcní zmˇeny patˇrí napˇríklad tvorba ohyb˚u, šroubovic, smyˇcek a výdutí, které jsou nezbytné pro navázání interakˇcních domén. Pro úplné pochopení dˇeje transkripce DNA je nezbytné porozumˇet tˇemto zmˇenám a vazbám CID k CTD. Tato práce si klade za cíl studovat problematiku CTD domény RNA Polymerázy II a její interakce s r˚uznými CID doménami. První cˇ ást bakaláˇrské práce shrnuje souˇcasné poznatky potˇrebné pro pochopení dˇej˚u, které probíhají na CTD. Také je zde uveden nezbytný aparát pro pochopení funkce NMR spektrometru. Ve druhé – experimentální cˇ ásti – je podrobnˇe rozepsána obsluha a mˇeˇrení na NMR spektrometru spoleˇcnˇe s problematikou NMR titrace mezi CTD a CID. Následnˇe je vysvˇetleno použití 5D NMR pro sekvenˇcní pˇriˇrazení rezonanˇcních frekvencí CTD.

– ix –

Pˇrehled použitého znaˇcení Pro snazší orientaci v textu je zde cˇ tenáˇri pˇredložen pˇrehled základního znaˇcení, které se v celé práci vyskytuje. BRCT doména CA150 CID CTD Ctg1 D2O dsDNA FF doména FID FT FTIID Glu HSQC INEPT kDa mRNA NMR NOE Nrd1 NUS Pcf11 doména Pin 1 Pro Prp40 pSP pTEF-b

BRCA1 C-terminální doména Transkripˇcní elongaˇcní faktor CDT interakˇcní doména C-terminální doména doména guanylyltransferázová doména Tˇežká voda Dvojˇretˇezcová DNA Doména hrající roli pˇri fosforylaci Volné doznívání indukce (free induction decay) Fourierova transformace Transkripˇcní faktor polymerázy II typ D Kyselina glutamová – aminokyselina Heteronukleární jednokvantová korelace (Heteronuclear Single Quantum Coherence) Insensitive nuclei enhanced by polarization transfer Jednotka hmotnosti proteinu – kilo Dalton Mediátorová RNA Nukleární magnetická rezonance Nukleární Overhauser˚uv efekt Nardilysin – podjednotka poly-A nezávislého transkripˇcního terminaˇcního komplexu Neuniformní vzorkování (non-uniforming sampling) Doména, která je souˇcástí CID Peptidyl-propyl cis-trans izomeráza 1 Prolin – aminokyselina Splicing faktor kvasinek Fosfoserinoprolin Pozitivní transkripˇcní elongaˇcní faktor b –x–

Pˇrehled použitého znaˇcení

Rbp # RNA Pol # RNAP II Rtt103 SCAF8 SCP1 Ser SMFT Ssu72 SUMO TATA-box TBP TFII# TMS TROSY Tyr WW doména

xi

Protein vázající retinol # RNA Polymeráza # RNA Polymeráza II Transkripˇcní terminaˇcní faktor RNA processing faktor Malá fosfatáza C-terminaˇcní domény 1 (small C-terminal domain phosphatase 1) Serin – aminokyselina Sparse Multidimensional FT RNA Pol II CTD fosfatáza Modifikaˇcní protein, vykazující podobnost s ubikvitinem (small ubiquitin-like modifier) Sedminukleotydová sekvence DNA v oblasti promotoru TATA vazebný protein Transkripˇcní faktor # Tetramethylensilan – slouˇcenina pro kalibraci NMR Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy Tyrosin – aminokyselina Proteinová doména obsahující dva vysoce konzervované tryptofany vázající se k motiv˚um bohatým na prolin

Kapitola 1 RNA Polymeráza II Pˇrenos biologické informace a jeho kontrola zahrnuje transkripci jako jeden z klíˇcových krok˚u. Transkripce je proces, pˇri kterém je informace uložená v DNA pˇrepisována do novˇe vzniklého fragmentu mesengerové RNA (mRNA). Celý proces probíhá díky RNA polymeráze a transkripˇcním faktor˚um. Zatímco u prokaryotické Escherischia Coli katalyzuje veškerou transkripci jen jediná RNA polymeráza, eukaryotní organismy v rozmezí komplexity od kvasinek až po cˇ lovˇeka obsahují tˇri r˚uzné RNA polymerázy. Všechny tˇri eukaryotické enzymy oznaˇcované jako RNA-polymerázy I, II a III jsou se svými více než deseti podjednotkami výraznˇe složitˇejší než RNA polymeráza E. coli. Kromˇe toho na rozdíl od enzymu E. coli vyžadují všechny tˇri eukaryotické RNA Pol pro zahájení syntézy ˇretˇezc˚u RNA pomoc dalších protein˚u, nazývaných transkripˇcní faktory. [16] RNA polymeráza II (RNAP II, Pol II, RNA Pol II) je velmi tedy d˚uležitá eukaryotická RNA polymeráza. Je umístˇena v jaderné plazmˇe bunˇecˇ ného jádra. Na základˇe genetické informace uložené v genech v DNA tato polymeráza umožˇnuje jejich transkripci, cˇ ímž vzniká mRNA. RNA polymeráza II totiž pˇrepisuje všechny geny, které kódují bílkoviny, a také vˇetšinu gen˚u pro malé stabilní jaderné RNA, jako jsou napˇríklad snoRNA, snRNA a miRNA. Bˇehem probíhající transkripce RNA Pol II také kontroluje poškození DNA a modifikuje okolní chromatin. Ostatní dvˇe eukaryotické polymerázy (RNA Pol I a RNA Pol III) se zamˇeˇrují na zbylé RNA geny, z nichž bílkoviny nevznikají. [1] [16] [17] [23]

1.1

Struktura RNA Pol II

RNA polymeráza II má mimoˇrádnˇe složité uspoˇrádání podjednotek – obsahuje dvˇe r˚uznˇe velké podjednotky a sadu malých podjednotek. V nejokleštˇenˇejší podobˇe se RNA Pol II skládá z 11 podjednotek, o celkové velikosti do 600 kDa. U kvasinek má RNA Pol II molární hmotnost cca 550 kDa a je složena z 11 r˚uzných podjednotek. Dvˇe nejvˇetší (Rpb1 a Rpb2) vykazují jistou podobnost s podjednotkami β , β ’ prokaryontní RNA polymerázy a tvoˇrí tedy jakési strukturní i funkˇcní jádro enzymu. Ve skuteˇcnosti, lidská podjednotka RNAP II m˚uže nahradit svoji analogickou cˇ ást z kvasinek bez ztráty životaschopnosti bunˇek. Pro iniciaci transkripce je tˇreba jak Rpb1 a Rpb2, tak ještˇe Rpb4/7 komplex, a navíc nˇekolik dalších transkripˇcních faktor˚u. –1–

Kapitola 1. RNA Polymeráza II

2

Nejvˇetší podjednotka RNA pol II – Rbp1 obsahuje poblíž svého výstupního místa dlouhou a flexibilní C-terminální doménu (CTD). Tato CTD se dá rozdˇelit do tˇrí cˇ ástí: 1) oblasti ohebného spojovaˇce, 2) oblasti sestávající z tandemových repetic konsensuální sekvence Tyr – Ser – Pro – Thr – Ser – Pro – Ser, a 3) odlišné C-terminální cˇ ásti. CTD kvasinek se m˚uže teoreticky rozvinout až do délky až 650 Ångström. Kvasinky obsahují 26 opakování heptapeptidu, savci vˇcetnˇe cˇ lovˇeka až 52 repetic. RNA Pol I ani RNA Pol III ve svém složení neobsahují žádnou podobnou repetici. Sekvence CTD z kvasinek:

SPEFTCSPTEPS–(Y1 S2 P3 T4 E5 P6 S7 )13 –YSPAAADYKDDDDK Propojováním specifických post-translaˇcních modifikací CTD s r˚uznými cˇ ástmi transkripˇcního cyklu daly vzniknout konceptu CTD kódu. Klíˇcovou funkci v tomto kódu zastávají post-translaˇcní modifikace (napˇr. fosforylace, methylace, ubiquitinace) tvoˇrené enzymy, které modifikují CTD, a dále pak CTD asociovanými proteinovými faktory, které cˇ tou tyto modifikaˇcní znaˇcky. Vhodná kombinace tˇechto faktor˚u vede ke zmˇenˇe prostorového uspoˇrádání CTD domény v cˇ ase, což ˇrídí chod událostí podílejích se na transkripci a zpracování RNA. CTD doména je po své fosforylaci, která probíhá na zaˇcátku transkripce a v jejím pr˚ubˇehu, opˇet defosforylována. Touto recyklací je umožnˇeno, aby RNA pol II opˇet vstoupila od zaˇcátku do transkripˇcního cyklu. [1] [3] [17] [18] [23]

1.2

Transkripce

K iniciaci transkripce potˇrebuje RNA Pol II, aby se navázaly transkripˇcní faktory na urˇcitá místa v oblasti promotoru, který je lokalizován na DNA ještˇe pˇred poˇcátkem transkripce. Tento promotor obsahuje silnˇe konzervovaná místa, která jsou následnˇe rozpoznávána RNA pol II. Pomocí TATA-boxu se nastaví preiniciaˇcní místo poˇcátku transkripce a právˇe sem se váže iniciaˇcní faktor FTIID (Transcription factor for polymerase II type D), který obsahuje TATA vazebný protein (TBP). TATA vazebný protein po navázání ohýbá ˇretˇezec DNA. Následnˇe se navážou další pomocné proteiny: TFIIA, TFIIB a posléze TFIIF spoleˇcnˇe s RNA pol II. Následuje odstranˇení promotoru a poté již samotná elongace ˇretˇezce, následovaná terminací spoleˇcnˇe s polyadenilací. [16] [18] [24] Formace preiniciaˇcního komplexu je zp˚usobena fosforylaˇcní zmˇenou serinu na pozici Ser5 , faktorem TFIIH a mediátorovými kinázami, které poté indukují disociaci mediátorového komplexu pryˇc z CTD. Následnˇe Ser5 fosforylovaná CTD povolává mRNA cˇ epiˇckovací enzymy, histon modifikující enzymy (Set2 komplex) a RNA procesní faktory. [3] [24] V pr˚ubˇehu pokraˇcujícího transkripˇcního cyklu CTD ztrácí vˇetšinu ze svých Ser5 fosforylací a pozitivní transkripˇcní elongaˇcní faktor (pTEF-b) provede fosforylaci na pozici Ser2 . Poˇcty fosforylovaných Ser5 klesají, naproti tomu se poˇcet fosforylovaných Ser2 zvyšuje, což se dˇeje, když se RNA pol II vyskytuje v prostˇrední cˇ ásti zpracovávaného genu. Jakmile RNA pol II dosáhne 3’ konce genu, Ser5 fosforylace poklesne, ale stále relativnˇe hodnˇe fosforylovaná Ser2 spustí procesy odštípnutí, polyadenilace a terminaˇcní faktory. Po uvolnˇení transkriptu a kompletní terminace transkripce, je CTD znovuobnovena fosfatázami, aby mohla opˇet vstoupit do transkripˇcního cyklu. [3]


1.3

3

CTD

Vlivem protein-proteinových interakcí dochází na RNA pol II ke konformaˇcním zmˇenám, které silnˇe ovlivˇnují syntézu mRNA. Jednou z nejd˚uležitˇejších souˇcástí tohoto procesu je právˇe C-terminální doména. Jak již bylo uvedeno, C-terminální doména je tvoˇrena tandemovou repeticí heptapeptidu o následující sekvenci: Tyr1 -Ser2 -Pro3 -Thr4 -Ser5 -Pro6 -Ser7 . Tato repetice se vyskytuje ve všech eukaryotních organismech. Její délka je závislá na druhu organismu – napˇríklad Saccharomyces cerevisiae obsahují 27 repetic, u myší 52, u drozofily 45 a v lidských buˇnkách má CTD doména 52 opakování YSPTSPS sekvence. Repetitivní povaha CTD a vysoký poˇcet jejích prolinových zbytk˚u naznaˇcují, že zaujímá r˚uzné konformace, které hrají d˚uležitou roli pˇri transkripci. Je spojována s metylací histonu, mRNA splicingem, polyadenylací, a pˇrímo spolupracuje s mRNA cˇ epiˇckovacím enzymem. Zmˇeny CTD fosforylace jsou pˇrechodné. Je tˇreba zd˚uraznit, že mutace, která odstraní veškerou nebo vˇetšinu CTD u myší cˇ i kvasinek nebo vážnˇe naruší jejich repetitivní sekvence, jsou smrtelné. [1] [6] [17] Neobvyklá je také konzervovanost repetic u jednotlivých druh˚u, které jsou specifické pro daný organismus. Zatímco kvasinky mají pozmˇenˇených 6 z 26 repetic, octomilka má oproti tomu pouze jednu ze 41 repetic nepozmˇenˇenu. [1] [3] Interakce CTD s (proteinovými) partnery se dynamicky mˇení podle aktuální potˇreby transkripˇcního cyklu. R˚uzné kombinace fosforylace a konformaˇcní zmˇeny vytváˇrejí specifické konfigurace pro vazbu jednotlivých faktor˚u. Dalo by se tedy ˇríci, že pr˚ubˇeh transkripce je ˇrízen souˇcasnˇe chemickými zmˇenami (fosforylacemi) a konformaˇcními zmˇenami (cis/trans izomeracemi). [1] [3] [5] RNAP II zahajuje transkripci, jen když je CTD nefosforylována, ale elongace zaˇcíná, jen když je CTD fosforylována, což ukazuje, že se tento proces spouští inicializací RNAP II komplexu s elongaˇcním komplexem. Elektrostatické repulze mezi sousedními fosfátovými skupinami pravdˇepodobnˇe zp˚usobují, že fosforylovaná CTD m˚uže dosáhnout vzdálenosti 650 Ångström od kulovité cˇ ásti proteinu. Zjednodušenˇe tento model vypadá jako malá kuliˇcka s dlouhým ocáskem. Ve skuteˇcnosti fosforylovaná CTD poskytuje vazebná místa pro ˇradu pomocných (proteinových/vazebných) faktor˚u, které se zapojují do procesu transkripce. Vznik tˇechto vazebných míst a následná vazba specifických faktor˚u závisí na fosforylaˇcním stavu CTD, který se mˇení bˇehem transkripˇcního cyklu, a usmˇerˇnuje události biogeneze mRNA. [2] [18] Heptapeptidový CTD motiv obsahuje až 5 potenciálních míst pro fosforylaci (Y1 , S2 , T4 , S5 a S7 ), které jsou zobrazeny na obr. 1.1). Z výše uvedených možných fosforylaˇcních míst podléhá nejvíce serin na pozici 2 p˚usobení reverzní fosforylace CTD kináz a fosfokináz. CTD ovšem upˇrednostˇnuje fosforylaci serin˚u na pozici Ser2 a Ser5 , které ovšem nemají rovnocenné funkce. Fosforylace Ser2 a Ser5 vyvolává 4 r˚uzné kombinace/stavy fosforylace CTD repeat˚u. Fosforylovaná forma Pol II nese pr˚umˇernˇe jednu fosforylaci na jedno opakování. Pˇredpokládá se, že fosforylaˇcní stav CTD je výsledkem stejnomˇerného p˚usobení místnˇe specifických CTD kináz a fosfatáz. [2] [18] Proteiny rozpoznávají CTD fosforylaci bud’to pˇrímo – kontaktem s fosforylovanými rezidui, nebo nepˇrímo, bez kontaktu s fosfátem. Katalytický mechanismus CTD fosfatáz je znám, ale základy CTD specificity v˚ucˇ i tˇemto enzym˚um z˚ustávají zatím neodhaleny. [2] Místa fosforylace se mˇení bˇehem transkripˇcního cyklu, což má za následek vazbu spe-


4

Obrázek 1.1: Chemické složení jedné repetice CTD. Oranžovˇe zobrazeny možné fosforylace a svˇetle modˇre možné zmˇeny cis/trans. Oddˇelení jednotlivých aminokyselin v ˇretˇezci je naznaˇceno modˇre pˇrerušovanˇe. Upraveno dle [3].

cifických RNA procesních faktor˚u. K Ser5 fosforylaci dochází poblíže oblasti promotoru, což vede k pˇripojení cˇ epiˇckovacího enzymu. Ser2 fosforylace pˇrevládá v oblastech vzdálenˇejších od promotoru, a má za následek spouštˇení mechanismu 3’-RNA zpracovávání. Proto tedy m˚uže CTD kód urˇcovat aktuální pozici RNA Pol II v transkripˇcním cyklu. [2] CTD kód m˚uže nabývat 16 r˚uzných kombinaˇcních stav˚u aminokyselin na jedné repetici, což je výsledek kombinací 4 rozdílných fosforylaˇcních stav˚u se 4 prolinovými konfiguracemi: rezidua na pozici Pro3 a Pro6 mohou být každá v cis nebo trans konformaci. [2] Ve skuteˇcnosti je situace ale mnohem komplikovanˇejší: [2] 1. Proteiny se mohou vázat na jedno nebo více CTD opakování – což znamená, že jeden repeat není funkˇcní jednotkou CTD. Ukazuje se však, že dvojice heptapeptid˚u by tuto funkci již zastat mohly. 2. Není jasné, jak propyl izomeráza m˚uže mˇenit specificitu pro proteiny vázající se k CTD, pokud tyto enzymy pouze urychlují cis/trans izomerii prolinových reziduí, v protikladu s kinázami, které nastavují fosfátové znaˇcky na CTD, cˇ i fosfatázami, které mohou odebrat tyto fosfátové znaˇcky. Nicménˇe propyl izomerázy Pin1 mohou mít vliv na fosforylaci CTD in vitro. 3. CTD kód m˚uže být prodloužen fosforylací na reziduu Tyr1 a možnou glykosylací CTD. 4. 52. repeat v lidské CTD obsahuje fosforylované místo pro protein kasein kinázu II. 5. Krátký motiv na C-konci CTD, který je lokalizován za opakováními a hraje d˚uležitou roli na stabilizaci a funkci CTD.


1.4

5

Struktura CTD

RNAP II váže ve svém aktivním místˇe dva ionty Mg2+ v blízkosti pˇeti konzervovaných kyselých zbytk˚u. Vypadá to, že RNA polymerázy katalyzují prodloužení RNA pomocí dvou kovových iont˚u, podobnˇe jako to provádí DNA polymerázy. Stejnˇe jako v pˇrípadˇe bakteriálních RNA polymeráz, je povrch RNAP II témˇeˇr zcela zápornˇe nabit, kromˇe hlavního kanálku a oblasti kolem aktivního místa enzymu, které jsou nabity kladnˇe. [18] Dále bylo pomocí X-ray krystalografie zjištˇeno, že se dsDNA váže do hlavního kanálku. RNAP II zachytí DNA pomocí Rpb1 a Rpb2, která tvoˇrí jakási „klepeta“, ve kterých je DNA zachycena. Pomocí konformaˇcních zmˇen se RNAP II pˇreskládá na transkripˇcní komplex. [18] DNA je odvíjena po tˇrech bazích pˇred vstupem do aktivního místa (které se nachází na Rbp 1). Po pr˚uchodu tímto místem je DNA náhle zalomena o 90◦ v cˇ ásti Rbp 2, d˚usledkem cˇ ehož je templát v aktivním místˇe otoˇcen, což umožˇnuje, aby byl dále pˇreˇcten. Tato báze je párována s ribonukleotidem na 3’ konci RNA, která se nachází nad pórem o pr˚umˇeru 12 Ångström, na konci tzv. sekundárního kanálku, jehož prostˇrednictvím získávají NTP pˇrístup k aktivnímu místu. RNA-DNA hybridní dvoušroubovice zaujímá pˇrechodnou konformaci mezi A- a B-DNA, a je nadále podvíjena. RNA Polymerázy pracují s DNA skrze jejich cukr-fosfátovou páteˇr, nikoliv ale s hranami jejich bazí. Po jedné otáˇcce tohoto RNA-DNA hybridního helixu se hybrid dostává do místa, které rozdˇeluje RNA a templátový DNA ˇretˇezec, což umožní opˇetovné spojení dvou samostatných ˇretˇezc˚u DNA opˇet na dvoušroubnovici. [18] Volná CTD zaujímá v prostoru konformaci jako dlouhý ocásek, který vyr˚ustá z katalytického jádra Pol II a je flexibilnˇe pˇripojena do místa poblíž RNA výstupního kanálku tohoto enzymu. Flexibilní je také 80 reziduí dlouhá spojka mezi jádrem polymerázy a CTD. Na zaˇcátku spojky se nachází α helix, který váže podjednodku polymerázy Rpb7, která spoleˇcnˇe s Rbp4 tvoˇrí podkomplex, který produkuje enzym. Poté následuje již výše zmiˇnovaná konsenzuální sekvence Y1 S2 P3 T4 S5 P6 S7 . [2] Poslední výsledky ukazují, že volná CTD struktura je velmi flexibilní i pˇresto, že vykazuje urˇcité reziduální struktury a tendenci k tvorbˇe β otáˇcek. CTD obsahuje dva SPXX motivy (S2 P3 T4 S5 , S5 P6 S7 -Y1 ), o kterých se pˇredpokládá, že tvoˇrí β otáˇcky stabilizované dvˇema vodíkovými m˚ustky. NMR studie jediné repetice heptapeptidu odhalují, že se β -otáˇcky vyskytují v S2 P3 T4 S5 motivu, ale i v nestrukturované formˇe CTD. [2] [3] Nedávné studie CTD o délce dvou repeat˚u s fosforylovaným S2 místem ukazují na dynamicky neuspoˇrádaný celek. Pˇrevážnˇe neuspoˇrádaný charakter volné CTD zˇrejmˇe umožnˇ uje mnoho r˚uzných interakcí s cílovými proteiny díky možnosti rychlé a energeticky nenároˇcné zmˇeny konformace. [2] Jedna z možných kompaktních CTD forem je náhodná smyˇcka. Je však možné, že úseky CTD mohou nabývat tvaru spirály, což by vedlo k jejímu celkovému zhutnˇení (uvedeno na obr. 1.2). Pˇri mnohoˇcetné fosforylaci jsou ale kompaktní formy CTD více rozptýlené do prostoru v d˚usledku repulze náboj˚u. [2] Rozpoznávání pozmˇenˇené CTD probíhá následovnˇe: CTD peptid s fosforylovaným Ser5 je vázán k guanylyltransferázové doménˇe Ctg1, která m˚uže vazebnˇe zahrnout až 3 repeaty CTD. Dvojitˇe fosforylovaná Ser2 a Ser5 se váže k WW doménˇe Pin 1 a fosforylovaná Ser2 je vázána k CID doménˇe Pcf11. Ve všech strukturách se CTD peptid váže ke


6

Komplex RNA Pol II Flexibilní spojka

Rozvinutá CTD Nespojitá spirála

Kompaktní spirála Náhodná smy ka

Obrázek 1.2: Komplex RNA Pol II se svou CTD, která je vyzobrazena v nˇekolika stavech sbalení. Modˇre znaˇcená je DNA a cˇ ervenˇe RNA. Upraveno dle [2]

konzervovaným žlábkovým doménám, což by mohlo mít za následek, že by byl schopen vázat podobné strukturní skupiny. [REF] Centrální CTD repeat je cˇ ásteˇcnˇe vyklopen ven, tvoˇrící strukturu podobnou otáˇcce, která interaguje s dalšími proteiny. Dva boˇcní repeaty se nacházejí ve struktuˇre podobné β vinutí. Hydrofobní interakce zahrnují prolinové zbytky na CTD a tyrosinový zbytek Tyr1 , který m˚uže tvoˇrit vodíkovou vazbu s Ctg1 skrze svou fenylovou hydroxylovou skupinu. Ke struktuˇre fosforylovaného Ser2 CTD peptidu se váže CID doména Pcf11. Naopak ke fosforylovanému Ser5 se váže CID doména Rtt103. CTD motiv S2 -P3 -T4 -S5 tvoˇrí β otoˇcku, zatímco ostatní pˇrilehlé zbytky jsou v rozvinuté konformaci. Mezi CTD a CID vznikají vodíkové vazby a CTD rezidua Tyr1 a Pro3 se vážou k hydrofobním míst˚um. Velká rozmanitost interakcí, která byla pozorována s CTD-proteinovými komplexy, naznaˇcuje, že jednoduchá pravidla v CTD kódu pravdˇepodobnˇe neexistují. Specificita vazeb pochází z r˚uzných modifikací izoforem, modifikaˇcních vzor˚u, délky vazby CTD peptid˚u a cis/trans konformací fosfoserin-prolin/peptidyl-prolynových vazeb. V tˇechto komplexech CTD peptidová páteˇr zaujímá rozliˇcné typy smyˇcek, pokud je vázána k nukleotidtransferázové doménˇe (NT) Cgt 1, CDT interakˇcní doménˇe (CID), BRCT doménˇe SCP1 a Ssu72, a tvoˇrí spirální tvar, když je navázaná Pin 1 WW doména. Stabilizace konformace peptidu a specifické rozeznávání je získáno kombinací prostorových omezení, intramolekulární a intermolekulární vodíkové vazby, van der Waalsovými silami, elektrostatickými silami a patrovými (stacking) interakcemi. Výsledkem výše uvedeného je, že každý proteinový faktor má sv˚uj vlastní požadavek na funkˇcní jednotku CTD peptidu, která m˚uže nabývat délky tˇrí repetic, jako je tomu u Cgt1 nebo 4 zbytky krátká, jako je tomu u SCP1. [3]

1.5

Fosforylace CTD

Bˇehem transkripce jsou d˚uležité dvˇe hlavní CTD fosforylace (uvedeny na obr. 1.3). Serin na páté pozici je fosforylován bazálním transkripˇcním faktorem TFIIH poblíž promotoru. Genetická a biochemická data ukazují, že cˇ epiˇckovací enzym je povolán touto modifikací. Struktura guanylyltransferázy (Cgt1)-CTD fosfopeptidového komplexu organizmu Candida albicans ukazuje, jak je CTD kód cˇ ten. Použitý peptid obsahuje cˇ tyˇri heptapeptidové repetice, každá s fosforylací serinu5 , ale pouze 17 reziduí je viditelných ve struktuˇre. Fosfopeptid se váže na štˇerbinu nukleotid transferázové domény, s prodloužením podob-


7

nou β konformaci, která obsahuje jednu otoˇcku u prolinu6 . Fosfáty na dvou Ser5 zbytcích z heptapeptidových repetic se váží kladnˇe nabitými kapsami a chovají se jako elektrostatické kotvy na obou koncích vazebné štˇerbiny. Kromˇe toho Ser5 , tyrozin a dva proliny v ˇretˇezci repetic mohou také tvoˇrit specifické kontakty s Cgt1. [1] Serin2 je fosforylován bˇehem elongace r˚uznými druhy kináz. Pˇredpokládá se, že polyadenilaˇcní faktory mohou specificky interagovat s fosforylovaným Ser2 , který je zakotven na CTD. Tyto dvˇe fosforylace pomáhají rozlišovat poˇcáteˇcní a pozdní fáze transkripce. Fosforylace m˚uže ovlivnit tendenci CTD peptid˚u ke tvorbˇe β otoˇcky a polyprolin helikázy typu II. [1]

Obrázek 1.3: Chemické a izomeraˇcní zmˇeny vedoucí ke zmˇenˇe konformace. Upraveno dle [3]. Fosforylaˇcní znaˇcky mohou být syntetizovány a odebírány specifickými fosfatázami. Nejlépe prozkoumanou jsou serin fosfatázy (pS2 , pS5 , pS7 ). Fosforylace Tre4 je spojována s ukonˇcováním zpracování mRNA 3’ a transkripˇcní elongací. Podobnˇe Tyr1 m˚uže být také fosforylován, což vede k stimulaci a vazbˇe elongaˇcního faktoru Spt6 . Zajímavé je, že se Tyr1 fosforylace podílí na vazbˇe faktor˚u, které se uplatˇnují jak v poˇcáteˇcní, tak koncové fázi zpracovávání RNA. Mnohonásobné fosforylace CTD netvoˇrí jenom nová vazebná místa, ale také mají vliv na celou strukturu CTD. Kv˚uli odpuzování náboj˚u mezi fosfátovými skupinami se struktura CTD pˇri fosforylaci stále více prodlužuje. [3]

1.6

Izomerace

Izomerace peptidových vazeb Ser2 -Pro3 a Ser5 -Pro6 je další d˚uležitou složkou CTD kódu (uvedena na obrázku 1.3). Serin-prolin a peptidyl-prolyl vazby mohou nabývat dvou odlišných stav˚u izomerace: cis a trans. V cis konformaci peptidová vazba tvoˇrí motivy: ohyb, s lépe pˇrístupným povrchem; smyˇcku nebo otoˇcku. Pˇrechod mezi cis a trans izomery vede k velkým strukturním zmˇenám, které zavádí ostré zmˇeny do peptidové páteˇre, a narušují tak pˇredchozí interakce, což zp˚usobuje nové možnosti rozpoznávání. Spontánní pˇrechod mezi dvˇema izomerními formami je velmi pomalý, protože cis a trans konformace jsou oddˇeleny velkou energetickou bariérou. Mohou být ovšem katalyzovány celou tˇrídou specifických enzym˚u, peptidyl-propyl cis-trans izomerázami (PPIázy), které ovládají naˇcasování izomerace specifickými protein-protein interakcemi. Prolin izomeráza Pin1/Ess1 souvisí s mRNA 3’ koncovou formací. Pin1 se váže k cˇ ásti CTD skrze svou WW doménu, (motiv, který se vyskytuje v nˇekolika dalších CTD-vázajících proteinech). [1] [3]


1.7

8

Další chemické modifikace CTD

Guanylyltransferázová doména cˇ epiˇckovací enzymové podjednotky Cgt1 váže fosforylovanou CTD. Cgt1 struktura vykazuje smíšené α/β ohyby. Další faktory ovlivˇnující CTD se vážou k fosforylované CTD skrze: domény specifické k CTD-vazbˇe, zahrnující WW domény, FF domény a CTD interakˇcní domény (CID). [2]

1.7.1

WW vazebné domény

Pin1, jehož souˇcástí je výše uvedená WW doména, je u lidí spojován s r˚uznými onemocnˇeními, jako je napˇríklad Alzheimerova choroba. WW domény jsou 40-reziduální domény, které obsahují dva tryptofanové zbytky oddˇelené 20 až 22 aminokyselinami. Na základˇe jejich vazebné specificity lze WW domény rozdˇelit do pˇeti skupin. Napˇríklad poddoména IV je specifická k fosfoserino-prolinovým motiv˚um (pSP), které se objevují dvakrát v každém CTD repeatu. [2] [3]

1.7.2

FF vazebné domény

FF domény se skládají ze dvou konzervovaných fenylalaninových zbytk˚u. Vícenásobné kopie FF domén, které vážou fosforylovaný CTD, m˚užeme najít v elongaˇcním faktoru (CA150) a splicing faktoru (Prp40). Struktura FF domény se skládá z troj-helikálních svazk˚u s 310 helixem vloženým do otáˇcky mezi druhým a tˇretím helixem. [2]

1.7.3

Výˇcet dalších modifikací

Fosforylace a další modifikace nemˇení jenom chemickou strukturu, ale provádí i konformaˇcní zmˇeny, což vede k rozpoznávání ostatními faktory. Napˇríklad fosfátová skupina fosfoserinu nese dvojitý negativní náboj a je schopná tvoˇrit vodíkové vazby cˇ i solné m˚ustky. Naproti tomu methylová skupina argininu/lysinu má opaˇcný efekt – rozrušuje pˇrípadné vodíkové vazby a podporuje hydrofobní interakce. Ubiquitinace a sumoylace p˚usobí velmi výrazné zmˇeny na CTD strukturu. Pˇripojení uhlovodík˚u, ubiquinonu a SUMO zˇrejmˇe blokuje pˇrístup k okolním aminokyselinám a zabraˇnuje nebo reguluje dynamické zmˇeny dalších posttranslaˇcních modifikací a vazebných faktor˚u. Detailní mechanismy a funkce nejsou zatím dobˇre popsány. [3] CTD m˚uže být také glykosylována, a to na serinu a treoninu. Glykosylace na pozici Ser5 a Ser7 vede k formaci pre-inicializaˇcního komplexu u vyšších eukaryot. Lysin m˚uže být mono-/di-/tri-methylován, zatímco argininová dimethylace m˚uže být symetrická cˇ i nesymetrická. Lysin ještˇe m˚uže být acetylován cˇ i sumoylován (podle SUMO small ubiquitinlike modifier). [3]

1.8

CID

CID (z angliˇctiny CTD interacting domain) jsou nejvíce studovaným druhem z CTD vazebných domén. Jsou souˇcástí protein˚u, které se podílejí na zpracovávání RNA, napˇríklad


9

jako podjednotka poly-A nezávislého transkripˇcního terminaˇcního komplexu Nrd1 u kvasinek. [3] CID je složen z osmi α šroubovic uspoˇrádaných do pravotoˇcivé superhelikální struktury, kde helixy 2, 4, a 7 spoleˇcnˇe tvoˇrí žlábek, který interaguje s CTD. Studie struktury odhalily, že CID se váže na 8 až 11 aminokyselin z CTD ˇretˇezce. Ve všech strukturách tvoˇrí CID-CTD komplexy, kde CTD peptid zaujímá klasickou β šroubovicovou konformaci, která je pˇrizp˚usobena vazebnému žlábku CID. Tato β otoˇcka je tvoˇrena S2 bP3 bT4 bS5 b a je vždy stabilizována tˇremi intramolekulárními vodíkovými vazbami, bez ohledu na fosforylace. Rozpoznávání konformace CTD peptidu je dosaženo pomocí mnoha kontakt˚u mezi proteiny obsahující CID a CTD. Tyto kontakty zahrnují vodíkové m˚ustky mezi CID a P6 a,b, S7 a, Y1 b a S5 b. Boˇcní hydroxylová skupina Y1 b tvoˇrí vodíkové m˚ustky s aspartátem CID. [3] Všechny CID-CTD komplexy obsahují vysoce konzervované strukturní rysy zahrnující Y1 zbytky: Y1 hydroxylová skupina tvoˇrí vodíkové m˚ustky s konzervovaným asparátem na CID, a aromatický kruh Y1 je vtˇesnán do hydrofobní kapsy CID. [3] CID domény se nacházejí v poly-A závislém 3’-RNA procesním faktoru Pcf11, dále v poly-A nezávislém 3’-RNA procesním faktoru Nrd1, ve faktorech obsahujících serin/ /arginin bohaté úseky SCAF4 a SCAF8, a v Rtt103, což je proteinový faktor, který se zúˇcastˇnuje terminace transkripce. CID doména Pcf11 se skládá z 8 α šroubovic v pravotoˇcivém superhelikálním uspoˇrádání. Zajímavé je, že Rtt103 CID váže pS2 CTD s vyšší afinitou než Pcf11 CID. Toto chování je vysvˇetleno pˇrítomností konzervovaného argininu v Rtt103 a také SCAF8, který tvoˇrí solné m˚ustky s fosfátovou skupinou pS2 b. [3] Ve všech komplexech, kde Ser-Pro peptidyl-propyl vazby jsou v trans konformaci vyjma struktury Nrd1 CID, která se váže k pS5 CTD. Nrd1 se váže výše na β otoˇcce v porovnání s ostatními CID-CTD komplexy. Používá konzervovanou oblast CID na N-terminální špiˇcce α2 šroubovice ke specifickému rozpoznání pS5 skrze vodíkový m˚ustek, která je zprostˇredkovávaná serinem a argininem. Struktura Nrd1 CID v komplexu s pS5 CTD ukazuje, že specifické rozpoznání pS5 a je usnadnˇeno cis konformací pS5 a-P6 a peptidylprolylové vazby. Cis konformace zvyšuje mezimolekulární kontakty a zabraˇnuje peptidu kolizi s α1 -α2 smyˇckou Nrd1. [3] Kromˇe specifické fosforylace terminaˇcní cesta Nrd1 vyžaduje Rss1 (Pin1 u lidí) – peptidyl-prolyl izomerázu, která specificky izomerizuje pSer5 -Pro6 peptidyl-propylovou vazbu v CTD. V kvasinkách je Ess1 podnícena defosforylací pSer4 -Pro6 , a pˇredpokládá se, že reguluje spojení s CTD. [5] Pro otestování, zdali Tyr1 fosforylace CTD narušuje vazby terminaˇcních faktor˚u, byla zjištˇena afinita cˇ ištˇené rekombinantní kvasinkové CID Nrd1, Pcf1 a Rtt103 pro r˚uzné kombinace dipeptidových fosfopeptid˚u za použití anizotropní fluorescence. Žádná z CID se neváže na nefosforylovaný CTD peptid. Pcf11-CID a Rtt103-CID se váží na fosforylovanýSer2 ; zatímco Nrd1-CID je pˇrednostnˇe vázán na fosforylovaný Ser5 CTD peptid. Naproti tomu, žádný z CID neváže fosforylovaný Tyr1 CTD peptid, at’ již byly ostatní peptidy fosforylovány, cˇ i nikoliv. Tedy Tyr1 fosforylace blokuje navázání CID k CTD in vitro. [4] Hlavním strukturním rozdílem mezi Pcf11-CID a Rtt103-CID vyplývajícím z rozdílných primárních sekvencí protein˚u je pˇrítomnost jedné otáˇcky navíc ve šroubovici 4 a mnohem kratší otoˇcce, která spojuje helix 7 a 8 v Rtt103-CID. SCAF8 a Nrd1 CIDy sdílí s Rtt103-CID prodloužení helixu 4 a kratší otoˇcku mezi helixy 7 a 8, ale liší se


10

ve smyˇcce, která pˇripojuje šroubovici 1 a 2 k další 310 -šroubovici v SCAF8-CID a také k otoˇcce šroubovice 1 v Rtt103-CID nebo Pcf11-CID. [14]

Kapitola 2 NMR spektroskopie Nukleární magnetickou rezonancí (NMR) lze mˇeˇrit frekvenci precese pro jádra, která mají nenulový spin. Spinová rezonance je daná lichým poˇctem proton˚u nebo neutron˚u v jádˇre. Nejlepší mˇeˇritelnost vykazují atomy, které mají poloˇcíselný spin, napˇríklad 1 H, 13 C, 15 N, 31 P. Pokud mají ale atomy sudý poˇ cet proton˚u a neutron˚u, to znamená, že jejich kvantové cˇ íslo je rovno nule, nejsou v NMR pozorovatelná – napˇríklad 12 C, 16 O. Záˇrení, které je absorbováno jádry, zp˚usobuje pˇrechody mezi energetickými stavy, které vznikají rozštˇepením jednoduchých stav˚u s nenulovým spinem. V moderní magnetické rezonanci se využívá magnetických polí až do intenzity cca 23 Tesla. NMR je metoda vhodná zvláštˇe pro studium struktury a uspoˇrádání molekul, pˇriˇcemž vyšší citlivosti a pˇresnosti je dosaženo jak vyšší intenzitou magnetického pole, tak vlastnostmi vzorku (koncentrace, pH, koncentrace soli apod.), ale také citlivostí mˇeˇrící sondy a kvalitou mˇeˇrící elektroniky. [25] Abychom byli schopni urˇcit strukturu pomocí NMR, potˇrebujeme znát: - multiplicity a interakˇcní konstanty J - chemický posun δ - integrální intenzity signál˚u a další hodnoty, napˇr. korelaˇcní signály

2.1 2.1.1

Teorie mˇerˇ ení Larmorova frekvence

Vektor magnetického momentu se pohybuje v magnetickém poli kolem své osy (koná precesní pohyb), který má stejnou frekvenci, jako je rezonanˇcní frekvence. Tato frekvence je oznaˇcována jako Larmorova. Mimo magnetické pole má tento vektor náhodnou orientaci. [28]

2.1.2

Stínˇení jader elektrony

Pokud jsou v atomu pˇrítomny elektrony, mohou zastínit jádro. Vytváˇrí se indukované magnetické pole, které má opaˇcnou orientaci než vnˇejší magnetické pole B0 . Naproti tomu holé atomové jádro, jako má napˇríklad H+ , je plnou mˇerou ovlivˇnováno vnˇejším polem B0 . – 11 –

Kapitola 2. NMR spektroskopie

12

Nˇekteré signály se mohou pˇri NMR mˇerˇení rozštˇepit (spin-spinové rozštˇepení) v d˚usledku interakcí se sousedními jádry pˇres své valenˇcní elektrony. Vzdálenost rozštˇepených signál˚u je udávána interakˇcní konstantou (Jab (Hz)), která je nezávislá na indukci vnˇejšího magnetického pole. Tento jev se projeví rozdˇelením intenzity signálu podle multiplicity pík˚u ve spektru. [25]

2.2

Postup mˇerˇ ení

Nevybuzené atomy mají svoje spiny orientované náhodnˇe. Teprve po vystavení silnému magnetickému poli (ˇrád indukce od 1 Tesla), jaderné spiny zaujímají dvˇe uspoˇrádané polohy – ve smˇeru vnˇejšího magnetického pole a proti smˇeru vnˇejšího mag. pole, které se liší svou energií stav˚u. Tato jádra jsou tedy excitována silným magnetickým polem. Je potˇreba, aby toto pole bylo vysoce stabilní a homogenní v celé délce mˇeˇreného vzorku, jinak hrozí rozšíˇrení linií spektra. Nehomogenní prvky magnetického pole lze odstranit rotací kyvety se vzorkem. Pˇri této rotaci každé jádro prochází r˚uznými oblastmi magnetického pole. Tato rotace je zprostˇredkována proudˇením vzduchu pˇres rotor, ve kterém je kyveta uchycena. [27] Do mˇeˇrící cívky, umístˇené v homogenní cˇ ásti magnetu, umístíme vzorek obsahující magneticky aktivní jádra. Cívkou protéká stˇrídavý proud o frekvenci v ˇrádech stovek MHz. Dále se již spojitˇe mˇení intenzita magnetického pole B0 nebo frekvence proudu v cívkách. Jakmile jsou splnˇeny rezonanˇcní podmínky, dochází k absorpci záˇrení vysokofrekvenˇcních rádiových vln. [25] Souˇcasné NMR spektrometry pracují již ve FT (Fourier transform) módu. Ten funguje následovnˇe: všechna jádra jednoho izotopu jsou excitována velmi krátkým radiofrekvenˇcním pulzem o trvání ˇrádovˇe nˇekolik µs. Pˇri návratu jader do rovnovážného stavu (relaxaci, zejména T2 ) je možno pozorovat volný pokles indukce, neboli FID (free induction decay). FID reprezentuje závislost intenzity indukované magnetizace na cˇ ase. Má-li vektor magnetizace nenulovou komponentu v transversální rovinˇe xy, precesní pohyb magnetizace vyvolá oscilující napˇetí v cívce, která obklopuje vzorek. FID tak nabývá tvaru exponenciálnˇe tlumené periodické funkce, která je souˇctem sinusoid s frekvencemi daných signál˚u. Nese informaci o fázovém posunu každé frekvence v˚ucˇ i fázi excitaˇcní frekvence. FID je závislostí intenzity signálu na cˇ ase, který je pomocí Fourierovy transformace transformován na závislost intenzity signálu na frekvenci, tedy klasické NMR spektrum. [25] [27] [28] Citlivost mˇeˇrení se zvyšuje s druhou odmocninou poˇctu opakování mˇeˇrení vzork˚u, což je hlavní výhoda FT NMR proti dˇríve používané kontinuální vlnˇe (CW). Lze dobˇre mˇeˇrit i zˇredˇené vzorky s jinak malou citlivostí. V rámci FT NMR je možné manipulovat se spinovými systémy cˇ i populacemi na jednotlivých hladinách, což vede k získání dalších informací o zkoumaném vzorku. [27] U souˇcasných FT spektrometr˚u se obvykle používá stejná cívka jak pro vysílání radiofrekvenˇcního pulzu, tak pro snímání odezvy. Další cívka cˇ i cívky slouží pro vysílání/snímání frekvencí jiného jádra, vytváˇrení gradient˚u pole a atd. [27]


2.3

13

T1 a T2 relaxace

V souvislosti s relaxací signálu se zavádí pojem relaxaˇcní cˇ as. Rozlišujeme zejména dva relaxaˇcní cˇ asy – první (T1 ) se oznaˇcuje jako longitudinální (spin-mˇrížkový) a má význam cˇ asu potˇrebného k návratu populace excitovaných spin˚u do p˚uvodního stavu. Tento cˇ as je velmi ovlivnˇený interakcí magnetických moment˚u s fluktuujícími magnetickými poli okolních jader. Vyjadˇruje hodnotu cˇ asu návratu více než poloviny populace (63 %) do p˚uvodního neexcitovaného stavu. Pˇri mˇeˇrení biomolekul nabývá relaxaˇcní cˇ as T1 hodnot 300 až 2000 ms. [19] Druhý relaxaˇcní cˇ as T2 je oznaˇcován jako transverzální (spin-spinová relaxace). Je dvakrát až desetkrát kratší, než cˇ as T1 , a má zásadní vliv na tvar spektrálních cˇ ar, nebot’ pološíˇrka cˇ áry je nepˇrímo úmˇerná relaxaˇcnímu cˇ asu T2 . Pro velké molekuly je T2 malé a naopak pro malé molekuly (napˇr. organické molekuly, ligandy, peptidy) je cˇ as dlouhý. V kapitole o TROSY je struˇcnˇe zmínˇen jeden ze zp˚usob˚u, jak dosáhnout relativnˇe úzké cˇ áry i pro velké molekuly a tím zvýšit hranici mˇeˇritelných biomolekul v NMR pˇres cca 20 kDa, které jsou hraniˇcní pro použití konvenˇcních NMR technik. [19]

2.4

Struktura pˇrístroje

Pˇrístroj na mˇerˇení NMR je obvykle velmi rozmˇerný supravodivý magnet zvonovitého tvaru, vyžadující neustálé chlazení. Magnetické pole je vytváˇreno supravodivými cívkami, z nichž každá obsahuje nˇekolik tisíc závit˚u, s protékajícím proudem ˇrádovˇe stovky Ampér˚u (250-260 A pro 950 MHz). Tyto supravodivé cívky jsou ponoˇrené do chladicích kapalin – tekutý dusík o teplotˇe −196◦ C (77,4K) a kapalné hélium −269◦ C (4,2K). Uprostˇred NMR magnetu je vertikální otvor, do kterého lze zavést vzorek. Pro lepší ilustraci je struktura popsána na obr. 2.1. [25] [26] Homogenita pole se optimalizuje pomocí speciální sady r˚uznˇe orientovaných cívek (shimovací cívky). Mˇeˇrení provádíme v sondˇe, která je vsunuta spodní cˇ ástí pˇrístroje. V poslední dekádˇe došlo k širšímu využívání speciálních kryosond, které jsou chlazeny plynným heliem na teplotu cca 17K, cˇ ímž se na snímaném signálu sníží ztráty vlivem termálního šumu v elektrických obvodech cívky a pozorujeme tak vyšší pomˇer signál šum ve srovnání s konvenˇcními sondami, které pracují pˇri laboratorní teplotˇe. [25] Jako kyvety se používají tenké trubice s jedním otevˇreným koncem, vyrobené z borosilikátového skla. Dodávají se v r˚uzných pr˚umˇerech (od cca 10 po 1,7 mm) a r˚uzným pr˚umˇer˚um odpovídá r˚uzná výmˇenná mˇeˇrící sonda (napˇr. 5mm kryosondu lze použít na mˇeˇrení 5 a 3 mm kyvet). Kyvety se liší i kvalitou zpracování, která je d˚uležitá pro mˇeˇrení na vyšších frekvencích. Mezi další souˇcásti NMR spektrometru patˇrí napˇríklad field frequency lock, systém shimovacích cívek, pulzní gradienty magnetického pole, kvadraturní detekce. [26]

2.4.1

Field frequency lock

Vlivem nestability magnetického pole B0 (driftu) se postupnˇe mˇení poloha mˇerˇeného signálu. Pˇri mˇeˇrení proto aktivujeme field lock, který se stará o stabilizaci tohoto driftu magnetického pole. Funguje jako samostatný NMR spektrometr, který pracuje se signálem


14

deuteria, a podle zmˇeny signálu 2 H koriguje hlavní pole B0 . Proto se tedy do mˇeˇreného vzorku pˇridává vždy pˇribližnˇe 10% deuteria. [26]

2.4.2

Systém shimovacích cívek

Tento systém se stará o stabilizaci pole v prostoru, nebot’ magnetické pole Zemˇe není na všech místech homogenní. Tato nehomogenita B0 je také zp˚usobena nedokonalou konstrukcí magnetu, okolních feromagnetických pˇredmˇet˚u, cˇ i nehomogenitou samotného vzorku. [26] Nehomogenita je odstraˇnována malými zmˇenami B0 pomocí korekˇcních cívek. Tento proces je nazýván shimmování. Korekˇcní shimovací cívky jsou rozmístˇeny kolem hlavní cívky v r˚uzných smˇerech, cˇ ímž lze pˇresnˇe mˇenit hlavní pole B0 . Pokud bylo dobˇre provedeno shimování, tvar a pološíˇrka pík˚u se blíží se ideálnímu tvaru Lorentzovy kˇrivky a celkovˇe se zlepší kvalita spektra. Rozlišujeme nˇekolik druh˚u cívek: z – cívky axiální; x nebo y – cívky radiální. Moderní NMR pˇrístroje obsahují systém automatického cˇ i poloautomatického shimování, které nejcˇ astˇeji využívá pulzní gradienty magnetického pole. [26]

2.4.3

Pulzní gradienty magnetického pole

Pomoci pulzních gradient˚u jsou vybírány koherence, a tím eliminovány dlouhé fázové cykly. Tyto gradienty také vykazují velkou efektivitu v potlaˇcování nežádoucích signál˚u, jako je tˇreba H2 O, bez efektu pˇrenosu magnetizace chemickou výmˇenou. [26]

2.5

Chemický posun

Chemický posun je jedním z dobˇre mˇeˇritelných parametr˚u v NMR spektru. Udává strukturní informaci. Tento parametr definuje vztah mezi Larmorovou frekvencí jádra a jeho chemickým okolím: pokud jádra nemají stejné chemické okolí a liší se rozložením elektron˚u, a tím pádem i intenzitou stínˇení jádra, které je úmˇerné vnˇejšímu magnetickému poli B0 , lze je charakterizovat stínící konstantou sigma. Dochází tedy k posunu rezonanˇcní frekvence o urˇcitý zlomek tohoto pole a jádra, která jsou nejvíce stínˇena, se posunují k vyššímu poli (tzn. nižším hodnotám ppm). Tento posun se vyjadˇruje pomocí jednotek ppm (miliontiny vnˇejšího pole). Jako poˇcátek stupnice je zvolen standard - tetramethylensilan (TMS). Výhoda tohoto standardu je, že má jedinou intenzivní a ostrou linii proton˚u, která je dobˇre identifikovatelná mezi ostatními a vzhledem k jeho nízké reaktivitˇe s biomolekulami jej lze použít jako vnitˇrní (nebo vnˇejší) standard mˇeˇreného vzorku. [25] [26] Hodnota výsledného chemického posunu, záleží na elektronové hustotˇe okolí jádra pozorovaného jádra. Chemický posun se používá namísto hertz˚u (Hz) z d˚uvodu, že se jedná o jednotku pˇrenositelnou mezi spektrometry o r˚uzné intenzitˇe magnetického pole. Chemický posun lze vypoˇcítat jako: δx =

Ωx − Ωre f · 106 ω0


15

kde δx znaˇcí konkrétní chemický posun v jednotkách ppm, Ωx rezonanˇcní frekvenci mˇeˇreného vzorku, ω0 frekvence magnetu a Ωre f rezonanˇcní frekvenci standardu (TMS). [25] [26] Chemický posun nˇekterých jader v proteinech a nukleových kyselinách je charakteristicky závislý na sekundární struktuˇre. Pokud se v místˇe náhodného klubka vyskytne alfa-šroubovice, chemický posun klesá, naopak u beta-skládaného listu roste. Silnˇe se liší napˇríklad chemický posun proton˚u ve vázaných skupinách −CH2 − cˇ i = CH−. Zmˇeny chemického posunu lze pozorovat napˇríklad pˇri NMR titraci proteinu ligandem. Z tˇechto zmˇen je možné následnˇe odvodit interakˇcního povrch studovaných molekul cˇ i disociaˇcní konstanty. [33] [19] Tabulka chemických posun˚u pro vybrané aminokyseliny, které se vyskytují v následující experimentální cˇ ásti, je uvedena v pˇríloze pod oznaˇcením tab. 3.1.

2.6

H2O a vliv D2O

K mˇeˇrení NMR spekter je potˇreba dosáhnout koncentrace proteinu alespoˇn 0,2 až 0,5 mmol/l, pH v rozmezí 4-8, adice redukˇcních cˇ inidel (R-SH) – kv˚uli zabránˇení oxidace cysteinu a následného vysrážení vzorku a pˇridání 5 až 10 % D2 O pro správnou funkci locku (viz. podkapitola Field frequency lock). [33] NMR je narozdíl napˇr. od rentgenové krystalografie metodou, která umožˇnuje mˇeˇrení za podmínek blízkých fyziologickým, což znamená, že mˇeˇríme ve vodném prostˇredí. Tato skuteˇcnost s sebou nese problém v podobˇe dominantního signálu vody, který, pokud jej nepotlaˇcíme, pˇrekryje signál všech ostatních pozorovaných protonových jader. Zp˚usob˚u, jak signál H2 O potlaˇcit nˇekolik. Tím nejsnažším by bylo mˇeˇrení v D2 O, leˇc v pˇrípadˇe protein˚u by došlo k výmˇenˇe amidických proton˚u za deuterony a další mˇeˇrení by nebylo možné. Je tedy tˇreba signál potlaˇcit jinými metodami: napˇr. metoda presaturace, metoda WATERGATE. Tato bakaláˇrská práce si neklade za cíl jakkoliv porovnávat zmínˇené metody – tyto jsou zde uvedeny jen pro pˇredstavu a dokreslení komplexity NMR mˇeˇrení biomolekul nezkušeného cˇ tenáˇre. [33]

2.7 2.7.1

Metody NMR HSQC

HSQC (Heteronuclear Single Quantum Coherence) je velmi citlivá spektroskopická metoda, která se cˇ asto používá v NMR spektroskopii. Základním schématem experimentu je pˇrenos magnetizace z protonu na druhý heteroatom použitím INEPTu (Insensitive nuclei enhanced by polarization transfer). Tato metoda využívá korelace chemického posunu pˇri pˇrímé vazbˇe k jádru. Vzniká tak dvoudimenzionální spektrum korelující 1 H na jedné ose s heteronukleárním atomem – nejˇcastˇeji 31 C nebo 15 N. Ve spektru lze pozorovat pík pro každý proton pˇrímo navázaný na pozorovaný heteroatom. [30] [31] 1 H-15 N HSQC protein˚ u: Všechna aminokyselinová rezidua mají (vyjma prolinu) amidový proton, který je pˇripojen k dusíku peptidickou vazbou (s jednovazebnou interakˇcní konstantou cca 90 Hz). Zmˇeˇrením proteinového 1 H-15 N HSQC získáme graf (proteinový


16

NMR otisk prstu), v nˇemž každý jeden pík odpovídá jedné aminokyselinˇe (a postranním rˇetˇezc˚um obsahujícím −NH2 ). HSQC je ovšem limitováno velikostí proteinu a pro proteiny pˇresahující velikostí 20-30 kDa již naráží na limit rozlišení a detekovatelnosti vlivem T2 relaxace. [30]

2.7.2

TROSY

TROSY (Transverse Relaxation Optimized Spectroscopy) je 2D metoda, která se používá k mˇeˇrení heteronukleárních korelací podobnˇe jako HSQC a stejnˇe jako HSQC slouží jako základ tˇrí- a více-dimenzionálním experiment˚um. Tato metoda využívá vyrušení anizotropie chemického posunu (CSA) a dipolárního kaplingu, pˇrípadnˇe mezi r˚uznými dipolárními kaplingy (správnˇe by se mˇel kapling nazývat interakˇcní/štˇepící konstanta, ale frekvence užívání tohoto názvu pˇrevládá v NMR žargonu nad cˇ eským ekvivalentem). Výsledkem 1 H-15 N TROSY spekter velkých biomolekul jsou ve srovnání s klasickým HSQC experimentem výraznˇe ostˇrejší píky. Závisí ovšem na síle magnetického pole. Ideální je 1 GHz pole pro amidy NH a 500 až 800 MHz pro aromatické postranní ˇretˇezce. TROSY tedy zlepšuje rozlišení a je vhodná pro molekuly o hmotnosti nad 20-30 kDa. Nejˇcastˇeji se používá pro biomolekuly, jako jsou velké bílkoviny, DNA, cˇ i proteinové komplexy. [30] [31] [32]

2.8

NMR titrace

NMR titrace je realizována tak, že k vzorku molekuly obohacené napˇr. izotopem 15 N je v malých pˇrídavcích pˇrititrován neznaˇcený vazebný partner (napˇr. protein, nukleová kyselina, peptid, malá organická molekula, ion). Titrace je monitorována zmˇeˇrením spektra (v pˇrípadˇe protein˚u typicky 1 H-15 N HSQC – heteronukleární jednokvantová korelace) po každém jednom pˇrídavku. Na konci titrace je koncentrace ligandu mnohem vˇetší než koncentrace samotného proteinu. V pˇrípadˇe pomalé výmˇeny (pomalá výmˇena na cˇ asové škále NMR, interakˇcní konstanta cca 100 nM-10 µM) je vznik komplexu provázen zmˇenou intenzity pík˚u (kde intenzita pík˚u odpovídajících volné formˇe pozorované molekuly se snižuje, zatímco intenzita pík˚u komplexu se zvyšuje) a také zmˇenou chemického posunu pozorovaných jader. V pˇrípadˇe rychlé výmˇeny (cca 10µM-100mM) pˇri vzniku komplexu je pozorován jen jeden pík, který je váženým pr˚umˇerem rezonanˇcních frekvencí volné a vázané formy pozorované biomolekuly. [22]

2.9

Strukturované vs. nestrukturované proteiny

Pokud je protein dobˇre strukturován, píky v NMR spektrech jsou ostré a dobˇre rozlišitelné s minimem spektrálních pˇrekryv˚u. Foldování protein˚u je nejvíce ˇrízeno vnitˇrními rezidui a jejich hydrofobními interakcemi. [8] [30] Struktura protein˚u má zásadní vliv na jejich funkci. Mnoho protein˚u cˇ i jejich oblastí mají strukturní poruchy v jejich pˇrirozeném funkˇcním stavu – což znamená, že nemohou


17

být popsány jednoduchým rovnovážným 3D stavem. Strukturní neuspoˇrádanost se vyskytuje v eukaryotických promotorech a souvisí s regulaˇcní funkcí. Existují také proteiny, které jsou nestrukturované ve volném/nenavázaném stavu a po pˇripojení vazebného partnera dojde k vytvoˇrení stabilní tˇrídimenzionální struktury. [7] [8] I proteiny, které jsou zapojeny do tvorby vazby, mohou fluktuovat mezi mnoha dynamickými stavy. Oblasti neuspoˇrádání mohou mít d˚uležité funkce, jako je napˇríklad zvyšování konformaˇcní volnosti a pˇrizp˚usobivosti dvou vazebných míst (napˇr. model klepeta RNA Pol II). Neuspoˇrádanost celého ˇretˇezce proteinu m˚uže umožˇnovat zcela nové, pˇrechodné, protein-proteinové interakce (náhodný model, napˇríklad rozpoznávání nˇekterých antigen˚u). [7] [8] Detailní charakterizace neuspoˇrádaného stavu a následky identifikace „foldovacích“ iniciaˇcních míst jsou nutné pro pochopení všech funkcí proteinu. [9]

2.10

5D NMR

Standardní pˇrístup pˇriˇrazování rezonanˇcních frekvencí protein˚u je založen na kombinaci troj-rezonanˇcních experiment˚u, které poskytují sekvenˇcní informaci skrze porovnání Cα a Cβ chemických posun˚u cˇ i korelací N chemických posun˚u. Tyto experimenty však neposkytují dostateˇcnou rozlišovací schopnost pro jednoznaˇcné pˇriˇrazení pro místa v proteinech s velkou degenerací chemických posun˚u proteinové páteˇre, zejména v pˇrípadˇe aminokyselin s opakujícími se motivy, jako je zkoumaný CTD heptapeptid nebo v pˇrípadˇe nestrukturovaných protein˚u. Pˇriˇrazení standardními metodami NMR biomolekul selhává v d˚usledku spektrálního pˇrekryvu signál˚u. V poslední dobˇe vznikly vysoce sofistikované metody, které používají Cα a Cβ chemických posun˚u cˇ i N a HN posun˚u k zjištˇení sekvenˇcního propojení v kombinaci s vysoce-dimensionálními experimenty, jako je napˇríklad metoda 5D. [11] Pulzní schéma 5D spektroskopie, která v sobˇe kombinuje vysokou dimenzionalitu spektra s nelineárním vzorkováním FIDu, umožˇnuje pˇriˇrazení proteinové páteˇre z jednoho spektra, zaznamenaného za cˇ as bˇežného 3D experimentu. Tato metoda již byla úspˇešnˇe odzkoušena na složitém biologickém systému, 20 kDa s cˇ ásteˇcnˇe narušenou δ -podjednotkou prokaryotní RNA Pol z Gram-pozitivních bakterií (BMRB 16912), kde sekvenˇcní pˇriˇrazení využívající klasických metod selhávalo. [11]

2.11

Použité softwarové vybavení

Pˇri mˇeˇrení a zpracovávání NMR spekter byl použit následující software:

2.11.1

Bruker Topspin

Bruker Topspin je komerˇcní program dodávaný s NMR spektrometry nˇemecké firmy Bruker. Tento program je podporován pro nejbˇežnˇejší platformy (Windows, Mac OS X cˇ i CentOS). Byl navržen pro jednoduché ovládání veškeré práce a cˇ inností spojené s mˇeˇrením na NMR spektrometrech firmy Bruker. Pomocí tohoto programu jsou zadávány a kontrolovány akviziˇcní parametry NMR experiment˚u. Dále tento program zajišt’uje nastavení


18

spektrometru, mˇeˇrící sondy atp. S programem TopSpin lze namˇeˇrená data i zpracovávat a provádˇet jednoduché analýzy následovnou práci s již namˇeˇreným spektrem, jako je napˇríklad vzájemné porovnávání spekter. Je dostupný na webové adrese: http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmrsoftware/software/topspin/ Pˇrevod dat z Bruker formátu NMR spektrometry od firmy Bruker ukládají namˇeˇrená hrubá NMR data do soubor˚u fid nebo ser podle dimenzionality spektra. Zpracovaná data jsou pak uloženy v souborech 1r, 2rr nebo 3rrr opˇet dle dimenzionality spektra. Program Sparky je schopen pˇreˇcíst 2rr a 3rrr soubory nicménˇe práce s tímto formátem program znaˇcnˇe zpomaluje. Pro rychlejší práci se spektry je vhodnˇejší pˇrevést spektra do formátu ucsf (University California San Francisko). Data z Bruker formátu do ucsf formátu lze pˇrevést pomocí podprogramu bruk2ucsf, který je souˇcásti balíku doprovodných nástroj˚u programu Sparky. Pro potˇreby této bakaláˇrské práce byl používán program Bruker Topspin verze 3.1.

2.11.2

Sparky

Sparky je jedním z nejjednodušších program˚u, které bˇeží v GUI (graphics user interface – grafické uživatelské prostˇredí) a zvládají zobrazovat 2- a více-dimenzionální NMR spektra. Tento program bˇehem svého spouštˇení využívá python konzoli. Zvládá napˇríklad pˇriˇrazovat píky a pokroˇcile s nimi pracovat, porovnávat naráz r˚uzná NMR spektra, obsahuje mnoho doplˇnk˚u, a možnost doprogramování nových v pythonu svými uživateli. Lze jej rychle ovládat pomocí dvojpísmenných klávesových zkratek, což velmi urychluje práci. Obsahuje také podprogramy na pˇrevod r˚uzných souborových typ˚u NMR spekter. Jedinou nevýhodou je, že byl v roce 2008 ukonˇcen vývoj, takže Sparky tedy stále obsahuje nˇekolik chyb, jako napˇríklad že pˇri otevˇrení mnoha oken podteˇce jejich seznam mimo zobrazitelnou oblast na obrazovce nebo že pˇri stisku funkˇcních kláves obˇcas nereaguje na poprvé, ale je nutné pro správnou funkci onu klávesu znovu stisknout. Je to freewarový program, který lze bezplatnˇe stáhnout na webových stránkách http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/. Díky využitím pythonu je tento program také multiplatformový – podporuje všechny tˇri hlavní operaˇcní systémy. Pro potˇreby této bakaláˇrské práce byl používán program Sparky verze 3.113.

2.11.3

NMRPipe

NMRPipe je UNIXový software, který integruje funkci zpracování, grafického rozhraní a analytických nástroj˚u, urˇcených pro plnˇení rutinních procedur a výzkumnˇe orientovaných multidimenzionálních požadavk˚u. Tento systém je založen na principu UNIXových trubek (pipes), které dovolují podprogram˚um sdílet toky dat podle požadavk˚u uživatele. NMRPipe zpracovává proud (stream) spektrálních dat, které teˇcou skrze trubky program˚u podílejících se na zpracování, z nichž každý provádí jednu proceduru z celkového systému, jako je napˇríklad Fourierova transformace cˇ i lineární predikce. Kompletní zpracování multidimenzionálních spekter je ˇrešeno skrze schéma zpracování, které je napsáno ve formˇe jednoduchého UNIXového


19

skriptu pro terminál. Zpracovávající moduly jsou schopny si sami naˇcíst potˇrebné údaje a parametry zpracovávaných dat. Tento režim asynchronních trubek je vhodný napˇríklad díky své vysoké flexibilitˇe, dobré rychlosti zpracování, možnosti volby, zda uživatel chce používat výhradnˇe zpracování v operaˇcní pamˇeti cˇ i na disku. Dále pak podporu mnoha datových formát˚u, možnost pˇrerozdˇelení výpoˇct˚u mezi více procesor˚u (multi-CPU) cˇ i poˇcítaˇcových klastr˚u. Program NMRPipe lze volnˇe stáhnout na internetu na stránkách: http://spin.niddk.nih.gov/ bax/software/NMRPipe/info.html a poté, bez instalace, rovnou spouštˇet na všech tˇrech hlavních operaˇcních systémech, což jsou Windows, Mac OS X a Linux. Každé zpracování NMR dat zaˇcíná konverzí dat z formátu spektrometru (bruker-formát) do formátu NMRPipe. Tuto operaci kontroluje funkce bruk2pipe (ukázka skriptu je uvedena v pˇríloze jako obr. 3.8). Po úspˇešné konverzi je tˇreba data pˇretransformovat z cˇ asové domény do frekvenˇcní domény. U jednodušších 2D- a 3D-spekter je tato procedura pomˇernˇe nenároˇcná, nicménˇe v práci zmiˇnovaná spektra byla sbírána s nelineárním vzorkováním a celá procedura zpracování vyžaduje nároˇcnˇejší zp˚usob zpracování. Pˇrestože softwarový balík NMRPipe zahrnuje i moduly NMRDraw a NMRView, které umožˇnují analýzu a post-processing NMR dat, program Sparky se osvˇedˇcil a je k tˇemto úˇcel˚um tradiˇcnˇe využíván. Pro potˇreby této bakaláˇrské práce byl používán program NMRPipe verze 7.9 rev 2013.012.23.09.


20

ˇ NMR magnetem. 1. Rezervoár na tekutý dusík, 2. Rezervoár pro kaObrázek 2.1: Rez palné helium, 3. Supravodivý magnet, 4. Elektronika magnetu, 5. Kanál pro vložení vzorku (zvýraznˇen zelenˇe), 6. Pozice mˇeˇrící sondy (zvýraznˇen cˇ ervenˇe), 7. Komíny pro servisní doplˇnování tekutého dusíku a kapalného helia, 8. Pozice vzorku bˇehem mˇeˇrení.

Kapitola 3 Experimentální cˇ ást V této experimentální cˇ ásti bude cˇ tenáˇr nejdˇríve seznámen se aspekty pˇrípravu vzorku pro mˇeˇrení NMR, následuje struˇcný popis použitého software k akvizici, zpracování a analýze NMR spekter. Dále zde bude uveden popis pr˚ubˇehu samotného mˇeˇrení u NMR spektrometru, NMR titrace a v poslední cˇ ásti pˇriˇrazování poˇradí aminokyselin na proteinovou páteˇr pomocí 5D NMR.

3.1

Pˇríprava vzorku

Proteinová NMR spektroskopie se opírá o detekci izotop˚u 1 H, 13 C a 15 N. Pˇrirozené zastoupení izotop˚u 13 C a 15 N je ale velmi malé a pro zvýšení citlivosti požadované pro multi-dimenzionální NMR spektroskopii je nutné zvýšit jejich zastoupení v NMR vzorcích. [22] Pˇri sestavování struktury projektu je tedy nutné zvolit, jaké atomy je tˇreba mít obohaceny (13 C cˇ i 15 N), což pˇri expresi protein˚u volíme zdroji dusíku (NH4Cl/15 NH4Cl) a energie (glukóza/C6 −13 C-glukóza). Pro srovnání je zde uveden obecný postup pro pˇestování protein˚u v buˇnkách: Do bunˇek E. Coli cˇ i kvasinek se vnese vektor požadované sekvence, která obsahuje informaci o expresi daného proteinu. Tyto buˇnky se kultivují na obohaceném substrátu 13 C znaˇcené glukózy, cˇ i 15 N napˇríklad znaˇcený 15 NH4Cl. Po dostateˇcné kultivaci jsou buˇnky oddˇeleny od pˇestebního bujónu, lyzovány ultrazvukem. Požadované proteiny jsou následnˇe navázány pomocí svého taggu (proteinové purifikaˇcní znaˇcky) k separaˇcnímu médiu, odstˇredˇeny, odsáty od zbytku a následnˇe pˇreˇcištˇeny. Vzorek pro NMR mˇeˇrení byl pˇripraven následovnˇe – protein byl exprimován v BL21 (DE3) RIPL E.Coli v M9 r˚ustovém mediu obsahujícím C6 −13 C-glukózu a 15 NH4Cl. Kultura rostla do optické hustoty OD pˇribližnˇe 0,6, poté indukována 0,1mM IPTG. Protein byl exprimován pˇri 30◦ C pˇres noc. Buˇnky byly lyzovány v denaturaˇcním pufru (8M mocˇ ovina) na NiNTA kuliˇckách a refoldován na kolonˇe s nativním pufrem. Protein byl eluován nativním pufrem obsahujícím 300mM imidazol. Pˇríprava vzorku byla optimalizována a provádˇena kolegyní Olgou Jasnovidovou, M.Sc.

– 21 –

Kapitola 3. Experimentální cˇ ást

3.1.1

22

Pˇríprava vzorku pro NMR mˇerˇ ení

Dodaný peptid byl rozpuštˇen ve fosfátovém pufru (50 mM Na2 HPO4 , 100mM NaCl, pH=8.0, 10mM beta-merkaptoetanol a 10/90 objemových% D2 O/H2 O.). Takto pˇripravený roztok peptidu byl vpraven do NMR kyvety, se kterou se dále pracovalo. Vzorky byly míchány a pˇripravovány kolegyní Olgou Jasnovidovou, M.Sc.

3.2

Mˇerˇ ení NMR spekter

3.2.1

Manipulace se vzorkem

5mm NMR kyveta se vzorkem (obr. 3.1) byla vložena do NMR rotoru a dle šablony vycentrována tak, aby byla kyveta správnˇe usazena v mˇeˇrící sondˇe. Pomocí proudu stlaˇceného vzduchu byl rotor s kyvetou nadnášen a postupným snižováním pr˚utoku vzduchu docházelo k zanoˇrování vzorku do spektrometru a následnému usazení kyvety v sondˇe.

3.2.2

Inicializaˇcní procesy mˇerˇ ení

Na separátním displeji kontrolujícím hladinu deuteriového signálu se objevil signál D2 O, a funkce lock (viz. výše) je aktivována. Po „zalockování“ je zadán pˇríkaz pro gradientní optimalizaci homogenity magnetického pole shimmovacími cívkami. Dalším pˇríkazem (atmm manwbsw) je zahájeno ladˇení NMR sondy.

3.2.3

Ladˇení sondy

Sonda obsahuje dva hlavní ladící kapacitory, z nichž se jeden stará o ladˇení požadované rezonanˇcní frekvence (tuning) a druhým, který zajišt’uje nezbytné pˇriˇrazení impedance síti (matchnig). Impedance mˇeˇrícího obvodu sondy a frekvence musí být naladˇeny tak, aby minimum zobrazeného signálu (pro 1 H a 13 C uvedeno na obr. 3.2) smˇeˇrovalo do pr˚useˇcíku cˇ ervené svislice a frekvenˇcní osy x. [20] Moderní sondy jsou vybaveny generátorem rozkmitání kmitoˇctu (wobble generátor), který poskytuje symetrickou informaci frekvenˇcní závislosti na ladˇení. V použitých spektrometrech byla wobbling funkce již zakomponována do softwaru Bruker Topspin, tudíž ladˇení a vyrovnávání (matching) bylo provádˇeno pˇrímo na obrazovce v reálném cˇ ase. [20] Typický pˇríklad rozladˇené ladící kˇrivky je uveden na obrázku 3.3. Pomocí GUI operátor iterativnˇe naladí nejdˇríve Matching (urˇcuje pohyb kˇrivky ve vertikálním smˇeru), a následovnˇe Tuning (pohyb kˇrivky v horizontálním smˇeru). Smyslem této cˇ innosti je dostat kˇrivku do nejnižšího bodu, osovˇe soumˇernou podle cˇ ervené vertikální linie tak, aby nebyl narušen tvar kˇrivky. Obecnˇe se postupuje dle vzr˚ustající rezonanˇcní frekvence ladˇených jader, napˇr. 15 N− >13 C− >1 H. Velmi záleží na tom, v jakém prostˇredí je vzorek rozpuštˇen, jaká je koncentrace solí (NaCl/KCl), teplotˇe apod. Nepˇresné naladˇení sondy se odráží v horší citlivosti mˇeˇrení a delších radiofrekvenˇcních pulzech.


23

Obrázek 3.1: Vlevo kyveta se vzorkem zasazená do rotoru. Uprostˇred vložený komplex s rotorem do šablony, pro správné vycentrování vzorku. Vpravo detailní pohled na správné vycentrování vzorku.


24

Obrázek 3.2: TopSpin – wobbling: Správnˇe naladˇená sonda pro proton (vlevo) a uhlík (vpravo)

Obrázek 3.3: TopSpin – wobbling: Ladˇení sondy pro dusík. Vlevo výchozí nastavení z poloautomatického režimu. Vpravo správnˇe doladˇená sonda operátorem.


3.2.4

25

Kalibrace 90◦ 1 H pulzu

Znát cˇ asovou délku pulzu je nezbytné pro správné mˇeˇrení pulzní FT NMR spektroskopie. Špatné nastavení excitaˇcního pulzu tedy vede k necitlivosti a nepoužitelnosti NMR mˇeˇrení. Doba pulzu je urˇcena následovnˇe: Naší snahou je zjistit délku doby pulzu pro 90◦ , kdy je funkce sinus v maximu. Nejlépe se ale tato doba hledá ve cˇ tyˇrnásobné cˇ asové hodnotˇe – když funkce sinus nabývá svého nulové hodnoty => lze pozorovat (v ideálním pˇrípadˇe) nulový signál. [20] Nejdˇríve je délka pulzu p1 (oznaˇcení 90◦ 1 H pulzu v programu TopSpin) nastavena na hodnotu 1 µs. Po namˇeˇrení jednoho 1D spektra je potˇreba nastavit správnou fázi signálu H2 O. Jakmile je vše v poˇrádku, probíhá zadání hodnoty, která by pˇribližnˇe mohla být správná (u mˇeˇrených vzork˚u se pohybovala kolem hodnot 45 až 55 µs pˇri výkonu pulzu 14 W). Po každé zmˇenˇe hodnoty cˇ ísla délky pulzu p1 probíhá zkušební mˇeˇrení a následné vyhodnocení tvaru výsledného 360◦ pulzu, dokud není dosaženo „nulové“ intenzity signálu. Správnˇe nakalibrovaný pulz je uveden na obr. 3.4. Koneˇcnˇe je tato hodnota délky pulzu p1 vydˇelena cˇ tyˇrmi, aby byla získána hodnota 90◦ pulzu, která je potˇrebná k samotnému mˇeˇrení.

Obrázek 3.4: TopSpin: Nastavení p1 pulzu. 360◦ pulz zobrazen vlevo a 90◦ vpravo.

Pˇríkazem „gs“ (go scan) provedeno zkušební mˇerˇení naneˇcisto – dochází pˇri nˇem k optimalizování akviziˇcních parametr˚u (výkon presaturaˇcních pulz˚u, offset v protonové dimenzi atp.) v reálném cˇ ase, aniž by byly sbírány FIDy.


3.2.5

26

Spuštˇení NMR experimentu

Po úspˇešné kalibraci a optimalizaci akviziˇcních parametr˚u dochází k nastavení dalších parametr˚u (poˇcet opakování mˇeˇrení, poˇcet bod˚u v jednotlivých dimenzích, poˇcet mˇeˇrení, než dojde ustavení termodynamické rovnováhy, apod.). Poté je možno spustit mˇeˇrení 1D a/nebo 2D spektra, jehož výstupem po FT je již samotné spektrum. Po ukonˇcení mˇeˇrení je tˇreba vypnout lock a stlaˇceným vzduchem vzorek v rotoru vyjmout z magnetu. V našem pˇrípadˇe inicializaˇcní kroky trvaly cca 10-15 minut. Samotné mˇeˇrení 1D a 2D spektra s potˇrebnou pˇresností pro jeden vzorek zabralo pˇribližnˇe 50 minut. Mˇeˇrení probíhalo na NMR spektrometru firmy Bruker 950 MHz. Pˇrípadné opakování mˇeˇrení pro jiný vzorek/jinou koncentraci bylo provedeno opakováním celé procedury. Obˇcas po mˇeˇrení spektra bylo nutné vyrovnat fáze pro jednotlivé detekované atomy. Pro ilustraci je zde uveden obrázek 3.5. V pˇríloze je také uveden protokol mˇeˇrení vˇcetnˇe pˇríkaz˚u (obr. 3.9).

Obrázek 3.5: TopSpin: Fázová korekce pro 3 vybrané píky spektra.

3.3

NMR titrace

Bˇehem mˇeˇrení související s touto bakaláˇrskou prací bylo provedeno nˇekolik kompletních NMR titrací. Podrobnˇeji bude popsána jen jedna z nich, a to z 22. 11. 2012. Ostatní probíhaly analogicky. Zpracování a analýza veškerých dat namˇeˇrených bˇehem této bakaláˇrské práce vyžaduje výraznˇe vˇetší cˇ asovou dotaci, nebot’ se jedná o rozsáhlý projekt, v dalším textu budou tudíž zmínˇeny pˇredevším dokonˇcené fragmenty projektu.


27

Titraˇcní experiment (popis viz. výše) probíhal v šesti krocích, pˇriˇcemž v prvních cˇ tyˇrech probíhala samotná titrace a v posledních dvou experimentech byl k titraˇcní smˇesi pˇrimíchán MRI-kontrastní agens OmniScan. Mˇeˇrení CTD kontruktu nazvaného „15N E5_13_flag“ probíhalo mˇeˇrením 1 H−15 N TROSY spekter CTD za pˇrídavk˚u neznaˇceného Nrd1 CID. Význam názvu mˇeˇrení: 15N oznaˇcuje obohacení CTD izotopem dusík 15 N; E5 – fosforylovaný Ser5 byl vymˇenˇen v sekvenci za Glu5 (velká strukturní i chemická podobnost = simulace fosforylace – rozvedena na obr. 3.6); 13 – 13krát repetice; flag = CTD obsahuje purifikaˇcní kotvu flag (sekvence: DYKDDDDK) na C-terminálním konci. NMR mˇeˇrení bylo provádˇeno za konstantní teploty 293K (20◦ C) a konstantního pH vzorku 8.0.

Obrázek 3.6: Strukturní porovnání fosforylovaného serinu (vlevo) a kyseliny glutamové (vpravo). Uprostˇred vyrenderován pro srovnání pˇrekryv tˇechto aminokyselin. V prvním kroku bylo zmˇeˇreno 1 H-15 N TROSY volného 15 N E5_13_flag bez pˇridání vazebného CIDu, pˇri podmínkách: 100mM NaCl, 50mM Na2 HPO4 a 10mM betamercapto EtOH. Je vhodné pˇripomenout, že Nrd1 CID interaguje se dvˇema opakováními CTD , tudíž pˇri 13 opakováních CTD oˇcekáváme vazbu více jednotek Nrd1 CID za vzniku velkého komplexu Nrd1 CID-CTD. [2] [14] V druhém kroku byla pˇridána první dávka 70-80 µl 1,86mM CID, ve tˇretím kroku stejná dávka CIDu, vedoucí na celkový objem CID 150-170 µl. Ve cˇ tvrtém kroku byl pˇridáním zvýšen celkový objem stále stejného CID na 220-250 µl a pˇribližná koncentrace CID:E5 byla 3:1. V pátém kroku bylo k pˇredchozímu vzorku pˇridáno 5 µl 0,5M OmniScanu. A v posledním (šestém) kroku bylo pˇridáno opˇet 5 µl 0,5M OmniScanu. Titrace na chemické úrovni tedy probíhala tak, že k 15 N E5_13_flag byl postupnˇe pˇridáván CID, který nemˇel znaˇcený dusík, cˇ ímž pádem byl Nrd1 CID v 1 H-15 N TROSY nepozorovatelný. Po tvorbˇe komplexu 15 N E5_13_flag s CIDem lze pozorovat zmˇeny v 2D spektru, zp˚usobené chemickým posunem. OmniScan, neboli chemicky gadodiamid, je chemická slouˇcenina gadolinia, která se váže na povrch komplexu E5 s CIDem a zp˚u-


28

sobuje vymizení pík˚u, které jsou exponované do solventu. Pˇri pˇreložení prvního a cˇ tvrtého spektra mˇeˇrení titrace 15 N E5_13_flag lze pozorovat posun vˇetšiny pík˚u ve 2D spektru, což je d˚usledkem vzniku komplexu E5 s Nrd1 CID. Toto spektrum je uvedeno na obrázku 3.7.

Obrázek 3.7: NMR titraˇcní spektrum E5 13 C s Nrd1 CID. Modˇre je zobrazeno spektrum pˇred titrací a cˇ ervenˇe spektrum po ukonˇcení titrace. Volné spektrum E5 CTD vykazuje charakteristické znaky cˇ ásteˇcnˇe nestrukturovaného proteinu – velký spektrální pˇrekryv, píky jsou intenzívní a nelze rozlišit, jaké procento z oˇcekávaných 117 je pozorovatelných. Spektrum po ukonˇcení titrace sice potvrzuje pˇredpokládanou interakci mezi obˇema molekulami, ale oˇcekávaná stabilizace strukturní konformace CTD E5 vedoucí k vˇetšímu spektrálnímu rozptylu a pozorování „nových“ pík˚u se neprojeví. Je však znovu zd˚uraznit, že pˇri formování komplexu dochází ke zvýšení molekulové hmotnosti až na >100 kDa, což už je velká molekulová hmotnost i na TROSY experiment.

3.4

Pˇriˇrazování sekvence aminokyselin v CTD pomocí 5D NMR experimentu

Druhý úsek experimentální cˇ ásti bude vˇenován pˇriˇrazování sekvence aminokyselin CTD pomocí 5D NMR experimentu. Jako vzorek byl použit „13C 15N E5 13Flag“. Od pˇredchozího výše popisovaného vzorku se liší tím, že navíc obsahuje izotopicky obohacené uhlíky 13 C.


29

Po namˇeˇrení titrace pomocí TROSY experiment˚u bylo zˇrejmé, že bude tˇreba zmˇenit pˇrístup ke studiu interakce mezi Nrd1 CID a E5 CTD použitím rozvíjejících se technik uhlíkové detekce. Za tímto úˇcelem bylo namˇeˇreno CON spektrum („HSQC“ nebo „otisk prstu“ nestrukturovaných protein˚u). Obrázek spektra uveden v pˇríloze pod oznaˇcením obr. 3.10. Tento experiment ukázal výraznˇe lepší disperzi signál˚u a po pˇrídavku Nrd1 CID lze rovnˇež pozorovat zmˇeny chemického posunu, analogicky jako v 1 H-15 N TROSY spektru. Nicménˇe diskutována budou pouze spektra týkající se volného proteinu CTD E5. Vzorek 13 C 15 N E5 13Flag, který byl použit pro 5D mˇ eˇrení obsahoval: 0,97 mM CTD RNA Pol II se substituovaným Ser5 za Glu5 v heptapeptidické repetici. Proteinový pufr obsahoval 50 mM Na2 HPO4 , pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM beta-merkaptaethanol a 10% D2 O. Veškeré experimenty byly provedeny pˇri 293,2 K. 5D experiment CACONCACO koreluje v 5 dimenzích Cα s karbonyly dvou sousedních aminokyselin. Toto mˇeˇrení bylo provádˇeno se rozlišením na 6000 (aq) x 2000 (15 N) x 3125 (13 Cα ) Hz. Maximální vývojové cˇ asy v nepˇrímých dimenzích, byly nastaveny 24 ms pro 13 Cα dimenzi, 50 ms pro 15N dimenzi a 32 ms pro 13 C’ dimenzi. Experiment byl mˇeˇren v pseudo 2D režimu na základˇe parametr˚u stanovených pro standardní 2D CaCO. Experiment byl zaznamenán s 1024 komplexními body v mˇeˇrené dimenzi a 1800 hyperkomplexními body náhodnˇe rozdˇelenými do nepˇrímo detekovatelných dimenzí. Data byla namˇeˇrena na 700 MHz Bruker Avance II spektrometru vybaveným kryogenní sondou s pˇrímou detekcí uhlíku (5 mm CPTXO 13C/15N-1H/D Z-GRD Z130738/0001). Pro ilustraci je v pˇríloze uvedena fotka spektrometr˚u z mˇeˇrení – jak z titrace, tak z tohoto experimentu (obr. 3.11).

3.4.1

Zpracování dat

Veškerá namˇeˇrená data byla zpracována pomocí softwaru NMRPipe/NMRDraw. Poˇcet spektrálních bod˚u byl nastaven na 1536. Nestejnomˇernˇe vzorkovaná 5D data byla zpracována algoritmem Sparse Multidimensional Fourier Transform (SMFT). Spektra byla dále analyzována v NMR softwaru Sparky. K pˇrekonání degenerací v kmitoˇctech byly použity a vzájemnˇe zkombinovány 4 netradiˇcní zp˚usoby experimentálního zpracovávání. [11] • Pˇrímá detekce 13 C za využití vysoké disperze karbonylových signál˚u. • Rozlišení v nepˇrímých dimenzích bylo maximalizováno prodloužením vývojových cˇ as˚u s využitím relativnˇe pomalých R2 relaxaˇcních rychlostí. Ke zrychlení sbírání dat byla použita metoda neuniformního vzorkování (NUS). • Pomocí NUS se dále podaˇrilo pˇri 5D mˇeˇrení odstranit spektrální pˇrekryv a nejasnosti v pr˚ubˇehu pˇriˇrazovaní. • Byly použity metody pro optimalizaci podélné relaxaˇcní doby, které vedou k nár˚ustu rychlosti a citlivosti mˇeˇrení.


30

Pˇridáním dimenzí v 5D experimentu také velmi vzrostlo rozlišení. Hlavní výhoda použitého NUS je zkrácení cˇ asu mˇeˇrení experimentu. K získání frekvenˇcních informací z 5D spektra je zapotˇrebí bud’ snížit dimenzionalitu spektra, nebo plnˇe obnovit trojrozmˇerné spektrum. V rámci této bakaláˇrské práce byl použit druhý zp˚usob, nebot’ se poté pracuje s 2D a 3D spektry. Ke zpracování všech 5D namˇeˇrených dat a následného pˇrevedení do plnohodnotného 5D spektra by bylo zapotˇrebí terabajt˚u prostoru v diskovém poli poˇcítaˇce, tudíž je výhodnˇejší vypoˇcítat 2D ˇrezy z 5D matice za pomoci SMFT algoritmu. Nejdˇríve bylo nutné projít 3D spektrum v programu Sparky a oznaˇcit významné signály píky. Tímto vznikl seznam pík˚u, který obsahoval pˇresné souˇradnice v trojrozmˇerném prostoru jednotlivých signálních špiˇcek (vrchol˚u pík˚u). Podle toho seznamu byly následovnˇe vygenerovány pomocí programu NMRPipe 2D spektra pro každý oznaˇcený pík zvlášt’. Ukázka zpracovávajícího skriptu pro NMRPipe je uvedena v pˇríloze (jako obr. 3.8). Tímto generováním, které vzniklo bˇehem nˇekolika minut, bylo vytvoˇreno mnoho soubor˚u 2D spekter, oznaˇcených ucsf∗, kde hvˇezdiˇcka reprezentuje cˇ íslo od 0 do N, kde N je cˇ íslo poˇradí pˇredposledního píku. Hlavní práce pˇriˇrazování probíhá pˇrevážnˇe v programu Sparky. Nejdˇríve bylo potˇreba zvolit poˇcáteˇcní bod, ze kterého se dále vycházelo metodou propojování jednotlivých aminokyselin do ˇretízku za sebe. Bylo tedy otevˇreno 2D spektrum s oznaˇcením ucsf0, kde byl oznaˇcen jediný významný pík pomocí funkce uživatelské znaˇcky (user label) libovolným cˇ íslem, napˇr. 99. 2D spektrum obsahovalo souˇradnice pro Cα a C’. Podle hodnoty souˇradnice Cα byl nastavený ˇrez rovinou ve 3D spektru, kde byly již oznaˇceny píky, podle kterých se generovala 2D spektra. Hodnota C’ z výchozího 2D spektra byla použita k nalezení odpovídajícího píku ve 3D spektru tak, že vertikální cˇ ára vedená touto hodnotou protínala nový pík ve 3D. Podle souˇradnic tohoto píku z 3D spektra byl nalezen podle klíˇce odpovídající ucsf∗ 2D soubor. V tomto souboru spektra byl opˇet oznaˇcen další pík, tentokrát s cˇ íslem o jedna nižší, než pík pˇredchozí. Tento oznaˇcený pík opˇet ukazoval do 3D do roviny Cα , a pod souˇradnicí odpovídající C’ byl další pík, jehož spektrální 2D ucsf∗ soubor byl vyhledán a použit. Tato cˇ innost se opakovala do doby, dokud 2D spektra ukazovala na píky ve 3D. Sekvence tedy byla pˇriˇrazována odzadu. Chronologicky jdoucí cˇ ísla odpovídají chronologickému poˇradí aminokyselin v ˇretˇezci. Matematicky ˇreˇceno: Oznaˇcený pík Ni ; Cαi ; C’i v 3D spektru (NCACO) koreluje s ucsf∗ 2D spektrem (CACO) s hodnotami Cαi−1 ; C’i−1 . Obˇcas se stalo, že ve 3D nebyl kolem osy hodnoty C’ nalezen žádný odpovídající pík – což bylo zp˚usobeno chybˇejícími 2D soubory, které byly poté dodateˇcnˇe generovány a opˇet pˇriˇrazovány. Byl tedy podle seznamu soubor˚u zvolen další poˇcáteˇcní bod s cˇ íslem o 100 vyšším než pˇredchozí poˇcáteˇcní bod. Nezˇrídka se stávalo, že 2D spektrum ukazovalo do místa 3D spektra, které mˇelo již použitý pík, a tím pádem došlo k zacyklení metody. Toto bylo zp˚usobeno repetitivní sekvencí heptapeptidu a tedy spektrálním pˇrekryvem. Pro názornou ukázku je v pˇríloze uvedena tabulka (tab. 3.2), ve které jsou zaznamenány nˇekteré z vybraných hodnot pˇri pˇriˇrazování bˇehem mˇeˇrení. Jediný problém pˇri pˇriˇrazování aminokyselin se vyskytl u serinu, který pˇredcházel v ˇretˇezci prolinu, nebot’ takto vázaný prolin snižuje chemický posun serinu.


31

Byly tedy urˇceny následující fragmenty sekvence: r YSPTEPSYSPAAADYKDDD, r EPSYS, r SPTEPS, x PEFT, r YSP, r TE, r TE, r TE, r PSY Kde symbol „r“ znaˇcí repetici, neboli zacyklení a symbol „x“ znaˇcí, že toto místo se stalo slepým bodem, který pˇri pˇriˇrazování nikam dále nevede. Urˇceno bylo 44 aminokyselin v ˇretˇezci ze 117 aminokyselin (neboli 38%). Urˇcené fragmenty jsou zobrazeny cˇ ervenou barvou v následující sekvenci. Fragmenty z opakování byly umístˇeny do náhodné pozice. Poˇcátky opakování heptapeptidu zobrazeny kurzívou:

SPEFTCSPTE PSYSPTEPSY SPTEPSYSPT EPSYSPTEPS YSPTEPSYSP TEPSYSPTEP SYSPTEPSYS PTEPSYSPTE PSYSPTEPSY SPTEPSYSPT EPSYSPAAAD YKDDDDK

Závˇer Cílem bakaláˇrské práce bylo studium CTD RNA Pol II a její interakce s CID doménami r˚uzných protein˚u, zejména Nrd1 a Rtt103. Zmˇeˇrením nˇekolika NMR titrací, kde jsme pomocí série 15 N TROSY sledovali zmˇeny jak na stranˇe CID domény, tak na stranˇe CTD domény, jsme ovˇeˇrili, že v nastavených podmínkách k vytvoˇrení komplexu mezi CTD a CID dochází. K jednoznaˇcnému pochopení, která jsou klíˇcová rezidua úˇcastnící se této interakce, je potˇreba jednoznaˇcnˇe urˇcit rezonanˇcní frekvence pozorovaných jader (tedy páteˇrových jader 1 H, 15 N, C, a Cα). Interakce mezi Rtt103 a CTD probíhá v oblasti pomalé výmˇeny (na cˇ asové škále NMR), což komplikuje urˇcení finálních pozic interagujících pík˚u proteinu Rtt103 CID. Další komplikací je skuteˇcnost, že CTD je flexibilní, vˇetší cˇ ástí neuspoˇrádaný protein. V naší práci byly použity dva konstrukty se tˇrinácti opakováními, kde fosforylované seriny byly nahrazeny glutamáty, a to bud’ na pozici dvˇe (pˇri interakci s Rtt 103) nebo pozici 5 (pˇri interakci CTD s Nrd1 CID). Nestrukturovanost tˇechto konstrukt˚u si nutnˇe vyžádala rozvíjející se metodologii „bezprotonových“ experiment˚u, která je ideální právˇe pro nestrukturované proteiny nebo tzv. „neostré“ komplexy [7]. Výše uvedené cíle jsou pomˇernˇe ambiciózní a zcela jistˇe pˇrekraˇcují rámec standardní bakaláˇrské práce. Je tedy znaˇcným úspˇechem, že se podaˇrilo v rámci bakaláˇrské práce namˇeˇrit nˇekolik sérií titraˇcních 15 N TROSY spekter a data pro sekvenˇcní pˇriˇrazení 13E5 CTD. Jako hlavní a nejcennˇejší výsledek bakaláˇrské práce lze považovat kompletní analýzu 5D spekter a z nich vyplývající sekvenˇcní pˇriˇrazení cca 38% ze 117 aminokyselin dlouhé aminokyselinové CTD domény. V rámci získání výše uvedených výsledk˚u jsem se seznámil s pˇrípravou vzorku pro NMR mˇeˇrení, se softwarovým a hardwarovým vybavením nezbytným pro úspˇešné zvládnutí bakaláˇrské práce. Tato mˇeˇrení jsem použil k NMR titraci, která je následovnˇe vysvˇetlena v dalším kroku experimentální cˇ ásti. Tato NMR titrace má za úkol ukázat konformaˇcní zmˇeny samotné CTD z kvasinek, což se na 2D spektrogramu projevilo posunem jednotlivých pík˚u. Ve druhé polovinˇe experimentální cˇ ásti jsem se vˇenoval pˇriˇrazování sekvence aminokyselin CTD pomocí 5D NMR experimentu. Namˇeˇrené 5D spektrum bylo rozdˇeleno na 3D spektrum a 2D ˇrezy, které byly vygenerovány podle vrchol˚u pík˚u z 3D spektra. Následnˇe jsem provedl postupné pˇriˇrazování poˇradí aminokyselin pomocí programu Sparky. S jistotou se mi podaˇrilo urˇcit poˇcáteˇcní cˇ ást sekvence i flag oznaˇcenou oblast. Problematická byla oblast 13 repetic heptapeptidu, nebot’ pˇri procesu pˇriˇrazování došlo k zacyklení metody, zp˚usobené repetitivní povahou sekvence. I pˇres tyto problémy se mi podaˇrilo urˇcit jednu kompletní repetici a také mnoho fragment˚u nˇekolika aminokyselin z tˇechto repetic. – 32 –

Závˇer

33

Tato práce v laboratoˇri NMR spektroskopie vedla k prohloubení znalostí o RNA Polymeráze II, její CTD, CID a funkci NMR spektrometru spoleˇcnˇe s praktickým mˇeˇrením NMR spekter a pˇriˇrazováním sekvence aminokyselin CTD z 5D NMR.

Pˇríloha jednopísmenná AMK trojpísmenná zkratka AMK A Ala C Cys D Asp E Glu F Phe K Lys P Pro S Ser T Thr Y Tyr

hodnota δ (ppm) pro Cα 53,17 58,19 54,69 57,33 58,11 56,95 63,32 58,72 62,26 58,13

Tabulka 3.1: Hodnoty chemického posunu pro vybrané aminokyseliny

#!/bin/csh zcat ./ser.gz | bruk2pipe \ -bad 0.0 -aswap -DMX -decim 2840 -dspfvs 20 -grpdly 67.9857025146 \ -xN 1024 -yN 25600 \ -xT 512 -yT 12800 \ -xMODE DQD -yMODE Complex \ -xSW 7042.254 -ySW 10000.000 \ -xOBS 176.108 -yOBS 700.253 \ -xCAR 175.000 -yCAR 0.000 \ -xLAB 13C -yLAB 1H \ -ndim 2 -aq2D States \ -out ./test.fid -verb -ov #sleep 5 Obrázek 3.8: Procesní skript pro NMRPipe "fid.run"

– 34 –

35 Pˇríloha

ucsf U7 U48 u. label 399 1299 δ (ppm) 57,6 55,5 AMK Y S

U5 94 63,1 P

U3 U4 U9 U6 95 96 97 98 61,7 54,2 63,13 58 T E P S

U0 99 57,66 Y

U47 U32 U17 U20 U15 U12 U13 U14 U1 U11 S99 192 193 194 195 196 197 198 199 200 55,55 63,01 52,2 52,4 52,47 54 57,98 55,59 54,28 54,56 S P A A A D Y K D D

Tabulka 3.2: Urˇcená posloupnost aminokyselin. První ˇrádek znaˇcí cˇ íslo ucsf souboru, druhý ˇrádek oznaˇcuje uživatelskou znaˇcku pro každý pík, tˇretí ˇrádek poté hodnotu Cα a koneˇcnˇe cˇ tvrtý ˇrádek pˇriˇrazenou aminokyselinu, odpovídající chemickému posunu δ v ppm.

U8 201 55,56 D

Pˇríloha

36

Protokol mˇ eˇ ren´ ı: - zkontrolovat, zda v magnetu/sondˇ e nen´ ı kyveta s jin´ ym vzorkem - zkontrolovat a nastavit teplotu poˇ zadovanou pro mˇ er ˇen´ ı ("edte") - spustit vzduch pro zaveden´ ı vzorku ("bsmsdisp" - v hlavnim menu okna B kliknout na lift nebo v pˇ rı ´kazov´ e ˇ ra ´dce napsat "ej") - vloˇ zit vycentrovan´ y vzorek s rotorem do spektrometru - vypnout "lift" (alternativnˇ e zadat "ij") a vyˇ ckat, aˇ z vzorek sestoup´ ı do sondy - nastavit "lock" na deuterium (v~menu "H20+D20 10/90") - spustit optimalizaci homogenity mg. pole pˇ rı ´kazem "topshim" - zkontrolovat zapojen´ ı spektrometru pˇ rı ´kazem "edasp" - spustit automatick´ e ladˇ en´ ı sondy "atma" - spustit ruˇ cn´ ı doladˇ en´ ı "atmm manwbsw" - nastavit odezvu locku pˇ rı ´kazem "loopadj" - kontrola tvaru c ˇ´ ary H2O a zah´ ajen´ ı kalibrace 90° 1H pulzu - nastavit "p1 1" - zkontrolovat v´ ykon pulzu "plw1" - spustit "zgqfp" a pot´ e nastavovat "p1" na spr´ avnou d´ elku 360 stupˇ n˚ u - opakovat pˇ redchoz´ ı krok, aˇ z do dosaˇ zen´ ı spr´ avn´ eho tvaru pulsu - pˇ repnout se do okna mˇ eˇ ren´ ı a nastavit "p1/4" urˇ cen´ e v pˇ redchoz´ ım kroku - spustit kontroln´ ı "gs", po skonˇ cen´ ı optimalizace ukonˇ cit "stop" - nastavit poˇ cet opakov´ an´ ı "ns" - zkontrolovat poˇ cet bod˚ u v kaˇ zd´ e dimenzi aj. "eda" - spustit mˇ eˇ ren´ ı "zgqfp" pro 1D a "zg" pro dva- a v´ ıce-dimenzion´ aln´ ı spektra - po skonˇ cen´ ı 2D experimentu zpracovat hrub´ a data "xfb" - pˇ rı ´padnˇ e upravit f´ azi ".ph" Obrázek 3.9: Popis krok˚u a pˇríkaz˚u pro mˇeˇrení na NMR spektrometru

Pˇríloha

37

Obrázek 3.10: CON spektrum. 13 C 15 N E513 Flag:Nrd1 modˇre a 13 C 15 N E513 Flag free cˇ ervenˇe.

38 Pˇríloha

Obrázek 3.11: Fotografie NMR spektrometr˚u, na kterých probíhalo samotné mˇeˇrení. Vlevo je spektrometr 700 MHz a vpravo spektrometr 950 MHz, oba od firmy Bruker.

39 Pˇríloha

Obrázek 3.12: Softwarové prostˇredí TopSpin

Seznam použité literatury [1] S. Buratowski, „The CTD code“, Nat. Struct. Biol., roˇc. 10, cˇ . 9, s. 679—680, záˇr. 2003. [2] A. Meinhart, T. Kamenski, S. Hoeppner, S. Baumli, a P. Cramer, „A structural perspective of CTD function“, Genes Dev., roˇc. 19, cˇ . 12, s. 1401–1415, cˇ er. 2005. [3] O. Jasnovidova a R. Stefl, „The CTD code of RNA polymerase II: a structural view“, Wiley Interdiscip. Rev.-Rna, roˇc. 4, cˇ . 1, s. 1–16, úno. 2013. [4] A. Mayer, M. Heidemann, M. Lidschreiber, A. Schreieck, M. Sun, C. Hintermair, E. Kremmer, D. Eick, a P. Cramer, „CTD Tyrosine Phosphorylation Impairs Termination Factor Recruitment to RNA Polymerase II“, Science, roˇc. 336, cˇ . 6089, s. 1723–1725, cˇ er. 2012. [5] K. Kubicek, H. Cerna, P. Holub, J. Pasulka, D. Hrossova, F. Loehr, C. Hofr, S. Vanacova, a R. Stefl, „Serine phosphorylation and proline isomerization in RNAP II CTD control recruitment of Nrd1“, Genes Dev., roˇc. 26, cˇ . 17, s. 1891–1896, záˇr. 2012. [6] B. M. Lunde, S. L. Reichow, M. Kim, H. Suh, T. C. Leeper, F. Yang, H. Mutschler, S. Buratowski, A. Meinhart, a G. Varani, „Cooperative interaction of transcription termination factors with the RNA polymerase II C-terminal domain“, Nat. Struct. Mol. Biol., roˇc. 17, cˇ . 10, s. 1195±, ˇríj. 2010. [7] P. Tompa a M. Fuxreiter, „Fuzzy complexes: polymorphism and structural disorder in protein-protein interactions“, Trends Biochem. Sci., roˇc. 33, cˇ . 1, s. 2–8, led. 2008. [8] M. Fuxreiter a P. Tompa, „Fuzzy interactome: the limitations of models in molecular biology“, Trends Biochem. Sci., roˇc. 34, cˇ . 1, s. 3–3, led. 2009. [9] A. Chatterjee, A. Kumar, J. Chugh, S. Srivastava, N. S. Bhavesh, a R. V. Hosur, „NMR of unfolded proteins“, J. Chem. Sci., roˇc. 117, cˇ . 1, s. 3–21, led. 2005. [10] N. J. Anthis, J. R. Haling, C. L. Oxley, M. Memo, K. L. Wegener, C. J. Lim, M. H. Ginsberg, a I. D. Campbell, „beta Integrin Tyrosine Phosphorylation Is a Conserved Mechanism for Regulating Talin-induced Integrin Activation“, J. Biol. Chem., roˇc. 284, cˇ . 52, s. 36700–36710, pro. 2009. [11] J. Novacek, A. Zawadzka-Kazimierczuk, V. Papouskova, L. Zidek, H. Sanderova, L. Krasny, W. Kozminski, a V. Sklenar, „5D C-13-detected experiments for backbone – 40 –

Seznam použité literatury

41

assignment of unstructured proteins with a very low signal dispersion“, J. Biomol. Nmr, roˇc. 50, cˇ . 1, s. 1–11, kvˇe. 2011. [12] R. D. Chapman, M. Haidemann, C. Hintermair, a D. Eick, „Molecular evolution of the RNA polymerase IICTD“, Trends Genet., roˇc. 24, cˇ . 6, s. 289–296, cˇ er. 2008. [13] D. Wishart, B. Sykes, a F. Richards, „The Chemical-Shift Index — a Fast and Simple Method for the Assignment“, Biochemistry (Mosc.), roˇc. 31, cˇ . 6, s. 1647–1651, úno. 1992. [14] K. Kubicek, J. Pasulka, H. Cerna, F. Loehr, a R. Stefl, „H-1, C-13, and N-15 resonance assignments for the CTD-interacting domain of Nrd1 bound to Ser5phosphorylated CTD of RNA polymerase II“, Biomol. Nmr Assignments, roˇc. 5, cˇ . 2, s. 203–205, ˇríj. 2011. [15] H. P. Phatnani a A. L. Greenleaf, „Phosphorylation and functions of the RNA polymerase IICTD“, Genes Dev., roˇc. 20, cˇ . 21, s. 2922–2936, lis. 2006. [16] D. P. Snustad, M. J. Simmons, a A. Matalová, Genetika. Masarykova univerzita, 2009. [17] Voet, Zdenˇek Štípal, Biochemie, Státní pedagogické nakladatelství, 1992. [18] D. Voet a J. G. Voet, Biochemistry. John Wiley & Sons Canada, Limited, 2011. [19] I. Hrazdira a V. Mornstein, Lékaˇrská biofyzika a pˇrístrojová technika. Neptun, 2001. [20] S. Berger a S. Braun, 200 and more NMR experiments: a practical course. WileyVCH, 2004. [21] Mgr. Eliška Šmiˇráková, Diplomová práce: Strukturní studie platinovaného DNA hairpinu pomocí NMR spektroskopie a výpoˇcetních metod, 2012. [22] Mgr. Tomáš Hošek, Diplomová práce: Studium interakˇcního místa RNA-vázajícího proteinu pomocí NMR a výpoˇcetních metod, 2011.

Elektronické zdroje [23] http://en.wikipedia.org/wiki/RNA_polymerase_II (7. kvˇe. 2013) [24] https://is.muni.cz/auth/el/1431/jaro2012/Bi4020/p4-MB-2012.pdf (14. kvˇe. 2013) [25] http://fch.upol.cz/skripta/zfcm_pred/5_nmr.pdf (13. kvˇe. 2013) [26] http://www.vscht.cz/nmr/predmet/lekce/NMR-lekce14.pdf (14. kvˇe. 2013) [27] http://www.studiumchemie.cz/NMR/skripta.pdf (12. kvˇe. 2013) [28] http://artemis.osu.cz/biofyzika/Studium/Studmat/material/NMR.pptx (9. kvˇe. 2013)

Seznam použité literatury

42

[29] http://www.vscht.cz/nmr/predmet/lekce/NMR-lekce2.pdf (13. kvˇe. 2013) [30] http://www.nmr.sinica.edu.tw/Cours/Course20040227/TROSY_large_protein_training_Feb2704.pdf (14. kvˇe. 2013) [31] http://nmrwiki.org/wiki/index.php?title=2D_HSQC (12. kvˇe. 2013) [32] http://www.chem.ox.ac.uk/spectroscopy/nmr/acropage.htm (14. kvˇe. 2013) [33] http://www.vscht.cz/nmr/predmet/lekce/nmr_proteinu.pdf (12. kvˇe. 2013)

MASARYKOVA UNIVERZITA ÚSTAV FYZIKY KONDENZOVANÝCH LÁTEK. Bakalářská práce BRNO 2013 PAVEL VEVERKA

Recommend Documents