MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA. Ramanova spektroskopie DNA modifikované protinádorově účinnými komplexy platiny RIGORÓZNÍ PRÁCE

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

Ramanova spektroskopie DNA modifikované protinádorově účinnými komplexy platiny

RIGORÓZNÍ PRÁCE

Brno 2008

Veronika Kohoutková

Anotace

DNA je cílovým místem působení platinových cytostatik. Bylo prokázáno, že mechanismus působení platinových komplexů spočívá v jejich schopnosti vytvářet s molekulou kovalentní adukty. Cisplatina vytváří kovalentní vazbu zejména s nukleofilními místy guaninových zbytků v DNA, a protože je cisplatina bifunkčním činidlem, má schopnost vázat se k jednomu (monofuknční adukt) nebo ke dvěma (vnitrořetězcové a meziřetězcové můstky) místům v řetězci DNA. Všechny tyto adukty výrazně narušují konformaci DNA. K zásadním nedostatkům léčby cisplatinou patří snižování citlivosti nádoru vůči cisplatině při opakovaném podávání tohoto léčiva. Léčba s sebou nese celou řadu doprovodných nežádoucích vedlejších účinků. Cílem této práce je na vybraných platinových komplexech sledovat změny v Ramanových spektrech a porovnat tyto změny s již známými spektry cisplatiny a transplatiny. Byly připraveny krátké fragmenty DNA a ty byly modifikovány různými komplexy platiny. Od všech komplexů byly připraveny tři rb a výsledná diferenční spektra byla srovnána s diferenčními spektry cisplatiny a transplatiny. Největší změnu v Ramanově diferenčním spektru pozorujeme při záměně jedné aminoskupiny transplatiny za ligand a to piperidin.

Klíčová slova: platinová cytostatika, DNA, Ramanova spektroskopie

1

Anotation

DNA is a critical target for the activity of platinum cytostatics. There is a large body of experimental evidence that success of platinum complexes results from their ability to form on DNA various types of covalent adducts. Cisplatin forms covalent bonds with nucleophilic sites on guanine residues present in DNA and because of a cisplatin is a bifunctional agent it is able to bind to one (monofunctional adduct) or two (intrastrand crosslinks, interstrand crosslinks) places in a DNA chain.

All of these adducts distort characteristicly the

conformation of DNA. The main problem in the curing with cisplatin is the cutting down the sensitiveness of the tumor towards the cisplatin when the cisplatin is repeating in the treatment. A medical treatment is connected with a lot of unadvisable effects. The aim of this study is the following of changes in Raman spectras of chosen platin complexes and compare this changes with the known spectras of cisplatin and transplatin. A short fragments of DNA were prepared through the sonication and they were modified with platinum complexes of three rb. The comparations were taken in differences Raman spectras of cisplatin and transplatin. The largest change in the difference Raman spectra was found in the replacement of one ammine ligand for piperidine.

Keywords: platinum cytostatics, DNA, Raman spectroscopy

2

Prohlašuji, že jsem pracovala samostatně a použila pouze literatury uvedené v seznamu. Veronika Kohoutková

3

Ráda bych poděkovala doc. RNDr. O. Vránovi, CSc. za odborné vedení, všestrannou pomoc a zájem, který věnoval mé práci. Zvláštní poděkování patří Mgr. Jarmile Mlčouškové za pomoc při měření na Ramanovu spektrometru. Rovněž děkuji všem spolupracovníkům na oddělení molekulární biofyziky BFÚ AV ČR za vytvoření příjemného pracovního prostředí.

4

OBSAH

Seznam nejdůležitějších zkratek

8

I. ÚVOD

9

II. TEORETICKÁ ČÁST

10

1. Koordinační sloučeniny kovů s protinádorovými účinky

10

2.

1.1. Vývoj platinových komplexů

10

1.2. Struktura platinových komplexů

11

1.3. Využití cisplatiny

11

1.4. Toxicita cisplatiny, rezistence vůči cisplatině

12

Mechanismus působení cisplatiny

12

2.1. Reaktivita platnatých komplexů

12

2.2. Distribuce cisplatiny v buňkách

13

2.3. Vazba cisplatiny na DNA

14

2.3.1. Struktura DNA

14

2.3.2. Reakce cisplatiny s DNA

17

2.4. Poškození DNA po modifikaci cisplatinou

19

2.5. Reparace DNA

20

2.6. Proteiny se specifickou vazbou na DNA modifikovanou cisplatinou

20

3. Platinové komplexy druhé generace

21

3.1. Klinicky používané deriváty cisplatiny

22

3.1.1. Karboplatina

22

3.1.2. Oxaliplatina

23

3.1.3. Nedaplatina

24

3.2. Protinádorové deriváty transplatiny

24

3.3. Vícejaderné platinové komplexy

26

4. Síly stabilizující DNA

26

4.1. Denaturace DNA

28

5. Ramanova spektroskopie

29

5.1. Princip vibrační spektroskopie

29

5.2. Výhody a nevýhody vibrační spektroskopie

29

5.3. Vibrace molekul

31

5.4. Objev a princip Ramanova rozptylu

32

5

5.5. Povrchem zcitlivěná Ramanova spektroskopie: SERS a SE(R)RS

34

5.5.1. Povrchem zcitlivěná rezonanční Ramanova spektroskopie SE(R)RS

34

5.5.2. Povrchem zcitlivěná Ramanova spektroskopie SERS

34

5.5.2.1. Princip SERS

34

5.5.2.2. Experimentální espekty SERS

35

5.5.2.3. SERS DNA

35

5.6. Fluorescence

36

5.7. Komponenty Ramanova spektrometru

36

5.8. Popis a aplikace Ramanovy spektrometrie

37

5.9. Ramanova spektroskopie nukleových kyselin

38

5.9.1. Nukleotidy a jejich analoga

38

5.9.2. Syntetické nukleové kyseliny a krátké fragmenty DNA

39

5.9.3. Nukleové kyseliny (DNA)

39

5.9.4. Ramanovo spektrum DNA

40

5.9.5. Přehled pásů Ramanova spektra ctDNA v B-konformaci (650-1750 cm-1), 42 porovnání A a B-konformace 5.10. Úspěchy v Ramanově spektrometrii

45

III. CÍL PRÁCE

47

IV. MATERIÁL A METODY

48

1.Materiály

48

1.1. Použité chemikálie

48

1.2. Použité roztoky

48

2.Metody

49

2.1. Sonikace

49

2.2. UV spektrometrie

49

2.3. Elektroforéza v agarózovém gelu

50

2.4. Polarografie

50

2.5. Dialýza DNA

50

2.6. Lyofilizace DNA

51

2.7. Purifikace DNA

51

2.8. Modifikace DNA platinovými komplexy

51

2.9. Ramanův spektroskop

52 6

V. MĚŘENÍ, VÝSLEDKY A DISKUSE

54

1. Studium vlivu sonikace na DNA

54

2. Spektrofotometrická analýza

55

3. Polarografická analýza

55

4. Analýza modifikovaných DNA pomocí Ramanovy spektroskopie

58

4.1. Analýza spektra DNA modifikované cisplatinou

62

4.2. Analýza spektra DNA modifikované transplatinou

65

4.3. Srovnání spekter DNA modifikovaných cisplatinou a transplatinou

67

4.4. Analýza spektra DNA modifikované komplexem cis-PtCl2(NH3)(pip)

68

4.5. Analýza spektra DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip)

70

4.6. Srovnání spekter DNA modifikovaných cisplatinou, transplatinou

73

a komplexy cis-PtCl2(NH3)(pip) a trans-PtCl2(NH3)(pip) 4.7. Analýza spektra DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(NH3)(pz)

74

4.8. Analýza spektra DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(4-pic)(pip)

76

4.9. Analýza spektra DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(4-pic)(pz)

78

4.10. Analýza spektra DNA modifikované komplexem cis-PtCl2(NH3)(4-pic)

80

4.11. Analýza spektra DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(NH3)(4-pic) 82 4.12. Srovnání spektra DNA modifikovaných cisplatinou, transplatinou

84

a komplexy cis-PtCl2(NH3)(4-pic) a trans-PtCl2(NH3)(4-pic) 4.13. Srovnání některých významných změn ve spektrech všech měřených

85

DNA modifikovaných vybranými komplexy platiny 4.13.1. Shrnutí výsledků všech naměřených Ramanových spekter DNA

87

modifikovaných vybranými platinovými komplexy

VI. ZÁVĚR

97

VII. POUŽITÁ LITERATURA

100

7

Seznam nejdůležitějších zkratek

bp

pár bází

bk

backbone (cukrfosfátová kostra)

cisplatina, cis DDP

cis-[(NH3)2Cl2Pt]

ct DNA

thymová DNA

dienplatina

[PtCl(dien)]Cl

dA

deoxyadenosin

dC

deoxycytidin

dG

deoxyguanosin

DNA

deoxyribonukleová kyselina

DPP

diferenční pulzní polarografie

dT

deoxythymidin

HMG

„High Mobility Group“

IAC

vnitrořetězcová křížová vazba („intrastrand crosslink“)

IEC

meziřetězcová křížová vazba („interstrand crosslink“)

intensity

intenzita

pic

picolin

pip

piperidin

pz

piperazin

rb

množství molekul komplexu navázaných na jeden nukleotid (cPt/cDNA)

RNA

ribonukleová kyselina

stacking

vrstvení bazí

transplatina, trans DDP

trans-[(NH3)2Cl2Pt]

wavenumber

vlnočet (cm-1)

8

I. ÚVOD Jako rakovinu nebo též nádorové onemocnění označujeme skupinu nemocí, které se vyznačují nekontrolovaným buněčným dělením. Rychle se dělící nádorové buňky mají schopnost napadat ostatní tkáně a rozšiřovat se do jiných částí těla. Když jsou normální buňky poškozené nebo staré, spustí se program kontrolované buněčné smrti - apoptózy. Rakovinové buňky se však dokáží apoptóze vyhnout. Ke vzniku rakoviny dochází tehdy, když je genetickými nebo environmentálními faktory poškozena DNA takovým způsobem, že dojde k deregulaci buněčného dělení. Všechny naše orgány jsou tvořeny buňkami, které, pokud to tělo potřebuje, se dělí a vytváří tak buňky další. Toto je normální stav ve zdravém těle. Jestliže se však buňky dělí i bez potřeby vzniku nových buněk, vytvoří masu tkáně, která je považována za nádor. Nádory mohou být benigní (ne rakovinové, nezhoubné) a maligní (rakovinové, zhoubné). Zhoubný nádor se sestává z rakovinových buněk, které mají schopnost rozšiřovat se do svého bezprostředního okolí a ničit buňky zdravé. Někdy se nádorové buňky odtrhnou od původního (primárního) nádoru a nádor se rozšiřuje do dalších orgánů v těle a to buď krví nebo lymfatickým systémem. Když se tyto buňky dostanou na nové místo, mohou se dělit dál a vytvořit nový nádor, který se nazývá sekundárním nádorem čili metastázou. Ačkoliv některé typy nádorů nemůžeme dnes zcela vyléčit, existuje mnoho způsobů jak zastavit nádorové bujení. Chemoterapie je oproti chirurgickým a radioterapeutickým metodám nejmladší, avšak zaznamenává mohutný celosvětový vývoj. Na trhu je několik desítek léků s prokázanou účinností při léčbě nádorových onemocnění. Farmaceutické společnosti v současné době provádějí výzkum více než 300 potenciálních preparátů, které jsou určeny k léčbě zhoubných nádorů. Cytostatika, neboli protinádorová chemoterapie, svým zásahem do buněčného cyklu nádorové buňky brání této buňce v dalším dělení. Při chemoterapii chemickými cytostatiky však dochází nejen k ničení rychle se množících buněk nádorových, ale i k ničení přirozených rychle se množících buněk, jako jsou buňky jaterní tkáně, bílé krvinky, červené krvinky, spermie, vajíčka. Sledování změn nukleových kyselin po vazbě protinádorově účinných komplexů vedoucích k zastavení růstu nádorů je důležité pro pochopení primární příčiny úspěchu daného léku. Tyto poznatky pak mohou být využity pro navrhování nových typů léčiv, které by mohly účinkovat proti jiným typům nádorů (než stávající používaná cytostatika) nebo snižovat vedlejší účinky provázející léčbu pacientů trpících rakovinou.

9

II. TEORETICKÁ ČÁST

1. Koordinační sloučeniny kovů s protinádorovými účinky Využití anorganických kovových sloučenin pro léčbu nádorových onemocnění se datuje již do 19. století, kdy roku 1865 Lissauer publikoval výsledky své práce s arsenoterapií [1]. V roce 1931 Collier a Kraus publikovali teorii platnou dodnes a to, že protinádorové účinky sloučenin těžkých kovů nezávisí jen na použitém kovu, ale také na celkovém charakteru sloučeniny a její chemické struktuře [1].

1.1. Vývoj platinových komplexů Nejznámější

dosud

používané

cytostatikum

na

bázi

platiny

je

cis-diammindichloroplatnatý komplex neboli cisplatina. Ačkoliv tento komplex byl syntetizován již roku 1844, schopnost platinových komplexů zastavovat buněčný růst byla objevena náhodně Barnettem Rosenbergem až v roce 1965. Tento americký biofyzik studoval vliv elektrického pole na růst bakterií Escherichia coli, přičemž k měření používal platinové elektrody ponořené do roztoku s chloridem amonným. Po jisté době došlo k zastavení buněčného dělení bakterií a k jejich filamentóznímu růstu, čímž se až třistakrát prodloužila jejich délka. Následně bylo prokázáno, že příčinou tohoto jevu není elektrické pole, ale tetrachlorodiamminplatičitý komplex vzniklý uvolněním malého množství platiny do roztoku elektrolytu. Rosenberg pokračoval v syntéze jednoduchých aminoplatnatých a aminplatičitých komplexů a jejich testování na experimentálních nádorových modelech. Ukázalo se, že po aplikaci některých těchto komplexů opravdu dochází ke zmenšení nádorů a prodloužení doby života u pokusných zvířat [2]. První klinické pokusy s cisplatinou proběhly v roce 1971 a koncem 70. let se již cisplatina běžně používala v klinické praxi. Ačkoliv cisplatina je velice účinné cytostatikum, jiné deriváty platiny, jako transplatina či dienplatina (obr. 1), jsou protinádorově neaktivní.

10

Obr. 1: Strukturní vzorce a) cisplatiny, b) transplatiny, c) dienplatiny

1.2. Struktura platinových komplexů Platina vytváří ve vodném prostředí komplexní sloučeniny a to nejčastěji ve druhém (čtyřvazebném) a čtvrtém (šestivazebném) oxidačním stupni. V prostředí živých organismů obsahujících řadu redukujících látek lze předpokládat převažující oxidační stupeň II, pro nějž je charakteristická čtvercově planární struktura komplexu. Pt(IV) komplexy tvoří nejčastěji oktaedrickou strukturu a jsou méně reaktivní [3]. V klinické praxi se využívají komplexy platiny dvojmocné i čtyřmocné.

1.3. Využití cisplatiny Cisplatina neboli cis-[(NH3)2Cl2Pt ] je komerčně nejúspěšnější protinádorový preparát a je klinicky využívána s úspěšností dosahující až 90 % při léčbě nádorů urogenitálního traktu. Úspěšně je také aplikována v případě léčby malobuněčného karcinomu plic a některých nádorů hlavy a krku. V kombinaci s radioterapií je pomocí cisplatiny dosahováno uspokojivých výsledků také při aplikaci proti nádorům kostí a tenkého střeva. Přibližně 30 % všech pacientů umírajících na rakovinu má však nádory prsu, konečníku či tlustého střeva, kde je terapie cisplatinou, bohužel, neúspěšná [4].

11

1.4. Toxicita cisplatiny, rezistence vůči cisplatině K zásadním nedostatkům léčby cisplatinou patří

vznik rezistence, tedy snižování

citlivosti nádoru vůči cisplatině při opakovaném podávání tohoto léčiva. Vlastní léčba s sebou nese celou řadu doprovodných vedlejších účinků. Nejčastějšími komplikacemi jsou nefrotoxicita (narušení funkce ledvin), myelotoxicita (porušení nervových drah v míše), ototoxicita (ztráta vnímání zvuků o vysokých frekvencích), poškození krvetvorby, zažívacího traktu a alergické reakce (kožní vyrážka, nevolnost, zvracení) [5]. Některé z těchto vlivů se daří potlačovat vhodnou volbou léčebného postupu (například dlouhodobá infuze cytostatika v kombinaci s podáváním většího množství tekutin a diuretik), přesto však představují vedlejší účinky tohoto cytostatika velká omezení při chemoterapii. Možným způsobem jak snížit toxicitu cisplatiny je její vazba na nosičové molekuly, které dokáží rozlišit mezi nádorovou a zdravou tkání. Mechanismus rozpoznání nádorových buněk spočívá v tom, že na povrchu nádorové buňky se vyskytuje velké množství receptorů pro steroidní hormony, které jsou nezbytné pro růst nádoru. Pokud by se podařilo na některý z účinných komplexů navázat ligand, jež se na tyto receptory bude přednostně vázat, zvýšila by se tak koncentrace cytostatika v nádorové tkáni a omezily se nežádoucí interakce. Dosud se však žádný z připravených komplexů neosvědčil natolik, aby bylo možno přistoupit ke klinickým zkouškám [6].

2. Mechanismus působení cisplatiny Brzy po objevu protinádorových účinků cisplatiny se vědci snažili odhalit mechanismus jejího působení. Za klíčovou se považuje vazba na DNA [6]. 2.1. Reaktivita platnatých komplexů Cisplatina patří do skupin komplexů s centrálním atomem platiny v oxidačním stupni II a vykazuje čtvercovou planární symetrii. Chemická stabilita vazby mezi centrálním atomem platiny a ligandem závisí na jeho schopnosti poskytovat elektrony na uskutečnění vazby, tedy na tzv. elektrodonorním charakteru. Síla vazby vzrůstá s polarizovatelností elektronového obalu ligandu, přičemž afinita ligandů pro vazbu s dvojmocnou platinou klesá v pořadí:

12

CN->NH3>OH->Cl->NO3->ClO4->H2O Dalším faktorem ovlivňujícím termodynamickou stabilitu vazby mezi platinou a ligandem je takzvaný trans-efekt. Tímto pojmem je myšlena schopnost ligandu usnadňovat substituci v poloze trans [8]. V případě cisplatiny jsou na centrální platinový atom navázány dva typy ligandů, chloridový iont a NH3, z nichž chloridový atom vykazuje větší trans-efekt než NH3. U transplatiny, kdy jsou v poloze trans vždy dva stejné ligandy, dochází k vzájemnému vyrušení trans efektů. Ligandy odstupují podstatně méně ochotně než u cisplatiny, kde proti sobě stojí vždy chloridový iont a NH3, a vazba mezi platinou a chloridovým iontem je destabilizována v mnohem větší míře. Je tedy patrné, že chloridové anionty u cisplatiny budou ve vodném prostředí odstupovat podstatně rychleji než u transplatiny. Ve vodném prostředí bude tedy probíhat hydrolýza (výměna chloridových iontů za molekulu vody) mnohem snáze u cisplatiny, než u jejího trans izomeru. Aminoligandy jsou k výměně za vodu relativně inertní a k jejich odstupování nedochází (viz. výše uvedená afinitní řada).

2.2. Distribuce cisplatiny v buňkách Při aplikaci cisplatiny dochází k neselektivní reakci s různými částmi buňky: 5-10 % je vázáno na membrány, 20 % na nukleové kyseliny a nukleoproteiny, 20-50 % na proteiny a zbývající platinový komplex se dělí mezi cisplatinu vázanou na malé molekuly a volný komplex. Pouze některé interakce však mají vliv na buněčný růst a dělení. Například vazba platinových komplexů na proteiny sice inhibuje jejich enzymovou aktivitu, avšak jak dokazuje celá řada experimentů, největší cytostatickou účinnost má vazba cisplatiny na DNA [9]. Cisplatina je při chemoterapii aplikována intravenózně. V krevní plazmě je relativně vysoká koncentrace chloridových iontů (150 mM při pH 7,4), tudíž téměř 93 % cisplatiny se nachází v dichloro- nebo chlorohydroxo- formě. Tento nereaktivní stav komplexu umožňuje průnik z krevního řečiště pasivním transportem přes plazmatickou membránu do buněk. V cytoplasmatickém prostoru buněk je koncentrace chloridových iontů při stejném pH pouze 4 mM, dochází tedy k hydrolýze (asi 33 %) a cisplatina se stává kladně nabitou reaktivní molekulou. Po průchodu do jádra reaguje cisplatina ve dvou krocích. V prvním kroku reaguje hydrolyzovaná forma cisplatiny zpravidla s N7 guaninem za vzniku monofunkčního aduktu.

13

V následujícím kroku, pokud je v blízkosti další vhodné reakční místo, hydrolyzuje druhá chloridová skupina a vytváří se druhá vazba s DNA - vzniká bifunkční vazba komplexu s DNA (obr. 2) [10].

Obr. 2: Schematický proces vstupu cisplatiny do buňky po intravenózní aplikaci spolu se schématem reakce cisplatiny s DNA

2.3. Vazba cisplatiny na DNA 2.3.1. Struktura DNA

Molekula DNA je složena z nukleotidů, které jsou tvořeny z pětiuhlíkového monosacharidu (2-deoxy-ß-D-ribóza), z kyseliny trihydrogenfosforečné (H3PO4) a z purinové (adenin, guanin) nebo pyrimidinové (cytosin, thymin) báze. Sloučenina vzniklá spojením purinové nebo pyrimidinové báze N-glykosidickou vazbou s deoxyribózou se označuje jako deoxyribonukleosid.

Strukturní

jednotkou

polynukleotidového

14

řetězce

jsou

zbytky

deoxyribózy, které jsou spojeny fosfodiesterovými vazbami. Nejčastěji se DNA vyskytuje v podobě tzv. dvoušroubovice, která je složena ze dvou polydeoxyribonukleotidových řetězců. Oba řetězce jsou k sobě navzájem komplementární. Uplatňuje se zde tzv. Watson-Crikovo párování bází (obr. 4). Podle tohoto pravidla se prostřednictvím vodíkových vazeb páruje adenin s thyminem a guanin s cytosinem. DNA je schopna tvořit tři základní prostorová uspořádání (komformace): A, B a Z (obr. 3). V daný okamžik je preferována ta konformace, která je energeticky nejvýhodnější s ohledem na nukleotidovou sekvenci, obsah vody a iontovou sílu. DNA v konformaci A a B je pravotočivá, zatímco v konformaci Z je levotočivá. Základní parametry jednotlivých forem jsou shrnuty v tab.1 [11].

a)

15

b)

c)

Obr. 3: Molekulární model: a) A-DNA, b) B-DNA, c) Z-DNA

16

Charakteristika dvoušroubovice Konformace A Konformace B Konformace Z Vinutí Celkový tvar Umístění osy dvoušrobovice Větší žlábek

pravotočivá

pravotočivá

levotočivá

krátká a široká

dlouhá a tenká

podlouhlá a tenká

přes větší žlábek

přes páry bází

přes menší žlábek

velmi úzký a

široký a hluboký

zploštělý na

hluboký

povrchu

šířka

0,27 nm

1,17 nm

0,88 nm

hloubka

1,35 nm

0,88 nm

0,37 nm

Menší žlábek

velmi široký

úzký a hluboký

velmi úzký

a mělký

a hluboký

šířka

1,1 nm

0,57 nm

0,2 nm

hloubka

0,28 nm

0,75 nm

1,38 nm

Zvýšení na pár bází

~ 0,23 nm

~ 0,34 nm

~ 0,38 nm

~ 2,5 nm

~ 3,4 nm

~ 4,6 nm

~ 11

~ 10,5

~ 12

anti

anti

C3`-endo

C2`-endo

Zvýšení na jeden závit (otáčku) Počet párů bází na jeden závit Konformace glykosidické vazby Konformace deoxyribózy

anti u C syn u G C2`-endo u dC C3`-endo u dG

Tab.1: Průměrné parametry A, B a Z-konformace ds DNA

2.3.2. Reakce cisplatiny s DNA Jakmile bylo prokázáno, že se cisplatina váže na DNA a tato skutečnost by mohla souviset s protinádorovým působením cisplatiny, rozběhla se další fáze výzkumu zaměřená na studium interakcí cisplatiny s DNA. V neutrálním prostředí je DNA polyaniontem vlivem záporně

nabitých

fosfátových

zbytků

v její

cukrfosfátové

kostře.

Cisplatina

má

v hydrolyzované formě kladný náboj a dochází tedy k elektrostatickému přitahování mezi tímto komplexem a DNA. V prvním kroku reakce se cisplatina přiblíží natolik, aby, jakožto 17

elektrofilní činidlo, mohla reagovat s nukleofilními místy na DNA. Vazebná místa na DNA můžeme seřadit podle reaktivity s platnatými komplexy následovně: guanin-N7>>adenin-N7>cytosin-N3>adenin-N1 Atomy dusíku v poloze N7 guaninu a adeninu jsou orientovány do prostoru velkého žlábku a jsou tedy snadno přístupné pro vazbu komplexu, na rozdíl od dusíku N3 cytosinu a N1 adeninu, se kterými cisplatina v neutrálním protředí může také reagovat. Tato její vazba je však znesnadněna Watson-Crickovým párováním bází (obr. 4) [12].

Obr. 4: Schematické znázornění Watson-Crickova párování bází a umístění vazebných míst pro platinové komplexy: a) adenin-thymin, b) guanin-cytosin Nejvíce zastoupeným aduktem cisplatiny na DNA je vazba tohoto komplexu ke dvěma sousedním guaninovým zbytkům v jednom řetězci. Tento adukt je označován 1,2-GG-IAC a tvoří až 60 % všech aduktů cisplatiny. Cisplatina se také může vázat na sousední deoxyadenosin a deoxyguanosin, přičemž adeninový zbytek je vždy na 5´konci. Tento typ aduktu je označován 1,2-AG-IAC a tvoří asi 20 % navázané cisplatiny. Dalším vnitrořetězcovým typem aduktu je vazba cisplatiny na dva guaninové zbytky separované od sebe jedním nukleotidem tzv. 1,3-GG-IAC. Tento typ aduktu tvoří asi 10 % navázané cisplatiny. Cisplatina vytváří také meziřetězcovou vazbu a to mezi dvěma guaninovými zbytky v komplementárních řetězcích v sekvenci 5´-GC-3´. Tento adukt (1,2-GG-IEC) tvoří společně s monofunkčně navázanou cisplatinou 5-10 % vázané cisplatiny na lineární DNA (obr. 4). Za významné z hlediska protinádorové aktivity jsou považovány bifunkční adukty. Platnaté komplexy tvoří zřejmě i adukty mezi DNA a proteiny [12].

18

Vazba cisplatiny na DNA způsobuje změnu její konformace v okolí vazby. Rozsah a typ distorze závisí na typu aduktu (obr. 5) [13].

Obr. 5: Grafické znázornění aduktů cisplatiny – a) 1,2-GG-IAC, b) 1,2-AG-IAC, c)1,3-GG-IAC, d) 1,2-GG-IEC

2.4. Poškození DNA po modifikaci cisplatinou Poškození DNA po vazbě cisplatiny má nepochybně vliv na její funkci. Zásah do procesů replikace a transkripce může mít pro buňku vážné následky [14]. Bylo prokázáno, že cisplatina zastavuje replikaci DNA in vitro [15]. Váže se na sekvence (dG) (n > 1) a blokuje DNA polymerázu [16]. Experimenty zabývající se posouzením vztahu mezi inhibicí replikace, cytotoxicitou a buněčným cyklem iniciovaly vznik hypotézy, že podstatou protinádorových účinků cisplatiny může být inhibice transkripce [17]. Bylo také zjištěno, že buňky vystavené působení cisplatiny prošly S fází, ve které probíhá replikace DNA, ale byly zablokovány v G2 fázi. Ukazuje se, že tato schopnost cisplatiny je různá u různých buněčných linií. U buněk s deficitním opravným systémem dochází k zablokování buněčného cyklu již při malých koncentracích cisplatiny [18]. Experimenty demonstrující schopnost cisplatiny blokovat buňky v G2 fázi vedly k závěru, že cisplatina inhibuje transkripci a poskytly také první informace o mechanismu buněčné smrti. Degradace DNA poskytla první vodítko a následující výzkum jednoznačně potvrdil, že cisplatina je schopna vyvolat v buňkách signál ke spuštění programované smrti buňky – apoptózy [19].

19

2.5. Reparace DNA Adukty jsou odstraňovány za pomocí reparačních mechanismů. Na odstraňování aduktů cisplatiny se podílí především nukleotidová excizní oprava, která je využívána k opravám řady poškození DNA [20]. Postižené místo je většinou vystřiženo z DNA ve formě fragmentu [21]. Excizní opravný mechanismus je velmi dobře popsán díky dědičnému lidskému onemocnění Xeroderma pigmentosum. Kromě excizního reparačního mechanismu existují i další typy reparačních mechanismů, které také mohou mít vliv na cytotoxicitu aduktů cisplatiny. Bakterie E. Coli s mutací v rekombinačním nebo „mismatch“ opravném mechanismu vykazují zvýšenou citlivost na cisplatinu, což naznačuje, že i tyto mehanismy hrají roli v buněčné odezvě na působení cisplatiny [22].

2.6. Proteiny se specifickou vazbou na DNA modifikovanou cisplatinou Přestože cisplatina dokáže inhibovat replikaci i transkripci, je zřejmé, že na procesech vedoucích až k apoptóze buňky se podílejí ještě další faktory – zřejmě buněčné proteiny, které se specificky váží na adukty cisplatiny [23]. Dnes je známa již celá řada takových proteinů. Patří sem proteiny účastnící se excizního reparačního mechanismu – XPE, XPA, RPA [24] nebo ERCC1 [25] a dále proteiny, které jsou součástí „mismatch“ opravného mechanismu např. MutS α [26]. Další skupinou proteinů vyznačující se specifickou vazbou na DNA modifikovanou cisplatinou jsou HMG proteiny (high mobility group). HMG proteiny jsou nehistonové chromozomální proteiny, které hrají důležitou úlohu při vytváření vysoce organizovaných struktur DNA v chromatinu. Tyto proteiny obsahují konzervativní doménu (80 aminokyselin), která umožňuje vazbu k DNA (takzvaný HMG box). Bylo zjištěno, že HMG1 protein se váže selektivně k 1,2-GG-IAC, 1,2-AG-IAC a 1,2-GG-IEC aduktu cisplatiny, ale neváže se k monofunkčním aduktům a 1,3-GG-IAC aduktu. Po objevení vazby HMG1 proteinu na DNA modifikovanou cisplatinou byla vyslovena teorie, která vysvětluje úlohu HMG proteinů v protinádorové účinnosti cisplatiny [27]. HMG proteiny se pevně váží k aduktům cisplatiny a brání tak jejich odstranění opravnými mechanismy buňky. Přetrvávající adukt pak vyvolává změny DNA, které brání její replikaci, případně může dojít až k indukci apoptózy buňky (obr. 6). Jiné proteiny se pak specificky naváží na DNA modifikovanou cisplatinou, např. TBP nebo YB-1 [28].

20

Obr. 6: Schematické znázornění možného stínícího účinku HMG proteinů

3.

Platinové komplexy druhé generace Právě kvůli vedlejším účinkům cisplatiny (viz. kap. 1.4.) a tedy velké zátěži pacientů, je

stále velká snaha vyvinout léčivo se stejnými léčebnými účinky, ale menšími komplikacemi při chemoterapii. Vývoj nových protinádorově aktivních komplexů je zaměřen na přímá analoga cisplatiny, transplatinové komplexy, polynukleární platinové komplexy, komplexy s atomem platiny ve čtvrtém oxidačním stupni a koordinační sloučeniny s jiným centrálním kovem než platinou.

Doposud bylo syntetizováno více než 3000 analogů cisplatiny, z nichž několik desítek postoupilo do klinických zkoušek [1].

V raných fázích vývoje platinových komplexů byl kladen důraz především na omezení toxických dopadů na organismus, jak již bylo zmíněno (kap. 1.4.). Srovnávacím modelem nově vznikajících preparátů byla vždy cisplatina, jejíž účinky na organismus jsou poměrně dobře popsány. Méně výrazná toxicita některých komplexů druhé generace napomohla ke zjednodušení léčebných postupů a umožnila rozvoj kombinované terapie [29].

21

Toxicita platinových sloučenin závisí na jejich struktuře. Díky stálému ověřování předpokladu, že terčem působení platinových léčiv v buňce je DNA [30] se zdá, že rozdílná chemická struktura nově vyvíjených platinových komplexů může podstatně ovlivnit právě jejich vazbu na DNA. Vlastnosti odstupujících skupin sloučeniny totiž ovlivňují průběh distribuce léčiva ve tkáních a buňkách. Na druhou stranu charakter neodstupujících skupin má vliv na konformační změny DNA [31].

3.1. Klinicky používané deriváty cisplatiny

Od zavedení cisplatiny do klinické praxe byly syntetizovány a zkoumány stovky jejich bifunkčních derivátů. Mnoho z těchto sloučenin však nevedlo k výrobě nových terapeutik a nemohlo být uvedeno do klinické praxe. Kromě cisplatiny získala mezinárodní atest k léčení nádorových onemocnění pouze karboplatina (v ČR známá pod názvem Cycloplatin) a oxaliplatina (využívaná ve Francii) [31]. Další přímý analog cisplatiny, nedaplatina, je schválena pouze v Japonsku.

3.1.1. Karboplatina

Karboplatina (cis-diaminocyklobutyldikarboxylát-platnatý komplex) (obr. 7) vzniká substitucí

dvou

odstupujících

atomů

chlóru

v molekule

cisplatiny

za

stabilnější

cyklobutyldikarboxylátovou skupinu [32]. Do klinické praxe byla zavedena v roce 1986 [33].

Obr. 7: Strukturní vzorec karboplatiny

22

Na rozdíl od cisplatiny vykazuje karboplatina nižší toxické účinky, proto může být podávána i v daleko vyšších dávkách. Nežádoucí účinky, projevující se myelosupresí (útlum aktivity kostní dřeně, tedy útlum krvetvorby), zaznamenáváme pouze v extrémně vysokých dávkách karboplatiny [34]. Karboplatina vytváří podobné spektrum aduktů jako cisplatina. Adukty se odlišují pouze svojí sekvenční preferencí [35]. Další rozdíl mezi karboplatinou a cisplatinou spočívá v ochotě vázat se na DNA. K určitému stupni modifikace je zapotřebí až o dva řády vyšší koncentrace karboplatiny než cisplatiny. Karboplatina působí na podobné spektrum nádorů jako cisplatina. V praxi je používána především při léčbě nádorů vaječníků [7].

3.1.2. Oxaliplatina

Oxaliplatina (cis-diaminocyklohexyl-platnatý komplex) (obr. 8) byla poprvé syntetizována ve Francii [36]. Při jejím podávání lze pozorovat méně výrazné neurotoxické účinky. Léčba však bývá provázena nauseou.

Obr. 8: Strukturní vzorec oxaliplatiny

Oxaliplatina se hydrolyzuje pomaleji než cisplatina a je méně ochotná vázat se na DNA [37]. Avšak adukty karboplatiny mají podobné účinky jako adukty cisplatiny [38]. Oxaliplatina se ukazuje vhodná pro léčbu některých nádorů, které jsou rezistentní vůči cisplatině (karcinom tlustého střeva). Oxaliplatina však musí být podávána v kombinaci s 5-fluorouracilem a kyselinou folinovou [39].

23

3.1.3. Nedaplatina

Nedaplatina (cis-diaminoglykolát-platnatý komplex) (obr. 9) je látka strukturně podobná karboplatině. Byla vyvinuta v Japonsku, kde se zatím pouze používá. Nachází obdobné terapeutické využití jako karboplatina a cisplatina [37].

Obr. 9: Strukturní vzorec nedaplatiny

Z pohledu vazby na DNA není příliš překvapivé, že uvedení těchto tří nových protinádorových léčiv (karboplatiny, oxaliplatiny a nedaplatiny) do klinické praxe nepředstavuje zásadní průlom v léčbě rakoviny platinovými cytostatiky [40]. Důvodem je, že adukty vytvořené přímými deriváty cisplatiny, které se používají v klinické praxi, jsou podobné jako ty, které tvoří cisplatina. Liší se pouze v relativních stupních modifikace [31].

3.2. Protinádorové deriváty transplatiny

Na základě srovnávání účinků cisplatiny a transplatiny se po dlouhá léta vycházelo z hypotézy, že pouze platinové komplexy v konformaci cis mohou disponovat protinádorovou aktivitou [30]. Hlavní rozdíl mezi cisplatinou a jejím trans izomerem spočívá zejména v tom, že transplatina je kineticky více reaktivní a více náchylná k deaktivaci. Zatímco cisplatina tvoří především jednořetězcové podélné vazby mezi sousedními guaninovými bázemi, transplatinové adukty mají charakter meziřetězcových vazeb a velká část aduktů je monofunkčních. Tyto adukty rovněž způsobují konformační změny DNA, ale v mnohem menší míře než je tomu u cisplatiny [41]. Biologicky aktivní transplatinové komplexy byly odvozeny od transplatiny substitucí jedné nebo obou aminových skupin - heterocyklickou aminovou skupinou, alifatickou skupinou nebo iminoéterovou skupinou (obr. 10), čímž došlo k dramatickému nárůstu protinádorové aktivity daného komplexu [42]. U některých těchto sloučenin bylo dokonce dokázáno, že jsou účinné proti širšímu spektru nádorů a celá řada komplexů působí i na buněčné linie rezistentní vůči cisplatině [43]. 24

Obr. 10: Strukturní vzorce transkomplexů: a) transplatina, b) trans-[PtCl2(NH3)(thiazol)], c) trans-PtCl2(E-iminoether)2 Tato práce je zaměřena na srovnávání cisplatinových a transplatinových komplexů spolu s cisplatinou a transplatinou. Ve všech případech používaných komplexů byly nahrazeny jedna nebo dvě aminoskupiny za ligand a to piperidin, piperazin nebo picolin (viz. obr. 11). Některé vlastnosti platinových komplexů používáných v této práci byly již proměřeny [44,45]. Byla změřena rychlost vazby, předdenaturační a denaturační změny měřené pomocí CD spektroskopie, stabilita interstrand a intrastrand crosslinků. Dále byla proměřena teplota tání DNA modifikované těmito komplexy a cytotoxicita vůči vybraným buněčným liniím. Tato práce dále rozvíjí poznatky o těchto a dalších komplexech.

Obr. 11: Strukturní vzorce: a) cisplatiny, b) transplatiny, c) cis-(PtCl2)(NH3)(pip), d)

cis-(PtCl2)(NH3)(pz),

e)

cis-(PtCl2)(NH3)(4-pic),

f)

trans-(PtCl2)(NH3)(pip),

g)

trans-(PtCl2)(NH3)(pz), h) trans-(PtCl2)(NH3)(4-pic),

i)

trans-(PtCl2)(4-pic)(pip),

j)

trans-(PtCl2)(4-pic)(pz) [44]

25

3.3. Vícejaderné platinové komplexy

Vícejaderné platinové sloučeniny zahrnují skupinu protinádorových látek s různými chemickými a biologickými vlastnostmi naprosto odlišnými od vlastností jednojaderných platinových léčiv [46]. Nejvýznamnější sloučeninou je tříjaderná dvojvazebná sloučenina s nábojem 4+ BBR3464 [{trans-PtCl(NH3)2}2 µ-trans-Pt(NH3)2{H2N(CH2)6NH2}2]4+ (obr.12).

Obr. 12: Strukturní vzorec BBR3464

Klinické testy komplexu BBR3464 prokázaly účinnost proti nádorům slinivky, plic a melanomům. Již v preklinických testech dosahovalo BBR3464 výborných výsledků. Tato látka vykazovala cytotoxicitu již při desetkrát nižších koncentracích než tomu bylo u cisplatiny. Jednou z dalších výhod byla aktivita proti lidským nádorovým liniím, které získaly rezistenci k cisplatině, a nádorům způsobeným mutací p53 [47]. Protein p53 je nádorovým supresorem, který působí jako transkripční faktor účastnící se regulace řady genů (MDM2, GADD45, p21, Bax) [48]. Bylo zjištěno, že lidské rakovinové buňky se vyznačují vysokou frekvencí mutací v p53. K aktivaci p53 dojde vlivem poškození DNA nebo jinými buněčnými stresy. P53 zablokuje buněčný cyklus a spustí apoptózu. Narušení funkce proteinu může způsobit vznik rakoviny. Ve skutečnosti se asi polovina nádorů vyznačuje poruchou funkce proteinu p53 [49]. BBR3464 může nalézt uplatnění ve více jak 60 % případů nádorových onemocnění způsobených mutací v p53.

4. Síly stabilizující DNA V rovině bází je dvoušroubovice DNA stabilizována vodíkovými můstky, které vznikají mezi bázemi v rámci Watson-Crickova párování bází (viz. obr. 4). Vodíkové vazby

26

jsou elektrostatického typu a jejich velikost je nepřímo úměrná kvadrátu vzdálenosti a přímo úměrná velikosti parciálního náboje na atomech podílejících se na vazbě, tedy na atomech N, H a O. Vodíkové vazby jsou více než 30 krát slabší ve srovnání s kovalentní vazbou ( ∆H 0 = −10kJ / mol ). Mezi interakce stabilizující dvoušroubovici ve směru kolmém na rovinu bází patří dipóldipólová interakce, Londonovy disperzní síly a hydrofobní interakce. Každá báze nukleové kyseliny má permanentní dipólový moment, který ovlivňuje její elektrostatické vlastnosti. Londonovy disperzní síly jsou důsledkem nerovnoměrného rozložení elektrického náboje způsobeného fluktuací elektronové hustoty. Dochází ke vzniku indukovaných dipólů, které mohou polarizovat elektronové hustoty okolních atomů. Touto polarizací vzniknou indukované paralelní dipóly, které se vzájemně přitahují [50,51]. Další síly stabilizující DNA ve vertikálním směru jsou hydrofobní interakce. Dochází jimi k minimalizaci kontaktu nepolárních skupin DNA s molekulami vody. Nepolárními částmi DNA jsou báze, které jsou umístěny uvnitř dvoušroubovice DNA. Báze se vrství v dvoušroubovici nad sebou, aby byl minimalizován kontakt nepolárních bází s vodou. Tyto interakce se v anglické literatuře označují jako stacking interakce a projevují se silněji u purinových bází než u pyrimidinových. Molekula DNA jako celek je hydratována. Molekuly vody jsou vodíkovými můstky navázány do velkého žlábku a vytvářejí tak hydratační obal molekuly, který stabilizuje strukturu dvoušroubovice. Samotná molekula DNA je polyaniont díky záporně nabitým fosfátovým skupinám v cukrfosfátové kostře DNA. Záporné náboje však také způsobují destabilizaci duplexu DNA v důsledku elektrostatického odpuzování záporně nabitých cukrfosfátových koster jednotlivých řetězců. Tyto odpudivé síly jsou odstraněny, pokud se v roztoku nacházejí kationty, které vytvářejí kolem DNA iontovou atmosféru, která odpudivé síly odstiňuje, a tak zvyšuje termodynamickou stabilitu DNA. Příspěvky jednotlivých interakcí jsou velmi malé, ale díky jejich množství a kooperativitě vzniká stabilní dvoušroubovicová molekula DNA [52]. Vazba platnatých komplexů na DNA na ní indukuje celou řadu distorzí, které se pak promítnou do termodynamických vlastností DNA. Obecně lze volnou energii vazby na DNA vyjádřit jako součet pěti základních příspěvků:

27

∆ Gcel = ∆ Gkonf + ∆ Gt+r + ∆ Ghyd + ∆ Gion + ∆ Gmol ∆ Gcel je celková energie, kterou můžeme experimentálně sledovat. ∆ Gkonf je příspěvek volné energie vzniklý v důsledku konformačních změn DNA a molekuly, která se váže po vytvoření aduktu. ∆ Gt+r vyjadřuje ztrátu translační a rotační energie po vzniku vazby. ∆ Ghyd je energie hydrofobního transportu molekuly z roztoku do místa vazby na DNA. ∆ Gion je změna volné energie po uvolnění iontů navázaných v místě vazby před vytvořením aduktu. ∆ Gmol je energie uvolněná při vzniku vazby mezi DNA a jinou molekulou.

4.1. Denaturace DNA Tání neboli denaturace DNA je děj, při němž dochází k přerušení vazeb mezi řetězci DNA a k jejich následnému oddělení. Denaturaci DNA můžeme provést několika způsoby: zvýšením teploty, extrémním snížením koncentrace iontů v roztoku či extrémním snížením nebo zvýšením pH. Při denaturaci DNA dochází k rozpadu jejího hydratačního obalu v důsledku tepelného pohybu molekul vody, dále dochází k přerušení vodíkových můstků mezi bázemi a také k výraznému narušení stacking interakcí. Přechod dvouřetězcové DNA na dva samostatné, oddělené řetězce je charakterizován teplotou tání Tm, což je teplota, při níž je zdenaturovaná právě jedna polovina molekul DNA [53]. Tato veličina je zejména závislá na sekvenci DNA a iontové síle. Aby DNA zdenaturovala, musíme do systému dodat teplo. Jedná se tedy o děj endotermický a enthalpie příslušná denaturaci je kladná. Oddělením řetězců se dostává systém do stavu s nižší uspořádaností, celková entropie tedy roste a systém přechází do entropicky stabilnějšího stavu. Denaturace DNA je charakterizována termodynamickými veličinami ∆ S (entropie), ∆ H (enthalpie), ∆ G (Gibbsova volná energie), které popisují stabilitu DNA. Hodnoty těchto veličin odpovídají veličinám příslušným vzniku dvoušroubovice DNA z jednotlivých řetězců a liší se pouze znaménkem [54]. Pokud ∆ H roste, klesá stabilita molekuly, pokud ∆ H klesá, dojde ke stabilizaci. Pokud roste míra neuspořádanosti systému, klesá ∆ S. Jestliže klesá míra neuspořádanosti systému, roste

∆ S. V případě denaturovaného stavu DNA je větší míra neuspořádanosti systému než u dvoušroubovice [55]. Tání dlouhých fragmentů DNA (například plazmidové DNA nebo DNA z telecího thymu) není dvoustavový kooperativní děj, jak je tomu u krátkých fragmentů DNA. Vzhledem ke 28

značné délce několika tisíc párů bází a nerovnoměrnosti rozmístění GC a AT párů, dochází k diskontinuálnímu tání po oblastech, které však tají kooperativně. Tento fakt se na termogramu projeví vznikem charakteristických píků. Píky vznikající při nižších teplotách přísluší oblastem bohatým na AT páry a naopak píky vznikající při vyšších teplotách přísluší oblastem bohatým na GC páry [56,57].

5. Ramanova spektroskopie

5.1. Princip vibrační spektroskopie

Molekuly jsou tvořeny atomy, které jsou spojeny elastickými vazbami. Proto atomy mohou vykonávat periodický pohyb – mají vibrační stupně volnosti. Pohyby atomů v molekule relativně vůči sobě jsou superpozicí tzv. normálních vibrací, ve kterých všechny atomy vibrují se stejnou fází a frekvencí. Amplituda normální vibrace je popsána normální souřadnicí. Nelineární (respektive lineární) n-atomová molekula má 3n-6 (respektive 3n-5) normálních vibrací, které tvoří její vibrační spektrum. Toto spektrum závisí na hmotnostech atomů, jejich geometrickém uspořádání (rovnovážné konfiguraci) a síle vazeb mezi nimi. Molekulární agregáty (např. krystaly) se chovají jako supermolekuly, v nichž jsou vibrace jednotlivých komponent spřaženy. V prvním přiblížení jsou normální vibrace nezávislé a vzájemně neinteragují. V případě větších výchylek však přestávají být vibrace harmonické a ve vibračním spektru se mohou projevit kromě fundamentálních vibrací i vyšší harmonické nebo kombinační vibrace. Základními experimentálními metodami studia molekulárních vibrací jsou infračervená (IČ) a Ramanova spektroskopie. Jsou založeny na dvou fyzikálně rozdílných jevech - absorpci v případě IČ spektroskopie a rozptylu v případě Ramanovy spektroskopie. Obě však umožňují studovat přechody mezi vibračními stavy molekul v základním elektronovém stavu [58-61].

5.2. Výhody a nevýhody vibrační spektroskopie

Výhody Ramanovy spektroskopie jako metody studia biologických molekul lze shrnout do několika bodů [58]:

29

(a) Jak Ramanova tak i IČ spektroskopie jsou nedestruktivní metody, takže po změření spekter je možno otestovat biologickou aktivitu studovaného vzorku, případně ho recyklovat pro další experimenty. (b) Metody vibrační spektroskopie lze použít na vzorky plynné, kapalné i pevné. V případě nukleových kyselin či proteinů to mohou být roztoky (vodné i nevodné), suspenze, gely, tenké vrstvy, vlákna či amorfní vzorky. Data získaná ze vzorku v daném morfologickém stavu jsou přenositelná na stejný vzorek v jiném morfologickém stavu. Metody vibrační spektroskopie tak umožňují přímé srovnání struktury proteinu v krystalu s jeho strukturou v roztoku. (c) Lze pracovat s relativně malým objemem vzorku (přibližně 10 mikrolitrů i méně v případě Ramanovy spektroskopie). (d) Ve srovnání s fluorescencí (10-9 s) a nukleární magnetickou rezonancí (10-6 s) probíhá Ramanův rozptyl ve velmi krátké časové škále (10-15s). Vibrační spektroskopie je tedy vhodnou metodou studia dynamicky biologických procesů. V současnosti je k dispozici rozsáhlá databáze Ramanových spekter proteinů a NK, která je přenositelná na nově zkoumané systémy, včetně složitých molekulárních komplexů.

Ramanova spektroskopie má ještě některé další výhody oproti IČ spektroskopii [58]: (e) Voda jako přirozené rozpouštědlo pro biomolekuly představuje jisté komplikace při měření IČ spekter, v Ramanových spektrech však díky slabému rozptylu může být její příspěvek snadno kompenzován. (f)

Vysoké intenzity Ramanova rozptylu pocházejí od molekulárních vibrací vyvolávajících velkou změnu polarizovatelnosti molekuly. V nerezonančních Ramanových spektrech proteinů jsou zpravidla nejintenzivnější ty pásy, které odpovídají

vibracím peptidových skupin polypeptidového řetězce, aromatickým

postranním řetězcům a postranním řetězcům obsahujícím síru a karboxyl. Ramanovým spektrům NK dominují pásy odpovídající vibracím bází a fosfátových skupin páteře molekuly. (g) Intenzity Ramanova rozptylu mohou vzrůst až o několik řádů díky rezonančnímu zesílení, tzn. při excitaci zářením, jež je v rezonanci s elektronovým přechodem molekuly. Rezonanční zesílení umožňuje výrazně snížit koncentraci vzorku. Díky

30

selektivitě rezonančního zesílení lze takto získat informaci například o chromoforu zabudovaném v nějaké matrici (v jeho přirozeném okolí).

Vibrační spektroskopie má samozřejmě i některé nevýhody [58]: (a)

Z hlediska spektrálního rozlišení nemůže konkurovat nukleární magnetické rezonanci. Nedostatečné rozlišení lze však do jisté míry překonat pomocí chemické (izotopická záměna) či biologické (bodová mutace) modifikace studované biomolekuly.

(b)

Ramanův jev jako nepružný rozptyl je ve srovnání s absorpcí a emisí záření velmi slabý. Proto musí být věnována mimořádná péče přípravě vzorku a jeho čistotě.

(c)

Ačkoliv potřebný objem vzorku je relativně malý, vzorek musí být dostatečně koncentrovaný (typicky 10-100 mikrogramů na mikrolitr).

5.3. Vibrace makromolekul Normálními vibrace jsou takové vibrace molekuly, při nichž dochází k současným pohybům atomů nebo funkčních skupin v molekule se stejnou fází a frekvencí. Normální vibrace jsou na sobě nezávislé a nedochází při nich ke změně těžiště molekuly (např H2O). Biomakromolekuly jsou tvořeny velkým počtem atomů spojených chemickými vazbami, přičemž molekula jako celek podléhá vzájemným pohybům. Díky tomu, že molekula obvykle postrádá skutečnou symetrii, jsou všechny tyto normální vibrační módy schopny Ramanova přechodu. Většina vibračních módů je však úzce lokalizována a reprezentuje vibrace relativně malé skupiny atomů, která je potom označována jako skupinová vibrace. Atomy účastnící se dané skupinové vibrace vibrují ve fázi, nicméně amplitudy jejich výchylky z rovnovážné polohy se mohou lišit. Proto lze analyzovat v aproximaci danou skupinu atomů pouze na základě nejmarkantnějších amplitud. Při analýze Ramanových spekter je třeba brát v úvahu všechny příspěvky skupinových vibrací a zejména při studiu biomakromolekul je nezbytné ověřování polohy daných vibračních pásů příslušných

komponent

biomakromolekuly

specializované výpočetní metody [62] atd.).

31

(Ramanova

analýza

dané

molekuly,

5.4. Objev a princip Ramanova rozptylu

Teoretické předpovězení Ramanova rozptylu bylo v roce 1923 uskutečněno A. Smékalem. Objevení Ramanova rozptylu se datuje do roku 1928, kdy C. V. Raman objevil, že při ozáření vzorku intenzivním monochromatickým světlem lze ve spektru rozptýleného záření pozorovat kromě budící čáry i symetricky rozložené slabší linie. Vzdálenost těchto linií od centrální čáry, vyjádřená ve stupnici vlnočtů, je charakteristická pro rozptylující látku a nezávisí na vlnové délce budícího záření [59]. Jednou z možností popisující Ramanův rozptyl je kvantově mechanický model, který zahrnuje vlnově-částicovou povahu kvant záření, fotonů, a kvantování energetických hladin molekuly. Lze rozlišit několik variant celého procesu (obr. 13). Podstatou Ramanova jevu je zářivý přechod mezi stacionárními stavy jedné (1) a druhé (2) molekuly (obr. 13), způsobený interakcí s optickým zářením. Molekula interagující s fotonem budícího záření současně vyzařuje sekundární foton, jehož energie splňuje podmínku zachování energie : hv = hv0 + (E2-E1). Při přechodu 2-1 je ve vztahu znaménko +, při opačném přechodu znaménko -. Spektrum Ramanova rozptylu se tedy skládá z dvojic čar, které jsou symetricky rozloženy vůči čáře elasticky rozptýleného záření o frekvenci v0. Oblast nižších frekvencí se nazývá Stokesovou a oblast vyšších frekvencí antiStokesovou větví Ramanova rozptylu [59].

Rayleigh

λsc = λex

λsc ≠ λex λex Obr. 13: Schéma vzniku Ramanova rozptylu

32

Obr. 14: Schématické znázornění interakcí foton-molekula

Ramanova spektra vznikají při ozáření látky monochromatickým zářením o vyšší energii než je energetický rozdíl mezi základními a excitovanými rotačními a vibračními energetickými hladinami molekul studované látky. Dopadající záření (soubor fotonů) interaguje s částicemi tak, že dochází ke srážkám, z nichž některé jsou pružné a jiné nepružné. Elastických srážek je převážná většina (106 : 1) a mají za následek pouze změnu směru fotonu a ne jeho energie. Pro vznik spektra jsou důležité srážky neelastické, při nichž dochází k přenosu energie. Narazí-li foton na molekulu v základním stavu, předá jí část své energie, čímž ji excituje do vyššího rotačního resp. vibračního stavu a sám se odrazí s nižší energií. Naproti tomu dojde-li ke srážce fotonu s molekulou, která je jíž excitována, tato se deexcituje a foton se odráží s energií vyšší (obr. 14). Protože za běžných podmínek je počet molekul v základním stavu větší než počet molekul ve stavu excitovaném, je Stokesova část spektra intenzivnější než antiStokesova. Vzhledem k tomu, že populace vyšších vibračních stavů se řídí Boltzmanovým rozdělením (rov. 1), je procento molekul nacházejících se v tomto stavu malé.

N1/N0 = exp(-hυvib/kT)

(1)

Rovnice 1: Vztah popisující Boltzmanovo rozdělení, kde N0, N1 jsou populace molekul v základním, respektive vyšším, vibračním energetickém stavu, h je Planckova konstanta, υvib je vibrační frekvence, k je Boltzmanova konstanta a T je teplota [59].

33

V praxi se proto obvykle měří jen polovina spektra, a to v oblasti Stokesově. Stupnicí je relativní vlnočet. Jako zdroje monochromatického záření se v současné době používají výhradně lasery. Rozptýlené záření se měří nejčastěji pod úhlem 90° ke směru incidentního záření, ve speciálních případech i pod úhlem 0° nebo 180°. Jako detektor se používal chlazený fotonásobič, nyní se používá CCD kamera [59].

5.5. Povrchem zcitlivěná Ramanova spektroskopie: SERS a SER(R)S

5.5.1. Povrchem zcitlivěná rezonanční Ramanova spektroskopie SE(R)RS

Resonanční Ramanova spektroskopie se používá ke studiu složitějších látek. U této metody se využívá rezonanční Ramanův efekt, který je založen na přiblížení vlnové délky záření k maximu absorpčního pásu vzorku. Dochází tak k růstu intenzity Ramanových pásů v některých případech až o tři řády.

5.5.2. Povrchem zcitlivěná Ramanova spektroskopie SERS V roce 1977 bylo na základě experimentů zjištěno, že zesílení Ramanových signálů o několik řádů je vyvoláno do té doby neznámým efektem, který byl označen jako povrchem zesílený Ramanův rozptyl (Surface-Enhanced Raman Scattering – SERS). Tato metoda se dnes, mimo jiné, používá při analýze různých biologických systémů a molekul [60].

5.5.2.1. Princip SERS V roce 1974 bylo poprvé pozorováno Ramanovo spektrum pyridinu adsorbovaného na stříbrné elektrodě [63]. Původní interpretace zesílených Ramanových signálů však nebyla správná. K poznání jevu došlo až o tři roky později a efekt byl nazván povrchem zesílený Ramanův rozptyl. Přestože se SERS používá už řadu let, přesný mechanismus této metody není ještě zcela znám [64]. Existují dvě hypotézy: elektromagnetická a chemická. Elektromagnetická se zabývá indukovaným

dipólem

p,

který

při

Ramanově

rozptylu

vzniká

působením

elektromagnetického světelného pole E na molekulu s polarizovatelností α (p=Eα). Tento jev 34

je popsán jako zvýšení intenzity elektromagnetického pole adsorbátu na kovovém povrchu. Chemická hypotéza předpokládá, že v důsledku chemické adsorbce studované molekuly na povrchu kovu, dochází k velkému zvýšení molekulové polarizace adsorbátu [65]. Jestliže při SERS dochází k rezonančnímu efektu (citlivost metody je zvýšena o dalších několik řádů) jedná se o SE(R)RS – Surface-Enhanced Resonance Raman Scattering (5.5.1.).

5.5.2.2. Experimentální aspekty SERS U metody SERS lze užít dvou substrátů a to elektrod nebo koloidů adsorbátu [66]. Elektrody jsou zhotoveny z ušlechtilých kovů: nejpoužívanější je stříbro, zlato, měď. Před použitím musí být povrch elektrod důkladně vyhlazen a následně podroben jednomu nebo několika oxidačně-redukčním cyklům. Koloidy jsou připravovány chemickou redukcí solí příslušných kovů ve vodném prostředí nebo i některých bezvodých prostředích - např.: Ag koloid v prostředí glycerolu, Ag koloid v prostředí ethanolu. Výhody koloidu spočívají zejména ve snadné přípravě a pohodlném monitorování stupně agregace koloidu pomocí UV-VIS spektroskopie. Nevýhody koloidů oproti elektrodám jsou v nemožnosti přímé regulace potenciálu a v tendenci koloidu k nekontrolované agregaci.

Metodou SERS lze studovat jak malé molekuly (metabolity, nukleové báze, aminokyseliny atd.) [67,68], tak poměrně složité systémy (proteiny, oligo- a polynukleotidy, DNA atd.). Tato metoda se s úspěchem využívá při analýze velmi malých koncentrací studovaných látek adsorbátu.

5.5.2.3. SERS DNA Řada autorů se snaží získat SERS spektra DNA jak na Ag elektrodách [69], tak na koloidech [70]. Spektra nativní DNA nelze prakticky naměřit, protože kontakt s kovovým povrchem se uskutečňuje

pomocí

nukleových

bází,

které

jsou

v nativní

DNA

ukryty

uvnitř

dvoušroubovice. DNA je navíc polyaniont a při kontaktu s kovovým povrchem dojde k odpuzovaní (koloid je také záporně nabitý). Pokud se naměří nějaké spketrum, jsou zaznamenány pouze signály získané z cukrfosfátové kostry. DNA si tedy po adsorbci na povrch buď zachová nativní strukturu, v tomto případě se téměř žádné spektrum nezíská, nebo

35

dojde k distorzi molekuly DNA a je možné získat spektrum, které je totožné se spektrem denaturované DNA [71].

5.6. Fluorescence Kromě výše zmíněného rezonančního Ramanova efektu existují další dva blízké procesy interakce fotonu s molekulou, přičemž oba dva se vyskytují s větší pravděpodobností než Ramanův rezonanční rozptyl. V prvním případě molekula po absorpci fotonu neemituje žádné záření a do nižšího elektronického stavu se vrací disipací energie fotonu formou tepla. Tento jev může mít negativní vliv na vlastní průběh měření, neboť může docházet k tepelné degradaci citlivých vzorků. Druhým případem je fluorescence, při níž dochází v rámci vyššího elektronického stavu k nezářivým přechodům do základního vibračního stavu a následně k zářivým přechodům na různé vibrační hladiny základního elektronového stavu (obr. 14). Absolutní frekvence fotonů pocházejících z fluorescence je tedy nezávislá na frekvenci excitačního záření, na rozdíl od fotonů Ramanova rozptylu, jejichž frekvence je dána rozdílem frekvence excitačního záření a vibrační frekvencí molekuly (υ0 – υvib). Od Ramanova rozptylu se fluorescence odlišuje také časovou škálou celého procesu. Zatímco rezonanční i nerezonanční Ramanova interakce se odehraje v čase kratším než 10-11 sekundy, fluorescenční emise trvá více než 10-9 sekundy [60] .

5.7. Komponenty Ramanova spektrometru

Úspěšné

použití

Ramanovy

spektroskopie

v

bioanalýze

je

úzce

spjato

se zdokonalováním detektorů, spektrometrů, filtrů atd. (obr. 15). Zaměříme-li se na detektory, tak je na místě uvést 90. léta a začátek používání CCD detektoru, který vykazuje mnohem větší citlivost (místo klasického detektoru) a do té doby nebyl používán. Výhodou tohoto detektoru je změření signálu již během jedné sekundy s větší přesností [61]. Zdrojem u Ramanovy spektroskopie může být například YAG laser, ale především jsou užívány plynové lasery (He-Ne, Ar, Kr) [61]. S přechodem k mikroramanově spektroskopii se v poslední době využívají různé typy diodových laserů [60].

36

Z dopadajícího záření je při analýze nutné odfiltroval elastické záření, k čemuž lze použít holografický zářezový filtr nebo rozklad záření na mřížce [60]. Pro analýzu in vivo a další je výhodná tzv. vláknová optika. Pomocí této techniky lze snadněji analyzovat části těla jako například kůži, vlasy, nehty, oblasti úst nebo lze provádět rozbor neurotransmiterů. Nevýhodou je však velice slabý Ramanův signál [60].

Obr. 15: Blokové schéma Ramanova spektrometru

5.8. Popis a aplikace Ramanovy spektrometrie

Jako příklad je uvedeno Ramanovo spektrum vody (obr. 16). Vodorovná osa reprezentuje rozdíly mezi energiemi „Ramanovsky“ rozptýlených fotonů a fotonů excitačního záření. Svislá osa pak odpovídá intenzitě „Ramanovských“ fotonů. Vzhledem k tomu, že energie (E = hν) je ve vlnočtové škále lineární (na rozdíl od ekvivalentní škály vlnových délek), je zvykem v Ramanově spektroskopii vyjadřovat tyto energetické rozdíly v jednotkách reciprokých centimetrů (obr. 16). Pozice vibračních pásů nejsou obvykle uváděny v absolutních vlnočtech, nýbrž jako rozdíl absolutního vlnočtu použité excitační vlnové délky a absolutního vlnočtu rozptýleného fotonu. V literatuře najdeme nejčastěji označení Ramanův posun, Raman shift či wavenumber [60].

37

“stretching” vibrace

“bending” vibrace

Obr. 16: Ramanovo spektrum vody. Ve spektru je možné dobře rozeznat všechny vibrační přechody vody (viz. 3N-6). Pás při 1640 cm-1 odpovídá deformační vibraci. Pásy při 3250 cm-1 a 3400 cm-1 souvisí se symetrickými a antisymetrickými elastickými vibracemi molekul vody.

Analýza tkání in vivo i ex vivo je jedna z aplikací Ramanovy spektroskopie. Ramanova spektra tkání jsou vyhodnocována jako rozdíl mezi normální a poškozenou tkání. Stejně jsou pak hodnoceny i chemické stavy orgánů a buněk. Změny v chemické struktuře buněk a tkání jsou nejzřejmějším indikátorem onemocnění a často se objevují v Ramanově analýze dříve než v jakékoli jiné dostupné metodě [60].

5.9. Ramanova spektroskopie nukleových kyselin

5.9.1. Nukleotidy a jejich analoga

První studie nukleových kyselin pomocí Ramanovy spektroskopie mají počátky u Lorda, Thomase [72,73,75] a Peticolase [74]. Tyto studie byly zaměřeny na studium mononukleotidových a polynukleotidových modelových struktur. Na ně navázaly další práce zabývající se základními složkami nukleových kyselin [74] a studiem interakcí nukleotidů s různými ionty a s tím spjatými konformačními efekty [75]. Ramanova spektroskopie byla také využita ke studiu interakcí vodíkových můstků v místě karbonylové, amino- nebo iminoskupiny DNA purinů a pyrimidinů [76].

38

5.9.2. Syntetické nukleové kyseliny a krátké fragmenty DNA

Syntetické polynukleotidy jsou často používány jako modelové sloučeniny, například při sledování vlivu iontů, pH a teploty na konformaci nukleových kyselin. Příklady využití Ramanovy spektroskopie ke studiu struktury syntetických oligonukleotidů a polynukleotidů shrnují např. publikace [75, 76]. Samostatnou kapitolou je využití fragmentů DNA při studiu vazebných interakcí DNAprotein. Pomocí diferenční Ramanovy spektroskopie jsou srovnávána spektra komplexu (s navázaným proteinem) se sumou jednotlivých izolovaných komponent. Touto metodou již byly studovány četné komplexy protein-DNA s nejrůznějšími DNA vazebnými motivy a rozpoznávacími mechanismy [77]. Syntetické polynukleotidy také často stály na počátku studia vazebných interakcí DNA s léčivy. Příkladem může být práce zabývající se studiem DNA v komplexu s adriamycinem [78].

5.9.3. Nukleové kyseliny (DNA)

Aplikace Ramanovy spektroskopie při popisu struktury nativních nukleových kyselin jsou obvykle úzce spjaty se zmíněnými studiemi na syntetických fragmentech, protože mají shodnou většinu spektrálních znaků [79-81]. Lze nalézt příklady, kdy byly pomocí metod Ramanovy spektroskopie studovány např. strukturní změny v genomových DNA způsobené vlivem teploty [82], pH [83,84], kovových iontů [85, 86] nebo léčiv [87]. Současné práce se věnují analýze genomových DNA s různým poměrem zastoupení bází. Výsledky ukazují, že charakter Ramanových spekter B-DNA je závislý na sekvenci bází, na celkovém zastoupení bází, a že na základě charakteristických Ramanových signálů mohou být genomové DNA rozlišeny [88]. Diferenční Ramanova spektroskopie je schopna odhalit i drobné změny v sekundární struktuře DNA, jakými jsou například rozdíly mezi superhelikální a relaxovanou formou plazmidové DNA [89]. Přehled o výsledcích studie nukleových kyselin pomocí Ramanovy spektroskopie poskytnou například následující souhrnné přehledy [90-95].

39

800

1200

1489

1714

1650 1671 1604

1511

1691

1577 1400

1531

1421 1444 1462

1292 1303 1316

1216 1238

1000

1177

1054

1141

974

894 920

579 596 616 644 600

1013

834

728 750

671 682

1255

1337

1093

1375

784

5.9.4. Ramanovo spektrum DNA

1600

1800

Wavenumber (cm-1)

Obr. 17: Ramanovo spektrum DNA z telecího brzlíku po odečtení spektra solventu (100mM NaCl), excitace při 532 nm, koncentrace DNA ve vzorku ~30 mg /ml [61]

Pro molekulu DNA existuje 3N-6 normálních vibrací, ovšem v reálném Ramanově spektru DNA je možno v intervalu ~600-1800 cm-1 rozeznat přibližně 30 skupinových vibrací (pásů). Podle původu lze tyto vibrace rozdělit do tří skupin:
Vibrace aromatických bází – tvoří většinu pásů v Ramanově spektru DNA.
Vibrace cukerného zbytku – tyto vibrace patří mezi méně zastoupené a méně intenzivní v Ramanově spektru DNA.
Vibrace fosfátové skupiny – ve spektru se nachází tři pásy pocházející od vibrací fosfátové skupiny – 790 cm-1, 835 cm-1 a 1092 cm-1 a všechny slouží jako důležité konformační markery.

V Ramanově spektru DNA byly pozorovány pásy, jejichž vlnočet i intenzita se mění v závislosti na sekundární struktuře nukleové kyseliny a označují se jako Ramanovy konformační markery (viz. tab.2, obr. 17).

40

Skupina

A-DNA

C=O

706 ± 5

O-P-O

807 ± 3

B-DNA

Z-DNA

790 ± 5

745 ± 3

835 ± 7 PO2-

1099 ± 1

1092 ± 1

1095 ± 2

C2´ H2

1418 ± 2

1420 ± 2

1425 ± 2

Tab. 2: Ramanovy pásy indikující A, B a Z konformaci cukr-fosfátové kostry v molekule DNA [74, 96]

Obr. 18: A) Strukturní vzorce deoxynukleotidového guaninu v konformaci C2´-endo/anti (vlevo) a C3´-endo/syn (vpravo), B) Kovalentní struktura ribosyl-fosfátové kostry opakující se v jednotce RNA

Markery týkající se vibrací bází souvisí primárně s „dýchacími“ vibracemi aromatického kruhu bází spřaženými s pohyby atomů furanózového kruhu přes N-glykosidickou vazbu.

41

Pozice markeru závisí na konformaci cukerného zbytku (C3´-endo / C2´-endo) nebo na orientaci glykosidické vazby (anti / syn). Přehled markerů je uveden v tab. 3. Nejvýznamnější spektrální změny doprovázející přechod mezi A a B-konformacemi se nachází v oblasti 600 – 750 cm-1 a mají povahu posunu vlnočtů pásů.

Báze G

A

C

T

C3´-endo/

C2´-endo/

C1´-exo/

C3´-endo/

C2´-endo/

anti

anti

anti

syn

syn

664 ± 2

682 ± 2

670 ± 2

625 ± 3

671 ± 2

1318 ± 2

1333 ± 3

1343 ± 2

1316 ± 2

1324 ±2

(644)664 ± 4

663 ± 2

624 ± 3

1335 ± 2

1339 ± 2

1310 ± 5

780 ± 2

782 ± 2

784 ± 2

1252 ± 2

1255 ± 5

1265 ± 2

(668)642 ± 2

(668)665 ± 2

745 ± 2

748 ± 2

777 ± 2

790 ± 3

1239 ± 2

1208 ± 2

Tab. 3: Ramanovy pásy indikující konformaci deoxynukleosidů a nukleosidů v molekule nukleové kyseliny [74, 96].

5.9.5. Přehled pásů Ramanova spektra ctDNA v B-konformaci (650-1750 cm-1), porovnání A a B-konformace

VLNOČET PŘIŘAZENÍ 644 cm-1

dA, dC

Pás odpovídající adeninu a cytosinu. Ve spektru B-DNA je výrazně slabší než ve spektru A-DNA.

671 cm-1

dT

Tomuto pásu odpovídají vibrace thyminu.

682 cm-1

dG

Pás při 680 cm-1 náleží vibracím aromatického kruhu guaninu. Je to marker B-konformace DNA a svědčí o přítomnosti C2´-endo

42

konformaci furanozového zbytku a anti konformaci glykosidické vazby. 728 cm-1

dA

Vibrace aromatického kruhu adeninu. Při přechodu DNA z B do A-konformace se tento pás nepatrně posouvá k vyššímu vlnočtu (od ~728 cm-1 k ~731 cm-1).

750 cm-1

dT

Vibrace aromatického kruhu thyminu. Charakteristickým znakem odlišujícím A-DNA a B-DNA struktury je dramatický pokles Ramanovy intenzity pásu thyminu při 748 cm-1 v A-DNA ve srovnání s intenzitou tohoto pásu v B-DNA. Při přechodu DNA z B Do A-konformace se tento pás nepatrně posouvá k vyššímu vlnočtu (od ~748 cm-1 k ~753 cm-1).

784 cm-1

dC, dT, OPO, Tento velmi intenzivní pás je ve spektru B-DNA tvořen B-konform.

překryvem více příspěvků. Ze 2/3 jsou to vibrace cytosinu (~780 cm-1) a thyminu (~790 cm-1) a z 1/3 se na tomto pásu podílí symetrická vibrace fosfodiesterové vazby C3´-O-P-O-C5´ v cukrfosfátové kostře DNA.

834 cm-1

OPO,

Nepříliš výrazný, ale významný pás při 834 cm-1 odpovídá

B-konform.

antisymetrické vibraci fosfodiesterové vazby C3´-O-P-O-C5´. Ukázalo se, že spolu s pásem při 790 cm-1 jsou tyto dva markery B-konformace

protějškem

intenzívního

pásu

807

cm-1

charakteristického pro A-DNA. 894 cm-1

d

Dva relativně slabé pásy při 895 cm-1 a 920 cm-1 jsou připisovány vibracím vazeb v deoxyribózovém kruhu.

-1

920 cm

d

Spolu

s pásem

při

894

cm-1

odpovídá

vibracím

vazeb

v deoxyribózovém kruhu. 974 cm-1

d

Spolu s pásy 894 cm-1 a 920 cm-1 odpovídá vibracím deoxyribózového kruhu.

-1

1013 cm

d

Pás odpovídající vibracím cukerného zbytku.

1054 cm-1

C=O,

Vibrace cukrfosfátové kostry a C=O skupiny.

cukrfosfátová kostra 1093 cm-1

PO2-,

Vibrace fosfátové skupiny PO2- v cukrfosfátové kostře DNA.

B-konform.

Vzhledem k tomu, že Ramanova intenzita tohoto pásu se nemění

43

v závislosti na konformaci DNA, je tento pás často využíván k normalizaci intenzit Ramanových spekter. Ve spektrech A-DNA se tento pás posouvá k vyššímu vlnočtu na přibližně ~1101 cm-1. 1141 cm-1

dT

Pás odpovídající vibracím deoxythymidinu.

1177 cm-1

dG

Vibrace pyrazolového kruhu guaninu.

1216 cm-1

dG

Pás odpovídající vibraci imidazolového kruhu guaninu.

1238 cm-1

dT, dC

Pás odpovídající vibraci thyminu a cytosinu.

1255 cm-1

dT, dC

Tento pás se skládá z komponent odpovídajících vibracím aromatického kruhu thyminu a cytosinu.

1292 cm-1

dC

1303 cm-1

dA, dC

Vibrační mód cytosinového kruhu. Pás

skládající

se

z komponent

odpovídajících

vibracím

aromatického kruhu adeninu a cytosinu. 1316 cm-1

dG

Málo výrazný vibrační mód aromatického kruhu guaninu, který se vyskytuje v blízkosti 1319 cm-1 ve spektrech B-DNA nebo 1322 cm-1 ve spektrech A-DNA.

1337 cm-1

dA, dG

Tento pás odpovídá především vibracím aromatického kruhu adeninu a v menší míře i guaninu. Tento pás se z části překrývá s vibračním módem aromatického kruhu guaninu (viz. výše 1316 cm-1).

1375 cm-1

dT

1421 cm-1

C 2´H2

Tento pás odpovídá vibraci aromatického kruhu deoxythimidinu. Ramanova linie při 1421 cm-1 byla připsána deformační vibraci C2´H2 skupin deoxyribozylu v B-DNA. Tato vibrace patří k markerům B-konformace DNA. Jejím ekvivalentem v A-DNA jsou píky 1396 cm-1 a 1418 cm-1.

1444 cm-1

CH2

Spolu s pásem při ~1463 cm-1 odpovídají různým módům CH2 skupiny.

1462 cm-1

C5´H2

Tento málo intenzivní pás byl připsán deformační vibraci C5´H2 skupin deoxyribozylu v B-DNA.

1489 cm-1

dG, dA

Pás odpovídající převážně vibracím imidazolového kruhu guaninu. Minoritní příspěvek pochází také od adeninu. Poloha pásu je ovlivňována vodíkovými můstky v okolí dusíku N7 guaninu.

1511 cm-1

dA

Původem pásu jsou vibrace imidazolového kruhu adeninu.

1531 cm-1

dC

Pás související s vibracemi aromatického kruhu cytosinu.

44

1577 cm-1

dG, dA

Marker purinů, zahrnuje překrývající se příspěvky od dG a dA. Je známo, že plocha tohoto pásu se (téměř) nemění při přechodech mezi různými formami DNA dvoušroubovice a při změnách v solventu, které nevedou k denaturaci DNA (což naznačuje možné uplatnění tohoto pásu jako vnitřního standardu při normování spekter).

1604 cm-1

dG

Nevýrazný pík při 1604 cm-1 byl připsán vibracím aromatického kruhu guaninu.

1650 cm-1

C=O

Pás odpovídající především vibracím exocyklické karbonylové skupiny (C=O) thyminu.

1671 cm-1

C=O

Tento pás byl připsán vibracím karbonylové skupiny (C=O) bází. V rámci tří bází obsahujících tuto skupinu je příspěvek thyminu k celkové intenzitě pásu největší, guaninu malý a cytosinu zanedbatelný.

1691 cm-1

C=O

Tento pás byl připsán vibracím karbonylové skupiny (C=O) guaninového zbytku.

1714 cm-1

C=O

Tento pás byl také připsán vibracím karbonylové skupiny (C=O) guaninového zbytku.

Tab. 4: Přehled nejvýznamnějších pásů typického Ramanova spektra DNA v B-konformaci [61]

Popis jednotlivých pásů viz. např. literatura [82-98].

5.10. Úspěchy v Ramanově spektrometrii

Studium molekul, které mají významné funkční a strukturní role v živých organismech, je velmi důležitou oblastí, která může mít velký přínos při poznávání vztahů mezi strukturou těchto látek a jejich biologickou funkcí. Ramanova spektroskopie získala po svém objevu důležitost mezi spektroskopickými metodami. Je nepostradatelná při určování struktury jak anorganických, tak organických sloučenin. Poskytuje informace především o nepolárních látkách. Další oblastí využití

45

Ramanovy spektroskopie je identifikace chemických individuí. Výhody a nevýhody již byly zmíněny výše (kap. 5.2.). Vysoká citlivost i u malých systémů, přesnost a možnost použití v klinické diagnostice, laboratorních studiích i medicíně, je jednou z dalších výhod. Využití studia pomocí Ramanovy spektroskopie bylo nejvíce rozvíjeno v posledních letech in vivo a Ramanův jev se stal proto velice úspěšnou metodou. Jednou z velkých přínosů Ramanovy spektrometrie je široká škála informací obsažená v každém naměřeném spektru, velmi vysoká citlivost a dobrá interpretace o poloze molekuly díky ostrým píkům. Zdá se, že Ramanova spektroskopie se brzy zařadí mezi úspěšné klinické metody a studie proteinů, léčiv, buněk, bakterií a virů.

46

III. CÍL PRÁCE

1. Připravit vzorky fragmentů DNA naštěpením dlouhovláknové DNA pomocí sonikace.

2. Charakterizovat připravené vzorky z hlediska délky fragmentů a přítomnosti jednořetězcové DNA v roztoku.

3. Připravenou DNA modifikovat vybranými platinovými komplexy a provést analýzu připravených Pt-DNA komplexů pomocí Ramanovy spektroskopie. DNA modifikovat v případě každého komplexu třemi rb a srovnat s výsledky mé diplomové práce [99].

47

IV. MATERIÁL A METODY

1. Materiál

1.1. Použité chemikálie

DNA byla vyizolována z telecího thymu [100].

Standard molekulových délek DNA (100bp) byl od firmy TaKaRa. Cisplatina i transplatina byly od firmy Sigma. Jejich zásobní roztoky o koncentraci 5.10-4 M byly připraveny rozpuštěním v destilované H2O a skladovány ve tmě. Komplexy

cis-PtCl2(NH3)(pip),

trans-PtCl2(4-pic)(pip),

trans-PtCl2(NH3)(pip),

trans-PtCl2(4-pic)(pz),

trans-PtCl2(NH3)(pz),

cis-PtCl2(NH3)(4-pic)

a

trans-PtCl2(NH3)(4-pic) byly poskytnuty prof. Danem Gibsonem – Department of Medicinal Chemistry and Natural Products, School of Pharmacy, The Hebren University of Jerusalem, Israel Agarózu dodala firma Serva.

EDTA (ethylen diamin kyseliny tetraoctové), tris-boritan sodný, NaCl (chlorid sodný), NaClO4 (chloristan sodný), sacharóza, bromfenolová modř, fenol, chloroform, ethanol, EtBr (ethidium bromid), NaAc (octan sodný), HCO2NH4 (mravenčan amonný) a fosfátový pufr byly od firmy Sigma.

1.2. Použité roztoky

TBE pufr (pH 8,5)

40 mM tris-boritan sodný 2 mM EDTA

Roztok bromfenolové modři

40 % (w) sacharóza 0,25 % (w) bromfenolová modř

48

Roztok NaCl

0,1 M, 4 M

Roztok NaClO4

0,01 M

Roztok EtBr

10 mg/ml

Roztok NaAc

3 M, pH 5,5

HCO2NH4

0,3 M

fosfátový pufr

0,1 M

2. Metody

Při všech experimentech byla použita deionizovaná voda (MilliQ systém, Millipore).

2.1. Sonikace

Sonikace byla prováděna na přístroji Dynatech – Sonic Dismembrator. DNA byla rozpuštěna v 0,5 M NaCl. Sonikace probíhala vždy minutu za nepřetržitého chlazení v ledové lázni. Přístroj byl nastaven na maximální výkon 35 W. Po 10, 20 a 25 minutách byly odebrány alikvotní podíly a analyzovány pomocí polarografie a elektroforézy (viz. kap. V.1. a V.3.). Pro zajištění maximální optické homogenity vzorků byly případné sraženiny a prachové částice odstraněny ze zásobního roztoku filtrací přes membránový filtr s póry o velikosti 0,22

µm (Millipore).

2.2. UV spektrometrie

Koncentrace thymové DNA byla měřena na základě absorbance při vlnové délce 260 nm v kyvetě o optické dráze 1 cm. Měření bylo prováděno na přístroji Beckman DU 7400. Extinční koeficient ctDNA je: 6600 mol-1 l cm -1. Koncentraci DNA vyjádřenou v µg/ml je možné přepočítat na molární koncentraci DNA podle vztahu: 320µg/ml = 1.10-3M DNA.

49

2.3. Elektroforéza v agarózovém gelu

Agarózový gel (1 %) byl připraven rozvařením příslušného množství agarózy v TBE pufru a po pomalém vychladnutí na 60 °C nalit do připravené formy. Gel byl ponechán jednu hodinu tuhnout, poté byl vložen do eletrolytického tanku a zalit TBE pufrem. Ke vzorkům byl přidán roztok bromfenolové modři a vzorky byly naneseny na gel. Elektroforéza probíhala za pokojové teploty při napětí 60 V po dobu cca tří hodin. Pro elektroforézu byl použit zdroj elektrického napětí Standard Power Pack P25 od firmy Biometra. Barvení gelu bylo provedeno roztokem EtBr (10 mg/ml) po dobu 30 minut. Gel byl

vyfotografován po

prosvícení gelu UV zářením na transiluminátoru TVX-20M (312 nm).

2.4. Polarografie

Polarografická měření byla prováděna na analyzátoru PARC Model 384B. Byl použit tříelektrodový systém. Rtuťová kapková elektroda byla jako pracovní, nasycená Ag/AgCl elektroda jako referentní a platinový drát jako pomocná elektroda. Polarografické křivky byly zaznamenány při následujícím nastavení paramerů analyzátoru: doba kapky 1s, amplituda pulsu -50 mV, rychlost nárůstu potenciálu elektrody 5 mV/s. Jako prostředí byl použit 0,3 M mravenčan amonný s fosfátovým pufrem (0,01 M) pH 6,8. Vzorky byly před měřením vybublány dusíkem po dobu 240 s. Z dříve provedených studií [100] je známo, že nativní, dvouřetězcová molekula DNA (ds) poskytuje na dpp křivce malý pík (tzv. pík II) v oblasti -1,38 V. Mírné zvyšování teploty, tzv. předdenaturační teploty, se projevuje vzrůstem píku II. Dojde-li vlivem nějakého zásahu ke vzniku jednořetězcových oblastí ve vzorku DNA (např. zvýšením teploty nad teplotu denaturace), pak se na polarografické křivce objevuje další pík (označovaný jako pík III) v oblasti kolem -1,45 V. Intenzita proudu poskytovaného jednořetězcovou DNA (pík III) je asi 100x větší než u píku II stejně koncentrovaného roztoku nativní DNA [100] .

2.5. Dialýza DNA

DNA byla převedena z roztoku NaCl do roztoku H2O pomocí dialýzy (Spectra/Por, 12-14000). 50

2.6. Lyofilizace DNA

Lyofilizace vzorků DNA byla provedena na přístroji Labconco 4,5.

2.7. Purifikace DNA

K odstranění proteinů způsobujících fluorescenci při analýze vzorku Ramanovou spektroskopií z roztoku DNA lze použít extrakci fenolem a chloroformem. Ke vzorku se přidá stejný objem fenolu a směs se důkladně protřepe. Následuje krátká intenzívní centrifugace (Sigma 4K15, 5 minut, 14000 ot.) a odebrání vodné fáze obsahující DNA. Celý proces se dvakrát opakuje s chloroformem. Finálním krokem je přesrážení vodné fáze dosahující DNA ethanolem (proběhne zakoncentrování nukleových kyselin a odstranění nezreagovaného agens, rozpouštědla či pufru). Ke vzorku se přidá 1/10 objemu vzorku 3M NaAc, pH 5,2 a trojnásobek objemu 100 % ethanolu. Celá směs se důkladně protřepe a nechá se cca 30 minut při teplotě –20 °C. Následuje centrifugace (30 minut, 14000 ot.) a odebrání supernatantu. Pak se ke sraženině přidá stejný objem 80 % ethanolu a celý postup se opakuje.

2.8. Modifikace DNA platinovými komplexy

Z platinových komplexů (dodány v krystalické formě) byly připraveny zásobní roztoky o koncentraci 5x10-4 - 2x10-3 M v deionizované vodě a skladovány ve tmě při laboratorní teplotě. DNA byla inkubována s roztokem Pt-komplexu, o koncentraci dle požadovaného rb, v roztoku 0,01M NaClO4 při 37 °C ve tmě po dobu 24 hodin. (Stupeň modifikace rb udává počet atomů platiny navázaných na jednu bázi DNA: rb =

c Pt .) c DNA

Výsledná koncentrace platinových komplexů v takto připravených roztocích byla ověřena pomocí bezplamenné atomové absorpční spektroskopie (FAAS) na přístroji Zeeman Atomic Absorption Spectrometer AA 240Z (Varian).

51

2.9. Ramanův spektroskop

Spektra byla zaznamenána na Ramanově spektrometru Jobin-Yvon T64000 (Horiba). Základem celé sestavy je zobrazovací spektrograf vybavený planární holografickou optickou mřížkou s 1200 vrypy/mm. Další součástí je zpětně osvětlovaný CCD detektor (mnohokanálový, tekutým dusíkem chlazený, 1024 x 256 pixelů, s pracovní teplotou –140 °C). Vzhledem k tomu, že pro holografickou mřížku s 1200 vrypy/mm nepokryje CCD detektor celou oblast našeho zájmu v Ramanově spektru DNA (tj. cca 600-1800 cm-1), skládá se každé spektrum vzorku ze dvou subspekter, která se překrývají v intervalu širokém cca 400 cm-1. Před každým záznamem subspektra byla provedena kalibrace spektrografu pomocí pásu 1003,6 cm-1 v Ramanově spektru směsi toluen-acetonitril 1:1. Zdrojem excitačního záření byl argonový laser Coherent Innova 90C FreD (vlnová délka 488 nm), který generuje několik linií v zelené, modré a fialové oblasti spektra. Na laser navazuje jednoduchý mřížkový monochromátor, který filtruje z laserového svazku plasmové linie způsobující v Ramanově spektru nežádoucí artefakty. Nedílnou součástí sestavy je vzorkový prostor se sběrnou optikou. Ten umožňuje plynule měnit uspořádání měření, nejčastější je 90° geometrie. Sběrná optika, zde uzpůsobená i pro práci v UV oblasti spektra, přivádí rozptýlené záření na vstupní štěrbinu premonochromátoru (tripple konfigurace) respektive holografický notch filter (single konfigurace) [60]. Jednotlivé funkce spektrometru řídí software LabSpec, Jobin-Yvon, Horiba. Koncentrované roztoky vzorků, v případě DNA 5 µl o koncentraci 30 µg/µl, byly zataveny do skleněných kapilár Kimax 34507 (Kimble products, USA) a vloženy do fokusovaného laserového svazku. Vlnová délka excitačního záření byla 488 nm (argonový laser Innova 90C FreD, Coherent). Intenzita záření dopadajícího na vzorek byla 100 mW a byla monitorována pomocí BroadBand Power Meter (Melles Griot) [61]. Počet akumulací byl 20 a čas 10 sekund. V případě měření vzorků v pevné fázi byla intenzita záření dopadajícího na vzorek 10 mW, počet akumulací byl 20 a čas 12 sekund. Vzorky piperidinu, picolinu a piperazinu byly měřeny v pevné fázi jako krystaly pod mikroskopem s následujícími podmínkami měření: intenzita záření dopadajícího na vzorek 10 mW, počet akumulací 20, čas 12 sekund. Zpracování naměřených dat probíhalo pomocí softwaru LabSpec. Prvním krokem bylo složení dvou subspekter ve výsledné spektrum a odečtení solventu. Dalším z kroků v procesu zpracování měření byla normalizace jednotlivých spekter, přičemž jako vnitřní standard byla použita plocha pásu při 1014 cm-1 (vibrace cukerného zbytku) a 1093 cm-1 odpovídajícího 52

vibraci fosfátové skupiny v molekule DNA (viz. kapitola Ramanova spektroskopie nukleových kyselin 5.9.). V případě diferenčních spekter bylo od modifikovaného spektra odečteno spektrum DNA. Výsledná podoba spektra byla zpracována v programu Origin 8. Spektra prezentována v této práci jsou uváděna s efektivním spektrálním rozlišením 5 cm-1.

53

V. MĚŘENÍ , VÝSLEDKY A DISKUSE

1. Studium vlivu sonikace na DNA

Prvním bodem studia bylo připravit DNA o nižší molekulové hmotnosti pomocí sonikace. Sonikace probíhala způsobem popsaným v kapitole 4.2.1. Důvodem nepřetržitého chlazení byl ohřev vzorku během sonikace a cílem bylo zabránit tepelné denaturaci DNA. Charakterizace vzorku proběhla pomocí

elektroforézy. Rozsah molekulových délek byl

zjištěn na základě srovnání s markerem molekulových hmotností (tzn. směsí DNA o fragmentech s definovanou délkou 100 bp). Průměrná molekulová hmotnost fragmentů DNA byla menší než 800 bp. Po porovnání průměrných molekulových hmotností bylo zřejmé, že nejvýhodnější je sonikace 20 minut, kdy byly získány vzorky o nejnižší molekulové hmotnosti (viz. obr. 19).

Obr. 19: Agarózový gel po elektroforéze a vizualizaci – v minutách je uvedena doba sonikace, jako kontrola byla použita nesonikovaná thymová DNA

54

2. Spektrofotometrická analýza

Koncentrace DNA byla měřena na UV spektrofotometru před a po ukončení sonikace. Pokud by došlo během sonikace k výrazné denaturaci DNA, absorbance při 260 nm by prokazatelně vzrostla (hypochromní efekt: dvoušroubovicová thymová DNA má o cca 28 % nižší absorbanci v maximu než DNA denaturovaná). U vzorků odebíraných po sonikaci v intervalu 0-20 min. však k žádnému nárůstu absorbance nedošlo. Tím se potvrdil předpoklad, že během sonikace nedošlo k denaturaci DNA. Vzhledem k omezené citlivosti spektroskopie byla jako další metoda k detekci případné přítomnosti jednořetězové DNA zvolena diferenční pulzní polarografie, která je mnohem citlivější a přesnější.

3. Polarografická analýza

Byly zaznamenány DPP křivky nativní DNA, tepelně denaturované DNA, sonikované DNA a samotného elektrolytu (viz. obr. 20). Ve vzorcích sonikovaných po dobu kratší než 25 min. žádný pík III patrný nebyl. Tato skutečnost znamená, že sonikací došlo pouze ke zkrácení délky molekul, nikoliv k denaturačním změnám. Hodnoty píku II a III byly získány jako rozdíl mezi maximem píku a tangentou příslušné elektrochemické křivky. Zvyšování proudu DNA (tab. 5), která byla sonikována 0-20 min., bylo následkem pouze předdenaturačních změn.

55

(1) DNAsonikovaná10min. (2) DNAsonikovaná20min. (3) DNAsonikovaná25min.

(1) nativní thymová DNA (2) denaturovaná thymová DNA

16 III

12

14 (3)

12 II

Proud (A) *10-8

Proud (A) *10-8

10

8 (2) (1)

6

(2) (1)

10

8

6 4

4 -1,3

-1,4

-1,5

-1,6

-1,3

-1,4

-1,5

Potenciál (V)

Potenciál (V)

a)

b) 16 14

Proud (A) *10-8

12 10 8 6 4 2 0 -1,1

-1,2

-1,3

-1,4

-1,5

-1,6

Potenciál (V)

c)

Obr. 20: Polarografické křivky – a) DPP křivky nativní thymové DNA (ds) (1) a tepelně denaturované DNA (ss) (2), b) DPP křivka thymové DNA sonikované 10 min. (1), 20 min. (2), 25 min. (3) , c) DPP elektrolytu (0,3 M HCO2NH4)

56

Proud (nA)

Thymová

Tepelně

Thymová DNA Thymová DNA Thymová DNA

nativní DNA

denatur. DNA

sonik. 10 min.

sonik. 20 min.

sonik. 25 min.

43

55

40

40

50

Tab. 5: Hodnoty proudů pro měřené DNA - thymová nativní dsDNA (c = 320 µg /ml, Ep = -1,35 V) , tepelně denaturovaná ssDNA (c = 15 µg /ml, Ep = -1,46 V) , thymová DNA sonik. 10 min., thymová DNA sonik. 20 min., thymová DNA sonik. 25 min. (c = 320 µg /ml, Ep = -1,35 V). Z obr. 20b je zřejmé, že po 25 minutách sonikace se na dpp křivce objevuje slabý náznak peaku III. To znamená, že při této době sonikace dochází u vzorku DNA ke vzniku malého množství (méně než 1 %) jednořetězové DNA. Nejdelší možná doba sonikace, při které ještě nevzniká velké množství ssDNA, je za našich podmínek 20 minut.

57

4. Analýza modifikovaných DNA pomocí Ramanovy spektrometrie - Přehled změn v Ramanových spektrech DNA po modifikaci jednotlivými komplexy platiny

Pro normalizaci byly u všech spekter použity pásy 1014 cm-1 a 1093 cm-1. Pás 1014 cm-1 odpovídá vibraci cukerného zbytku. Pás 1093 cm-1 odpovídá vibraci PO2- skupiny v cukrfosfátové kostře DNA. Ramanova intenzita se u těchto pásů mění pouze při silných elektrostatických interakcích a rozsáhlých denaturačních změnách. V případě modifikace DNA všemi používanými komplexy tyto pásy však zůstávají zachovány. Oblast za 1610 cm-1 je ovlivněna vibracemi vody. Ze spekter byl odečten příspěvek od solventu (0,1 M NaCl). Diferenční Ramanova spektra od DNA modifikované všemi měřenými komplexy klesají lineárně v závislosti na rb.

Níže uvedené obrázky Ramanových spekter DNA modifikované jednotlivými komplexy mají jednotnou škálu intenzit pro obr. 21, 22; obr. 31, 37; obr. 26a,b, 27a,b, 29a,b, 30a,b, 32a,b, 33a,b, 34a,b, 34a,b, 35a,b, 36a,b; obr. 29c, 30c, 32c, 33c, 34c, 35c, 36c (škála intenzity těchto obrázků je zhruba 1% oproti stejným obrázkům s indexem a,b). Ostatní obrázky (obr. 23, 24, 25, 28) mají zvolené maximální možné minimum velikosti intenzity.

Na obr. 21 jsou uvedena diferenční Ramanova spektra DNA modifikované všemi

1691 1715

1511 1578

1603 1669

1214 1237 1256 1304 1338 1376 1421 1446 1490

1143 1178

1054

970 1014

894 922

834

670 683 729 750

787

1093

používanými komplexy.

(10)

(1) cis-PtCl2(NH3)2 rb 0,1) (2) trans-PtCl2(NH3)2 rb 0,1) (3) cis-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,1) (4) trans-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,1) (5) trans-PtCl2(NH3)(pz) rb 0,1) (6) trans-PtCl2(4-pic)(pip) rb 0,1) (7) trans-PtCl2(4-pic)(pz) rb 0,1) (8) cis-PtCl2(NH3)((4-pic) rb 0,1)) (9) trans-PtCl2(NH3)(4-pic) rb 0,1) (10) kontrola ctDNA

(9) Intensity (a.u.)

(8) (7) (6) (5) (4) (3) (2) (1) 800

1000

1200

1400

1600

1800

Wavenumber (cm-1)

Obr. 21: Diferenční Ramanova spektra DNA modifikované studovanými komplexy (vynásobeno pětkrát): 1-9) rb = 0,1, Ramanovo spektrum 10) nemodifikované DNA,

58

Na obr. 22 jsou uvedena všechna naměřená spektra DNA modifikované všemi používanými

1691 1715

1603 1669

1511 1578

1214 1237 1256 1304 1338 1376 1421 1446 1490

1054

1143 1178

970 1014

894 922

834

670 683 729 750

787

1093

komplexy.

(10)

(1) cis-PtCl2(NH3)2 rb 0,1) (2) trans-PtCl2(NH3)2 rb 0,1) (3) cis-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,1) (4) trans-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,1) (5) trans-PtCl2(NH3)(pz) rb 0,1) (6) trans-PtCl2(4-pic)(pip) rb 0,1) (7) trans-PtCl2(4-pic)(pz) rb 0,1) (8) cis-PtCl2(NH3)((4-pic) rb 0,1)) (9) trans-PtCl2(NH3)(4-pic) rb 0,1) (10) kontrola ctDNA

(9) Intensity (a.u.)

(8) (7) (6) (5) (4) (3) (2) (1) 800

1000

1200

1400

1600

1800

Wavenumber (cm-1)

Obr. 22: Ramanova spektra DNA modifikované studovanými komplexy: 1-9) rb = 0,1, 10) nemodifikované DNA

Aby byla možná jednoznačná interpretace všech naměřených spekter a zejména jednotlivých píků [101-103], byla také proměřena spektra používaných platinových komplexů v pevné fázi (obr. 23). Exaktní přiřazení jednotlivých píků daným vibracím by bylo možné provést na

1452

1370

1218

1073

1029

823

základě výpočtů jednotlivých vibrací [62].

(7)

(1) cis-PtCl2(NH3)(pip) (2) trans-PtCl2(NH3)(pip) (3) trans-PtCl2(NH3)(pz) (4) trans-PtCl2(4-pic)(pip) (5) trans-PtCl2(4-pic)(pz) (6) cis-PtCl2(NH3)(4-pic) (7) trans-PtCl2(NH3)(4-pic)

1372

1452

(5) 1218

1073

1029

823

Intensity (a.u.)

671

(6)

(4) (3)

1452

1372

1278

1027

814

671

(2)

(1) 1000

1500

Wavenumber (cm-1)

Obr. 23: Přehled všech naměřených Ramanových spekter studovaných komplexů v pevné fázi

59

Díky nízké rozpustnosti platinových komplexů, typicky ≤ než 1 mM, není možné získat Ramanova spektra komplexů v roztoku. Spektra používaných komplexů byla získana pomocí mikroramanovy spektroskopie. V tomto případě byly krystalky komplexu v mg množství měřeny přímo a výhodou byla možnost kontroly kvality vzorku. Kalibrace pomocí pásu 1003,6 cm-1 byla prováděna před každým měřením kvůli kontrole nastavení polohy mřížky. Ramanovo spektrum kalibrační směsi toluen-acetonitril je na

1211 1157 1180

1380

919

813

623

521

1031

786

Intensity (a.u.)

1003

obr. 24.

400

600

800

1000

1200

1400

Wavenumber (cm-1)

Obr. 24: Kalibrační Ramanovo spektrum směsi toluen-acetonitril 1:1

60

Při měření Ramanových spekter DNA (viz. obr. 25) byl závažným problémem výskyt fluoreskujících látek téměř v každém vzorku. Ukázalo se, že i stopové množství těchto látek může celé měření znehodnotit. Nejlepším postupem k odstranění těchto látek ze vzorku byla

1578

1490

1715

1691

1669 1603

1511

1421 1462 1446

1214 1178 1143

1014 1054

894 922 970

834

670 683 729 750

1237

Intensity (a.u.)

1256 1304

1093

787

1338

1376

purifikace DNA pomocí extrakce fenolem a chloroformem (viz. část IV. kap. 2.7.)

1000

1500 Wavenumber (cm-1)

Obr. 25: Ramanovo spektrum DNA

Detailnější popis viz. část III, kap. 5.9.5. Z kap. 5.9.5. také vyplývá, že DNA používaná pro modifikaci jednotlivými komplexy se nachází v B-konformaci (viz. poměr intenzity pásů 682/670 cm-1 a dále pásy 787 cm-1, 834 cm-1, 1421 cm-1). Popis jednotlivých spekter byl vypracován pomocí literatury [82-98].

61

1669

1715

1603

1511

1421 1462 1446

1691

1578

1490

1338

1504

1657

1588

1000

(1)

(2)

(3)

1490

1395

1436

1378

1196

1243 1298 1320 1344

1025

885

1237 1256 1304

1093

1143 1178 1214

834 894 922 970 1014 1054 807

(1) cisDDP rb 0,1 (2) cisDDP rb 0,05 (3) cisDDP rb 0,01 (4) kontrola ct DNA

(4)

845

706

670 683 729 750 685

665

Intensity (a.u.)

787

1376

4.1. Analýza spektra DNA modifikované cisplatinou

1500 Wavenumber (cm-1)

Obr. 26a): Diferenční Ramanovo spektrum DNA modifikované cisplatinou 1) rb = 0,1,

1669

1691 1715 1715 (2)

1395

1490

1504

1588 1657

1691

1603 1578 1669

(3)

1511

1421 1446 1462

1490

1603

1511

1421 1462 1446 1376

1298 1320 1344 1378 1436

1196

1243

1000

(1) cisDDP rb 0,1 diferencni spektrum (2) cisDDP rb 0,1 (3) kontrola ctDNA

1578

1490

1338 1214 1237 1256 1304 1239 1256 1304 1338

1093 1054

1025

894 922 970 1014

1143 1178 1214

1093

1143 1178

970 1014 1054

894 922

834

807 845 885

834

787 667 683 729 750 665 685 706

Intensity (a.u.)

670 683 729 750

787

1376

2) rb = 0,05, 3) rb = 0,01, Ramanovo spektrum 4) nemodifikované DNA

(1)

1500 Wavenumber (cm-1)

Obr. 26b): Ramanovo spektrum: 1) cis-PtCl2(NH3)2 – diferenční Ramanovo spektrum, 2) Ramanovo spektrum cis-PtCl2(NH3)2, 3) kontrola ctDNA

62

Získaná spektra po modifikaci DNA cisplatinou jsou uvedena na obr. 26a,b. Nepříliš výrazný nárůst intenzity píku v oblasti 667 cm-1 (posunut oproti B-DNA – 670 cm-1), ale naopak nárůst intenzity píku 683 cm-1, nenaznačuje znatelný přechod z B-konformace do A. Pokud intenzita pásu 667 cm-1 naroste více, než intenzita pásu 682 cm-1, potom je poměr intenzit píků 682/667 cm-1 > 1 a DNA modifikovaná daným komplexem se nachází v A-konformaci. V případě modifikace DNA cisplatinou však tento jev nenastal. Ovšem nárůst intenzity píku 807 cm-1 značí lokální strukturní změny DNA modifikované cisplatinou. Tento pík je protějškem intenzivního pásu 834 cm-1 v B-konformaci a jeho nárůst intenzity tedy signalizuje změny v B-DNA. Lokální minimum v oblasti 845 cm-1 souvisí s antisymetrickou vibrací fosfodiesterové vazby C3´-O-P-O-C5´. Naopak lokální maximum v oblasti 885 cm-1 souvisí s vibracemi vazeb v deoxyribózovém kruhu (v B-DNA 894 cm-1) a svědčí o možné distorzi DNA. Vibrace v oblasti 800 cm-1 - 1050 cm-1 odpovídají vibracím cukrfosfátové kostry, kde nebyla zaznamenána žádná výraznější změna. Pás v oblasti 1093 cm-1 odpovídá vibraci PO2- skupiny v cukrfosfátové kostře DNA. Vzhledem k tomu, že Ramanova intenzita se u tohoto pásu nemění v závislosti na modifikaci DNA vybranými platinovými komplexy, byl tento pás využit k normalizaci intenzit všech spekter (kap. 4). Pás v oblasti 1243 cm-1 odpovídá vibraci thyminu a cytosinu. Tento pás je lehce posunutý oproti spektru DNA v B-konformaci (1237 cm-1). Došlo zde ke změnám v párování bází G-C a A-T. Pro DNA modifikovanou cisplatinou došlo pravděpodobně k narušení vrstvení bází a cytosin se přímo účastnil koordinační vazby s platinovým atomem, což vedlo k nárůstu intenzity tohoto pásu. Oblast kolem pásu 1298 cm-1 je vibračním módem cytosinového kruhu (posunut oproti B-DNA – 1292 cm-1) a nárůst velikosti intenzity tohoto pásu v případě modifikace DNA cisplatinou znamená lokální porušení G-C páru. V oblasti 1320 cm-1 se vyskytuje málo výrazný vibrační mód aromatického kruhu guaninu. Tento pás se posunuje do blízkosti 1319 cm-1 ve spektrech B-DNA a za oblast 1319 cm-1 ve spektrech A-DNA, což vidíme v případě DNA modifikované cisplatinou (1320 cm-1). Došlo zde k lokální distorzi vazeb G-C párů (viz. i nepatrný nárůst intenzity píku 1298 cm-1), změně struktury DNA a pravděpodobně tedy i k lokální denaturaci DNA modifikované cisplatinou. Oblast 1330 cm-1 - 1344 cm-1 odpovídá především vibracím aromatického kruhu adeninu a v menší míře i guaninu (přesně 1337 cm-1 v B-DNA). Nárůst intenzity pásu 1344 cm-1 souvisí opět s distorzí vazeb G-C párů a lokální denaturací v této oblasti. Pás 1378 cm-1, který je posunut oproti B-konformaci DNA (1375 cm-1), odpovídá vibraci aromatického kruhu deoxythimidinu. Je tedy pravděpodobné, že i vodíkové můstky mezi A-T párem byly porušeny a lokální denaturace proběhla i v těchto místech, ovšem v menší míře, než v oblasti vodíkových můstků G-C páru. Pokles intenzity 63

pásu v oblasti 1395 cm-1 a naopak nárůst intenzity pásu v oblasti 1436 cm-1 souvisí s deformační vibrací C2H2 skupin deoxyribozylu v B-DNA. Pás 1421 cm-1, který se nachází v této oblasti spektra deformačních vibrací C2H2 skupin deoxyribozylu, signalizuje změny z B-konformace na konformaci blízkou A. Ve všech spektrech DNA modifikované studovanými komplexy je intenzita pásu 1421 cm-1 nulová nebo značně poklesla do záporných hodnot. Pokud však dojde k významné změně DNA z B-konformace do A, tento pás se posune do oblasti 1396 cm-1 a 1418 cm-1. To ze spektra DNA modifikovaného cisplatinou patrné není (obr. 26b). Výrazný pokles intenzity pásu 1490 cm-1 odpovídá modifikaci v poloze N7 guaninu a je také charakteristický pro všechna měřená spektra DNA modifikované vybranými komplexy. Pás v oblasti 1504 cm-1 (v B-DNA se nachází v oblasti 1511 cm-1) souvisí s vibracemi imidazolového kruhu adeninu a nárůst intenzity tohoto pásu značí částečnou modifikaci adeninu spolu s guaninem v případě modifikace DNA cisplatnou. Spolu s pásem 1490 cm-1 je tento pás markerem platinace u všech případů DNA modifikované používanými komplexy platiny. Dvojpík v oblasti 1588 cm-1 a 1657 cm-1 je ovlivněn vibracemi vody u všech DNA modifikovaných měřenými komplexy. Samotný pás v oblasti 1588 cm-1 odpovídá překrývajícím se příspěvkům od dG a dA. Ve spektru B-DNA se tento pík nachází v oblasti 1577 cm-1. Nárůst intenzity tohoto pásu v případě modifikace DNA cisplatinou znamená narušení vodíkových vazeb G-C a T-A párů. S tímto faktem souvisí opět i předdenaturační a denaturační jevy vyskytující se v DNA modifikované cisplatinou, což podporuje i nárůst intenzity pásu 1344 cm-1 a 1378 cm-1. Pás v oblasti 1657 cm-1 odpovídá zejména vibracím exocyklické karbonylové skupiny (C=O) thyminu a může být interpretován jako narušení vodíkových vazeb thyminu (stejně jako pásy 1378 cm-1 a 1583 cm-1).

64

4.2. Analýza spektra DNA modifikované transplatinou

1578

1490

1669

1511

1715

1462

1603

1691

1338 1214

1421 1446

1237 1256 1304

1436 1506 1532 1589

1394

1329 1332

1240

1659

1093 1143 1178 1179

1039

920

913

834 894 922 970 1014 1054

670 683 729 750 803

(4)

(1) (2)

(3)

1490

686

670

683

Intensity (a.u.)

787

1376

(1) trans DDP rb 0,1 (2) trans DDP rb 0,05 (3) trans DDP rb 0,01 (4) kontrola ct DNA

1000

1500 Wavenumber (cm-1)

Obr. 27a): Diferenční Ramanovo spektrum DNA modifikované transplatinou 1) rb = 0,1,

1691 1715

1669

(1) transDDP rb 0,1 diferencni spektrum (2) transDDP rb 0,1 (3) kontrola ctDNA

(3) 1669 1659

1589

(2) (1)

1490

1436 1506 1532

1394

1329

1332

1240

1179

1143 1178

1093 823 894 922 920 970 1014 1039 1054

913

686

803

1093 1143 1119 1214 1216 1178 1237 1237 1256 1256 1304 1304 1338 1338 1376 1376 1421 1421 1446 1446 1462 1462 1490 1490 1511 1511 1578 1603 1578

970 1014 1054

894 922

834 787

670 683 729 750 683

670

Intensity (a.u.)

670 683 729 750

787

2) rb = 0,05, 3) rb = 0,01, Ramanovo spektrum 4) nemodifikované DNA

1000

1500 Wavenumber (cm-1)

Obr. 27b): Ramanovo spektrum: 1) trans-PtCl2(NH3)2 – diferenční Ramanovo spektrum, 2) Ramanovo spektrum trans-PtCl2(NH3)2, 3) kontrola ctDNA

65

Zpracovaná spektra po modifikaci DNA transplatinou jsou uvedena na obr. 27a,b. Malý nárůst intenzity píků v oblasti 670 cm-1 a naopak výraznější nárůst intenzity píku v oblasti 683 cm-1 signalizuje, že neproběhla znatelná změna B-konformace, podobně jako pro DNA modifikovanou cisplatinou. Nárůst intenzity píku 803 cm-1 v případě DNA modifikované transplatinou (v B-konformaci DNA se tento pík nachází v oblasti 807 cm-1), značí lokální strukturní změny v B-DNA. Interpretace je stejná jako v případě DNA modifikované cisplatinou (807 cm-1). I DNA modifikovaná transplatinou signalizuje nárůstem intenzity tohoto píku změny v B-DNA, avšak tyto změny jsou menší než v případě DNA modifikované cisplatinou. Pásy v oblasti 913 cm-1 a 920 cm-1 souvisí s vibracemi vazeb v deoxyribózovém kruhu obdobně jako pás 885 cm-1 pro DNA modifikovanou cisplatinou. Nepatrný nárůst intenzity pásu v oblasti 1179 cm-1 souvisí s vibrací pyrazolového kruhu guaninu (v oblasti B-DNA se tento pík nachází v oblasti 1177 cm-1). Obecně tento pík souvisí s koordinací platinového atomu k dusíku N7 guaninové báze. Je možné, že při modifikaci DNA transplatinou došlo k lokální denaturaci, proto zde intenzita píku 1179 cm-1 nepatrně narostla. Nárůst intenzity pásu v oblasti 1240 cm-1, je o 35 % menší než v případě DNA modifikované cisplatinou. V případě DNA modifikované transplatinou došlo k narušení vrstvení bází a cytosin se přímo účastnil koordinační vazby s platinovým atomem (IEC), což vedlo k nárůstu intenzity tohoto pásu. V oblasti 1329 cm-1 se vyskytuje málo výrazný vibrační mód aromatického kruhu guaninu, který se vyskytuje v blízkosti 1319 cm-1 ve spektrech B-DNA a za oblastí 1319 cm-1 ve spektrech A-DNA (zmíněno již v kap. 4.1.). Tendence posunu tohoto pásu za oblast 1319 cm-1 je patrný pro DNA modifikovanou cisplatinou (1320 cm-1) i DNA modifikovanou transplatinou (1329 cm-1). V případě modifikace DNA transplatinou ovšem tento posun k vyšším vlnočtům nelze interpretovat jako znatelnou změnu z B-konformace do A-konformace, ale spíše jako lokální denaturační tendenci G-C páru bází. Nárůst intenzity pásu při 1332 cm-1 odpovídá překrývajícím se příspěvkům od aromatického kruhu adeninu, guaninu (v B-konformaci DNA je tento pás v oblasti 1337 cm-1). Tento pás byl oproti cisplatině (1344 cm-1) posunut k nižším vlnočtům. Nevýrazné pásy v oblasti 1394 cm-1 a 1436 cm-1 souvisí s deformační vibrací C2H2 skupin dexoribozylu v B-DNA a lokálními distorzemi těchto vazeb. Významný pokles intenzity píku 1421 cm-1, který signalizuje změny z B-konformace na konformaci blízkou A je znatelný pro DNA modifikovanou cisplatinou (obr. 26b) i DNA modifikovanou transplatinou (obr. 27b). Tento pokles intenzity však bude menší v případě DNA modifikované transplatinou. Nárůst intenzity pásu 1589 cm-1 v případě modifikace DNA transplatinou je menší, než-li pro DNA

66

modifikovanou cisplatinou a znamená menší předdenaturační a denaturační jevy vyskytující se v DNA modifikované transplatinou.

1490

1659

1506

(7)

(6)

1657

1490 1436

1344

(1)

(2) (3)

1490

1243

1025

885

807

1332

1240

1014

1669

1256

1578

1338

(1) cis DDP rb 0,1 (2) cis DDP rb 0,05 (3) cis DDP rb 0,01 (4) trans DDP rb 0,1 (5) trans DDP rb 0,05 (6) trans DDP rb 0,01 (7) kontrola ct DNA

(4) (5)

686

1039

803

588,522 665

Intensity (a.u.)

683

1093

787

1376

4.3. Srovnání spekter DNA modifikovaných cisplatinou a transplatinou

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Wavenumber (cm-1)

Obr. 28a): Diferenční Ramanovo spektrum DNA modifikované cisplatinou 1) rb = 0,1, 2) rb = 0,05, 3) rb = 0,01 a transplatinou 4) rb = 0,1, 5) rb = 0,05, 6) rb = 0,01, Ramanovo spektrum 7) nemodifikované DNA

Vypracovaná diferenční spektra po modifikaci DNA cisplatinou a transplatinou jsou uvedena pro všechna rb na obr. 28. Obě DNA modifikované těmito komplexy nevykazují znatelný přechod z B-konformace do A. U DNA modifikované cisplatinou je poměr intenzity pásů 683/667 cm-1 1,2. U DNA modifikované transplatinou je poměr 683/670 cm-1 1,3. DNA modifikovaná tranpslatinou se bude tedy více udržovat v B-konformaci. DNA modifikovaná cisplatinou se může lokálně měnit v A-konformaci více než DNA modifikovaná transplatinou. Tomuto faktu nasvědčuje i pás v oblasti 1320 cm-1 a nulový pás v oblasti 1421 cm-1. V oblasti pásu kolem 1240 cm-1 je výraznější změna v případě DNA modifikované transplatinou (viz. obr. 26a) a znamená větší lokální denaturaci a pravděpodobně i narušení vrstvení bází. DNA modifikovaná cisplatinou vykazuje větší předdenaturační a denaturační změny (viz. obr. 26a- nárůst intenzity pásů 1320 cm-1, 1344 cm-1, 1378 cm-1).

67

4.4. Analýza spektra DNA modifikované komplexem cis-PtCl2(NH3)(pip)

1578

1715

1603

1691

1669

1578

1490 1462

1511

1421 1446

(4) 1667

(1) (2) (3)

1490

1379

1452

1505 1535

1372

1093

1143 1178 1214 1237 1238 1256 1278 1304 1338 1352

1027

894 922 970 1014 1054 858

807

834

670 683 729 750 671

669

Intensity (a.u.)

787

1376

(1) cis-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,1 (2) cis-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,05 (3) cis-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,01 (4) kontrola ct DNA

1000

1500 Wavenumber (cm-1)

Obr. 29a): Diferenční Ramanovo spektrum DNA modifikované cis-PtCl2(NH3)(pip) 1) rb = 0,1, 2) rb = 0,05, 3) rb = 0,01, Ramanovo spektrum 4) nemodifikované DNA

1691

1669

1715 1675

(3)

1578

1578 1669

1603

1511

1578

1490

1667

1372

1352

(1) cis-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,1 diferencni spektrum (2) cis-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,1 (3) kontrola ctDNA

1505 1535

1421 1446 1462 1490 1511 1505

1421 1462 1446

1338 1256 1338 1376 1304 1278 1328

1027

1238

1143 1178

1237

1093

1143 1178

1214 1237 1256 1304

1093 970 1014 1054 1014 1027

1054

807 894 861

933 970 858

807 671

669

894 922

834 790

670 683 729 750

Intensity (a.u.)

670 683 729 750

787

1376

(v rámečku jsou vyznačeny příspěvky piperidinu - viz. obr. 29c)

(2)

1000

1490

1452

(1)

1500 Wavenumber (cm-1)

Obr. 29b): Ramanovo spektrum: 1) cis-PtCl2(NH3)(pip) - diferenční Ramanovo spektrum (v rámečku jsou vyznačeny příspěvky piperidinu – viz. obr. 29c), 2) Ramanovo spektrum cis-PtCl2(NH3)(pip), 3) kontrola ctDNA

68

1278

1027 1014

1220

1452 1417

1309

1183

1132

1346

1076

1372

858

814

738

802

671 655

Intensity (a.u.)

1000

1500

Wavenumber (cm-1)

Obr. 29c): Ramanovo spektrum komplexu cis-PtCl2(NH3)(pip) v pevné fázi Získaná spektra po modifikaci DNA komplexem cis-PtCl2(NH3)(pip) i spektrum tohoto komplexu v pevné fázi jsou uvedena na obr. 29a-c. Z průběhu diferenčního Ramanova spektra je zřejmé, že dochází ke změnám v oblastech kolem 670 cm-1 a 683 cm-1. Intenzita pásu 670 cm-1 narostla mnohem více, než intenzita pásu 683 cm-1. Poměr intenzit pásů 683/670 cm-1 je tedy 0,9, což značí přechod z B-konformace do A-konformace. Tento přechod je oproti DNA modifikované cisplatinou poměrně znatelný (viz. obr. 26b a 29b). Dále vidíme změny v oblasti 807 cm-1, což vypovídá také o případných změnách z B-konformace (834 cm-1) do A-konformace (807 cm-1) a tato změna se shoduje s nárůstem intenzity pásu 670 cm-1. Pásy v oblasti 671 cm-1, 858 cm-1, 1027 cm-1, 1278 cm-1, 1372 cm-1 a 1452 cm-1 souvisí s příspěvkem vibrací piperidinu. Největší velikost intenzity mají dle spektra komplexu cis-PtCl2(NH3)(pip) měřeného v pevné fázi (obr. 29c) píky 671 cm-1, 1027 cm-1, 1278 cm-1. Nárůst intenzity píků komplex cis-PtCl2(NH3)(pip) měřeného v pevné fázi byl největší ve srovnání s ostatními komplexy měřenými v pevné fázi (obr. 30c, 32c, 33c, 34c, 35c, 36c). Mnohem více oproti DNA modifikované cisplatinou narostl pás 1238 cm-1 (zhruba o 40 %), který odpovídá vibraci cytosinu spolu s thyminem a vypovídá o lokální denaturaci. Nárůst intenzity v oblasti 1352 cm-1 souvisí se změnou intenzity pásu složeného z příspěvků adeninu, guaninu a thyminu. V této oblasti došlo k poměrně značným distorzím v G-C a A-T párech bází a tedy i k poměrně značné lokální denaturaci. Pás v oblasti 1578 cm-1 narostl o 23 % více než tomu bylo u DNA modifikované cisplatinou. Tato změna znamená mnohem znatelnější narušení vodíkových vazeb G-C a T-A párů (obdobně jako pás 1352 cm-1) a výraznější předdenaturační a denaturační jevy, než-li tomu bylo právě v případě cisplatiny. 69

1691

1582

1715

1603 1669

1578

1490 1511

1421 1462 1446

(4) 1677

1421

1511 1532

1353

1271

1238 1203

1054 1060

1028

(1) trans-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,1 (2) trans-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,05 (3) trans-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,01 (4) kontrola ct DNA

1338

1093

1214 1237 1256 1304 1143 1178

894 922 970 1014 1054

(1) (2)

(3)

1490

861

815

813

834

683 729 750 736

670

661 667

Intensity (a.u.)

787

1376

4.5. Analýza spektra DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip)

1000

1500 Wavnumber (cm-1)

Obr. 30a): Diferenční Ramanovo spektrum DNA modifikované trans-PtCl2(NH3)(pip) 1) rb = 0,1, 2) rb = 0,05, 3) rb = 0,01, Ramanovo spektrum 4) nemodifikované DNA

1669 1669

1715

1603 1578 1603

(3)

1582 1677

1511 1532

1421

1691

1578

1490 1421 1462 1446

1421 1376 1462 1490 1511 1353

1238

1271

1511

1338 1214 1237 1256 1304 1203

1060

1054

1143 1178

1093 1143 1195 1178 1236 1251 1304 1338

970 1014 1054 1028 1054

894 922

803 813 864 815 894 922 1028 970 1014

(1) trans-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,1 diferencni spektrum (2) trans-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,1 (3) kontrola ctDNA

(2) (1)

1490

861

736

670

683 729 750 667

661

Intensity (a.u.)

670 683 729 750 790 834

1093

787

1376

(v rámečku jsou vyznačeny příspěvky piperidinu - viz.obr. 30c)

1000

1500 Wavenumber (cm-1)

Obr. 30b): Ramanovo spektrum: 1) trans-PtCl2(NH3)(pip) - diferenční Ramanovo spektrum (v rámečku jsou vyznačeny příspěvky piperidinu – viz. obr. 30c), 2) Ramanovo spektrum trans-PtCl2(NH3)(pip), 3) kontrola ctDNA

70

1346

1453

1369 1411

1307

1427

1271

1203 887

1116

861

800

736

771

948

661

815

1028

Intensity (a.u.)

1000

1500

Wavenumber (cm-1)

Obr. 30c): Ramanovo spektrum komplexu trans-PtCl2(NH3)(pip) v pevné fázi Spektra po modifikaci DNA komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip) i spektrum tohoto komplexu v pevné fázi jsou uvedena na obr. 30a-c. Obdobně jako po modifikaci DNA komplexem cis-PtCl2(NH3)(pip) dochází ke změnám v oblastech kolem 670 cm-1 a 683 cm-1. Poměr intenzit pásů 683/670 cm-1 je 0,8, což značí nejmarkantnější přechod z B-konformace do A-konformace ze všech DNA modifikovaných studovanými komplexy. Tento fakt je podpořen i nejvýraznějším nárůstem intenzity pásu 813 ± 2 cm-1, který je také markerem B-konformace. Tento pás sice může být ovlivněn příspěvkem piperidinu (815 cm-1 viz. obr. 30c) měřeného v pevné fázi, avšak vibrace antisymetrické fosfodiesterové vazby zde zcela jistě převládla. Pásy v oblasti 661 cm-1, 861 cm-1, 1028 cm-1, 1203 cm-1 a 1271 cm-1 souvisí s příspěvkem vibrací piperidinu. Největší velikost intenzity mají dle spektra komplexu trans-PtCl2(NH3)(pip) měřeného v pevné fázi (obr. 30c)

píky 1028 cm-1 a 1271 cm-1,

obdobně jako při modifikaci DNA komplexem cis-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 29c). Pás v oblasti 736 cm-1 souvisí s částečně s vibrací piperidinu. Pokud se však podíváme na spektrum komplexu trans-PtCl2(NH3)(pip) v pevné fázi (obr. 30c), lze říci, že intenzita tohoto pásu je poměrně malá. V Ramanově spektru (obr. 30a) je tento pás ovlivněn i překrývajícími se vibracemi od aromatického adeninu a thyminu. Lze tedy uvažovat lokální výrazné změny A-T páru bází. Pokud se podíváme na znatelný vzrůst píku 1511 cm-1, který vypovídá právě o vodíkových vazbách adeninu (při narušení vodíkových vazeb intenzita pásu vzrůstá), lze říci, že A-T vodíkové vazby byly porušeny. Došlo zde k silné lokální denaturaci DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip). Vibrace v oblasti 1054 cm-1 (patrný i ve spektru B-DNA) a 1060 cm-1 odpovídají vibracím cukrfosfátové kostry. Je tedy 71

pravděpodobné, že došlo ke změnám v B-konformaci i v těchto místech DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip). Tyto pásy v žádných jiných spektrech DNA modifikované studovanými komplexy patrné nebyly. Proto i předpoklad, že DNA modifikovaná komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip)

zaznamenala

největší

změnu

z

B-konformace

ve

prospěch

-1

A-konformace je správný. Vibrační pás 1238 cm , který odpovídá vibraci cytosinu a thyminu a vypovídá o lokální denaturaci, také narostl nejvíce ze všech DNA modifikovaných studovanými komplexy. Nejvýraznější nárůst intenzity v oblasti 1353 cm-1, byl opět patrný pro DNA modifikovanou komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip). V této oblasti došlo ke změnám konformace deoxyribonukleosidů v G-C a A-T párech, což by vypovídalo o výrazné lokální denaturaci (stejně jako pás 1238 cm-1). Nárůst intenzity pásu v oblasti 1532 cm-1 souvisí s vibracemi aromatického kruhu cytosinu (v B-DNA se tento pás vyskytuje v oblasti 1532 cm-1). Tento nárůst intenzity signálu vypovídá o větší míře narušení struktury v okolí cytosinu. V případě DNA modifikované komplexem cis-PtCl2(NH3)(pip) byl tento signál patrný v oblasti 1535 cm-1, avšak jeho intenzita byla menší (viz. obr. 29b). Modifikace DNA komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip) způsobuje největší změny intenzit píků ze všech DNA modifikovaných studovanými komplexy.

72

4.6. Srovnání spekter DNA modifikovaných cisplatinou, transplatinou a komplexy

1578

1490

1338 1376

1669

729

1256

1093

787

cis-PtCl2(NH3)(pip) a trans-PtCl2(NH3)(pip)

600

800

1200

1677 1657

(4)(5) (6) (1)(2)

(3)

1490

1395 1000

(10) (11)(12) (7) (8) (9)

1436

1344

1243

1025

885 845

685

665

807

1490

1511

1353

1238

1028

Intensity (a.u.)

667

813

(13)

(1) cis DDP rb 0,1 (2) cis DDP rb 0,05 (3) cis DDP rb 0,01 (4) trans DDP rb 0,1 (5) trans DDP rb 0,05 (6) trans DDP rb 0,01 (7) cis-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,1 (8) cis-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,05 (9) cis-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,01 (10) trans-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,1 (11) trans-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,05 (12) trans-PtCl2(NH3)(pip) rb 0,01 (13) kontrola ctDNA

1400

1600

1800

Wavenumber (cm-1)

Obr. 31: Diferenční Ramanovo spektrum DNA modifikované cisplatinou 1) rb = 0,1, 2) rb = 0,05, 3) rb = 0,01, transplatinou 4) rb = 0,1, 5) rb = 0,05, 6) rb = 0,01, cis-PtCl2(NH3)(pip) 7) rb = 0,1, 8) rb = 0,05, 9) rb = 0,01 a trans-PtCl2(NH3)(pip) 10) rb = 0,1, 11) rb = 0,05, 12) rb = 0,01, Ramanovo spektrum 13) nemodifikované DNA

Zpracovaná spektra po modifikaci DNA cisplatinou, transplatinou a komplexy cis-PtCl2(NH3)(pip), trans-PtCl2(NH3)(pip) jsou uvedena pro všechna rb na obr. 31. Obě DNA modifikované komplexy cis-PtCl2(NH3)(pip) a trans-PtCl2(NH3)(pip) vykazují přechod z B-konformace do A-konformace oproti DNA modifikované cisplatinou a transplatinou. U DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip) je poměr intenzity píků 683/670 cm-1 nejmenší (0,8). V případě modifikace tímto komplexem tedy došlo k nejvýraznějšímu přechodu z B-konformace do A-konformace. V oblasti 1027 ± 1 cm-1 vidíme vysoký příspěvek

piperidinu

v případě

komplexu

cis-PtCl2(NH3)(pip)

(obr.

29c)

i

trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30c). V oblasti pásu kolem 1238 cm-1 je nejvýraznější změna v případě DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip), což znamená největší lokální denaturaci DNA modifikované tímto komplexem.

73

4.7. Analýza spektra DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(NH3)(pz)

1715

1603 1669

1462

1511

1421 1446

1691

1578

1490

1338 1214 1237 1256 1304 1143 1178

1054

1093

1666

1579

1452

1512

(1) (2)(3)

1490

1355 1372

1240

1218

861

(4)

1029

894 922 970 1014

834

804 807

670

683 729 750

659 667 671

Intensity (a.u.)

787

1376

(1) trans-PtCl2(NH3)(pz) rb 0,1 (2) trans-PtCl2(NH3)(pz) rb 0,05 (3) trans-PtCl2(NH3)(pz) rb 0,01 (4) kontrola ctDNA

1000

1500 Wavenumber (cm-1)

Obr.

32a):

Diferenční

Ramanovo

spektrum

DNA

modifikované

komplexem

trans-PtCl2(NH3)(pz): 1) rb = 0,1, 2) rb = 0,05, 3) rb = 0,01 a Ramanovo spektrum

(1) trans-PtCl2(NH3)(pz) rb 0,1 diferencni spektrum (2) trans-PtCl2(NH3)(pz) rb 0,1 (3) kontrola ctDNA

1715

1669

1603

1691

1578

1490 1511

(3)

1666

1669

1578 1579

1512

(2) (1)

1490

1452

1421 1446 1462 1490 1511

1421 1462 1446

1338 1372

1355

1218

1143 1178

1240

1214 1237 1256 1304

1093

1143 1178

1338 1376

1214 1237 1256 1304

1093 970 1014 1054

894 922 970 1014 1029 1054

861

807

804 671

667

659

670 683 729 750

810

Intensity (a.u.)

790

894 922

834

670 683 729 750

787

1376

4) nemodifikované DNA (v rámečku jsou vyznačeny příspěvky piperazinu - viz. obr. 32c)

1000

1500 Wavenumber (cm-1)

Obr. 32b): Ramanovo spektrum: 1) trans-PtCl2(NH3)(pz) - diferenční Ramanovo spektrum (v rámečku jsou vyznačeny příspěvky piperazinu – viz. obr. 32c), 2) Ramanovo spektrum trans-PtCl2(NH3)(pz), 3) kontrola ctDNA

74

1471

1449 1452

1372

1422

1218

1227 1312 1350

1270

1193 1132

1077

869

1009

861

814

804 738

1029

671 659

Intensity (a.u.)

1000

1500

Wavenumber (cm-1)

Obr. 32c): Ramanovo spektrum komplexu trans-PtCl2(NH3)(pz) v pevné fázi Získaná spektra po modifikaci DNA komplexem trans-PtCl2(NH3)(pz) i spektrum tohoto komplexu v pevné fázi jsou uvedena na obr. 32a-c. Z Ramanova spektra je patrné, že poměr intenzity pásů 683/670 cm-1 < 1 (přesně 0,9), což značí přechod z B-konformace do A-konformace. Nárůst intenzity píku 670 cm-1 je o 22 % než po modifikaci DNA komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip), avšak oproti modifikaci DNA transplatinou je tato změna znatelná. Nárůst intenzity pásu v oblasti 807 cm-1 je v případě modifikace DNA komplexem trans-PtCl2(NH3)(pz) menší než pro DNA modifikovanou komplexy cis-PtCl2(NH3)(pip) a trans-PtCl2(NH3)(pip), ale je o 3 % větší než pro DNA modifikovanou cisplatinou. I tento fakt signalizuje změnu z B-konforamce do A-konformace, ovšem ne tak výraznou jako v případě modifikace DNA komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip). Pásy v oblasti 659 cm-1, 671 cm-1, 804 cm-1, 861 cm-1, 1029 cm-1, 1218 cm-1, 1372 cm-1 a 1452 cm-1 souvisí s příspěvkem vibrací piperazinu. Největší velikost intenzity mají dle spektra komplexu trans-PtCl2(NH3)(pz) měřeného v pevné fázi (obr. 32c) píky 671 cm-1 a 1029 cm-1. Nárůst intenzity píku 1240 cm-1 je menší než po modifikaci DNA komplexy cis-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 29b) a trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30b), ale o 25 % větší než po modifikaci DNA transplatinou (obr. 27b). Nárůst intenzity v oblasti 1355 cm-1 není tak výrazný jako pro DNA modifikovanou komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30b), takže ke změnám konformace deoxyribonukleosidů v G-C a A-T párech došlo jen velmi málo a lokální denaturace v této oblasti byla také malá.

75

1669

1715

1603

1511

1691

1338

1578

1490

(1) trans-PtCl2(4-pic)(pip) rb 0,1 (2) trans-PtCl2(4-pic)(pip) rb 0,05 (3) trans-PtCl2(4-pic)(pip) rb 0,01 (4) kontrola ctDNA

1678

1452 1503 1540 1583

(1) (2)(3)

1490

1353 1421

1218

1236

(4)

1073

1029

861

1011

1421 1446 1462

1237 1256 1304

1143 1178 1214

894 922 970 1014 1054

834 823

671

741

667

807

Intensity (a.u.)

670 683 729 750

1093

787

1376

4.8. Analýza spektra DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(4-pic)(pip)

1000

1500 Wavenumber (cm-1)

Obr.

33a):

Ramanovo

Diferenční

spektrum

DNA

modifikované

komplexem

trans-PtCl2(4-pic)(pip): 1) rb = 0,1, 2) rb = 0,05, 3) rb = 0,01 a Ramanovo spektrum 4) nemodifikované DNA (v rámečku jsou vyznačeny příspěvky piperidinu a picolinu -

1540

1691 1715

1678

1583

1578 1669

(3)

(2) (1)

1490

1452

1503

1669

1603

1578

1490 1421 1462 1446 1421

1353

1000

(1) trans-PtCl2(4-pic)(pip) rb 0,1 diferencni spektrum (2) trans-PtCl2(4-pic)(pip) rb 0,1 (3) kontrola ctDNA

1421 1446 1462 1490 1511

1376 1256 1304 1338

1237 1213 1236 1218

1073

1143 1178

1511

1338 1214 1237 1256 1304

1093 1072 1093 1011 1060 1029

861

894 922 970 1011

869

811 823

1143 1178

970 1014 1054

894 922

834 787

807 741

671

670 683 729 750 667

Intensity (a.u.)

670 683 729 750

787

1376

viz.33c)

1500 Wavenumber (cm-1)

Obr. 33b): Ramanovo spektrum: 1) trans-PtCl2(4-pic)(pip) – diferenční Ramanovo spektrum (v rámečku jsou vyznačeny příspěvky picolinu a piperidinu – viz. obr. 33c), 2) Ramanovo spektrum trans-PtCl2(4-pic)(pip), 3) kontrola ctDNA

76

1073

1471

1449 1452 1422

1304 1344 1372

1218 1191

1138

1272

1225

1011 861

803

1029

823 808

671 659

Intensity (a.u.)

1000

1500

Wavenumber (cm-1)

Obr. 33c): Ramanovo spektrum komplexu trans-PtCl2(4-pic)(pip) v pevné fázi Spektra po modifikaci DNA komplexem trans-PtCl2(4-pic)(pip) i spektrum tohoto komplexu v pevné fázi jsou uvedena na obr. 33a-c. Poměr intenzity pásů 683/670 cm-1 < 1 (přesně 0,9), což značí přechod z B-konformace do A-konformace. Nárůst intenzity píku 670 cm-1 je o 10 % menší než po modifikaci DNA komplexem trans-PtCl2(NH3)(pz) (obr. 32b). Avšak nárůst intenzity píku v oblasti 807 cm-1 je v případě modifikace DNA komplexem trans-PtCl2(4-pic)(pip) větší o 17 % než v případě modifikace DNA komplexem trans-PtCl2(NH3)(pz). Tento pás sice může být ovlivněn příspěvkem picolinu a piperidinu (823 cm-1 - viz obr. 33c) měřeného v pevné fázi, avšak vibrace antisymetrické fosfodiesterové vazby zde zcela jistě převládla, podobně jako v případě DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30c). Vidíme, že poměr změny intenzit píku 670 cm-1 a 807 cm-1 je

pro

DNA

modifikovanou

komplexy

trans-PtCl2(4-pic)(pip)

(obr.

33b)

a

trans-PtCl2(NH3)(pz) (obr. 32b) zhruba stejný, proto je i celkový poměr intenzit píku 670/683 cm-1 pro DNA modifikovanou těmito komplexy 0,9 a změna z B-konformace do A-konformace je srovnatelná. Pásy v oblasti 671 cm-1, 823 cm-1, 861 cm-1, 1011 cm-1, 1029 cm-1, 1073 cm-1, 1218 cm-1, 1372 cm-1 a 1452 cm-1 souvisí s příspěvkem vibrací picolinu

a

piperidinu.

Největší

velikost

intenzity

mají

dle -1

spektra

komplexu

-1

trans-PtCl2(4-pic)(pip) měřeného v pevné fázi (obr. 33c) píky 671 cm , 823 cm a 1073 cm-1. Malý pík v oblasti 741 cm-1 odpovídá překrývajícím se příspěvkům aromatického kruhu adeninu a thyminu. Je možné, že v této oblasti došlo ke strukturním změnám v párování A-T bází. Nárůst intenzity píku 1236 cm-1 je o 28 % větší než v případě DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(NH3)(pz) (obr. 32b), avšak o 7 % menší než po modifikaci DNA komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30b). Intenzita píku v oblasti 1353 cm-1 je naopak o 5 % menší než pro DNA modifikovanou komplexem trans-PtCl2(NH3)(pz) (obr. 32b). 77

4.9. Analýza spektra DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(4-pic)(pz)

1715

1603 1669

1691

1578

1490 1462

1511

1421 1446

1214 1237 1256 1304 1338 1218

1677

1581 1508 1533

(1)

(2) (3)

1490

1353

1372

1452

(4)

1236

1073

1029

823

1143 1178

922 970 1014 1054

807

894

834

670 683 729 667

Intensity (a.u.)

750

1093

787

1376

(1) trans-PtCl2(4-pic)(pz) rb 0,1 (2) trans-PtCl2(4-pic)(pz) rb 0,05 (3) trans-PtCl2(4-pic)(pz) rb 0,01 (4) kontrola ctDNA

1000

1500 Wavenumber (cm-1)

Obr.

34a):

Diferenční

Ramanovo

spektrum

DNA

modifikované

komplexem

trans-PtCl2(4-pic)(pz): 1) rb = 0,1, 2) rb = 0,05, 3) rb = 0,01 a Ramanovo spektrum 4) nemodifikované DNA (v rámečku jsou vyznačeny příspěvky picolinu a piperazinu -

1669 1677

1508 1581

1691

(3)

(2)

(1)

1490

1508 1533

1691 1715

1669

1603

1578

(1) trans-PtCl2(4-pic)(pz) rb 0,1 diferencni spektrum (2) trans-PtCl2(4-pic)(pz) rb 0,1 (3) kontrola ctDNA

1578

1490 1452

1462

1421 1353

1372

1236

1218

1511

1421 1462 1446 1338 1376

1211 1237 1256 1304

1093 1073

894 922 970 1014 1029

1143 1178

1073

874

1490

1338 1214 1237 1256 1304

1093

1143 1178

970 1014 1054

894 922

834 787 811 823

667

807

670 683 729 750

Intensity (a.u.)

670 683 729 750

787

1376

viz. obr. 34c)

1000

1500 Wavenumber (cm-1)

Obr. 34b): Ramanovo spektrum: 1) trans-PtCl2(4-pic)(pz) – diferenční Ramanovo spektrum (v rámečku jsou vyznačeny příspěvky picolinu a piperazinu – viz. obr. 34c), 2) Ramanovo spektrum trans-PtCl2(4-pic)(pz), 3) kontrola ctDNA

78

1073

823

1471

1450 1452

1372

1421

1344 1310

1270

1136

1191

869 949

738

655

676

857

1218

1227

1011 1029

814

805

Intensity (a.u.)

1000

1500

Wavenumber (cm-1)

Obr. 34c): Ramanovo spektrum komplexu trans-PtCl2(4-pic)(pz) v pevné fázi Získaná spektra po modifikaci DNA komplexem trans-PtCl2(4-pic)(pz) i spektrum tohoto komplexu v pevné fázi jsou uvedena na obr. 34a-c. Poměr intenzit pásů 683/670 cm-1 < 1 (přesně 0,9), což opět značí přechod z B-konformace do A-konformace. Nárůst intenzity píku 670 cm-1 je o

8 % menší než po modifikaci DNA komplexem

trans-PtCl2(4-pic)(pip) (obr. 33b). Nárůst intenzity pásu v oblasti 807 cm-1 je v případě modifikace DNA komplexem trans-PtCl2(4-pic)(pz) také o 12 % menší než v případě modifikace DNA komplexem trans-PtCl2(4-pic)(pip). Tento pás sice může být, obdobně jako v případě komplexů trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30c) a trans-PtCl2(4-pic)(pip) (obr.32c), ovlivněn příspěvkem picolinu a piperazinu (823 cm-1 – viz obr. 34c) měřeného v pevné fázi, avšak vibrace antisymetrické fosfodiesterové vazby zde zcela jistě také převládla. Pásy v oblasti 823 cm-1, 1029 cm-1, 1011 cm-1,1073 cm-1, 1218 cm-1, 1372 cm-1 a 1452 cm-1 souvisí s příspěvkem vibrací picolinu a piperazinu. Největší velikost intenzity mají dle spektra komplexu trans-PtCl2(4-pic)(pz) měřeného v pevné fázi (obr. 34c) píky 823 cm-1a 1073 cm-1. Nárůst intenzity píku 1236 cm-1 je o 27 % menší než v případě DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(4-pic)(pip) (obr. 33b). Nárůst intenzity v oblasti 1353 cm-1 je o 2 % větší než v případě DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(4-pic)(pip).

79

1578

1490

1715

1603 1669

1511

1462

1691

1446 1421

1237

1256 1304 1338

1093 1143 1214

(1) cis-PtCl2(NH3)(4-pic) rb 0,1 (2) cis-PtCl2(NH3)(4-pic) rb 0,05 (3) cis-PtCl2(NH3)(4-pic) rb 0,01 (4) kontrola ctDNA

1000

1680

1504 1533 1578

(4)

(1) (2) (3)

1490

1421

1353

1236 1218

1147

1073

1178

970 1014 1054 1029

823

920

807

894 922

834

670 683 729 750 667

Intensity (a.u.)

787

1376

4.10. Analýza spektra DNA modifikované komplexem cis-PtCl2(NH3)(4-pic)

1500 Wavenumber (cm-1)

Obr.

35a):

Diferenční

Ramanovo

spektrum

DNA

modifikované

komplexem

cis-PtCl2(NH3)(4-pic): 1) rb = 0,1, 2) rb = 0,05, 3) rb = 0,01 a Ramanovo spektrum

1691 1715

1669

(1) cis-PtCl2(NH3)(4-pic) rb 0,1 diferencni spektrum (2) cis-PtCl2(NH3)(4-pic) rb 0,1 (3) kontrola ctDNA

1715

1669

(3)

1680

1093 1093 1143 1143 1214 11781214 1178 1237 1237 1236 1256 1256 1304 1304 1353 1338 1338 1376 1376 1421 1421 1421 1446 1462 1462 1490 1490 1504 1511 1511 1533 1578 1578 1578 1603

(2)

1000

1490

(1) 1218

920 1073

894

922 970 1014 1073

812 823

807

670 683 729 750 667

1029

1147

970 1014 1054

894 922

834 787

Intensity (a.u.)

670 683 729 750

787

4) nemodifkované DNA (v rámečku jsou vyznačeny příspěvky picolinu - viz.obr. 35c)

1500 Wavenumber (cm-1)

Obr. 35b): Ramanovo spektrum: 1) cis-PtCl2(NH3)(4-pic) – diferenční Ramanovo spektrum, 2) Ramanovo spektrum cis-PtCl2(NH3)(4-pic) (v rámečku jsou vyznačeny příspěvky picolinu viz. obr. 35c), 3) kontrola ctDNA

80

1340

1353

1147

1073

920

1467

1421

1375

1448 1452

1337

1226

1282

1218 1270

1012

1193

1309

1139 1132

907

1029

917

823 742

672

655

858

805

815

Intensity (a.u.)

1000

1500

Wavenumber (cm-1)

Obr. 35c): Ramanovo spektrum komplexu cis-PtCl2(NH3)(4-pic) v pevné fázi Zpracovaná spektra po modifikaci DNA komplexem cis-PtCl2(NH3)(4-pic) i spektrum tohoto komplexu v pevné fázi jsou uvedena na obr. 35a-c. Spektrum DNA modifikované komplexem cis-PtCl2(NH3)(4-pic) vykazuje velice podobné změny jako spektrum DNA modifikované cisplatinou (obr. 26b). Prvním srovnatelným prvkem je poměr intenzity pásů 683/670 cm-1 > 1 (přesně 1,1), což signalizuje, že DNA po modifikaci tímto komplexem nezaznamenala výrazný přechod z B-konformace do A-konformace. Nárůst intenzity píku 683 cm-1 je o 26 % menší než po modifikaci DNA cisplatinou, to ovšem neukazuje na změny v B-konformaci DNA, ale spíše lokální strukturní změny DNA modifikované komplexem cis-PtCl2(NH3)(4-pic). Nárůst intenzity píku v oblasti 807 cm-1 je v případě modifikace DNA komplexem cis-PtCl2(NH3)(4-pic) o 5 % menší než v případě modifikace DNA cisplatinou. Tento pás sice může být, obdobně jako v případě komplexů trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30c), trans-PtCl2(4-pic)(pip) (obr. 33c) a trans-PtCl2(4-pic)(pz) (obr. 34c), ovlivněn příspěvkem picolinu (823 cm-1 – viz obr. 35c) měřeného v pevné fázi, avšak vibrace antisymetrické fosfodiesterové vazby zde zcela jistě také převládla. Pásy v oblasti 823 cm-1, 920 cm-1, 1029 cm-1, 1073 cm-1, 1147 cm-1, 1218 cm-1 a 1353 cm-1 souvisí s příspěvkem vibrací picolinu. Největší velikost intenzity mají dle spektra komplexu cis-PtCl2(NH3)(4-pic) měřeného v pevné fázi (obr. 35c) téměř shodně pásy 823 cm-1, 920 cm-1, 1073 cm-1, 1147 cm-1 a 1353 cm-1. Nárůst intenzity píku 1236 cm-1 je o 24 % menší než v případě DNA modifikované cisplatinou (obr. 26b). Intenzita píku v oblasti 1353 cm-1 je nejmenší ze všech měřených DNA modifikovaných vybranými komplexy (obr. 21).

81

1511

1715

1603 1669

(4) 1680

1503 1530 1581

1452

1421 1462 1446

(1)(2)

(3)

1490

1421

1354

1691

1578

1490

(1) trans-PtCl2(NH3)(4-pic) rb 0,1 (2) trans-PtCl2(NH3)(4-pic) rb 0,05 (3) trans-PtCl2(NH3)(4-pic) rb 0,01 (4) kontrola ctDNA

1338 1237 1256 1304

1218

1073

1236

1093 1143 1178 1214

970 1014 1054 1029

859

823

807

894 922

834

670 683 729 750 667

Intensity (a.u.)

787

1376

4.11. Analýza spektra DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(NH3)(4-pic)

1000

1500 Wavenumber (cm-1)

Obr.

36a):

Diferenční

Ramanovo

spektrum

DNA

modifikované

komplexem

trans-PtCl2(NH3)(4-pic): 1) rb = 0,1, 2) rb = 0,05, 3) rb = 0,01 a Ramanovo spektrum

1691 1715

1669

1603

1511

1578

1490

(3)

1578 1669 1680

1715

1511 1581 1503 1490 1530

1452

1376

(1) trans-PtCl2(NH3)(4-pic) rb 0,1 diferencni spektrum (2) trans-PtCl2(NH3)(4-pic) rb 0,1 (3) kontrola ctDNA

1490 1421 1462

1354 1421

1218

1236

1214 1237 1251 1304 1338

1093

1143 1178 1073

1029

894 922 970 1014 1054 859

823

1000

1421 1462 1446

1338

1093

1214 1237 1256 1304 1143 1178

970 1014 1054

894 922

834 787 817 807

670

683 729 750 667

Intensity (a.u.)

670 683 729 750

787

1376

4) nemodifkované DNA (v rámečku jsou vyznačeny příspěvky picolinu - viz.obr. 36c)

(2)

(1)

1500 Wavenumber (cm-1)

Obr. 36b): Ramanovo spektrum: 1) trans-PtCl2(NH3)(4-pic) – diferenční Ramanovo spektrum, 2) Ramanovo spektrum trans-PtCl2(NH3)(4-pic) (v rámečku jsou vyznačeny příspěvky picolinu – viz. obr. 36c), 3) kontrola ctDNA

82

1073

823

1465

1445

1452

1370

1412 1422

1308 1348

1197

947

1130

1272 1279

1011

734

674

663

859

1218 1231

803

1029

810

Intensity (a.u.)

1000

1500

Wavenumber (cm-1)

Obr. 36c): Ramanovo spektrum komplexu trans-PtCl2(NH3)(4-pic) v pevné fázi Spektra po modifikaci DNA komplexem trans-PtCl2(NH3)(4-pic) i spektrum tohoto komplexu v pevné fázi jsou uvedena na obr. 36a-c. Poměr intenzit pásů 683/670 cm-1 < 1 (přesně 0,9), což signalizuje, že DNA po modifikaci tímto komplexem zaznamenala přechod z

B-konformace

do

A-konformace,

oproti

DNA

modifikované

komplexem

cis-PtCl2(NH3)(4-pic) (obr. 35b). Nárůst intenzity píku 670 cm-1 je o 5 % větší než po modifikaci DNA komplexem trans-PtCl2(4-pic)(pip) (obr. 33b), avšak o 28 % menší než po modifikaci DNA komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30b), u kterého byla zaznamenána největší změna v modifikované DNA z B-konformace do A-konformace. Nárůst intenzity píku v oblasti 807 cm-1 je v případě modifikace DNA komplexem trans-PtCl2(NH3)(4-pic) o 25 % menší než v případě modifikace DNA komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30b). Tento pás sice může být, obdobně jako v případě komplexů trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30c), trans-PtCl2(4-pic)(pip) (obr. 33c), trans-PtCl2(4-pic)(pz) (obr. 34c) a cis-PtCl2(NH3)(4-pic) (obr. 35c), ovlivněn příspěvkem picolinu (823 cm-1 – viz obr. 36c) měřeného v pevné fázi. Vibrace antisymetrické fosfodiesterové vazby zde však zcela jistě také převládla, jak již bylo uvedeno i v ostatních případech. Pásy v oblasti 823 cm-1, 859 cm-1, 1029 cm-1, 1073 cm-1 a 1218 cm-1 souvisí s příspěvkem vibrací picolinu. Největší velikost intenzity mají dle spektra komplexu trans-PtCl2(NH3)(4-pic) měřeného v pevné fázi (obr. 36c) pásy 823 cm-1 a 1073 cm-1. Nárůst intenzity píku 1236 cm-1 je o 8 % menší než v případě DNA modifikované komplexem cis-PtCl2(NH3)(4-pic) (obr. 35b), což naznačuje menší lokální denaturací v této oblasti v případě DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(NH3)(4-pic). Intenzita píku v oblasti 1354 cm-1 je naopak o 55 % větší než v případě DNA modifikované komplexem 83

cis-PtCl2(NH3)(4-pic). V této oblasti došlo k poměrně značným distorzím v G-C a A-T párech bází a tedy i k poměrně velkému rozsahu lokální denaturace (obdobně jako v případě DNA modifikované komplexy cis-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 29b) a trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30b)).

4.12. Srovnání spekter DNA modifikovaných cisplatinou, transplatinou a komplexy

1669

1578

1490

1338 1376

729

1256

1093

787

cis-PtCl2(NH3)(4-pic) a trans-PtCl2(NH3)(4-pic)

1680

1503

1354

1218

1073

807

(10) (11)(12)

1436

1657

(7)(8) (9) (4) (5) (6) (1) (2)

(3)

1490

1344

1243

1025

885

807

665

1490

Intensity (a.u.)

674

(13)

(1) cis DDP rb 0,1 (2) cis DDP rb 0,05 (3) cis DDP rb 0,01 (4) trans DDP rb 0,1 (5) trans DDP rb 0,05 (6) trans DDP rb 0,01 (7) cis-PtCl2(NH3)(4-pic) rb 0,1 (8) cis-PtCl2(NH3)(4-pic) rb 0,05 (9) cis-PtCl2(NH3)(4-pic) rb 0,01 (10) trans-PtCl2(NH3)(4-pic) rb 0,1 (11) trans-PtCl2(NH3)(4-pic) rb 0,05 (12) trans-PtCl2(NH3)(4-pic) rb 0,01 (13) kontrola ctDNA

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

Wavenumber (cm-1)

Obr. 37: Diferenční Ramanovo spektrum DNA modifikované cisplatinou 1) rb = 0,1, 2) rb = 0,05, 3) rb = 0,01, transplatinou 4) rb = 0,1, 5) rb = 0,05, 6) rb = 0,01, cis-PtCl2(NH3)(4-pic) 7) rb = 0,1, 8) rb = 0,05, 9) rb = 0,01 a trans-PtCl2(NH3)(4-pic) 10) rb = 0,1, 11) rb = 0,05, 12) rb = 0,01, Ramanovo spektrum 13) nemodifikované DNA Získaná spektra po modifikaci DNA cisplatinou, transplatinou a komplexy cis-PtCl2(NH3)(4-pic) a trans-PtCl2(NH3)(4-pic) jsou uvedena na obr. 37. DNA modifikovaná komplexem trans-PtCl2(NH3)(4-pic) (obr. 36b) vykazuje znatelný přechod z B-konformace do A, oproti DNA modifikované transplatinou (obr. 27b). Srovnáme-li však DNA modifikovanou tímto komplexem s DNA modifikovanou komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30b), je

změna z B-konformace do A-konformace v případě DNA modifikované

komplexem trans-PtCl2(NH3)(4-pic) (obr. 36b) o 14 % menší. Nárůst intenzity v oblasti 807 cm-1 je v případě modifikace DNA komplexem cis-PtCl2(NH3)(4-pic) (obr. 15b) srovnatelný s DNA modifikovanou cisplatinou (obr. 26b). DNA modifikovaná cisplatinou i komplexem cis-PtCl2(NH3)(4-pic) si zachovává B-konformaci jen s lokálními strukturními změnami. Tendence k zachování B-konformace je pro DNA modifikovanou cisplatinou o 8 % větší než pro DNA modifikovanou komplexem cis-PtCl2(NH3)(4-pic). Výrazné změny ve 84

spektrech

DNA

modifikované

komplexy

cis-PtCl2(NH3)(4-pic)

(obr.

35c)

a

trans-PtCl2(NH3)(4-pic) (obr. 36c) v oblasti pásů 823 cm-1 a 1073 cm-1 souvisí s vibracemi picolinu. V oblasti pásu kolem 1353 ± 1 cm-1 je výraznější změna v případě DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(NH3)(4-pic), což znamená větší lokální denaturaci a tedy větší distorzi DNA modifikované tímto komplexem.

4.13. Srovnání některých významných změn ve spektrech všech měřených DNA modifikovaných vybranými komplexy platiny

DNA+komplex

670 cm-1 (dG) DNA 890 cis DDP 1375 trans DDP 758 cis-PtCl2(NH3)(pip) 1364 trans-PtCl2(NH3)(pip) 1930 trans-PtCl2(NH3)(pz) 1305 trans-PtCl2(4-pic)(pip) 1318 trans-PtCl2(4-pic)(pz) 1263 cis-PtCl2(NH3)(4-pic) 1196 trans-PtCl2(NH3)(4-pic) 1397

683 cm-1 (dG) 1270 1708 989 1270 1458 1148 1170 1217 1270 1270

834 cm-1 (bk) 985 1272 125 1142 1513 1023 1413 1398 147 985

1237 cm-1 (dC, dT) 2767 3073 2009 4301 5306 3854 4950 3631 2359 2191

1256 cm-1 (dC,dT) 1400 2049 0 2645 2970 1170 1568 1483 80 30

1338 cm-1 (dA, dG) DNA 4120 cis DDP 4840 trans DDP 3491 cis-PtCl2(NH3)(pip) 5513 trans-PtCl2(NH3)(pip) 7055 trans-PtCl2(NH3)(pz) 4884 trans-PtCl2(4-pic)(pip) 4676 trans-PtCl2(4-pic)(pz) 4770 cis-PtCl2(NH3)(4-pic) 3184 trans-PtCl2(NH3)(4-pic) 4947

1376 cm-1 (dT) 5701 3178 3515 5293 6249 4798 5158 5163 4435 5179

1490 cm-1 (dA,dG) 6537 4682 4901 4743 4986 4345 5640 4145 5398 4837

1511 cm-1 (dA) 2498 2368 1911 3350 4318 2666 3186 0 3125 3194

1578 cm-1 (dA, dG) 5800 6407 6348 7928 5565 6993 6845 6785 7732 7470

DNA+komplex

Tab. 6: Změny velikosti intenzit v Ramanových spektrech po modifikaci DNA všemi používanými komplexy (rb= 0,1), velikost změn je udána v jednotkách a.u. (změny jsou pouze relativní, absolutní rozměr z nich nevyplývá, odečet byl proveden v programu origin obr. 26b, 27b, 29b, 30b, 32b, 33b, 34b, 35b, 36b, ), modře je uvedena DNA, k níž se změna daného píku vztahuje

85

DNA+komplex

670 cm-1 (dG) cis DDP 154 trans DDP 85 cis-PtCl2(NH3)(pip) 153 trans-PtCl2(NH3)(pip) 217 trans-PtCl2(NH3)(pz) 177 trans-PtCl2(4-pic)(pip) 148 trans-PtCl2(4-pic)(pz) 142 cis-PtCl2(NH3)(4-pic) 134 trans-PtCl2(NH3)(4-pic) 157

683 cm-1 (dG) 134 78 100 115 90 92 96 100 100

834 cm-1 (bk) 129 13 116 154 104 143 142 15 100

1237 cm-1 (dC, dT) 111 73 155 192 139 179 131 85 135

1256 cm-1 (dC,dT) 146 0 189 212 84 112 106 6 2

1338 cm-1 (dA, dG) cis DDP 117 trans DDP 85 cis-PtCl2(NH3)(pip) 134 trans-PtCl2(NH3)(pip) 171 trans-PtCl2(NH3)(pz) 119 trans-PtCl2(4-pic)(pip) 113 trans-PtCl2(4-pic)(pz) 116 cis-PtCl2(NH3)(4-pic) 77 trans-PtCl2(NH3)(4-pic) 120

1376 cm-1 (dT) 56 62 93 110 84 90 91 78 91

1490 cm-1 (dA,dG) 72 76 73 76 66 86 63 83 74

1511 cm-1 (dA) 95 76 134 173 107 128 0 125 128

1578 cm-1 (dA, dG) 110 109 137 96 121 118 117 133 129

DNA+komplex

Tab. 7: Procentuální změny velikosti intenzit v Ramanových spektrech pro všechny DNA modifikované měřenými komplexy (rb = 0,1), intenzita nemodifikované DNA je 100 % (viz. tab. 6)

86

DNA+komplex

670 cm-1 (dG) cis DDP ++ trans DDP + cis-PtCl2(NH3)(pip) ++ trans-PtCl2(NH3)(pip) +++ trans-PtCl2(NH3)(pz) ++ trans-PtCl2(4-pic)(pip) ++ trans-PtCl2(4-pic)(pz) ++ cis-PtCl2(NH3)(4-pic) ++ trans-PtCl2(NH3)(4-pic) ++

683 cm-1 (dG) +++ + ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++

834 cm-1 (bk) ++ + ++ +++ ++ ++ ++ + ++

1237 cm-1 (dC, dT) ++ + ++ +++ ++ ++ ++ + ++

1256 cm-1 (dC,dT) ++ 0 ++ +++ ++ ++ ++ + +

1338 cm-1 (dA, dG) cis DDP ++ trans DDP + cis-PtCl2(NH3)(pip) ++ trans-PtCl2(NH3)(pip) +++ trans-PtCl2(NH3)(pz) ++ trans-PtCl2(4-pic)(pip) ++ trans-PtCl2(4-pic)(pz) ++ cis-PtCl2(NH3)(4-pic) + trans-PtCl2(NH3)(4-pic) ++

1376 cm-1 (dT) + + ++ +++ ++ ++ ++ ++ ++

1490 cm-1 (dA,dG) ++ ++ ++ ++ + +++ + ++ ++

1511 cm-1 (dA) ++ + ++ +++ ++ ++ 0 ++ ++

1578 cm-1 (dA, dG) ++ ++ +++ + ++ ++ ++ ++ ++

DNA+komplex

Tab. 8: Nárůst (pokles) velikosti intenzit v Ramanových spektrech DNA po modifikaci jednotlivými komplexy (viz. tab. 6): počet znaků je dán poměrem zastoupení změny (nárůst, pokles) v daném sloupci

4.13.1 Shrnutí výsledků všech naměřených Ramanových spekter DNA modifikovaných vybranými platinovými komplexy 670cm-1, 683 cm-1 Oba tyto píky jsou markery A respektive B-konformace. Pokud je intenzita píku 670 ± 3 cm-1 > než intenzita píku 683 ± 3 cm-1, je studovaná DNA v konformaci A. Je-li tomu naopak, je studovaná DNA v konformaci B. Oba píky souvisejí s vibracemi deoxynukleosidů dT (hlavně 670 cm-1) a dG. U píku 683 cm-1 klesá jeho intenzita při změně konformace cukerného zbytku deoxyriboguanosinu z C2´-endo/anti konformaci na C3´-endo konformaci.

87

Poměr velikosti intenzit pásů 683/670 cm-1 klesá v následujícím pořadí (viz. Tab. 9): trans

DDP>cis

DDP>cis-PtCl2(NH3)(4-pic)>trans-PtCl2(4-pic)(pz)>cis-PtCl2(NH3)(pip)>

trans-PtCl2(NH3)(4-pic)>trans-PtCl2(4-pic)(pip)>trans-PtCl2(NH3)(pz)>trans-PtCl2(NH3)(pip)

DNA+komplex

683/670 cm-1

cis DDP

1,2

trans DDP

1,3

cis-PtCl2(NH3)(pip)

0,9

trans-PtCl2(NH3)(pip)

0,8

trans-PtCl2(NH3)(pz)

0,9

trans-PtCl2(4-pic)(pip)

0,9

trans-PtCl2(4-pic)(pz)

0,9

cis-PtCl2(NH3)(4-pic)

1,1

trans-PtCl2(NH3)(4-pic) 0,9 Tab. 9: Poměr velikosti intenzit píků při 683/670 cm-1, je-li intenzita píku 683 cm-1 větší než intenzita píku 670 cm-1, hodnota uvedená v tabulce je větší než jedna, a modifikovaná DNA se nachází v B-konformaci, je-li intenzita píku 683 cm-1 menší než intenzita píku 670 cm-1, hodnota je menší než jedna, a modifikovaná DNA se nachází v A-konformaci

Z tab. 9 je patrné, že DNA po modifikaci komplexy cis DDP (obr. 26b), trans DDP (obr. 27b) a cis-PtCl2(NH3)(4-pic) (obr. 35b) si zachovávají svoji B-konformaci, tzn. že intenzita pásu při 670 cm-1 narostla méně než intenzita pásu při 683 cm-1. DNA modifikovaná komplexy

cis-PtCl2(NH3)(pip)

(obr.

29b),

trans-PtCl2(NH3)(pip)

(obr.

30b),

trans-PtCl2(NH3)(pz) (obr. 32b), trans-PtCl2(4-pic)(pip) (obr. 33b), trans-PtCl2(4-pic)(pz) (obr. 34b), trans-PtCl2(NH3)(4-pic) (obr. 36b) vykazují, ve výše uvedené řadě poměru velikosti intenzit pásů 683/670 cm-1, změnu z B-konformace do A-konformace nebo konformace velice podobnou A-konformaci. Avšak o částečné změně z B-konformace do A-konformace pro DNA modifikovanou komplexy cis DDP, trans DDP a cis-PtCl2(NH3)(4-pic) nasvědčuje úbytek intenzity píku nebo přímo nulová intenzita píku při 1421 cm-1 (stejně jako v případě DNA modifikované ostatními komplexy). Pík 1421 cm-1 odpovídá deformační vibraci C2´H2 skupin dexyribozylu

88

v B-DNA. I DNA modifikované cis DDP, trans DDP a cis-PtCl2(NH3)(4-pic) mohly tedy přejít částečně do A-konformace nebo do konformace velice blízké A-konformaci.

DNA+komplex

konformace

DNA+komplex

konformace

cis DDP

B

trans DDP

B

cis-PtCl2(NH3)(pip)

A

trans-PtCl2(NH3)(pip)

A

cis-PtCl2(NH3)(4-pic)

B

trans-PtCl2(NH3)(4-pic)

A

10 a

10 b

DNA+komplex

konformace

DNA+komplex

konformace

trans-PtCl2(NH3)(pip)

A

trans-PtCl2(NH3)(4-pic)

A

trans-PtCl2(NH3)(pz)

A

trans-PtCl2(4-pic)(pip)

A

trans-PtCl2(NH3)(4-pic)

A

trans-PtCl2(4-pic)(pz)

A

10c

10d

DNA+komplex

konformace

trans-PtCl2(4-pic)(pip)

A

trans-PtCl2(4-pic)(pz)

A

10e Tab

10a-e:

Porovnání

konformací

všech

studovaných

DNA

modifikovaných:

a) cis komplexy, b) trans komplexy, které byly měřeny spolu s cis izomerem, c) trans komplexy, které měly ve srovnání s trans DDP zaměněnu jednu aminoskupinu za ligand: piperidin, piperazin, picolin, d) trans komplexy, které měly ve srovnání s trans DDP zaměněnu jednu skupinu za ligand picolin, e) trans komplexy, které měly ve srovnání s trans DDP zaměněny obě aminoskupiny za ligandy: piperidin, piperazin, picolin

807 cm-1 Pás 807 ± 6 cm-1 je v A-konformaci DNA protějškem intenzivního pásu 834 cm-1 v B-konformaci. Je to tedy marker A-konformace a jeho intenzita nejvýznamněji narostla pro DNA modifikovanou komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30b). Naopak nejméně jeho intenzita 89

narostla pro DNA modifikovanou komplexem trans DDP (obr. 27b). Tento nárůst byl o 62 % ménší, než pro nativní DNA (bráno jako 100%) (viz. tab. 9, 11). Nárůst intenzity tohoto pásu i pro DNA modifikovanou komplexy cis DDP (obr. 26b), trans DDP (obr. 27b)

a

cis-PtCl2(NH3)(4-pic) (obr. 35b) by mohl znamenat, že dochází k úbytku B-formy DNA vlivem modifikace. Při úbytku B-konformace DNA intenzita tohoto signálu roste a signalizuje A-konformaci DNA nebo konformaci velice blízkou A-DNA.

DNA+komplex

807 cm-1

cis DDP

2397

trans DDP

690

cis-PtCl2(NH3)(pip)

2712

trans-PtCl2(NH3)(pip)

3407

trans-PtCl2(NH3)(pz)

2490

trans-PtCl2(4-pic)(pip)

2926

trans-PtCl2(4-pic)(pz)

2582

cis-PtCl2(NH3)(4-pic)

2297

trans-PtCl2(NH3)(4-pic)

2587

Tab. 11: Velikost intenzity píku 807 cm-1 (rb= 0,1), velikost změn je udána v jednotkách a.u. (změny jsou pouze relativní, absolutní rozměr z nich nevyplývá, odečet byl proveden v programu origin z obr. 26b, 27b, 29b, 30b, 32b, 33b, 34b, 35b, 36b Velikost intenzity pásu 807 cm-1 klesá v následující řadě (viz. Tab. 7): trans-PtCl2(NH3)(pip)

>

trans-PtCl2(4-pic)(pip)

>

cis-PtCl2(NH3)(pip)

>

trans-PtCl2(NH3)(4-pic) > trans-PtCl2(4-pic)(pz) > trans-PtCl2(NH3)(pz) > cis DDP > cis-PtCl2(NH3)(4-pic) > trans DDP

834 cm-1 V oblasti 800-1000 cm-1 se nachází vibrační pás 834 cm-1. Pásy v této oblasti jsou citlivé na změny v sekundární struktuře DNA a na změny v cukrfosfátově kostře. Pás 834 cm-1 je jedním z charakteristických markerů B-konformace DNA a odpovídá vibracím fosfodiesterových vazeb. V A-konformaci DNA se tento pás posouvá k nižším vlnočtům do

90

oblasti 807 – 811 cm-1, jak bylo již zmíněno (viz. tab. 11). Ve spektrech všech DNA modifikovaných používanými komplexy je možné pozorovat pokles intenzity tohoto pásu a ve spektrech DNA modifikovaných komplexy cis-PtCl2(NH3)(pip) (807 cm-1) (obr. 29b), trans-PtCl2(NH3)(pip) (803 cm-1) (obr. 30b), trans-PtCl2(NH3)(pz) (810 cm-1) (obr. 32b), trans-PtCl2(4-pic)(pip) (811 cm-1) (obr. 33b), trans-PtCl2(4-pic)(pz) (811 cm-1) (obr. 34b) a trans-PtCl2(NH3)(4-pic) (817 cm-1) (obr. 36b) tento pás přešel ve výše uvedenou oblast tohoto pásu v A-konformaci DNA. Velikost intenzity vibračního pásu 834 cm-1 klesá v následující řadě (viz. Tab. 7): trans-PtCl2(NH3)(pip) > trans-PtCl2(4-pic)(pip) > trans-PtCl2(4-pic)(pz) > cis DDP > cis-PtCl2(NH3)(pip)>trans-PtCl2(NH3)(pz)>trans-PtCl2(NH3)(4-pic)>cis-PtCl2(NH3)(4-pic) > trans DDP U DNA modifikované komplexem cis DDP (obr. 26b) intenzita tohoto vibračního pásu mírně klesla, ale posun k nižším vlnočtům neproběhl. Zde je ovšem nutné opět zmínit pás 1421 cm-1, jehož intenzita je v případě modifikace DNA cis DDP nulová. Lze tedy říci, že i po modifikaci DNA cis DDP došlo ke změnám B-konformace DNA. Po modifikaci DNA komplexy trans DDP (823 cm-1) (obr. 27) a cis-PtCl2(NH3)(4-pic) (812 cm-1) (obr. 35b) se vibrační pás 834 cm-1 posunul k nižším hodnotám. Tento posun v případě modifikace DNA zmíněnými komplexy znamená lokální změny v B-DNA v konformaci velice blízkou A-DNA.

1073 cm-1 Vibrační pás 1073 cm-1 částečně souvisí s vibracemi cukrfosfátové kostry, ale zejména s vibracemi jednotlivých měřených komplexů. Komplexy

trans-PtCl2(4-pic)(pip)

(obr.

33c),

trans-PtCl2(4-pic)(pz)

(obr.

34c),

cis-PtCl2(NH3)(4-pic) (35c) a trans-PtCl2(NH3)(4-pic) (36c) jsou v této oblasti ovlivněny velice silnými příspěvky picolinu, piperidinu a piperazinu. Komplexy cis-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 29c), trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30c) mají podobné znatelné vibrační módy v oblasti 1027 ± 1 cm-1, která je ovlivněna příspěvky piperidinu. Komplex trans-PtCl2(NH3)(pz) (obr. 32c) má obodobně výrazný pík v oblastech 671 cm-1 a 1029 cm-1, které jsou ovlivněny vibracemi piperazinu. Intenzita vibračního pásu 1073 cm-1 nejvíce narostla po modifikaci DNA komplexem trans-PtCl2(4-pic)(pip) (obr. 33b,c), kde si tuto výraznou změnu můžeme vysvětlit, příspěvkem vibrací cukrfosfátové kostry a zejména příspěvkem vibrací picolinu a piperidinu. 91

Vůbec nenarostl tento pás v případě modifikace DNA trans DDP (obr. 27b), což ovšem vysvětluje výše uvedený zmíněný příspěvek komplexů v pevné fázi. Velikost intenzity tohoto pásu klesá v následující řadě (viz. Tab. 7): trans-PtCl2(4-pic)(pip)

>

trans-PtCl2(4-pic)(pz)

>

cis-PtCl2(NH3)(4-pic)

>

trans-PtCl2(NH3)(4-pic) > trans-PtCl2(NH3)(pip) > cis DDP > cis-PtCl2(NH3)(pip) > trans-PtCl2(NH3)(pz) > trans DDP

DNA+komplex

1073 cm-1

cis DDP

1226

trans DDP

0

cis-PtCl2(NH3)(pip)

1049

trans-PtCl2(NH3)(pip)

1666

trans-PtCl2(NH3)(pz)

725

trans-PtCl2(4-pic)(pip)

3362

trans-PtCl2(4-pic)(pz)

2503

cis-PtCl2(NH3)(4-pic)

2312

trans-PtCl2(NH3)(4-pic)

2003

Tab. 12: Velikost intenzity píku 1073 cm-1 (rb= 0,1), velikost změn je udána v jednotkách a.u. (změny jsou pouze relativní, absolutní rozměr z nich nevyplývá, odečet byl proveden v programu origin z obr. 26b, 27b, 29b, 30b, 32b, 33b, 34b, 35b, 36b,

1237 cm-1 Oblast tohoto píku (1100-1400 cm-1) je ve spektru DNA velice členitá. Změny pásů v této oblasti vypovídají o změnách struktury aromatických kruhu purinů a pyrimidinů, jsou citlivé k vazbě kovových atomů právě k aromatickým kruhům a k narušení vrstvení bází. Pás v oblasti 1237 ± 2 cm-1, který souvisí s vibracemi thyminu a cytosinu, narostl nejvýrazněji pro DNA modifikovanou komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30b). Výrazný nárůst velikosti intenzity je tedy příspěvkem vibrace thyminu a cytosinu v DNA, signalizuje navázání centrálního atomu platiny na DNA a je znakem značné lokální denaturace. Nejméně se tento pás změnil v případě modifikace DNA komplexem trans DDP (obr. 27b), kde tedy k lokální denaturaci GC párů dochází velice málo anebo vůbec nedochází. V případě

92

modifikace DNA trans DDP sice dochází k tvorbě IEC, které jsou tvořeny mezi G-C páry bází, ale jejich zastoupení je pouze cca 6 %. Vodíkové můstky mezi guaninem a cytosinem byly přerušeny, cytosiny byly vytěsněny zcela mimo dvoušroubovici DNA a nepodílely se na vrstvení bází. Díky Ramanovu hyperchromnímu efektu pak dochází k zesílení signálu těchto cytosinů. Nárůst intenzity píku 1237 cm-1 však nemusí být tak markantní jako pro ostatní DNA modifikované měřenými komplexy. Velikost intenzity pásu 1237 cm-1 klesá v následujícím pořadí a s tím souvisí i pokles lokální denaturace v tomto pořadí(viz. Tab. 7) : trans-PtCl2(NH3)(pip) > trans-PtCl2(4-pic)(pip) > cis-PtCl2(NH3)(pip)>trans-PtCl2(NH3)(pz) > trans-PtCl2(4-pic)(pz) > cis DDP > cis-PtCl2(NH3)(4-pic) > trans-PtCl2(NH3)(4-pic) > trans DDP

1256 cm-1 Tento pás souvisí s překrývajícím se příspěvkem vibrací cytosinu spolu s thyminem. Velikost intenzity tohoto pásu klesá v řadě (viz. Tab. 7): trans-PtCl2(NH3)(pip) > cis-PtCl2(NH3)(pip) > cis DDP > trans-PtCl2(4-pic)(pip) > trans-PtCl2(4-pic)(pz)>trans-PtCl2(NH3)(pz)>cis-PtCl2(NH3)(4-pic)>trans-PtCl2(NH3)(4-pic)> trans DDP Výrazné strukturní změny v G-C a A-T párech bází způsobují lokální denatrační projevy. Pro DNA

modifikovanou

komplexy

trans-PtCl2(NH3)(pip)

(obr.

30b)

(1251

cm-1)

a

trans-PtCl2(NH3)(4-pic) (obr. 36b) (1251 cm-1) byl tento pás posunut k nižšímu vlnočtu možnými distorzemi vazeb.

1338 cm-1 Tento vibrační mód souvisí s vibrací adeninu a guaninu a vypovídá o lokální denaturaci v G-C a A-T párech bází. Velikost intenzity tohoto pásu je klesající v pořadí (viz. Tab. 7) : trans-PtCl2(NH3)(pip)

>

cis-PtCl2(NH3)(pip)

>

trans-PtCl2(NH3)(4-pic)

>

trans-PtCl2(NH3)(pz) > cis DDP > trans-PtCl2(4-pic)(pz) > trans-PtCl2(4-pic)(pip) > trans DDP > cis-PtCl2(NH3)(4-pic) Tento pás je citlivý na změny v elektronové struktuře aromatického kruhu purinů i pyrimidinů. Pás vzrůstá s narušením stackingem bází a vazbou platiny na aromatický kruh. 93

V případě modifikace DNA kompelxy trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30b) a cis-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 29b) tedy proběhly nejvýraznější změny konformace deoxyribonukleosidů v G-C a A-T párech, což se shoduje s výsledky změn v pásu 1256 cm-1. V případě modifikace DNA komplexem cis-PtCl2(NH3)(4-pic) (obr. 35b) je však nejmenší vzrůst intenzity odůvodnitelný tím, že zde je značný příspěvek komplexu v pevné fázi (viz. obr. 35c) a tím je tedy zastíněn efekt změny konformace v G-C a A-T párech.

1376 cm-1 Pík 1376 cm-1 signalizuje spolu s pásem 1352 cm-1 lokální denaturaci a souvisí s vibraceme thyminu. Velikost intenzity píku 1376 cm-1 klesá v následujícím pořadí (viz. Tab. 7): trans-PtCl2(NH3)(pip)>cis-PtCl2(NH3)(pip)>trans-PtCl2(NH3)(4-pic)>trans-PtCl2(4-pic)(pz) > trans-PtCl2(4-pic)(pip) > trans-PtCl2(NH3)(pz) > cis-PtCl2(NH3)(4-pic) >

trans DDP

>

cis DDP Pás 1376 ± 4 cm-1 souvisí ve všech případech DNA modifikovaných použitými komplexy s příspěvkem piperidinu, picolinu a piperazinu, dle přítomnosti daného ligandu v komplexu (viz. obr. 29c, 32c, 33c, 34c, 35c,). Výsledek lze tedy vysvětlit tak, že v případě DNA modifikované studovanými komplexy,

u kterých proběhla záměna jedné nebo dvou

aminoskupin za ligand, tento pás vzrostl příspěvkem lokální denaturace, ale také příspěvkem daného ligandu. U DNA modifikované trans DDP (obr. 27b) a cis DDP (obr. 26b), které jsou ve výše uvedené řadě poklesu velikosti intenzity tohoto pásu na posledních dvou místech, k žádné záměně aminoskupiny za ligand nedošlo, a proto lze říci, že k poměrně malému nárůstu intenzity píku došlo vlivem lokální denaturace v A-T páru a možném přerušení dvou vodíkových vazeb tohoto páru bází.

1490 cm-1 Změna intenzity pásu 1490 cm-1 (souvisejícího s vibracemi adeninu a guaninu), respektive její pokles v diferenčních Ramanových spektrech, který souvisí s modifikací N7 guaninu, je markantní pro všechna spektra DNA modifikované použitými komplexy. Velikost intenzity tohoto pásu klesá po vazbě elektrofilního činidla k dusíkovému atomu N7.

94

Velikost intenzity tohoto pásu klesá v řadě (viz. Tab. 7): trans-PtCl2(4-pic)(pip) > cis-PtCl2(NH3)(4-pic) > trans-PtCl2(NH3)(pip) > trans DDP > trans-PtCl2(NH3)(4-pic) > cis-PtCl2(NH3)(pip) > cis DDP > trans-PtCl2(NH3)(pz) > trans-PtCl2(4-pic)(pz)

1511 cm-1 Pás v oblasti 1511 cm-1

je vibračním módem imidazolového kruhu adeninu a

dohromady s pásem 1490 cm-1 je markerem platinace u všech případu DNA modifikované studovanými komplexy platiny. Pokles velikosti intenzity pásu 1511 cm-1 je patrný z následující řady (viz. Tab. 7): trans-PtCl2(NH3)(pip) trans-PtCl2(4-pic)(pip)

>

cis-PtCl2(NH3)(pip)

>

trans-PtCl2(NH3)(4-pic)

>

> cis-PtCl2(NH3)(4-pic) > trans-PtCl2(NH3)(pz) > cis DDP >

trans DDP > trans-PtCl2(4-pic)(pz) Nejvyšší nárůst intenzity v případě modifikace DNA komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30b) koreluje s výše uvedenými změnami jednotlivých pásů. V případě modifikace DNA tímto komplexem došlo k výraznému navázání platiny a k výraznému porušení vodíkových můstků mezi adeninem a thyminem. V případě modifikace DNA komplexem trans-PtCl2(4-pic)(pz) (obr. 34b) však nulový nárůst intenzity neznamená, že by k předpokládané platinaci vůbec nedošlo, ale spíše to svědčí o strukturních distorzích A-T párů. Pás 1511 cm-1 byl v případě modifikace DNA komplexem trans-PtCl2(4-pic)(pz) (obr. 34b) posunut do oblasti 1508 cm-1. U modifikace DNA komplexem trans-PtCl2(4-pic)(pz) (obr. 34b) navíc narostl pozitivně pás 1533 cm-1, který souvisí s vibracemi aromatického kruhu cytosinu (v B-konformaci DNA se vyskytuje v oblasti 1531 cm-1) a tato změna se tedy velice dobře shoduje s výše uvedenými fakty.

1578 cm-1 Charakteristickým znakem v diferenčních spektrech DNA modifikovaných všemi studovanými komplexy je pokles a následný nárůst velikosti intenzity při 1578 ± 4 cm-1, respektive 1586 ± 4 cm-1. Oba tyto pásy souvisí s vibracemi guaninu a adeninu.

95

Velikost intenzity pásu 1578 cm-1 klesá v řadě(viz. Tab. 7) : cis-PtCl2(NH3)(pip)

>

cis-PtCl2(NH3)(4-pic)

>

trans-PtCl2(NH3)(4-pic)

>

trans-PtCl2(NH3)(pz) > trans-PtCl2(4-pic)(pip) > trans-PtCl2(4-pic)(pz) > cis DDP > trans DDP > trans-PtCl2(NH3)(pip) Největší nárůst velikosti intenzity pásu 1578 cm-1 byl zaznamenán pro DNA modifikovanou komplexy cis-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 29b) a cis-PtCl2(NH3)(4-pic) (obr. 35b). Výrazný nárůst intenzity pro DNA modifikovanou těmito cis komplexy může být interpretován jako znatelné narušení vodíkových vazeb G-C a T-A párů. S tímto faktem souvisí předdenaturační a denaturační jevy vyskytující se v DNA modifikovaných těmito komplexy. Naopak nejmenší nárůst intenzity pro DNA modifikovanou komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30b) souvisí s faktem, že v případě modifikace DNA tímto komplexem velice zřetelně narostl pás 1603 cm-1, který ve spektru nemodifikované DNA tvoří pouze nepatrný signál pásu 1578 cm-1 (viz. obr. 25). Pás 1603 cm-1 souvisí s vibracemi aromatického kruhu guaninu. Nárůst intenzity tohoto pásu ukazuje na narušení vodíkových vazeb guaninu a můžeme jej vysvětlit jako marker předdenaturačních, případně denaturačních jevů, obdobně jako pás 1578 cm-1.

Z výsledků je zřetelné, že největší změny (nárůst velikosti intenzity pásů) jsou patrné téměř v případě všech píků po modifikaci DNA komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip) (obr. 30a,b). Naopak nejmenší změny v nárůstu velikosti intenzity píků vykazuje DNA modifikovaná trans DDP (obr. 27a,b).

96

VI. ZÁVĚR

V souladu s cílem této práce se podařilo analyzovat DNA pomocí Ramanovy spektroskopie ke studiu změn souvisejících s modifikací DNA vybranými platinovými komplexy.

Prvním krokem mého studia bylo připravit DNA s kratší délkou řetězců za podmínek, kdy DNA neobsahuje denaturovanou DNA. Zkrácení bylo provedeno pomoci sonikace. Vybraným postupem byly připraveny vzorky DNA o molekulové hmotnosti menší než 800 bp. Tyto vzorky byly dále charakterizovány pomocí polarografické analýzy a bylo zjištěno, že za použitých podmínek je možné sonikaci provádět nejdéle 20 minut. Po této době se již v roztoku začala objevovat tepelně denaturovaná ssDNA.

Takto připravená DNA byla modifikována komplexy, které obsahovaly platinu jako centrální atom – cisplatinou, transplatinou a komplexy cis-PtCl2(NH3)(pip), trans-PtCl2(NH3)(pip), trans-PtCl2(NH3)(pz), trans-PtCl2(4-pic)(pip), trans-PtCl2(4-pic)(pz), cis-PtCl2(NH3)(4-pic) a trans-PtCl2(NH3)(4-pic). U všech měřených DNA modifikovaných studovanými komplexy dochází ke změnám jak ve spektrální části odpovídající vibracím cukrfosfátové kostry, tak i v oblastech vibrace bází a v neposlední řadě v oblastech vibrací jednotlivých ligandů. Nejvýraznějším rysem společným pro všechna diferenční spektra jsou změny související s interakcí dusíku N7 deoxyguanosinu s platinovým atomem, a to zejména negativní diferenční pás při cca 1490 cm-1.

Z tab. 9 vyplývá znatelný přechod z B-konformace od A pro DNA modifikovanou komplexy: cis-PtCl2(NH3)(pip), trans-PtCl2(NH3)(pip), trans-PtCl2(NH3)(pz), trans-PtCl2(4-pic)(pip), trans-PtCl2(4-pic)(pz), trans-PtCl2(NH3)(4-pic). Pro DNA modifikovanou komplexy cis DDP, trans DDP a cis-PtCl2(NH3)(4-pic) sice poměr intenzity pásů 683/670 cm-1 přechod z B-DNA do A-DNA nenaznačuje, ale průběhy diferenčních Ramanových spekter (např. pokles intenzity pásu 1421 cm-1) vypovídají o změnách v B-konformaci, nejspíše na konformaci blízkou A-DNA nebo přímo A-DNA.

Po srovnání modifikace DNA komplexy cis-PtCl2(NH3)(pip), trans-PtCl2(NH3)(pip) a

cis-PtCl2(NH3)(4-pic)

a

trans-PtCl2(NH3)(4-pic) 97

s modifikací

DNA

cisplatinou

a transplatinou, lze říci, že DNA modifikovaná komplexem cis-PtCl2(NH3)(4-pic) nevykazuje znatelný přechod z B-konformace do A podobně jako DNA modifikovaná cisplatinou a transplatinou.

Naopak

pro

DNA

po

modifikaci

komplexy

cis-PtCl2(NH3)(pip),

trans-PtCl2(NH3)(pip) a trans-PtCl2(NH3)(4-pic) byl zaznamenán větší nárůst intenzity píku 670 cm-1 oproti 683 cm-1 a došlo tedy k přechodu z B-konformace do A-konformace.

U

DNA

modifikované

komplexy

trans-PtCl2(4-pic)(pip),

trans-PtCl2(4-pic)(pz),

cis-PtCl2(NH3)(4-pic), trans-PtCl2(NH3)(4-pic), které všechny obsahují jako jeden z ligandů picolin, se jimi modifikovaná DNA zřetelně mění. U DNA modifikované komplexy trans-PtCl2(4-pic)(pip), trans-PtCl2(4-pic)(pz) a trans-PtCl2(NH3)(4-pic) je přechod z B-konformace do A-konformace značný (viz. tab. 9). V případě modifikace DNA komplexem cis-PtCl2(NH3)(4-pic) výrazná změna z B-konformace DNA do A-konformace nenastala pravděpodobně vlivem cis izomeru oproti DNA modifikované trans-PtCl2(NH3)(4-pic). Nejvýraznější je ve všech třech Ramanových spektrech DNA modifikovaných těmito komplexy pás v oblasti 1073 cm-1 odpovídající vibraci picolinu.

Záměna jedné aminoskupiny trans DDP za ligand: pic, pip, pz nastala v případě komplexů trans-PtCl2(NH3)(pip), trans-PtCl2(NH3)(pz), trans-PtCl2(NH3)(4-pic). Tato záměna vede u všech DNA modifikovaných zmíněnými komplexy ke změně z B-konformace do A-konformace. U DNA modifikované komplexem trans-PtCl2(NH3)(pip) vede tato záměna k nejvýraznějšímu rozsahu lokální denaturace a také k nejznatelnějšímu přechodu z B-konformace do A-konformace.

Záměna obou aminoskupin trans DDP za ligandy: pic, pip, pz je v případě komplexů trans-PtCl2(4-pic)(pip) a trans-PtCl2(4-pic)(pz) charakterizována po modifikaci DNA těmito komplexy nárůstem intenzity píku v oblasti 1029 cm-1, což je ovlivněno příspěvkem picolinu, piperidinu a piperazinu. DNA modifikované těmito komplexy jsou charakterizovány přechodem z B-konformace do A-konformace, stejně jako ostatní měřené DNA modifikované všemi použitými trans komplexy kromě transplatiny.

U všech DNA modifikovaných studovanými komplexy je velice výrazný pás v oblasti 1236 ± 5 cm-1, který je ovlivněn vibracemi thyminu a cytosinu a signalizuje navázání centrálního atomu platiny k DNA v případě všech modifikovaných DNA.

98

Po srovnání míry denaturace modifikované DNA studovanými komplexy naměřené pomocí CD spektetroskopie (pokles 280nm při denaturačních změnách, nárůst 280nm v případě předdenaturačních změn) [44,45] s analýzou pomocí Ramanovy spetroskopie, lze říci, že výsledky

jsou

v dobré

shodě.

V případě

DNA

modifikované

komplexem

trans-PtCl2(NH3)(4-pic) jsou denaturační jevy dle Ramanovy analýzy patrné, avšak pomocí CD spektroskopie znatelné nejsou. Tento rozdíl lze vysvětlit lokálními strukturními změnami a s nimi související lokální denaturací ( píky 1338 cm-1, 1376 cm-1, 1511 cm-1). Změny není možné precizně proměřit pomocí CD spektroskopie (kvůli nízké citlivosti metody). Pomocí Ramanovy spektroskopie je interpretace těchto změn možná.

Závěr se shoduje se závěrem uvedeným v mojí diplomové práci [99] – největší změnu v Ramanově diferenčním spektru pozorujeme při modifikaci DNA, kde je jedna aminoskupina transplatiny zaměněna za ligand, a to piperidin (trans-PtCl2(NH3)(pip). Domnívám se, že tato práce může přispívat k zavedení metodiky analýzy modifikované DNA pomocí Ramanovy spektroskopie a usnadnit tak vývoj a testování nových protinádorových léčiv nejen na bázi platiny.

Poznámka: Práce bude publikována.

99

VII. POUŽITÁ LITERATURA

1. Keppler, B. K. (ed.) (1993) Metal complexes in cancer chemotherapy, VCH, Weinheim, 2. Rossenberg, B., Lippert, B. (1999) Cisplatin-Chemistry and biochemistry of leading anticancer drug, Wiley-VCH, Zurich, 3-30 3. Drobník, J. (1983) Cancer. Chemother. Pharmacol., 10, 145-153 4. Villani, G., Le Gac, N. T., Hoffmann, J. S., Lippert, B. (ed.) ( 1999) Cisplatin - Chemistry and biochemistry of the leading anticancer drug, Willey – VCH, Weinheim 5. Yarema, K. J., Lippard, S. J., Esigmann, J. M. (1995) Nucleic Acids Res., 23, 4066-4072 6. Bradley, L. J. N., Yarema, K. J., Lippard, S. J., Essigmann, J. M. (1993) Biochemistry, 32, 982-988 7. O´Dwyer, P. J., Stevenson, J. P., Johnson, S. W., Lippert, B. (ed.) (1999) Cisplatin, Chemistry and biochemistry of leading anticancer drug, Wiley-VCH, Zurich, 31-72 8. Greenwood, N.N., Earnshaw, A. (1993) Chemie prvků, Svazek II, Informatorium, 1443 9. Malinge, J. M., Pérez, C., Leng, M. (1992) Biochemistry, 31, 12397 10. Just, G., Holler, E. (1989) Cancer. Res., 47, 388-395 11. Rosypal, S. (1999) Úvod do molekulární biologie, I. díl, Brno 12. Pullman, A., Pullman, B. (1981) Q. Rev. Biophys., 14, 289-294 13. Malinge, J. M., Pérez, C., Leng, M. (1994) Nucleic Acids Res., 22, 3834-3839 14. Farell, N., Qu, Y., Feng, L., Van Houten, B. (1990) Biochemistry, 29, 9522-9531 15. Prenzler, P. D., McFayden, W. D. (1997) J. Inorg. Biochem., 68, 279-282 16. Žaludová, R., Žákovská, A., Kašpárková, J., Balcarová, Z., Kleinwachter, V., Vrána, O., Farrell, N., Brabec, V. (1997) Eur. J. Biochem., 246, 508-517 17. Kašpárková, J., Nováková, O., Vrána, O., Farrell, N., Brabec, V. (1999) Biochemistry, 38, 10997-11005 18. Fichtinger-Schepman, A. M. J., van der Veer, J. L., den Hartly, J. H. J., Lohman, P. H. M., Reedijk, J. (1985) Biochemistry, 24, 707-713 19. Vrána, O., Boudný, V., Brabec, V. (1996) Nucleic Acids Res. 24, 3918-3925 20. Bellon, S. F., Coleman, J. H., Lippard, S. J. (1991) Biochemistry 30, 8026-8035 21. Ushay, H. M., Santella, R. M., Caradonna, J., P., Grunberg, D., Lippard, S. J. (1982) Nucleic Acids Res. 10, 3573-3588 22. Scanlon, K. J., Kashani-Sabet, M., Tone, T., Funato, T. (1991) Pharmac. Ther., 52, 385-410

100

23. Missura, M., Buterin, T., Hindger, R., Hübscher, U., Kašpárková, J., Brabec, V., Naegeli, H. (2001) EMBO J., 20, 3554-3564 24. Turci, J. J., Henkels, M., Hermanson, I. L., Patrick, S. M. (1999) J. Inorg Biochem., 77, 83-87 25. Yamada, M., O´Regan, E., Brown, R., Karran, P. (1997) Nucleic Acids Res., 25, 491-495 26. Kašpárková, J., Brabec, V. (1995) Biochemistry, 34, 12379-12387 27. Zamble, D. B., Lippard, S. J. (1999) Cisplatin-Chemistry and biochemistry of a leading anticancer drug, VHCA, Wiley-VCH, Zürich, Weinheim, 73-89 28. Tinoco, I. J., Sauer, K., Wang, J. C. (1995) Physical Chemistry, Prentice-Hall, New Jersey 29. Barnard, C. F. J., Raynaud, F. I., Kelland, L. R. (1999) Topics in biological inorganic chemistry, Springer, 45-47 30. Reedijk, J. (1996) Chem. Commun., 801-806 31. Brabec, V., Kašpárková, J. (2005) Research Signpost, 37, 188-218 32. Natile, G., Coluccia, M. (1999) Topics in biological inorganic chemistry, Springer, 73 33. Harrap, K. R. (1985) Cancer Treat. Rev., 12, 21-33 34. Yarbo, J. W. (1992) Seminars of Oncology, 19, 1-164 35. Blommaert, F. A., van Dijk-Knijnenburg, H. C. M., Dijt, F. J., Denengelse, L., Baan, R. A., Berends, F., Fichtinger-Schepman, A. M. J. (1995) Biochemistry, 34, 8474-8484 36. Tashiro, T., Kawada, Y., Sakurai, Y., Kidani, Y. (1989) Biomedical pharmacotherapy, 43, 251-275 37. Woynarowski, J. M., Faivre, S., Herzig, M. C. S., Arnett, B., Chapman, W. G., Travino, A. V., Raymond, E., Chaney, S. G., Vaisman, A., Varchenko, M., Juniewicz, P. E. (2000) Molecular pharmacology, 58, 920-935 38. Woynarowski, J. M., Chapman, W. G., Naper, C., Herzig, M. C. S., Juniewicz, P. E. (1998) Molecular pharmacology, 54, 770-802 39. Hartmann, J. T., Lipp, H. P. (2003) Expert opinion on pharmacotherapy, 889-913 40. Kawanishi, K., Miyagi, Y., Yamamoto, J., Nakamura, K., Kodama, J., Hongo, A., Yoshinouchi, M., Kudo, T. (2001) Cancer chemotherapy pharmacology, 47, 303-311 41. Leng, M., Schwarz, A., Giraud-Panis, M. J., Kelland, L. R., Farrell, N. P. (2000) Platinum based drug in cancer therapy, Humana Press Inc., Totowa/NJ, 63-65 42. Fuertes, M. A., Castilla, J., Alonso, C., Perez, J. M. (2002) Anticancer agends 2, Curr. Med. Chem., 539-547 43. Perez, J. M., Fuertes, M. A., Alonso, C., Navarro-Ranninger, C. (2000) Crit. Rev. Oncol. Hematol., 35, 109-120 101

44. Kašpárková, J., Marini, V., Najajreh, Y., Gibson, D., Brabec, V. (2003) DNA binding mode of the cis and trans geometries of nex antitumor nonclassical platinum complexes containing piperidine, piperazine, or 4-picoline ligand in cell-free media. Relation to their activity in cancer cell lines, Biochemistry, 42, 6321-6332 45. Kašpárková, J., Nováková, O., Najajreh, Y, Gibson, D., Perez, J. M., Brabec, V. (2003) Effects of a piperidine ligand on DNA modification by antitumor cisplatin analogues, 16, 1424-1432 46. Farrell, N. P., Sigel, A., Sing, H., Dekker, M. (2004) Metal ions in biological systems, Basel, 42, 251-254 47. Farrell, N. P., Kelland, L. R. (2000) Platinum based drug in cancer therapy, Humana Press. Inc. Totowa/NJ, 321-322 48. Levine, A. J. (1997) Cell, 88, 323-340 49. Agarwal, M. L., Taior, W. R., Chernov, M. V., Chernova, O. B., Stark, G. R. (1998) Journal biol. chem., 273, 1-15 50. Halliday, D., Resnick, R., Walker, J. (2000) Fyzika, Část 2 – Mechanika, Termodynamika, Prometheus Brno 51. Saenger, W. (1983) Principles of Nucleic Acid Structur, Springer-Verlag, New York, 117 52. Kalous, V., Pavlíček, Z. (1980) Biofyzikální chemie, SNTL Praha 53. Mrevlishvili, G. M., Razmadze, G. Z., Mdzinarashvili, T. D., Metreveli, N. O., Kakabadze, G. R. (1994) Thermochimica Acta, 274, 37-43 54. Mrevlishvili, G. M., Metrveli, G. Z., Razmadze, G. Z., Mdzinarashvili, T. D., Kakabadze, G. R., Khvedelidze, M. M. (1998) Thermochimica Acta, 308, 41-48 55. Plotnikov, V., Brandts, J. M., Lin, L. L., Brandts, J. F. (1997) Anal. Biochem., 250, 237-244 56. Cadburz, J. E., Chowdhry, B. Z. (1998) Biocalorimetry aplications of calorimetry in the biological sciences, John Wiley & Sons 57. Prosser, V. a kol. (1989) Experimentální metody biofyziky, Academia Praha 58. Moore, W. J. (1972) Physical Chemistry, Prentice-Hall, Englewood Cliffs 59. Smith, E., Den, Geoffrey (2008) Modern Raman Spectroscopy, A practical approach, Wiley 60. Edited by Schreder, B. (1995) Infrared and Raman Spectroscopy Methods and Applications, Weinheim 61. Mašek, V. (2007) Disertační práce, BFÚ Brno

102

62. Michalska, D., Wysokinski, R. (2005) The prediction of Raman spectra of platinum (II) anticancer drugs by density functional theory, Chemical physics letters, 403, 211-217 63. Fleichsmann, M., Hendra, P.J., McQuillan, A.J. (1973) Chem.Phys. Lett., 26, 163 64. Kiefer, W., Schrader, B. (ed.) (1995) Infrared and Raman Spectroscopy Methods and Applications, 489 – 498, Weinheim, New York 65. Otto, A. (2005) J. Raman Spectroscopy, 36, 497 – 509 66. Li, X., Wang, Y., Jia, H., Song, W., Zhao, B. (2005) J. Raman Spectroscopy, 36, 635 – 639 67. Vo-Dinh, T., Yan, F., Wabuyele, M.B. (2005) J. Raman Spectrcoscopy, 36, 640 – 647 68. Drachev, V.P.,Thoreson, M.D.,Nashine, V., Khaliullin, N., Ben-Amotz, D., Davisson, V.J., Shalaev, V.M. (2005) J. Raman Spectroscopy, 36, 648-656 69. Brabec, V., Niki, K. (1985) Biophys. Chem., 23, 63-64 70. Nabiev, I.R., Sokolov, K.V., Vološin, O.N. (1990) J. Raman Spectroscopy, 21, 333 71. Lee, P.C., Meisel, D. (1982) J. Phys. Chem., 86, 3391-3395 72. Lord, R.C., Thomas,G. J. Jr. (1967) Raman studies of nucleic acids. II. Aqueous purine and pyrimidine mixtures, Biochim. Biophys. Acta, 142, 1-11 73. Thomas, G. J. Jr. (1970) Raman spectral studies of nucleic acids. 3. Laser-excited spectra of ribosomal RNA. Biochim. Biophys. Acta, 213, 417-23 74. Erfurth, S.C.,

Kiser, E. J., Peticolas, W. L. (1972) Determination of the backbone

structure of nucleic acids and nucleic acid oligomers by laser Raman scattering, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 938-41 75. Carmona, P., et al. (1999) J. Raman Spectrosc., 30 76. Toyama, A., et al. (2001) J. Mol. Struct., 598 77. Kraft, C., et al. (1998) Raman spectroscopic analysis of Tet repressor-operator DNA interaciton in deuterium oxide, Cell Mol. Biol. (Noisy-le-grand), 44, 63-71 78. Kocisova, E., Chinsky, L., Miskovsky, P. (1998) Sequence specific interaction of the antiretrovirally active drug hypericin wiwth 5´ATGGCAGGATAT3´oligonucleotide: a resonance Raman spectroscopy study, J. Biomol. Struct. Dyn., 15, 1147-54 79. Thomas, G. J. Jr., ed. Clark, R.J.H, Hester, R.E. (1986) Spectroscopy of biological systems, New York, Wiley, 233 80. Peticolas, W.L., et al. (1987) Biological applications of Raman Spectroscopy, in Nucleic Acids Res., J. Wiley & Sons, Inc., 81-133 81. Pappas, D., Benjamin, Smith, W., Winefordner, J.D. (2000) Raman spectroscopy in bioanalysis, Elsevier, Talanta, 52, 131-144 103

82. Duguid, J.G., et al. (1996) DNA melting investigated by differential scanning calorimetry and Raman spectroscopy, Biophys. J, 71, 3350-60 83. Muntean, C.M., et al. (2005) DNA structure at low pH values, in the presence of Mn2+ ions: a Raman study, J. Raman Spectroscopy, 36, 1047-1051 84. Muntean, C.M., Segers-Nolten, G. M. (2003) Raman microspectroscopic study of effects of Na(I) and Mg(II) ions on low pH induced DNA structural changes, Biopolymers, 72, 225-229 85. Thomas G. J. Jr., et al., ed. Theophanides, T., Anastassapoulou, N. (1993) Spectroscopy of biological molecules, Dordrecht, Kluver, 39 86. Duguid, J., et al. (1993) Raman spectroscopy of DNA-metal complexes. I. Interactions and conformational effects of the divalent cations: Mg, Ca, Sr, Ba, Mn, Co, Ni, Cu, Pd, and Cd. Biophys. J, 65, 1916-28 87. Rajani, C., Kincaid, J. R., Petering, D. H. (1999) The presence of two modes of binding to calf thymus DNA by metal-free bleomycin: a low frequency Raman study, Biopolymers, 52, 129-46 88. Deng, H., et al. (1990) Dependence of the Raman signature of genomic B-DNA on nucleotide base sequence, Biopolymers, 50, 656-666 89. Serban, D., Benevides, J. M., Thomas, G. J. Jr. (2002) DNA secondary structure and Raman markers of supercoiling in Escherichia coli plasmid pUC19, Biochemistry, 41, 847-53 90. Vrána, O., Mašek, V., Dražan, V., Brabec, V. (2007) Raman spectroscopy of DNA modified by intrastrand cross-links of antitumor cisplatin, Journal of structural biology, 159, 1-8 91. Benevides, J. M., Kawakami, J., Thomas, G. J. Jr. (2008) Mechanism of drug-DNA recognition distinguished by Raman spectroscopy, Journal of Raman spectroscopy, Wiley 92. Prescott, B., Steinmetz, J., Thomas, G. J. Jr. (1984), Characterization of DNA structures by laser Raman spectroscopy, Biopolymers, 23, 235-56 93. Thomas, G. J., Jr. (1999), Raman spectroscopy of protein and nucleic acid assemblies, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 28, 1-27 94. Thomas, G. J. Jr., Tsuboi, M. (1993) Raman Spectroscopy of nucleic acids and their complexes, Adv. Biophys. Chem., 3, 1-70 95. Benevides, J., Overman, S.A.,Thomas, G. J. Jr. (2005) Raman polarized and ultraviolet RR spectroscopy of nucleic acids and their complexes, J. Raman. Spectrosc., 36, 279–299

104

96. Thomas, G. J. Jr., Wang, A.H., ed. Eckstein, F., Lilley, D. M. J. (1988) Nucleic Acids and Molecular Biology, Vol.2., Berlin: Springer 97. Schmitt, M., Popp, J. (2005) Raman spekctroscopy at the beginning of the twenty-first century, Raman Spectrosc., 37, 20-28 98. Duguid, J., et al. (1995) Raman spectroscopy of DNA-metal complexes. II. The Thermal Denaturation of DNA in the Presence of Sr2+, Ba2+, Mg2+, Ca2+, Mn2+, Co2+, Ni2+ and Cd2+, Biophys. J., 69, 2623-2641 99. Kohoutková, V. (2008) Diplomová práce, Brno 100. Vrána, O. (1985) Disertační práce, BFÚ Brno 101. Seong-Ho, Ch., Hyun Gyu, P. (2005) Surface-enhanced Raman scattering (SERS) spectra of sodium benzoate and 4-picoline in Ag colloids prepared by γ - irradiation, Applied Surface Science, 243, 76-81 102. Mostafa, S. I. (2007) Mixed ligand complexes with 2-piperidine-carboxylic acid as primary ligand and ethylene diamine, 2,2´-bipyridyl, 1,10-phenanthroline and 2(2´-pyridyl) quinoxaline as secondary ligands: preparation, characterization and biological activity, Transition Metal Chemistry, 32, 769-775 103. Lecomte, S., Baron, M. H. (1997) Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Investiation of Fluoroquinolones-DNA-DNA Gyrase-Mg2+ Interactions. II. Interaction of Pefloxacin with Mg2+ and DNA, John Wiley & Sons

105