MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta
VÝZNAM PŘEDPORODNÍHO SCREENINGU PŘÍTOMNOSTI STREPTOCOCCUS AGALACTIAE V POCHVĚ MATKY
Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant
Vedoucí bakalářské práce:
Autor:
MUDr. Jana Juránková, Ph.D.
Ondřej Dohnal
Brno, duben 2009
1
Jméno a příjmení autora: Ondřej Dohnal
Název bakalářské práce: Význam předporodního screeningu přítomnosti Streptococcus agalactiae v pochvě matky
Pracoviště: Oddělení klinické mikrobiologie Fakultní nemocnice Brno
Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Jana Juránková, Ph.D.
Rok obhajoby bakalářské práce: 2009
Souhrn: Cílem této práce je představit bakterii Streptococcus agalactiae především ve vztahu k potenciální nebezpečnosti pro novorozence a z toho vyplývající
důležitosti předporodního screeningu, využívající jak klasickou
kultivační metodu, tak nejběžnější nekultivační metody používané především pro zjištění stavu kolonizace v době porodu.
Klíčová slova: Streptococcus agalactiae, screening, kultivační metody, nekultivační metody
Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem. 2
Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracoval samostatně pod vedením MUDr. Jany Juránkové, Ph.D. a uvedl v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje.
V Brně dne: …………….
….………….………..
3
Rád bych poděkoval MUDr. Janě Juránkové, Ph.D. za ochotu a cenné rady při psaní této práce.
4
Použité symboly a zkratky:
CDC
Centers for Disease Control and Prevention
DNA
deoxyribonukleová kyselina
EIA
Enzyme ImmunoAssay (enzymová imunoanalýza)
FISH
Fluorescenční in situ hybridizace
FN
fakultní nemocnice
GBS
group B streptococcus
GPK
gynekologicko - porodnická klinika
MOPS
3-(N-morfolin) propan sulfonová kyselina
OIA
Optical ImmunoAssay (optická imunoanalýza)
PCR
Polymerase Chain Reaction (polymerázová řetězová reakce)
RNA
ribonukleová kyselina
5
1 Úvod. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 2 Streptococcus agalactiae. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9 2.1 Kolonizace. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 2.2 Virulence. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 2.3 Onemocnění. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 2.3.1 Novorozenecké onemocnění. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 2.3.1.1 Časná a pozdní forma. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 2.3.1.2 Velmi pozdní forma. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2.3.1.3 Rizikové faktory. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 2.3.2 Epidemiologie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 3 Profylaxe. . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 3.1 Alergie na penicilinová antibiotika. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 3.2 Očkování. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 4 Screening. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 4.1 Odběr vzorku. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 4.2 Screeningové metody. . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 4.2.1 Kultivace. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 4.2.1.1 Krevní agar. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 4.2.1.2 Todd Hewittuv bujón. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 4.2.1.3 LIM bujón. . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 4.2.1.4 Granada médium. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 4.2.2 Nekultivační metody. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 4.2.2.1 Enzymová imunoanalýza. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 4.2.2.2 Fluorescenční in situ hybridizace. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23 4.2.2.3 Polymerázová řetězová reakce. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 4.2.2.3.1 Real-time PCR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 4.2.2.4 Optická imunoanalýza. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 5 Experimentální část. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 5.1 Materiál a metodika. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 6
5.1.1 Kultivace. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29 5.1.2 CAMP-test. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 5.1.3 Latex-aglutinační test. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 5.2 Výsledky. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33 6 Diskuse a závěr. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34 7 Použitá literatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
7
1 Úvod
Streptococcus agalactiae byl dříve považován zejména jako původce bovinní mastitidy. Nicméně, od roku 1960 byl zjištěn jako vedoucí
původce
novorozeneckých infekcí v průmyslových zemích a také jako důležitý původce nemocí mezi těhotnými ženami a dospělými se sníženou obranyschopností. Lidské a bovinní kmeny se však od sebe navzájem liší. U novorozenců způsobuje těžké invazivní nemoci projevující se většinou do 3 měsíců života. Novorozenci jsou nejčastěji postiženi sepsí, pneumonií a meningitidou. Prenatální screening nosičství je zatím jedinou možností v prevenci novorozeneckých infekcí. Pozitivita screeningu vede k podání antibiotik v době porodu a tak ke snížení možnosti přenosu streptokoka na dítě potažmo propuknutí novorozeneckého onemocnění.
8
2 Streptococcus agalactiae
Jedná se o grampozitivní, nepohyblivou, fakultativně anaerobní (schopnost tvořit ATP v závislosti na přítomnosti či nepřítomnosti kyslíku v okolí) baktérii, jenž netvoří spory a je kataláza negativní (enzym katalyzující rozklad molekuly peroxidu na vodu a kyslík). Řadí se mezi β-hemolytické streptokoky a je jediným zástupcem streptokoků skupiny B (v anglicky psané lékařské literatuře označovány jako GBS) dle Lancefieldové (skupinově specifický antigen B). Na krevním agaru roste v lesklých, šedo-bílých, 3 až 4 mm velkých koloniích s úzkou zónou beta-hemolýzy v okolí. V tekutých médiích tvoří řetízky. Optimální teplota pro růst tohoto mikroorganismus je 37°C. Mnohé kmeny taktéž rostou v přítomnosti žluče a všechny hydrolyzují hipurát sodný. Neobsahuje pyrrolidonylpeptidasu a tudíž není pozitivní na PYR test. Je schopen fermentace různých uhlíkatých zdrojů za vzniku řady vedlejších produktů, jako je laktát, aceton, etanol, karboxyl nebo 3-hydroxybuten-2-on. Jako auxotrof má mechanismy pro import důležitých nutrientů z exogenních zdrojů, nezbytných pro svůj růst (8 ABC přenašečů a permeas specifických pro určité aminokyseliny). Sám je schopen syntézy alaninu, serinu, glycinu, glutaminu, aspartátu, asparaginu a threoninu. Byly kompletně sekvenovány geny 3 kmenů (NEM316, 2603V/R a A9009) a dvou plazmidů ( plasmid pGB3631 a plasmid pGB354). Nejvýznamnější z kompletně sekvenovaných kmenů je kmen NEM316, při jehož analýze se určila místa zodpovědná za extracelulární produkty (kapsulární polysacharidy, povrchové proteiny a sekreční proteiny), jenž se zapojují do virulence a přispívající tak k patogenezi. Kmen NEM316 obsahuje 17 genů společně s transkripčním genem cps Y pro nesulfátové kapsulární polysacharidy, 30 genů pro povrchové proteiny obsažené v buněčné stěně a různé geny zodpovědné za 71 sekrečních proteinů.
9
2.1 Kolonizace
Primárně se Streptococcus agalactiae nachází u třetiny populace v rektu a ve střevech, kde je součástí běžné střevní flóry. Může taktéž vycestovat z konečníku do pochvy, kde se nachází asi u 10-40 % žen. Pro zdravé dospělé není tato bakterie nijak škodlivá a nezpůsobuje žádné problémy, proto obvykle nevyžaduje léčbu. Osídlení může být přechodné, chronické nebo střídavé. Rovněž jsou pozorovány rozdíly v kolonizaci populace se vztahem k věku, etnice a geografických podmínkám. Někdy se však Streptococcus agalactiae může stát patogenem vyvolávajícím urogenitální infekce, sepse, infekce kůže a měkkých tkání, meningitidy a abscesy.
2.2 Virulence
Streptococcus agalactiae produkuje několik virulentních faktorů, mimo jiné hemolysin, C5a peptidasu (pouze u lidských patogenních kmenů), hyaluronidasu (není u všech kmenů), různé povrchové proteiny (váží lidské IgA a slouží jako adhesiny) a kapsulární polysacharidy. Zatím bylo identifikováno deset rozdílných typů kapsulárních polysacharidů (Ia, Ib, Ic a II – VIII). Pro člověka jsou nejvýznamnější serotypy III a V. Serotyp III je nejčastěji spojovaný s neonatální
infekcí.
U
tohoto
typu
obsahuje
pouzdro
kyselinu
N-
acetylneuraminovou (sialovou), která brzdí aktivaci komplementu alternativní dráhou a fagocytózu. Serotyp V je spojován s rezistencí k erytromycinu. U infekcí dospělých není žádný serotyp dominantní.
2.3 Onemocnění
Způsobuje
invazivní
bakteriální
infekce
novorozenců,
těhotných
a
netěhotných dospělých působením bakterií přímo na buňky nebo nepřímo 10
pomocí toxinů, které uvolňují. U dospělých jsou především postiženy starší osoby (70 let a více), osoby s poruchou imunity , např. diabetici, u nichž se projevuje infekcemi močových cest, pneumonií, endokarditidou a výjimečně i meningitidou. Kolonizace těhotných žen je většinou asymptomatická, někdy se však může objevit zánět amnionu, endometritida nebo genitouretrální infekce s bakteriémií. V šestinedělí navíc může bakteriémie u žen po císařském řezu vést k endokarditidě, meningitidě nebo ke tvorbě abscesů. Streptokokové infekce však nejčastěji převládají u novorozenců, z důvodu nedostatečně vyvinutého imunitního systému.
2.3.1 Novorozenecké onemocnění
Onemocnění novorozenců způsobené Streptococcus agalactiae se významně podílí na perinatální mortalitě a morbiditě. Nejčastěji působí sepse, pneumonie a meningitidy (až u poloviny pacientů následky ve formě hluchoty, slepoty nebo mentální retardace). Méně často celulitis a osteomyelitis. Novorozenecká onemocnění způsobené streptokoky skupiny B má 3 formy: časnou, pozdní a velmi pozdní.
2.3.1.1 Časná a pozdní forma
Projevují se během prvního týdne života. Časnou formou však představují pouze infekce manifestující se do 48 hodin po porodu. Jsou výsledkem šíření Streptococcus agalactiae z pochvy do plodové vody, která je pak vdechnuta nebo polknuta dítětem a projevující se sepsí dítěte, popřípadě i matky. Děti rozené matkami, jenž jsou kolonizované
Streptococcus agalactiae, se také
mohou nakazit během průchodu porodním kanálem. V závislosti na místě počáteční kontaminace, mohou být novorozenci nemocní při porodu, nebo později. 11
Klinické symptomy zahrnují letargii, cyanosu, apnoe (= dočasné ztráty dechu) až zhoršující se dechové obtíže vedoucí k nutnosti umělé plicní ventilace. Dechové potíže jsou spjaty s hemolysinem, který poškozuje plicní epitel a tím vede k inhibici tvorby surfaktantu, nezbytného pro rozpětí plicních sklípků a následné dýchání. Způsobuje taktéž sepsi, která může být doprovázena meningitidou. Při sepsi může v důsledku septického šoku nastat smrt, pokud není rychle zavedena léčba. Objevují se rovně meningitida a pulmonální infekce.
2.3.1.2 Velmi pozdní forma
Projevuje se do 3 měsíců života. Nejčastějším projevem je hnisavá meningitida. Dále se vyskytují septická artritida, osteomyelitida, konjuktivitida, středoušní zánět, endokarditida a zánět pobřišnice. Novorozenec se může nakazit nejen od matky, ale také od zdravotnického personálu, který může nakazit dítě během ošetřovacích procedur, a šířit tak nákazu z dítěte na dítě. Také mastitida u matky je potenciálním zdrojem infekce.
2.3.1.3 Rizikové faktory
Zvýšeným rizikem vzniku novorozeneckého Streptococcus agalactiae onemocnění jsou ohroženy matky s anamnézou předchozího porodu dítěte s časnou nebo pozdní formou Streptococcus agalactiae onemocnění, matky s prokázaným vaginálním nosičstvím Streptococcus agalactiae nebo při pozitivní Streptococcus agalactiae kultivaci moče kdykoliv v průběhu těhotenství (předpokládá se masivní osídlení konečníku i pochvy). Dále se k rizikovým faktorům řadí porod před 37. týdnem těhotenství (imunitní systém novorozence není dostatečně vyvinut pro boj s bakteriemi), odtok plodové vody více než 18 hodin před porodem (předpokládá se, že Streptococcus agalactiae může způsobit předčasné prasknutí membrány následkem sekrece proteas a 12
aktivace lokálního zánětu), teplota matky během porodu ≥ 38°C (i epidurální anestesie během porodu může zvýšit teplotu), zamítnutí plánovaného císařského řezu, přes 6 vaginálních kontrol během porodu, mladý věk rodiček (pod 20 let), příslušnost k černé rase či hispánský původ, porodní hmotnost dítěte pod 2500 g, vysoká
kolonizace
povrchu
novorozence
streptokoky
během
porodu,
mnohočetné těhotenství (jestliže se u jednoho z dětí vyvine Streptococcus agalactiae infekce, je zvýšené riziko i pro další děti), při neznalosti výsledku kultivace, chybějící nebo nízký titr protilátek proti kapsulárním antigenům Streptococcus agalactiae u matky.
2.3.2 Epidemiologie
Celkem je odhadováno 20-30 % kolonizovaných žen, což má za následek přibližně 50 % perinatálně kolonizovaných dětí, u nichž se v 1-2 % rozvine infekce. Časná a pozdní forma se přisuzuje 80 % případů a velmi pozdní zbývajících 20 % případů. Smrtelné následky se odhadují na 4-10 % . Výskyt onemocnění v Evropě je v rozpětí 0,5-2 novorozenců z 1000 živě rozených.
13
3 Profylaxe
Přítomnost jednoho nebo více rizikových faktorů pro Streptococcus agalactiae
onemocnění
novorozence
při
porodu
je
důvodem
k
indikaci intrapartální chemoprofylaxe. Těhotná žena má být před porodem seznámena s výsledkem kultivačního vyšetření a poučena o přínosu a rizicích intrapartální antibiotické profylaxe. Intrapartálně podaná antibiotika sníží kolonizaci genitálního traktu rodičky a tím i kolonizaci novorozence, což prokazatelně vede ke snížení výskytu časného, pozdního a velmi pozdního onemocnění
novorozenců,
mortality
způsobené tímto
onemocněním a
postpartální morbidity matek. Léčba je ukončena s dobou porodu. Pouze u matek, u kterých se vyskytly jasné příznaky infekce se s léčbou pokračuje. Významným faktorem ovlivňujícím účinnost intrapartální chemoprofylaxe je interval mezi prvním podáním antibiotika a dobou porodu plodu (při intravenózním podání Ampicilinu rodičce s pozitivní vaginální kultivací do 1 hodiny před porodem, dojde k následné kolonizaci novorozence streptokoky ve 46 % případů, dojde-li k porodu v intervalu 1 až 2 hodiny po podání antibiotika sníží se kolonizace na 29 %, porod v interval 2-4 hodiny znamená riziko kolonizace 2,9 %, při porodu nad 4 hodiny po aplikaci antibiotika je kolonizace novorozence pouze v 1,2 % případů). Nejvyšší účinnosti se dosáhne podáním antibiotika minimálně 4 hodiny před porodem, jinak vzrůstá nebezpečí kolonizace novorozence. Přesto je vhodné antibiotika podat i ženám, které přicházejí do porodnice s velkým nálezem a předpokladem brzkého porodu, jelikož i kratší doba mezi podáním antibiotika a porodem novorozence chrání. Většina Streptococcus agalactiae je dostatečně senzitivní na penicilin, který je netoxický a levný. Nevýhodou je možný výskyt alergických reakcí. Podává se intravenózně 5 milionů jednotek Penicilin G v počáteční dávce, dále 2,5 milionů jednotek intravenózně každé 4 hodiny do konce porodu. Jestliže žena neporodí
14
do 8 hodin od podání první dávky, pokračuje se dále podáváním 2,5 milionů jednotek po 6 hodinách až do porodu. Alternativou jsou 2 g intravenózně Ampicilinu v počáteční dávce, pak 1 g intravenózně každé 4 hodiny do porodu plodu.
3.1 Alergie na penicilinová antibiotika
Ženám s nevěrohodnou alergickou anamnézou se v počáteční dávce podávají 2 g Cefazolinu (Cefalosporin I. generace) v infuzi a dále se pokračuje podáváním 1 g po 8 hodinách až do porodu. Při vysokém riziku anafylaxe se podává 600 (900) mg Clindamycinu v infuzi po 8 hodinách do porodu, nebo Azitromycin 500 mg v infuzi po 24 hodinách do porodu. Vankomycin je určen jako rezervní antibiotikum pouze pro ženy s vysokým rizikem anafylaxe k penicilinovým antibiotikům a s prokázanou rezistencí k předchozím antibiotikům. Podává se 1 g intravenózně ve 12ti hodinových intervalech až do porodu.
3.2 Očkování
Možnou profylaxí do budoucna je zavedení vhodné vakcinace spojené s eradikací Streptococcus agalactiae onemocnění. Již od 70. let se datují první pokusy o vývoj účinných očkovacích látek, které indukovaly tvorbu protilátek proti kapsulárním antigenům streptokoků (některé studie upozorňují na možnou souvislost mezi novorozeneckým onemocněním a absencí mateřských antikapsulárních protilátek). Imunizace žen během nebo před těhotenstvím by mohla snížit výskyt mateřských chorob a ochránit děti před perinatálním získáním infekce transplacentárním přestupem ochranných IgG protilátek. To by mohlo vést k eliminaci potřeb spojených s prenatálním screeningem a intrapartální antimikrobiální profylaxí ( a s tím souvisejícími náklady) a zejména 15
snížení potenciálně nepříznivých účinků intrapartální chemoprofylaxe. Vhodná očkovací látka proti Streptococcus agalactiae je však stále ve stádiu vývoje a klinických zkoušek.
16
4 Screening Screeningu na přítomnost Streptococcus agalactiae by se měly podrobit všechny těhotné ženy (výjimku tvoří pouze ženy s Streptococcus agalactiae pozitivní kultivací moči kdykoliv v průběhu těhotenství) mezi 35. až 37. týdnem těhotenství. Odběr kultivačních vzorků se provádí z postranních stěn dolní třetiny pochvy a rekta (v ČR není odběr z rekta indikován). Odebrané vzorky se umístí do transportního média a odešlou do laboratoře.
4.1 Odběr vzorku
Postup pro správný odběr vzorku ke kultivaci Streptococcus agalactiae v 35.37. týdnu těhotenství dle doporučení CDC: - stěr z dolní třetiny vagíny a rekta (skrz anální sfinkter) použitím jednoho nebo dvou tampónů. Vzorek je možné odebrat jak ambulantně zdravotnickým personálem, tak i samotnou pacientkou, po příslušné instruktáži. Při odběru poševního vzorku by nemělo být použito zrcátko. - odebraný vzorek se umístí do komerčně dostupného transportního média (Amies, Stuart bez uhlí). Jestliže jsou poševní a rektální vzorky odebrány zvlášť, mohou být oba tampóny umístěny do stejného média. Transportní médium udrží životaschopnost Streptococcus agalactiae až 4 dny při pokojové teplotě . Na štítku by mělo být zřetelně označeno, že se jedná o vzorek pro kultivaci Streptococcus agalactiae. Rovněž, pokud je objednaný test citlivosti u pacientek s alergií na penicilin, mělo by být na štítku uvedeno, že u vzorku mají být provedeny testy citlivosti na Clindamycin a Erytromycin.
4.2 Screeningové metody
Pro screening Streptococcus agalactiae se používají jednak metody, při kterých se stěr kultivuje na různých médiích, metody využívající v průkazu 17
různé antigenní struktury na povrchu této bakterie nebo techniky spjaté s expresí specifického genu, či jeho části.
4.2.1 Kultivace
Při kultivačních metodách se doporučuje nejprve použít obohacené selektivní bujóny pro maximalizaci záchytu Streptococcus agalactiae a zabránění přerůstání ostatních organismů, které se vyskytují v odebraném vzorku z pochvy a rekta. V opačném případě jsou výsledky kultivace falešně negativní až u 50 % žen.
Postup zpracování vzorku pro kultivaci na Streptococcus agalactiae dle CDC: - tampón se po vyjmutí z transportního média ponoří do vhodného selektivního média, jako je Todd Hewittuv bujón obohacený gentamicinem (8 µg/ml) a kyselinou nalidixovou (15 µg/ml), nebo colistinem (10 µg/ml) a kyselinou nalidixovou (15 µg/ml). Mezi komerčně dostupné pomnožovací média patří Trans-Vang bujón s 5 % defibrinované ovčí krve nebo LIM bujón. - bujón s tampónem se inkubuje 18-24 hodin při 35-37ºC v prostředí 5 % CO2. - kultura bakterií je naočkována na pevné půdy Standardní kultivační vyšetření umožňuje získat výsledek do 48 hodin. Toto vyšetření je preferováno před užitím tzv. rychlých diagnostických testů, u kterých hrozí riziko falešně negativních výsledků. Rychlé diagnostické testy se využívají pouze v časové tísni. Je třeba, aby v době porodu nebylo kultivační vyšetření starší více jak 5 týdnů.
4.2.1.1 Krevní agar
Běžné růstové médium pro izolaci, kultivaci a odlišení různých mikroorganismů. 18
Ingredience na litr deionizované vody: Pepton C ……………………… 15,0 g Pepton S ……………………..… 5,0 g NaCl ………………………….... 5,0 g Agar ……...………………….... 12,0 g defibrinovaná beraní krev ……..... 5 % konečné pH 7,3 ± 0,2 při 25°C
Interpretace výsledků: Kolonie Streptococcus agalactiae vykultivované na krevním agaru vykazují zónu β-hemolýzy.
4.2.1.2 Todd Hewittuv bujón
Medium používané ke kultivaci beta-hemolytických streptokoků, zvláště pro serologické studie. Je také doporučeno pro kultivaci pneumokoků a dalších náročných organismů. Médium je připraveno z hydrolyzátu hovězího srdce, peptonu a kvasničného extraktu, které dodávají nezbytné růstové nutrienty. Dextrosa je přidána jako energetický zdroj a zároveň stimuluje streptokokovou antigenní produkci. Fosforečnan a uhličitan slouží jako pufry, které chrání hemolysin před kyselými produkty vzniklých při kvašení dextrosy.
Ingredience na litr deionizované vody: hydrolyzát hovězího srdce ……….…… 3,1 g pepton C ...…………………………… 10,0 g kvasniční extrakt …………………….. 10,0 g NaCO3 ……………………………….... 2,5 g 19
dextrosa ………………………….……. 2,0 g NaCl ………………………….…….…. 2,0 g NaH2PO4 …………………………..…... 0,4 g konečné pH 7,8 ± 0,3 při 25°C
4.2.1.3 LIM bujón Médium doporučené k selektivnímu pomnožení streptokoků skupiny B (Streptococcus agalactiae). Médium je připravené ze základu pro Todd Hewittuv bujón, vytvořeného z hydrolyzátu hovězího srdce, peptonu a kvasničného extraktu, k poskytnutí nezbytných nutrientů pro růst streptokoků. Uhlík a energii dodává glukosa. Fosforečnan a uhličitan slouží jako pufry, které chrání hemolysin před kyselými produkty vzniklých při kvašení sacharidů. Colistin a kyselina nalidixová působí inhibičně na gram-negativní mikroorganismy.
Ingredience na litr deionizované vody: Todd Hewitt bujón……………………. 30,0 g kvasniční extrakt …………………..… 10,0 g kyselina nalidixová ……………….… 15,0 mg colistin sulfát ……………………….…. 10,0 g konečné pH 7,6 ± 0,2 při 25°C.
4.2.1.4 Granada médium
Selektivní a diagnostické médium schopné snadné a rychlé (18-24 hodin) detekce a identifikace Streptococcus agalactiae. Granada medium se skládá z peptonu, škrobu a koňského séra, jenž poskytují nezbytné
nutrienty
pro
růst
bakterií.
Dále
obsahuje
MOPS
a
hydrogenfosforečnan sodný sloužící jako pufry. Methotrexát v médiu zvyšuje 20
pigmentaci. Dextrosa a pyruvát sodný brání v tvorbě inhibičních směsí v médiu. Selekci způsobují metronidazol (inhibice anaerobů), colistin sulfát (gramnegativní) a krystalová violeť (gram-pozitivní). Agar je použit ke zpevnění.
Ingredience na litr deionizované vody: pepton .………………………………………………….. 25,0 g rozpustný škrob ………………………………………… 20,0 g 3-(N-morfolin) propan sulfonová kyselina (MOPS)……. 11,0 g Na2HPO4 …………………………………………………. 8,5 g dextrosa …………………………………………….……. 2,5 g pyruvát sodný ……………………………………………. 1,0 g Metronidazol ……………………………………………...1,0 g MgSO4 ………………………………………………… 20,0 mg Methotrexát ………………………………………….…. 6,0 mg colistin sulfát …………………………..…………..…… 5,0 mg krystalová violeť …………………………..…………… 0,2 mg koňské sérum ………………………………………..…. 50,0 ml agar ………………………………………………...……. 10,0 g konečné pH 7,45 ± 0,1 při 25 °C.
Postup: - vzorek se naočkuje na médium - inkubace je možná anaerobní nebo aerobní, obě při 35°C nejméně 18 hodin za aerobních nebo anaerobních podmínek. Obě metody inkubace jsou si rovnoceny. - zkontrolují se narostlé kolonie
Interpretace výsledku: Kolonie Streptococcus agalactiae narostlé na Granada médiu mají oranžovou až červenou pigmentaci, jenž je pro tuto bakterii specifická. 21
4.2.2 Nekultivační metody
Tyto testy se nejčastěji používají pro zjištění stavu kolonizace za porodu. I přes svou časovou nenáročnost nemohou nahradit kultivační metody, jenž jsou důležité pro zjištění citlivosti na antibiotika.
4.2.2.1 Enzymová imunoanalýza
Jedná se o imunochemickou reakci s enzymatickou detekcí (vznik viditelného zbarvení) umožňující stanovení koncentrace analytu ve vzorku (spektrofotometricky, nefelometricky, turbidimetricky, fluorometricky nebo luminometricky) . EIA metody lze rozdělit na heterogenní, kde je třeba separace volné a vázané frakce analytu a na homogenní, kde separace není nutná. Heterogenní EIA může být buď kompetitivní, kdy je enzymaticky označen antigen nebo protilátka, a nekompetitivní, při které je značená protilátka. Nejčastěji se využívá kompetitivní EIA se značenou protilátkou, neboli ELISA.
Princip: Specifická protilátka navázaná na pevnou fázi (stěny titračních jamek) reaguje s antigenem ve vzorku za vzniku imunokomplexu. Po odmytí nenavázaného antigenu se do jamek přidá protilátka konjugovaná s enzymem (konjugát), která se váže na imunokomplex přes antigen. Po odstranění nenavázaného konjugátu a přidání vhodného substrátu, který je štěpen enzymem, se reakce vyzualizuje.
Obrázek 1. princip ELISA 22
Postup při QUIDEL Group B Strep Testu - k vzorku se přidá extrakční činidlo - extrakt se přefiltruje přes membránu potaženou králičími protilátkami proti Streptococcus agalactiae - přidá se polyklonální enzymaticky značená protilátka proti streptokoku skupiny B - inkubace 1 minutu při pokojové teplotě - membrána se promyje mycím roztokem (k odstranění nenavázaného konjugátu) a přidá se substrát - počkáme 2 minuty - pozoruje se výsledek
Interpretace výsledku: Při pozitivní reakci se na membráně objeví modrý kruh
4.2.2.2 Fluorescenční in situ hybridizace
Princip: vazba fluorescenčně značené oligonukleotidové hybridizační sondy na komplementární úsek DNA (RNA)
ds DNA …………… double-stranded DNA ss DNA ……………..single-stranded DNA
Obrázek 2. princip FISH 23
Postup při identifikaci 16S rRNA - ze vzorku na tampónu se připraví nátěr na podložní sklíčko - nátěr se inkubuje 20 minut při 30°C s lysozymem (1mg/ml) rozpuštěným v 10 mM Tris (pH 8,0) - nátěr se vypere - na sklíčko se nanese 10 µl hybridizačního pufru obsahujícího 20% formamid a 5 ng od každé hybridizační sondy (značené fluorochromem Cy3) - současně se aplikují sondy EUB 338 (fluorescein isothiokyanát – váže se na DNA) a DAPI (4´,6´-diamidino-2-phenylindol - váže se na DNA a RNA) - vzorek se nechá hybridizovat 90 min při 46°C a poté se propere - sklíčko se prohlédne pod fluorescenčním mikroskopem dvěma nezávislými pozorovately
4.2.2.3 Polymerázová řetězová reakce
Princip: reakce založená na schopnosti dvojvláknové DNA denaturovat při vysoké teplotě a opět renaturovat po jejím snížení za zachování pravidel komplementarity bází. Pro reakci jsou nezbytné oligonukleotidové sondy (primery), které ohraničují oblast DNA určenou k amplifikaci. Dále je potřeba vzorek DNA (ds DNA), směs čtyř deoxynukleotidtrifosfátů (dNTPs), Mg2+ ionty, Taq polymerázu (enzym syntetizující nová vlákna DNA) a pufr.
Obrázek 3. princip PCR 24
Obecný průběh: 1. denaturace DNA zahřátím na 94°C 2. připojení primerů k vláknu DNA zapříčiněné ochlazením na teplotu 60 °C 3. tvorba úseků DNA vymezené primery při teplotě 72 °C - Tyto tři kroky se cyklicky opakují. Celý průběh PCR probíhá automaticky v termocyklerech.
Postup při identifikaci scp B genu (kódující C5a peptidasu): - extrakce bakteriální DNA : 1. ve zkumavce se vzorek smíchá s fenol-chloroformovou směsí 2. zkumavka se promíchá 3. zkumavka se centrifuguje 3 minuty při 1600 g za pokojové teploty 4. supernatant se odpipetuje do polypropylenové zkumavky 5. do zkumavky se přidá stejné množství fenol-chloroformové směsi a opakuje se krok 2., 3. a 4. 6. do zkumavky se přidá stejné množství chloroformu a opakuje se krok 2., 3. a 4. 7. extrahovaná DNA se vysráží v etanolu - do zkumavky se ke 22µl DNA ze vzorku přidá 50 µl PCR Master Mixu (TrisHCl, KCl, MgCl 2, deoxynukleotidy, primery, Taq polymerasa) - zároveň se vzorkem se zpracovává i pozitivní a negativní kontrola - DNA se 5 minut amplifikuje v termocykleru (45 cyklů - 30 s při 94 ºC, 30 s při 55 ºC a 30 s při 72º C) - po amplifikaci se provede elektroforéza v 2% agarosovém gelu -
po
elektroforéze
se
gel
obarví
a
pozoruje
se
výsledek
Interpretace výsledku: Při pozitivním výsledku jsou vzorek a pozitivní kontrola ve stejné vzdálenosti od místa nanesení 25
4.2.2.3.1 Real-time PCR
Modifikovaná PCR umožňuje měřit množství vznikající DNA pomocí flourescenčních
sond,
jejich
intenzita
fluorescence
je
přímo
úměrná
syntetizované DNA . Tím odpadá nutnost elektroforézy naamplifikované DNA Sonda může být buď nespecifická, kdy se váže na dvouvláknovou DNA, nebo specifická, kdy se oligonukleotidová sonda, obsahující dva fluorochromy (reporter a zhášeč, který v blízkosti reporteru brání jeho fluorescenci), váže na vlákno DNA. 4.2.2.4 Optická imunoanalýza - OIA STREP B® firmy BioStar®
Test využívající k prokázání Streptococcus agalactiae ve vaginálním stěru sacharidový antigen, jenž je pro něj specifický. Sada obsahuje extrakční zkumavky, reagencie 1A a 1B (extrakční činidla), reagencii 2 (neutralizační činidlo), reagencii 3 (konjugát), reagencii 4 (mycí roztok), reagencii 5 (substrát), testovacího zařízení, pozitivní kontroly, pipety a tampóny pro stěr vzorku.
Princip: vazbou antigenu na imobilizované protilátky se změní optická tloušťka molekulární vrstvičky na reakční ploše, jenž má za následek změnu odrazu světla a tím i odlišné zbarvení původně zlaté reakční plochy
Postup: - do extrakční zkumavky se kápnou 3 kapky reagencie A1 - tampón se vzorkem se umístí do zkumavky - tampónem se důkladně mačká o dno zkumavky a počká se 3 minuty - tampón se podrží v ose stěny a přikápnou se 3 kapky reagencie B1 – obsah zkumavky by měl zežloutnout - opět se tampónem mačká o dno zkumavky a počká se 3 minuty 26
- tampón se podrží v ose stěny a přikápnou se 3 kapky reagencie 2 – obsah zkumavky by měl zezelenat - tampón se vymačká o stěnu zkumavky (jestli není ve zkumavce dostatek tekutiny, tampón se vrátí do zkumavky a přikápne se 1-2 kapky reagencie 2) - počkají se 3 minuty - na zlatou OIA testovací plochu se pipetou ze setu kápnou 2 kapky ze zkumavky (je důležité vzorek rozprostřít bez doteku ke všem okrajům) - počká se 10 minut - testovací plocha se omyje prudkým proudem reagencií 4 (nesmí se však zatopit testovací zařízení) - před uzavřením zařízení se zkontroluje, zda je savý papír v poloze ″I″ - počká se 10 vteřin
Obrázek 4. testovací zařízení pro OIA STREP B® http://www.invernessmedicalpd.com/poc/flash/flash_oia_strepb.html
- zařízení se otevře a savý papír se přesune do polohy ″II″ - na testovací plochu se kápne 1 kapka substrátu (do středu plochy) a počká se 5 minut - povrch se omyje proudem mycího roztoku - zařízení se zavře (savý papír musí být stále v poloze ″II″) a počká se 10 vteřin - po otevření se interpretuje výsledek při běžném laboratorním osvětlení (sluneční světlo tvoří na testovací ploše třpyt a ztěžuje tak odečtení výsledku)
27
Interpretace výsledku: U pozitivního testu je viditelný kontrolní bod a v jeho okolí barevné pole (od světle purpurové do modré). Jestli je vidět pouze kontrolní bod, je výsledek negativní. Pokud není vidět ani kontrolní bod, je test neplatný a musí se opakovat.
Obrázek 5. výsledky při OIA STREP B® http://www.invernessmedicalpd.com/poc/flash/flash_oia_strepb.html
28
5 Experimentální část
5.1 Materiál a metodika
Za období roku 2008 bylo na GPK FN Brno celkem vyšetřeno 290 žen na přítomnost Streptococcus agalactiae. U všech žen byl odebrán poševní stěr ve 37. týdnu gravidity a zaslán na Oddělení klinické mikrobiologie FN Brno, kde se provedlo standardní kultivační vyšetření. U podezřelých kolonií byl proveden CAMP-test a pro ověření serologické skupiny streptokoka byl proveden latexaglutinační test. Dále byl kmen testován na citlivost k antibiotikům.
5.1.1 Kultivace
Vaginální stěr se očkuje na krevní agar, MC agar a selektivní půdu pro streptokoky skupiny B (chromIDTM Strepto B agar francouzské firmy bioMérieux). Po naočkování pevných půd se tampón ponoří do bujónu pro selektivní pomnožení koků. Vše se inkubuje 18-24 hodin v termostatu při teplotě 37°C a zvýšené tenzi CO2. Druhý den se kontrolují narostlé kolonie. Na MC agaru Streptococcus agalactie neroste. K usnadnění identifikace se přes materiál na krevním agaru naočkuje čára Staphylococcus aureus a v místě hustého inokula se položí amikacinový disk k odstínění doprovodné flóry a růstu pouze streptokoků v jeho okolí.
Obrázek 6. světle růžové až červené kolonie Streptococcus agalactie narostlé na chromIDTM Strepto B agaru 29
5.1.2 CAMP-test
CAMP-test je test na zjištění přítomnosti Streptococcus agalactiae ve vzorku. Streptococus agalactiae způsobuje na krevním agaru β-hemolýzu, která je
nápadně
zesílena
v přítomnosti
Staphylococcus
aureus.
Dochází
k hemolytické interakci mezi hemolýzou Staphylococcus aureus (beta-lysin narušuje membránu erytrocytů) a Streptococcus agalactiae (vazba hemolysinu na membránu erytrocytů), jejímž výsledkem je zesílená hemolýzu.
Postup: - ke stafylokokové čáře se z obou stran kolmo přiočkuje zkoumaný kmen - inkubace 24 hodin při 37°C
Interpretace výsledků: V případě pozitivity se objeví nápadné ostře ohraničené zesílení hemolýzy motýlkovitého tvaru.
Obrázek 8. pozitivní CAMP-test
30
5.1.3 Latex-aglutinační test - PASTOREXTM STREP firmy BIO-RAD PASTOREXTM STREP je souprava pro detekci streptokoků skupiny A, B, C, D, F a G s využitím latexových částic pokrytých skupinově-specifickými homologními protilátkami. Set obsahuje šest lahviček s latexovou suspenzí (vždy pro jednu skupinu), dvě lahvičky extrakčního enzymu, lahvičku s pozitivní kontrolou (polyvalentní antigen) a jednoúčelové tyčinky a aglutinační karty.
Princip: reakce protilátky vázané na latexových částicích s antigeny v extraktu za vzniku viditelných shluků
Postup: - vyžíhanou kličkou se setře 5 až 10 kolonií z čisté streptokokové kultury a homogenizují se v enzymovém roztoku. - inkubace - buď 15 až 45 minut při pokojové teplotě (18-30°C) - nebo 10 až 30 minut při 37°C - lahvičky s latexovými částicemi se důkladně protřepají - do kruhů na aglutinační kartě se kápne vždy jedna kapka (jednotlivé latexové suspenze vždy do samostatného kruhu) - k latexové suspenzi se pipetou přikápne jedna kapka extraktu - obsah každého kruhu homogenizujeme tyčinkou (pro každý kruh nová tyčinka) - kartou se maximálně jednu minutu horizontálně krouží. - pozoruje se výsledek.
Interpretace výsledků: Pozitivní reakce se projeví tvorbou červených shluků na zeleném pozadí. Patrná a rychlá aglutinace pouze s jednou ze šesti latexových suspenzí přesvědčivě stanovuje skupinu kmene. U negativního výsledku má suspenze stále hnědou 31
barvu. Pokud je reakce neinterpretovatelná, jsou pozorovány malé shluky na hnědém pozadí
nebo
aglutinace
s
několika
specifickými
latexovými
reagenciemi. Jestli se objeví reakce tohoto typu, měla by být znovu provedena izolace kmene.
Obrázek 9. pozitivní (+) a negativní (-) výsledek latex-aglutinačního testu
32
5.2 Výsledky
Ženy
vyšetřené
na
přítomnost
Streptococcus
agalactiae v pochvě za rok 2008
Procentuální zastoupení (%)
GPK FN Brno Celkem materiálů
290
100
Pozitivní
63
21,72
Negativní
227
78,28
screening žen na Streptococcus agalactiae za rok 2008 (%) 120
100
80
60
40
20
0 1 celkem
2 pozitivní
33
3 negativní
6 Diskuse a závěr
Za rok 2008 bylo na GPK FN Brno celkem odebráno 290 poševních vzorků ve 37. týdnu těhotenství pro předporodní screening Streptococcus agalactiae. Všechny vzorky byly podrobeny standardní kultivační metodě, kultivačně pozitivní pak latexové-aglutinaci a CAMP-testu. Screeningovými metodami byla kolonizace prokázána u 21,72 % (63) vyšetřených žen. V porovnání se studií provedenou v Italském Turíně mezi rokem 2005-2006, použitím kultivační metody (Columbia CNA 5% horse blood, Todd–Hewitt broth) a latexovéaglutinace, bylo z celkových 400 screenovaných žen pozitivní 18 % (45). Z porovnání sice vyplývá, že v loňském roce byl výskyt Streptococcus agalactiae v Brně vyšší než v Turíně v období 2005-2006, ale nesmíme zapomínat, že se v obou případech jedná pouze o část z celkového počtu obyvatel dané země. Novorozenecké infekce způsobené Streptococcus agalactiae představují celosvětově velký problém. Jelikož zatím není vyvinuta vhodná vakcína, je jedinou možností, jak předejít těmto onemocněním, provádět screening na jeho přítomnost v pochvě (rektu) u všech těhotných žen ve 35.-37. týdnu těhotenství a v případě pozitivního výsledku podat vhodná antibiotika ke snížení rizika přenosu bakterie z matky na dítě. Mezi metodami, užívanými ke screeningu jsou nejpoužívanější metody využívající různá kultivační média. Výhodou kultivace je, že zároveň dovoluje testování citlivosti na antibiotika, které jsou prozatím jedinou možnou profylaxí. Ovšem nevýhodou této metody je její časová náročnost, která se obvykle pohybuje okolo dvou dnů. To vedlo k zavedení nových, rychlých metod, které umožňují potvrdit přítomnost Streptococcus agalactiae během několika hodin. Tyto metody při identifikaci vesměs používají techniky molekulární biologie nebo imunochemie.
34
Z nekultivačních metod je nejpoužívanější latexová aglutinace, dále PCR a její modifikace Real-time PCR, FISH, OIA a EIA. Nejrychlejší z výše uvedených metod je EIA s dobou trvání testu kolem 10 minut. Technika však není dostatečně citlivá pro nízký stupeň kolonizace, což vede k falešně negativním výsledkům. Rovněž citlivost OIA závisí na síle kolonizace a je schopna poskytnout výsledek do 30 minut od příjmu vzorku. PCR je metoda s vysokou citlivostí a časem 40-100 minut k provedení. Je však finančně náročnější. FISH je velmi citlivá metoda s dobou trvání kolem 3,5 hodin. Latexová aglutinace je taktéž velmi citlivá metoda s možností získání výsledku do 40 minut. Při screeningu Streptococcus agalactiae v praxi by se měly vždy použít metody s dostatečnou citlivostí pro záchyt této bakterie. Proto je vhodné používat kultivační metodu a některý z dostupných nekultivačních testů, v závislosti na finančních možnostech laboratoře. Z 290 poševních vzorků, odebraných na GPK FN Brno v roce 2008, byl užitím standardní kultivační metody, latexovou-aglutinací a CAMP-testem Streptococcus agalactiae prokázán u 21,72 % (63) žen.
35
7 Použitá literatura 1. Breckwoldt M. aj. [z něm. orig. přel. Vladimír Šabata]: Gynekologie a porodnictví, Martin: Osveta, 1997, s. 161-162. 2. Mašata Jaromír: Infekce v gynekologii a porodnictví, Praha: MAXDORFJESSENIUS, 2004, 371 s. 3. Votava Miroslav a kol.: Lékařská mikrobiologie speciální, Brno: Neptun, 2003, 495 s. 4. Greenwood David aj. : Medical microbiology : a guide to microbial infections : pathogenesis, immunity, laboratory diagnosis and control, Edinburgh: Elsevier, 2007, 738 s. 5.
Votava
Miroslav
a
kolektiv:
Lékařská
mikrobiologie. II. Přehled
vyšetřovacích metod v lékařské mikrobiologii, Brno: Masarikova univerzita, 2003, 309 s. 6. Bartůňková Jiřina, Paulík Milan a kolektiv: Vyšetřovací metody v imunologii, Praha: Grada Publishing, a.s., 2005, 176 s. 7. Pritchard J. Dorian, Korf Bruce R.: Základy lékařské genetiky, Praha: Galén, 2007, 182 s. 8. Měchurová A., Unzeitig V., Vlk R.: Doporučený postup při diagnostice a léčbě kolonizace streptokoky skupiny B v těhotenství a za porodu, publikován v České gynekologii, 69, 2004, č. 5, 421-422, v Moderní gynekologii a porodnictví,
16,
2007,
č.
1,
supplementum
A,
dostupné
na:
http://www.perinatologie.cz/dokumenty/doc/doporucenepostupy/Doporucene%20postupy%20v%20perinatologii%20-%2003.pdf 9. Holec Vladislav: Vyšetření GBS aneb screening Streptococcus agalactiae v těhotenství,
Ostrava,
červenec
http://www.zuova.cz/informace/mgt002.php
36
2005,
dostupné
na:
10. CDC: Prevention of Perinatal Group B Streptococcal Disease. Revised Guidelines from CDC, August 16, 2002 / Vol. 51 / No. RR-11, dostupné na: http://www.cdc.gov/mmwr/PDF/rr/rr5111.pdf 11. Sharat K Narayanan aj.: Streptococcus Group B Infections, březen 2006, dostupné na: http://emedicine.medscape.com/article/229091-overview 12. Černá Marcela: Infekce streptokokem skupiny B, publikované v časopise Máma a já, srpen 2007, dostupné na: http://www.rodina.cz/clanek5833.htm 13. Ha Bean Kim, Kit Pogliano : Streptococcus agalactiae, dostupné na: http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Streptococcus_agalactiae 14. Křepelka P.: Perinatologický význam streptokoků skupiny B, publikované v časopisu
Gynekolog,
duben
2000,
str.
147,
dostupné
na:
http://www.gyne.cz/clanky/2000/400cl1.htm 15. Mičuda S., Fuksa L., Brčáková E., Cermanová J., Geršl V.: Molekulárně biologické metodiky ve farmakologii - Real-time PCR, dostupné na: http://www.lfhk.cuni.cz/farmakol/interakce/micuda/real-PCR.htm 16. Morrow D. L., Kline J. B., Douglas S. D., and Polin R. A.: Rapid detection of group B streptococcal antigen by monoclonal antibody sandwich enzyme assay, publikováno v Journal of Clinical Microbiology, duben 1984; díl 19,číslo 4,
strana
457–459,
dostupné
na:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?artid=271094&blobtype=pdf 17. Dinsmoor Mara J. a další: Comparison of Culture and Rapid Enzyme Immunoassay for the Detection of Group B Streptococcus in High-Risk Pregnancies, publikované v Infectious Diseases in Obstetrics and Gynecology, 1994,
díl
2
(3),
strana
115–119,
dostupné
na:http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?artid=2364376&blobtype= pdf 18. Granato P. A. a Petosa M. T.: Evaluation of a rapid screening test for detecting group B streptococci in pregnant women, publikované v Journal of Clinical Microbiology, červenec 1991; díl 29, číslo 7, strana 1536–1538, 37
dostupné
na:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?artid=270151&blobtype=pdf 19. Artz L. A., Kempf V. A. J. and Autenrieth I. B.: Rapid Screening for Streptococcus agalactiae in Vaginal Specimens of Pregnant Women by Fluorescent In Situ Hybridization, publikováno v Journal of Clinical Microbiology, květen 2003;
díl 41(5), strana 2170–2173, dostupné na:
http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?artid=154702&blobtype=pdf 20. Bergero M. G. a další: Rapid Detection of Group B Streptococci in Pregnant Women at Delivery, publikované v The New England Journal of Medicine, červenec
2000,
díl
343,
číslo
3,
strana
175-179,
dostupné
na:
http://content.nejm.org/cgi/reprint/343/3/175.pdf 21. Honest Honest, Sushma Sharma and Khalid S. Khan: Rapid Tests for Group B Streptococcus Colonization in Laboring Women: A Systematic Review, publikováno v PEDIATRICS, duben 2006, díl 117, číslo 4, strana 1055-1066, dostupné na: http://pediatrics.aappublications.org/cgi/reprint/117/4/1055 22. Song J. Y. a další: Evaluation of the Strep B OIA test compared to standard culture methods for detection of group B streptococci, publikováno v Infectious Diseases in Obstetrics and Gynecology, 1999, díl 7 (4), strana 202-205, dostupné na:http://www.pubmedcentral.nih.gov/picrender.fcgi?artid=1784740&blobtype= pdf 23. Thinkhamrop J. a další: Infections in International Pregnancy Study: Performance of the Optical Immunoassay Test for Detection of Group B Streptococcus, publikováno v JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, listopad
2003,díl
41,
číslo
11.
strana
5288–5290,
dostupné
na:
http://jcm.asm.org/cgi/reprint/41/11/5288.pdf 24. Health Protection Agency a DEVANI: OVERVIEW OF GROUP B STREPTOCOCCAL, SCREENING AND LABORATORY, DIAGNOSTICS
38
IN
EUROPE,
aktualizováno
24.
září
2008,
dostupné
na:
http://www.hpa.org.uk/web/HPAwebFile/HPAweb_C/1222236723117 25. Haberland C. A. a další: Perinatal Screening for Group B Streptococci: CostBenefit Analysis of Rapid Polymerase Chain Reaction, publikováno v PEDIATRICS, září 2002, díl 110, číslo 3, strana 471-480, dostupné na: http://pediatrics.aappublications.org/cgi/reprint/110/3/471?maxtoshow=&HITS= 10&hits=10&RESULTFORMAT=&fulltext=Perinatal+screening+for+group+B +streptococci%3A+costbenefit+analysis+of+rapid+polymerase+chain+reacti&searchid=1&FIRSTINDE X=0&volume=110&issue=3&resourcetype=HWCIT 26. Bergseng H. a další: Real-time PCR targeting the sip gene for detection of group B streptococcus colonization in pregnant women at delivery, publikováno v Journal of Medical Microbiology, únor 2007, díl 56, strana 223–228, dostupné na: http://jmm.sgmjournals.org/cgi/reprint/56/2/223 27. Natarajan G. a další: Real-Time Polymerase Chain Reaction for the Rapid Detection of Group B Streptococcal Colonization in Neonates, publikováno v PEDIATRICS, červenec 2006, díl 118, číslo 1, strana 14-22, dostupné na: http://pediatrics.aappublications.org/cgi/reprint/118/1/14 28. Elbaradie S.M., Mahmoud M. a Farid M.:Maternal and neonatal screening for Group B streptococci by SCP B gene based PCR: A preliminary study, publikováno v Indian Journal of Medical Microbiology, 2009, díl 27, číslo 1,strana
17-22,
dostupné
na:
http://www.ijmm.org/article.asp?issn=0255-
0857;year=2009;volume=27;issue=1;spage=17;epage=21;aulast=Elbaradie 29.
OIA
STREP
B®
Product
Demonstration,
dostupné
na:
http://www.invernessmedicalpd.com/poc/flash/flash_oia_strepb.html 30.
Hardy
Diagnostics:
LIM
Broth,
dostupné
na:
https://www.hardydiagnostics.com/catalog2/hugo/LIMBroth.htm 31.
Hardy
Diagnostics:
GRANADA
MEDIUM,
dostupné
https://www.hardydiagnostics.com/catalog2/hugo/GranadaMedium.htm 39
na:
32.
Hardy
Diagnostics:
TODD
HEWITT
BROTH,
dostupné
na:
https://www.hardydiagnostics.com/catalog2/hugo/ToddHewittBroth.htm 33. Savoij D., Gottimer C., Crocilla' C. a Zucca M.: Streptococcus agalactiae in pregnant women: Phenotypic and genotypic characters, publikováno v Journal of Infection, únor 2008, díl 56, číslo 2, strana 120-125, dostupné na: http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6WJT4RGG2K71&_user=835458&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&view=c&_acct=C 000045159&_version=1&_urlVersion=0&_userid=835458&md5=a81eb641397 79e29a1bf3c3a1d152bed 34.
Hardy
Diagnostics:
Blood
Agar,
dostupné
na:
https://www.hardydiagnostics.com/catalog2/hugo/BloodAgar.htm 35. Juránková Jana: Předporodní screening Streptococcus agalactiae- přednáška 36. BIO-RAD: PASTOREXTM STREP, příbalový leták
40
