MALDI-TOF massaspectrometrie Click to add title

MALDI-TOF massaspectrometrie Click to add title een revolutie in de microbiologie? Click to add subtitle

G. Coppens G. De Sutter

28 september 2010

MALDI-TOF massaspectrometrie een revolutie in de microbiologie? Waarom implementatie in ons lab sinds oktober 2009? •

Veelbelovende techniek voor identificatie in microbiologie – Artikel Seng et al. CID 2009:49 (15 august) 543 – 551 Ongoing Revolution in Bacteriology: Routine Identification of Bacteria by MALDI-TOF MS

– Positieve ervaringen met uittesten in België (UZLeuven, VUB, Ulg Luik) – Vooral toestel Bruker goed gedocumenteerd

•

“Buikgevoel” - de identificatiemethode van nabije toekomst

•

Revolutie: met of zonder “?”

Robin Platel, ICAAC 2010

MALDI-TOF massaspectrometrie een revolutie in de microbiologie?

Inhoud van deze presentatie:

Identificatie van micro-organimen met MALDITOF-MS

Toepassing van deze technologie in een routine lab microbiologie

Microflex – Maldibiotyper ™ systeem van Bruker Daltonics


Principe MALDI-TOF MS Benodigde apparatuur en software Testkwaliteit: - eigen verificatie/validatie - (enkele publicaties)

Implementatie MALDI-TOF MS in routine laboratorium microbiologie Kostenraming

Besluit


Wat we NIET behandelen: •

Vergelijking tussen toestellen (Bruker <– > Shimadzu = Vitek MS BioMérieux)

•

Epidemiologische toepassingen van MDT (subtyperen van stammen)

•

Identificaties rechtstreeks op klinische monsters – (urine, positieve hemocultuur flessen)

•

Toepassingen MALDI-TOF buiten de microbiologie (onderzoek macromoleculen -> klinische scheikunde)

Principe van MALDITOF-MS

Een per micro-organsime bekomen spectrum (speciespecifiek) wordt vergeleken met in een databank opgeslagen speciesspecifieke referentiespectra om tot een identificatie te komen.

MALDI-TOF massaspectrometrie Matrix assisted


MALDI-TOF massaspectrometrie Matrix assisted


MALDI-TOF massaspectrometrie Laser Desorption/Ionisation

UV – 337 nm – 60Hz (instelbaar) Robin Platel, ICAAC 2010

MALDI-TOF massaspectrometrie Laser Desorption/Ionisation

Donna Wolk, ICAAC 2010

MALDI-TOF massaspectrometrie Time of flight

+

+

+ 20,0 KV

Vacuum: 5 – 2 x 10-6 mbar

MALDI-TOF massaspectrometrie

Intens. [a.u.]

MALDI-TOF-profiling: Breed toepasbaar op (myco)bacteriën, gisten, schimmels

Aspergillus fumigatus

3000 2000

Intens. [a.u.]

1000 0

Bacillus subtilis

8000 6000 4000 2000 0

Candida albicans ATCC 10231

1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

Escherichia coli DH5alpha

2500 2000 1500 1000 500 0 3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000 m/z

Bruker Daltonics

4364.06

ribosomal Protein RL36 RS32 RL34 RL33meth. RL32 RL30 RL35 RL29 RL31 RS21

6254.64

5380.64

5000

7157.65 7273.87

3000

6410.90

5096.01

6315.49

4000

7870.62

2000

8368.99

Intens. [a.u.]

MALDI-TOF massaspectrometrie

Meting ~ 1 u voor 96 identificaties ; 1000

Massa range:2000-20000 Da 0 4000

4500

5000

5500

6000

6500

7000

7500

8000

m/z

E. coli

m/z 4364,33 5095,82 5380,39 6255,39 6315,19 6410,60 7157,74 7273,45 7871,06 8368,76

MALDI-TOF massaspectrometrie IDENTIFICATIE

Principe opbouw score value

Score value = log(0,6 x 0,3 x 0,9 x 1000) = 2.21

[0 – 3]

SAMENVATTING PRINCIPE MALDI-TOF MS


Benodigde apparatuur en software

Microflex™ LT MALDI-TOF spectrometer

135cm (H) x 51 cm (B) x 68 cm (D) Tafelmodel „plug and play”


Klassieke Target: • Gepolijst staal • 96 spotzones of cirkels • Afwasbaar • Herbruikbaar


FlexControl v 3.0 : Stuurt de microflex massaspectrometer aan. MALDI Biotyper v 2.0 identificatiesoftware : Vergelijkt de bekomen spectra met de databank van gekende spectra. MALDI Biotyper Automation control v 2.0 : Koppelt de – Microflex massaspectrometer – Flexcontrol software – MALDI Biotyper

zodat geheel vlot in routine kan gebruikt worden.

Benodigde apparatuur en software Database: Reference Library 3.0 voor MALDI Biotyper 2.0 • Bibliotheek van referentiespectra van micro-organismen 3287 MSP‟s van stammen (MSP = Main Spectra Projection) 1820 species, 294 genera (juni 2009) • Periodieke update: – “hiaten” van minder goed vertegenwoordigde species worden opgevuld – databank wordt steeds performanter

•

2 delen: – Basisdatabank (laatste update mei 2010: 3476 MSP‟s) – Security Relevant Database: bevat 13 species die in aanmerking kunnen komen voor bioterrorisme (b.v. Salmonella (Para)typhi, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae , …)

•

Mogelijkheid om eigen databank(en) te realiseren (arbeidsintensief, ervaring)

Testkwaliteit Aanvaardingscriteria - Diverse aanvaardingscriteria (Bruker, publicaties, SOP‟s, …) - Aanvaardingscriteria Bruker: (te) streng ? Range

Identification

Symbols

Color

2.300…3.000

Highly probable species

(+++)

green

2.000…2.299

Secure genus, probable species

(++)

green

1.700…1.999

Probable genus

(+)

yellow

0.000…1.699

Not reliable

(-)

red

-Voor de eigen validatie aanvaardingscriteria van Seng et al. CID 2009:49 gebruikt: score value > 1.9 is indicatief voor de SPECIESidentificatie. 1.7 – 1.9 is indicatief voor GENUSidentificatie. < 1.7 is indicatief voor onbetrouwbare identificatie.

Testkwaliteit MALDI-TOF MS Accuraatheid op 50 referentiestammen (vrnl ATCC) Haemophilus influenzae Haemophilus parainfluenzae Streptococcus dysagalactiae Streptococcus species (F, 2) Streptococcus equisimilis (C) Streptococcus agalacatiae Streptococcus pyogenes Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Staphylococcus saprophyticus Aerococcus viridans Bacillus cereus

Escherichia coli Shigella flexneri (2b) Salmonella Thyphimirium Proteus mirabilis Proteus vulgaris Proteus hauseri Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Enterobacter cloacae Enterobacter aerogenes Serratia marcescens Morganella morganii

Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa Stenotrophomonas malthophilia Lactobacillus gasseri Prevotella melaninogenica Bacteroides fragilis Trichophyton mentagrophytes Saccharomyces cerevisiae Candida albicans

Concordant: 94% (47/50) - Discordant: 6% (3/50) Verificatie laboratorium microbiologie – ZOL – 2009 Met dank aan Dr. A. Van de Abeele, AZSL GENT voor levering aantal stammen

Testkwaliteit MALDI-TOF MS Accuraatheid op 50 referentiestammen (vrnl ATCC) 3/50 “discordanties”: ATCC

MDT

Shigella flexneri *

Escherichia coli (2.15)

Haemophilus parainfluenzae**

Aggregatibacter aphrophilus (1.90)

Trichophyton mentagrophytes***

Trichophyton tonsurans (1.76)

* Geen identificatie van Shigella species mogelijk met MDT ** Slechts 2 MSP in databank *** Slechts 1 MSP in databank Verificatie laboratorium microbiologie – ZOL - 2009

Testkwaliteit MALDI-TOF MS

Accuraatheid : vergelijking 2 methodes in klinische routine • • • • • • •

Gedurende november - december 2009 Representatieve stammen uit klinische monsters routine Prospectief Vergelijking klassieke geaccrediteerde identificatiemethode (KI) Met identificatie door middel van MALDI-TOF MS Stammen in groepen onderverdeeld Aanvaardingscriterium nieuwe methode: per groep > 90% concordantie (Verification and Validation of Procedures in the Clinical Microbiology Laboratory, Cumitech 31A, 2009, R. B. Clarck et al, ASM press)

Verificatie laboratorium microbiologie – ZOL - 2009

Testkwaliteit MALDI-TOF MS Accuraatheid in klinische routine Routine ZOL

N

Concordant

Concordant %

Opmerkingen

ATCC e.a.

50

47

94

S. aureus

62

62

100

CNS

119

115

97

Validatie species volgt

Streptokokken

58

50

86

Indien optochine:98.2%

Enterokokken

73

72

99

Enterobacteriën

225

218

97

Restricties

Niet vergisters

136

128

94

Restricties

GPS aëroob

15

15

100


Anaëroben

19

18

95

Verder te valideren

H, M, N

26

25

96

Restricties

Gisten

71

71

100

Schimmels TOTAAL

Validatie volgt 854

821


96%

Accuraatheid in klinische routine Groep STAPHYLOKOKKEN •

Concordanties: 97.9% (183/187)

•

Onderscheid tussen S. aureus (n=62) en CNS (n= 119): 100% correct

•

Geen identificatie met MALDI-TOF: 4/187 (CNS met KI)

•

Accuraatheid speciesidentificatie CNS : – bijkomende troef van de Maldi-tof MS – accuraatheid niet te evalueren in routine met KI (tot “CNS” niveau)


Accuraatheid in klinische routine Groep STREPTOKOKKEN - RESTRICTIES Streptococcus agalactiae (n=12): concordantie 100% Streptococcus pyogenes (n=12): concordantie 91.6% - 1 stam niet geïdentificeerd met MDT

Streptococcus pneumoniae (n=16): concordantie 100% - 1 stam met score < 1.9

Streptococcus species (n=18): concordantie 100% op GENUSniveau, MAAR! - 7/18 geven S. pneumoniae met optochine R (verwantschap met S. mitis, idem met 16SrRNA)

Besluit: • Beta-hemolytische streptokokken betrouwbare identificatie • S. pneumoniae betrouwbaar indien optochine S • Andere streptokokken voorlopig slechts op genusniveau aanvaard (Streptococcus species), speciesidentificatie verdere te valideren.


Accuraatheid in klinische routine Groep ENTEROBACTERIACEAE EN ENTEROPATHOGENEN Concordantie: 97% (218/225) 7/225 “discordanties”: KI

Salmonella enteritidis Serratia marcescens Aeromonas hydrophila Klebsiella oxytoca (2x) Citrobacter koseri Geen identificatie

MDT

Salmonella species Serratia ureilytica* Aeromonas caviae Raoultella ornithinolytica (2x) Klebsiella pneumoniae** Helicobacter pullorum

*98.3% gelijkenis met S. marcescens met 16S rRna gen seq., 43.7 % gelijkenis met DNA-DNA hybridisatie ** staalverwisseling


Accuraatheid in klinische routine Groep ENTEROBACTERIACEAE EN ENTEROPATHOGENEN RESTRICTIES met MALDI-TOF MS: -

Geen onderscheid tussen E. coli en Shigella species Identificatie Salmonella op speciesniveau (Nog) geen betrouwbare differentiatie binnen het Enterobacter cloacae complex: -

E. asburiae, E. cloacae, E. hormaechei, E. kobei, E. ludwigi, E. nimipressuralis

-

Sterk verwantschap binnen het Aeromonas genus

-

Moeilijk onderscheid tussen Klebsiella oxytoca en Raoultella ornithinolytica -

(genetisch sterke verwantschap)

Restrictions Biotyper identification – M. Kostrzewa – Bruker - 2010

Accuraatheid in klinische routine Groep NIET VERGISTERS Concordantie: 94% (128/136) 8/136 “discordanties”: KI

MDT

Achromobacter denitrificans Achromobacter xylosoxidans Pseudomonas putida Pseudomonas stutzeri

Achromobacter insolitus Achromobacter ruhlandii Pseudomonas monteilii *

Pseudomonas aeruginosa Stenotrophomonas maltophilia Stenotrophomonas maltophilia Stenotrophomonas maltophilia

Escherichia coli ** Klebsiella pneumoniae ** Achromobacter xylosoxidans ** Haemophilus influenzae **

Geen identificatie

* Nieuw species uit Pseudomonas putida subcluster IIc (Int. J.Syst. Bact. (47):3:846) ** verschillende kolonies gebruikt uit polymicrobiële flora: menselijke fouten


Accuraatheid in klinische routine Groep NIET VERGISTERS RESTRICTIES met MALDI-TOF MS: •

Pseudomonas hibiscola, geniculata, beteli : meestal = Stenotrophomonas maltophilia

•

Geen betrouwbare differentiatie binnen het

Acinetobacter baumanii-calcoaceticus complex: - A. baumanii, A. calcoaceticus, A. genospecies 3, A. genospecies 13

•

Geen betrouwbare differentiatie tussen Achromobacter xylosoxidans en Achromobacter ruhlandii

Restrictions Biotyper identification – M. Kostrzewa – Bruker - 2010

Accuraatheid in klinische routine Groep ANAEROBEN -Restricties

Concordantie 95% (18/19) Belang verse kolonies: zeker bij anaëroben Bruker 2009

Accuraatheid in klinische routine Groep Haemophilus, Moraxella en Neisseria species Concordantie: 96.1% (25/26)

N = 26 Haemophilus influenzae: 9 Haemophilus parainfluenzae: 10 Moraxella catarrhalis: 5 Neisseria species: 2

– 23 op speciesniveau – 2 op genusniveau (niveau KI) – 1 DISCORDANTIE*

* KI

Haemophilus parainfluenae

MDT

Haemophilus influenzae

Slechts 2 MSP’s voor H. parainfluenzae in databank = onvoldoende Verificatie laboratorium microbiologie – ZOL - 2009

Accuraatheid in klinische routine Groep GISTEN Concordantie: 100% (71/71) - 89% met rechtstreekse methode - Concordantie onafhankelijk van score value

Verificatie laboratorium microbiologie – ZOL – 2009 Jeroen Heyligen 2009

N = 71 Candida albicans: 59 Candida glabrata: 8 Candida parapsilosis: 1 Candida tropicalis: 1 Clavispora lusitaniae: 1 Rhodoturula species: 1

MALDI Biotyper - Product

Solid Media

Intens. [a.u.]

Clinical Application - Fungi * 19652_altM_manu\0_G4\1\1SLin, Smoothed, "Baseline subt."

5000

4000

3000

2000

1000

0

4000

6000

8000

10000

12000

14000

Intens. [a.u.]

m/z

1500

1250

1000

750

500

Aspergillus versicolor DSM 1943

250

0

4000

6000

8000

10000

12000

14000

m/z

MALDI Biotyper, December 2009, MIX, vers. 1, Slide 38 of 40

MALDI Biotyper - Product

Liquid Media under Agitation

Intens. [a.u.]

Clinical Application - Fungi x104

1.25

1.00

0.75

0.50

0.25

0.00 4000

6000

8000

10000

12000

14000

m/z

Aspergillus versicolor DSM 1943

MALDI Biotyper, December 2009, MIX, vers. 1, Slide 39 of 40

Fungi Sample Preparation Generating Reproducible Mass Spectra

Testkwaliteit MALDI-TOF MS Accuraatheid in klinische routine Routine ZOL

N

Concordant

Concordant %

Opmerkingen

ATCC e.a.

50

47

94

S. aureus

62

62

100

CNS

119

115

97


Streptokokken

58

50

86

Indien optochine:98.2%

Enterokokken

73

72

99

Enterobacteriën

225

218

97

Restricties

Niet vergisters

136

128

94

Restricties

GPS aëroob

15

15

100


Anaëroben

19

18

95

Verder te valideren

H, M, N

26

25

96

Restricties

Gisten

71

71

100

Schimmels TOTAAL

Validatie volgt 854

821


96%

Concordantie met VITEK 2

84.1% op species niveau 11.4% op genus niveau

95,5% (1586/1660) concordant met VITEK 2 Donna Wolk, ICAAC 2010

Bruker: 93.6% (674/720)

bioMérieux Vitek MS: 88.2% (635/720)


Testkwaliteit: accuraatheid MALDI-TOF versus 16S rRNA gen sequencing -

Selectie van stammen: -

Moeilijke identificaties met klassieke methode Onverklaarde discordanties tussen MDT en klassieke identificatie

-

147 stammen geanalyseerd met 16S: 95% concordantie

-

Beperkingen MALDI-TOF en 16S DNA lopen vaak gelijk: -

E.coli vs. Shigella sp. Streptococcus mitis vs. Streptococcus pneumoniae ….

=> Voor deze species: moleculaire technieken op andere genetische regio‟s aan te wenden

Verificatie laboratorium microbiologie – ZOL – 2010 Kevin Martens

Testkwaliteit MALDI-TOF MS REPRODUCEERBAARHEID

Testkwaliteit MALDI-TOF MS REPRODUCEERBAARHEID 4 ATCC-stammen

Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Enterococcus faecalis ATCC 29212 werden gedurende 10 runs telkens 4 x geïdentificeerd 100% reproduceerbaar qua identificatie

Spreiding op score value: - eerder groot, vooral voor E. faecalis ATCC 29212 - daarom 2e run met meer aandacht voor applicatie koloniespot (“less is better”)

Testkwaliteit MALDI-TOF MS REPRODUCEERBAARHEID Score value

ESCO ATCC 25922

STAU ATCC 25923

PSAE ATCC 27853

ENFS ATCC 29212

Gemiddelde

2.422

2.181

2.339

2,023

Standaarddeviatie

0,064

0,152

0,095

0,325

Gemiddelde

2.395

2.359

2.369

2.390

Standaarddeviatie

0,046

0,057

0,052

0,059

RUN 1: n= 40

RUN 2: n = 40

Besluit: Kwaliteit van koloniespot belangrijkste factor voor bekomen van goede score value en goede reproduceerbaarheid. Verificatie laboratorium microbiologie – ZOL - 2009

Testkwaliteit MALDI-TOF MS REPRODUCEERBAARHEID

Melman et al., JCM, 2009

Testkwaliteit MALDI-TOF MS REPRODUCEERBAARHEID Is identificeren in duplo noodzakelijk? Besluit uit 1039 in duplo uitgevoerde identificaties tijdens de validatiefase: •

In duplo applicatie van de kolonies is niet noodzakelijk, wat een besparing in tijd en kosten betekent

•

In ongeveer 3 tot 4 % van de identificaties een probleem opduiken waarbij een herhaling van de MDT identificatie zal dienen te gebeuren.

•

Mogelijk kan dit percentage verminderen bij toename van de ervaring bij het aanbrengen van kolonies op de target.

•

Bij éénmalige applicatie is het zeer belangrijk dat bij het technisch valideren vergeleken wordt met het originele kolonietype op de gebruikte kweekbodem.

MALDI-TOF massaspectrometrie Click to add title een revolutie in de microbiologie? Click to add subtitle

28 september 2010

Situatieschets voor Maldi-biotyper -

Conventionele fenotypische testen Aanmaak van voedingsbodems voor de conventionele fenotypische testen Beperkt gebruik van commerciële kits Geen automatisatie identificaties of gevoeligheidsbepalingen

ZOL = klassieke microbiologie

Maldi-biotyper in de praktijk

Technische validatie - Controle (ATCC stam) - Kolonie versus resultaat

Onderhoud -

Calibratie Reiniging target Reiniging kamer Gepland onderhoud firma 1. Reiniging ionenbron frequentie afhankelijk van het gebruik  toestel blijft bruikbaar 2. Jaarlijks „groot‟ onderhoud  toestel niet bruikbaar (2 à 3 dagen)  zorgen voor backup - Opnieuw klassieke microbiologie? - 2de toestel? - Ander labo?

-

Niet gepland onderhoud firma

Technicus gerelateerde fouten -

Te veel / weinig materiaal Staalverwisseling Memory phenomenon: resten vorige analyse

Practische implementatie -

Implementatie niet vanzelfsprekend

-

Doorbreken van de klassieke workflow

-

Stress

Marleen

Marleentje

Cindy Erna

Daisy

Ilse Vera

Nicole

Inge Kim

Myriam

Ellen Marie-Jeanne

Betty Hilde

Frank

Els

Kostprijs -

Aankoop: ± 150.000 euro Update database: ± 2.500 euro per jaar Onderhoudscontract: ± 6.500 euro per jaar Consumables: ± 10 cent per test

 Prijs daalt naarmate het aantal analyses toeneemt

Interne studie Jeroen Heyligen: - Afschrijfperiode van 5 jaar: klassiek systeem iets goedkoper

Toekomst voor microbiologie ZOL -

Malditof: - Koppeling internet - Koppeling LIS (paperless?)

-

Verder automatiseren? -

-

MalditofA? Entautomaat? Automaat gevoeligheidsbepalingen? Kiestra Lab automatisation?

Nieuwbouw

Zullen wij als mlt‟s onze expertise verliezen??

MALDI-TOF massaspectrometrie een revolutie in de microbiologie? Besluit – Breed toepasbaar op alle (gegroeide) micro-organismen – Eenvoudige handeling, weinig materiaal vereist

– Snelste TAT voor identificatie micro-organismen – Goede performantie: vergelijkbaar met 16S rRNA gen sequencing!

– Goedkoper dan conventionele identificaties (manuele en automaten) • Afhankelijk van aantal identificaties/dag! – Kennis van taxonomie vereist (interpretatie resultaten) – Kennis van beperkingen van de identificatietechniek • Op te vangen met klassieke testen of 16S


-

Besluit Geschikt als methode voor identificaties microbiologie in routine

-

Inpasbaar in labautomatisatie microbiologie -

-

Momenteel nog arbeidsintensief: stand alone

Veelbelovend: -

Verdere uitbreiding van (eigen/commerciële) DATABANK Identificatie rechtstreeks op HC en URINE Toepassingen in EPIDEMIOLOGIE – typeren stammen Toepassingen opzoeken RESISTENTIE mechanismen in onderzoek

REVOLUTIONAIR!

MALDI-TOF massaspectrometrie Click to add title een revolutie in de microbiologie! Click to add subtitle

G. Coppens G. De Sutter

28 september 2010

MALDI-TOF massaspectrometrie Click to add title

Recommend Documents