İSI DNS ÉS POPULÁCIÓTÖRTÉNET: 11 ezer év demográfiai változásinak negatív hatása a lucfenyı (Picea abies) genetikai variabilitására egy kárpáti refúgium-területen Magyari E. K., Bálint M., Parducci L., Major Á., Nédli J., Rácz I.
2011.03.28.
1
MOTIVÁCIÓ
2005: Molekuláris Taxonómiai Labor nyílik az MTM-ben Potenciális hasznosítás lehetıségei fosszilis témában? tavi üledékbe zárt fosszilis pollenek és makrofosszíliák
İSI DNS KUTATÁSOK –
rövid történeti áttekintés I. „Özönvíz elıtti DNS” – 1984-1995
Fosszilis, erısen fragmentálódott DNS szálak, melyek sokszor posztmortem bázis-transzformáción esnek át
Higutchi et al. 1984: 150 éves múzeumi kvaggából sikeresen vontak ki és amplifikáltak ısi DNS-t (Fokföldön 1800-as években kipusztult zebra alfaj)
Hihetetlen korú ısi DNS maradványok („özönvíz elıtti DNS”): 100 millió évesnél is idısebb fosszíliák látszólagosan sikeres DNS analízise: pl. oligocén és kréta borostyánban talált rovarok, növényi maradványok (1992-1994), miocén Magnolia fosszíliák (1990-1991), 80 millió éves dinoszaurusz csont (1994), kréta korú dínó-tojás (1995) Egyiket sem sikerült reprodukálni, a 2000-es évek kutatásai szerint a DNS megtartás maximálisan néhány százezer éves idıtartományban lehetséges
İSI DNS KUTATÁSOK –
rövid történeti áttekintés II. „Özönvíz utáni DNS” – a 2000-es évek
Az ısi DNS vizsgálatok kettéágazó vizsgálati célja: 1.
Populációgenetikai kérdések vizsgálata: pl. hogyan hat az elterjedési terület fluktuációja a genetikai diverzitásra, fajképzıdés, evolúció
2.
Az egykoron élt fajspektrum kiderítése, diverzitás változás vizsgálata, ısi DNS használata fajmeghatározásra (metagenomika)
Barlangi medve - mitokondriális genom hosszú szakaszai ismertek, barnamedvétıl 1.5 millió éve vált el, többszöri géndiverzitás csökkenés az utolsó glaciálisban Gyapjas mamut - teljes mitokondriális genom hajszálból, rövidebb mtDNS szaksazok vizsgálata több faj együttes jelenlétét bizonyították az utolsó glaciálisban, 2011: japán kutatók Oroszországban tárolt mamut tetem sejtmagjait akarják elefánt petesejtbe ültetni: Jurasic Park helyett Pleistocene Park 4000 éves grönlandi ember - 3 billió bázispár hajból 2010-ben, mai szibériaiakkal rokonítható Neandervölgyi ember – 4 billió bázispárt közöltek 2010-ben, 99,7%-os egyezés a modern emberrel, elválsái idı: 500-700 ezr év, keveredhetett a modern emberrel
Barlangi medve
Gyapjas mamut
Grönlandi emeber
Neandervölgyi emeber
Taylor at al. (2010) Missing saiga on the taiga; Campos et al. (2010) Ancient DNA sequences point to a large loss of mitochondrial genetic diversity in the saiga antelope (Saiga tatarica) since the Pleistocene
Szaiga antilop – ısi DNS vizsgálat modern DNS vizsgálattal párhuzamosan - kihalás szélén álló fajról van szó, környezeti változásokra érzékenyen reagál, de kedvezı feltételek esetén gyorsan szaporodik és mobilis, kedvezıtlen környezetben viszont tömegesen pusztul - genetikia vizsgálat eredménye: hirtelen populációméret csökkenés 2000 és 11000 éve, elıbbit valószínőleg emberi hatásra utóbbit klimatikus hatásra bekövetkezı élıhely beszőkülés okozta. + dokumentált tömeges pusztulások betegség, téli nagy hóborítás hatására: 1971, 1987, 1993 -az ısi DNS vizsgálat konzervációbiológiai jelentısége: ez a faj drámai populációméret csökkenéseket képes túlélni köszönhetıen a botlleneck utáni gyors szaporodásának, következésképpen védelmét leginkább az szolgálná ha a terjedését segítenék elı és nem a hirtelen elhalálozásokat próbálnák megakadályozni (élıhely összekötı folyosók létrehozása)
2011.03.28.
5
İSI NÖVÉNYI DNS VIZSGÁLATOK -KIS SZÁMÚ VIZSGÁLAT elsısorban metagenomika: milyen fajok voltak jelen? + Archeobotanika (pl. fıbb gabonák, szılı, kukorica)
VIZSGÁLT NÖVÉNYFAJ - LUCFENYİ (PICEA ABIES) Miért a lucfenyıt választottuk? 1)
2)
3) 4)
Európai populációnak genetikai mintázata részletesen tanulmányozott (kloroplaszt, mitokondriális és nukleáris régiók) Az utolsó eljegesedés során fontos erdıalkotó a Kárpát-medencében, bizonyos helyeken feltételezhetı a folyamatos jelenléte (pl. hegyvidéken) Fosszíliáinak elıkerülése várható glaciális és holocén tavi üledékekben Pollenje nagy mérető (100-150 mikron), relatíve könnyen izolálható az üledékbıl
Tollefsrud et al. (2008)
A LUCFENYİ GENETIKAI CSOPORTJAI ÉS EZEK ALAPJÁN FELTÉTELEZETT POSZTGLACIÁLIS TERJEDÉSI ÚTVONALAK Mikor történt ez az elválás?
Ezek a populációk nem terjedtek északra a holocén felmelegedés során, csak magassági övek közt mozogtak
Retyezát-hegység
2011.03.28.
Full glacial (LGM) distribution of Picea abies in the Carpathian Basin
A PCA alapú lucfenyı genetikai csoportok földrajzi eloszlása, és a genetikai csoportok kapcsolata minimum-evolúciósfák alapján. 8
Eemian interglacial (ca. 120 000 years BP) disribution of Picea abies in Central-Southern Europe. Taken from Ravazzi ( 2002)
A LUCFENYİ ELTERJEDÉSI Maximum spruce expansion (Picea abies+Picea omoricoides) during the early Weichselian (107–75 TERÜLETÉNEK kyr BP) VÁLTOZÁSAI AZ Maximum expansion of Picea abies in southern ELMÚLT 120,000 Europe during middle pleniglacial interstadials (55–35 kyr cal BP) ÉVBEN EURÓPÁBAN Tentative range map of Picea abies in central and southern Europe during the LGM (25–17.5 kyr cal BP).
Ravazzi (2002) Lucfenyı (Picea abies) área
MOTIVÁCIÓ Ravazzi 2002 The time window used by most researchers (the postglacial) to evaluate the influence of historical events on genetic structure of European tree populations seems too short compared to the amount of genetic variability that was probably not eliminated by the restriction of populations during the LGM. This is especially important in the case of spruce, which was not reduced to a confined refugium but survived in large regions in southern Europe. Hope is now placed in fossil DNA extraction and identification, because this will allow a real integration of paleobotanical and molecular methods.
CÉLKITŐZÉSEK
? ?
Az ısi és modern lucfenyı populáció DNS vizsgálata révén annak felderítése, hogy a késıglaciális és holocén idıszak (elmúlt ~ 15000 év) klímaváltozásai és az emberi tevékenység (erdıirtás) hogyan hatottak a fafaj genetikai összetételére a Déli-Kárpátokban, mely terület ma számos área-specifikus allélt hordoz közepes genetikai diverzitás mellett. A faj túlélése szempontjából kulcsfontosságú-e ezen área-specifikus allélek védelme?
2011.03.28.
Hosszútávú cél: a paleobotanikai leletek alapján feltételezhetı DNY-ÉK irányú glaciális összeköttetés bizonyítása lucfenyı fosszíliák DNS vizsgálatával 11
KUTATÁSI TERÜLET - TAUL DINTRE BRAZI, RETYEZÁT-HG.
T.sz.f.m. : 1740 m Terület : 0,5 ha Vízmélység: 80 cm pH: 5,7 Növényzet : Pinus mugo úszóláp, Rhododendron myrthillus, Sphagnum sp., Picea abies, Pinus cembra Fúrásmag: 5 m
A RETYEZÁT
VIZSGÁLT ANYAG – LUCFENYİ POLLEN É S TOBOZ Kor TDB-1
510 10000
Mélység 520 (cm) (kal BP év)
üledékszelvény
530 Pollen minta DNS vizsgálatra (kb. 10700 kal. BP év)
540 11000 550
Teljes lucfenyı toboz fele DNS vizsgálatra (11000 kal. BP év) Fosszilis lucfenyı pollen
560 12000
580 14000
3,25 cm
570 13000 11000 éves lucfenyı (Picea abies) toboz magokkal 545 cm mélységbıl vízszintesen feküdt
590 600
15000
A tobozból izolált szárnyas lucfenyı mag
c 1,3
m
MÓDSZEREK – fosszilis lucfenyı toboz, mag és tobozpikkelyek A toboz fele radiokarbon kormeghatározásra került, míg másik fele ısi DNS analízisre (6 mag és 4 tobozpikkely)
DNA analysis
2011.03.28.
A magok és tobozpikkely izolálása steril fülke alatt történt, UV besugárzás (1 J/cm2, 1 óráig forgatás mellett
14C
dating
DNS kivonás a porított magokból és tobozpikkelyekbıl NucleoSpin Plant II Kit-el (Macherey-Nagel) 15
MÓDSZER ÉS MUNKAFOLYAMAT Arche DNA lab
Arche DNA lab
A DNS laborban lucfenyıvel korábban nem dolgoztak A recens lucfenyı anyag elemzése a fosszilist követte (szennyezés elkerülése érdekében) A DNS ısiségének bizonyítása: minta kontroll, reagens kontroll, PCR reakciók és szekvenálás ismétlése külföldi laborban (Uppsala University) A pollen minták fagyasztást követıen közvetlen a PCR reakciók elıtt lettek összetörve (5 pollen egy PCR csıben)
MÓDSZEREK – PCR & SZEKVENÁLÁS Minták:
PCR produktum tesztelése agaróz gélen ráamplifikálás szekvenálás
10 fosszilis lucfenyı mag 4 fosszilis tobozpikkely
Marker választás: pszeudo-gének, mikroszatelliták, intergénikus spacer-ek és intronok (rövid 136-220 bázispáros szakaszok.
462 fosszilis lucfenyı pollen 58 modern lucfenyı tőlevél PCR mixes: 5 ul of the template solution), 1x reaction buffer, 1.5 mM MgCl2, 0.1 mM dNTP (each), 0.255 pmMole F and R primer, and 0.4 U of AmpliTaq Gold polymerase. PCR profile: 10 min at 94 ºC, 45 cycles of 20 sec at 94 ºC, 30 sec at 55 ºC, 1 min at 72 ºC, final elongation 7 min at 72 ºC, with 10 ºC as2011.03.28. end-temperature.
ndhCp-ndhKp pseudogenes psbM-trnD intergene spacer B: (ORF46b) D: Pt15169 trnT-trnL intergene spacer trnL-intron trnL-trnF intergene spacer matK-trnK intron
ndhK-for1 ndhC_ndhK-rev psbM_trnD-f1
CACTTCAGTTCTTGTTGTTCC TCGCCACAGAACCAACGATG GTTCGAGTAACGGAATCTAAC
psbM_trnD-rev1
CGAACGTCTTCTGGAGTAGC
B-for B-rev D-for D-rev trnT_trnL-sp-f1
GCTTATGGCATTGTTGATGT TGGGCATTCTAGCTGTATTG CTTGGATGGAATAGCAGCC GGAAGCGCATTAAGGTCATTA CTGAGCTAAGCAGGCTCAATGG
trnT_trnL-sp-brev
GCATGTTATTATCCTCCCCTAG
trnL-intron-f2 trnL-intron-rev Aa_trnLF-for
GAACGCTCTATTTACACC ACACGTAGAATTGGACTCTATC GGTTCAAGTCCCTCTATCCC ACTGATCAACTCAACTTGTCATAAG ATGG GCCCTCGTTCATGAGAATAACC CATGAGTCAGGAGAGCGATTGG
Aa_trnLF-rev trnK2i-f1 trnK2i-r1
136 bp 200 bp 212-220 bp 124 bp 251 bp 237 bp 186 bp 19717 bp
EREDMÉNYEK 58 modern szekvencia ~ 1550 bázispár össz-hossz
28 fosszilis pollen szekvencia 124-251 bázispár hosszúak (összesen 462 próbálkozás) +2 Sweden
22 fosszilis mag és tobozpikkely szekvencia, 1241016 bázispár hosszúak
9
Recent haplotypes:
1297
1464
882
1081
K2i(134)
Li(154)
873
1279
TL(206)
872
LF(133)
TL(197)
834
1084
TL(196)
634
Li(157)
TL(168)
630
LF(115)
D(82)
629
G
T
C
B11
?
?
C
12A+5G
Buk9
?
?
C
11A+6G
A
A
C
G
T
C
G
T
C
A
T
C 1551
CP2
?
?
C
11A+6G
C
A
C
G
T
C
G
T
C
A
T
C 1551
Gtk24
?
?
C
10A+6G
A
A
C
G
T
C
G
T
A
A
T
T 1550
KR8-2
?
?
C
13A+5G
A
A
C
G
T
C
G
T
C
A
T
C 1552
P9
?
?
C
12A+5G
C
A
C
G
T
C
G
T
C
A
T
C 1551
St15
?
?
C
10A+6G
A
A
C
G
T
C
G
T
C
A
T
C 1550
Z7
?
?
C
12A+5G
A
A
C
G
T
C
G
T
C
A
T
C 1551
H12
?
?
T 12A+4G+3A+G A
C
T
G
T
A
G
C
C
A
G
C 1554
C
A
C
G
T
C
G
A
T
C 901
A
A
C
Length (bp)
424
C
1-200
T
B(88)
G
Position (total):
1-136
C
M
D(78
C 1551
D(77)
T
A
CK
B(107-126) 443 - 462
T
A
Region (position):
MUTÁCIÓS POZÍCIÓK Két fosszilis szekvencia kizárólag a fosszilis anyagban fordult elı
Arche cone: cone
?
Arche seeds: seed3 seed4 seed8 seed9 ? seed10 Arche pollen grains: a-B-p1 a-D-p2 a-D-p3 a-TL-p4 a-TL-p5 a-TL-p6 a-TL-p7 a-TL-p8 a-TL-p9 a-TL-p10 a-TL-p11 a-TL-p12 a-TL-p13 a-CK-p14 ? a-CK-p15 ? a-M-p16 a-M-p17
124 T
C
? C
? ?
C
10A+7G
? C
A
A
A
C
C
A
C
C
A
C
G
T
C
G
G
T
C
G
G
T
A
G
10A+6G
A
237 575 A
T
C
T
C 990 C 1016 212 124 124
G
T
C
G
251
G
T
C
G
251
G
T
C
G
251
G
T
C
G
251
G
T
C
G
251
G
T
C
G
251
G
T
C
G
251
G
T
C
G
251
G
T
A
G
251
A
G
A
A
A mai populáció gyakori és a ritka alléljei egyaránt elıkerültek a fosszilis mintákból, és érdekes jelenség, hogy a mai ritka allélek a fosszilis mintákban gyakoribbak voltak 13 pont mutációt észleltünk
251
136 136 200 200
5 in/del polimofizmust
A İSI DNS SZEKVENIÁK AUTENTIKUSSÁGÁT TÁMOGATÓ EREDMÉNYEK A reagens és minta kontrollok nem amplifikáltak DNS-t Az agaróz gélen tiszta és egyértelmő csíkok Olyan haplotipusok voltak jelen az ısi anyagban amik ma hiányoznak a területrıl A vizsgálatok replikálhatóak voltak egy független külföldi laborban
Alapstatisztikák: polimorfizmus, populációk differenciáltsága és génáramlás mérése az ısi és recens populációk közt No. haplotype s B
D
TL
Li
LF
Ki
Haplotype diversity (Hd)
Nucleotide diversity (π)
Average no. differences (k)
Ancient
2
1.0000
0.0070
4.0000
Recent
5
0.5758
0.0026
0.8020
Ancient
2
0.5333
0.5333
0.5333
Recent
3
0.3001
0.3410
0.3409
Ancient
3
0.3846
0.0026
0.7912
Recent
2
0.0351
0.0001
0.0351
Ancient
2
0.6667
0.0028
0.6667
Recent
3
0.0696
0.0003
0.0702
Ancient
1
0.0000
Recent
3
0.2500
Ancient
1
0.0000
Recent
2
0.0351
Fst
Ks
Kst
0.1731
0.9104
0.0355
0.3266
0.3592
0.0937
0.0580
0.1842
0.4248
0.4569
0.1000
0.2304
0.2458
0.0036
0.0333
0.0000
0.0000 0.0000 A koraholocén populáció0.0938 0.0014 0.2544 genetikai diverzitása 0.0000 magasabb volt0.0000 mint a ma0.0000 élı0.0002 populációé0.0351
**
**
*
**
ns
ns
** - significant at p < 0.01 | * - significant at p < 0.05 | ns – not significant
MAXIMUM PARSZIMÓNIA FÁK A KLOROPLASZT DNS SZEKVENCIÁK ALAPJÁN
İsi DNS szekvenciák
Picea abies PAR (grains cm-2 yr-1)
A LUCFENYİ KÉSİGLACIÁLIS ÉS KORAHOLOCÉN POLLEN AKKUMULÁCIÓS RÁTÁJÁNAK (PAR) IDİBELI VÁLTOZÁSA A BRAZI-TÓ ÜLEDÉKSZELVÉNYÉBEN 10000
9 2200 -0
8 3900 - 2200
7 7200 - 3900
6 9180 - 7200
5 4 10100 11100 - 9180 - 10100
3 12800 - 11100
2 1 13900 15000 - 12800 - 13900
PAR zones
8000 6000 4000 2000 0
0 1
2
3
4
5
6
7 8 9 10 11 12 13 14 15 Age (kyr cal yr BP)
Az ısi DNS minták pozíciója positions of the aDNA samples
Populáció méret csökkenés
A piros szaggatott vonal a PAR 3-tagú mozgó átlagát mutatja
A LUCFENYİ KÉSİGLACIÁLIS ÉS KORAHOLOCÉN POPULÁCIÓDINAMIKÁJA POLLEN, SZTÓMA ÉS MAKROFOSSZÍLIA ANALÍZIS ALAPJÁN
Age Depth cal yr BP cm 0
Su
m
1000 2000
510 10000
3000
520
4000 5000
530
200
200
300
300
6000 7000
540
Early Holocene warming 11,700-10,820 yr BP 8000 cal400 rapid increase in woody cover, dense Larix forest around the lake
11000 550
570 13000
10000 warming 14,450-12,900 cal yr BP; establishment Bolling/Allerod of Pinus mugo,Larix decidua, Pinus cembra and Picea abies on the lakeshore 11000 500
580 14000
12000 13000 14000cold phase > 14,450 cal yr BP Oldest Dryas 15000 lakeshore treless,600 steppe tundra and alpine herbs (Soldanella,
590 15000
400
Younger Dryas cooling 9000 cal yr BP 12,900-11,700 regional expanison of Artemisia and Chenopodiaceae; decreasing tree cover on the lakeshore, but Picea abies survives
560 12000
600
Taul Zanogutii (1900 m) Picea
Ca rp in us be Fa tu gu lu s s
Pi ce aa Co bie s ry lu s
He
rb s
ru bs Sh m Su
Pi ce
Ti m
Depth cm
es
ca l
e(
c a a al y rB bi Pi P) ce es ( a s t Pi a b ce i e o m a Pi a ab s (p ta) ce i e er Pi a a s (l ide ce bie ea rm a s ve ) a b (b s ) i e ud s( s p o ca Su lle le) m n) Tr ee s
TDB-1 (1770 m)
A lucefnyı 13,900 évvel ezelıtt telepedett Primula) 0 10 20 0 10 5 5 5 10 10 20 0 10 20 meg 10 20a30Brazi-tó 40 50 60 70 partján, 80 90 a késıglaciálisban Relative frequency (%) Concentration (number of remains on slide) majdnem folyamatos a jelenléte, a Fiatal Concentration (number of remains per 10 cm ) First accurrance of Picea abies Driász lehőlési fázis egy rövid szakaszán on lakeshore fosszíliái hiányoznak → a térségben ekkor is jelen van, de a tó partjáról visszahúzódik 3
20 30
500
600 Holocén pollenszelvények a Brazitóból és a Zenóga-tóból. Arra utalnak, hogy a lucfenyı aFarcas hegységben az et al. 1999 elmúlt 11000 évben gyakori volt, de kiterjedése jelentısen fluktuált
0 10 20 30 0 10 20
A RETYEZÁ RETYEZÁT-HEGYSÉ HEGYSÉG ÉS A KÖ KÖRNYEZİ RNYEZİ TERÜ TERÜLETEK TÁ TÁJHASZNÁ JHASZNÁLATI TÉRKÉ RKÉPE
A lucfenyvesek korlátozott kiterjedést érnek csak el a Retyezáthegységben, az északi oldalon nagyobb az állomány A hegyi rétek és legelık kiterjedés nagy a déli oldalon, erdıirtás?
Forrás: Grodzinska et al. 2004
A Lolaia gleccser maximális kiterjedése 16 ezer éve
A lucfenyı hipotetikus refúgiumai a gleccserek maximális kiterjedése idején
Reuther et al. 2007
Taul dinte Brazi (1740 m)
A lucfenyı koraholocén expanziójának iránya
Reuther et al. 2007
A genetikai, EREDMÉNYEKfosszilis pollen, KONKLÚZIÓK és pollen akkumulációs ráták sztóma 3 makrofosszília adatok együttesen arra drasztikus populációméret csökkenést Adataink arra utalnak, hogy a korautalnak, aterjedıben lucfenyı a lévı hegységben, holocén,hogy még lucfenyı rögzítettek az elmúlt 11000 évben valószínőleg alacsonyabb tszf populáció genetikai diverzitása (bottleneck). Ezek nagy magasságokban éltea túl az utolsó ma élı nagyobb volt mint hegységben valószínőséggel hozzájárultak a eljegesedés maximumát, a késıpopulációé, és a koraholocén populáció lucfenyı genetikai ezekbıl variabilitásának glaciális expanzió a lokális több mára kihalt allélt is hordozott. csökkenéséhez, és elképzelhetı hogy populációkból indult meg. több ısi alléltípus is áldozatául esett a hirtelen állománycsökkenésnek, melyek közül a legerısebb a középkorra tehetı (antropogén erdıirtások sorozata).
KONZERVÁCIÓ-BIOLÓGIAI KÖVETKEZTETÉSEK • A Kárpátokban a hegység szabdalt morfológiájának következtében, kis területen változatos génállományú fapopulációk élnek (a fenyıfajok esetében a populációk genetikai differenciáltsága is jóval nagyobb itt mint az Alpokban!!!) • Ezt a különösen gazdag génállományt fokozottan védeni kell a jövı érdekében! • İsi és modern DNS adataink a pollen alapú demográfiai rekonstrukcióval kiegészítve arra utaltak, hogy az erdıirtások MÁR CSÖKKENTETTÉK A LUCFENYİ GENETIKAI DIVERZITÁSÁT A RETYEZÁTHEGYSÉGBEN, ami a faj alkalmazkodóképességének a csökkenését is maga után vonhatja. Fontos tehát a meglévı állományok fokozott védelme, a természetes terjedés elısegítése a déli oldalon a legeltetés korlátozásával. KORAHOLOCÉN (11000 ÉVE)
MAI ÁLLAPOT
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET! Támogatóink: European Commission (MERG-CT-2006-041088 ‘Combining palaeoecology and palaeogenetics’), OTKA PD73234
