LAMPIRAN. Universitas Sumatera Utara

LAMPIRAN

Universitas Sumatera Utara

Lampiran 1. Sterilisasi Alat dan Bahan Sterilisasi alat dilakukan sebelum semua peralatan digunakan, yaitu dengan cara membungkus semua peralatan dengan menggunakan kertas stensil kemudian di masukkan ke dalam oven dengan suhu 1500C selama 4 jam. Bahan atau media dimasukkan kedalam autoklaf pada suhu 1210C dengan tekanan 15psi (per square inci) selama 15 menit. Untuk alat yang tidak tahan panas tinggi disterilisasi dengan zat kimia berupa alkohol 70 %.


Lampiran 2. Pembuatan Ekstrak Biji Teratai

Biji teratai yang telah kering dan simplisia

Penimbangan dan penyiapan simplisia

Proses penyaringan setelah maserasi dan Pemisahan ekstrak dengan pelarut menggunakan rotary evaporator

Ekstrak setelah dilakukan pemisahan dan Proses pemekatan ekstrak dengan water bath


Lampiran 3. Proses Pengujian Toksisitas A. salina

Kista A. salina dan wadah penetasan

Proses pemipetan larutan uji dengan mikropipet

Proses pengukuran air 5ml


Proses pemasukan A. salina dan botol vial dengan berbagai konsentrasi

Setelah pengamatan 24 jam


Lampiran 4. Pembuatan Konsentrasi Larutan Uji Larutan induk adalah konsentrasi 80%, yaitu dengan perbandingan 0,8 gram dalam 1 ml DMSO (b/v). Untuk membuat konsentrasi 70%, 60% dan 50% dilakukan dengan pengenceran sebagai berikut:

V1 N1 = V2 N2 a. Konsentrasi 70% 1 x 70% = V2 x 80% V2 = 0,875 ml = 875µl

b. Konsentrasi 60% 1 x 60% = V2 x 80% V2 = 0,75 ml = 750 µl

c. Konsentrasi 50% 1 x 50% = V2 x 80% V2 = 0,625 ml = 625µl


Lampiran 5. Pembuatan Media Bakteri dan Jamur

Media Trypticase Soy Agar (TSA) Sebanyak 40 g bubuk TSA dilarutkan dalam 1000 ml akuades yang ditempatkan dalam Erlenmeyer 1 liter dan dipanaskan pada penangas air sambil diaduk hingga larut dan homogen dengan menggunakan batang pengaduk, kemudian disterilkan dengan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan uap 1atm selama 15 menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau cawan yang telah steril, setelah memadat disimpan dalam lemari es dengan plastik steril.

Media Potato Dextrose Agar (PDA) Sebanyak 39 g bubuk PDA dilarutkan dalam 1000 ml akuades yang ditempatkan dalam Erlenmeyer 1liter dan dipanaskan pada penangas air sambil diaduk hingga larut dan homogen dengan menggunakan batang pengaduk, kemudian disterilkan dengan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan uap 1atm selama 15 menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau cawan yang telah steril, setelah memadat disimpan dalam lemari es dengan plastik steril.

Media Brain-Heart Infusion Agar (BHIA) Sebanyak 52 g BHIA dilarutkan dalam 1000 ml akuades yang ditempatkan dalam Erlenmeyer dan dipanaskan pada penangas air sambil diaduk hingga larut dan homogen, kemudian disterilkan dengan autoclave pada suhu 121oC dengan tekanan uap 1atm selama 15 menit. Setelah itu dimasukkan ke dalam tabung reaksi atau cawan yang telah steril, setelah memadat disimpan dalam lemari es dengan plastik steril.


Lampiran 6. Analisis Kriteria Bakteri Aeromonas hydrophila

Uji oksidase positif dan uji Rimmler-Shoots (RS) positif

Uji Motilitas motil dan Uji O/F positif

Pewarnaan gram negatif berwarna merah dan berbentuk batang pendek


Lampiran 7. Analisis Kriteria Bakteri Streptococcus agalctiae

Uji motilitas non motil dan uji O/F positif fermentatif

Pewarnaan gram positif berwarna ungu dan berbentuk bulat


Lampiran 8. Analisis Kriteria Bakteri Saprolegnia sp.

Proses penanaman jamur

Pengujian Jamur secara morfologi

Hasil pengamatan mirkroskopis


Lampiran 9. Pembuatan Larutan Baku McFarland 0.5 Larutan baku McFarland terdiri atas dua komponen, yaitu larutan BaCl2 1% dan H2SO4 1 %. Sebanyak 0,05 mL larutan BaCl2 1 % dicampurkan dengan 9.95 mL larutan H2SO4 1 % dan dikocok hingga homogen. Kekeruhan larutan diukur pada panjang gelombang 620 nm dengan menggunakan akuades sebagai blangkonya. Nilai absorban larutan baku harus berada di kisaran 0,08 sampai dengan 0.13. Larutan baku McFarland 0,5 ekuivalen dengan suspensi sel bakteri dengan konsentrasi 1.5 × 108 CFU/mL.


Lampiran 10. Proses Pengujian Antimikroba

Pembuatan media dan sterilisasi dengan Autoclave

Oven untuk sterilisasi petri dan lamina air flow

Penghomogenan dengan vortex dan ketiga ekstrak setelah divortex


Proses pemipetan untuk setiap konsentrasi larutan uji

Konsentrasi larutan uji untuk setiap pelarut


Proses penghomogenan bakteri dalam larutan NaCl dan Pembandingan dengan larutan Mcfarland

Proses pengusapan suspensi bakteri

Proses pemberian cakram yang telah diberi ekstrak dengan berbagai konsentrasi


Bakteri dan jamur setelah masa pengamatan

Proses pengukuran zona hambat


Lampiran 11. Hasil Skrining Fitokimia Biji Teratai

a

b

d

c

a

b

(1)

c

d

(2)

d

c

b

a

(3) Hasil pengujian alkaloid (1) pelarut etil asetat, (2) pelarut n-heksana, (3) pelarut metanol dengan pereaksi; a. Bouchardat, b. Mayer, c. Wagner, d. Dragendroff.

a

Hasil pengujian fenolik; c. Pelarut n-heksana

a.

b

Pelarut

c

metanol,

b.

Pelarut

etil

asetat,


(1)

(2)

(3)

(4)

(5) (6) Hasil pengujian glikosida; (1) pelarut metanol dengan pereaksi Fehling, (2) pelarut metanol dengan pereaksi Molisch, (3) pelarut etil asetat dengan pereaksi Molisch, (4) pelarut n-heksana dengan pereaksi Molisch, (5) pelarut etil asetat dengan pereaksi Liebermann-Bouchard, (6) n-heksana dengan pereaksi Liebermann-Bouchard

Hasil pengujian saponin; c. pelarut etil asetat

a

b

a.

pelarut

c

n-heksana,

b.

pelarut

metanol,


T

S

β

S

β

(1) T

(2) T

S

β

(3) Hasil pengujian terpenoid/steroid; (1) pelarit n-heksana,(2) pelarut etil asetat, (3) pelarut metanol


Lampiran 12. Data Awal Kematian A. salina Pada Berbagai Konsentrasi Ulangan

Perlakuan U1

U2

U3

U4

U5

Kontrol air laut

0

2

0

1

0

0,6

Kontrol DMSO

3

2

3

4

3

3

1000 ppm

6

6

6

3

5

5,2

100 ppm

5

6

2

3

5

4,2

10 ppm

5

0

5

2

3

3

1000 ppm

4

5

7

4

3

4,6

100 ppm

7

5

4

5

3

4,8

10 ppm

3

6

1

0

5

3

1000 ppm

6

4

6

5

3

4,8

100 ppm

3

6

3

5

6

4,6

10 ppm

2

5

1

5

2

3

n-heksana

Etil asetat

Etanol

Rata-rata


Lampiran 13. Contoh Perhitungan Penentuan LC50 Ekstrak Biji Teratai a. Ekstrak Biji Teratai dengan Pelarut n-heksana Konsentrasi Total Jumlah Persen Log LC50 Probit (ppm) Populasi Kematian Mortalitas Konsentrasi (ppm) 0 50 3 6 3,36 10 50 15 30 1 4,61 257,709 100 50 21 42 2 4,87 1000 50 26 52 3 5,13

Pelarut

n-heksana

Pada ekstrak dengan konsentrasi 10 ppm Persen mortalitas =

=

Jumlah Artemia Hidup 15

50

Jumlah Populasi

x 100%

= 30%

Nilai probit dilihat dari tabel probit ulangan untuk kolam dan persentase untuk baris. Untuk menentukan LC50 dengan menggunakan persamaan regresi linier Y= a + bx No. 1 2 3 4 Σ Rata-rata

Konsentrasi (x) 0 1 2 3 6 1,5

Mortalitas (y) 3,36 4,61 4,87 5,13 17,97 4,4925

x2

y2

0 1 4 9 14

xy

11,2896 21,2521 23,7169 26,3169 82,5755

0 4,61 9,74 15,39 29,74

Maka: b

=

𝑛𝛴𝑥𝑦− 𝛴𝑥𝛴𝑦

=

(4𝑥29,74)−(6𝑥17,97)

𝑛𝛴𝑥 2 −𝛴(𝑥)2

(4𝑥14) −(6)2

= 0,557

a

=y–bx

= 4,4925 – (0,557x1,5) = 3,657


Sehingga y = 3,657+0,557x. LC50 merupakan konsentrasi yang menyebabkan kematian 50% hewan uji, pada tabel probit y = 5 dan x = Log konsentrasi y = 3,657 + 0,557x 5 = 3,657 + 0,557x x=

5−3,657 0,557

x = 2,41113, LC50 = anti Log x = 257,709 Koefisien korelasi menggunakan rumus r=

r=

𝛴𝑥𝑦

�𝛴𝑥 2 𝛴𝑦 2 29,74

√14x82,5755

= 0,874706

Grafik kematian A. salina (hubungan antara Log konsentrasi dengan mortalitas) ekstrak n-heksana 6

Mortalitas Probit

5

4,87

4,61

4,87

4

y = 3,657+0,557x r = 0,8747

3,36

3 2 1 0 0

1

2

3

Log Konsentrasi


b. Ekstrak Biji Teratai dengan Pelarut etil asetat Konsentrasi Total Jumlah Persen Log LC50 Probit (ppm) Populasi Kematian Mortalitas Konsentrasi (ppm) 0 50 3 6 3,36 10 50 15 30 1 4,61 496,675 100 50 24 48 2 4,87 1000 50 23 46 3 4,87

Pelarut

etil asetat


=


50

Jumlah Populasi

x 100%

= 48%



Mortalitas (y) 3,36 4,61 4,87 4,87 17,71 4,4275

x2

y2

0 1 4 9 14

xy

11,2896 21,2521 23,7169 23,7169 79,9755

0 4,61 9,74 14,61 28,96

Maka: b

=


=

(4𝑥28,96)−(6𝑥17,71)


(4𝑥14) −(6)2

= 0,479

a

=y–bx

= 4,4275 – (0,4797x1,5) = 3,709


Sehingga y =3,709+0,479x. LC50 merupakan konsentrasi yang menyebabkan kematian 50% hewan uji, pada tabel probit y = 5 dan x = Log konsentrasi y = 3,709 + 0,479x 5 = 3,709 + 0,479x x=

5−3,709 0,479


r=

𝛴𝑥𝑦

�𝛴𝑥 2 𝛴𝑦 2 28,96

√14x79,9755

= 0,86549

Grafik kematian A. salina (hubungan antara Log konsentrasi dengan mortalitas) ekstrak etil asetat 6

Mortalitas Probit

5

4,87

4,61

4,87

4 3,36

3

y = 3,709+0,479x r = 0,8654

2 1 0 0

1

2

3

Log Konsentrasi


c. Ekstrak Biji Teratai dengan Pelarut metanol Konsentrasi Total Jumlah Persen Log LC50 Probit (ppm) Populasi Kematian Mortalitas Konsentrasi (ppm) 0 50 3 6 3,36 10 50 15 3 1 4,61 496,675 100 50 23 46 2 4,87 1000 50 24 48 3 4,87

Pelarut

metanol


=


50

Jumlah Populasi

x 100%

= 48%



Mortalitas (y) 3,36 4,61 4,87 4,87 17,71 4,4275

x2

y2 0 1 4 9 14

xy

11,2896 21,2521 23,7169 23,7169 79,9755

0 4,61 9,74 14,61 28,96

Maka: b

=


=

(4𝑥28,96)−(6𝑥17,71)


(4𝑥14) −(6)2

= 0,479

a

=y–bx

= 4,4275 – (0,4797x1,5) = 3,709


Sehingga y =3,709+0,479x. LC50 merupakan konsentrasi yang menyebabkan kematian 50% hewan uji, pada tabel probit y = 5 dan x = Log konsentrasi y = 3,709 + 0,479x 5 = 3,709 + 0,479x x=

5−3,709 0,479


r=

𝛴𝑥𝑦

�𝛴𝑥 2 𝛴𝑦 2 28,96

√14x79,9755

= 0,86549

Grafik kematian A. salina (hubungan antara Log konsentrasi dengan mortalitas) ekstrak etil asetat 6

Mortalitas Probit

5

4,87

4,61

4

y = 3,709+0,479x r = 0,8654

3,36

3

4,87

2 1 0 0

1

2

3

Log Konsentrasi


Lampiran 14. Data Awal Zona Hambat Ekstrak Biji Teratai a. Aeromonas hydrophila Ulangan Pelarut

Konsentrasi

n-heksana

0 (DMSO) 50 60 70 80 Antibioktik (Klorampenikol) 0 (DMSO) 50 60 70 80 Antibioktik (Klorampenikol) 0 (DMSO) 50 60 70 80 Antibioktik (Klorampenikol)

Etil asetat

metanol

0

0

0

0

0

0

Ratarata (mm) 0

3,5 0,9 0,9 6,1 33,3

3,5 0,9 0,9 6,1 33,3

3,5 6,1 2,4 6,1 33,3

2,4 3,5 5,3 4,3 33,3

10,2 5,9 3,1 6,1 33,3

23,1 17,3 12,6 28,7 166,5

4,62 3,46 2,52 5,74 33,3

0

0

0

0

0

0

0

0 0 0 0 32,7

0 0 0 0 32,7

0 0 0 0 32,7

0 0 0 4,4 32,7

0 0 1,9 0 32,7

0 0 1,9 4,4 165

0 0 1,9 4,4 33

0

0

0

0

0

0

0

0 0 0 0 32,7

0 0 0 0 32,7

0 0 0 0 32,7

0 0 0 0 32,7

0 0 0 0 32,7

0 0 0 0 32,7

0 0 0 0 32,7

U1

Ulangan U2 U3 U4

U1

U2

U3

U4

U5

∑

b. Streptococcus agalctiae Pelarut

n-heksana

Konsentrasi

0 (DMSO) 50 60 70 80 Antibioktik (Klorampenikol)

∑

0

0

0

0

0

0

Ratarata (mm) 0

16,8 14,2 16,8 17,2 43,2

14,2 15,9 16,8 17,2 43,2

12,8 14,2 14,2 15,9 43,2

18,6 16,8 14,2 16,8 43,2

12,8 14,2 14,2 15,9 43,2

75,2 75,3 76,2 83 216

15,04 15,06 15,24 16,6 43,2

U5


Etil asetat

metanol

0 (DMSO) 50 60 70 80 Antibioktik (Klorampenikol) 0 (DMSO) 50 60 70 80 Antibioktik (Klorampenikol)

0

0

0

0

0

0

0

5,3 6,2 7,3 7,3 45,8

7,3 9,3 10,7 10,7 45,8

10,7 12,3 7,3 8,8 45,8

5,3 6,2 7,3 7,3 45,8

5,3 6,2 7,3 7,3 45,8

33,9 40,2 39,9 41,4 229

6,78 8,04 7,98 8,28 45,8

0

0

0

0

0

0

0

5,3 4,2 6,8 8,6 45,8

4,5 2,5 6,8 7,3 45,8

6,4 9,1 11,4 7,3 45,8

4,5 2,5 6,8 7,3 45,8

4,5 2,5 6,8 8,6 45,8

25,2 20,8 38,6 39,1 229

5,04 4,16 7,72 7,82 45,8

U1

Ulangan U2 U3 U4

c. Saprolegnia sp. Pelarut

n-heksana

Etil asetat

metanol

Konsentrasi

0 (DMSO) 50 60 70 80 Antibioktik (Nistatin) 0 (DMSO) 50 60 70 80 Antibioktik (Nistatin) 0 (DMSO) 50 60 70 80 Antibioktik (Nistatin)

∑

0

0

0

0

0

0

Ratarata (mm) 0

9 7 9 8 11,2

5 3 10 9 12,5

8 7 8 8 11,2

9 10 10 9 11,2

9 4 12 9 11,2

40 31 49 43 57,3

8 6,2 9,8 8,6 11,46

0

0

0

0

0

0

0

7 7 7 8 12,5

6 6 7 5 12,5

6 5 12 8 12,5

6 8 11 15 12,5

4 4 11 15 12,5

29 30 48 45 62,5

5,8 6 9,6 9 12,5

0

0

0

0

0

0

0

7 9 10 10 11,4

6 8 8 11 11,4

13 10 11 11 11,4

8 9 9 9 11,2

10 10 10 12 9,4

44 46 48 53 54,8

8,8 9,2 9,6 10,6 10,96

U5


Lampiran 15. Tabel Probit Menurut Vilchez dkk. (2001) Persentase 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 99

0 3,72 4,16 4,48 4,75 5,00 5,25 5,52 5,84 6,28 0 7,33

1 2,67 3,77 4,19 4,50 4,77 5,03 5,28 5,55 5,88 6,34 0,1 7,37

2 2,95 3,82 4,23 4,53 4,80 5,05 5,31 5,58 5,92 6,41 0,2 7,41

3 3,12 3,87 4,26 4,56 4,82 5,08 5,33 5,61 5,95 6,48 0,3 7,46

Probit 4 5 3,25 3,36 3,92 3,96 4,29 4,33 4,59 4,61 4,85 4,87 5,10 5,13 5,36 5,39 5,64 5,67 5,99 6,04 6,55 6,64 0,4 0,5 7,51 7,58

6 3,45 4,01 4,36 4,64 4,90 5,15 5,41 5,71 6,08 6,75 0,6 7,67

7 3,52 4,05 4,39 4,67 4,92 5,18 5,44 5,74 6,13 6,88 0,7 7,75

8 3,59 4,08 4,442 4,69 4,95 5,20 5,47 5,77 6,18 7,05 0,8 7,88

9 3,66 4,12 4,45 4,72 4,97 5,23 5,50 5,81 6,23 7,33 0,9 8,09


LAMPIRAN. Universitas Sumatera Utara

Recommend Documents