113
Lampiran 1 Analisis fitokimia a. Uji alkaloid Satu gram sampel daun digerus dan ditambahkan 1.5 ml kloroform dan tiga tetes amoniak. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan lima tetes H2SO4 2 M. Fraksi asam dibagi menjadi tiga tabung kemudian masing-masing ditambahkan pereaksi Dragendorf, Meyer, dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih pada pereaksi Meyer, endapan merah pada pereaksi Dragendorf, dan endapan cokelat pada pereaksi Wagner. b. Uji flavonoid Sebanyak 0.5 g daun sampel ditambahkan dengan methanol sampai terendam lalu dipanaskan. Filtrat ditambahkan dengan lima tetes H2SO4, terbentuknya warna merah karena penambahan H2SO4 menunjukkan adanya senyawa flavonoid. c. Uji saponin Sebanyak 0.5 g sampel ditambahkan air secukupnya dan dipanaskan selama lima menit. Larutan tersebut didinginkan kemudian dikocok selama ±10 menit dan bila menimbulkan busa menunjukkan adanya saponin. d. Uji triterpenoid dan steroid Satu gram sampel ditambahkan 2 ml etanol lalu dipanaskan dan disaring. Filtratnya
diuapkan
kemudian
ditambahkan
dengan
eter.
Lapisan
eter
ditambahkan dengan pereaksi Liebermen Burchard (tiga tetes asetat anhidrat dan satu tetes H2SO4 pekat). Warna merah atau ungu yang terbentuk menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau adanya steroid. e. Uji tannin Lima gram sampel ditambahkan air kemudian didihkan selama beberapa menit. Disaring dan filtrat ditambahkan dengan 3 tetes FeCl3, warna biru tua atau hitam kehijauan yang terbentuk menunjukkan adanya tanin.
114
Lampiran 2 Analisis klorofil dan antosianin Klorofil dianalisis menggunakan metode Sims (2002). Pelaksanaannya adalah sebagai berikut: sampel daun diambil menggunakan alat pelubang yang berdiameter 1 085 cm. Sampel dimasukkan ke dalam mortar kemudian diberi 1 ml asetris (aseton) dengan menggunakan mikropipet, sampel daun digerus dan ditambah 1 ml asetris (aseton) lagi. Setelah itu dihomogenkan, lalu dimasukkan ke microtube 2 ml setelah sebelumnya diberi label sesuai perlakuan. Kemudian dimasukkan ke centrifuge 14 000 rpm selama 10 menit, 1 ml supernatan dan ± 3 ml asetris dipipet ke dalam tabung reaksi dan dimasukkan ke dalam spektrofotometer (Vortex → λ 663, 647, 537, dan 470). Selanjutnya dilakukan perhitungan kandungan antosianin, klorofil (a dan b), dan karotenoid.
115
Lampiran 3 Analisis isoezim Analisis pola pita isoezim dilakukan menurut metode Wendel dan Weeden (1989). Enzim yang akan dianalisis adalah enzim peroksidase (PER), esterase (EST), dan asam Fosfatase (ACP). Tahapan analisis isozim adalah sebagai berikut: 1. Pembuatan gel pati. Gel pati yang digunakan mengandung 10% pati kentang. Pati kentang yang digunakan sebanyak 12 g dan buffer gel 120 ml. Pati dilarutkan dengan sedikit buffer gel dalam erlenmeyer, sisa buffer gel dipanaskan di atas hot plate sampai mendidih, kemudian ditambahkan ke dalam erlenmeyer yang berisi larutan pati tadi sampai habis dan larutan pati matang. Setelah itu, larutan divakum untuk menghilangkan udara dalam gel sampai gelembung udara habis. Gel lalu dituangkan secepat mungkin pada baku berukuran 10 cm x 15 cm, baki sebelumnya telah diolesi parafin cair dan lubang pada kaki baki ditutup dengan selotip. Gel lalu disimpan selama satu malam pada suhu 5 - 10ºC dalam lemari es. Buffer gel yang digunakan merupakan campuran 11.15 g tris, 2.7g asam sitrat, 200 ml buffer elektroda yang dilarutkan dalam 2000 ml H2O. Buffer elektroda merupakan campuran 11 875 g asam borat, 2 g NaOH, 1000 ml H2O dengan pH 8.3. 2. Ekstraksi enzim Daun muda sebanyak 0.2-0.5 g dimasukkan ke dalam mortar dan digerus halus dengan menambahkan pasir kuarsa sekitar 40 mg serta diberi buffer pengekstrak 1 ml. Ekstraksi enzim dilakukan dalam keadaan dingin di atas es untuk mencegah rusaknya enzim. Buffer ekstrak yang digunakan berupa campuran 5 g sukrosa, 1400 µM merkaptoetanol dan 100 ml H2O. Supernatan yang mengandung enzim diserap dengan memasukkan potongan kertas saring Whatman berukuran 0.5-0.7 cm ke dalam setiap mortar untuk menyerap cairan sel dari setiap contoh daun. Potongan kertas saring tersebut dilap menggunakan tissue untuk membuang cairan sel yang berlebih, selanjutnya potongan kertas saring tersebut disisipkan pada lubang gel yang tersedia.
116
3. Elektroforesis Selotip yang ada pada kaki cetakan dilepaskan kemudian gel yang telah disispi kertas saring dimasukkan dalam baki yang telah berisi buffer elektroda pH 8.3 sampai kaki cetakan terendam, selanjutnya disimpan dalam ruang pendingin. Elektroforesis awal dilakukan selama 30 menit pada 100 volt dan elektroforesis tetap pada 200 volt selama 4 jam. Untuk mengontrol jarak migrasi, salah satu lubang diberi penanda bromfenol biru. 4. Pewarnaan dan fiksasi. Setelah selesai elektroforesis, gel dibelah menjadi tiga bagian pada posisi horizontal di atas alat pemotong. Sebelumnya kertas saring dikeluarkan dari lubang-lubangnya. Lembaran gel dimasukkan ke dalam nampan yang masingmasing telah diberi larutan pewarna dari enzim yang telah disiapkan sebelumnya sampai gel terendam. Gel dalam baki diinkubasi pada suhu ruang sampai muncul pita yang cukup jelas pada gel. Metode pewarnaan yang digunakan adalah menurut Soltis dan Soltis (1992). Komposisi larutan pewarna untuk sistem enzim PER adalah campuran dari 100 ml buffer asetat pH 4.8 - 50 mg CaCl2, 0.05 mg 3-amino-9 etil karbazol (dilarutkan dalam 3 ml aseton), 150 mg MgCl2, dan 100 ml tris HCl pH 8.5, 20 mg NAD, 300 mg asam malat, 20 mg MTT, dan 4 mg PMS. Larutan pewarna untuk EST adalah campuran 0.05 M fosfat pH 6.0 5ml, aquades 45 ml, S 20 mg, β-Namhtyl acetate (yang dilarutkan dalam aseton) 20 mg serta garam Fast Blue RR 50 mg. Selesai pewarnaan, gel dicuci dengan air mengalir sampai bersih. Kemudian potongan gel difiksasi dengan 50% gliserol atau dengan campuran etanol : aquades : asam asetat : gliserol = 5 : 4 : 2 :1. 5. Dokumentasi Setelah dicuci dan difiksasi, gel dipindahkan dari baki ke tempat pengamatan menggunakan plastik transparansi. Pola pita yang muncul digambar di kertas dan difoto. Pengamatan terhadap analisis isozim tanaman krisan yang diuji dilakukan dengan cara deskripsi yaitu dengan menginterpretasikan pola pita yang terjadi.
117
Lampiran 4 Komposisi Media WPM Bahan Kimia (NH4)2SO4 NH4NO3 NaNO3 KNO3 Ca(NO3)2.4H2O CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O Na2SO4 KH2PO4 NaH2PO4.H2O KCl FeSO4.7H2O Na2EDTA FeCl3.6H2O Fe2(SO4)3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O H3BO3 KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O NiCl2.6H2O AlCl3 Myo-inositol Niacin Pyridoxine-HCl Thiamine-HCl Glycine Ca D-pantothenat Sucrose Sumber: Gunawan (1992).
Mg/l 400 576 96 370 170 27.8 37.3 22.3 8.6 6.2 0.25 100 0.5 0.5 1.0 20000
