LABORATORNÍ HEMATOLOGIE V PŘEHLEDU

Miroslav Pecka

LABORATORNÍ HEMATOLOGIE V PŘEHLEDU Fyziologie a patologie hemostázy

2004

Recenzenti: prof. MUDr. Ladislav Chrobák, CSc. prof. MUDr. Miroslav Penka, CSc.

© Doc. RNDr. Miroslav Pecka, CSc., 2004 Autor: Doc. RNDr. Miroslav Pecka, CSc. II. interní klinika - Oddělení klinické hematologie Fakultní nemocnice, Hradec Králové a Katedra interních obor ů Lék ařské fakulty University Karlovy, Hradec Králové Fotodokumentace: Irena Šulcová Technická spolupráce: Martina Tomšíková Grafická spolupráce: Ing. Eliška Slezáková Vydal a vytiskl: tiskárna ~ FlNIDR, s. r. o., Český Těšín , 2004 Litografie: Infiniti art, s. r. o., Český Těš ín Vydání této publikace p odpořili : A. L. Instruments, s. r. o., Český Těšín Biovendo r, s. r. o., Brno Biogenix , Praha Distribuce: Hk Credit ISBN (3. díl) 80-86682-03-X ISBN (soubor) 80-86682-00-5 ISBN ( l. díl) 80-86682 -0 1-3

OBSAH

Úvod

11

1. CÉVY, CÉVNí SYSTÉMY A ENDOTELOVÉ BUŇKY 1.1 Cévní systém (schéma, tlaky, distribuce krve) 1.1.1. Rozlo žení tl aků v cévních systémech 1.1.2. Distribuce krve do orgánů a cév

13 13 14

1.2. 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.3.1 1.2.4. 1.2.5.

Cévy Tepny (arterie) Tepénky (art erioly) Vlásečnice (kapiláry) Funkce vlásečnic (kapilár) ". Zilky (venuly) Žíly (vény)

15 15 15 15 16 18 18

1.3. 1.4. 1.5. 1.5.1. 1.5.1.1. 1.5.1.2. 1.5.2.

Struktura cévní stěny Změna průsvitu cévy Endotel a endotelové buňky Vznik a vývoj endotelových buněk Funkce endotelových buněk Aktivity endotelových bun ěk Známky poškození nebo aktivace endotelu

19 21 22 22 22 23 24

2. FY ZIOLO GIE HEMOSTAZY 2.1. Hemostáza (sr ážení krve) 2.1.1. Hemo stáza od narození do dospělosti 2.1.1.1. Fetdlni a neonatdlni hemostdza 2.1.1.2. Hemostdza dětského věku 2.1.1.3. Hemosuiza pozdního věku 2.1.2. Složky hemostázy 2.1.2.1. Cévní stěna 2.1.2.2. Složka tkáiíová 2.1.2.3. Krevní destička 2.1.3. Kontakty mezi krevními a endoteliálními buňkami 2.1.4. Úloha některých adhezivních proteinů v hemo stáze 2.1.5. Mechanismy hemo statických procesů

26 27 27 27 28 28 28 29 30 30 30 32

5

hemokoagul a čn ích procesů

2.1.6.

Dynamika

2.2. 2.2.1.

Primární hemostáza Průběh tvorb y primární

2.3. 2.3.1. 2.3.2. 2.3.2.1. 2.3.2.2. 2.3.2.3. 2.3.2.4. 2.3.3. 2.3.4. 2.3.4.1. 2.3 .4.2. 2.3.5. 2.3.5.1. 2.3.6. 2.3.7. 2.3.7.1. 2.3.7.2. 2.3.7.3.

Plazmatický koagulační systém Historie vývoje názorů na proces hem ostázy Ko agulační faktory

2.4. 2.4.1. 2.4.2 . 2.4.2.1. 2.4.2.2. 2.4 .3. 2.4 .4. 2.4.5. 2.4.5. 1. 2.4.5.2. 2.4.6. 2.5. 2.5.1. 2.5.1.1. 2.5.1.2.

destičkové

34 35 35

zátk y

Setino v ě p rotedzy

Kofaktory Substráty Koagulačně aktivní

komplexy Popis, stru ktura a funkce plazmatických koagu l. Přeměna protrombinu na trombin Vnější (extrinsic) systém Vnitřní (intrinsic) systém Přeměna fibri nogenu na fibri n Pieměna fibrin ogenu na nerozpu stn ý fib rin Úloha trombinu v hernokoagulaci Nový pohled na ko agulačn í děje v ' fá 1lll.C l.ťl. Cll l aze A mplifikační fáze Propagační fáze

Fibrinolytický systém Plazminogen Aktivátory plazminogenu Vn itřn í Vnější Přeměna

plazrninogenu na plazmin Plazrnin Štěpné produkty fibrinogenu a fibrinu Štěpen í fibrinogenu a rozp ustného fibrinu Štěpen í nerozpustn ého fibrinu Aktivace fibr ino lýzy

Systémy inhibitorů hemostázy Inhibitory koagu lace a fibrinol ýzy Inhibito ry plazmatickéh o Inhib ito ry fibrinoiyzy

koagulačn ího

6

systém u

faktorů

38 38 39 40 44 44 44 48 65 66 67 70 70 72 74 . 75 80 80 87 87 89 89 89 91 92 94 94 94 96 98 99 99 116

2.5.2. 2.5.3.

Inh ibito ry s nespecifickým i vazbami Získané inhibitory

123 125

3. VYŠETŘOVACí METODY HEMOSTÁZY Přístroje a techniky používané v hemostáze 3.1. Koagulační 3.1.1. Zákalové (nefe lometrick é, turbidimetrické ) 3.1.2. Spektrofotometrické metody (chromogenní substráty) 3.1.3. Imunochemické metody . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1.4. 3.1.4.1. 3.1.4.2. 3.1.4.3. 3.1.4.4. 3.1.4.5. 3.1.4.6. 3.1.5. 3.1.6. 3.1.7.

ELiSA (enzymimunoanaiyra) E1D (elektroimunodifuze) LiA (světelná nebo laserová imunoanalyza ) R1A (radioimunoanalyza ) Latex - aglutinační testy Hemaglutina čni testy Gelifikační testy Průtoková cytometrie peR (polymer ázov á řetězov á reakce)

3.2. 3.2.1. 3.2.2. 3.2.2.1. 3.2.2.2.

Typy koagulačních stanovení Manu ální Přístroje (koag ulornetry) Optické Elektro mechanické

3.3. 3.3.1. 3.3.2. 3.3.3.

Testy používané v hemostáze Glob ální testy Skupinové testy Specifické

3.3.3.1. 3.3.3.2.

Me tody ke stanoveni fibrin ogenu Funkčn í ak tivita složek koagulačního a fi brinolytického sy stému Odlišen í defi cience faktorů od přítomnosti inhibitor/i

3.3.3.3.

4. PATOFYZIOLOGIE HEMOSTÁZY 4.1. K rv ácivé stavy 4.1.1. Krv áci vé stavy z cév ních příčin (purpury) 4.1.1.1.

Vrozené purpu ry 7

13 1 131 131 132 134 134 134 135 135 135 136 136 136 136 137 137 137 137 137

.

139 139 142 147 147 148 151

153 153 154

4.1.1.2. 4.1.2. 4.1.2.1. 4.1.2.1.1. 4.1.2 .1.2. 4. 1.2.1.3. 4.1.2.1.4. 4.1.2.2. 4.1.2.2.1. 4.1.2.2 .2. 4.1.2.3. 4.1 .2.3.1 . 4.1.2.3.2. 4.1.3. 4.1.3.1. 4.1.3. 1.1. 4.1.3.1.2. 4.1.3 .1.3 . 4.1.3.2. 4. 1.3.2.1. 4.1.3 .2.2 . 4.1.3 .2.3. 4.1.3 .2.4 .

4.2. 4.2.1. 4.2.1.1. 4.2.1.2. 4.2.1.3. 4.2.2. 4.2.2.1. 4 .2.2.1.1. 4.2.2.1.2. 4 .2.2.1.3. 4.2.2.2. 4.2 .2.2.1. 4.2.2.3.

Získané purpury Krváci vé stavy z poruchy krevních destiček Trombocytop eni e TROMBOCYTOPENIE z NEDOSTATEČNÉ PRODUKCE TROMBOCYTŮ T ROMBOCYTOPENIE ZE z VÝSENÉ DESTRUKCE TROMBOCYTŮ TROMBOCYTOPENIE ZE ZvýSENÉ KONZUMPCE TROMBOCYTŮ TROMBOCYTOP ENIE ZE ZTR ÁT TROMBOCYTŮ

Trombocyt opatie VROZE NÉ TROMBOCYTOPATlE . .. . . . . • . • • • • . . . . . . . . • • . • . . Z ISKANÉ TROMBOCYTOPATIE

Trombocyt oza. TROMBOCYTÚZA

. .. . . . . . . .. • . . . . . . . . . . .. . . .

trombocyt ěmie . . . .. .. . . • . .. . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . ..

T ROMBOCYTÉMIE . . . . . . . .. • . . . . . . . .. • . . . . . . . . . . . . . . .

Koagulopatie Vrozené koagulopatie H EMOFILI E VON WILLEBRANDOVA NEMOC . • . .. . . . . . . . . .. .. . . . . . . . . . D EFEKTY OSTATNlcH FA KTORŮ . . . . . . . . . . • .. . . . . . . . • • . • . .

Získané koagulopatie P ORUCHY RESO RBCE A VYUŽ IT/ VITAMINU K A UTOIMUNITNI AALOIMUNITNI KOAGULOPATIE O STATN/ ZISKANÉ POR UCHY KOAGULACE KRVÁCIVÉ STAVY Z JINÝCH PŘIČIN

Trombotické a trombofilní stavy Trombotické stavy Venózní trombózy Arteriáln í trombózy Laboratorní markery tromb ózy Trombofilní stavy Vrozené (kongenitdlni} trombofilni stavy R EZISTENCE NA AKTIVOVANÝ PROTEIN C ( A P C - R) D EFEKT

2021 OA

ALELY PROTROMBlNU

HYPERHOMO CYSTEINÉMIE

. . . . • .. . . . . .. . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . •. . . . ..

Získané trombofilni stavy A NTIFOSFOLlPIDOv ý SYNDROM ( A P S )

Sekundární (pti dru žene) trombofilni stavy

8

155 156 156 158 159 162 164 166 167 170 170 170 171 171 172 172 177 179 182 183 184 184 185 191 191 194 195 197 198 199 200 202 202 204 204 205

4.3. 4.3.1. 4.3.2. 4.3.2.1. 4.3.2.2. 4.3.2.3. 4.3.2.4. 4.3.2.5. 4.3.2.6. 4.3.3. 4.3.3 .1. 4.3.3.2. 4.3.3.3 4.3.3.4. 4.3.3.5. 4.3.4. 4.3.4 .1. 4.3.4 .2. 4.3.4.2.1. 4.3.4.2.2 . 4.3.4.3. 4.3.4 .3.1. 4.3.4 .3.2. 4.3.4.4. 4.3.4.4. 1. 4.3.4.4.2 .

Antitrombotická léčba Monitorování léčby

208 208 Antikoagulační léčba 209 Nepřímé inhibitory trombinu 209 Ptim ě inhibitory trombinu 213 Potlačení geneze fakto r ů závislých na vitaminu K 214 Monitorování antikoagulační léčby kumariny 215 Monitoro vání antikoagula čni léčby preparáty heparinu 216 Monitorování léčby hirudin em 219 Trombolytická léčba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 220 Mechanismus trombolýzy 220 Trombolytika 221 Nepiim átrombolytika 221 Piinui trombolytika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 223 Monitorování trombolytick ě léčby 225 A ntiagregační léčba 225 Blokáda adheze destiček na subendoteli álni matrix 226 Blokáda aktivačních cest a cyklil 226 B LOKÁDA ENZYMŮ CYKLU KYS. ARACHIDONOVÉ 226 BLOKÁDA MEMB RÁNOVÝCH RECEPTORŮ KREVNICH DESTIČEK 228 Blokáda agregace destiček blokátory GP lib/lila 229 B LOKÁTORY RECEPTORŮ GP lIb/lIla 229 B LOKÁTORY AKTIVÁTORU AGREGACE KREV. DESTIČEK - TRO MBINU . . 230 Monitorování antiagrega čni léčby 230 SLEDOVÁNI INHIBICE AGREGAČNI KŘIVKY STIMULOVANÉ KOLAGENEM . 230 S LEDOVÁN/INHIBICE AGREGAČNI KŘIVKY S PROPYLGALÁTEM . . . •.. 230

Seznam použitých zkratek

233

Rejstřík

238

9

ÚVOD Po delší úvaze piedklddám širší odborné veiejnosti se záj mem o laboratorní hema tologii knihu La boratorní hematologie v přehledu (3. dil) - fyzio logie a patofyziologie hem ostdzy . Proti p ůvodnim u záměru jsem piesko čil část, kte rá se týká" ultrastruktury, morfolog ie, fy ziologie a patofyziolog ie krevních buněk" . Tato kniha by měla být publikována během Česko-slovenských dmi laboratorní hematologie v roce 2006. Piikročil js em k tomu zej ména z toho důvodu, že v posledních n ěkolika letech došlo k významnému pokroku v odhalování hemo statickych procesů, a tak i tato obla st se v mnoh ém dostává do roviny mol ekulárních proces ů a vzáje mné interakce mezi buiikami či buiíkami a prostiedim. O těchto souvislostech j e j en málo zmínek v so učasn ém českém písemnictví. V této knize se věnuji zejména cévnímu systému, vztahu mezi endoteletn a hemostdzou. aktivaci koagulačních faktor ů , vzniku koagula čn ě aktivních komplex ů a toto dá vám do spojitosti s klasickými a novými modely hemostatickych pro cesti. V další části se věnuji problematice flb rinolyzy, inh ib itorů krevního srá žení a jejich p iiměmu zásahu v oblasti aktivova né hemostdzy. V části za měieně na pa tofyziologii hemost ázy se zabývám pťičinami vzniku dan ého onemocn ění a laboratorními testy. Nezam ěiuji se na klinické aspekty související s diagnostickou rozvahou a strategií l ěčby. V první čás ti popisuji krvácivé stavy z různycti piičin (cévní stěna, krevní des tička, koagulopatie), dále trombotické a trombofilni stavy a možnostmi j ejich léčebného monitorování. Samostatn ý oddíl j e věn o ván metodám a piistrojo v ě technice využitelné pN sledování změn hemo statickycli m echanism ů . Kniha vycház í Z mých více než 27letých zkušeností s laboratorní problematikou oboru klini cké hematologie a volnou formou nava zuje na již diive vydané publikace" Pieh led laboratorní hematologie I- IV". Ch těl bych využít této piiležitosti a poděkovat prof MUDr. Jarosla vu Ma lému , CSc. za celoživo tní spolupráci a nezištné ptiitelstvi. Je p ro mně milou po vinností pod ěkovat i ob ěma recenzent ům prof MUD,: Lad islavu Chrobákovi, CSc . a prof MUDr. Miroslavu Penkovi, CSc. za jejich velmi kva lifikovanou, d ůslednou a p ečli­ vou recenzi této knihy. Poděkování patii dále Martin ě Tomšíkové za včasné a ry chl é vypsání a seiazeni jednotlivých statí a pomoc pii úpravě obrdzk ů . Ro vn ěž j sem velmi zavázán paní Ireně Šulcové za perfektni pie vedeni obrdzků do elektronické podoby a j ejich kopírování, ing. Elišce Slezáko vé a Mgr: Filipu Vrbackému za z/totoveni digitálních fotografií a g rafů k jednotlivým statím této knih y. Firmám A.L. lnstruments a HK Credit, piedevšim panu ing. L. Cimal ovi a panu ing. J. Michálkovi a dalším firmám děkuji za podporu pii vydání a piipadn ě dist ribuci této knihy. Na závěr bych ch těl poděkovat i všem dalším spo lupracovniků nt, laboran tkám a l ěka iům za jejich pochope ní pro mou práci a své rodině za trp ělivost, kterou mi poskytovala po celou dobu sepisování j ednotlivých statí.

V Hradci Králo vé, zdi ! 2004 Miro sla v Pecka II

1. CÉVY, CÉVNÍ SYSTÉMY A ENDOTELOVÉ BUŇKY 1.1. Cévní systém (schéma, tlaky, distribuce krve) Cévy , to není jen jakýsi "potrubní systém", pro rozvod oky slič en é krve a jej í návrat po p řed ání kys líku tkáním. Cévní stěna je jednou s velmi d ůl ežitých složek hemostatického procesu a to zej ména její s tyč n á plocha s krevní m řečiš­ těm - endotel.

V krevním oběhu můžeme rozlišit: O tepenný rozvod (vyšší tlak) - rozvádí oky slič enou krev ze srdce do tkání O žilní rozvod (nižší tlak) - sbírá tekuti nu z tkání a odvádí odky sli čenou krev k srdci a k plicím.

l~t~:i6~ -IH-'~=5 truncus -llf-~~

coeJiacus

Tepenný (červeně) a žilní rozvod (modře)

a. brachlalis a. hepa tica co mmu nis

V. femoralis

SCHÉMA CÉV NÍHO SYSTÉMU O Za prům ěrny lidský život se srdce smrští asi 2,5 miliardkrát a p ies cévy pie čerpá

asi 145 milion ů litr ů krve. O Vyšší rychl ost krevníh o toku je v arteriích. O lýšší ry chlost krevního toku je ve vnit ťnich částech cév. O Erytrocyty proudí ve vnitinich částech cév, kdežto trombocyty podél cévní

Vláseč n ice

Kapilár)-

Venózní cévní systém

stěny.

13

Arteriální cévní systém

SCHÉMA KAPILÁRNÍHO ROZVODU

1.2. Cévy 1.2.1. Tepny (artérie)

Žíla

Mají průměr kolem 2-3 cm a silné a pružné s těn y složené ze 3 vrstev: • vnitřní - vystlaná endotelem • střední - hladké svaly, kolagenní vlákna a fibroblasty • zevní - fibroelastické vazivo, cévy vyživující artérie a nervy

vnltřnl elastick á lamlnOL

e ndo tehum

flbrokolagennl~ tun ice mt lm a t k áň

~/~. hlad~:~::o;;~~;a::~ ::: ~\~ lamn ou

,

. : - : - - - :~kolagelYll

•

.,

.

_6;;~~-'-

Řez

Tato struktura umožňuj e tepnám vyrov- Gdi;;;:;;;O;;;;O;:;;;:------:;;-.......,~~~~;;j návat velké tlakové rázy vznikající při každém srdeč n í m stahu. Svaly tepenné stěny jsou pod kontrolou nervového systému, který říd í kontrakci nebo dilataci tepny.

Tepna

1.1.1. Rozložení

tumca advcnl ilia

arter ií - schéma

tlaků

Tlak v cévách smě ­ rem od srdce k systému kapil ár p o stupn ě klesá z hodn oty kolem 100 na hodnoty 25 mmHg .

v cévních systémech Řez Systémová cirkulace vyššl tl ak

.. u

~

o"

arterií (vlevo) a vénou (vpravo)

Plicnl c irkulace nižš l tlak

CD

~

~

:§ ~

...J

'"

'"

O g.l;J -""~ .>e

>

120

100

m

1.2.2. Tepénky (arterioly) Artérie se větv í uvnitř tkání na menší tepénky (arterioly), jejichž stěny mají mévaziva a vy tv ořeno u vrstvu hladké svaloviny. Svaly arteriol jsou řízeny vegetativními nervy. Arterioly jsou místem hlavního odporu se kterým se při svém toku krevním řeči štěm krev setkává - periferní odpor. ně

40

Kre vní tlak y v systémové a plicní cirkulaci

1.1.2. Distribuce krve do Krev v jednotlivých orgánech a čás tec h cévního systému není rozložena rovnom ěrně. Nejvíce krve se nachází ve vénách (64 % obje mu krve), nej méně v kapilárách (při ­ bli žn ě 5 % objemu krve).

orgánů

a cév 7,0%

9,0%

14

• vény O plíce O kapiláry [::J velké arterie O malé arterie a arterioly srdce (diastola)

Menší (vlevo) a

větší

(vpravo) arteriola - schéma

1.2.3. Vlásečnice (kapiláry) Z tepének mů že přech ázet krev do žilek v láseč n i ce m i (kapilárami). V l á sečni ce mají průměr blízký průměru lidského vlasu. Množství v láseč n i c , kterým je tkáň vy15

baven á závisí na i n te nzi tě jejího metab olismu . Jedna arteriola se mů že větvi t až do I00 vlásečni c .

1?~~"'.i.fli~""il;'~fiJ.\ :.u."rlff~

Ve ven ázni část i kapil áry je krevní tlak nízký, nižší než os mo tický tlak kre vn ích bílkovin - tzv. onkotický tlak. Dochází proto k nasá vání tekutiny do kapil áry. Při poruše této rovnováhy dochází ke vzniku otoků (edémů). KAPILÁRA VENÚZNÍ ČÁSTI

St ruktura kapilár - tenk ý

řez

tkán í

1=='=:2=..:1-..!:L_~:'=:=----,~l.:lo....--!;---i.LJ

O V kosterním svalu prochází krev za klidu v oblasti o pr ů iezu I mm 2 asi 200 kapilárami, v dob ě maximálníh o výkonu až 2 500 kapilárami. O V těle člo věka j e asi 90 km vlásečnic.

J.2.3. J. Fun kce

vlásečn ic

(ka pilár )

živin a zplodin metaboli smu mezi krví a tkán ěm i se v kapil árách . Stěn y kapilár j sou složeny z jedné vrstvy end otelových buněk. Maj í právě tak ový průřez , že se jimi musí pohybovat krvinky v řadě za sebo u. Mezi ka piláram i a extrace lulární tekutinou doch ází k usta vení ro vnováhy mezi objeme m kr ve a m ezibun ě čn é tekutiny. Vlastní

vý měn a plynů,

u skute čňuj e

o

V kapilárách dochází k výrazné látkové vým ěn ě, která se u skute čiiuje na velké ploše vymezené endoteliálni zónou kapil ár: Napii plocha kapilár sva l ů dosp ělé­ ho člověka dosahuje rozm ěrů 6400 m2 . O V lidském organizmu j e síť zhruba 10 miliard kapil ár; ve kterých je v daném okamžiku so ustieděno asi 5 % celkového množství krve. SCHÉMA OKYSLIČOVÁNÍ A VÝMĚNY LÁTEK MEZI VLÁSEČNICEMIA TKÁNĚMI Vlásečnice

Kapiláry V arteriální části ka piláry je krevní plazm a p ůsoben ím krevního tlaku filtro vána přes kapil ární s těn u , tak že čás t tekutiny přech á zí do mezi bun ě čn ého pro storu. Krvinky a bílkoviny z ůs tá v aj í v k apiláře.

od srdce

C02 metabolity

02 živiny Tkáně

KAPILÁRA ARTERIÁLNÍ ČÁSTI

o

V kapilárách kyslík opouští če rvené krvinky, prostupuje tenkými stěnam i kapilár a difund uje intersticiální tekutinou až k jednotlivým buiíkdm : Opa čným směrem prochází CO2, O Z krve do tkání pronikají rovn ěž výživné látky, zatímco opačným sm ěrem p rostupují odpadní a vedlejší produkty (napi: m očo vin a ) . O K org án ům, které produkty látkové přeměny a odpadové látky b uď vylu čují nebo zne ško diiuji patří: ledviny, plíce, játra, slezina a j iné.

16

17

1.2.4. Žilky (venuly)

1.3. Struktura cévní stěny

Krev z perifern ího kapilárního pro krvení se sbírá do žilek a odtud do žil.

Cévní stě na je tvořena intimou, médií a adventicii. Infima se skládá z jedné vrstvy endoteliálních buněk uložených na bazální membrán ě (BM). Cévní endotel vytváří styčnou plochu mezi cirkulující krví a tkáněmi. Monocelulární vrstva tenkých plochých endotelií s p očívá na bazální membrán ě, která spolu se subendoteliální plochou vytváří sekundární bariéru přech odu tekutin, makrom olekul a formovaných elemen tů Prů řez cévní stěnou do extracelul árního prostoru. Subendoteliální bazální membr ánu tvoří látky známé jako extracelulámí matrix (EC). Její hlavní s o učás tí je kolagen typu IV a V, elastin a mikro fibril y spolu s glykoproteiny (GP) a dále lamininem, entaktinem, vitronectinem a von Willebrandovým faktorem. Hlavním proteoglykanem BM je heparan sulfát.

1.2.5. Žíly (vény)

Příčný řez

Žíly mají tenč í stěny než tepny a obsahuj í málo svalových vláken. Pouze v žilách kon če­ tin, které musí udržet velký hydro statický tlak krve, mají s tě ny žil sil nějš í vrstvu svalovi ny. V žilách j sou vytvořeny ch lopně, které dovolují krvi proudit pouze ve s měru od tkání k srdci. Z žil se krev vrací horní a dolní dutou žilou do srdce.

venulou

endote lium

fibrok olagenni tká ň - Iun i ca adven titia

L-

,;-'--

-4-._

hladky sval - tunica medi a

-

-

......... flbro kolaqenn l tkáň - tunica intima

Véna - schéma

O Subintima malých a vel-

"""",..,

•-

_

.-

kých cév (prostor pod ::..-=.., -;. BM) obsahuje žírné buiiendotell8lnl o o e.drscerulárnl malrix ky, které syntetizují bazalni membrána 8ubendotellum a skladují heparin, histavn"'nl elastická membrána min, seroto nin. bunky hladké svaloviny O Média j e ohrani čena vnitinůn a zevním elastice lastlcká mem br ána kým listem (lamina) a j e tvo ie na hladkým sva l- l:....~......:J/;;;w;;llE====3iOil;;;:.II:::z=d-=---.J buňky

vn ějAI

Podélný

řez

cévou

stvem obklopeným pojivo vou tkání. Obsahuje kolagen typu I a Ill, elastická vlákna, glykozaminog lykany, strukturální glykoproteiny. Zodpovídá za elasticitu a tonus cévy. Pomocí elastic kých vláken a hladké svaloviny zajišťuje změn u průs v itu cévy. O V adventicii j sou fi broblasty (syntéza pojivové tkán ě), adipocyty (syntéz a lipidů ) a nachází se zde i žírné buiiky: O Za subendotel pova žujeme obecně cévní stěn u mimo vrstvu endotelovych bun ěk. U do sp ěl ého jedince představuje cévní endotel přibližně 1 % hmotnosti těla a plochu kolem 5 000 rn-. V porovnání s velkými cévami se podíl ploch y endotelu na je dnotku krevního objemu v mikrocirkulaci mnohon á s obně zvětšuje. Mikrocirkulace představuje hlavní prostor, ve kterém se p ůsobeni endotelu uplatiíuje. Neporuše ný a n e sm áči vý endotel je nejlepším proti srážlivým pro střed ím . 18

19

Protisrážli vě působí:

O O O O O

elektronegativni náboj povrchu endoteli álních buněk glykosaminoglykany (heparan sulfát a heparin jsou přímo tvořeny endotelem) piirozeně inhibitory krevniho srážení vázané na povrchu endotelu ( např. AT) receptory membrány (trombomodulin) prostacyklin (je syntetizován v cév ním endotelu)

1.4.

Změna průsvitu

cévy

Hybno st (motilita) cévní stěny může být vyvolána dvěm a mechani smy: • p ůsobky uvolněnými z endotelovyclt buněk • neurovegetativn ůn systémem. Tento systém ovlivňuj e reflex ně stimulaci nebo inhibici pů s obků , kter é mohou ovlivnit změn u prů svitu cévy Cévní tonus je regulován různými mechanismy : • Hlavní úlohu zde hrají systémy angiotensinlrenin (působení přes AT1 -receptory uvolněn í Ca2+) _ vyvolá vazokonstrikci

Ca 2 + kaná ly

L

.:=====--

-.J

Přenos signálu pomocí AT I-receptoru

•

Systém oxidu dusnatého (NO), který vyvolá vazo dilataci aktivací enzymu guanylátcyklázy. O NO j e plynn ásubstance, která se tvoi i v endotelu oxidací aminokyselin)' argininu -Arg. Snadn o difunduj e Z endotelu do hladk ého svalu, kde akti vuje enzym guanyl átcykldzu. Tento enzym ve zvýšené míle produkuj e cyklický guanozinmonofosfát (cGMP J, který vyvolá snížení koncentrace nitrob un ěčn ěh o vápníku, sníží se kontrakce a dochází k vazodilataci. NO proniká rovněž do tromb ocytů, u kterých také snižuje kontraktilni pochody podobným mechanismem, tím tlumí adhezivní a agrega čn í procesy krevních destiček.

Změna průsvitu cévy nastává při vazokonst rikci nebo vazodila taci: • Vazokonstrikce má extrémně rychlý průběh, který může velmi efektivně zabránit krvácení hlavn ě v malých cévách, ale nem ů že zamezit krvácení v cévách vě tš ích . Zde se uplatní hl avn ě systémy krevních desti ček (adheze a agregace). Vazokonstrikce před­ Normální céva (nahoře) stavuje komplexní interakci mezi nervovým a vazokonstrikce (d ole) systémem, sva lový mi , - - -- - - -- - - - - - - - - - - - ----, vazodilata ce vazokonstrikce bu ňk a mi a n ěkterým i angiotenzinogen kininogeny mediátory, jako je serokalikrei n ) tonin, adrenalin, noradrenln renalin a jiné.

1- [

~l-I

,.----..,_1_ ['-----~l - I - ---------angiotenzin I

•

20

Vazodilatace je vyvolána prostaglandiny, hlavn ě prostacyklinem I.

bradykinin

ACE

agiotenzin II

21

ina ktivni ště py

bradykininu

1.5. Endotel a endotelové

buňky

End otel tv oří funkčn í a dynamický netrombogenn í povrch lumina cév ajeho poškození mů že být p říč inou zá nětu , trombózy nebo ateros klerózy. U do spělého jedince představuje end otel přibli žně 1 % hm otnosti těla a plochu kolem 7 m2 (Cines a spol. , 1998). Endotel mimo jiné reguluje cévní tonu s, průtok krve a permeabilitu kapilár, pr oliferaci bun ěk hladkého svalu i hemostázu (Poredoš, 2001). Endotel sehrává klíčovou roli v regul aci hemostá zy, jak prostřednictvím exprese vazebných míst pro prokoagul ační , tak i antikoagul ačn í č i n i tele na svém povrchu , č i tvorbou a u v olň o váním řady biologicky aktivníc h látek (Hudeček a spo l., 2004) . ANGlOGENEZE

Formace

Bazální membrána - kolagen IV -Iaminin

Degradace bazální membrány ~

růstu

)

/

Migrace -................

pokrý vá v ni třn í povrch všech céva tvoří fyzi kální překážku mezi krví a cév ní s tě­ nou. Dnes se předpokl ád á, že endotelové bu ň ky mají i výz namné výkonné a reg ulační funk ce, které vyplývaj í z jejich sekrečn ích aktivit a schopnosti m ěnit tyto aktivity v závislosti na signálech přich ázej ících z kardiovaskulárního, imunitního a nervového systému (Schni tzet; 1997). Podle současných poznatků se považuje cévní endotel za rozsáhlý a velmi aktivní endokrinní orgán, který zodpovídá za mnoh é ž i v o tn ě důl ežité funkce organismu ( Fe rančik a spo l., 1997). End otelové buňky mají velmi č ilo u bios yntézu bílkovin. Endotel umožií.uje výměn u kyslíku , tekutin a makromolekul mezi krví a tkán ěm i , udržuje rovnováhu mezi stimulací a inh ibicí rů stu cév, mezi vazokonstrikcí a vazo dilatací, rozhoduje o adhez i krevních elementů , podílí se na metaboli smu lip oproteinů a významně ovlivňuje procesy hemostázy (Davies, 1993). Účastn í se rovněž i na meta stázování solidních n ádorů. Endotelové buňky plní v organizmu tyto funkce: • zajišťují ne smáčivý (netrombogenní) povrch céva kapilár • udržuj í lumen cév otevřený a průchodn ý • podílejí se na regulaci vazomotoriky cév (d ůl ežité pro krevní tlak a průtok krve) • podíl ejí se na funkci t rombo cytů a hem ostáze

1.5.1.2. Aktivity endotelových buneK •

Mitóza ,....-..........

•

1.5.1. Vznik a vývoj endotelových

buněk

B ěhem embryon áln ího vývoje se endotelie diferencují z prekurzorových buněk, které j sou pra vděpodobn ě toto žné se subpopulací hem opoetických CD34+ kmenových bun ěk . Tyto .Jiemangioblasty" se mohou i v do sp ělo sti mobili zov at z kostní d řeně do periferní cirkulace, kde se podílejí na angiogenezi (Poredoš, 2001) .

1.5.1.1. Funk ce endotelovýc h D říve

se

předp okl ád al o ,

buněk

•

že endotelové

b u ňky

22

pouze

vy tváří

inert ní vrstv u, kter á

selektivní propustnost endotelu pro molekuly a buňky z cirkulace do okolního prostředí. Endotelov é buňky mají schopnost běh em n ěkolika minut revers i b il ně m ěn it svoj i archit ekturu a tím i veliko st mez ery mezi sebou. Touto mezerou pak prochází makromolekuly a buňky do mimocévního pro storu. schopnost endotelu syntetizovat a vylučovat množství mediátorů a cytokinů. Tyto pů s obky regulačn ě zasahuj í do kardiovaskulárního a imunitního systému. Endotelové buňky mají na své m po vrchu receptory pro cytokiny, leuk oadhezivní molekul y, chemotaktické faktory a neurotransm itery (Esmon, 2000). Endotelové bu ň ky mají intenzivní metabolismus . Je u nich rozvinut cykl us kyse liny arachid onové a jsou schopny syntetizovat a u volň ov at substa nce, které: • způ s obuj í změnu prů sv itu cévy (pros tacyk lin a oxid dusnatý, dří ve označ o­ vaný jako EDRF: endothelium - derived relaxin g factor). Vazodil atace a vazoko nstrikce js ou velmi důležité pro udr žení krevního sráž ení pou ze v mí stě poranění, a dále u sn adňují rychlé odplavení koagul ačně akti vních látek . • zabraňují agregaci krevních destiček (prostacyklin) • akti vuj í protein C (trombomodulin) • aktivuj í nebo inhibují fibrin olýzu (t-PA, u-PA, PAl-I) • potencují účinek AT a TM (heparan sulfát) na po vrchu endotelu je vyvázána řada receptorů. Jde zejm éna o receptory pro: trombomodulin - TM , VWF, protein S, trombos pondin, fibronectin a tPA.

23

1.5.2. Známky poškození nebo aktivace endotelu Je d ůležité rozlišit těžší s tupeň poškození endotelu od fu nkčních změn, tj . od zvýšené akti vace endotelu a poruch inhibi ční funkce endotelu (Bultas a Karetová, 2004): • Po škozeni endotelu • Dezintegrace celé buňky - s uvoln ěním protein ů na jejím povrchu (TM, TFPI, adhezivní proteiny ) nebo ze zásobních granul endotelu (vWF) • Poškození buněčné membrány - oxi d ačním stresem nebo proteolytickými enzy my u voln ěn ým i z aktivovaných neutrofilů , spoje ným s u voln ěn ím transmemb ránových protein ů (TM , adhezivní prot einy) a proteinů vázaných v povrchové proteoglykanové vrs tvě (TFPI, tPA). • Dysfunkce endotelu - porucha funkce se může týkat: • Antitrombotického p ů s oben í povrchu endotelu • Regulace krevního tlaku • Průtoku krve • Permeability kapil ár

Luscher; T. F. , Nol, G.: Endothe lial function as an end -point in interventi ona I trials: Concept, methods and current data. J. Hypertension 14, 1996, supp!. 2, s. 111-119.

Davies, P. F. : Endothelium as a signal

transduction interface for flow force s. Cell surface dynamics. Thromb. Haemost. 70, 1993, s. 124-128. T.: The endotheliaI cell protein C receptor. Thromb. Haemost. 83, 2000, Č . 5, s. 639-643.

Es1l10 11, Ch.

Poredoš, P.:Endothelial dysfunction in the pathogenesis of atherosclerosis . C1in. App!. Thrombosis/Haemostasis 7, 200 1, Č. 4, s. 276 - 280.

v.,

Ferenčik; M ., Štvrtil1ová, Hulin, I., Ja hnová, E.: Cievný endotel ako endokr in-

ný orgán ovplyvňujúcí funkciu kardiovaskulá rn ého a imunitného systému. Klinická imunológia a alergológia 7, 1997, Č. 3, s. 17-24.

Schnitzer; J. E.: The endotelial cell surface and alveolae in health and disease. In: Vascular Endo theliu m (G. V. R. Bom, C.J. Schwartz - eds.) Stuttgard - New York, Schattauer 1997, s. 77-95.

Hudeček,

J., Paeeková, M., Chudej, J., Kubisz, P. : Infekce a hemostáza. Vn i tř. Lék. 50,2004, č.6, s. 453-461.

visseren. F. L. J., BOUW1I1al1 , J. J. M., Bout et; K. P. et al.: Procoagulant activity of endot-

helial cells after infection with respiratory virus es. Thromb. Haemost. 84, 2000, Č . 2, s.3 19-324.

Obecně

• • • •

j sou za známky poškození nebo aktivace endotelu považován y: t-PA a PAI-l (působky převážně syntetizované endotelem)

plazmatický trombomodulin - (TM). Při poškození endotelu se z něho proteolytickou degradací tvoří různé nízkomolekulární fragmenty. plazmatický v WF (jeho zdrojem je endotel) TF exprimovany na povrchu endotelu (odraží stu peň stimulace endotelových buněk)

Prot ože endotel p ři své odpo věd i na stimulaci nebo poškození syntetizuje a exprimuj e řad u proteinů o v liv ň uj ícíc h hemost ázu, není možné určit jediný spolehlivý ukazatel jeho aktivace. Vždy je nutné brát v úvahu vyšetření více p arametr ů (Visseren a spol., 2000). V SOUČASNOSTI SE PŘEDPOKLÁDÁ , ŽE ABNORMALITY V AKTIV ITÁCH ENDOTELOVÝC H BUNĚK (DYSFUNKCE ENDOTE LU) JSOU SOUČÁSTí PATOGENEZE TAK OVÝC H CHOROB NÝCH STAVŮ, J AKO JSOU HYPERTEN ZE, ATERIOSKLERÚZA, DIABETES MELLlTUS A SEP TIC KÝ SOK. tLusch er a Nol, 1996).

Liter atur a Bulta s, J., Kate roto vd, D .: Léčba trombotick ých s tav ů - kde jsme a kam se ub íráme. Remedia 14, 2004, Č . 2, s. 182-200.

Cines, D. B., Pollak, E. S., Buck, C. A. et al.: Endothelial cells in ph ysiology and in the pathophysiology of vascular disorder s. Blood 9 I, 1998, č . !O, s. 3527-3561. 24

25

Některé důležité

2. FYZIOLOGIE HEMOSTÁZY 2.1. Hemostáza (srážení krve)

HEMOKOAGULAC E -

HEMOSTAzA J E SCHOPNOST ORGANISMU ZASTAVIT KRVÁCENí. JDE O KOMPLEXNí PROCES , NA KTERÉ M SE ronn.t ŘADA SLOŽEK A MECHANISMŮ S ROZD(LNÝMI VSTUPY A ÚČiN KY. J EDNÁ SE O SLOŽITÝ MECHANISM US SPOJENÝ S CELO U ŘADOU POZITIVNí CH A NEGATIVNíCH ZPĚTNÝCH VAZE B.

Poža davky kladené na hemostatické mech anismy se liší podle toho, zda tyto mecha nismy probíhají v arteriální nebo venóz ní čás ti cév ního řeč iště: Krevní tlak v cévách vyžaduje pohot ovou interakci krevního u závěru .

ko agulačních faktorů

s de-

stič kami při tvorb ě

o

V žilách je naopak důležitá účast inhibitorů plazmatických koagulačních faktokteré brání rů stu kre vní sraženiny a jej í propagaci do cév ního řeč i ště.

rů ,

Na lokalizaci krevní zátky a fibrino lytické mechan ismy.

pře devší m

SOUBOR MECHA NI SM Ů , PŘI KTERÝCH SE ZEJMÉNA U P LATŇUJE

PLAZMATICKÝ KOAG ULAČ NÍ SYSTÉM

Pro existenci živého organismu je zcela nezbytné zachování krevního oběh u a pťitomn ost krve v tekutém stavu. Krev je oddě­ lena od vnějšího pro sti edi cévní stěnou , která ji chrání pied unikáním . PFi poškození cévní výstelky se začíná uplatiíovat he - mostatický mechanismus, který piem ěni tekutou krev na krevní sraženinu, která cévu uzavie. Po '---.:L"-"=----' určité dob ě se rána postupn ě Tvorba fibrinov é zátky v cévním systému zhojí, krevní sra ženina se rozpustí a obnoví se p ůvodni cirkulace tekuté krve. Systém krevního srážení j e tedy velmi d ů ­ ležitý pro zachování integrity (celistvosti) oběhového systému. Za určitých okolností však m ů že docházet ke srážení krve i bez naru šení integrity cévy a tehdy m ů že vést porucha krevního srážení ke komplikacím. Vedle patologickýc h oko lnos tí, které ovliviiujt proces krevního sráže ní v souvislosti s jinou chorobou nebo nepiiznivym stav em, je známa celá iada vrozených defektů, které samy mohou ovlivnit procesy krevního srážení a tím i všechny další interakce v nichž m ů ­ že krevní srážení sehrát svo u roli.

o

pojmy

H EMOSTÁZA - KOMPLEXNí D ĚJ, PŘI KTERÉM DOCHÁzí K ZÁSTAV&: KRVÁCENí

na jej ím odbourávání se

výrazně

podíl í

o

Proces srážení krve neni ve své podstatě fyzio logický krev za normálních okolností srážet nenui.

2.1.1. Hemostáza od narození do

U zdravého jedince se

dospělosti

Hemo stáza je dynamický proces, kter ý z hledi ska vývoj e organi zmu prochází stádii. Rozlišujeme hemo stázu : Fetdlni a neonat álni

různými

• • • •

Dětského věku

Dospělosti

Ve stáří

2.1.1.1. Fetální a neonatální hemostáza •

•

Fetální a neon atální hemo stáza je nevyzrálá s velmi malou rezervní kapacitou při odpo vědi na různé p odn ěty. Koagulační proteiny neprocházi plac entární bariérou .

Syntéza koagulačních proteín ů • začín á ve fetu kolem 10. týdne, jejich koncentrace stoup á s prodlužující se dobou těh oten stv í. • mezi 19.-29. týdnem jsou hodnoty faktorů na 113až 1/2 hodnot po narození. • kolem 30.-38. týdne na 112 až 3/4 hodnot po narození. • u zralého novorozence jsou hodnoty faktorů K - dependentních a faktorů kontaktu na 1/3 až 1/2 oproti hodnotám dospělých . Koncentrace po stupně stoupá a přibli žně po 6 měsících od narození se blíží hodnotám dospělých . Koncentrace fetálního fibrinogenu odpovídá hl adině dospělých (fibrinogen má však sníženou schopnost polymerace). Laboratorní hodnoty • PT: prodlou žen mezi 19.-29. týdnem průměrně na trojn ásobek (33 s) hodn oty do sp ěl ých (13 s). Ve 30.-38. týdnu poklesne na hodnoty kolem 23 s. Po narození se časy PT ustálí na hodn otách kolem 17 s. • APTT je prodloužen na hodnoty kolem 160 s v 19.-29. týdnu a na 105 s ve 30.-38. týdnu. Po narození se hodnoty pohybuj í kolem 44 s. • Doba krvácení je po porod u srovnatelná s hodnotami do spělých.

2.1.1.2. Hemostáza V

děts kém věku

dětského

veKu

se jednotlivé parametry hemostázy

dospělých:

26

děj.

27

p ostupně

bUží hodnotám

• •

hodnoty vitamin K - dependentních faktorů a faktorů kontaktu jsou asi o 20 % nižší. hodnoty faktorů V, VIII, XIII a vWF j sou podobné jako u dospělých .

schopností vazokonstrikce - dochází při ní ke stažení cévy je místem interakce jednotlivých složek všech sys té mů hemostázy je zdrojem a zásobárnou některých faktorů, inhibitorů a dalších látek pro zástavu krvácení.

důležitých

Přes

•

• • či

veškeré odlišnosti hemostázy v dětském věku od hemostázy dospělých: zachována hemostatická rovnováha. rovnováha je velmi křehká s velmi nízkou rezervní kapacitou. mírné rozkolísání nestabilní rovnováhy může vyvolat závažné komplik ace.

• • •

z ů s t áv á

V tomto věku se vyskytuje velmi málo trombóz a trombotickych p ťihod (vrozených, získaných). Rozkolísání rovnováhy vede spíše ke krvácivým komplikacůn.

2.1.1.3. Hemostáza pozdního veKu Se stoupajícím věkem (nad 50 let) se: • zvyšují sig n i fi kantně hladiny některých faktorů (fibrinogen, F VIII, F VIla). • u n ěkterých faktorů naopak doch ází k jejich sntient (protrombin, F X, AT). Význ amn ě

se ve vyšších věkov ých skupinách zvyšují hladiny molekulárních koagulace a fibrinolyzy (F IX a X, F I + 2, TAT, D-dimery) oproti mladším věko vým skupinám: • 51-69 let: zvýšení zhruba o 25 % (D-dimery o 72 %) • 90-100 let: zvýšení o 200- 300 % (D-dimery o I 100 %) markerů aktivace

Na poranění (porušení své celistvosti) reaguje cévní stěn a reflexním smrštěním - vazokonstrikci. Změnu průsvitu cévy zaji šťuje střední vrstva elastickými vlákny a hladkou svalovinou. Tím se v okamžiku poranění zabrání unikání krve z řeč i ště . Krev nemů že v postiženém úseku proudit a tedy ani unikat. Vazokonstrikce je pouze do časn á a trvá krátce, ale umožňuje , aby se aktivovaly ostatn í systémy. Předev ším dochází k organiz aci primární (destičkové) hemostatickě zátky na obnažené subendotelové pojivové tkáni cévní s těny. Nejdůležitěj ší složkou z hlediska zástavy krvácení je endotel (cévní výstelka) a subendotelov ě struktury . Intaktní endoteliální buňky hrají podstatnou úlohu v primární hemo stáze, protože udržují trombocyt v intaktním stavu a brání jeho adhezi na cévní stěnu. Aktivaci destiček kontrolují různými mechanismy:

•

• •

2.1.2. Složky hemostázy Hemostáza je řízen á optimální souhrou endoteliální bariéry, trombocytů, aktia inhibičních faktorů koagulační kaskády a fibrinolytického systému.

•

vačních

• Hlavními složkami hemostázy jsou: • cévní stěna (endotel a subendotelové struktury) • složka tkáiíová (uvol něná z porušené tkáně) • krevní destičky • činitelé plazmatického koagulačniho systému s aktivátory, inhibit ory a složkami fibrinolýzy

vytváří

bariéru mezi krví a tkáněmi a oddělují tak od cirkulace vysoce trombogenní subendoteliální vrstvy, zejména struktury na bázi kolagenu (kolagen typu III). syntetizují prostacyklin (PGl z), který stabilizuje destičku stimulací pomocí cAMP trvale uvoliíují NO , který tlumí aktivaci krevních de sti ček pomocí cyklického guanosinmonofo sfátu (cGMP) produkuj í endonukleázy (zejména CD39/ADPázu) , které přeměňují ADP na neaktivn í AMP. vytváří negativní elektrostatický náboj, který nedovolí neg ativně nabitým tromboc ytům přilnout k endotelu

Vlastní hemostatické procesy

ovlivňuje endotel:

O cestou aktivace proteinu C (trombomodulin se váže na endotelov ý receptor) O tvorbou heparansulfátů, proteoglykan ů - potencují účinek antitrombinu O uvoln ěn ím TFPI z endotelových bun ěk

2.1.2.1 . Cévní stěna Cévní s těna s endoteliální výstelkou hraje v hemostáze důležitou úlohu. Endotel kontroluje jak protrombotické děje v případě poškození cévy, tak udržuje fluiditu krve za fyziolo gických podmínek. Vedle modulace hemo stázy má při poškozen í cévní s tě ny význam i vazo konstrikce, která nejen sníží průtok krve a zmenší riziko krvácení, ale umožní l ok áln ě zvýšit protrombotické pů sobky. Do procesu srážení krve zasahuje cévní s tě na n ěk olika zp ůsoby: 28

2.1.2.2. Složka tkáiíová Z

poraněné tkáně

a okolních

buněk

•

ADP - vyvolává primární agregaci

•

Tkáiíový faktor -

se

způsobí přeměnu

uvolňuje:

protrombinu na trombin

29

2.1.2.3. Krevní

destička

Krevní destičky se zúčastň uj í hemostatických procesů tím, že zpro středkují řadu interakci mezi krvía cěvni stěnou , ale hl avně se uplatňují v primární hemostáze. Dále krevní desti čky poskytujífosfolipidový povrch pro navázání koagul ačních faktor ů závislých na vitaminu K přes Ca2+ můstky. Navíc se krevní destičky zúčastňují hemostázy tím, že specificky váží faktory VIII a V a jsou schopny přímo aktivovat faktory XII a XI.

2.1.3. Kontakty mezi krevními a endoteliálními

Funkce fibronectinu: Fibronectin se zúčas tň uj e v komple xu interakcí s ostatními makromolekulami na ovlivnění bun ěčných vlastností zahrnujících adhezi, morfologii, migraci, fagocytózu, diferenciaci, hemostázu a antigenní transformace. Zprostředkovává vzájemná buněčná propojení interakcemi mezi buněčným i receptory a složkami extracelulární matrix. Fibronectin obsahuje v jedné části své molekuly sekvenci RGPS (Arg-Gly-Asp-Ser) - sekvence umožňující buněčné připojení. RGPS je místem připojení buněčného RGPS receptoru, který je členem skupiny integrinových proteinů . Pomocí RGPS adhezní sekvence váže fibronectin aktivované de stičky. Na molekule fibronectinu jsou další vazebná místa pro některé makromolekuly.

buňkami

Akt ivace krevních des tiček vede k expozici některý ch aktivovaných receptorů , j ako je selektin (CD-62). P-selektin je uvolňován z a-granulí krevních destiček a zabudovává se do jejich membrány. Urč ité množství p-selektinu přech ází do plazmy. Předoklád á se, že p-selekt in je důležitým receptorem pro navázání leukocytů . Kontakt mezi desti čkami vyvolává rů zn é reakce v leukocytech, které odpovídají produkcí a uvolněním n ěkterých cytokinů a adhezivních proteinů. Rovněž je známa s ti m u lač n í funkce krevních d estiček na endoteliální buňky. To vede k expre si adhezivních proteinů (ICAM- I, VCAM-I a selekti n ů) . K aktivaci endotel iálních bun ěk dochází i prostředni ctvím akti vovaných koagulačních faktorů , interleukinem I (lL- I) a tumor nekroti zujícím faktorem (TNF). Selektin y a adhezivní molekul y zpros tře dkuj í navázání endoteliálních buněk a leukocytů , hlavně g ranul ocytů. Kont akt vede u gran u locy tů k rolování ("rolling") těchto bun ěk po endoteli ální v rs tvě, následn é adhezi a migraci do tkání.

2.1.4. Úloha některých adhezivních proteinů v hemostáze

STRUKTURA FIBRONECTlNU (domény)

O -{\-_HI.-_) XIIIa

FBNIHEP

KOL

B

HEP FBN S

S

I

I

B - bl/fíky

HEP - hepa rin FBN - fibrin KOL - kolagen

Vazebná místa

Fibronectin zpro s třed kovává adhezi desti ček a jejich rozprostranění, j ak v klidových podmínkách, tak i v cirkulaci. Podporuje adhezi krevních de sti č ek k ostatním po vrchům (kolagen typu I a III).

Fibronectin je sl o učen i na dvou velmi podobných polypeptidových řetězců spojených disulfidickou vazbou blízko C-konce molekul y. Každá subjednotka je organizo vána do různ ých strukturálních domén, obsahuj ících specifická vazebná místa pro buň ky, kolagen, fibrin a glykosamin oglykany.

VITRONECTIN O MW74 kDa (monomerní forma ) > 100 kDa (multimer) O Syntéza: v jaterní buňce O Koncentrace v plazm ě: 200-400 j.lg/l Vitronectin je adhezivní glykoprotein, který se nachází v lidské pl azm ě , tkáních a extracelulátní tekutině . Vitronectin se po přid ání do tkáň o v ý ch kultur snadno mě­ ní v multimer. Podporuje připoj ení a navázání možných variant buněčn ých typ ů zahrnujících endotelie, osteosarkomové a melanomo vé buňky, krevní dest i čky, fibroblasty, osteoklasty a makrofágy. Funkce vitronectinu: Vitronectin má ú střední regulační úlohu v systému komplementu, koagulace a fibrinolýzy. Je identick ý s S proteinem komplementu a inhibuje lýzu buněk zprostředkovanou komplementem. Fibronectin redukuj e rychlou inaktiva ci trombinu a F Xa vyvolanou antitrombinem a dále váže a stabilizuje biologickou aktivitu PAI-I a způsobuje jeho konverzi do latentní podoby nezbytné pro fibrinol ýzu.

30

31

FIBRONECTIN (lidský) O MW- 440 kDa O Synt éza: v jaterní ch buňkách O Koncentrace II plazmě: 300 mg/I Lid ský fibronectin je adhezivní glykoprotein, který se nachází v subendotelu a pl azmě. Je syntetizová n fibroblasty, endotelem, b u ň kam i hladké svaloviny a epitelem. Je p řítomen v pl a zm ě , sube ndo telu a gra nulíc h kre vních d e sti ček . Rozlišujeme dva typy fibronectinu: • Plazm atick ý • Bun ěčný

TROMBOSPONDlN (anti-angiogen ic factot: glykoprotein G) Trombospondin je velký multifunkční glykoprotein uvolňovaný trombinem z a-granulí aktivovaných krevních destiček. Je rovněž syntetizován a uvolňován fibroblasty, buňkami endotelu a hladkých svalů. Podporuje agregaci krevních destiček a angiogenezi. Hraje důležitou roli ve zpevnění hemostatické zátky. Štěpí se trombinem . OSTEONECTlN Je prot ein vázající měď, který stimuluje angiogenezi a vede ke "zakulacení" buněk dosud neznámým mechanismem.

Působí přímo

ČASOVÉ RELACE JEDNOTLIVÝCH PROCESŮ HEMOSTÁZY

Primární hemostáza

Fibrinolýza

O Vazokonstrikce

O Aktivace fibrinolýzy (minuty) O Lýza sraženiny (hodiny)

(bezprostředně)

změně

tvaru

TENASCIN teliálním

poškozeného úseku a obnovení plně funkčního pIŮ toku. Současně s tímto dějem dochází k inicializaci procesů, které vedou k proliferaci poškozených tkání a nakonec k celkovému zhojení poškozené cévy (Colman a spol., 2001).

O Adheze destiček (desetinyažjednotky sek.) O Agregace destiček (sekundy až minuty)

proti adhezivní funkci fibronectinu, ale podporuje adhezi k endo-

buňkám.

SCHÉMA HEMOSTÁZY

2.1.5. Mechanismy hemostatických

procesů

Po jakémkoli poškození endotelu cévního po vrchu (mechanické, chemické, biologické) je zahájen proces srážení kombinovanou adhezivní reakcí, která zahrnuje jak krevní desti čky, tak i ostatní buňky nebo látky podílející se na hemostáze. K zástav ě krvácení dochází bezprostředně po ataku tvorbou primámí hemostatické zátky, která se aktivováním dalších procesů zpevní a po jejím smrštění se vytvoří 1r.l1IiiiI~:.a,;~:-iJiIooilt; Fibrinová zátka definitivní krevní zátka.

J\J!ilYíJ!:HJJl1WJJ1J!j ~l{ HjJU ~w1J V !JMJJjJl!J "YliiHJJJ!J

MEZI ZÁKLADNí MECHANISMY HEMOSTÁZY PATŘí: O Primární hemostáza O Plazmatický koagulační systém O Fibrinolytický systém O Ihibitory krevního srážení a fibrinolýzy

Primární hemostdza, tj. vytvoření destičkové zátky a sekundární hemostáza, tj. stabilizace trombu fibrinovou sítí jsou funkce důležité pro udržení integrity cévní stěn y a cirkulace krve . V primární hemostáze zaujímají klíčovou roli trombocyty, domin antním momentem sekundární hemostázy je tvorba trombinu , vedoucí k polymeraci fibrinogenu . Oba pochody tvoří jeden navzájem se prolínající celek. Konečnou fází hemostatického děje je fibrinolýza , která umožní rozpu štění trombu, rekanalizaci 32

33

o

Krev v systému in vitro. Umístíme-li nati vní krev mimo cévní ie či št ě (napi: do zkumavky ), dochází po čase k samovolnému srážení krve - vzniká krevní koláč. Po centrifugaci se získá krevní sediment a nažloutlá tekutina , které tik áme sérum.

2.1.6. Dynamika

hemokoagulačníchprocesů

V lidském organismu dochází pravděpodobně v některých místech k aktivaci hemostatickycli proces ů . Tyto aktivační procesy jsou tlumeny inhibitory krevního srážení a pochody, kterými jsou aktivní látky transportovány do tkání. Současně se udržuje rovnováha mezi koagulačním a fibrinolytickým systémem. Předpokládá se trvalá existence r-----------------~ určité koncentrace trombinu v cirkulaci. Jeho biologický poločas se pohybuje mezi 20-30 sekundami Koagulace Fibrinolýza a proto se musí určitá část trombinu stále tvořit. Je to přirozené, protože fyziologickou funkcí krevních destiček je uzavírat prostory mezi sou- '----l

I

I

I

I

2.2. Primární hemostáza Primární ltemostdza je proces tvorby primární hemostatickězátky, která uzavírá místo narušení celistvosti cévní stěny a zastavuje tak krvácení (Levy-Toledano a spol., 1997). Primární hemostázy se hlavně zúčastňuje: • krevní destička • cévní složka

2.2.1. Průběh tvorby primární destičkové zátky •

Neaktivní cirkulující destičky volně smáčené krevním tokem mají oválný diskonezměněnou) endotelovou výstelku cévní stěny krevní destičky nereagují. Jakmile dojde k narušení endotelové výstelky (poranění, zánětlivý nebo degenerativní proces), obnaží se pod endotelem pojivová tkáň V místě , kde dojde k poškození cávní stěny a obnažení kolagenních vláken v subendoteliálním prostoru, dochází k adhezi, tj. přichycení krevních destiček pomocí jejich receptorů glykoproteinové povahy (GP lalIlalIlb a GP Ib/V/lX) ke kolagenovým vláknům. Spojení je zprostředkováno bivalentními proteiny: vWF nebo fibronectinem - Fb (Colman a spol., 2001).

idni tvar. Na normální (nenarušenou a •

->

sedními endotelovými buňkami i při jejich pouhém funkčním oddálení. Adheze a agregace krevních destiček vyvolá vnitřními podněty nevelkou iniciaci hemostá zy, včetně uvolnění trombinu.

Literatura Coltnan, R. W, Hish, J., Marder; V. J. et al.: Hemostasis and Thrombosis. New York 2001 Lippincott Williams and Wilkins. '

•

•

•

34

Adheze destiček s aktivací receptorů navodí kaskádu biochemických a metaboliských pochodů - aktivace krevních destiček. Při tomto ději dochází ke změně tvaru , k centralizaci granulí. Proces je provázen uvolněním proagregačních a chemických působků (sekrečnifáze), zejména PDGF, PF4, pTG, fibrinogenu a dochází i k aktivaci receptorů GP lIb/IIIa. Pomocí mezibuněčných signálů se kontaktují další destičky, protože aktivované destičky secernují ze svých granulí ADP a metabolismem kyseliny arachidonové vzniká TXA 2 . Obě dvě tyto látky jsou výraznými stimulátory agregace krevních destiček. Váží se na své receptory okolních destiček, aktivují je a ty po aktivaci mění svůj tvar na kulovitý s výběžky, přitom dochází ke změně struktury, k aktivaci a obnažení vazebných míst receptorů GP lIb/IIIa. Aktivace a změna struktury receptorů umožní vzájemnou vazbu trombocytů bivalentními proteiny - fibrinogenem, vWF a vitronektinem. Dochází k vzájem35

•

nému pospojov áni krevních destiček - agregaci. Nejprve probíhá prim ámi agr egace , která bývá hl a vn ě vyvolána ADP u v oln ěn ým z porušených bun ě k a tkání. Z gran ulí krevníc h dest iček se uvolní další proagregační působky (ADP, TXA 2 ) a trombospondin, který vytvoří stabilizující můs tky mezi des tič ka m i a agregace se tak stává nevratnou - sekundárn í agregace . Pro agreg ační stimuli aktivují další destičky, dochází k amplifikaci (zesílení) dě­ je a postupn ě se t v oří tzv. bl1ý trombus - destičko vá zátka.

SCHÉMA PRIM ÁRNÍ HEMOSTÁZY

.-----/-;.... Porušenícévní stěny .-----l~ Vazokonstrikce

o

Dalšími d ů le žitym i stimuly ve vyvolání agregace jsou kolagenovd vlákna a trombin. O První vlna ag regace navozena ze vní ak tivací destiček vede ke vzniku nestab ilního trontbocytdmiho agregátu , druhá vlna (vyvo laná u voln ěným i destičko vými p ů sobky), vede ke vzniku stabilní zátky, zpevněn é fi brinovou sítí.

•

• •

Vyvrcho lením této fáze primární hem ostázy je přesun fosfolipidů, z vnitřní memb ránové dvoj vrstvy (fosfati dylseri nu, fosfatidyletanolaminu) do v nějších memb ránových struktur krevní dest i čky. U v oln ěn é fosfolipidy vý raz ně potencují další fázi procesu hemostázy, tedy polymeraci rozpustného fibrinu na nerozpustný fibrin (Colma n a spo l., 2001). Viskózní metamorfóza způsobí slepení a splynutí tro mbocytů . D e stič ko v ý trornbus se zvě tš uje a je hlavním hemostatickým mechanismem. B ěhem tvorby destičkové zátky se uplatňu­ je i TF z poškozených periv askulárních tká~-- I , ní. Na povrchu akti vovaných krevních des tiček doch ází k t v o rb ě koag ulač ně • ... ", ' ;'. aktivníc h ko mplexů a povrch krev ní des tič ' .-1-.. . ky se tak stává pří stupný pro interakce s ko....-:.......,."'.. " agul ačními faktory, která vyústí nakonec v tvorbu fibrinové zátky. Fibrinová vlákna "--~"""':L.C.'" se objeví až pozděj i. Do vytvořené fibrinové sítě jsou vychytávány erytrocyty a leukocyty a "bílý" trombus se postup ně měn í v "červe ný" . ..,~·t

~\ ·~· ,·: .:c;~

•

V primární hemostáze hrají základní úlohu glykoproteiny krevní destičky , pře­ devším komp lexy GP Ib/lX, ale i GP Ia/Ila, GP Ibllla a GP lY. Ro vn ě ž svoji úlohu sehrávaj í adhez ivní molekuly (vibronektin a fibrone ktin) a von Will ebrand ů v faktor (S uss man , 1992). Při vy tvoře n í des ti čko vého trombu pře b íraj í k líč o v ou úlohu GP Ilb/Illa a fibrinogen (Gordon a Che lladurai, 1992). Upl atňují se zde ro vn ě ž prostaglandiny, cAMP, trombin a další pů sobky (Nemerson, 1992). Z ú časti některý ch látek n apř. fibrinogenu a trombinu na krevních de st i č kách vyplývá vzájemná propoje nost primární hemostázy s plazmatickým koagu lačním systémem . Po dobně i samotné des tičky ov li vň ují plazmatické ko agulačn í procesy u vol něn ým i p ůsobky, adhezivními molekul ami a fosfolipid y (Swars a spo l., 1991). 36

Literatura Co ltnan, R. w., Hirsh, K., Ma rde r; V. J. et al.: Hemostasis and Thrombosis, New York 200 1, Lippincott Williams and Wilkins.

Nemerson, 2. : The tissue factor pathway of blood coagulation. Sem. Hemato!. 29, 1992, Č . 3, s. 170-17 6.

Gordon, S.G. a Chelladurai , M.: Non-tissue factor procoagulants in cancer cells. Cancer and Metastasis Reviews II , 1992, s.267-282.

Sussman , f. f.: Normal pathwa ys of coagulation. Sem. Hemato!. 29, 1992, Č. 3, s. 157-158 .

Swars, Levy - Tol eda no , S., Gallet,

c.,

H., Haf ne I; H. G., Erb el, R.,

Ehrenthal,

Nadal, F. et al.: Pho sphorylat ion and dephosphorylation mechanism in platelet function a tightly regulated balance. Thromb . Haemost. 78, 1997, s. 226-227.

w.,

P rell wi tz;

w. ,

Me yer; J.:

Prothrombin fragment F 1+2 : early sign of subacute thrombotic occlusion aft er coronary stent implantation. Eur. Heart. J. 12, (Suppl), 1991, s. 940.

37

2.3. Plazmatický

koagulační systém

Pl azm atický ko agula čn í sy stém skupinu dějů , které vedou ke vz niku nerozpustného fibrinu , Doch ází p ostupn ě k přeměn ě fibrinogenu na fibrin, dále na fibrinové monomer y, které spo n tá n ně polymeruj í. Polym ery fibrinu se pak propojují kovalentn ími vazbami p ů s obením aktivovaného faktoru XIII (XIIIa) - vzniká nerozpustný fibrin. Fibrin vy tváří vláknitou síť, ve které se zachycují krevní ~~rn~~~~~~~~M; ""..........--.:.. buňky - t voří se krevní sraženina tzv. stabilni fibrinová zátka , na jejím ž stažení (retrakci ) v posledn í fázi hemostázy a tím i na staže ní okrajů rány a její hojení se podílej í krev ní de sti čky (Sussman, 1992). před st avuj e

2.3.1. Historie vývoje názorů na proces hemostázy Vy světlit n ěkteré

procesy, které vedou ke srážení krve, se

pod ařil o

až ve 20. století:

SCHMID T a M O RAW ITZ 1905 V roce 1905 navrhl Moraw itz základní hemostatické schéma, ve kterém se uplatň o valy 4 k o agulační faktory (Mo rawitz; 1905 ): • fib rinogen (F I) • protrombin (F II) • tromb oplastin (F III) - tkáňo vý faktor • Ca 2+ (F IV)

aktivní složka (FXlIa) spustila následnou kaskádovitou reakci během které se aktivovaly další faktory (XI, IX a X). Proces srážení MacFarlane chápal jako sérii reakcí, která vedla k tvorbě trombinu a následně k přeměně fibrinogenu na fibrin (Ma cFarlane, 1964). Složky, které se na hemostáze podílely označilj akofaktOl}' pla zmatického koagUlo.Č1ll11O systému . Vněj ší systém u této před stavy měl menší význam, k jeho aktivaci mělo docházet až při výrazněj ším poškození tkání a po uvolnění TF. Rozvoj hemokoagulačních systémů a dějů po roce 1964 Krevní srážení bylo posuzováno jako komplexní děj , ve kterém se plně uplatňu­ jí vzájemné interakce buněčn ých a plazmatických systémů, jež jsou přítomny v kro vi a v cévní s tě n ě . Krevní srážení je dáno přede vš ím interakcí mezi systémem krevních destiček, systémem plazmatických koagulačních faktorů, systémem inhibitorů krevního srážení, fibrinolýzou a cévní stěnou. Kromě těchto základních sys témů se na srážení krve podílí i erytrocyty, leukocyty, systémy adhezivních molekul a integ rin ů a dále produkty lipidového metabolismu. Celý proces vytváří řetězce reakcí založených na vzájemné aktivaci a inhibici , ovlivněný a kontrolovaný více mech anismy. ÚČELEM TĚCHTO DĚJŮ J E UDRŽENí DYNAMICKÉ ROVNOVÁHY, NEBOŤ .JEJ í ROZKOLí SÁNí MŮ ŽE VÉST KE VZNIKU ZÁVAŽNÝCH KLI NICKÝCH PROJ EVŮ.

2.3.2. Koagulační faktory

M acFA R LANE 1964 MacFarlane rozšířil před stavu Morawitzovu o další cestu aktivace. V systémech in vitro vytv ářel um ěl é podmínky, při kterých předpokládal odhalení subendotelových stru ktur, Kontaktem s těmito strukturami při tzv. kontaktní fázi se aktivoval F XII. Tato

Mezi národní komise pro názvosloví koagula čn ich faktorů sjednotila jejich názvy tak, že doporučila ozna čova t jednotlivě faktory iůnskymi čísly , podle časo vé posloupnosti jak byly objeveny. So učasně pon echala i n ěkterá synonyma . Aktivované formy se ozna čuji indexem a (Pi: F X - -> F Xa). Většina koagu lačních č ini telů je tvoiena v játrech , n ěkteré p otřebují k syntéze vitamin K. Větš i n a z nich, mimo fakto ry I a II (fibrinogen, protromb in) se nachází v plazmě ve velmi nízkých koncentracích. Přev ážná čás t faktorů , s výjimkou tkáň ovéh o faktoru, je v pl azm ě přítomna v p od ob ě proenzymu (koenzymu) a pro svou správnou funkci vyžaduje proteolytické š těpe ní , při kterém z pů vodn ího proenzymu vzniká koagulačn ě aktivni enzym . Jediný z faktorů, který koluje v cirkul aci v aktivní form ě , ale ve velmi nízkých koncentracích, je faktor VIla. Větš i na F VII je pří­ tomna v pl azmě v podobě neakti vního proenzymu . V případ ě koagulačních faktorů se jedná pře v ážn ě o glykoprotein y charakteru proenzymů a kofaktorů , které v procesu krevníh o srážení prod ěl ávají strukturální zm ěn y. Faktory II, VII, IX, X, XI, XII a prekalikrein po rozštěp ení vykazují enzymatickou aktivitu a řadí se mezi serinov ě proteázy . Jejich aktivní místo obsahuje serin. Jiné koagulační faktory se po ro z štěpen í ú č astní tvorby ko agul ačně aktivních komplexů a chovají se jako kofaktory . Jsou to především faktory VIII, V a vysoko-

38

39

Piedstava: Srá žení krve probíhá ve dvou fázích: I . Z poran ěné tkán ě se uvolní tkáňová tromb okináza (tromboplastin), která za přítomnosti Ca 2+ aktivuje v plazm ě p řítomný proenzym protrombin na aktivní enzym trombin. 2. Trom bin aktivuje přem ěnu fibrin ogenu na fibrin.

molekul árn í kininogen HMWK (high mol ecular weight kininogen). Fibrinogen subst rát pro trombin, který jej štěp í. Ch yběn í , pokle s, nebo funkční ned ost atečno st vě tš i ny fa ktor ů ( kro mě faktoru XII) vedo u ke krvácivým projev/lm. tvoří

CHROMOSOMÁL NÍ LOKALIZACE KOAGULAČNÍCHFAKTORŮ

Funkce aktivního místa serinových proteáz V aktivním mí s tě serinové proteázy j sou uloženy aminokyseliny s reakt ivním i postranními řetězci, které vz ájemně reagují se , - - - - - - - - - - - - - - , substrátem . Pro katalytický účinek enzymu mají zej m éna význam po stranní řetězce seri1111 (Ser) a histidinu (His) . Histid in slouží jako donor a akceptor protonů. Karboxylová skupina Lys nebo Arg na molekule proenzymu , vytvoří nejp rve s hydroxylovou skupinou serinového zbytku v akti vním mí stě serinové prote ázy ester a odš těp í se aktivač n í peptid. Hydrolysou esteru se uvolní produkt (větš i nou další serinová proteáza) a regeneruje se serin v aktivním m í stě enzymu, který provedl proteolýzu. ' - - - -- - - - - - - - - - - ' Faktor VII a - akti vní místo

Serinová proteáza

Ester

..•.....•.••••

.

~

2.3.2.1. Seril10vé proteázv

>

Proteázy p atří mezi hydrol ytické enz ym y, které katalyzuj í vazby, tedy vaz by C-N.

š těpení

CH 2 0 H .....

.

R - CH ,

~1

~

H

~3

N

C

H

CHN

II

I

a

R2

H

~1

H

.... / CH-, / N-, / CX / CH-, / N....

N H

II

a

m í stě

I

+/

CH

H3N

R2

-, /

rr

~ N- - ) ....

H N

....

H

nový enzym

Aktivní místo hislidinové zakončeni sermove prote azy ~

a

OH I

. ..

K serinovým proteázám se

řadí

bílko viny a glykoproteiny z oblasti:

•

••

Ser - His - Asp -

~

II

a

CHa'

+

aminokyselinu serin. Obsahují tzv. ka-

Serin-Histidin-Kyselina aspartamová

~.

C

I

C

• .... / " - /"- /"-

C

Serinové proteázy mají v aktivním talytickou triádu:

~

H N

CH

prct e éza

•

.

:i r-~H .. · : 1 ~~~H I I :' :~ -

peptidické

R3

peptid

+NH - Rz ~ R - CH z - O - C - Rl + HzN - Rz O:~ W....~.~is) O HzO

R - CHz - OH + Rl - C Ser

serino~é zakončeni

Akti vační

!

Proe ~ zy m

40

(Ser- His-Asp)

-Z;/r-... ~ 1 , aktivní místo

Plazmatických faktor/I - faktory II, VII, IX, X, XI, XII a prekalikrein . • Fibrinolýzy - plazminogen , t-PA, u-PA. • Serpin ů - protein C Faktory II, VII , IX a X, XI, XII a dále protein C a S mají velmi podobnou molekulární strukturu, Jedn á se o f aktory závislé na K vitaminu. Bílk ovinné řetězce těchto molek ul bývají ukon čeny glutamo vou kyselinou.

protrombi n plazmin ogcn aktivátor plazmin ogenu

urc kin áza faktor VII fakto r XII

protcin S

Stru ktur a n ěkterých serinových proteáz (domény: P - prot eázová, GF - růstového faktoru , K - Krin gle)

41

Syntéza

prekurzorů (proenzymů)

serinových proteáz COO-

Část molek uly glutamové kyseliny zvaná též "gla oblast" je

I

k plné funkci těchto faktorů a navázá ní Ca z+. Jedná se o tu čás t molekul y kyseliny glutamové, ve které je tzv. r karboxy-glutamové zakončení. V přítomnosti vitaminu K je tato část glutamové kyse liny karboxylována enzymem rglukarboxyldzou , důležitá

I

CHz

I Kyselina yC H glutamová I Glu ~CHl I

redukovaná forma

I

CH , 1

iet ězec

zHN - CH - CO - NH I

p CHz

CHz

Y CHz

CH -COOH

I

-

COO-

I

I

I

COOH

COOH

Koag ula čn í faktor

PIVKA fa ktor aO OQa o ~ol~

o

sn

KARBO XYLACE GLUTAMOVÉ KYSELI NY Vy-OBLASTI

COO-

zHN - CH - CO - NH - protein ovy

I

t glukarboxyláza (G e )

Vit. K

a

H 3 N+ - C-H

Kyselina gluta mová (Glu)

r glukarboxyldza je enzym uložený v membrán ě endoplazmatického retikula. Obsahuje 7 tran smemb ránových hydrofó bních sekvencí a katalytickou doménu o délce 400 aminokyselin.

ní tzv. PIVKA (Protein [nduced by yitamin K absence or vitamin K gntagonists) faktory.

Vit. K

oxidovaná forma

Ca l + /''. COo- COo-, / yCH Kyselina I y.kar boxyglutamová ~CH2 I

(COl, Oz)

a CH

a CH

/

/

'\.

-CO NH -

Mimo r karboxylaci probíhaj í ve f aktorech i j iné post-translan čn i mechanismy, jako je fosfo rylace, sulfatace a jin é.

Aktivace serinových proteáz Prostorová struktura (konformace) enzymu je důležitá pro vznik aktivního centra. Tato prostorová struktura určuje i specifitu vazby pro substrát. Aktivačním procesem se většinou rozumí limitovaná (částečná) proteolýza , při které je molekula rozštěpena za vzniku dvouřetězcové bílkoviny spojené disulfidickými mů stky nebo nekovalentní vazbou. Proteolýza vyvolaná serinovými proteázami probíhá většinou v místě argininové (AI;g) nebo lysinové (Lys) vazby. Vzniká látka s enzymatickou aktivitou serinové proteázy. Aktivní centrum je poblíž C- oblasti molekuly. !

!

Gla

! proteolýza

~r - - - - - - - - ,

H zN -( Cla-ollast}-m-{ Aktivní místo }- COOH

'\.

-CO NH S

Druh á karboxylová skupina je nezbytR ná k v az bě na fosfolipidové struktury pře s I Hee OOH vápníkové mů s tky při tvorbě koagul ačn ě I e aktvních k omplexů, u kterých doch ází o o k sesk upení akti vního faktoru, neaktivního faktoru (zastupuje roli substrátu) a kofaktoru. Fosfo pilidovo u matrix vytváří memb rány aktivovaných bun ěk ( větši n o u se jedn á o monocyty a tromboc yty). V p říp ad ě jatern í poruchy, sníže ní Vazba aktivova né a neaktivované formy faktorů na fosfolipidovou matrix hladin y vita miny K, anebo p ři antikoag ul ačn í l éčb ě preparáty kum arinového typu ke ka rboxy laci nedochází. Místo aktivních faktorů zů st áv ají ko agul ačně neakti v42

S

H zN -( Cla- Ojlast 1 Aktivačn í p eptid

S------S

o

Nespecifická aktivace koagulačních faktor ů Imlže nastat i vlivem proted; mikroo rganizm ů, tumoroznicli buněk, leukocytů nebo prote á: uvolněných z poškozené tkán ě.

43

ODŠTĚPENÍ AKTIVAČNÍHO PEPTIDU A VZN IK AKTIVNÍHO MÍSTA

2.3.2 .2. KofaktolJI Nachází se ve formě plazmatické (Fak tory V a VIII, HMWK, Prote in S) nebo vázané do buněčné membrány (TF). TF nepotřebuje být aktivován. Plazmatické kofaktory jsou aktivovány. Při akti vaci nedochází ke spojení disulfidickými, č i nekovalentními vazbami, ale kovalentní vazbo u přes Ca 2+. Faktory V a VIII jsou inaktivovány rozštěpením molekuly v systému protein u C.

(mikrovehikuly, mikropartikule) uvolněné z membrán kre vních destiček . Tyto drobné membránové struktury nejsou zjistitelné v běžn ý ch analyzátorech krev ních částic. V tomto strukturálním uspořádání vznikají ko agulačně aktivní ko mplexy, kte ré mohou aktivovat dal ší složky koagul ačního procesu. Na vzniku koagu lač ně aktivního komplexu se podílí: • E nzy my - většinou jde o serinovou proteázu Mikročástice u volněné z krevních (poskytuje aktivní místo) destiček • Substráty - většinou jde o proenzym, který se proteol ýzou aktivuje • Kofa ktory - většinou jde o struktury složené ze dvo u řetězců, které jsou vzájemně propojeny Ca 2+ můstkem . Tyto složky vytváří sterický blok a napomáhají natočit a udržet proenzym v katalytickém místě serinové proteázy. • Ionty Ca2+ - umožňují vyvázání karboxylových skupin enzymů a proenzymů na záporně nabitý fosfolipidový povrch. • Fosfo lipidové povrchy - fosfo lipidov é membrány nebo jejich zbytky, které mají ve vn ěj ší povrchové vrstvě záporn ě nabité fosfolipidy (fosfa. '.I tidyletanolamin , fosfatidy lserin).

Vznik

STRUKTURA FAKTORU V a

koagulačně

aktiv.

Vazba faktorů na fosfolipidové povrchy - červeně vyznačen fosfatidylserin (P - proenzym, E - enzym, K - kofaktor)

komplexů

Většina hemokoagulačních reakcí probíhá na makroskopickém povrchu a ne v roztok u . Akti v ační fosfolipidové povrch y poskytují poškozené cévní s těn y ( tkán ě, monocyty ), subendoteliální struktury, ateriosklerotické pláty nebo membrány krev ních destiček . Uplatňují se však i třírozměrné struktury, zejmé na jde o mikročás tice

Zdvojená karboxylová skupina následné připoje ní proteáz k fosfolipidovému povrchu buněčné F Xa, Ca2+, --:J membrány, pro střednictvím vápníko- Pl,FVa '00000 I I vých můstků (Ca 2+). Enzymový kofak- FCaXs, PI B300 tor (TF, VlIla, Va) specificky váže na FXa+ Ca2 ~ vitaminu K závislou proteázu (F VIla, FXa ~1 F IXa , F Xa). Kofakt or zvýší afinitu enAkc eler8ČnI faktor zymu k fosfolipidovému povrchu a zvý, '0 ' 00 1000 10 000 100000 Vliv j edn otlivých složek komp lexu protrombinázy ší kata lyticko u rychlost enzymu. Kofaktory vykazují mno hem vyšší na rychlost rea kce (PI- fosfolipid) afinitu k fosfolipidov ým povrchům než enzymy. Enzym vzhledem ke své malé afinitě k povrchu se váže přesn ě v mí stě navázání kofaktoru na fosfolip idový povrc h (Waxman a spol., 1992). Při katalytické reakci se nejprve vytvoří komplex [enzym . substrát], v našem případě komplex [serinová proteáza . proenzym]. Za vazbu substrátu jsou odpověd n é iontové vztah y a valence reaktivních skupin postranních řetězc ů . Serinová proteáza pomocí svého aktivní ho místa proteolyticky štěp í substrátovou část proenzymu, odštěpí se aktivační peptid a z proenzymu vzniká další serinová prote áza .

44

45

těžký řetězec

(

Al

I

A2

lehký

řetězec

~-A-3-~ B

umožňuje

Zt ,

+

2.3.2.3. Substráty Fibrinogen je substrátem v enzymové reakci, při které jej trombin štěpí na fibrin. O Domén a - je IVzsáhlý polypeptidový iet ězec vytv átejici záhyby, ktelý má charakter

samostatné j ednotky v molekule dané s loučen iny (bílkovina. glykoprotein a jiné).

2.3.2.4.

Koagulačně

aktivní komplexy

Membránové struktury

NĚKTERÉ SERINOVÉ PROTEÁZY A MÍSTA JEn AKTIVACE

Protrombin Faktor VII

,,

_

r- 7

~

~

Vila neboXla

Faktor IX Faktor X

Xa

="-~---

IH

,,

Vila neb o Xla

.

- ? ,-. ?~ ~ . . . . . ..-.;....;.

_

~......,L-..J

trombin

Připojení serinové proteázy v Gla-ob last i přes Ca 2+ můstky (modré)

,. ne bo Xlla

Faktor XI

~

kallkreln

V koag u lačně aktivním komplexu doc hází ke vzniku koagulačně aktivní složky

štěpení

neaktivovaného faktoru za

~

Faktor XII

PLAZMATICKÉ PROTEINY - MW A KONCENTRACE V PLAZMĚ

,.-,-

S - substrát E - enzym P - produkt

SCHÉMA AKTIVACE FAKTORŮ A VZN IK KOAGULAČNĚ AKTIVNÍCH KOMPLEXŮ

46

Protein

MW (kDa) v

Fibrinozen Protrombin Faktor V Faktor VII Faktor VIII Faktor IX Faktor X Faktor XI Faktor XII Faktor XIII Protein C Protein S (volný) Protein Z Prekalikrein HMWK Fibronectin Antitrombin Plazminozen Urokináza Heparin kof. II a-2-antiplazmin PCI a -2-makroglobulin

330 72 330 50 330 56 58,8 160 80 320 62 69 62 86 110 450 58 90 53 66 63 57 725

47

Koncentrace plazmě (mg/l) 3000 90 10 0,5 0,1 5 8 5 30 10 4 10 2,2 50 70 300 290 216 0,1 90 60 4 2100

Koncentrace v pl a zm ě (mmol/l) 9,09 1,388 0,03 0,0 1 0,003 0,08928 0,13605 0,031 0,375 0,03125 0,0645 0,1449 0,0355 0,5814 0,6363 0,667 5 2,4 0,001887 1,3636 0,9524 0,00702 2,8966

2.3.3. Popis, str uktur a a funkce plazmatických koagulačních faktorů

FIBRINOGEN (FAKTOR I) O MW 340 000 O Biologický poločas: 64-96 hodin O Fyziologické hodnoty JI plazm ě: 2-4 g/l (8,8 umol/l) Fibrinoge n je nejlépe charakterizovaný glykoprotein p řítomn ý, jak v pl azmě , tak i v granulích krevních desti ček . Je syntetizován v játrech (Shafer a Higg ins, 1988; Blomback, 1996). Struktura molekuly: Mo leku(J. (J. la fibrinoge nu t voří dimer , který se skládá se ze 3 rozdílných p árů polypept idových řetězců a , p a '{, které j sou vzáje mně vázány disulfidický mi m ů stky. Důl e žitou úlohu v udrž ení struktury fibri- L ===========~ ----J nogenu hrají Ca 2+ ionty. Struktura molekuly fibrinogenu Specifická vazeb ná místa na molekule fibrinoge nu jsou čas to kryptická (skrytá) a jsou dostupn á až po konform ační zm ěně molekul y a to buď přem ěnou fibrinog enu na fibrin nebo od štěpen ím fibrin op ept id ů B, příp adn ě vazbou na pevný povrch. Fibrinogen má 3 vazebná místa pro navázání Ca 2+. Jsou-li tato místa obsaze na, je fibrinogen chráněn před štěpe­ ním plazminem . Cukerné složky navázané na a a pjsou nezbytné při polymerizaci fibrinových vláken. Jednotli vé řetězce molekul y fibrin ogenujsou kódován y geny na 4 . chro moso mu. Dále se fibrinogen váže na membránový bílkovinný komplex krevní d esti č k y GP lIb/lIla. Mim o tuto vazbu se fibrinogen váže i na některé další integrované i neintegrované recepto ry (a 130 kDa receptor, CD 44 povrchový receptor, kalretikulin , 92-94 kDa receptor, ICAM-l) fi brob l astů a endoteliálních, nádorových, hem opoetických, lymfoidn ích a mezoteli álních bun ěk a o v l iv ň uje jejich proliferaci, adhezi, agregaci , migraci a také u vol ň o v án í vWF. Funkce: Fibr inogen je substrátem nejen pro trombin , ale i pro plazmin (Hosseso n, 1997). Kromě toho mů že být fibrinog en š těp e n i jin ými tzv. trombinu podobnými enzymy, jedná se přede v ším o hadí jedy ( n apř. reptiláz a). Fibrino gen je rovn ě ž hlavní krev ní bílkovinou podporující agregac i krevních de stič ek pro středn ictví m interakce s d e st i č ko v ým i receptory na sousedících destičkách (GP lIb/lIla). O Fib rinogen j e vychytáván trombo cyty a shromažďován v j ejich a- granulích. O Minimální plazmatická koncentra ce fibrin ogenu pro hemo stdzu j e 0,5-1,0 g/l. O Fibrinogen parit mezi proteiny akutnífáze (cévní poškození, chirurgický zákrok, akut ní infekce, infarkt myokardu). V prů běh u n ěkolika hodin po navození těch to stavit dojde ke zvýšení syn t ězy fib rinoge nu v játrech a je ho hladina se v p r ůb ěhu 3-5 dmi zvýší na 3- 5násobek výchozí hodn oty. Po této době se vrací k nornuilu . 48

PROTROMBIN (FAKTOR II ) O MW' 72 kDa (Trombin 37 kDa) O Biologický polo čas: 48 hodin O Koncentra ce v plazm ě: 100-200 mg/l 1,4llmol/l akti vita : 0,7-1 ,3 Protrombin je složený z 532 aminokyselin. Vzn iká v játrech za přítomn o sti vitaminu K. Úči nkem protrombin ázy se mění na trombin (F IIa). STRUKTURA F II (domény)

- COOH

8-

-

-

-8

GLA - oblast zahrnující y karboxylové skupiny glutamové kyseliny KRl - ..Kringle " dom éna SP - setinov á pro tedza aktiva ční peptid uvolněný po piem ěn ě zymogenu na aktivní serinovou prote ázu - frag menty 1 a 2

[><]

Přeměna protrombinu

Faktor Xa

štěpí

na trombin protrombin v místě Arg320 za vzniku meizotrombinu: STRUKTURA MEIZOTROMBlNU (domény )

M><1-B-@-9

q=J-C O O H

8-----8 •

Faktor Xa dále štěpí meizotrombin v místě Arg27 1 a doch ází k uvolněn í fragmentu Fl a F2, součas ně a-tromb in š tě p í meizotromb in: • v místě Arg 155 : oddělí se fragment 1 a fragment 2 • v místě Arg 284 : ošt ěp í se malý fragment s N koncem (272- 284)

49

Výskyt TF a jeho stimulace

STRUKTURA a-TROMBINU (dom ény)

Trombin vznikající touto cestou se nazývá a -trombin. Dalším štěpen í m B řetěz­ ce trombinu autoprot eolýzou nebo trypsinem vznikají ~ trombin (ře tězec B se ště pí v m í stě Arg 71 nebo 73 na Bl a B2 řetě zec) a y trombin (B2 řetězec se dále štěpí v m í stě Arg 154 na B5 a B4 řetězce). SCH ÉMA MOLEKULY PROTROMBINU - GLA-OBLAST aktivační

peptid

~

L

I

-Ala-Asn-Lys-G Iy-Phe-Leu-Gla-Gla-VaI-Arg-Lys-Gly-Asn-Leu-Gla-A rg-Gla-Cys-Leu-Gla-Gla-Pro-Cys-5er-Arg- GIa-Gla-Ala-Phe-Gla-Ala -Lys- Gla

F unkce trombinu: Trombin p ů s ob í jak ko ag u lač ně, tak i i n h ib ič ně . aktivity trombinu: • š těpí fibrinogen na fibrin • limito vanou proteolýzou aktivuje faktor y V a VIII • aktivuje faktory IX a XIII • je význa mným aktivátorem krevních destiček • na endotelu posiluje tvorbu a sekreci t-PA • po navázání na trombom odulin aktivuje protein C a TAH Trombin se dále upl at ňuj e i v procesech zánětu a hojení.

Nej d ů le ži t ěj š í

TF je ve velkém množství exprimován na subendoteliálních bu ňkách ( b uň ky nesoucí TF) v subendoteliálních strukturách (Scarpati a spol., 198 7). Exprese TF na fibroblastech a svalových buňkách umo žňuj e aktivovat hemostázu okamžitě po porušení integrity cévní s tě ny (Rickles a spo l., 1995). Makrofá gy a hladké svalové bu ňky u vol ňuj í TF do okolí a jsou pra vděp odobn ě zdroje m extravask ulárního TF zji ště né ho v ateromatózních plátech (Giesen a Neme rson, 2000) . Apoptóza provázená změnam i v membráně vede ke zvýšení aktivity TF. TF se za normálních okolností na buňkách krevní cirkulac e nevyskytuje Endotelové bu ňky a leukocyty n orm áln ě tkáň ový faktor neexprimují. R ůzné stimuly (rů s tov é faktory, endotoxin, cytokiny, TNF, lL-I ) vedou in vivo ke zvýšení syntézy TF v buňkách , které ho běžně produkují, ale současně k jeho expresi buňk ami , které jej za fyziologických podminek neprodukují (endotelové buňky, monocyty aj.). In vitro se zj išťuj e TF prakticky ve všech buně čn ých kulturách. Aktivita tkáň o vého faktoru byla zj i štěna v plazmě (Osterud a spol., 2000 ; Ozcan a spol., 2001). Zatím nebyla potvrzena schopnost gran ulocy tů generovat aktivitu nebo antigen TF. Za zdroj TF v cirkulující krvi jsou považovány monocyty. TF uvolněn ý ze stimulovaných m onoc ytů mů že vyvo lat trombózu u chronickýc h i nfekt ů, u gram negativní sepse, u endokarditidy, nestabilní anginy pectoris, ale i při operacích a traumatech (Osterud a spo l., 2000). U nádorových one moc ně n í jsou monocyty stimulovány nádorovými buňkami k expre si TF. Hladinu TF v krvi mohou zvyšovat i nádorové a leukemické bu ňky (Rickles a spol., 1995). Některé buňky jsou po stimulaci schopné odš těpovat tzv. vezikuly obsahující TF. V p od statě jde o "prokoag u lač ní mikro č ásti c e" , které vznikají při rekonstrukci a odště pe n í membrány z celé řady buněk po jeji ch aktivaci nebo apoptóze ( Greet; 2001). Tyto mikroč ásti ce obsahuj í některé prokoagulační fosfolipidy (fosfatidylserin a fosfatidyletanolamin ). Mikročást i ce odštěp en é z tromb oc ytů , m on oc ytů a endotelovýc h b u něk souvisí p ravd ěp odobně s protromb otick ými stavy, jako je heparinem indukovaná trombocytopeni e, paroxysmální no ční hemoglobinurie a hemolyticko uremick ý syndrom (Greet; 2001; Osumi a spo l., 200 1).

Složení a

zařazení

TF

(Tiss ue Factor - TF, -CO 142. dii ve: t k áňov ý tromboplastin. F III) O MW 37 kDa TF je membránový protein, který je exprimová n na povrchu řady bun ěk . Je součás tí membrán endoplazmatického retikul a. Extrahuje se z tkán ě s nej větší aktivitou v mozku, v plicích , pl acentě , ale i v jin ých orgánech.

Lidský TF je integrální transmembránový glykoprotein o 263 aminokyselinách , Patří do 2. tříd y rodin y cytokino vých recepto r ů . Jeho koagul ačn í aktivita kolísá podle druhu tkán ě a způsob u příprav y. Struktura molekuly: TF obsahuje extrace lulární č ást (AA: 1- 219), hydrofóbní transmembráno vou část (AA: 220-242) a C-terminální cytoplazmatickou oblast (AA: 243-263). V extracelul ární dom éně má 3 glykosy lovaná místa (Wax/11a/l a spol., 1992). Molekula je vysoce asymetrická. Extracelulární část sestává ze dvou domén typu fibronektinu III se d věm a fosfory lačn í mi místy. Tato část má význam při tvorbě koagulačn ě aktivního komplexu [TF . VIl a]. TF je pevně zakotven ve fosfolipidové membráně hydrofobní čás tí své molekuly. Tím se vys vě tl uj e nerozpust-

50

51

TKÁŇOVÝ FA K T OR (TF)

nost jeho molekuly. TF se snad no váže na membránový povrc h nebo fosfolipidové vesikuly, což zajišťuje jeho aktivitu v suspenzi. Funkce: TF nevyžaduje aktivační kroky a není známo, že by mě l enzymatickou aktivitu. Jakmile dojde ke kontaktu s krví , slouží TF jako vysoce afinit ní receptor pro F VIla a vytváří s ním v přítomnosti Ca 2+ na fosfolipidovém povrc hu komp lex [TF . VIla] v poměru I: I , který dále vyvolá přeměnu F X na F X, (Rapapo rt a Vijaya Mohan Rao, 1995). TF se váže u F VIla na Lys 165, Lys l66 a Glu 35 . KOAGULAČNĚ AKTIVNÍ KOMPLEX [TF. VIla]

e 35

Faktor VIla .•• •••••

165

166

~

.

Neaktivní faktor VII může také tvořit komplex s TF, který je proteo lyticky neaktivní. Komplex [TF. VIla] je navíc důležitým aktivátorem faktoru IX (Osterud a Rapaport, 19 77). TF působí jako buněčný receptor pro F VIla a současně zvyšuje je ho afin itu k s ubstrátům . Inhibice [TF . VIla] Inhibice tohoto komplexu je zajišťována dvěma cestami : • TFPI - v procesu hemostázy probíhá inhibice [TF . VIla] ve dvou stupníc h. Nejprve se váže F Xa k TFPI na AI ;g reaktivního místa druhé domény Kunitzova typu za vzniku komplexu [Xa . TFPI]. Ve druhém stupni se F VIla váže na Lys reaktivního místa první domény za vzniku kvartern ího komplexu [Xa . TFPI . VIla. TF], který už není kataly ticky aktivní. Úloha třetí domé ny není zatím známa. • AT - v přítomnosti heparinu velmi rych le vyvazuje F VIla vázaný na TF za vzn iku ternárního komplexu [AT . heparin . VIla]. TF bez vazby na VIla postrádá koag ulační aktivitu. AT tedy na rozd íl od TFPI umožň uje vyvázání F VIla z vazby na TF a tím TF pro vázání dalších molekul F VIla. TFPI se z těchto důvodů považuje za primární regu látor katalytické aktivity [TF . VIla} v procesu hemostázy. Klinický význam: TF hraje významnou úlohu při vzniku hyperkoagulačních s tavů a pravděpodobně i u vě tši ny trombotických nemocí. Tkáňový faktor má i ně­ které nehemostatické funkce. Patří k nim jeho účast v angiogenezi, aterogenezi, při zánětech a při růstu a metastázování tumorů. Tyto funkce pravděpodobně souvisí s působením TF v úloze signálního receptoru, který zprostředkovává přesun bu něč­ ného vápníku, aktivaci enzymů a expresi některých genů. uvolňuje

52

Neaktivní (kryptogenní) forma TF V membráně buněk hladkého svalstva byla zji štěna neaktivní tzv. .Jcryptogenní" forma TF. Tato forma váže F VIla, ale vzniklá struktura nevykazuje koagulační aktivitu . Kryptogenní TF představuje tzv. latentní pool koag ulačního TF. Předpokládá se, že příčinou je ho inaktivity, přestože má kompletní expozici a zakotvení v membráně je buď chybění expozice fosfatidylserinu a fosfatidyletanolaminu, nebo sterická zábrana (vyvolaná sousedními molekulami), která brání plné exprimaci TF na membráně. Je možné, že po expozici kolagenu se stává kryptogenní TF aktivním a podporuje vznik trombózy. KALCIU M (FAKTOR IV) Vápníkové ionty (Ca2+) jso u nezbytné pro celou řadu reakcí ve všech systémech hemostázy. Nejme nší nutná koncen trace pro hemokoagulaci je 0,5 mmol/l. U faktorů závislých na K vitaminu zprostředkují vápníkové ionty připojení y karboxylové skupiny kyseliny glutamové na fosfolipidy. Kalciové ionty jsou mimo jiné vyžadovány pro uspořádání koagulačně aktivních komplexů vnitřní [VIIIa . IXa] a vněj ší [VIla. TF] tendzy a protro mbituizy [Va . Xa]. Na přítom nosti kalciových i ontů je také odvislá tvorba některých inhibičních komplexu - např. [TFPI . Xa . VIla . TF] . FAKTOR V (PROAKC ELERIN) O MW: 330 kDa O Biologický poločas: 12-15 hodin aktivita : 0,65-1,5 O Koncentrace v plazm ě: 8-14 mg/I 20 nmolll Faktor V je jednořetěz- r - - - - - - - - - -- - - - - - - - - - - - - , Sch ematicky diagram krovnl M j!a.karyoéyt · " - cový glykoprotein, který ..•• <'-o--~ 'II vzniká v játrech a megakaU@ ,:: ryocytech a váže se poměr­ esllček ~.~, • D ně snadno na povrch bu. ~~~ a-granule něčné membrány . Nac hází se v p lazmě cirkulující kr- '---- - -- -- - - - - - - - - - - - ---' Tvorba FV v megakaryocytech a jeho uklád ání ve a v ex-granulích krevních do a -granulí krevních destiček destiček (asi 20 %). Minimální aktivita nezbytná k zástavě krváce ní je 10- 15 %. FV je podobný svým složením F VIII. Ionty Ca 2+ stabilizují FV a jsou nezbytné pro jeho aktivaci. Faktor V je aktivován limitovanou proteolýzou trombinem nebo F Xa. d e stičky

';

,

I'

ditěpov;nl ~~ ;:;'\;':';

~

STRUKTURA F Va (domény)

lehký řetězec

těžký řetězec

(

Al

I

A2

B

I Cl I C2 ) ~__A_3_A.._...J"--_~ 53

AKTIVACE FAKTORU V TROMBINEM

STRUKTURA F VII (domény)

(N

M W: 330kDa

C )

Faktor V

Ha

jl!

94kDa

na 71 kDa

Ha

jl,

.......

1

jl!

120kDa

r'

..... ---

N 94 kDa

těžký řetězec

+-{

)-ca2

Faktor Va

74kDa C lehký

.... ....

74kDa .... ....

řetězec

F Va mů že být akti vován i některým i dalšími pů s obky v nízkých koncentracích: plazminem , elastázou neutrofilů , desti čkov ým kalpainem, jedem Russelovy zmije. F u n kce : V kompl exu protrombin ázy společně s Ca2+ a fosfolipidy urychluje F Va rychlost proteolytického š těpení protrombinu faktore m Xa až 200 OOOkrát. FAKTOR VI Tento fa ktor je zde zmíněn z d ů vodu historick ého pohl edu, aby byla respektována posloupnost vzn iku číselných otnačeni j edn otlivych faktor ů . Později se tvrdilo, že ten to fa kto r tl člověka neexistuj e a že je p ťitom eti pouze u h o vězího dobytka. Dn es se tento termín nepou živ á. Faktor VI byl zto tožněn s n ěkter ym i fo sfolipidy, zej ména membráno vými fosfo lip idy vnitini dvojvrst vy memb rány krev ní destičky (fo sfatidylserin, [osfatidyletanolamin). V 70. a 80. letech minulého sto letí se označo val jako des tičkový faktor 3 (Platelet factor 3 - PF3). FAKTOR VII (PR O KONVERTlN) O MW 50kDa O Biologický p olo čas : 4-6 hodin O Koncentrace v plazm ě: F VII : 2- 5 mg/l (10 nmol/l ) aktivita: 0,7-1 ,3 F VIl a: < 100 pmol/l Lidský faktor VII cirkuluje v krvi ve formě zymogenu ja ko j ednořetězco vý glykopr otein o 406 aminokyselinách. Na N-konci se nachází doména bohatá na y karboxylov é skupiny glut amové kyseliny - gla oblast. Tyto karboxylové skupiny se získávají karboxylací y oblasti glutamové kyseliny zabudo vané v proteinov ém řetězci prozymogenu F VII. Karboxylace probíh á za účas ti vitaminu K v jaterní bu ňce (celkem je karboxylováno 10 C lu) . F VII p at ří tedy mezi serinové proteá zy - endopeptidázy s gla oblastí. 54

NHZ-~

)

S - - - - == - -

C LA - oblast zahrn ující y karbOA)llové skupiny glutamové kyseliny ECF - dom éna, ve kte ré p robíhají interakce mezi faktory SP - serinová p rotedza ""-/1 aktiva ční p eptid u volněný po p iem ěn ě zymogenu na aktivní serinovou p roV"l tedzu

F VII je v procesu koagulace proteolytick y štěpen na aktivní serinovo u prote ázu F VIla. K aktivaci dochází v přítomno sti trombinu nebo n ěkterého z faktor ů: IXa, Xa a Xla. Molekula F VII se š tě pí v mí stě Arg l 52 za vzniku dvou řetězc ů spojených kovalentn í jednoduchou disulfidickou vazbou. Řetězce aktivovaného F VII (F VIla)

• •

(MW: 20 kDa) - zako nč e n aminoskupinou (MW: 30 kDa) - z akon č en karboxy lovou skupinou. Obsahuje katalytickou doménu.

Lehký

řetězec

Těžký řete zec

STRUKTURA F VIl a (domény)

N H Z -B B-B lehký

řetězec

S

těžký řetězec

- COOH

S

55

Leh ký řetězec obsa huje Gla dom énu a dvě dom ény hom ologní s růstový m faktorem, tě žk ý zahrnuje aktivní místo enzymu. Aktivní forma F VII (F VIla) je stabilní po dobu asi 2,5 hodin y. Min imální hemostatická hladina se pohybuj e kol em 10 %. Aktivovaný faktor VII (F VIl a) se nachá zí v o l ně v cirkulaci v koncentraci odpov ídající přibli žn ě 1 % celk ového množství proteinu F VII , to odpovídá asi 2-5,5 ug/l, Množství volného aktivovaného F VII (FVIl a) v plazmě se postupně s věkem zvyšuje (Ma cik a Morrissey, 1991). Funkce: F VIla je ve lmi slabou serinov ou proteázou . Pln ý enzymatický poten ciál F VIla se proje ví tep rve až v komplexu s TE Po vyvázá ní na tkáňový faktor se její akti vita zvyšuje více než milionkrát (Waxman a spo l., 1992). F VIl a a TF vytváří na negativním fosfolipidovém buněčném povrchu na kalciu závislý kom plex [VIla . TF . Ca 2+. PI]. Tent o komplex tzv. vnější tetuiza , katalyzuje přeměnu fakt oru IX na IXa a faktoru X na Xa (Ne merson, 1992).

FAKTO R VII I (ANTlH EMOFILICKÝ FAKTOR A) O MW 330 kDa O Biologický poločas: 15- 20 hodin O Kon centrace v plazmě: 0,1-0,2 mg/l 0,7 nmol/l akti vita : 0,5-1,5 Faktor VIII je pla zmatický glyk oprotein - ~ globin o 233 2 aminokyselinách. V plazmě j e F VIII vázán do komplexu s vWE Molekula F VIII se váže na vWF poblí ž N - ko nce moleku ly vWE Vazebn é místo pro vWF má F VIII v oblasti svého lehkého ře tě zce . Komplex [VIII. vWF] pravd ěp odobně chrá ní F VIII před j eho biologic kým ště pením vlive m APC nebo F Xa (blíže o F VIII ve spoj itosti s vWF - viz kapitola vW F). Z této vazby j e u volň ov án kontaktem s fosfolipidy nebo trombinem za s o učas néh o u voln ěn í vazebného místa na strukturu fo sfo lip idů . F VIII má řad u shodných sekvencí s F V. Minimáln í aktivita F VIII, která je nezbytná k zás t a vě krvác ení j e vyšší než 25 %. Popisujeme je dnak funkční aktivitu faktoru VIII (FVlll:C) a antigen FVIII (FVIll:Ag). Gen pro FVIII je p oměrně velký a nach ází se na vrcholu dlouh ého raménka X chro mosomu. V součas né době je známo asi 80 rů zn ých muta cí F VIII (Wood a spol., 1984 ). Fun kčn í faktor VIII je char akterizován 3 strukturá lními doménami A,B,C a dv ěm a kyselými peptidy (a l , a2). Z krevní plazm y se podařilo izol ovat 2 ře tězce F VIII : • Těžký řetězec - HC (Heavy Ch ain) o MW 92000-210000, domény: AI , A2 , B • Lehký řetězec - LC (Light Chain) o MW 80 000 , domény: A3, Cl , C2

F VIII - str uktura molekuly (A, C - dom ény)

56

STRUKTURA F VIII (domény)

(

Al

I

A2

Cl I C2 ~......._A3_I _

" " ' - - J)

Tyto řetězce v přítomnosti fosfolipidů se spoj ují prostřednictvím Ca 2+ v koagu aktivní faktor VlIla. K aktivaci F VIII dochází limitovanou proteolýzou vyvolanou trombinem . V přítomno sti fosfolipi dů mů že být FVIII akti vován i pů s obe­ ním F Xa. Funkce: fu nkč ně aktivní F VIII (FVIIIa) funguje j ako proteinový kofaktor ve v n itřn í cestě aktivace protromb inu , při tvorb ě koagulačn ě aktivního komplexu tenázy [VIIIa . IXa . PI . Ca2+], nezb ytné k aktivaci F X (Vehar a spol., 1984). Reakce v komplexu tenázy je urychl ena v přítomnosti všech složek asi 10 OOOkrát. Nedostatek nebo funkční ned o statečno st F VIII může vést k t ěžkému krv ácivému defektu - hemofilii A . Klinická interpretace: hladina F VIII se zvyšuje při z ánětech, při chronických infekc ích a při stres u. lačně

FAKTOR IX (CHRISTMAS FAKTOR) O M W 55 kDa O Biologický poločas: 24 hodin O Koncent race v plazm ě: 3-5 mg!1 90 nmolll aktivita: 0,7-1 ,3 F IX je j ednořetězcový glykoprotein, který vzniká v j átre ch za úč asti vita minu K. Gla oblast obsahuje celkem 12 skupin y karboxyglutamové kyseliny. Při aktivaci se štěpí na 2 podjednotky vázané 2 disul fidickými můstky. Řadí se mezi endopeptidázy s gla oblastí.

o

Je popsáno asi 400 muta cíf aktoru IX

STRUKTURA F IX (domény)

®;.~~

NH2-B-B-GfJ;

S-------8

57

CLA - oblas t zahrnující y karboxylov ě skup iny glutamové kyseliny ECF - dom éna. ve které p robíhají interakce mezi fa ktory SP - serinovd protedza ~ aktivačn í p eptid uvolněný po piem ěn ě zym ogenu na aktivní seri no vou proV'-J te ázu

F IX je aktivován buď F Xla nebo koagulačně aktivním komplexem [VIla. TF . PL . Ca 2+] . Nejprve doch áz í k rozštěpení molekuly v místě Ala 146 za vzniku meziproduktu IX ex, kter ý je n ásledně konvertov án k plně aktivní formě IX ex13 ště pe ním v místě B (A rg 180). Lehký řetězec obsahuje Cla-doménu a 2 domén y hom olo gní s r ů sto v ým faktorem (EGF), těžký zahrnuje aktivní místo enzymu serinovou triádu (Se r365 , His 22 1, A sp 269) . Hemo statická hladin a potřebn á k zástavě krvácení se poh ybuje mezi 20-30 %. STRUKTURA F IXa (domény)

NHrBA-G(

- COOH

8-------8 Funkce: F IXa t voří koagulačně aktivní komplex v n i třn í cesty aktivace přemě­ ny protrombinu na trombin [VIIIa . IXa . Pl . Ca2+] tzv. vnitřní tetuizu, která aktivuje F X na Xa . FA K T O R X (FAKTOR 8TUARTA-PROWEROVÉ) (tuizev podle jména mu že a ženy, u kterých byla porucha poprvé ;:Ji.ftěn a)

o

MW' 58,9 kDa O Biologický poločas: 32 hodin O Kon centrace v plazmě: 6-10 mg/1 170 nmolll aktivita: 0,7-1,4 F X je d v ou řetězcový glykoprotein, který vzniká v játrech za ú časti vitaminu K. Gla oblast obsahuje celkem II skupin y karboxyglutamové kyseliny. Řadí se mezi endopeptidázy s gla oblastí. Lehký řetězec obsahuje Gla doménu a 2 dom ény homologní s rů stov ým faktorem (EGF) . Na těžkém řetězci je aktivní místo enzymu serinová triáda (Ser-His-Asp).

STRUKTURA F X (domény)

~.

NH'- B-B-G(- ,...----.. . 8

8

CLA - oblast zahrnující y karboxylo v ě skupiny glutamové kyseliny ECF - dom éna , ve které p robíhají interakce mezi faktory SP - seri novd protedza ~ aktiva ční peptid uvolněný po piem ěn ě zymogenu na akt ivní serin ovou proV'-J tedzu

Akt ivace F X probíhá v přítomno sti tenázy [VIIIa . . IXa . PL . Ca2+] nebo za úč asti kompl exu [VIla . TF . . PL . Ca 2+] . Při aktivaci dochází ke štěp en í těžkého ře­ tězce F X v místě Arg 52 - !le53 za současného uvolnění aktivačního glykopeptidu (AP).

Faktor Xa - aktivní místo serinové proteáz y a vazebná místa

STRUKTURA F Xa (domény)

NH'~B-G( 8 -- - - - - - 8

58

59

- COOH

K zástavě krvácení je potřeba nejmén ě 20 % jeho koaktivity. Funkce: Faktor Xa je součástí enzym atického koag u l ač ně aktivního komplexu protrombin ázy; která katalyzuje přeměn u protrombinu na trombin .

Během proteolýzy F XI dochází k roz štěpení dimerní molekuly v oblasti katalytického místa. Molekula zůs tává propojena přes disulfidické

ag u l ač ní

mů stky.

Inhibice F Xa v systému proteinu Z Protein Z (PZ) slouží jako kofaktor pro inaktivaci F Xa na fosfolipidovém povrchu. Vytváří se komplex s inhibitorem proteázového typu závislým na proteinu Z (ZPl - protein Z protease inhibitor ).

Str uktura molekuty faktoru XI (A - domény, LŘ -lehký řezětec)

FAKTOR XII (HAGEMANÚV FAKTOR) (podle n em ocněh o, u kterého byla poprvé zjištěna nepiitomnost tohoto fa kto ru)

FAKTOR XI (PLASMA TROMBOPLASTlN ANTECEDENT - PTA) (Nazýwí se též Rosenth al ů v f akto r podle autora, ktel:v ten to f aktor poprv épopsal) O MW 160 kDa O Biologický poločas: 60-80 hodin O Kon centrace v plazm ě: 4-5 mg/l (30 nmol/I) aktivita: 0,7-1,3 Koluje v krvi v neaktivní formě v podobě zymogenu (proenzymu) serinové proteázy. Je to glykoprotein, který je aktivován při tzv. kontaktní fázi plazmatického koagul ačn ího procesu (Thompso n a spol., 1977). F XI cirkuluje v obvodové krvi jako monodim er složený ze dvou identick ých řetě zc ů, vyvá zán nekovalentn í vazbou do kompl exu s HMWK (Hu a spo l., 1998). Minimální hladina pro koagulaci je 15-20 % aktivity. F XI si l ně adheruje k aniontový m povrchům, jako je sklo, celit , kaolin a je také vyvazová n na povrch krevní destičky. Studie prokáz aly na každé d e sti č ce asi 300 navázaných molekul F XI (Hu a spol., 1998). F XI p řítomný v desti čkách není identický s F XI kolujícím v plazmě. F XI je aktivován limitovanou proteol ýzou zpro středkov anou F XIIa (v přítom­ nosti HMWK a n egati vn ě nabitých povrchů ) . Aktivace je možná i trypsinem , F VIla a trombinem. Taxonomicky se řadí se mezi endopeptidázy.

o

MW 80 kDa O Biologický poločas: 50-70 hodin O Koncentra ce v plazm ě: 30-40 mg/l 400 nmol/l aktivita: 0,7-1 ,3 Jde o glykoprotein vznikající v játrech. F XII se řadí mezi serinov é proteázy. V p o d o bě zymogenu (proenzymu) nereaguje za fyzio logických podmínek s povrchem cévní s tě ny. Nach ází se jak v p lazmě, tak i v séru. K aktivaci faktoru XII dochází kontaktem se subendoteliálními strukturami při poškození povrchu cévní s tě ny. Akti vačním povrchem mů že být i sklo, kaolin , celit, dextran, sulfáty, elegová kyselina , kloubní chrupavka, ků že , mastné kyseliny a endotoxiny. Štěpení kalikre inem v místě F XIIa směřuj e k tvorbě F XIIa , vytváří se dva proteinové řetězc e spojené disulfidickou vazbou. Lehčí řetěze c (MW = 28 kOa) obsahující karboxylovou skupinu nese katalytickou triadu (Hitl°, A sp 89, Ser I9 1) , zatímco těž ší řetězec (MW = 52 kOa) s amino (-NH z) skupinou zaji šťuje připoj ení molekuly k aniontovým povrchům Štěpení kalikreinem v místě F XII~ vede k tvorbě složky, která může aktivovat prekalikrein, ale nemá výraznou prokoagu lační aktivitu.

STRUKTURA F XII (domény)

~

STRUKTURA F XI

r

H2-[

~: ...

I. I.

I I I A2

AJ

A4

60

I

Aktivní místo E )-

...

Aktivni místo E

~

AI

~

~ :a

(domény)

~

~

L-

COOHJ

8-

-

-

-8

EGF - struktura podobn á epide rmálnímu růsto v ému faktoru Type I a II - domény podobné těm, které se nachází u fib ronectinu 61

COOH

FAKT O R XIII (TRANSGLUTAMINAzA, E C 2.3.2.13 ) (fak to r sta bilizujicťflb rin) O MW 320 kDa O Biologický poločas: 40-50 hodin O Koncentrace v plazmě: 10-20 mg/I 50 nmol/I F XIII j e zymogenní forma glutam inyl-peptid y-glutamyl tran sfe rdzy. Nachází se jak v plazmě vázán na molekulu fibrinogenu, tak i v buněčných komponentách (krevní destičky, megakaryocyty, monocyty), dále i v placentě a játrech. Krevní destičky obsahují asi 50 % celkové aktivity F XIIIa (většina je uložena v cytoplazmě krevní destičky a je uvolňována při její aktivaci). Struktura faktoru XIII: • Faktor XIII přítomný v plavně je syntetizován v játrech a cirkuluje v podobě tetratneru (MW = 320 kDa), který obsahuje 2 páry dvou neidentických subjednotek (A2,B2). Podjednotky A a B jsou přítomny v plazmě i jako samo statné komponenty. • F XIII přítomný v buiikách je v nich syntetizován v podobě dimeru (MW = 146 kDa) složeného ze dvou identických A řetězců (A2). A jednotky z plazmy a z buněk jsou funkčně identické. A podjednotka je dále funkčně shodná s ostatními transglutaminázami, které zajišťují stabilizaci tkání kovalentně vázanými proteiny. Každá A subjednotka obsahuje 6 volných SH skupin, které poskytuje Cys , z nichž jedna je součástí aktivního místa F XIIIa (A2'). B podjednotka je částečně homologní se skupinou proteinů regulujících komplement. Hraje důležitou roli v regulaci aktivace F XIII. B podjednotka je tvořena v játrech a v plazmě je přítomna, buď v podobě tetrameru společně s A podjednotkou nebo samostatně v podobě dimeru. Je pravděpodobné, že jednou z funkcí B podjednotky je stabilizace podjednotky A (Mu rbeck a spol. , 1999). Aktivace faktoru XIII Přeměna F XIII na F XIIIa je výsledkem hydrolýzy vyvolané trombi- IO~ (FibriD' nem v místě Arg 36_Gly37 u N-konce A subjednotky. Tento proces je usnadněn disociací B2 dimeru od A2 dimeru za účasti iontů Ca z+ a fibrinogenu. Hydrolýza F XIII katal yzovaná trombinem je podporována polymerním fibrinem. Tím je zajištěno, že nemůže vznikat velké množství F XIIIa v době, kdy není ještě vytvořen fibrin, Fibrin urychluje štěpení subjednotek faktoru XIII trombinem a usnadňuje jejich di sociaci z centrální molekuly.

10

Aktivace F XIII trombinem 62

,

AKTIVACE F XIII (XIIIa)

®

Fibrinogen

FXIIIa

FXIII

,

~

G

nosič

Funkce F XlIIa V koagulační kaskádě F XIIIa stabilizuje fibrinovou sraženinu provazamm a a y řetězců fibrinu za vzniku homopolymeru. F XIIIa katalyzuje formaci intermolekulárních vazeb mezi různými proteiny. Další substráty, které může ovlivnit F XIIIa jsou fibronectin, a-2-antiplazmin, kolagen, F V a vWE Mimo svoj i úlohu v hemostáze ovlivňuje F XIIIa hojení ran a je důležitý i při udr žení plodu v době těhotenství.

F

I B R I N

/7 - (CH )z - C

o

<,

NHz

!FXllla

la ~ ! +G ~ "

GrG

®

Trombin, Ca2+ ~

e F I B R I

-(CH)z -C

/7

o

F

I B

<,

NH- (CH2)4 -

N

R

I N

PREKALIKREIN (F LET C H E R ÚV FAKTOR) O MW: 90 kDa O Biologic ký poločas: 30 - 40 hodin O Konc entrace v pla zm ě: 35 - 50 mg/l 400 nmol/I Prekalikrein (z řeč. kallikreas = slinivka břišní) je proteináza syntetizovaná ve 63

slinivc e b ři šní a v játrech. V krevní pl azm ě se vyskytuje ve formě zymogenu , který je vyvázán na HMWK. Prekalikrein je aktivován F XIIa nebo ~ na n -ka likrein. Kalikrein aktivuje F XII a zvyšuje uv olňování ki n i nů z kininogenů (Schloesser a spol., 1997). Struktura: molekul a prekalikreinu je složena z jednoho těžkého a dvou typ ů lehkých řetě zc ů .

Plazmatický koagulační systém se aktivuje: • stykem s tkáňovým faktorem • kontaktem se subendotelovými strukturami V některých částec h systému koagulace se upl atňuje kaskádovité zesileni. Pů vodní vyvolávací signál je mnohonás obn ě zesílen. Na každém stupni pak dochází ke zvýšení koncentrace meziproduktu .

VYSOKOMOLEKULÁRNÍ KIN INOGEN (High molecular weight kininogen - HMW K) O MW 120 kDa O Biologicky po ločas: 120-1 50 hodin O Koncentrace v plazm ě: 60-80 mg/l 700 nmol/l Kininogeny jsou plazmatické proteiny syntetizované v játrech a endotelu pupečníko v ých žil. Z k i n i nogenů vznikají za sp o l u účas ti prekal ikreinu nebo jin ých kininogendz: v rámci kininového metabolického systému vazoaktivní peptidy nazývané kininy (Heimark a spol., 1980). Nejd ůležitěj šími kininy j sou bradykinin a lysylbradykinin (oba ú činn ě snižují cévn í propu stnost, vyvolávají kontrakci hladkých s val ů a navozují pocit bolesti). HMWK se váže na povrch aktivovaných krevních de sti č e k a také na neutrofily a bu ňky endotelu. Funkce: Kininy se v hemostáze váží s po leč ně s F XI a prekalikreinem na poškozenou cévní s těn u a to tak, aby se vytvoři la optimální vazebná poloha vzhledem k faktoru XII. HMWK působ í jako kofak tor při aktivaci F XII kalikreinem. Přítomn o st HMWK umožň uje vyvázání prekalikreinu a F XI na z áporně nabité povrchy. HMWK je pak štěpe n kalikreinem ve třech krocíc h na š těp né produkty (bradykinin vzniká ve druhém kroku š těpení) .

AMPLI FIKACE SIGNÁLU SE ZVÝŠENÍM KONCENTRACE FAKTORŮ

2.3.4. Přeměna protrombinu na trombin K •

•

přeměně

protrombinu na trombin cesta aktivace protrombinu - v ětšinou je porušena celistvost cév a krev uniká s cévy a dostává se do okolních tkání. Aktivace nastává stykem s TF. vnitřní cesta aktivace protrombinu - většinou neni poru šena celistvost cév . Ak tivac e nastává kontaktem se subendote- L -

může

dojít dvěma cestami:

vnější

Prot rombin

~ L-L

( l imenll.2..priíi ~tr\i om:;bliin ~ L-L FXa

Trombin

-r~ Membrána krevní

destičky ----'

Přem ěna

protrombinu na trombin

liálními strukturami. Pře sto že jednotlivé reakce v procesu krevního sráže ní jsou p om ěrn ě dobře popsány, vlastní s pouš těcí mechanismus celého procesu je bezpochyby komplexní a složitý děj, závislý na řadě složek a faktorů , z kterého známe jen část dílčích HMWK - struktur a molekuly s vazebnými místy

64

úseků .

65

SCHÉMA KOAGULAČNÍCH DĚJŮ Vnitřní

mostázy je tvorba koagu l ačn ě aktivního komplexu [TF . VIl a] v m í stě poškození cévy (Nemerson. 1988). V pl azmě je vždy p řítomno malé množství akt ivovaného F VII (F VIl a), který m ů ž e vo l ně cirkulovat v krvi. Koagul ačn ě aktivní komplex [TF . VIla] vyvázaný na fosfolipidové matrix bun ěčné membr ány a v přítomno sti iont ů Ca 2+ aktivuje koagulaci přímo v místě poškození cévní stěny. Komplex [TF . VIla] konvertuje přeměnu: • F X -7 F Xa Dochází k mnohonásobnému zesílení (amplifikaci)

cesta

negativně

na bitý povrch HMWK

PK

XII ~Xlla XI

Ca 2+ HMWK Xla ~

Vněj ší

* - ___

I

.... <,

IX

VIII _

cesta

VII

IXa c a 2+ VIIIa - - - - - - - - •• PI

', " VIla + TF

l

!

..--........

"

p ů vodn íh o podn ětu.

cévní poškození

~~ X Xa X V ---+ Va

•

F Va p otřebný k ván F Xa:

~

~

Y

XIIIa

I

Xa

No vě generované faktory Va a Xa se pak uplatní ho komplexu - protrombintizy .

2.3.4.2.

Vnitřní

při tvorbě koag u l ač ne

aktivní-

(illtrinsi c) systém

... ~

Vnitřní systém aktivace přeměny protrombinu na trombin se spou ští ve fázi kontaktu. Při ní dochází k aktivaci F XII. F XlIa dále aktivuje faktory XI a IX, přičemž během této kaskádovité reakce dochází k amplifikaci (zesílení) vyvolávajícího efektu a k aktivaci faktorů V a VIII. Faktor IXa a VlIl a tvoří tenázu, která generuje do. statečné množství F Xa a ten společně s faktorem Va g v komplexu protrombinázy konvertuje protrombin na trombin. Vzniklý trombin akti vuje přeměnu fibrinogenu na fibrin. Fibrinové monomery polymerují a vzniklý polymer se stabilizuje F XII Ia aktivovaIII ným trombinem - vzniká nerozpustný fíbrin,

(extrinsic) systém

66

•

XIII

Polymerovaný fibrin ~ Nerozpustný fibrin

Vnější systém aktivace přeměny protrombinu na trombin se spouští po expozici tkáňového faktoru, při které dochází k vazbě F VIla vol ně cirkulujícího v plazmě na TF. Vytvořený komple x aktivuje F Xa, který společně s F Va vstupuje do komplexu protrombinázy a konvertuje přeměnu protrombinu na trombin. Vzniklý trombin aktivuje tvorbu fibrinu z fibrinogenu. Fibrinové monomery polymerují a vzniklý polymer se stabilizuje F XllIa aktivovaným trombinem - vzniká nerozpustný fibrin. Při poru šení kontinuity cév se krevní složky dostávají do tkání. Poškození tkáně vede k porušení endoteliální bun ě čn é bar iéry, která n orm áln ě od dě l uje buň ky nesoucí tkáiiový faktor - TF od cirkuluj ící krve (Weiss a spol., 1989). Klíč ovým bodem iniciace he-

--'

Proteolyza

Trombin

~

Vnější

L-

X

Fibrinogen -----+ Fibrin monomer

2.3.4.1.

protrombinázy je aktivo-

[TF. Vil a. Ca 2+ . PI]

Ca 2+ PI

Protrombin

vytvoře ní

~ ....'I!!:1I..

Im~=

U

vnitřn ího

systému dochází k aktivaci kontaktem

při neporu šen ě kontinuitě

1980). Sled

V nější

systém aktivace protrombinu

cév (Heimark a spol.,

d ěj ů

je zahájen aktivací Hagemanova faktoru po jeho kontaktu s poškozeným cévním povrchem (negativ ní náboj, subendotelové struktury).

67

lBI ~1iIllIII ~1iB ID

Vni třní

systém a ktivace protrombinu

Kontaktní povrchy • in vivo - subendotelová pojivová vé fosfolipid y) • in vitro - sklo, kaolin , silica Průběh

tk áň

(kolagen), povrch

trombocytů (de stičko­

F Xa sp o leč ně s F Va, fosfolipid y buně čn é membrány krevní desti čky a ionty Ca 2+ vytváří koagul ačně aktivní komple x protrombin ázu; který štěpí protrombin na trombin v mí stě , kde je navázána aminok yselin a A rg. Podmínkou celého procesu je přesn á prostorová orientace všech zúčastn ěn ých složek (Hem ker a spol., 196 7).

kontaktní fáze

Molekulový charakter děj ů běh em kontaktní fáze není ještě zcela objas něn . Předpokládá se, že F XII po styku se sebendoteliální výstelkou měn í svou konformaci a stává se u stericky pří stupným k pů­ sobení komplexu HMWK (Hig h molecular weight kin inogen) a kallikreinu. Tento komp lex jej hydrolyticky ště p í na dva fragmenty s aktivitou F XII (označ ují se F XIIa, f). ' - -- - - - - - - - - - - - - - -- - Vzniká tak cyklický děj , v němž se nejprve F XII aktivuje stykem se subendoteliální stru kturou - vzniká malé množství F XIIa, který v přítomnosti HMWK přemě­ ň uje prekalikrein na kalikrein. Ten pak hydrolyticky štěp í F XII na jeho fragmenty vzniká F XIIa, f. F XIIa mů že aktivovat i přeměnu plazminogenu na plazmin. V průběhu

koagulační kaskády se v této cestě postupně aktivují: hill~

Protrombin

Faktor Xa

FaktorXa

Fak tor Xa proteolyticky štěpí protrombin v místě Arg (F Va při proteo lýze funguje jako kofaktor). Při tvorbě protrombin ázy dochází ke zm ěnám konform ace molekul. Faktor Va se váže svým lehkým i tě žkým řetězcem na F Xa a k protrombinu se váže F Va svým těžký m řetězcem.

... hm ... [i

F VIIIa (aktivovaný trombin em) spolu s F IXa, s Ca2+ a fosfo lipidy aktivuje F X. Tomuto komplexu se říká vnitřní tetuiza. Protrombin áza je velmi účinn ě vyvazována na receptorová místa mem- ~ '--.........,/ brány krevní desti čky. Na povrchu krevní de sti čky bývá I 000-3 000 vazebných míst pro protrombinázu. Protrombináza š těpí protrombin na '-----J trombin za uvoln ění frag me n tů I a 2 (Fl , F2). Faktor Xa může sám vyvolat p řemě­ nu protrombinu na trombin, ale vazbou protrombinázy na krevní destičky se přeměn a protrombinu na trombin urychlí až 200 OOOkrát (Swars a spol., 1991) . Smy slem této neobyčejně rychlé produkce trombinu vázané na povrch trombocytu , je: Tenáza Obě

cesty, jak vnitřní, tak i vnější vedou ve své konečné fázi k akti vaci F X. 68

ZAJISTĚNí KOAGULACE STŘEDNĚ

v TÉ OBLASTI,

v MíSTĚ NARUSENÉ ENDOTE LOVÉ STR UKTURY, TEDY BEZPIWVE KTER É SE TVOŘÍ DESTI CKO VÁ ZÁTKA.

69

Tomu brání: • ředěn í aktivovaných faktorů jejich mísením s krevní plazmou - inaktivace trombinu • inakti vace protrombinázy (inhibicí a cestou stérické zábrany)

2.3.5.

Přeměna

fibrinogenu na fibrin

Trombin vyvolá přeměnu fibrinogenu na fibrinové monomery, které spontán ně polymerují a působením aktivovaného faktoru XIII (Xl IIa) vytv áří v konečné fázi nerozpustný fibrin. F XIII je aktivován trombinem (McKee a spo l.. 1972).

2.3.5.1. P l"eměna fibrinogenu na nerozpustn ý fibrin

Fibrinogen

j

Trombin

...",-"

o-e-o+ 1I11 Fibrin monom er

+ fibrinopeptidy

~~L-~~ Po lymerovaný fibrin

lXllla

Fibrinogen je molekul a se 3 doménami (2-D-dom ény jsou propojen y pře s doménu E). Trombin štěp í koncové amino skupiny řetě zců a v mí stě R 16 - G 17 a ~-řetězce fibrinogenové molekuly v místě R 14 - G 15 za od štěpen í dvou fibrinop eptid ů A (FPA) a dvou fi bri no pep ti d ů ,-B (FPB). Jde o malé peptidy (FPA peptid o 16 aminokyselinách a FPB peptid o 14 aminok yselinách), které D-doména tvoří asi 3 % hmotno sti molekuly fibrinogenu . Uvoln ění FPA probíhá rychleji než uvoln ění FPB . Urychlení odštěpo­ vání fibrinopeptidu B z molekuly fibrinogenu je pak zp rostře d ková no postranní asociací fibrinovýc h mo no merů při t v orbě fibrinu (Dy r a spol., 1989).

~ L-

Nerozpustný Ilbrln

---.J

Přeměna

fibrinogenu na nerozpustn ý fibrin

--, E·dom éna

D-dom én a

70

~

FPA FPB Fibrin monomer vzniklý po o dštěpen í obou fibrinopeptidů má molekuly a je náchylný k polymeraci.

změněno u

strukturu

Polymerace fibrinu Polymerace fibrinových monomerů probí- , - - - - - -- - - - - - - - - , FPA FPB há v první fázi na základě interakce komple- 1. Aktiv ace .t mentárních vazebných míst mezi doménami ~, E a D. Labilní čás ti ce se samo v o l ně spojují ne- ~ibril~~ kovalentními vazbami do větš ích ce l ků - vzniká intermedidrni polymer. Fibrinová vlákna se 3. Fibr inov é vazby napojují na sebe svými konci (v oblasti D-do- ~ mén). Následn ě vazebná místa E domény reagují s komplementárn ími místy y řetězce Dvdomén y p řil ehl ých fibrino vých mon om e rů L -----l (strana ke s tra ně) . Tak se p o stupně tvoří dvou- rrr- - - - - - - - - ---..------, vláknové protofibrily, ve kterých jsou jednotlivé monomery v sousedních vláknech navzájem posunuty o polovinu délky molekuly fibrinogenu - vzniká rozpustný fibrin . Tvoří se vlákna o průměru 40-200 nm, která nejsou mechanicky příli š pevná - fibrinovy gel .

-~

Stabilizace fibrinu F Xllla Zpevněn í se dosahuje ,----- - - - - - - - - - -- - - - - ----, -H N-CH -CO-R -HN-CH-CO-R ú činkem F XIIIa, který (CH2h (CH2h v příto m nos ti vápníkoco co- NH2 I vých i ontů vy tváří mezi NH2 + NH3 C- koncovými částmi y ře­ (CH2b F Xllla, Ca2+ NH2 R-NH - CH- CO-R tězců sousedních molekul (CH2 b R-NH -CH-CO-RNerozpustný fibr in v protofibrilách fibrinu pří čné kovalentní dvojné L --l

Fibrinové monomery U voln ěním těchto p eptidů se obnaží vazebná místa v centrální E-domén ě fibrinoge nu. Molekula tvoří nodulární strukturu, která mů že být dále segmentována do centrální E-dom ény a dvou D-dom én - vznikají tzv. fibrinov ě monomery , Nejpr ve se p ů soben ím trombinu odš těp í fibrinopeptid A (FPA) - fibrin 1 monomer a v další trombin odš těpí fibrinopeptid B (FPB) - fibrin 2 monomer. '--

~

Trombin Trombin Fibrinogen ~ Fibr in monomer 1 ~ Fibrin monomer 2

II

---'

vazby (mezi H 2N-CHr skupinou Lys"°6 j ednoho monom eru a H 2N- CHr skupinou Glu398 monomeru druhého). Dochází k příčnému vyztužování vláken, jejich zvětšení a tím zpev nění koagula - vzniká polymemi stabilní fibrin (Sobel a Gawinowitz, 1996). Tato tříro změrn á struktura fibrinu není rozpustná v moč ovin ě a je mnohem odolněj ší proti účinku proteináz (Olexa a Budzynski, 1980). Struktura fibrinu je ur č o-

71

SCHÉMA ŠTĚPENÍ FlBRINOGENU NA FlBRIN A JEHO POLYMERACE NA FIBRINOVOU SÍŤ

vána poč áte ční rychlostí "aktivace" fibrinogenu (tj. o dštěpováním FPA a FPB trombinem) a koncentrací fibrinogenu.

Fibrin není pasivní substrát, reguluje mnoho různých fyziologických reakcí a procesů : • moduluj e lýzu fibrinu nebo fibrinogenu • akt ivitu trombinu • akti vitu faktoru XIII • adhez i buněk

Trombin Stabilizace polymerovaného librinu faktorem XIIIa

FPA Fibrin monomer

o

O tloušťce fibrin ovych vláken, o velikost i p ár ů fibrin ov ě s ítě a tím spoj enýc h mechanický ch vlas tnostech - . Jrombogen ic it ě" fibrinu a tak é odolnosti k fi brinolyze rozhodují kin etické faktory p ťi tvorbě fib rinu. Podstatn ě se také uplatiiuje koncentrace fib rinogenu. O Takto vytvoieny stabilizovaný fi brin j e ne rozpustny v roztoku mo čoviny a v kyselin ě monochloroctově. Fibrin, který vznikl bez piitomnosti F Xl/I a Ca 2+ je v těchto roztocíc h rozpustný. O Ph pi'etn ěn ě fibrinogenu na fibrin se m ění vlastnosti molekuly. Odštěpením fibrin op eptid ů , p ůsob enim trombinu a v d ů sledku konform ačních změn p rovázejících polytnerizaci se vytvdii nové struktury, které mohou p ů sobit jako reg ulační místa p ro řadu mech an ism ů (zejména v oblasti fib rinolyzy). Nerozpustný librin - elektronový snímek

2.3.6. Úloha trombinu v hemokoagulaci

II

~!

II

FPB

0-0-0

! Polymerovaný fibrin

Ca 2+

F XlIIa

Nerozpustný fibrin

Trombin má řadu specifických vazebných míst, které se různě uplatňují v jeho četných aktivitách.

Trombin je vícefunkční bílkovina a mnohými biologickými aktivitami v hemostáze a trombóze: • Akti vuje plazmatick é faktory a krevní destičky • Podílí se na forma ci fibrinu (plazmatický koagulační systém, F XIII) • Podílí se na inhibici koag ulace a fibrnolýzy (APC, TAFI) • Ovl i vňuj e funkce některých buněk

O Trombin vázaný na fibrin významně ovliviiuj e aktiva ci plazminogenu. Trombin vyvázaný v tomto dim erním komplexu j e necitlivý k hepa rinu a j e pra vděp odob­ n ě piičin ou i ady heparino vycli rezistencí u n ěkterycli klini ckých stavů . Vazba tromb inu závisí na struktuie fib rinu, na tloušťce je ho vláken a na množstv í od-

72

73

štěpených fib rinopeptidů.

SCH ÉMA AKTIVACE KOAGULAČNÍCH PROCES Ů

Podle nejnovější teorie existují • Iniciační fáze • Amplifikační fáze • Propagační fáze

tři

fáze koagulace:

Nový tří stupňový model 20 0 koagulace vystihuje proces hemostázy in vivo, lépe než kla- ! 150 sický MacFarl an ů v model kas- :lj 100 TFPI Prctr ornb tnáza {F Xa/F Va/ P1/ Ca kádovitých reakcí a umo ž ňuj e ~t- 50 Vnitro l tenaza (F IXa/F Vlll a/P I/C a j vysvětl i t patogenezi protromTVorba k oag ula Tromb in - aktivace botických sta vů . V koagul ač­ F VlI aF V 10 20 ních procesech prob íhající ch Čas (mi nuty) ....J v organismu se více upl at ňuje L v nějš í systém, kdežto vn itřn í systém iniciuj e koagulačn í děj e hl a vn ě na artificiálním povrchu v systémech in vitro. Iniciační fáze probíhá na povrchu m onocytů, kdežto fáze am p lifi kač ní a č ás teč ­ n ě i propag ační probíhají na povrchu aktivo vaných tromb o c ytů. 20

]

20

destiček

tr"J ~J . . í) ...;1

2.3.7. 1.

2.3.7. Nový pohled na

koagulační děje

VÝS LEDKY ZKOUMÁNí RŮZNÝCH MODELŮ HEMOSTÁZY IN VITRO A OBJASNJ1Ní ŮLO­ HY INHIBITORŮ POTVRDILY, ŽE VNITŘNí A VNJ1JSí SYSTÉM NEMOHOU V ORGANISMU PŮSOBIT ODDJ1LENJ1 A ŽE EXISTUJ í VZÁJEMN É INTERAKCE MEZI ŘADOU KOAGULAČ­ NíCH FA KTORŮ A TíM I MEZI OBJ1MA SYSTÉMY KOAGULACE. ZJISTILO SE, ŽE:

• • • •

Vnitřní

systém není nezbytný pro iniciaci koagulace Koagul ace převážně probíhá na povrchu membrán krevních buněk Průběh koagulačn í ch reakcí není pří sně kaskádovitý, ale dochází k řadě interak cí mezi faktory v ni třního a v nější ho systé mu Hem ostáza není jen aktivová na při poškození cévy, ale i fyz iologic ky po námaze nebo po jídle. Dále bylo zj iš tě no, že jednotli vé so učás ti a procesy v hemost áze podléhají dennímu rytmu v závislosti na změn ách neurohumorálního a imunitníh o systému. Rovn ěž krevní de sti čky jsou aktivovány v cévním řečišti i při zachování integrity cévy (Galajda a spo l., 1998).

74

fáz e

Ve ,J ázi iniciace " je hlavním iniciátorem ko agulačního procesu in vivo nyní pojímán tkáňový faktor (TF). Proces iniciace hemostáz y, který prob íhá hl avn ě na povrchu mono cy tů vede k procesu regulo vané geneze trombinu (Andree a Ne me r-son, 1995). Výsledkem iniciační fáze je tvorba malého množství trombinu, který sice nedostačuje pro pieměnu fibrinogenu na fibrin, ale má význam pro pokračování koagulace v tzv. "amplifikační" a "propagační fázi". O F XIIa se na iniciaci koagulační kaskády in vivo většinou nepodili. Jak se ukázalo byla aktivace koagulace v tzv. koruakmi fdzi pouze artef aktem in vitro studií. pii kterých se pou žívaly nadm ěrn ě dávky aktiv átorů a artefici álni povrchy. Vyšeti'ení nemocných s deficitem nebo def ektem F XII ukázala, že u těchto nemoctiych nedochází k narušení iniciace hemostdzy a to i v ptipadě kardiochiru rgickycli zákroků s mimotělním ob ěhem. Expe riment álni práce na zviiatecn prokázaly, že vyvázání F XII protil átkami neovlivni pr ů běh koagulačních reakcí in vivo (M iller a spo l.. 1996).

Tkáiíový faktor se normálně nachází ve dvou rozdílných podobách, které se ňují na iniciaci koagulace za rů zn ých podmínek: •

TYTO NOVÉ POZ NATK Y VEDLY K REVIZI DO TÉT O DOBY POUŽíVANÝCH M ODELŮ A K VYTVO ŘEN í NOVÉ KO NCEP CE SRAŽENí KRVE.

Iniciační

zúč a st­

Sub endotelová a perivaskulárnisložka TF - zahrnuje povrch fibrobl astů v subendoteliální a perivaskulární oblasti a dále parench ymové buňky jako jsou mozek, plíce, ledviny, endometrium a placenta. Tato složka je charakterizována bazální expresí TF a zvýše ním jeho syntézy vlivem některých rů stov ých faktorů . 75

•

Perivaskulární exprese TF vytváří ochrannou vrstvu před masivním krv ácením. Zúčastňuje se hemostázy hlavně při poškození cévy, kdy ž se krev dostane do ko ntaktu s tká němi. Cévní složka TF - za hrnuje monocyty a endotel. V těchto buňkách nedochází k sy ntéze TF. Exprese na těchto buň­ kách je indukována různými podněty mezi které patří TNF (tumor necrosis ~ / TF ondoIoUWt:u'W:.llI factor) , endotoxin, interleukin I, lipopoTF TF Iysacharidy, n ě k te ré růstové faktory a trombin. (Conkling a spol. , 1988; Conway a spol., 1989; Mo ore a spol., L --' Exprimace TF na

1987; Cozzolino a spol., 1988).

některých buňkách

[T F. VIla . Ca 2+ • Pl] a současně se potencuje další exprese TF (Preis sner a Kans e, 1996). Aktivované monocyty j sou nej úči n něj ší m spou ště­ če m koagulace v cévním systému a to zejména tehdy, je-li exprese TF na endotelu velmi malá. K účinné hemostáze je však potřebná adheze monocytů k akt ivo vanému povrchu endotelu, která zvýší i expresi TF (Camerer a sp ol, 1996). V krvi koluje vždy malé množství F VIla « 100 pmol/I), který na rozdíl od ostatních seri nových prot eáz nem á sám o sobě prakticky žád nou proteolytickou aktivitu (Ma cik a Morrissey, 1991).

O Za fyziologických podmínek oddělují TF od cirkulace jednak endotelová bariéra (subendotelová a perivaskulární složka), tak i mechanismy selektivní exprese (cévní složka T F). B uňky, kte ré jsou s krví v pří mém ko ntaktu (endotelie, krev ní elementy) exprimují TF až po stimulaci. Pokud nedojde k přímém u poškození cévního systé mu, probíhá exprese TF hlavně na aktivovaných monocytech. Aktivace monocytů může být vy volá na řad ou příčin - z ánět , sepse, metabolický rozvrat, atero sklerotické z m ě ny aj . (Osterud a Bjorklid, 2001). monocyt ů se na chá zí j en asi 20 % jejich TF aktivity. Aby se projevila celá kapacita aktivity TF je pra vděpodobn ě nutná spo lupráce mono cyt ů s granulocyty a trombo cyty. Piedpoklddd se, že aktivované monocyty produkují TNF-a, který stimuluje granulocyty k tvorbě faktoru aktivujícího trombocyty (PA F). Tento faktor zvyšuj e exp resi a aktivitu monocyt árniho TF prostie dnictvim trombocyt ů (Osterud a Bjorklid, 2001 ; ten Cate a spol., 1999 ).

O Na povrchu aktivovan ých

P ů vod v plazm ě cirkulujícího faktoru Vlla neni zcela ja sný. Piedpokldd áse, že se v malých mno žstvích samo volně akti vuje, zej ména po jídle účinkem lipoprotein ů bohatých na triacylglyceroly. K aktivaci by moh lo docházet na povrchu fosfo lip idovych mikropartikuli za spoluúčasti F IXa (Baue!; 1997).

TF váže přímo aktivní faktor VII (F VIla), ale současně může vázat i inakti vní formu (F VII ). F VII I#~~~ je následně konvertován v komplexu s TF na aktivovanou formu (F VIla) autokatalytickým komplexem [TF . VIla] případně dalšími koagulačními proteázami (IXa, Xa, trom bin , plazm in). <,

Komp lex [TF . VIla]

K INICIACI KOAGULACE JE NEZBYTNÉ VYTVOŘENí KOMPLEXU [T F. VIlA] . TENTO PROCES JE ZÁVISLÝ NA UVOLNĚNt TF Z POVRCHU NĚKTERÝCH BUNĚK NACHÁZEJíCtCH SE V KRVI NEBO PŘICHÁZEJtcíCH DO STYKU S KRVí ADÁLE NA DOSTATEČNÉM MNOŽSTVí FVIIA, KTERÝ V MALÉM MNOŽSTVí CIRKULUJE V PLAZMĚ . Průběh

koagulace při exprimaci cévní složky TF Iniciační fáze koagulace probíhá na povrchu aktivovaných monocytů exprimujících TF. Faktor VIla se váže k membránovému TF na povrchu buněk za vzniku dimerního komplexu [TF .VIla]. TF v komplexu s F VIla p ů s o b í nejen jako kofaktor, ale zvyšuje jeho proteolyt ický účinek až 3 OOOkrát. Při vazbě F VIla na TF dochází současně k přenosu aktivačního signálu do buňky. Z vyšuje se koncentrace n i trobuněčného vápníku, aktivují se proteinové kinázy C a adhezivní kinázy. To se projeví inhibicí fosfolipido vé tran slokázy a zafixov áním čás ti buněčné membrány - vzniká plně účinný tetramerní komplex

76

TF + VII a

..

[T F . VIla ] aktivní komplex

t

({TF.Vlla), 1Xa, Xa, TF + VII

Plazmatická membrána

trombin, p lamiin)

.. [TF . VII] neaktivní komplex

[TF . VIla. Ca 2+ • PIJ

77

Komplex [TF. VIla] společně s fosfolipid y a ionty Ca 2+: • Limit ovanou proteolýzou aktivuje faktor IX na IXa (Rao a Rapaport, 1988):

F Va p otřebn ý k vytvoření malého množství protrombinázy na povrchu buněk exprimujících TF je aktivován buď F Xa nebo bu ňkami , které produkuj í nekoagul ační proteázy.

x

o

F lXa je daleko lépe ch ráněn proti inh ibič­ ním vliv ů m než F Xa a proto v aktivní form ě pie trvdv á až do p ropagačn í f áze, kdy j e adsorbován na m em b rán ě trombocytu a spo lečně se svým kofaktorem (F VlIla) tvoii tzv. "vnitřní ten ázu".

[TF . VIla . Ca2+ . PI] ~

Xa

Vzniklé malé množství trombinu aktivuje faktory V, VIII, XI, a krevní destičky v místě poškození tkáně.

Ca 2 +

n ahromaděné

IXa<

Trombocyt

X

/ ~....

"V nitřní tenáza"

;

~

."<. ~

~.....

.•....

~

<, ~

•

V systému tzv. "vněj š í tenázy" aktivuje komplex [TF . VIla] faktor X:

II·.'M~ FVlla

......

......

V+Va

VIII+VIIIa

IX+IXa

Souběžn ě

se vznikem komplexu [TF . VIla] dochází k aktivaci inhibitoru tká faktoru (TFPI - tissue factor protein inhibitor). Protože pů sobení komplexu [TF . VIla] je ohrani čen é jen na povrch buněk exprimujících TF, dojde po navázání TFPI k zablokov ání této cesty aktivace. Dochází i k inhibici faktoru Xa, který pokud opustí ochranné prostředí buněčného povrchu je rychle vyvázán AT na inaktivní komple x.

iiověho

Aktivovaný faktor X se na membráně aktivovaných monocytů váže do komplexu protrombinázy a v této formě generuje malé množství trombinu (Osterud a Rapaport, 1977):

cestou aktivovaný F Xa ne stač í k zabezpečení kompletní hemost ázy, tj. fibrinogenu na fibrinové vlákno. Koagulace pak probíh á dále jen v n itřní cestou ve fázi amplifikace a propagace. Vněj ší

přeměn y

78

79

o

hemostdzy neaktivuj í j en hemostdzu, ale j sou současně po lyfu nkčn im i molekulami, které p ů sob i na široké spe ktrum buněk p ies specifické recep tory. Trombin p ů sobi pies proteolyti cky aktivo vaný recept or PAR-I , F Xa pie s efe ktorový proteázový receptor EPR-1 a TF j e receptorem pro F Vlla a spo lečně s ním se ui časuiuje na p ienosu signálu do buiiky. Protedzy koag ulačn í kaskády takt o nepiimo regu lují tvorbu zdpalovych cykokin ů, chemo taxi leu ko cytů, p rolifera ci lymfocytů a jsou d ů ležitymi tůstovytni fakto ry pro endoteli álni buiiky (Hudeček a spo l., 2004). Protedzy

in iciační fáze

Hlavní tvorba trombinu je pak zaj i štěn a fosfoli pidový m komple xem - protrombin ázou [Va . Xa . Ca2+ . Pl] vyváz aného na membráně aktivovaných krevních destiček , ve kterém je F Xajiž dostatečně chráněn proti inaktivaci. Touto cestou vzniká dostatečné množství trombinu nezbytné k vytvoření pevné fibrinové zátky (Hoffma n a Mon roe, 200 1).

2.3.7.2. Amplifika ční fáze Ve" Fázi amplifikace" dochází k vyv ázánifaktorů aktivovaných ve fázi propagac e na po vrchy aktivovaných trombocytů, které se v procesu adheze a agregace so ustředily v místě poran ění k vytvoření dostatečného mno žství protrombinázy.

o

A ktivaci des tiček zaji šťuje v této fázi hla vně interakce destičko vých s trombine m (Hoffman a spol., 1996; Mor risse y a spol., 1997).

těchto

(Hudeček,2004).

Dostatečná tvorba

•

2.3.7.3. Propa gačn í fáze Ve ,Jázi propagace" koagulačně aktivní komplexy tetuiza a protrombindza vyvázané na povrchu krevních destiček, zaj istí dostatečn é množství trombinu, který vyvolá přem ěnu fibrinogenu na fibrin. Fosfolipidový kompl ex tenáza zaj išťuje de novo na povrchu krevních de stič ek aktivac i F X na F Xa .

....

.

IIa. xll.. x~

80

M ezi jedno tlivými kompl exy tohoto schémat u existuj í pozoruh odn é podobn osti. Každý Z nich obsahuje neenzymovy kofaktor (TF, Vl Ila, Va), ktery specificky váže na X

G

od F Vll1 a F V nevyžadu j e tkdiiovy faktor aktivaci.

[Xla . Ca2+ . PI]

.. IXa Proteo lyza

o

1l0VOU

uuuuaau

IX

• •

trombinu je nezb ytná. K vytvoření plně stabilizované a pevné fibrinov ě hemostatick ě zátky . K tomu je nezbytn á fu nkčnost obou tenáz, jak vnějš í [TF .VIla], tak vnitřní [IXa .VIII a]. K aktivaci F XIII - stabili zace fibrinov é sítě K aktivaci trombinem aktivovaného inhibitoru fibrinolýzy - TAFI (Thrombin Activable Fibr inolytic Inhib itor), který je vyžadová n k norm ální rezistenci fibrinové zátky během fibrinolytického procesu.

vitaminu K závislou seriprotedzu (F VIla, F IXa, F Xa). Na rozdíl

'l1'i1'1'l'l1n
destičková membra na

Ve fázi propagace se rov něž u pl atňuj e faktor XIa, aktivovaný trombinem ve fázi iniciace, který po navázání na povrch trombocytů podporuje další aktivaci faktoru IX.

klíčo v ým

tikoagul ační děje,

Trombin em aktivova né formy faktor ů VIIIa, Va a faktor IXa, aktivovaný komplexem [TF. VIl a] se s vysokou ú činno s tí váží na povrc h z áp orn ě nabitých fosfolip i d ů , odhalenýc h po flip-flop reakc i aktivova ných des ti ček (Bevers a spo l., 1982 ).

.. j..

enzymem hemostázy, který ov l iv ň uj e jak koagul ačn í a antak i fibrino lytické a antifibrinolytické systémy. Souhra funk cí systémů je zabepečována různou citlivostí jejich složek k působen í trombinu

Trombin je

recep to rů

Iniciační

Olrombln

D

a a m p li fi kač n í fáze koagulac e

Trombin

81

o

~

~ ~ ~

~

i + - - -----T"""--i ::: ~

~

;-

i

'I

~

Z

Z

~

~

~

~

~

~

~

~

~

~

~

Z

~

~

~

Normálně funkční

endotel norm álni endotel je schopen zabránit amplifikační a propagační fázi koagulace a vytvoření fibrinové zátky, Slouží k tomu 2 inhibiční mechanismy : • Antitrombin navázaný na povrchové proteoglykany na membráně endotelu inhibuje trombin • Systém proteinu C - který se tvoří na endotelu za účas ti systému trombomodulin/trombin š těpí faktory Va a VIIIa - z nesnadňuje tvorbu tenázy a protrombinázy a tím snižuje genezi trombinu.

~

~

Funkčně

•...........

z~ c o z ~

~

~

t ře m i

~

:J

• •

@

~

<

::E ::c:

~ ~

(/)

;,

u

Před

~

o < o

,~

Inhibitory v novém modelu koagulace

~

u < ....l

~

..

~

~

;,

nekontrolovanou aktivací koag ulačního procesu je organismus hlavními antikoagu lačními systémy :

chráně ný

TFPI Systém PC

• AT

~

~

Pii defi citech faktor ů IX, VIII, V, (Xl) je snížena tvorba trombinu na povrchu krevních destiček a tvoii se nestabilní destičková zátka (zvýšená permeabilita, zvýšená lyra). Hemofilie A i B je tedy onemocnění s poruchou koagulace, ale i fibrino lyzy: Hemostatickd zátka tvořená p ťi nedostatečn é aktivitě F XI (defi cit F Xl) je citli vější na lýzu a současn ě j e narušena i aktivace TAFI. Nemocným s defi citem F VII chybí možnost aktivovat F X.

........

~

......

•

Vzestup hladin y F Xa vyvolá tvorbu TFPI, který jej přímo inhibuje vytvořením komplexu [FXa . TFPI] . Tento komplex blokuje aktivitu komp lexu [TF . VIla] , který se nachází na povrchu dy sfu nkčníc h nebo aktivovan ých buněk , hl av n ě mo-

•

Vzestup hladiny trombinu vyvolá tvorbu rovnoce nného množství APC kom plexem [TM . Ila]. Inaktivací faktorů Va a VIIIa snižuje APC další tvorb u trom binu. Účinnost systému PC zvyšuje EPCR a PS, který je nezbytný pro inaktivaci F VIIIa v tenázo vém komp lexu. Antitrombin inaktivuje většinu složek koagulace. Tvorbu komplexů s těmito složkami významně urychluje přítomnost heparinu nebo jin ých glykosylaminoglykanů . Vazba heparinu na molekulu komplexu je v případě trombinu podmínkou. AT od straňuje trombin i z komplexu [TM . trombin] (de Jonge a spol., 2001).

.......

-"""'C '''O

"' I--C . -

n oc ytů .

~I:l.

;,= .~

~1"Il

~Q ~~

•

Literatura Andree, M. A. H. a Nemerson , Y. : Tissue factor: regulation of activity by flow and phospholipid surfaces. Blood Coagul. Fibrinol.,6, 1995, s. 189-197 . 82

Bauer; K. A.: Activation of the factor VII tissue factor pathway. Thromb. Haemostat. 78, 1997, s. 108-111.

83

B evers, E. M. , Comfu rius, P., Zwaa/, R. F. A.: The nature of the bindings site for protrombinase at the platelet surface as re vealed by Iipolytic enzymes. Eur. J. Bioehem. 122, 1982, s. 81-85. Blotnbiick, B.: Fibrinogen and fibrin -

proteins with complex roles in haemostasis and thrombosis. Thromb . Res., 83, 1996, s. 71-75 .

Greer; I. A.: Procoagulant microparticles: new insight and opportunities in pregnancy loss? Thromb. Haemo st. 85, 2001 , s. 3-4.

McKee, P. A., Sch wa rtz; M. L., Pizzo, S. v, Hm , R. L.: Cross-Iinking of fibrin by fib -

Heimark, R. L., Kura chi, K., Fujikawa, K, Davie, E. W : Surface activation of blood

Miller; G. J., Martin, J. C , Mitropoulos, K. A. et a/.: Activation of factor VII during alimentary Iipemia occurs in healthy adults and patients with congenital factor XII or factor XI deficiency, but not in patients with factor IX deficiency. Blood 87, 1996, s. 4 187-4 196.

coagulation, fibrinolysis and kinin formation, Nature 286, 1980, s. 456-460. Hemket; H C , Ecnouf, M. P., Hemker; P. W , Swart, A . C , Ma cFar/an e, R. G.:

Cam eret; E. , Kol sto , A. B., Pry dz, H : Cell bio logy of tissue factor, the principle initi ator of blood coagulation. Thromb . Res., 81,1996, s. 31-41.

Formation of prothrombin converting activity. Nature 215, 1967, Č . 98, s. 248-251. Hoffman , M., MOll/n e, D. M. , Rob erts , HR.:

Co nkling, P. R., G reenb erg , C S., Weinberg, J. B.: Tumor necrosis factor inducess tis-

Cellular interactions in hemostasis. Haemostasis 26, 1996, supll. I, s. 12-16.

sue factor-Iike activity in human leukemia cell line U 937 and peripheral blood monocytes. Blood 72, 1988, s. 128-133 .

Hoffman, M. a Monroe, D. M.: A cell-based

Conway, E. M., Ba ch , R., Rosenberg, R. D., Konigsberg, W H: Tumor necrosis

factor expression of tissue factor mRNA in endothelial cells, Thromb. Res. 53, 1989, s. 23 1- 24 1.

rin stabilizing factor. Ann. N. Y. Acad. Sci 202, 1972, s. 127.

hances tissue factor and suppresses thrombomodulin expression of human vascular endothelium in vitro. J. Clin. Invest. 79,1987, s. 124-130 .

Ozcan , M ., Morton , C T., So lovey, A ., Dandelet, L., Ba ch, R. R., Hebb el, R. P. , Slungaard, A. Key, NS.: Whole blood tis-

Muzbeck, L., Yee, V. C , He vessy,

expression of functional XI expression, Blood 91, 1998, s. 3800-3807.

D.VI; J., Blombiick , B. and He ssel, B. et a/.:

Hudeček,

Conversion of fibrinogen to fibrin induced by prontial release of fibrinopeptide B. Bioehim. Biophys. Aeta 990, 1989, s. 18-24.

Lék., 50, 2004, Č . 6, s. 463-471.

J., Paceko v á, M., Ch udej , J., Kubisz, P.: Infekce a hemostáza. Vnitř.

sue factor procoagulant activity remains detectable during severe aplasia following bone marrow and peripheral blood stem cell transplantation. Thromb. Haemost. 85, 200 1, s. 250-255.

Morawitz, P.: Die Chemie der B1utgerin-

H oses son, M. : Fibrinogen and fibrin

Hu, es, Bag/ia , F. A., suu« D. C B., Konkle, B. A., Walsh, P. N : Time-specific

Osumi, K., Ozeki , Y. , Saito, S., Nagamura, Y. , Ito, H., Kimura, Y. , Ogura, H , No m ura, S.: Development and assesment of enzyme

imunoassay for platelet - derived microparticles. Th romb . Haemost. 85, 200 1, s. 326-330.

gung. Ergeb. Physiol. 4, 1905, s. 207-223 .

Cozrolino , F., Torcia, M., Miliani, A. et al.: Potential role of interleukin - 1 as the trigger for diffuse intravascular coagulation in acute nonlymphoblastic leukemia. Am. J. Med. 84, 1988, s. 240-250.

Osterud, B. a Bjorklid, E.: The tissue ťactor pathway in disseminated intravscular coagulation. Semin. Thromb. Hemost. 27, 2001,č. 6, s. 605-617.

Moore, K. L., Andreoli, S. P., Esmon, N L., Esnton, C T., Bang , E. U.: Endotoxin en-

model of hemostasis. Thromb. Haemost. 85, 2001,č . 6, s. 958- 965. polymerization: Approval of the binding events that acompany fibrin generation and fibrin clot assembly. Blood Coagul. Fibrinol. 8, 1997, s. 257.

presence of tissue factor expression in granulocytes. Thromb. Haemost. 83, 2000, s.861-867.

z: Blood coagulation factor XIII: Structure and function. Thromb. Res. 94, 1999, s. 271- 305.

Preisner; K. T. a Kanse, S. M.: Protease reeeptors in the vaseulatare: Novel aspeets of regulation of haemostasis and wound repair. Biomed. Progress, 9, 1996, s. 22-27.

Neme rson, Y. : Tissue factor and hemostasis. Blood 71, 1988, s. 1-8 .

Rapaport, S. I. a Vijaya Mohan Ra o, L.: The Nenierson,

Z : The tissue factor pathway of blood coagulation. Sem. Hematol, 29, Č . 3, 1992, s. 170-176.

tissue factor pathway: How it has become a "prima balerina". Thromb. Haemost. 74, 1995, Č . I, s. 7-17 .

Olexa, S. A. a Budzyns ki, A. Z : Evidence for four different polymerization sites involved in human fibrin formation. Proe. Natl. Aead. Sci (USA) 77, 1980, s. 1374.

Rick/es, F. R., Hair; G. A., Zeff, R. A., Lee, E., Bona, R.: Tissue factor expression

in human leucocytes and tumor cells. Thromb. Haemost. 74, 1995, s. 391-395.

Ma cFarlane, R. G.: An enzyme cascade

in the blood clotíng mechanism, and its functions as a biochemical amplifier. Nature 202, 1964, s. 498-499.

Ga lajda, P., Baláž, D., Mokdů, M. , Kubisz, P. :

K problematike nového modelu hemostázy. Vnitřní lékařství 44, 1998, Č . II , s. 671- 674.

Macik, B. G. a Morrissey, J. H : Determi-

nation of activated factor VII (FVIIa) levels in plasma using a clottíng assay specific for FVIIa. Blood 78, 1991, Supp I, s. 61- 63.

Gi esen , P. L. a Ne ni erson, Y.: Tissue factor

on the loose. Semin. Thromb . Haemost. 26, 2 00 0 ,č . 4, s. 379-384.

Osterud, B. a Rapaport, S. l.: Activation of factor IX by the reaction product of tissue factor and factor VII: Additional pathway for initiating blood coagulation. Proe. Natl. Aead . Sei. 74, 1977, s. 5260-5264.

Scarp ati, E. M., Wen, D., Bro ze, G. J., Mil eti ch, J. P.: Human tissue factor cDNA

sequence and chromosome localisation on the gene. Bioehemistry 26, 1987, s. 5234-5238. Shafer; J. A. a Higgins. D. L.: Human fibri nogen . Crit. Rev. Clin. Lab. Sei. 26, 1988, s. 1.

Osterud, B., Vij aya Mo/um Ra o, L., O/s en, L. O.: Induction of tissue factor expression

in whole blood: Laek of evidence for the

84

85

Schloesset; M., Zeerlender; S., Lutz e, G. et al.:

Mutations in the Human Factor XII Gene. Blood 90, 1997, Č. 10, s. 3967-3977.

Thomps on, R. E., Mandl e, R., Kaplan, A. P. : Association offactor XI and high-molecular-weight kininogen in human plasma. J. Clin. Invest. 60, 1977, s. 1376.

Sobel, J. H. a Gawinowicz, M. A. : Indentification of the a. chain Iysine donor sites involved in factor XlIla fibrin cross-Iinking. J. Bio!. Chem. 271,1996, s. 19288

Vehar; G. A., Keyt, B., Eaton, D.: Structure of human F VIII. Nature 312, 1984, s. 337.

Waxman , E., Ross, J. B. A. , Laue , T. M. et al.: Tissue factor and its extracelular soluble domain: the relationship between intermolecular association with factor VIla and enzymatic activity of complex. Biochemistry 31, 1992, s. 3998-4003.

Sussman, I. I. : Normal pathways of coagulation. Sem. Hemato!. 29, Č . 3, 1992, s. 157-158. Sw a rs, H., Hafne r; H. G., Erbel, R., Ehrenthal, w., Prell witz; w., Meye t; J.: Prothrom-

Weiss, H. J., Turitto, V. T., Baumgartnet; H. R., Nemerso n, Y., Hoffmann, T.: Evidence for the presence of tissue factor activity on subendotelium. Blood 73, 1989, s. 968- 975.

bin fragment F 1+2: early sign of subacute thrombotic occ!usion after coronary stent implantation. Eur. Heart. J. 12, (Suppl) , 1991, s. 940. Ten Cate, Timm erman, J. J., Levi , M. M.: The pathophysiology of disseminated intravascular coagulation. Thromb. Haemost. 82,1999, Č. 2, s. 713-717.

Wood, W. I., Capon , D. J., Simonsen, C. J. at al.: Expresion of active human factor VIII from recombinant DNA C!ones. Nature 312, 1984, s. 330

2.4. Fibrinolytický systém Fibrinolytický systém je odpovědný za lýzu fibrinověho koagula , ale hraje také podstatnou úlohu při degradaci kolagenu, v angiogenezi, u metastáz tumoru. V této části bude popsána a diskutována pouze úloha fibrinolytického systému v hemostáze. Lidská krev obsahuje enzymový systém schopný rozpouštět krevní fibrinovou sraženinu. Za fyziologických podmínek systém udržuje hemostatickou rovnováhu. Fibrinové koagulum výrazně omezuje krevní tok, což může vést při nekontrolovatelné aktivaci i k uzavření cévy. Fibrinolýza je v řadě svých aktivačních a reakčních kroků podobná plazmatickému koagulačnímu systému. Centrální složkou fibrinolytického systému je plazminogen, který je prekurzorem (proenzymem) serinové proteázy - plazminu. Nejdůležitějšími aktivátory plazminogenu jsou prekurzory serinových proteáz tkáiíový aktivátor plazminogenu (t-PA) a urokindza (ll-Pa). Na fibrinové koagulum nebo na přítomnost fibrinov ých vláken reaguje organismus aktivací fibrinolytického systému (Davie a spol., 1991). Plazminogen se váže na krevní koagulum , je aktivován na plazmin působením akti v átorů uvoln ěných z endotelu. Plazmin proteolyticky působí na koagulum aje nakonec inakti vován cirkulujícími antiplazminy. Fibrinolýza je fyziologicky vázána na místo poranění , plazmin je generován pouze na povrchu koagula. Schopnost fibrinolýzy specificky š těp i t fibrin a ne fibrinogen je dána zvýšenou afinitou jak plazminogenu, tak i jeho aktivátoru (t-PA) k fibrinu.

o

Zvýšení fi brinolytických schopností krve m ů že vést ke krvácení, snížení fibrinolýzy m ů že naopak vyvolat trombotick ě stavy (Bachman, 1994).

2.4.1. Plazminogen

o

MW- Glu-plazminogen 90 kDa

Lys-plazminogen 83 kDa O Biologický poločas: Glu-plazminogen 48-60 hodin Lys-plazminogen 12-20 hodin O Fyziologické hodnoty : 2,4 umol/l plazmy 200-210 mg/I plazmy Plazminogen je jednořetězcový glykoprotein, který je syntetizován játry ve dvou formacích Glu- a Lyz- plazminogen. Je přítomen i v jin ých tkáních a buňkách 86

87

(eozinofily, ledviny). Lyz-plazminogen tvoří menší molekulu a má kratší biologický ne ž Glu-plazminogen. V plazm ě se plazminogen vyskytuje částečně vyvázán na gl ykoproteiny bohaté na hi stidin. Plazminogen se váže na povrchy nejrůz­ nějších buněk a na membrány krevních destiček. Buněčných receptorů pro plazrninogen je několik, v případě krevních destiček se jedná o GP lIb/lIla. Plazminogen je prekurzorem antikoagulačníhoproteinu plazminu, který jako serinová proteáza aktivuje disociaci fibrinové složky krevní sraženiny. Bílkovinný ře­ tězec plazminogenu sestává ze 790 aminokyselin a 2 cukerných složek navázaných v mí stech A sp 289 a Thr346 . Lid ský pla zminogen ses tává s 5 .Kringle" modulů spojených disulfidickými vazbami. Dále obsahuje proteázovou doménu a peptid s koncovou aminoskupinou. Domény označované .Kringles" obs ahují afinitní místa pro vazbu lysinu. Interakce plazminogenu s fibrinem a urantiplazminem je zprostředkována právě těmito lysino vými vazebný mi místy. Každý .Kringle" modul je slo žen ze 78 residuí, které mají podobnou sekvenci. poločas,

O .Kringle " moduly obsahují také některé krevní koagulační proteiny, jako je protrombin, tPA uPA, F X a jiné. Podobnost těchto enzym ů v oblastech zvaných Krin gle uka zuje na to, že tyto slou čeniny se vyvinuly běh em e volu čního vývoje z primiti vn ějši spo le čné f orm y.

genu je akt ivována t-PA nebo u-PA asi 10-20krát rychleji než Clu-formace. Aktivační působky štěpí molekulu plazminogenu v místě Lys77 a uvolní se peptid. Potom následuje další štěpen í v místě A rg 56o . Vzniká dvou řetězcová mol ekula sestávaj ící ze dvou fragmentů spoj ených disulfidickou vazbou: • těžší A řetězec • lehký B řetězec - obsahuje aktivní katalytické místo řetězec

B

8------8

2.4.2. Aktivátory plazminogenu 2.4.2.1.

Vnitřní

Jsou součástí krevní plazmy a tvoří je hlavně kontaktní systém: F XII, prekalikrein a HMWK. Akti vace nastává po kontaktu F XII s poškozenou cévní stěn o u . Mezi vnitřn í akt ivátory plazminogenu se dále řadí trombin a trypsin (Champan; 1997).

2.4.2.2.

STRUKTURA PLAZMINOGENU (domény)

řetězec

A

Vnější

Pocházejí z lidského organismu, ale z mí st mimo krevní

oběh

iChampun , 199 7).

Za fyziologických podmínek se na akti vaci plazminogenu podílí z 1/4 F XII a, z 1/4 u-PA a z 1/2 t-PA (Spra ggon a spol. , 1995 ).

přibližně

Urokin áza - u-PA (lidská H M W)

- COOH

O MW- 54 kDa (HMW forma) O Biologický poločas: 6 min

- - - -8

O Kon centrace v plazmě: 2-8 Ilg/l

K aktivaci plazminogenu dochází s o učas ně s aktivací koagulace. K přeměně plazminogenu na plazmin dochází působením aktivátorů plazminogenu. Plazminogen se váže na fibrin přes vazebná místa lysinu na jeho molekule. V místech navázaného plazminogenu jsou i vazebná místa pro jeho aktivátory. Aktivace pomocí t-PAje několikrát urychlena v přítomnosti fibrinu , který slou ží jako kofaktor při aktivaci plazminogenu vyvolanou t-PA . Interakce Glu -plazminogenu s fibr inovým povrchem zvy šuje rychlost akti vace t-PA 12-1 3krát. Forma Lys-plazmino-

Prourokin áza je jednořetězcová glykosy lovaná proteáza serinového typu , která se nachází hlavně v ledvinách. Je uvolňována z endoteli álProurokináza • _ _ Urokináza ních bun ěk v přítomnosti endotoxinu nebo tumor nekrotizujícího faktoru (TNF). Prourokináza (single chain urokinase: scu-PA) se nachází se v nízké koncentraci v plazm ě. Vlivem kontaktního sys tému (kalikerin, HMWK, F XIIa) a plazminu p řechází jednořetězcová formace (prourokináza - sou-Pá) na akti vní dvouřetězc ov ou form a-

88

89

K - Krin gle dom ény

I

ci (urokináza - u -PA). Urokináza je uvolňo vána v rámci fibrinolýzy a je rychle vyvazov aná hla vním modulátorem fibrinol ýzy PAl-I. Nach ází se v nízko- i vyso ko-molekulárních form ách (LMW: 31 kDa , HMW: 55 kD a). V plazmě cirkuluje samostatně (Spraggon a spo l., 1995). Popr vé byla izolována z moči.

O Urokituiza (u-PA) byla b lastůt n,

dále

JI

zjištěna i v pojivové tkáni, v buiikdch podobn ých fibro -

ep iteli álnich

bu ůkdch,

monocyt ech a makrof ázích.

Tkáiiovy akti vátor plazminogenu (r-PA)

O M W 68 kDa (HMW forma) O Biologický poločas: 5-8 minut O Kon centrace v plazmě: 5-10 f..lg/l N ejd ůl e žit ěj š ími faktory ov l iv ň uj í­ cími proces fibr inolýzy in vivo jsou tkáiíový aktivátor plazminogenu (t-PA) a jeho inhibitor (PAl-I). Většina t-PA v cirkulaci je vyvázána v komp lexu s PAl-I, č á s t je ve formě volné. t-PAje proteinázou serino vého typu , která se uvolňuje jako jednořetězcová

Ul hJ1d1J1jJ !J W:J jJ

n

-J

mo lekula ze zdra vých endotelových buněk po jejich stimulaci trombinem nebo aktivovaným proteinem C, případně histaminem, brad ykin em , či ILI. Dalším buněč­ ným zdroje m t-PA j sou aktivované monocyty a megakaryocyty (Lanbda a spol., 1996). Tk áňový akti vátor plazmin ogenu se vyskytuje hla vně v orgánech s bohatým cévním zas toupením, jako jsou d ěl oh a, ledviny, plíce. Koncent race t-PA se zvyšuje po žilní okluzi, po svalové m c vi čení , ale i při stresové reakci ( uvo l ně ní katecholamin ů a vazo presi nu). Jedn ořetězcová molekul a je proteolyticky štěp ena buď plazminem nebo tkáňo­ vý m kalikreinem, či F Xa za vzniku dv ouřetězo vé akti vní formy. t-PAje fibrin specifický aktivátor plazminogenu. Fibrino vá specifita je výsledke m interakc e kringle- 2 dom ény t-PA se specifickým lysinov ým reziduem na neroz pustném fibrinu. Nena vázan ý t-PA se rychle neutralizuje v játrech, kde je metabolizován . Aktivita t-PA v ů č i plazminogenu se zvyšuje, je-li plazminogen navázán na fibr inovou s íť nebo částečně degrado vaný fibrin (Wiman a Coll en, 19 78). Odpovídá tedy za specifickou fibr inol ýzu (H oyla ert s a spol., 1982). Toho se využívá při trombolytické léčbě cévních uz áv ěr ů zej ména při trombotizaci koronálních tepen . t-PA má příznivý efekt při redukci trombofilie a obnovy recirkulace po trombo lýze . účastní se napi: pro cesu nidace oplodněného vajíčka aje spolu s dalším aktivátorem plazminogenu - urokiruizou, účinný p ťi pro cesu prolifera ce a mi gra ce bun ěk (Godyna a spol. , 1996). Nyn i byl zjištěn tak é zvýšený obsah t-PA v mozku pii pro cesu " učen í " pokusných zviiat.

O t-PAje silná prote ára a

90

t-PA se rovněž podílí na pro cesu neovaskularizace butiky nebo tkán í, kde j eho proteolytická aktivita napomáhá migraci proliferujicich endotelií i buněk hladké sva loviny, popřípadě i tuidoro vých bun ěk pii metastdzovdni (Desana a spol; 1988). Takto musíme pohlížet na t-PA i z opačného nepiizniv ěho hlediska. V n ovějších studiích byla potvrzena zvýšená hladina t-PA u osob s rizikem 1M a s rozvojem aterosklerózy. V)'šší koncentrace t-PA j e po važována za další rizikový faktor kardiova skulárních chorob.

, \ ~,.

---.." ~ ,

Laboratorní stanovení • stanovení antigenu • stanovení aktivity t-PA

Iť :U~HJjjJ L-

o

'M

Struktura t-PA, reteplázy (r-PA), lanoteplázy (n-PA) a tenekteplázy (TNK-t-PA)

Proa ktivátory Jsou to extrakty tkáňov ých kultur některých bakterií, které se využívaj í zej mé na léčebn ě (Gonzales- Gronow a spol., 1978). Nejzn áměj ší je Streptokituiza (enzy m, který je produkovaný ~-hemolytickým streptokokem).

2.4.3. Přeměna plazminogenu na plazmin Fibrinolytický systém se aktivuje ihned po vytvoření prvních struktur fibrinu. Na fibrinový povrch se naváže plazmin ogen a t-PA. Dochází k formaci tern árníh o komplexu mez i t-PA, plazmin ogenem a lysino vými strukturami na C- ře tě zc i fibrinu [t·PA . plazminogen . fibrin] . Plazminogen v komplexu s t-PA, vy-

L-

----'

vázaný k fibrinu je velmi účinně konvertován na plazmin . Fibrin p ůsob í v této reakci jako kofaktor. Plazmin štěpí fibrinové koagulum na jednotlivé fragmen ty (fibrin degradační produkty - FDP). K zesílení účinku dochází zpětnou vazbou . V pr ůb ěhu š tě p e n í fibrinu plazminem vznikají koncové karboxylové lysinové řetězce degradovaného fibrinu , které na sebe váží další plazminogen a t-PA. Tím se zvyšuje tvorba plazminu a následn ě ú činnost fibrinolýzy. 91

Podle specificity k fibrinu rozlišujeme tyto aktivátory přeměny plazminogenu na plazmin: • s vyšší specifitou pro fibrin , aktivují předevš ím plazminogen na povrchu fibrinu • s lližší nebo žddnou specifitou pro fibrin , Tyto aktivátory vedou k rozsáhlé systém ové aktivaci plazminogenu , p ři níž dochází ke š těpe n í n ěkterých plazmatick ých bílkovin, například fibrinog enu , faktoru V a faktoru VIII. PREMĚNA PLAZMINOGENU NA PLAZMIN - AKTIVÁTORY PLAZMINOGENU SPECIFICKÉ A MÉNĚ SPECIFICKÉ PRO FIBRIN

Povrch fibrinu

a koagulačn í faktory II, V a VIII, Fibr inogen T b' GP lb, GP IIb/IIIa, vWF, trombo~ ~,\ rom ln spondin). Plazmin m ů že aktivovat F VII a XII, stimulovat agregaci o Fibr in monomer + fibrinopep tidy ... tromboc ytů a aktivo vat čás ti kom~"O-..-
~

-i:

.

'-----

(X2- antip,lazmin

Trombin

Kapalná fáze

,,

i:Aktivátory plazminogenu nespecifické

\_~~~.~é ně specifické pro fibrin ./

PAI-1

;------1

.-/

.....1

SCHÉMA FIBRINOLYTICKÉHO SYSTÉMU

Rbnnogen. Faktor V, Faktor VIII

~hl!HJJJJJJ~ ;.J1J

Inhibitory aktivátorů pla zminogenu Inhibitor aktivátoru plazminogenu PAI-I a urantiplazmin jsou inhibitory serinovýc h pro teáz - tzv. serp iny (serine proteinase inhibitor) a pů sob í jako hlavní inhibitory ak t ivátorů plazminogenu , resp. plazminu v lidské plazmě . O dalších inhibitorech fibrinolyzy viz kapitola inhibitory.

q

lfJ iI~~JJJ1J

I~~[ill[J~[]i]®(ID~[]i] q

~

q ~~~

2.4.4. Plazmin

[}1J[IDITíl[fi] [ITiIDD

[}1J[IDITíJ1iJ UrwD

I

FDP

o

MW 83 kDa O Biologický p oločas : O, I sekundy

Plazmin je proteolytický enzym o malé specifi tě, kter ý kromě fibrinu štěp í i někte­ ré další bílkovi ny koag u lač ní ho systému (fibrinogen, fibrin ve všech jeho podobách 92

o

Plazmin se dále zučastiiuje pii

zánětlivé

reakci, stimuluje prolijeraci B lymfo cy-

tli, zvyšuj e tvorbu protilátek a kapacitu růmycli cytostomických buněk.

93

2.4.5. Štěpné produkty fibrinogenu a fibrinu

o

CEibrinoge n / .Eibrin 12egradation Eroducts - FDP) (.Eibrinoge n / .Eibrin Splits Eroducts - FSP )

Ir-d imer slouží jako marker trombofihuob stavů. Spliíuje totiž všechny požadav ky, které by marker takovýc hto stavů m ěl obsahova t. Jejich hladina v krv i odráží aktuální aktivaci systému in vivo a nevzniká ex vivo (Amiral, 1998). Biologický poločas in vivo je 4-6 hodin .

2.4.5.1. Štepení fibrinogenu a rozpust11ého fibrinu Při štěpen í

fibrinogenu a rozpu stných

fibrinů

Tvorba O-dimeru

vznikají fragmenty (Mi rshahi a spol. ,

1986): • vysokomolekulární (X, Y) • nizkomolekulárni (D,E) Štěpy

•

•

XaY mají anti polymerační úči nek a tvoří s monomery fibrinu rozpustné komple xy. Tím zabraň uj í mon omerům fibrinu v jeji ch polymeraci, tedy ve vzniku fibrin ové s ítě - v tom se proje vuje jejich antikoagula ěni účinek. Jsou schopny inhibovat agregaci krevn ích de sti ček . Dále se štěpí na složky D a E. Štěpy D a E jsou odbourávány MFS (Amiral a spo l., 1990).

R ŮZNÉ FORMY D-DIMERŮ

Fragment O FragmentY Fragment E

SCH ÉMA ŠTĚPENÍ FIBRINOGENU A ROZPUSTNÉHO FlBRINU

o

2.4 .5.2. Štepení nerozpustného fibrinu Při proteolytické degradaci nerozpustného Št ěp o nl ne rozpu stn é ho ribr lnu ;, ' fibrinu plazmin em probíhá š těp e n í podobně (Bou nameux a spo l., 1994). Jsou od štěpo vány fragmenty X a Y, které se ale vzhledem k příč­ ným kovalentním vazbám od sebe neodd ěluj í . Konečn ým stadiem jsou fragmenty o MW 182 kDa, nazývané D-dim ery, které jsou ode· [).dlmo ry plavovány do obvodové krve. Molekul a D-dimeru se skládá ze dvou D-domén vzniklých z přilehlý ch fibrinových jednotek, spojených kovalentní Glu-Lys vazbou mezi jeji ch y ře tězc i . Tato kovaletní vazba zaj išťuje jeho odolnost proti š těpení plazminem a laboratorní průk az O-dimeru je přímým d ůkazem štěpení nerozpustilého fibrinu (Bou nameux a spo l., 1994).

Pro rychlost proteoiytick ě degrada ce fibrinu j e určujícím parametrem tloušťka fi bri novych vláken. Byla popsána korelace mezi ry chlosti fibrin olyzy a p rům ě­ rem vláken. Gely s většími PÓlY a s tlustším i vlákny, opticky hustší a mechanicky m én ě odo lné lyzuji ry chlej i, než gely s ten čími vlákny, které vznikají p ii větší koncentraci trombinu (Bachman, 1994).

SCHÉMA ŠTÉPENÍ NEROZPUSTNÉHO FlBRINU

•

94

95

o

2.4.6. Aktivace fibrinolýzy Fibrin olytická aktivita je sc hopnos t odb ourávat nerozpustný fibrin. Tento proces p atří mezi základní fyziologic ké děj e v organi smu . Aktivita odpovídá za odbou rává ní již nep otřebného fibrinové ho koagula po proběhlém procesu srážení krve a zhojení rány. Fibrinolýza tedy zprů­ chodůuje cévy a uvádíje do původniho stavu. Je aktivo vá na s tej ně jako ostatní ' - - - - - - - - - - - - - - - - - - -- - - ' systémy p ři porušení endotelu. Přestože k její aktivaci dochází s o u č a s ně s aktivací krevních destiček a koagulace, probíh á celá fibrinolýza podstatně déle tj. 48-72 hodin. Rovn ěž rozpouštění fibrinové zátky fibrino lytickými ději je za norm álních okolností n ěkolikahodinovy proces . Za chorobných s tav ů se mů že tento proce s výrazn ě zkrátit (až na několik minut ). Hyperfibrinolyza je spojována s výraznou produkcí plazminu. Jedná se o velmi neb e zpe čn ou klinickou situaci, která je spojována s tě žkým i krvácivými stavy, ale n ěkd y m ů že predisponovat i k tromb óze. Hyperfibrinolýza se mů že vyvinout u nemocných s traumatem v průb ěhu sepse, u DIK. Vě t š i na laboratorních testů zahrnující form aci plazminu, a generaci FDP není vhodná k prů k azu stavu se zvýše nou fibrinolýzou. Nejv hodnější m globálním testem bezp ro středn ě prokazuj ícím hyperfi brinolytický stav je trombelastografie. Hypofibrinolyza vzniká vě tš i no u ja ko následek poškození nebo nedo st ate čné funkce něk teré komponenty v systému fibrinolýzy : • defe ktní molekula nebo nízká koncentrace t-PA, u-PA a plazmin ogenu • ned ostat ečn é u volňo vání tPA z endotelu (syntéza, skladovací pool) • zvýšená koncentrace n ěkterých inh ibitorů fibrinol ýzy, zejména PAl-I a u-ž-antiplazminu. • nefunkční kont aktní systém . Hypofibrinolýza je č as to spojo vána s vývojem tromboembolické nemoci .

JJ;-lťJ1J~HJJJJ -D

FOP

o

D-D+2E

Fibrin oly za j e nepretržity proces, probíhající v normáln ě fun gujícím organismu: s vyšší aktivitou během dne a po fyzické námaze • s nižší akti vitou jl těhotenství O Fibrino lyza má význam u mn ohych reparativnicli proces ti, j ako j e rekanalizace tromb osovanych cév a různych zánětlivých změn s tvorbou fib rin u.

•

96

Fib rinolyti ckou aktivitu nalézáme nej en v krvi, ale tak é v jiných tělních tekutinách, napi: v slzách, synovi álni tekutině, menstruační kr vi, ml éku , m oči.

FIBRINOLÝZA J E OMEZENA J AKO VSECHNY REAKCE V PRO CESU SRÁŽENl J EN NA M1STO ENDOTE LlÁ LNl LÉZE. F YZIOLOGICKY PROB1HÁ J EN TAM, KDE VZNIKL FIBRIN. SYSTÉM PŘIROZENÝCH INHIBITORŮ PL AZMI NU SPOL U S KRE VNíM PRO UDEM ZAMEZUJE RozS1ŘEN l TÉTO REAKCE DO DALSlcH cxsrr ORGANISMU. Z A FYZIOLOGI CKÉHO STAVU NENí V PLAZMĚ BĚŽNÝMI TE STY FIBRINOLYTIC KÁ AKTIVITA PROKAZ ATELNÁ.

Literatura Amira/, J., Cro sley, M., Mi mil la, F. at al: Monoclonal antibodies to different neo -ep ítopes as fibrinogen and fibrin degradations products. Blood Coag. Fibrinolysi s I, 1990, s. 447--452.

Gon zal es-Gron ow, M. et a/.: M echa nism of activation of human plasminogen by the activator complex streptokinase - plasmin. J. Bio!. Chem . 253 , 1978, s.1090-1094.

Am iral, J.: Analytical criteria, performances and diagnostic value of D-Dimer as says. Haemostasis 28, 1998, sup!. 2, s. 188.

Hoy/a erts, M ., Rijken , D. C: Lijnen, H. R., Collen, D.: Kinetics of the activation of plasminogen by human tissue plasminogen actívator, Role of fibrin. J. Bio!. Chem. 257, 1982, s. 2912.

Bachman, F. : Fibrinolysis. In: Haemostasis and Thrombosis I . Eds: A. L. Bloom, C. D. Forbes, D. P. Thomas a E. G. D. Tuddenham. Churchill Livingstone, London 1994, s. 549-625.

Champan, H. A.: Plasminogen acti vators, integrins and the coordinated regulation of cell adhesion and migration. Curr. Opin. Cell Bio!. 9,1997, s. 7 14-724.

Bounameux, H., de Mo erloose, P. , Perriet; A ., Rebel; C.: Plasma measurement of D-dimer as diagnostic aid in suspected venous thromboembolísm : an over view. Thromb . Haemostas. 7 1, 1994, s. 1-6.

Lanbda, D. et al.: The 2,3 A crystal structure of the catalytic doma in of recombinant two-chain human tissue - type plasminogen activators. J. Mo!. Bio!. 258, 1996, s. 117- 135.

Davie et al.: The coagulation cascade: initiation, maitenance and regulation. Biochemistry 30, 1991, s. 10363-10370.

Mirs ha hi, M., Soria, J., Soria, C. et al: A la tex immunoassay of fibrin, fibrinogen degradation products in plasma using a monoclonal antibody. Thromb. Res. 44, 1986, s. 715-728.

Desan a, E., Zan etti, A ., Confo rt i, C.: Biochemical and functional characteristics of fibrinogen interaction with endotelíal cells. Haemostasis 18, 1988, s. 262.

Sp raggon, C. et al.: The crystal structure of the catalytic domain of human urokinase - type plasminogen activator. Structure 3, 1995, s. 681-691.

Codyna , S., Dia : Ri cart, M., Agraves, W S.: Fibulin - 1 mediates platelet adhesion via a bridge of fibrinogen. Blood 88, 1996, s. 2569 .

Wiman, B., Collen, D.: Molecular mechanism of physiological fibrinolysis. Nature 272, 1978, s. 549.

97

2.5. Systémy inhibitorů hemostázy Inhibitory kre vního sráže ní j sou so uč ástí a zároveň i základním regulačním mecha nis me m koa gulace. Po proběhnutí ce lé koagulační kaskády se docílí z n ačného zes íle ní prv otního aktivač ní ho impulsu (u vnitini cesty aktivace se pie dpokldd á zesílení až 1:1 000000). Tento sled reakcí by v krátk é době mohl vést k masi vnímu sráže ní krve, k ucp ání cév a n ásl edn ě ke smrt i. Udržov ání dynam ické hem ok oagu l ač n í rovnováhy j e základním princip em p roces ů kre vn ího srážení, Pod ílí se na něm celá řada m e ch a ni smů a p ři j eh o reg ulaci j e nej významn ěj š ím ú čin ekfyziologických inhibitorů koagulačního a fibrinolytické ho sys tému. Inhibitory krevniho sráženíjsou přirozené složky krve, které tlumí antikoagula čuimi mechanismy proces jejiho srážení vyvolaný plazmatickým koagulačním systém em a fibrinolyzou. Tyto látk y inh ibuj í aktivní slo žky hem ostatického procesu - proteolytické enzymy (h la v ně se rinové proteázy). V org ani smu slouž í inhibitory k zab rá ně n í nekontrolovatelnéh o sráže ní a tím k udr žení dynamické koagulační rovnov áh y. POZMf:Nf:NÉ HLADINY, PŘíPADN Ě FUNKČNí ABNORMALITY Nf:KTERÝCH INHIBITORŮ (Z EJMÉNA ANTlTROMBINU, SYSTÉMU PROTEINU C A TAFI) PŘEDSTAVUJí ZNAČ­ NÉ RIZIKO PRO VZNIK TROMBÓZY.

Kritéria pro

rozdělení inhibitorů

Inhibitory kr evního sráže ní mů žem e třídit podle různých krit érií dle: • původu: přirozené získa né • sp ecifity: inhibitory serinových proteáz (serpin ů) inhibitory kofakto rů serinových proteáz nespecifické inhibi tory s rozšíře ný m spektrem • systém u: inhibitory koagulace a fibrinolýzy

V této stati jsme použili pro inhibitory následujícího Přirozené

• •

rozdělení:

inhibitory

Sp ecifické inhibitory koa gul ace a fibrinolýzy Nespe cifické inhibitor y ko agul ace a fibrinol ýz y

Získané inhibitory SERPINY Serpiny tvoří velkou skupinu inhibitorů serinových proteáz (serpin - Serine Protease Inhibitor). Serpiny se vys kytuj í v tělov ých tekutinách nejen u s av c ů, ale i u dalších druhů ž i v oč i c h ů a rovn ě ž i u ros tlin. Většinou jde o nespecifické inhibitory, které tvoří komplex v p oměru I : I s cílov ým enzymem [serpin . serinová pro 98

teáza], který je z cirkul ace vyc hytává n serinovými receptory I a 2 ulo ženými na hepatocyte ch . Serpin y sehrávají důlež itou úlohu v sys témech hemostázy. Nadm ěrné štěpení s erp i n ů u některých patologick ých s tavů má pro organi smus závažné násled ky (větš i n o u se vyv ine DIK).

Ina ktivn i kom plex Iprcte áza . Inhibito r)

Inhibice ser inových proteáz serpiny

KUNINY Kuniny j sou inhibitory prote áz se stru kturo u v molekule, které se Kunitzo va typu . Jsou to látk y homologní s aprotininem.

říká

domén a

2.5.1. Inhibitory koagulace a fibrinolýzy 2.5.1.1. InhibitOlY plazmatického koagulačního s ystém u Trombin je proteolytický enzym, který se tvoří po dobu srážení krve v nadbytku . Po ukončení srážecího procesu musí být trombin rychle a účinně vyvázán (inhi bován) , aby srá žení krve nepokra čov alo . Inhibice není vázána jen na trombin, ale i na ostatní aktivované slož ky krevního sr ážení. Všechny známé inhibitory pla zmatického koagulačního sys tému jsou ob sažen y v plazmě ajejich specifi ci ta je velmi nízk á. Vedle hla vn ího subs trátu inhibuj í v menší míře větš i n u ostatn ích faktorů (serinových proteáz). Z fyziologick ých inhibitorů krevního sráž ení se v pla zmatickém koagulačn ím sys tému nej více upl at ňují Antitrombin (AT) a alfa2 - makroglobulin , Ob a j sou v pl azmě ob sažen y v poměrně vysoké koncentraci. AT spo leč ně s kofaktorem heparinu II odpovíd á za 80 % inh ib i ční koagulační aktivity.

ANTlTROMBlN (AT) (diive: Antitrombin III - AT III) Ndrev antit rombin byl popr vé použit na začátku století pro látky, které p ů sobily proti trombinu. V té dob ě se nazýval .Ji eparin cofacto r", Byl poprvé izol o ván V I: 1968 Abildgaardetn a pojmenován Antitrombin III. Dnes se pou žívá spíše názvu antitrombin, protože pojem .umtitrombin " neni v jin ých souvislostech pou žíván.

o

MW 58 kDa O Biologický polo čas: 65-70 hod (68 hodin). V p ťi­ tomnosti heparinu se m ů že biol ogický poločas zkráAntitrombin - strukturní model

99

tit na 32 hodin i méně. Patologicky doc ház í ke zkráce ní biol. poločasu pii šoku nebo u DIK, kde se m ů že zkrátit až na n ěkolik hodin .

Fyziologické hodnoty: Funkčn í

ak tivita: 0,8-1 ,2 (80- 120 %) Koncentrace v p lazmě: 0,10-0,25 ( prů měrně 0,14) g/l

Antitrombin je jedn ořet ě zc o v ý uTglykoprotein o 424 aminokyselinách, který v j átrech , ale byl zji štěn i v endotelových buňkách . Jedná se o antikoagul ačně n ejú č inn ěj š í látku , která je schopna neutralizovat účinek tromb inu (Lec hner a Kyrl e, 1995). Nep ů sobí však okamži tě , ale má opožděn ý ú činek (15-30 minut ). Syntéza AT má spoj itost se syntézou fibrin ogenu. Štěpení fibrinog enu je důsled­ kem aktivac e koagulačních mech ani smů , při kterých dochází k pokle su AT. Štěpení fibrin ogenu dává tedy signál k následn é syntéze AT. se

t v oří

STRUKTURA ANTITROMBINU

NH'-~-p-P R -s9-COOH S

S

S

CHO: doména bohatá na karbohydráty

F unkceAT AT pů sob í jako

nejdůležitěj ší

fy ziologic-

ký inhibitor serinovycli protedz: tak že vy-

.- .....

--.-- - ~ ~

Cí-:

Mlslo pro navázáni heparlnu's,

monosacharidů.

Reakce s trombinem Je-Ii př ítomn o malé množství trombinu vzniká komplex oz n ač ovaný jako TAT[Irombin . Antilrombin], který postrádá koagulační aktiv itu obou složek: Trombin + Antitromb in - - -....~ [Trombin. An tit rom b in] Tento komplex se o ddělí z receptorových struktur na buněčné membrán ě a je v něko l ika minutách odbouráván v játrech (buňkami MFS ). TAT informuje nepř ímo o hyperkoag ulačním stavu systému.

(domény)

S

vých jednotek na heparinu a rezidua lysinu na molekule AT. Na tato residua (Lys) se molekula heparinu váže . Setino v ě aktivní centrum trombinu má zásadní výz nam pro jeho reakci s AT. Trombin š těpí argininové vazby v bílko viná ch (zej ména v molekule fibrinogenu). Bazické obla sti AT (zej ména v místech Lys a A l:g) p řit ahují záporně nabité oblasti molekuly hepa rinu. Vazebné místo pro AT na heparinu tvoří specifická sekve nce

vazebné mlslo proF Xa

vazuje trombin a jin é plazmatické proteázy ' . " vazebné mlslo "!!!!I_._.- ' pro F lIa (v p om ěru 1:1) za vzniku kompl exu, který je odbouráván v MFS (Ba rrowc liff a Thomas, 1987; Lechn er a Kyrl e, 1995). Vazba se u skuteční mezi aktivním místem serinové proteázy (Se r) a místem A rg385_Ser386 v molekul e antitrombinu. arln Rychlo st vznik u tohoto komp lexu mů že být mnohonásobně zvýšena naváz ánůn heparinu nebo proteoglykan ů z endotelových Ant itrombin - vazebná místa bun ěk . Interakcí mezi heparinem a AT doserínov ě proleázy a heparinů chází ke konformační změ ně, při které se zpřís tu p ní (odkryjí) sekvence sulfátovaných nebo nesulfátovan ých mono sacharido -

Reakce s trombinem v přítomnosti heparinu Neutralizační aktiv ita AT vů či trombinu (pří­ H p adně faktoru Xa ) se 300-1 000 krát zvýší pů so­ bením látek s negativním povrchov ým nábojem - polyglykosaminoglykan ů , jako je např. hepa0ran sulfát (Lechner a Kyrle, 1995). Hepariny se nachá zí na povrchu endotelový ch buněk a moH OS03H H NHS 03H -' hou být u voln ěny z tk áň ov ých b azofilů (žírných '--buněk ) . Vazba heparinu s AT je reversibilní - heHeparan sulfát - strukturní vzorec parin u volněn ý z komplexu je schopen vazby z další látkou: AT + heparin - ---I..~ [AT. heparin] Trombin + [AT. heparin] - - -...~ [Trombin . AT. heparin]

~~~~n

~._ ""

/OD

Heparin jako s měs mukopol y sacharidů má rů znou afinitu k AT. Z komerčn ě dostupných heparinů se na AT vážou jen ty molekuly hep arinu , které mají sekve nci pentasacharidu. Následn á konformační změna AT vede až k tisícinásobnému zvýšení jeho antiproteázového účinku. Inaktivace tromb inu vyžaduje současnou vazbu trombinu i AT na jednu molekulu lteparinu. Tato reakce požaduje heparin tvořellý minimálně

18 monosacharidovymi jednotkami.

Krat ší molekuly trombin neinhibují, zachováva101

Vazba AT a trombinu na heparin

j í si však m ožnost inhibovat F Xa. Hepa rin

v komplexu s A T inhibuje faktory Ila a Xa. Vazba heparinu s AT vyž aduj e minimální kon centraci AT v pl azm ě> 40 % . Důle žitá je i hladina koagul ačních faktorů , počet krevních des tiček a p řítomno st proteinů akutní fáze. Svými č e t n ý m i zápornými náboji vytváří hepariny jakou si matrix , na které se mohou snadněji AT a trombin u spořádat a vytv ářet tak snadn ěji komplex [AT . trombin].

syntetické substráty. Po aplikaci AT in vivo lze touto metodou snadno monitorova t jeho hladinu v krevním o běh u . Imuno a afinitní analýzy poskytují podobn é výsledky. Diskrepance byly pozoro vány u dědi čn ých chorob s afu n kč n í m AT, při stanove ní AT v neonatální pl azmě a při stanovení AT v jeho kon centrátech. V po sledním případě je poměr aktivita/antigen niž ší. V uvedených případech není imunoanalýza vhodná a může po skytovat nesprávné údaje. Klinická interpretace: Klinický význam má snížení hladiny AT anebo z mě n y v jeho molekule - defekt AT. Riziko žilní nebo tepenné trombózy vzniká, jestli že plazmatická hl adina AT pokl esne pod hodnotu 70 %. Z výšená hladina nem á diagnos tický vý znam.

'{~

' ~'"

..

""

fl

Al

Inhibiční

vli v AT AT fun guje jako ve lmi potentní inhibitor trombinu. Podobn ě samotný AT mů že vyvazovat i F Xa. Ostatní proteázy vy vazuj e ú činn ěj i jen v přítomno sti heparinu. Kromě trombinu a F Xa vyvazuje i některé jiné složky koagulač ­ ního systému se kterými podobně jako s trombinem tvoří inakti vní komplexy. Jedná se zejména o další se rino vé proteázy uvedené ve schématu. Mimo to inhibuje urokindzu, Cl -esterdzu a trypsin. Reakce s trombinem trvá kolem 35 sekund, ' - - - - - - - - - - - - - - - - - - ' AT o vlivňuje i další složky s ostatními proteázami ko lem 25 minut. AT zakoagul ačního systému sahuje i do regulace systému komplementu .

FXla

Iikrein

FXa

nF. lIal

Laboratorní vyšetření: • průkaz bi ologické akti vit y • průkaz antigenu M ĚŘENÍ HLADINY AT V PLAZMĚ

1. M etody na bázi imunoanalýzy (průkaz antigenu) Klasick é techniky zahrnující radi áln í imun od ifúz i a elfo-techniky jsou časově n áro čné a byl y nahrazen y nefelometrickým i techn ikami (LlA), radioimunoanal ýzou (RIA) a enzymimunoanalýzou (ELISA). 2. Metody měření biologické aktivity U koagulačního stanovení AT je kvantitativní hodnocení redukováno na sledování reziduální aktivity trombinu nebo F Xa po jejich reakci s AT v prostředí s nadbytkem enzymu a v přítomno sti heparinu. (Neutralizace trombinu v nepřítomnosti heparinu je pom alá a účinek (X,2-makroglobulinu i (X,I-inhibitoru proteináz může konkuren čn ě inaktivo vat trombin). Daleko praktičtěj ší a dnes i rozš ířenější jsou metody používající chromogenní 102

Nedostatek AT je možným rizikovým faktorem tromboembolické nemoci: • Kongenit álni (vrozeny) nedostatek AT (au tosom á l ně dominant ní typ dědi čn o sti ) se vysky tuje as i u 3 % p acientů s tromboembolickým on emocn ěním . Existuje v několika podt ypech a antigenní exprese AT není vždy paralelní s jeho biologickou aktivitou . Asi 50 % nosi čů má v an amnéze trombózu, často rekurentní a spontánní. • Častěj ší ne ž kon genitální nedostatek AT j e nedostatek ziskany, Ten pak mů že vést k zvýšenému ohrožení žilní trombózou a k zvýš ení rezistence na heparin . Získaný nedostatek AT může vznik a t : • v dů sledku snížení syntézy AT. Nejčastěji u n ěkterych jaterních onemocnění (cirhóza), u nezralých nedono šenych dětí a to zvláště v souvislosti s respiračním distress syndromem, gastrointestin álnimi komplikacemi apod. • u n ěkterý ch typů medikamentózní terapie napi: léčba Lsaspiragindzou a estrogeny. Nepochybný pokles vyvolává déle trvající a vysoko dávková heparinová terapie, protože m ů že docházet k rezistenci na heparin. • při zvý šen ých ztrátách AT sekrecí - napi: u onemo cnění gastro intestituilniho traktu vedoucích ke zvýšeným ztrátám bílkovin a u n efrotick ěho syndromu paraleln ě se ztrátami albuminu . • zvýšená konzumpce AT u DIK - v souvislosti s šokovými stavy, sepsí, spáleninami , n ěkterymi gynekologický mi nemocemi, porodními komplikacemi a n ěkte rym i závažnými operacemi. Spo uštěcím mechanismem u gram negativní sepse j e u voln ěn í endotoxinu, u gram pozi tivní sepse sehrávají úlohu mukopolysacharidy. Snížená hladina AT omezí terapeutický účinek kompl exu f AT. heparin]. Výskyt AT v jiných tělních tekutinách O AT se vyskytuje nejen v pla zm ě, ale i v pleurdlni a peritone álni zánětlivé tekutin ě. V cere brospin álni tekutin ě se AT vyskytuje ve stálém pom ěru k albuminu jako neagregov ány protein bez prokazatelné inhibiční akti vity. Tato sku tečnos t bývá piipiso vdna fu nkci ba ri éry krevní oběh - cerebrospi ná lni mok. J03

o

Exkrece AT močí u normálních jedinc ů je menší než 3 J-lg za den. U pacientů s proteinurii se poměr AT/Albwnin mění ve velkém rozsahu. AT vylučovaný u těchto pacientů má znatelně sníženou afinitu k heparinu a neni schopen vázat trombin ani F Xa.

HC II (spolu s AT) se podílí na udržení netrombogenních vlastností vnitřního povrchu cév. BC II se uplatiíuje v inhibici trombinu až tehdy, poklesne-li hladina AT pod 30 %. Účinek HC II se projeví u vysokých dávek heparinu. HC II zprostředko­ vává antikoagulační účinky dermatansulfátu a laktobionových kyselin.

~D~

HEPARINOVÝ KOFAKTOR II (HC II ) Inhibiční účinek HC JI byl poprvé zjištěn v I: 1974 Briginshawem a Shanbergem jako reversibilni pomalá inhibice trombinu heparinen, která byla nazvána .Jieparin kofaktorem A " (Brigin shaw a Shangerge, 1974). Látka zp ůsobujici tento inhibiční efekt byla v roce 1981 izolována z lidské plazmy Tollefsenem a byla nazvána HC-JI (Tollefsen a Blank, 1981).

o

MW' 65,6 leDa O Koncentrace v plazmě: 8 - 9 mg/l 1.2 umol/I HC II je jednořetězcový glykoprotein patřící mezi inhibitory serinovyclt proteár, který se nachází hlavně na cévním endotelu a má zřejmě jen lokální význam. Je syntetizován endotelovými bu ňkami a játry. Molekula je složena ze 480 aminokyselin (Jaffe a spol., 1985) . Gen pro HC-II se nachází na 22. chromosomu (Tollefsen, 1981).

Funkce Heparinového kofaktoru II HC II je homologní inhibitor k AT. Na rozdíl od AT je aktivita BC II namířena výhradněproti trombinu. V prostředí o vyšší koncentraci heparinu (> 1 IU/mI) inhibuje HC II trombin, ale neinhibuje faktory Xa a IXa. Jedná se tedy o specifický inhibitor trombinu, se kterým tvoří komplex v poměru 1:1 (Tollefsen, 1995). Blokuje účinek trombinu nejen v hemostáze, ale i v dalších oblastech jeho působení. Trombin se váže u HC II na vazebné místo bílkovinného řetězce, které je uloženo v místě Leu444-Sel445. Účinek inhibičního působení HC II se zvýší až 1000 x v přítomnosti heparinu, heparansulfátu, dermatansulfdtu a dalších glykosamino-glykanů. Dochází k nespecifické vazbě BC-II na malou oblast sacharidového řetězce glykosaminoglykanu, Výraznější urychlení inhibice nastane naváže-li se na trombin minimálně 20 monosacharidových jednotek heparinu. Heparin a dermatansulfát reagují s různými místy povrchu HC-II a tato místa se částečně překrývají

I

Trombin

I<

heparin

AT <30%

m

I

heparin

Klinická interpretace: hladina HC-IIje snížena u novorozenců, zvyšuje se v tě­ hotenství a s přibývajícím věkem. Bývá zvýšena také během akutních zánětlivých reakcí. Zvýšená aktivita HC II byla zjištěna při vyšším INR během antikoagulační terapie dikumariny (Bertina a spol., 1987) . SYSTÉM PROTEINU C Společně s AT a TFPI je systém proteinu C nejúčinnějším inhibičním systémem hemostázy. Systém proteinu C je tvořen proteinem C, proteinem S a trombomodulinem (Esmon, 1992). Systém proteinu C je klíčovou složkou přirozené antikoagulační cesty, která je aktivována na povrc chu endotelových buněk trombinem navázaným k trombomodulinu. Systém proteinu C je schopen inaktivovat některé faktory krevního srážení (VIDa a Va)a tím reguluje tvorbu trombinu (Debize a spol., 1995).

Systém proteinu C - inaktivace

PROTEIN C O MW' 62 kDa (APC 56 kDa) O Biologický poločas: 5-7 hodin O Koncentrace v plazmě: 4-5 mg/I. Stejná u

mužů

i žen,

faktorů

Va a VlIla

mírně vzrůstá

s

věkem.

(Tollefsen , 1995).

HEP

+

Ha

------II~~

[HEP. lIa]

+

+

HC II

HCII

•

[HC ll. HEP]

------I.~

104

•

[HEP. HC II . Ha]

Protein C izoloval a popsal Stenflo v I: 1976. Ukázalo se, že popsaná substance je identická s autoprotrombinem Ila popsanym i: 1960 Seegersem a spol. Ndzev protein C dostal podle pořadí ph chromatografii, kde se projevil jako tieti (C) protein. PC je jednořetězcový plazmatický glykoprotein, který vzniká v játrech za účas­ ti vitaminu K a pravděpodobně i v endotelu. Tento řetězec o 461 aminokyselinách je následně štěpen. Molekula proteinu C pak sestává ze 2 polypeptidových řetězců, těžkého a lehkého, které jsou navzájem propojeny disulfidickými (-S-S-) můstky. 105

Lehk ý řetěz ec zahrnuj e na kalc iu záv islé domény pro navázání k fosfol ipidovému povrchu a pro připoj en í proteinu S. Katalytické místo této serinov ě protedzy j e um í stěno na tě žkém ře­ tě zci. Asi 10 % proteinu C zůs t ává v plazm ě v jednořet ě zcov é podobě (Mc Clure a spo l., 1992). Protein C obsahuje podobnou homologní strukturu jako protrombin a n ěkteré dal ší serinové proteázy. Je známo j iž více než 160 mutací v genu proteinu C. Většin a těchto mutací nem á klinický výz nam.

Protein C se vaze na specifický receptor (EPCR - endoteliální recepto r proteinu C). Akt ivace nastává přednostně na vě tš ím cévním endo telu. EPCR zvyšuj e aktivační účinek komplexu [trombin . trombomodulin] až pětinásobně . Při aktivaci proteinu C dojde k od štěpení peptidu o 12 aminokyselinách z N-konce jeho molekuly - vznik á tzv. aktivní protein C (f1ctivated Protein C. -APC). APC má biologický poločas kolem 15 minut.

Protein C - Gla oblast

Vazba Gla-domény PC na EPCR

STRUKTURA PROTEINU C (domény)

NH'-B@-G(

•

I>
SCHÉMA AKTIVACE PROTEINU C

- CO OH

trombin

\ lx

\.

s - - -- - - s

ISOOx ...

+

GLA - oblast zahrnující y karboxylov é skupiny glutamové kyseliny EGF - doména, ve které probíhají interakce mezi faktory SP - serinov ápro tedza "'-./1 akti va čn í peptid u voln ěný pii piem ěn ě zymogenu na aktivní seti novo u proV"-J tedzu

peptid

Aktivace proteinu C Prot ein C je proenzymem serinové proteázy. K nejúčinn ěj ší aktivac i dochází in vivo na povrchu cévních endotělii, kde je navázán speci fick ý endoteliální receptor trombinu trombomodulin - TM (Esmon a spo l., 1982 ). Trombomodulin váže trombin a moduluje jeho prokoagulační aktivitu . Trombin navázan ý na trombomodulin ve stechimetrickém pom ěru I : I již není koagulačně aktivní, ale umo žňuje aktivaci Pc. Akti vace trombinem v komplexu s trombomodulinem [trombin. tromb omodulin] probíhá více než I 500-2 OOOkrát rychleji , než se samotným trombinem . Akti vace proteinu C samotným trombinem je velmi pomalý a neefekti vní proces. 106

o

K aktivaci proteinu C m ů že docházet, mimo aktivaci kompl exem [trombin. trombomodulin], r ů znym zpl/sobem - napi: p ů soben im trypsinu , plazminu, j edu Russelovy zmije (RVV), PROTACEM, piipadn ě F Xa navázaným na tromb omodulin v ptitomnosti negativn ě nabi tých fosfo lipidovýc h povrch ů . 107

STRUKTURA AKTIVNÍHO PROTEINU C

SCHÉMA STĚPENÍ F Va KOMPLEXEM APC

(domény)

(domény)

NH'-G-~

COOH

G p C . PS . Pl .

dov ané rozštěpením v místech Arg 306 a Arg 679 :

o

~I

T

T

2+1

FVa FVi

Ca2+

(74 kDa

)

Faktor Vi

F Va obsahuje doménu pro navázání F Xa.

Odš těpením vazebného místa pro F Xa se inaktivovaný F Va F Vi) stáv á nepoužitelný pro vzn ik protrombinového komp lexu .

---'

F Va komp lexem [APC . PS . PI . Ca

I

94k~:

evca r

~

(oz načovaný

jako

ev

············· ····X ·········· ··~ 2+'f 74 kDo 1... ~~0irca2+i 74 kDo I fUll~'ťfm

Oddělení a vytěsnění hydrolyticky odštěpeného vazebného místa pro F Xa z povrc hu membrány uryc hluje komplex [APC . PS . Pl . Ca 2+]. Pro tein S vystupuje v této reakci jako kofaktor APC, ko nformač n í m uspořádání m ovlivň uje tu to reakci čás­ tečně i mo leku la fak toru VaL

&.

•• 94 kDo

108

T

••

+

11

odkrytí vaze bných míst v místě 306 a 679 O AIg306 - snížení aktivity o 70 % O A Ig 679 - snížení aktivity o 30 %

.

94kDa

~ ~

L - _--:--: Š t ě pen í těžkého řetězce

Arg 506 -

.

Ca2+ ( 74 kDa )

~PC.Ps.PI.ca2~ .~~

·

ca2V

0 0G D Těžší řetězec

ŠTĚPENÍ FAKTORU Va

FVa

..

Faktor Va

FunkceAPC Aktivovaná fortna proteinu C vykazuje úzce specifickou účinnost serinově proteázy. Na roz díl od účinku AT, kter ý vyvazuje enzym y do komplexu, působí APC , tak že v přítomnosti fosfolipidů a Ca 2+, proteolyticky štěpí a tím inaktivuj e, na membrán ě navázané pla zm atické faktory neenzymového původu - F Va a VlIla . Inhibice aktivity těchto faktorů, vede k blokaci nebo k me nší produkci koagulačně aktivních komp lexů tendry a protrombin ázy a ce lkově k pot lačení ak tivovaného koagu lač ní ho procesu. Kofaktory jsou v tomto p řípadě Pro tei n S a pravděpodo b ně i neaktivovaná forma faktoru V (Deb ize a spol., 1995).

těžký řetě~

..

Štěpení v místech Arg

s---------s

Akti vovaný faktor V (Va) je tvoře n dvěma řetězci , těžším (A I, A2 ) a leh čím (A3 , C l, C2 ). APC hydrolyticky š těp í těžší ře tězec F Va a to ve 3 specifických mís tec h (A rg306. 506. 679) : Inakti vace F Va koag u lač ně aktiv ním komplexem APC nastává sekvenč ním štěpen ím jeho molekuly v místě Arg 506 , násle -

··

...

rca2+i

74 kDo

I rAPC . PS . PI. Ca

2+)

109

G~~ irca2+i 74 kDo I

SCHÉMA AKTIVACE SYSTÉMU PROTEINU C A INAKTIVACE FAKTORU Va

SYSTÉM PROTElNU C V HEMOSTÁZE

V nitřní cesta n cgativ ně

na b itý povrch HMWK

PK

XII ~Xlla XI

PS

C a 2+ HMWK IX

(

Vněj ší Xla ... - - _ _

.. " 1

~

IXa

ca2+

vázaný p ro te in S (i naktivni)

VIII - + VlIla - - - - -- --

vo lný pro te in S (aktivní)

..

l

Vlla + TF

~

Pl

~

X

- - --

ŠTĚPENÍ FAK T ORU VlIlA

Aktivovaný protein C inaktivuje podobným způsobem i F VIIIa. Štěpí F VIIIa v místě Arg 336 v A I podjednotce a v místě Arg 562 v A2 podjednotce: Arg 336 - Al podjednotka Arg 562 - A2 podjednotka O Protein S s APC vytvdii komplex ve stechiome trické poměru (1:1) a ury chluje reakci 3-lOx. O Protein S zde p ůsobi jako kofaktor a umožiiuje navázání proteinu C kfospolipidovým po vrchům (napi: k m embrán ě krevních destiček, nebo k m embrán ě poško zených en do t ělii apod.). O Aktivovaný protein C má navíc i profibrinolytickou akti vitu (zvyšuje uvoliiovdni t-PA z vazby na PA1-1 v cévních endoteliich, s PAI-1 tvoii komplex).

Inaktivace proteinu C K inaktivaci aktivovaného proteinu C dochází v pří tomno sti : • přirozené ho inhibitoru proti APC-PCI (Protein C Inhibitor) • lehkých řetězců faktoru Va • lupus antikoagulans • cxz-makroglobuli nu • cx,-antitrypsinu

llO

e-

-

-

-

Protr ombin

-

cesta

VII

Xa ••

~

cévn í po škozen í

.-----........

X

C a 2+ PI

~

Trombin

~

Fibrinogen ---+ Fibrin monomer

~

Y

XI II

Xllla

Polymerovaný / flbrin ~ Ner ozp ust ný fibrin

Laboratorní vyšetření: • průkaz biologické aktivity : koagulační metody na bázi APlT s aktivací PC hadím jedem Prota cem (Kraus a spol., 1995) • průkaz antigenu: imunologické metody (ELISA) PROTEIN S (PS)

O MW- 69 kDa O Biologický polo čas: 60 hodin O Koncentrace v plazm ě: • Celkový PS (Ag ): u žen 20-40 mg/l plazmy (hodnota je asi o 10-15 % vyš ší u mu ž ů ) , stoupá s věke m u obo u pohlaví • Voln ý PS: 10 mg/l plazmy • funkční test: 65- 130 % Protein S izolova l v I: 1977 di Scipiema spol. v Seetle - odtud název protein S. Úlohu proteinu S jako kofaktoru aktivovaného PC popsal až v roce 1980 Walker. Protein S je jednořetězcový glykoprotein, který vzniká v játrech za účas ti vitaIII

minu K, dále může vznika t v endoteliálních buňkách a megakaryocytech (Estnon, 1992). Gen pro protein S j e přítomen na 3. chro mos omu. Převážn á část proteinu S je uložena va-gra nulích krev ních d esti č ek a v endotelu. Odtud m ů že být u volněn pů ­ sobe ním pro trombintizy a tendry, Vysky tuj e se : • na váz aný na specifický receptor přítomný na cévních endoteliíc h • plazmatický protein S, který může být ve dvo u formách: • vázaně (60 %): část proteinu S je vázána s C4-bBP (C4-bound .B.inding Erotein) složko u komplementu v komplexu [PS. C4-bBP]. Tato forma se neváže na APC. • voln ě (40 %): část proteinu S je v pl azmě ve formě volné. Tato forma se váže na APC. Kof akt orem proteinu C j e pou ze volný plazmatický protein S. STRUKTURA PROTEINU S (dom ěny)

NH 2 -

(

GIn

)-(

TRS

~~-("""

?

...J)-COOH

TSR - oblast citlivá k trombin u EGF - dom éna. ve které p robíhají interak ce mezi f aktory Gla - oblast zahrnující č karboxylové skupi ny glutamové kyse liny

SLOŽKA KOMPLEMENTU C4-bBP ( C4 - bound Bindin g P rot ein ) C4-bBP je regul ační protein ces ty komplem entu. Je to vyso ko molek ulární (m ultimem í) protein slože ný ze 6-7 a řetězců, který buď obsah uje nebo neob sahuj e ~ ře­ tězec . Pou ze form a s ~ řetězcem váže reversibilně PS . PS v sys tému komplementu pravděpodobně zp rostředkovává vazbu C4-bBP na povrch bun ěk . C4-bBP p atří mezi proteiny akutní fáze , jej ichž hladina se zvyšuje při zánětech, u akutn ích s tavů a u žen při léčbě steroidy (antikonce pce) . U těch to stav ů dochází k vyvá zání C4-bBP na volný protein S, při č em ž se hladina PS v pl azm ě výrazně sníž í. T R O M B O M O DU LI N O MW 74kDa Trombomodulin je integrální transmembránový glykoprotein trva le přítomn ý na cévním endotelu, kter ý váže trombin. Trombin vyv ázaný na trombomodulin ztrácí s vůj prokoagulační ú čin ek a naopak potencuje aktivaci proteinu C, který š těpen í m F V a VIII výrazně tlumí ko agulační procesy. Z povrchu endotelových buněk je trombomodulin u volňován do krevní plazm y proteolytickým š těpení m elastázou aktivovaných neutrofilů. Hlad ina plazmatickéh o TM je závislá na stavu endotelu a zvyšuje se v p říp adě j eho poškození a mů že být tak markerem pro endoteliální poškození, jak velkýc h, tak i malých cév, zatímco zvýšená hlad ina solubilního - sEPCR obráž í poškození jen mal ých cé v. Mut ace v molekule tromb omodulinu by mohl y být příčinou n ěkterých arteriálních trombóz. STRUKT URA TROMBOMODULlNU

F u nkce proteinu S Protein S má v přítomnosti Ca2+ afinitu k fosfolipidovým povrchům. Působí, jako kofaktor aktivovaného proteinu C, váže se na n ěj ve stechimetrickém p oměru I : 1. Protein S u snadňuj e vaz bu APC k fosfo lipidový m p o vrch ům des tiček a endotélií. Vzniká pravděpodobně komplex [APC . PS . Pl . Ca 2+]. Akt ivita proteinu S může být zvýšena v přítomnosti ~2 GP 1. Prote in S je inakt ivován trombinem proteolytickým š tě pen í m v mí stě řetězce s NH 2 ukon čením . Protein S ve své volné i vázané formě má vlastní inhib i ční aktivitu nezávislou na APC. Vázaná form a inhibuj e F Xa. Volná forma se navíc váže na faktory V, Va, PS a dá le na F VIII a to i ve form ě vázané - komplex [C4-bBP . PS] má vyšš í afinitu k F VIII než voln ý PS. Vyvázáním na tyto faktory blokuj e PS vznik tenáz y a pro trombinázy a inhibuje tak akti vaci F Xa a trombinu. V menší míře se PS váže i na F VIII v komplexu [FVIII . vWF].

E - EGF: oblast obsahující sekvence blízké lidskému epidenn álnimu 0- O-GLYCOS: oblast bohatá na o-glykosylovaná místa M - MEM: obla st pieklenujici membránu C - CYTO: cytoplazmatická doména obsahující volný cystein

Stanovení proteinu S • Vázallý protein S: PS vázaný na frakci komplementu C4-bBP • VolllÝ protein S : funkční test • Celkový protein S: stanovení antigenu proteinu S

V hemostáze se TM uplatňuje v těchto oblastech: • kofaktor pro aktivaci PC trombinem (reakci urychluje asi 1 SOOkrát) - v pomě ­ ru 1:1 vzniká kompl ex [TM . Trombin] , který nev yžaduj e Ca 2+. Nízká koncentrace F Va urychluj e vazbu PC na [TM . Trombin] .

J1 2

(dom ény}

G

J13

-COOH

růstov ému fa ktoru

• • •

inhibuje proteolytické působení trombinu na makromolekulární substráty ob sahuje-li molekula TM galaktozam inog lykan urychluj e TM inaktivaci trombinu pů s obením AT. komplex [TM . Trombin] aktivuj e fakt ory XIII, VIII , V a kre vní destičky

ENDOTELIÁLNÍ RECEPTOR PROTEINU C (Endotheli al protein C receptor - EPCR) EPCR je tran smembránov ý protein . Exi stují 2 formy EPCR pla zm atická a bu(membránov á) forma podporuj e aktivaci PC na end otelu . Plazmatická (rozpustilá) forma EPCR (sEPCR) si zachovává vaze bné vlastnos ti pro PC , ale nezvyšuje jeho akt ivaci , tak j ako j eho membráno vá form a - EPCR. Klinická interpretace: Zvýšené hlad iny sEPCR se nachází u nemocných se sepsí neb o SLE, či dalších sys témových nem ocí. ně čná. Bun ěčn á

I NH IB ITO R AKTIVOVANÉHO PROTEINU C (P rotein C Inhibitor - PCI, diive : PAI-3) O MW 57 kD a O Koncentrace v plazmě: 3-5 mg/I plazm y O PC] byl izolován Suzukim v r. 1983. PCI j e serinov á prot eáza syntetizovaná v j átre ch bez záv islos ti na vitaminu K. PCI s prot einem C tv oří ekvimolárn í komplex. Tato reakce je potencována heparinem ( úči nek se zvýší as i 30 krát). Inhibitor APC nen í speci fický j en k proteinu C, ale inhibuj e též komplex [TM . Trombin] i jiné slož ky koagul ace (F Il a, Xa, tPA, kalikrein, trypsin ). PCI byl ztoto žněn s PAI-3. INHIBITOR TKÁŇOVÉHO FAKTORU - TFPI (TFPI - I iss ue Eactor Eathway Inhibitor) O M W 33 kDa O Koncent race v plazm ě: I umol/I plazmy O Fyziologické hodnoty: volný TFPI D ěti 0-6 m ě s íc ů 7,S ± 2,0 6 m ě síců - 4 rok y S,9 ± 2,3 více než 4 rok y S,S ± 3,6 Do sp ělí 10,0 ± 4,S

celkový TFPI 76 ,0 ± 16,5 90,6 ± 17,S S9,2 ± 19,4 SI ,2 ± 30,4

j ednotka !lg/I pla zmy !lg/l plazmy !lg/I pla zmy u g/l pla zm y

Kon centrace TFPI v pl azmě stoupá s vyšší hladinou cholesterolu a kle sá při medikamentózní léčbě vro zen ých hypercholesterolemií. Ob sah TFPI se zvyšuje po poran ěn í.

TFPI j e pla zmatický inhibitor serinovycli proteáz Kunitzova typu - obsahuj e 3 Kunitzo vy domény tSprechet; 1994). Jde o specifický inhibitor zevní ces ty aktivace koagul ačního systému o 276 aminokyselinách, který inhibuje komplex [VIla . TF] . Na molekule jsou 2 akti vní místa. TFPI je syntetizován endotelovými buňkami a je u v olňován do krevního oběhu s p o l ečně s tkáňovým faktorem. Většina cirkulujícího TFPI je navázána na frakc e cholesterolu (lipoproteiny HDL-LDLVDL, hlavně LDL). TFPI je vychytáván z plazmy především játry a ledvinami. Nachází se: • v plazmě (20 %) : tento pool se m ů že vázat na lipoproteiny (LDL a HDL ), vznikají aterosklerotické pláty s následnou neutralizaci TF. • vázallý na endotel (SO %): uvoliiuj e se heparin em běh em h eparino v ě terapie heparin stimuluje uvoliiov áni TFP1 z endo teli álniclt bun ěk. MMe dojít ke zvýše ní hladiny pla zmati ckého TFP1 2-JOkrát (Kijows ki a spo l., 1994). Kontinuální infuze n efrakciono van ěh o heparinu zvyšuj e na dvojnásobek kon centra ce TFPI v plazm ě. Léčebn é hladiny LMWH zvyšuj í hladinu TFP1 podstatn ě mén ě (Esmon, 1992). Uvoln ění TFP1 a zvýšení j eho inhibiční aktivity po podání heparinu se považuje za j eden z hla vních m omentů pro vysvětlen í antikoagula čui aktivity endotelu. • vázaný na trombocyty (2- 10 %): z krevních destiček se uvolňuje po stimulaci trombinem. Proto je v místech destičkové agrega ce nalézána zvýšená hladin a TFPI. Funkce TFPI TFPI je důležitým inhibitorem zevní cesty koagulace. Má dvojí inh ibi ční účinek : • piůn á inhibice F Xa - váže se ve stechiometrickém poměru (I : I). Reakc e je ur ychlována heparinem a dalšími polyanionty • tvorba koagula čn ě neaktivniho komplexu [TFPI . Xa . VIla. TF] - závisí na koncentraci Ca 2+. TFPI se váže pouze na kom plex s [VIla . TF] , ale neinhibuje volný F VIla.

komplex [F Xa . TFPll

1 FVlla

Úloha TF PI v hemostáze

O TFP1 indukuje mimo jiné vazbu F Xa na monocyty a

inhibičně

vyvazuje tryp sin

TFPI byl poprvé popsán v roce 1987. Dii ve byl ozn ačován jako EPI - extrinsic pa thway inhibito r nebo LACl - lipop rotein associated coag ulation inhibitor:

ÚLOHA TFPI SPOCl vA V TOM, ZE INHIBUJE I MALÁ MNOZSTVl T F!

lJ 4

lJ5

Klinická interpretac e: Zvýšené hodnoty se nachází v p oč áteční fázi DIK, při sepsi a u některýc h n ád orů. Snížená hladina TFPI, příp adně defekt jeho molekuly mohou být pod obn ě jako u ostatních defektů inhibitorů provázeny tromb ofilií. Laboratorní stanovení: sledová ní aktivity TFPI (fu nkčn í test). TFPI-2 Byl popsán TFPI-2. Jde to homologní protein k TFPI o MW 32 kDa, který je vázaný k extrace lulární matrix. Jeho koncentrace v pl a změ je velmi nízká (ko lem 0,45 ug/l), ale v průb ěhu těhoten stv í se zvyšuje 40-70n ás obn ě. TFPI- 2 inhibuje proteázy s rů zn ými specifitami a funkcemi, jako je trypsin, chymotrypsin, plazmin, plazmatický kalikrein, faktory Xl a a XIIa a pravd ěpodobn ě inhibuje i amidolytickou aktivitu kompl exu [Vila. TF] . pri márn ě

OSTATNí PLAZMATICKÉ INHIBITORY Hlavní fyziologický inhibit or elastáz je inhibitor aJ prote ázy. Ostatní inhibitory mají p ravd ěp odobně jen minim ální důle žito st pro hemostázu. Inhibitory v ázan ě na buiíky mají trochu odlišnou úlohu při kontrole hemostatických proc es ů . Mezi důl ežité inhibitory této skupiny řad í m e protedzově nexiny I a II a trombomodulin. Proteázové nexiny nacházíme v endoteliálních bu ňkách , ale částeč­ n ě i na povrchu ostatních bun ěk. Tyto inhibitory reagují s některým i proteázami. 2.5. 1.2 . InhibitOlY fibrin o N zy Podobně j ako koagul ační systém má i fibrinolytický systém své inhibitory, které za fyziologických podmínek zajišťuji lokalizaci a utlumení fibrinolytických dě­ jli a zabraůujij ejich šiieni do okolí.

az-ANTIPLAZMIN MW 70 kDa

Biologický po loča s : 60 hodin Koncentrace v plazm ě: 50-70 mg/I I umol/I plazmy Po dlouhou dobu se hlavní inhibitory plazminu považovaly armakrog lobulin a arantitrypsin . Teprve v roce 1976 byl popsán n ejvýzn amn ější inhibitor plazminu - lX}-alltiplazmill . JJ6

A ntiplazminy jsou přítom ny v p lazmě v nadbytku a okam žitě váží velmi účinn ě veškerý n adbytečný plazmin v pom ěru Cl : I). Biologický p ol o čas volnéh o plazminu v krvi je jen 0,1 sekundy. Zejména a rantiplazmin je velmi důležitým inhibitorem systému fibrinolý zy. Je to glykoprotein tvořený v játrech, který patří mezi inhibitory proteináz serinového typu. arantiplazmin má velkou afinitu k vazebnému místu pro lysin na plazminu a podobn ě jako fibrin se k tomuto místu velmi ú č inn ě váže. a r antiplazmin vyva zuje jen volný plazmin piůomny Plazmin ~m u-ž-antlplazmin v plazmě se kterým tvoří kom- . . plex v p oměru I: I [plazmin . a rantiplazmin]. Takto vyvázaný a r antipl azmin je ods traně n pomocí MFS. Je-li piazmin vyvdzán na fibrin pak arantiplazmin takto [Plazmin. Iibrin] <STOPII]~ a -2-antiplazmin vyvázaný plazmin již prakticky ~=====~J neváže. Má sice nepatrný inhibiční vliv, ale reakc e probíh á asi 50krát pomaleji , než s volným plazminem. arantiplazmin dále inhibuj e navázání plazmin ogenu na fibrin, případně mů že š těpit faktory Xlla, Xla, Xa, příp adn ě kalikrein, trombin , u-PA a t-PA. Volný a r antiplazmin je inaktivová n, v příto mnos ti F XIIIa, vyvázá ním na a řetězec fibrinu.

I

I

I

I

I

I I I L.:======_-=-__

I

I

INHIBITORY AKTIVÁTORŮ PLAZMINOGENU (PAl) (Elasminogen Activator Inhibitor - PAl) Inhibitory aktivátorů plazminogenu jsou přirozené inhibitory tkáňového aktivátoru plazminogenu (tPA). Zatím jsou popsány 3 typy: PAl-I , PAI-2 a PAI-3.

PAI-! O MW' 52 kDa (glykosylovaná forma) 43 kDa (neglykosylovaná forma ) O Biologický polo čas: Biologický polo č as latentn í (neaktivní) formy je kolem I hodiny při fyziologickém pH a tepl otě. Lehce stab i l nější forma vzniká navázáním PAl-I na adhezivní protein Vitronectin (biologický p oloč as 2 hodiny). Mutované formy PAl-I mají biologické poloč as y až 145 hodin. O Koncentrace v p lazmě: 20- 100 ).lg/l Lidský PAI -I se řadí mezi serinové proteázy. Je syntetizován endoteliálními buňka­ mi cév, megakaryocyty a hepatocyty (po stimulaci cytokin y), jako j ednořetězcový glykoprotein, který je z převážn é č ás ti přítom en va-granulích krevních dest i ček , v menší m íře v endotelu a v pl azmě . Syntéza je reg ulována trombin em i některým i hormony n apř. glukoko rtikoidy, či inzulinem.

Jl 7

Funkce PAI-! PAI- I je inhibitor obo u typů aktivátoru plazm inogenu Ct-PA ~hJ~JJJ1JJ !JU BJJ a u-PA), PAI-2 inhibuje pouze u-PA, zatímco PAI-3 inhibuje u-PA, t-PA a trombin . N ejúčinn ěj ším inhibitorem z této řad y je PAl-I , který vytváří s tPA stechiometrický komp lex [PAl-I. t-PA]. v poměru I : I a tím j ej inak tiv uje. Proces je urychlován fibrinem, na který se PAl- I váže a v této vazbě rych leji vychytává t-PA z plazm y. Komplex pak disociuje z molekuly fibrinu aje odbouráván v játrech vazbou na receptor podobný Iipoproteinovým receptorům. Po u volnění PAl-I poměrně rychle konvenvertuje na neaktivní formu a v této podobě koluje v plazm ě. Aktivuje se změnou konformace a odhalením aktivn ího místa vazbo u na negativně nabitý povrch fosfolipidů. Klinické použití: Vyšší hodnoty PAI- I ukaz ují na indukci endotelu, navozuje je i endogenní insulin. Zvý šené hodnoty PAl- I jsou rovněž spjaty s dyslipemií smíšeného typu a obezitou. Vyskytují se i v tě h ote n st v í , při horečce a zánětu .

o

Účinek PA1-I je nam iien proti aktivaci plazminogenu, to znamená, že j eho úči­ nek spadá do období, kdy ještě neni akti vovdna fihrinolyza (výhoda v porovnání s účinkem a rantip/azminu, ktery je natniien proti vznikajícímu pla nninu). O Klinické studie proka zují, že j edinci se zvýšenou hladinou PAI-l se po proděla­ ném 1M dožívají kratšího věku. O PAI-I j e mo žné spolu s fibrinogenem a dalšími proteiny zánětlivého procesu (Csreaktivni protein, alfa 1 - antitr ypsin a jiné) zahrnout do skupiny protein ů tzv. akutní fá ze, j ejichž syntéza a u voln ění j sou induk ovány v rámci zán ětlivé (imunitn í) reakce organismu.

PAI-2 O MW: 48 kDa O Koncentrace v plazmě: 2-4 u g/l. Zvyšuje se v

tidázy, mezi které pat ii i TAFl j sou 110siteli atomu Zn, ktery je nezbytný pro "" 0'" P>T7 jejich katalytickou fun kci. Karboxypn s 1~1).4 .... peptidáza B (CPB) hydrolyzuje bazické aminoiet ězce. Byla obje vena v roce 1958 jako pankreatická protedza. Její hladina v séru j e prakticky nulo vá. _ "92 Vzhl edem k velk é podobnosti CPB a TAFI ve struktuie a katalytickém mechanizmu j ejich účinku je většina autoni ztoto žii uje a jejich názvy pou žívá jako synon yma (Hendriks a spol., 1989). TAFI byl popsaný v roce 1988, jako Mode l molekuly TAFI labilní karboxypeptidáza v séru , která interferovala při měření karboxypeptidázy N (Iysinová karboxypeptidáza - CPN). Vyskytuje se jako jednořetězcový glykoprotein o 401 aminokyselinách . Neaktivní zymogen o 423 aminokyselinác h je syntetizován v játrech. B ěh em sekrece TAFI v jaterní buňce je odštěpen N- koncový signální pept id o 22 aminokyse linách (Telil a Eaton , 1995). Gen pro TAFI má veliko st 48 kB , obsahuje I I exonů a nachází se v chromosomu 13q 14.11. "'.,41

P 3 ).')

RY.l2

o

V sou časné době j e navržena nová nomenklatur: místo TAFI - pro TAFI, místo TAFla - TAFl, místo TAFlai - TAFli (Antovic, J.P., 2004)

STRUKTURA TAFI (domény)

N - N22, N51, N63 , N86 HEH - S299, G336, D344

průběh u tě hote n stv í.

TROMBI NEM AKTIVOVANÝ INHIBITOR FIBRINOLÝZY (TAFI) (T hro mbin Ac tivated Eibrinolysis I nhibitor - TAFI, plasma pro-carboxypeptidase B /CPB/. pro-c arboxypeptidase U /CPU/. E.C.3.4. 17.3.)

O MW 58 kDa O Koncentrace v pla zm ě: 2,5 - 5 mg/I (50 nmo l/I)

COOH

N N

N

N

H

E

H

..........

S G D

Z~i~

TAFlje členem rodiny me talokarboxypeptidáz: Karboxyp eptidázy j sou enzymy, které hydrolyzuji C- koncový iet ězec peptidu. Dělím e j e na serin o v ě karb oxyp eptiddzy, cysteinové karb oxypeptiddzy a metalokarboxypeptidazy: Metalokarboxypep-

Tato část molekuly je homo logni s tk áiiovou karboxypeptiddzou B, která obsahuje 7 reziduí cysteinu (Cys64. 77, 136, 15 1, 160, 165, 291), dále koordinační místa Zlz2+ (H67, E69 , H196) a místo k vyvázání substrátu poblíž C- konce molekuly (D257, G244, S20 7).

118

119

Aktivace TAFI (TAFla) TAFI je neaktivovaná forma karboxypeptidázy U, která se aktivuje trombinem, plazminem a pravděpodobně také trypsinem. Trombin, plazmin a trypsin proteolyticky štěp í TAFI v místě Arg 92 proteinového řetězce počítáno od N konce molekuly. Při š těpení se oddělí od katal ytické domény aktivační peptid s N- koncem, obsahuj ící 4 N- glykosylov aná místa, která j sou důle žitá pro stabilizaci a prodl ou žení biologick ého poločasu TAH Při š těpen í se oddělí katalytická doména (TAFIa) s C- koncem cho vající se jako karbox ypeptidáza , která mů že hydrol yzo vat Lys a Arg v C oblasti proteinu (Fuentes-Prior a spol., 2000).

@

ll @)

TM má dvojí úlohu v koagulačním systému: • Sni žuje tvorbu trombinu v systému aktivace proteinu C vyvázáním do komplexu [TM . trombin] - reakce probíhá zejména při vysokých koncentracích trombomodulinu. • v systému komplexu [TM . trombin] ovlivňuje aktivaci TAFI a tak nepřímo pů­ sobí snížení fibrinol ytick ého efektu - reakce probíh á zejména při nízkých koncent racích tromb omodulinu.

o

I když o bě reakce mohou probíhat sou časn ě, zdá se že u rčujicim faktorem pro výsledný účinek vlivu TM na TAFI a PC je jeho koncentrace. K aktiva ci TAFI vedou nízké konc entrace TM (kolem 5 ntnol/l), zatímco p ťi vyšších kon centra cích (kolem 10 ug/ml ) se akti vace TAFI snižuj e. To se vysvětluje zvýšenou tvo rbou aktivovaného proteinu C, ktery zasahuje do koagula čních d ěj ů a snižuje p rodukci trombinu.

Trombomodulin působí profibrinolyticky při vyšších a antifibrinolyticky při nižších koncentracích. Důležitým faktorem pro regulační účinek in vivo TM na TAFI je průsvit cévy. Koncentrace TM v plazmě se zvyšuje směrem od aorty ke kapil árám. V kapilárách je díky vyšší koncentraci trombomodulinu, nejmenší aktivace TAFI a v d ů sledku toho i snížená inhibice fibrinol ýzy.

•

peptid Komplex trombinu s TM zvyšuje rychlost štěpe n í trombinem až I 250krát. TM je zprostřed ko ván jeho doménami pro epidermá lní rů sto v ý faktor (EGF-do mé ny). Trombin se váže na domény EGF-5 a 6, kdežto EGF-4 je nezby tná pro aktivaci proteinu C. Nejmenší mutant TM schopný j eště aktivov at TAFI mu sí mít u sp ořád án í těchto domén EGF-3, 4, 5 a 6 (Wang a spol.. 2000 ). A kt ivačn í ú činek

Inhibice TAFla TAFla se inaktivuje konformačnízměnou na TAFlai. Při této změn ě nedochází k proteolytickému š těp e n í. Degradace TAFl ai je umožněna trombinem, který jej proteolyticky štěp í v místě Arg 302 na 2 fragmenty o MW 25 a II kDa (Ma rx a spol., 2000). TROMBIN

konformačni

AKTIVACE TAFI 35,8kDa

I V1I ě1la> lJmD~~ ~ I •

/

Frng..," 25 kVa Fragme1ltII kDa

I I

TAFI (

Aktivační peptid

1..

Aktivni místo

. . .)

55 kDa

19,1 kDa (

Aktivační peptid)

TAFla

l..

35 ,8 kDa Aktivní místo

120

. . .)

Úloha TAFI v organizmu TAFI hraje klíčovou úlohu v interakci mezi prokoagulačn ůni, antikoagulač­ nimi a fibrinolytickými systémy. V plazmě koluje neaktivní forma TAFI v komplexu s plazminogenem [TAFI • plazminogen]. V tomto komplexu se TAFI váže IOkrát vyšší afinitou k Lys-plazminogenu, než Glu-plazminogenu. Vazb a TAFI na plazmin ogen je zp ro středko v án a glykosylovými místy na akti vač n í m peptidu TAFI (Wang a spol., 1998). TAFI nepatří mezi serpiny a jeho inhibi ční funkce je zcela odlišná. Plazminogen 121

i generova ný plazmin jsou vyvázány v p oč áteční fázi fibrinolytického na bílkovinný ře tězec molekul y fibrinu vazbami na karboxyskupiny koncových aminokys elin v jeho molekule - Lys a A rg. TAFIa hydrolyticky š těp í tyto aminok yselin y v koncových oblastech řetězce fibrinu v tzv. karboxy C- oblasti a tím snižuje počet vazebných míst pro plazminogen a t-PA na molekule fibrinu . a

n ásl edn ě

š těp e n í

TAFIa

Fibrin - Lys - OH Fibrin - Arg - OH

Fibrin - Lys Fibrin -Arg

Protože j ak plazminogen, tak i plazmin se nemohou d o statečně vyvázát k molekule fibrinu, nedoch ází k tvorbě trimerního komple xu [t-PA . plazminogen . fibrin] , snižuje se tvorba plazm inu a n ásledn ě i ú čin ek fibrin olytického systému. TAFI v p říp ad ě fibrin olýzy aktivova né t-PA modifikuj e koncové čás ti moleku ly fibrinu a tím z ne m ožň uje přip ojen í komplexu [t-PA . plazmin ogen] k akt ivač ním u povrchu fibrinu a vy tvoře n í kompl exu [t-PA . plazminogen . fibrin], j ak je patrné z obrázku.

Působení TAFla

Nor mální stav

inhibitoru

TAFIa cirkuluje v plazm ě vázaný v nekovalentním komplexu s a Tmakroglobulinem [aTmakroglobulin. TAFI]. TAFIaje velmi citliv ý na teplotu. V organizmu je jeho biologický poloč as kolem 10 minut. TAFIa též uvolňuje PAI-l z granulí aktivova ných krevních d estiček. F un kce TAFI v organismu Akti vace TAFI účinkem ko mplex u [trombin . TM] sp oj uj e oba jevy koagulace a to jednak inhibi čni vliv ' - - - - - - - - - - - - - - - ----------' TAFI na fibrinolyzu a profibrinolyticky efekt aktivovaného proteinu C. Aktivovaný TAFla moduluje fibrinol ýzu in vivo. Exprese TAFIa vyvolá inhibici fibrinolyzy zej ména u získaných tromb otick ých stavů ( n apř. u infarktu myokardu a cévní p říh ody mozko vé). Naopak je -li tento systém narušen, dochází ke zvýšellífibrillolýzy . To mů že mít za následek krváce ní u vrozených defektů v n i třn í cesty aktivace koagulace ( např. u he-

I

122

mofilie A i B). Tito nemocní mají sníženou tvorbu trombinu v iniciační fázi koagulace díky nízkým koncentracím TF a s o učas ně sníženou tvorbu trombinu vnitřní cestou aktivace. Aktivace TAFI a n ásledně i inhibice fibrillolýzy jsou v těchto případech narušeny a vytvořellý fibrin bude rychleji lyzován. Naopak u nemocnyclt s vysokými koncentracemi F VIII, IX a XI je fibrinolýza blokovaná a následkem toho se zvyšuje riziko trombózy. Nemocní s deficitem F XI jso u náchylní ke krvácení do tkání s vysokou lokální fibrinol ytickou aktivitou. Vysvětlením pro TAFla _ inhibiční efekt tento jev by mohla být nedostatečná inhibi(PLM - plazmin, PLG - plazminogen) ce fibrinolýzy z důvodu snížené tvorby trombinu (vlivem deficitu F XI) a snížená aktivita TAFI. Klinická interpretace: Klinické studie vykazují pozitivní korelaci mezi koncentrací TAFI a věkem mu žů a žen, které nepoužívali orální kontraceptiva. Hormon ální l éčba orálními kontraceptivy zvyšuje hladinu TAFI. U černošské populace - v porovnání s bílou rasou byla zji štěn a význ am ně nižší hodnota TAFI. Zvýšené hladiny TAFI byly nalezeny u nemocných s anginou pectoris, ICHS , u nemocných s venózní trombózou a při zánětec h . U revmatoidní artritidy a u n ěkterých hemobla stóz byly naopak zj ištěny snížené hladiny TAFI (van Tilburg a spo l, 2000).

2.5.2. Inhibitory s nespecifickými vazbami Vedle specifických inhibitorů existují také inhibitory s nespecifickými vazbami na cílové molekul y. K této s ku p i ně inhibitorů se řad í : • alfaj-makrog lobulin • alfa .vanritrypsin • Cl-inhibitor Jde ob ecn ě o inhibit ory proteáz, jejichž úč inek pře s ahuj e rámec ko agul ačních a fibrinolytických dějů. V těchto systémech se však mohou vý zn am ně uplatnit. arMAK RO GLOBULlN O MW- 725 kDa O Biologický poločas : 200-250 hodin O Koncentra ce v pla změ: 2-2,5 mg/l plazmy. Koncentrace se snižuje s věkem (v dět ství asi 2,5krát více než v dospěl o sti ) . Výrazn ě se zvyšuje v těh oten ství. armakroglobulin j e v historickém vývoji jedním z nej starších pla zmatických Molekula existova la v organizmech j iž n ěkdy před 600 miliony let.

p rote in ů .

123

~-makroglobllli1l

je tvořen hepatocyty v játdalších b uněk včetně m akrofágů. Je pří tom en v pl azm ě i mimo cévní systém. Je složen ze dvou, č i č tyř identických podjedn otek. Má nejširší spektru m antiproteázové aktivity. Je schopen v yt vářet komplexy s prote olyt ick ými enzymy plazmy, l eukocyt ů, bakterií i hadími jedy. Působí o d l iš ně v porovnání se serpiny, nevyužívá limitovanou proteolýzu. Tato velká molekula p ů s ob í pod obn ě jako past na myši. Molekula urmakrog lobulinu změ ní svo u konformaci, obklopí molekulu enzym u a tak uz avře vstup substrátu k n ěmu , zejména do oblasti aktivního místa cílového enzymu. L----In-h-jb-jb-j-ce-p-r-o-te-áz-----.J Vazba nevede tedy k inaktivaci aktivni složky, ale ~.makroglobulinem (M G) k e sterické z ábran ě (neumož ní se odk rytí vazebného místa). Klinická interpretace: Jeho účinek nenastupuje ihned, ale postupně se zvyšuje . Uplati'í.uje se zejména v situacích, kdy jsou vyčerp ány kapacity ostatních inhibitorů . rech i

řado u

2.5.3. Získané inhibitory Zatímco přirozen é inhibitory jsou součás tí a záro ve ň i základním reg u l ač n í m mechan ismem koagul ace, jsou získané inhibitory nále zem patologickým, n epř í zni ­ v ě zasahující m do koagulace. Ze získaných inhibitorů hrají nej významn ěj ší úlohu tzv. antifosfolipidově protilátky (Cines a McCrae, 1995; Debize a spol., 1995).

ANTI FOSFOLlPIDOVÉ PROTILÁTKY (APA - Antiphospholipide Antibody, Antifosfoproteinové protilátky) A n tifosfolip ido vě

protilátky předs ta vuj í heterog enní skupinu protilátek (irnuIgG a IgM), které vy tvářejí komplexní s lo učeniny s negativn ě nabitými fosfolipidy (kardiolipin, fosfatidylserin, fosfatidyletanolamin) nebo s jej ich komplexy s makromolekulární látkou - kofakt orem, n ej č astěji bílkovinné povahy. Jako proteino vé kofaktory pro vazbu APA na neg ati vn ě nabité fosfolipidy se upl atňuj í uz-glykoprotein I, protein C, protein S, annexin V, HMWK, F X a další. Vazba antifosfolipid ových protilátek na fosfolipidové struktury znemož ní nebo omezí tvorbu ko agulačně aktivních komplexů . nogl obul in ů

-

hla vn ě

Ko - kofaktor S - substrát En - enzym

C -l INHIBITOR (ClINH) O M W 105 kDa O Biologický poločas: 38 - 40 hodin O Koncentrace v plazmě: 0,18 - 0,22 gll plazmy Je to glyko protein, který je syntetizová n r------------~ v játrech a je uvolňov án v pr ůb ěhu akti vace dest ič ek Ue p řítomen v u granulích krevních de-

stiček).

CI ·inhi bitor

I

Je n ejm o cněj ším inhibit orem kont aktní fáze, inhibuj e faktory Xlla, Xla a kalikr ein, ale • i plazmin a zasahuje do systému kompl ementu . Účinek je asi 10-20krát zesílen v přítomnosti heparinu. Klinická interpretace: Jsou známy jak vrozené, tak i získané deficience Cl-inhibit oru ( n apř. při sepsi).

(X,-ANTI T RYPSIN O MW 55 kDa O Biol ogický poločas: 90 - 96 hodin O Koncentrace v plazm ě: 1.3 - 2.5 mg/I plazmy Je to glykoprotein, který je syntetizová n v játrech . Inhibuje především F Xa a je i poměrn ě silným inhibitorem aktivova ného Pc. Jeho hlavní význam spoč ívá v inhibic i proteáz slinivky bři šn í a bílých krvinek. 124

( většin ou

serinovd proteáza ) Ab - protilátka

[PI. Ab]

Ko . S. En X [PI.Ab]

Po vazbě kofaktoru v ko ag u lač ně aktivním komplexu dochází k modifikaci konfo rmace fosfolip idů spo čivajici v piechodu Z lameldrni do hexagonální fáze, pro níž j e charakteristická vyšší antigenic íta. Tím se vy tvářejí podmínky pro reakci APA s proteinfosfolipidovým komplexem. Pro APAje typická výrazná heterogenita. Pacienti často v ytv ářejí " koktej l " protilátek reagujicich s různymi fosfo lipidy. Specifické účinky jednotlivých druh ů APA z ůs t á vaj í zatím ne zcela obj asn ěny.

S antifosfolipidovými protilátkami se setká váme za • u paci entů s autoimunitním one mo cněním • u jedi n ců po prodělaném i nfekčním on em ocn ění • u zdravých lidí 125

různých

situací:

Podle jednoduché kl asifikace • a uto im unitní • aIIoi m u nitní

rozdělujeme

A PA na:

A u toim u n itn í A PA A utoimuni tní APA se vyskytují v séru 20-50 % pacientů se systémovým lupu s

erythematodes (SLE), m éně často ve spojitosti s jiným

onemocněnímpojivové tká -

ně. Přítomn ost

autoimunitní APA bývá spojová na s opa kovaný mi žilními i arteriá lními trombózami, trombocytopénií a u žen s opakovaný mi spo ntánními pot rat y.

A IIoim u n it n í APA Alloimunitní APA doprovázejí přechodně n ěkterá infekčnía maligní onemocn ěn í a na rozdíl od auto imunitních APA nen í j ej ich p řítomn o st v séru dop rovázena klinick ými příznaky. Na lézaj í se v 8 % u norm áln í populace a jejich výskyt stoupá s vě ke m . K lasifi k a ce A PA Antifosfolipidové protilátk y (A PA)

• •

t voří

heterogenní skupinu, kam

řad íme :

lupus antikoagulans (LA ) antikardiolipinov ě protilátky (ACLA) typu IgM , IgG a IgA (Debize a spol., 1995).

LUPUS ANTIKOAGULANS V r: 1952 Conley a Hartman prokázali v séru pa cient ů se systémovým Lupus Ery thema todes substanci, která zp ůsobova la prodloužení srážlivosti krve a času potie bn ěh o k p iem ěn ě prot rombinu na trombin. Později byla tato látka pojm enována .Jupus antikoagulans " (LA). Jedná se o skupinu imun ogl obulinů , které interferuji s jedním nebo více koa gulačními testy závislými na fosfolipidech . Jde hlavně o aut oprotilátky, které jsou n am ířen y proti fo sfolipidovým složkám protrombinov ěho komplexu koagus - substrát E n - enzym l ačn í kas ká dy (Debize a spol.. 1995). Ko - koenzym Může

• •

jít o :

protilátky typu A protilátky namiien ě proti protrombinu

Cílový antigen:

Výskyt:

~rglykoprotein I

1/3 LA 2/3 LA

protrombin

Tyto au to protilátky vstupují do koagulač n í ho děj e na různých úrovn ích koagupro ce su , re aguj í s proko agul ačním i fos fo lipidy a so u těží o místa na nich

l ačn íh o

126

s faktory k o agulačního sys té mu. Tím omezuj í vázání těchto faktorů do koagulačn ě aktivních komplexů a způ s ob ují abnormální nálezy koagul a ční ch te stů , zejména APIT. Dochází k interfere nci např. při en doteli ální aktivac i sys tému prot einu C , ale .. i k interferencí m na úrov ní primá rní heKomp etice faktorů a protilátek o míst o mostázy, p opřípadě v dal ších mí stech, ve na fosfolipido vém povrchu (GP - glykoprotein, Ab - protilátka). kterých se upl atňují ko agulačně aktivní fosfolipidové povrchy. Jedním z proteinů , který vytváří po dobné ko mplexy je i ~2"glykoprotein 1 ( ~2"GPl) . ~rGPI se dále váže na lipo pro tein y bohaté na triacylglycerol y. Protilátk a proti ~2-glykoproteinu I j e ~rglobulin , kter ý mů že inhibovat ce stu koagul ačn í kaskády tím, že váže negativn ě nabité fosfo lipidy, kter é se dostá vají na po vrch buněk např. u krevn ích elementů , endotéli í nebo trofobl astů v dů sl edku jej ich poškoze ní. ~rGP I se po navázán í autoprotilá tky ina ktiv uje a ztrácí své antiko agulačn í vlas tnosti. Klinická interpretace: Nemocní s LA APA namířené proti protrombinu a ~rGP mají zvýšené ri zik o vzniku trombózy (Cines a Mc Crae, 1995). LAjsou č as to nalézány u pacientů s tro mbocytopenií, u hepatitid, vazospas tickýc h poškození , kožních ulcerací, infarktu myokardu , trombózy mozko vých tepen, po přestál ých bakteriáln ích a virových infekcích, po malárii , lymeské borelióze a neurologic kých n ezánětli vých chorobách (epilepsie, migréna). O Frekvence LA

narůst á

s

věkem.

Laboratorní stanovení protilátek typu L A Od roku 1988 j e diagnostika LA pod dohledem Subcommittiee on Lupus

Anticoagulant-Antifosfopilid Antibodies oj the SSC oj the ISTH. Používaj í se: • funkční vyšetření: na zákl adě jejich schopnos ti ov l iv ň ovat ko agul ační testy závisl é na fosfolipidech (Lupus Anticoagul ans - LA ) O PT - asi 2/3 všech případů , antiprotrombinové protilátky. Trombóza asi u 20 % případů O A PIT O ředěný RVVT (R use l Y iper Y enom Iime) - anti- ~rglykoprotei nové protilátky. Trombóza se vys ky tuje as i u 70 % případů 127

•

ředicí studie: Jestli že testy jsou abnorm áln í p rovádí se ředící studie (smísením pla zmy pacienta a pla zmy nonn álu} konfirma čni testy : nedojde-li k normalizací testu v iedicic h studiích provádí se konfirma ční testy (iedi se fosfo lipid - APTT, tkáiíový f aktor - PT nebo účinná reag en ční složka p ťitonuui v setu - RVVT)

o

Neexistuje žádný absolutn ě spolehlivý screeningový test na pn/kaz LA.

•

ANTlKOAGULAČNÍ A PRO KOAGULAČNÍ PŮSOBENÍ PROTILÁTEK TYPU LA

lipinu reagují s fosfodiesterovo u skup inou kardiolipinu a reprezentují tak pouze jeden č l en skupiny protilátek, které se mohou vázat na fosfolipidy, kdežto nega tivně nabité fosfolipidy, na které se váží protilátky typu LA j sou t ěm ěi ve všech membránách různych. tkání (v mozku , trombocytech, endotelu). Tento rozdíl ve schopnosti vázat kardiolipin nebo negativn ě nabité fosfolipidy je klinicky velmi důležitý. Laboratorní stanovení: Od I: 1986 probíhá dia:'!'-....-L.ouu..~:c.:....-'-=--"'"""''-'--'--'--'''''''-'' gnostika antifosfo lipidovyc h protilátek podle doporu - "" čen i International Anticardiolipin Standardisation WorksllOps. Používají se kom erč­ ní ELISA testy pro ACLA ke stanovení hladin 19G , 19A a 19M (The Subcommittee on Lupus Anticoag ulans, 1995 ): • stanovení antigenu - ELISA metoda: • vy šetřují se antikardiolipinové protilátky (ACLA ) - IgG, IgM a IgA. • stanovují se protilátky proti některým fosfolipidům (fosfatidyletanolaminu, fosfatidylcholinu, fosfat idylserinu, fosfatidylglycerolu, fosfa tidylinozitolu, ky selině fosfatidylové) .

Literatura Barrowcliff, T. w, Thoma s, D. P.: Antithrom-bin III and heparin. In: Bloom, A. L., Thomas. D. P., eds. Haemostasis and Thrombosis. Second edition. Edinburgh : Churchill Li vingstone, 1987, s. 849

Debize, C., Massignon, D., Couer; P. : An tiphospholipid antibodies and thrombotic risk: relationship to thrombomodulin, D-dirners and prothrombin fragment 1 + 2. Nouv. Rev. Fr. Hématol. 37, 1995, Suppl II, s. 93- 96.

Bertina, R. M ., van der Lin den, I. K., En geser; L. at al.: Hereditary heparin

Esmon, E. L., OlVell, W. C., Esmon, C. T.:

cofactor II deficiency and the risk of development of thrombosis. Th romb os. Haemost. 57, 1987, s. 196-200.

ANTlKARDl O LlP INOVÉ PROTILÁTKY (ACLA - An t i~ard i oli p i n Antibody) V I: 1906 obje vil Wasserman v séru pacientů se syphillis protilátky, které nazval reaginy. V následujících 30 letec h se hledaly pro záchyt těchto protilátek vhodné zdroje an tigen ů a piedev štm vhodné metody k jejich záchytu. V I: 1951 Pangborn zj istil, že anti gen, který váže reaginy, je kyse lý .fosf olipid, získaný alkoholovou extrakcí h o vězíh o srdečn ího svalu a na zval ho kardiolipin. Kardiolipin je součástí vnitřní m embrány mitochondrií. Protilátky proti kardio128

Isolation of a membrane - bound cofactor for thrombin - catalyzed activation of protein. C. J. Biol. Chem. 257, 1982, s.859-864.

Brig insh a w, C . F., Shanberge, J. N.: Identification of two distinct heparin cofactors in human plasma. II. Inhibition of thrombin and activated factor X. Thromb . Res. 4, 1974, s. 463-477.

Esmon, Ch. T.: Protein S a P rotein C. Biochemistry, Physiology and Clinical Manifestation of Deficiences. Trend s. Cardiovas c. Med. 2, 1992, Č . 6., s. 214-219.

Cine s, D. B., McCrae, K. R.: The Antiphospholipid-protein syndrome. J. Clin. Immunol. 15, 1995, Č . 6, s. 965- 1005.

Hendriks, D., Scha rpe, S., W ill Sande, M., Lonunaert , M. P. : Characterization of a carboxypeptidase i human seru m distinct from ca rboxypeptidase. N. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 27, 1989, s. 277-285.

129

Ja ffe , E. A. , Armellino, D., Tollefs en, D. M.:

The Subcommittee on Lupus Anticoagulant - Antophospholipid antibody of the Scíentifíc and Standardisatíon Committee of the 18TH: Criteria for the diagnosis lupus anticoagulans: a n update, Thromb. Haemostas. 74, 1995, Č. 4, s. 11 85-11 90.

Biosynthesis of functionally active hepari n cofactor II by a human hepatoma-derived cell line. Bioehem. Biophys. Res. Comm. 132, 1985, s. 368- 374. Kij o wski, R. , Hoppensteadt, D., Wa/enga , J., Borri s, L. , Lassen, M. R., Fareed, J.: Role of

Tol lefs en, D. M. , Blank , M. K.: Detection of

tissue facto I' pathway inhibitor in post surgical deep venous thrombosis (DVT) prophylaxis in patients treated with low molecular weight heparin. Thromb . Res. 74, 1994, s. 53-64.

a new heparin - dependent inhibitor of thrombin in human pla sma . J. Clin.Invest, 68, 1981, s. 589-596. Tollefsen, D. M.: In sight into to mech anism of action of Heparín Cofactor II. Review Article. Thromb. Haemost., 74, 1995, Č. 5, s. 1209-1214.

Kolodziej, S. J. et a/.: Three dimensional structure of the human pla smin {Xz-mac roglobulin complex. J. Stmel. Biol. 123, 1998, s. 124-1 33.

Van Tilburg, N. H., Rosenda al, F. R., Bertina, R. M .: Thrombin activatable fib -

Kraus, M., Noah, M., Fi ckenschei; K.: The PCAT - a simple screening assay for assesing the functionality of the protein C a nticoagulant pathway. Thromb. Res. 79, 1995, s. 217-222.

rinolysis inhibitor and the r isk for deep vein thrombosis. Blood 95, 2000, s. 2855-2859. Wang, W, Boffa, M. B., Bajzar; L., Wa/ke l; J. B., Nesheim, M. E.: A study of the mechanism of inhibition of fibrinolysis by activated thrombin - activable fibrinolysis inhibitor. J. Biol. Chem. 273, 1998, s.27176-27 181.

Lee/m el; K. , Kyr! e, P. A .: Antítrombin III concentrates - a re they clinically useful? Thromb. Haemost. 83, 1995, Č . 3, s. 340-348. Me Clure, D. R., Walls , J. D., Grill/zeli, B. W : Port-translational processing events

Wang, W , Na gis hama, M., Schn eider; M., Mo rse t; J., Nesheim, M.: Elements of the

in the secretion pathway of human protein C, a complex vita min K-dependent antithrombotic factor. J. Biol. Chem. 267, 1992, s. 19710.

primary structure of thrombomodulin re quired for efficient thrombinactivable fib rinolysis. J. Biol. Chem. 275, 2000 , s. 22942-22947.

Sprecher; C. A ., Kisi e/, W , Math ewe s, S., Foste r; D. C: Molecula r c1oning, exp ress-

ion, and partial characterization of a second human tissue -factor-pathway inhibitor. Proc. Natl. Aead. Sei. USA 91, 1994, s. 3353-3357.

3. VYŠETŘOVACÍ METODY HEMOSTÁZY 3.1. Přístroje a techniky používané v hemostáze 3.1.1.

Koagulační

Jednotlivé složky ko agul ačn íh o systému js ou pří to m ny v pl azm ě vě tš i nou ve neaktivních složek - p roen zym ů (zy mogen ů) . Aby mohl prob ěhn out sr ážecí proces je nutné tyto složky aktivovat.

formě

Používají se tyto aktivátory: • nefyziologické: silika, kaolin, celit • fyziologické: tkáň o vé extrakt y nebo č ištěné či rekombin antní aktivova né koagulačn í faktory specifické: zmijí enzymy (jedy). Tyto mají svá omezení. Některé hadí enzymy nejsou závis lé na inhibit orech a aktivuj í nejen proen zymy (zyrnogeny), ale i PIVKA formy těchto koagul ačních faktorů . Hadích jed ů je možné využít i k inaktivaci i n hib i torů proteáz, které by jinak v systému b ěžný ch koagulačních testů mohly interferovat s n ěkterými složkami systému a vykazovat prodloužené hodnoty koagul ačn ích č as ů . Enzymatické cesty (zej ména oblast p ů s oben í seri novýc h proteáz) vyžadují nejen aktivované faktory, ale i aktivova né kofaktory a dále fosfolipidy a vápníko vé ionty. Jedn á se tedy vě tš i no u o velmi komple xní s měs i rel ati vn ě nestabilních protein ů. Takovýto nestabilní systém lze jen obtížně standardizovat.

•

Princ ip: Techniky využívané u koagul ačn ích vy šetření s počív aj í v tom, že se m ěří reakčn í čas od sp uš tě ní reakce až po vy tvoře ní zjistitelného koag ula nebo fib rin ového vlákna. Na měřené č asy se porovnávají s č asy standardní poolové normální kontrol ní plazmy v komerčn ím provedení (ISO 9001 ). Detekc e: • vizuální • optická • elektrická • magnetická

Tan, A. K. a Eaton , D. L.: Activation and characterization of procarbocypeptidase B from human plasma. Biochemistry 34, 1995, s. 5811-5 816.

3.1.2. Zákalové Cnefelometrické, turbidimetrické) Princip: Zákalové metody jsou 130

v las tně

fotooptické metod y. 131

Při měřen í těmito

me-

todami se sleduje mno žství odraženého svě t la na části cíc h kol oidního charakteru. Patří se m: • Nefelometrie: zjišťuje se množství rozptýleného záření na částicích koloidního charakteru ve s měru kolmém na dopadající paprsek (de tektor je umístěn v úhlu 90 s tupň ů) . • Turbidimetrie: zj i šťuje se změna optické hu stot y po PIŮcho du systé mem Detekce: Zji šťuje se optická hustota rozptýleného světla pro cházej ící ho m ěři cí ky vetou a dopadajícího na detektor.

je odlišné od max im a absorbance samo tného pNA (405 nm ). K měření se využívá v ětšinou monochromatického záře ní a ke zjištěn í výsledné hodnoty se pou žije buď kinetické metody nebo metody "end-point" . Změna absobance pNAje přímo úměr­ ná akti vitě enzy mu (Kolde, 2001).

~

c()~ ~

Detekce : spe ktrofo metrické stanovení [ fotocella

I

Enzym Chromogenní substrát - pN A substrát

3.1.3. Spektrofotometrické metody (chromogenní substráty)

---il~~

Oligopeptid produkt

+

p NA barevná substance

AKTIVACE ENZYMU A ODŠTĚPENÍ CHROMOFORU

Synt eti ck é chro mogenní subs tráty se zač aly použí vat k posou zení koagu l ační aktivity některých e n zy mů neb o i n hi bi torů, u kterých: • nebylo mo žně zavést jednoduch é koagulačni testy ( např. stanov ení F X III neb o Cl-inhibitoru ) • byla obtižná standardizace pro jejich sna dné ovlivnění řadou dalších působků ( např. antitrombinem). Metody za lože né na chromogenních subs trá tec h j sou schopné odhalit aktivitu , koagula čniho systém u (e nzy m, inhibitor) bez návazn osti na os tatní slož ky toh oto sys tému, jak je tomu n apř. u koagul ačn í ch metod . To má své vý hody i nev ýh od y, j ak je zm í něn o v ka pitole 3.3.3.2. Testy j sou velmi podobné bě žn ým fotometrickým stanovením en zymu a js ou snadno automatizo vateln é a standardizova telné.

jednotlivych složek

zji šťuj e int en zit a zabarvení (abs orba nce), kterou vykazuje odštěpený peptid po proběhl é prote ol yt ické rek ci. Ko agul ačn í fakt ory j sou vě t­ šinou serinové prote ázy, které štěpí peptidy neb o proteiny zejm én a v m í stě navázání argininu v molekul e proteinu . Me tody využívající ch rom ogenn í syntetické substrá ty pou žívají chromogenni peptid o 2-4 aminokyselinách, kte rý má ve snadno š těpi te l né koncové oblas ti navázanou látku tzv. chromofor, která po o dš těpen í z va zby peptidu po skytn e výr azn é zabarvení, měřitelné při u rčité vln ové délce. Většinou se jedná o p-nitroanilin (p-NA). Aminokyselinová sekvence j e totož ná nebo podo bná s mís tem ú č inku (aktiv ním místem ) enzy mu na přirozený substrát s c hrá ně ný m N-koncem :

Princip: V tomto syst ému se

Chr áněuý 1\_

kone c spccilické}lO su bst r átu

+ Místo štěpení specifickým enzymem

Z-Gly-Pro-Ar g-p-NA

štěpen

~

Chromogenní peptid je na oligo pe ptid a p-nitro anilin , kter ý je možné stanovit fofotocella tometrick y na spe ktrofoto metru. Maximum ab. . . _ _- J . so rba nce peptidu s navázaným pN a (38 0 nm ) '--- - - - - - - - - - ---'

N ě kdy se místo chro mogenních s u bs trátů pou žívaj í fluorogenni substráty. Detekce se pro vád í na j iném typu zaříze n í (spektrofluoro metry). Nej č astěj i pou ží-

132

133

c()8

(r- -

)

vanou fluorogenní skupinou je 7-amino-4-methylcoum arin (AMC), který vykazuje maximální fluorescenci při 440 nm. Spek trofluorometrická měření s fluroge nními substráty jsou obecně považována za přesnější než spektrofotometrická měření s chromogenními substráty. Tyto metody se hlavně využívají k měřen í e nzymů s nízkou koag ulační aktivitou . Dů ležitým údajem je specifita nebo-Ii selektivita enzymatického systém u, kterou je nezbytné znát zejména tam, kde je stanovení prováděno v plazmě, která mimo cílový enzym obsahuje i řadu dalších proteáz. Při zjištění tohoto údaje se měří reakč ní rychlost cílového enzymu proti reakč ním rychlostem kontaminujících enzymů.

3.1.4. Imunochemické metody 3.1.4.1. ELISA (enzwnimunoana!Ýza) V hemostáze se hl avn ě využívá se n dv ičové techniky. ELISA testy detekuj í antigeny v konce ntraci menší než I ng/ml. Zj i š ťuj e se pou ze množství dané látky, ne její fu n kč nos t. Princip : ke stanove ní antigenu se využívá protilátky zna- I ./ čené enzy me m (většinou peroxidázou). Př i tzv. "se ndv ičové metodě" se na pevnou část , kterou repreze ntuje s tě na mikrotitrační d estič ky neznámé, či známé (kalibrace) připojí urč i té množství anti----+ genu. Po promytí systému se z druhé strany naváže proti- l . -!

r--

labstrit

.

Produ t

látka značená enzymem (tzv. konjugát). Po promytí se enzym a nepřímo i antigen prokáží přidáním specifického chromogenního substrátu, který je enzy mem štěpen - vzniká barevný produkt. Intenzita zbarvení je přím o ú měrná koncent raci antigenu. Detekce: spektrofoto metrické stanovení barevného produktu. Jde o metody, při kterých se využívá reakce antigenu s protilátko u. Vznikající komplex se bu ď zvidite lní vhodným způsobem nebo fung uje jako n os ič pro navázání substance, ktero u se daná látka detekuje.

3.1.4.2. EID (elektroimunodi fuze ) Princip: zj iš ťovaný antigen, se pohybuje ve s tej nos mě rném elektrickém poli a reaguje s protilátkou přítomn ou v gelu za vznik u preci p itač ní ho píku (ra ketky) . Délka píku je přímo úměrná koncentraci "-134

-'

antige nu. Laurellova elektrofo réza a Ouchterlonyho elektroi munodifuze jsou používány pro velmi speciá lní aplikace. Detekce: elektroforéza

3.1.4.3. LIA (světelná nebo laserová imunoanalýza) (LIA - Liquid Immuno Assay )

CO

Princip: Na latexové částice se váže pO- I Iyklonální protilátka a v přítomnosti antigenu dochází k zeslabení průc hodu svě te l né ho nebo laserovéh o svazku L(sníže ní absorbance).

@M

Y

Antigen

Detekce: zeslabení tou.

světe l ného

La texová

_

částice s navázan ou protilátkou

nebo laserov ého paprsku po

průchodu měřící

kyve-

3.1.4.4. RIA (radioimunoanalýza) Princip : RIA metoda je obec ně určen a k měře­ ní koncentrace rozpustných ant ige n ů, h apte n ů nebo protilátek. U této metody se používá protilátky značené radionuklidem. Dochází k vzáje mné sou těživosti (kompetici) mezi z načeno u a neznače nou protilátko u, která vytváří komplex s určitým antigenem. Z kalibrační křivky zhotovené se známou hodnotou značené protilátky se po odeč tení na gama čítači vy počte výsledná hodnota. Detek ce: čítač gama záření.

3.1.4.5. Latex -

aglutinačn í

>--6l >--6l >>--6l

>>- >--6l ~

>-

>--6l ~ >>--6l

>- ~ n ezna ě en á

~

protilátka

~

La tex -

~

značená prot

ilátka

~~ agl u ti nač n í

test

testy

Princip: Na latexové částice jsou nespecificky I navázány protilátky proti hledané substanci ( např. protil átka proti fibrinoge nu). V pufrovaném prostřed í dochází k vyvazování vhodn é _ substance (antigenu) na latexové části ce s protilátkou, částice se spoj ují, nastává jejich shlukování - aglutinace. Detekce: Aglutinaci hodnotí subjekt, buď v i zuál ně na tmavé podložce nebo ve zkumavce, příp adn ě pod mikroskopem . 135

3.1.4.6.

Hemaglutinační

testy

3.2. Typy

Princip: krvinky ( n ej č astěj i se používá červený ch krvinek) mají na svém povrchu navázány receptor y nebo protilátky proti řadě induktorů. V pl azm ě přítomn ý induktor (antigen) se naváže na pří slu šné receptory nebo protilátky a dochá zí ke shlukování (aglutinaci) krvinek. Detekce: Aglutinaci hodnotí subjekt, buď vizuálně na tmavé podložce nebo ve zkumavce , případn ě pod mikro skopem. Gelifikační

Princip: detekce tvorb y prvého fibrinového vlákna v koagulačním médiu pomocí pohybu háčku v temperované vodní lázni Detekce: měření koagulačního času od okam žiku přidání startovací reagencie až do vytvoření fibrinového vlákna

Průtoková

cytometrie

Pr ůtokov á

cytometrie je využívána zejména ke stanovení receptorů nebo ostatna povrchu buněk, dále ke stanovení aktivačních produktů jako jsou destičkové vesikuly. Metody p růtoko vé cytometrie umo žňují rozlišit aktivované a neaktivo vané buňky a využívají se hl avn ě v hematoonkologii. Detekce: Speciální stanovení pomocí prů tokovéh o cytometru , využívající zn ač e­ ných monoklonálních protilátek ních

Tento

zp ů sob

vy šetie ni se v dnešní době prakt icky nepou živ á

testy

Princip: Snadno polymeruj ící složky ( n apř. monomery fibrinu) v přítomn o sti někte­ rých látek (protamin sulfát, etanol) výrazněji polymerují, příp adně tvoří komplexy. Detekce: Gel hodnotí subjekt - v plazm ě se objevuj í v l oč ky, č i vlákna fibrinu nebo se vytváří viditelný gel.

3.1.6.

stanovení

3.2.1. Manuální

o 3.1.5.

koagulačních

3.2.2.

Přístroje

(koagulometry)

3.2.2.1. Optické Princip: monochrom atické s věte l né záření prochází kyvetou , která na fotobuňku propouští nebo odráží jen určité množství zářen í. Optická hustota dopadajícího záření obráží vlastnosti média v aktuálním stavu koagulačního děje . Využívá se metod : • Turbidimetrie • Nefelometrie

antigenů

3.1.7. peR (polymerázová

řetězová

reakce)

peR je používána k identifikaci mutací některých složek hemostatického procesu, jako jsou: FV Leiden, protrombin 20210, polymorfismy faktorů XII a XIII a další.

Detekce: měří se snížení optické hustoty, buď po vy tvoře n í fibrin o vé struktury (stro- ~ norm álnl p rů b ě h mečková struktura), nebo po vytvoření ko-elij agula . K vý p oč tu nastavení optimální ab- ~ sorbance a jej í hodnoty při ukončení < m ěření se pou žívá rů zn ých algoritmů. Konečný bod měření (end-point) je počítán ze změny absorbance a odrazu světelného paprsku nebo se využívá jen předdefinované z m ě ny absobance (30 mA nad základní Koagulační č as ----l linii optick é hustoty ), č i se vychází z deri- L Normální a abnormální koagulace vace kři vky absorbance s věte l n é hustoty. Koagulometry vyu žívající derivace detekují velmi č as n é ko agulační zm ěn y a poskytují re l ativ n ě krátké č asy sráže ní. Vět šin a těchto optických metod je záv islá na koncentrac i fibrinogenu v plazm ě , ke které je nutné p ři měření přihlížet.

o

Optické koagulometry moh ou mít problémy se stanovením hemolytickych, lipemickych. nebo ikterických vzork ů.

3.2.2.2. Elektromechanické Elektromechanické 136

pří stroje

se

ro zděluj í

do dvou hlavních skupin:

137

Háčkové

Princip: do m ě ř í c í kyvety j sou vloženy dvě elektrody. Levá je poh ybli vá, pravá pe vná. Na elektrody je napojen elektrický proud. Jakmile dojde k v ytvoře­ ní prvního fibrinového vlákna , prob ěhne elektrický impul s mezi elektrodami a zastaví se ukazatel čas u .

3.3. Testy používané v hemostáze: • • •

globální - popisují celý sr ážecí proces sku pinové - popisují určitou část koagul ačního děj e specifické - stanovuje se jeden z koagulačních či ni telů

3.3.1. G lob á I II í testy Koaguolometr podle Schnitgera a Grosse - schéma

Detekce: proběhnutí elektrického signálu mezi elektrodami.

Doba srážlivosti nativní krve (LEE - WHITE) Meto du zavedli v roce 1913 Lee a White (Lee a White, 1913). Doba srážlivosti se dnes j iž neužívá, j de o obsoletni vyšetření, které se nah razuj e většino u skup inovými koagula čn ím i testy. Princip: Urč ení čas u srážení nativní žilní krve. M ěřil se po sražení krve za standardních podmínek. Fyziologické hodnoty:

Koagulometr Schnitger and Gross

skleněná

č as

od okamžiku odb ěru až

zkumavka (d = I cm): 4-9 minut (t

= 37 °C)

o

Kuličko vé

kyv eta

Princip: kovová kulička se pohybuje v magnetickém poli ( b u ď krouží nebo se kýve). Vlivem z mě ny viskozity pros tře dí , po s p uštění ko agul ačn ího procesu, dojde ke zpomalení pohybu ku ličky a k j ej ímu vychýlení z d ří věj š íh o

Krev se srazí a p iem ěni na rosolovitou hmotu - krevní koagulum. To obsahuje agregáty destiček, nerozpustný fi brin a ostatní krevní bunky (erytrocyty, leuk ocyty) zachycené ve vláknech fibrinov ě sítě. O V plastových a silikonovanych zkumavkách jsou srážecí časy delší. Pohybují se zhruba na dvojn ásobku až trojnásobku častl získaných ve skleněných zkumavkách.

s měru .

Detekce: změ na magnetického pole po vychýlení kuli čky. Tato změna je pak převeden a na elektri ck ý impuls, který za- r - Systém - - -Amelung ----, staví ukazatel č as u . O

Někte r ě

typy elektromechanických piistroj ů mohou mít určité problémy se stanovením lipemických vzork ů . Lipemický vzorek m ů že snížit viskozitu koagula. Princip AMAC 200 a 400

Doba krvácení (Doba krvácivosti, krvác ivost) Princip: U rčení času , při kterém dojde k z ás tavě krvácení p ři standardním vpichu Duke (Duke, 19/0), řezu : speciální lanceta - Soulier (Soulier a spol., 1952) nebo speciální řezn é zaříze n í - Ivy (lvy a spol. , 1935). Pro objektivní posou zení se provádí vyšetře n í na dvou nezá vislých místech v následných nebo so učas nýc h časo ­ vých intervalech. Fyziologické hodnoty: Duke Soulier Ivy

o

Amelung KC 4

COMPA CT

138

2- 5 minut 2-4,5 minuty 3-8 minut

Doba krvácení j e rychlá o rien tační metoda, která nám poskytne první info rmaci o funkci krevních destiček. Je d ůle žit á zejména tam, kde se podávají destičko­ vé koncentráty - informuje o ptijeti fun kčních destiček piijemcem a o p n/ kazu trombopatie.

AMAC 400

139

Test konzumpce

(spotřeby)

pro středí ,

p rotrom bin u

Princip: Stanov uje se mn ožstv í prot rombinu v sé ru za určitou dobu po vys rážení krve za standa rdníc h podmínek . Vy š etření n epřím o ukazuje na aktivitu složek participuj ících se na v ni třn í cestě aktivace přeměny prot rombinu na trombin. Fy ziologické hodnoty: nad 30-45 sekund

o

Pii srážení no rmální krve se pie vd žn áčást pro trombinu měn í na trombin. Zbytek protro tnbin u (10-20 %) zů s tává v séru. PN p oru chách, u kterýc h vázne tvorba koag u la čn ě aktivního komplexu - protromb ituizy. zů stan e zn a čn á čás t p rotrombinu nespotiebov ána a z ů st ává v séru (hemofilie a trombocytopenie). O Test se dnes již p rakticky nepou živ á Retrakce krevníh o koagula

Princip: po odb ěru nativní krv e dochází nejprve k tvorbě kre vní zátky, pozd ěji k retrak ci (s m rš těn í) krevního koagul a, při kterém se projevuje funkčno st kontraktilního sys tému kre vních destiček. Dochází k vypuzení přebytečné tekutiny, jejíž objem se z měří. Fyziologick é hodnoty: objem vytlače né tekutiny zaujímá 30-50 % objemu odebrané krve.

O Retrakce se vy šetiu je buď v kr vi nebo v plazm ě bohaté na krevní destičky - PRP

kre slí zaříze n í jednolitou č áru (paprsek se setkává v jednom m í stě ) zvýšení viskozity má za následek rozdělen í paprsků z obo u vý kyv ů a kresbu kři vky (Ma l/ett a Cox, 1992).

Parametry T E G k řivky • r - startovací čas (čas, který ub ěhne od přidán í vápník u po první zná mky for ma ce krevní sraženiny • k - kinetika fo rmace trombu • lila - maxim ální amplituda (zjišťuj e pevnost a stabilitu kre vní sraženiny)

Fy ziologické hodnoty: norm ální kři vka. Pom ocí thromboelastografu lze promě­ řo v at nesrážli vou krev, desti čkami bohatou a na d esti čky chudou pla zmu. Thromboelastograf zachycuj e kv alitativní a kvantitativní údaje, které charakterizují tvorbu krevní sraženiny, její fyzikální pevnost a stabilitu a schopnost její retrakce (Spi ess a spo l., 1987). Thromboelastograf velmi dobře popisuje stavy a některé defekt y koagulačního systému (hypo- a hyperkoagul ace, trombocytopenie, výrazná fibrinol ýza aj .). Příklady

2-hyperkoa gulační,

Fib r inolýza p lné k r ve Thromboelastografi ck é

vyš etření

TEG

kři vek

(I-normální, 3-trombocytopenická, 4-hemolilick á, S-fibrinolytická)

(Platelet Rich Plasma ). (T hro mboe lastograf - TEG)

Thromboelastograf byl vyvinut • a po užit Hartertem již v roce 1948 (Ha rt ert, 1948). V posledn í dob ě došlo k renesanci a novému g " plst 1S;:;: ě? rozvoji této techniky, zej ména v aplikaci na po číta čové zpraco- _.~m. vání. Nejnov ěj šim zástup cem těchto p iistroj ů je rotační thromboelastogra f ROTEG. L-

Princip: po o dběru nativní kr ve dochází nejprve k jejímu sraže ní po zději k retrakc i kr evního koagul a. Nakonec doch ází k proj evům fibri noly tic ké ak tivity a k rozpo uš tě n í krevní zátk y. Fy ziologické hodnoty: fibrino lýza probíhá za fy zio log ických podmínek až po více než 4 hod inách . Di agn ostick ý výz nam má zkrác ení č as u nástupu fibrinol ýzy, ze jména pod hodnoty 30 minut.

r to"nl""

1-

M

E ug lobulinová lýza

Princip: ve speciálním přístroji - thromboelastografu dochází ke srážení krve nebo plasmy vyvol an é přid áním iontú Ca 2+. Pomocí mechanického detekčního systému se měří změna ela sticity během formace krevní sraženiny, tvořené me zi pístem a s tě nou kyvety. Pří stroj má výkyvné zrca dlo, které odráží sv ětelný papr sek vysílaný s vě te l ným zdrojem. Zrcadélko je u m ístě no na poh ybli vém pístu uloženém ve válečku. Neprojevuje-li se visko zita

Euglobulinová lýza patří mezi globální testy fibrinolytického sy stému. Uk azuj e na lyti ckou schopnost euglobulinové frakce (Collen, 1999). Princip: Speciálním postup em získaná bílkovinná frakce ob sahující hlavně plazminogen se sráží ionty Ca 2+. S amovolně se aktivuj e fibrinolytický proces, generuje se plazmin a dochází k po zvolnému rozpouštění (I ýze) bílkovinné frakce. Detekce: Mírou fibrin olytic ké aktivity je doba, která uplyne od ok amžiku rekalcifikace plazmy do ok am žiku , kdy j e veškerá bílko vinn á frak ce rozpu štěna . Fyziologické hodnoty: více než 180 minut.

140

141

Princip thromboelastografu

---.J

o

3.3.2. S k II pin O V é testy SCHÉMA AKTIVACE PLAZMATICKÝCH KOAGULAČNÍCHFAKTORŮ

~!FJJJ.i

~fřJj

Kombinované tromboplastiny - obsahují: tkáňový tromboplastin ( n a př. z hově­ zího mozku ředěný ve fibrinogenové fra kci (bohaté nebo chudé na F V), obvykle obsahují absorbovanou hovězí plazmu a ionty Ca 2+. Tyto preparáty se větši­ nou využívaj í při antikoagul ační terapii. O WHO doporu čuje používání trotnboplastinů, j ejichž ISI se blíží I . Tyto trontb oplastiny mají většinou stejn é charakteristiky. i kdy ž se nestanovuje INR. O Mnoho reagencii ke stanovení tromboplastinov ěho času obsahuje činidlo neutrali zující heparin - polybren (kvarterní polymerovany amin). Výsledek PT neni pak odvislý na koncentraci heparinu. Abnormální hodnoty PT se nachází: • U vrozených nebo získaných nedostatečností faktorů II, V, VII , X a fibrinogenu • Při or áln í an tikoagul ač ní léčbě • Při nedostatku vitaminu K • U jaterních nemocí (z pokl esu faktorů protrombinového komplexu) • Jsou-Ii přítomny autoprotilátky proti faktorům a lupus antikoagulans APT T (APTT - Ak tivovaný parc iální trornbo plastinov ý test)

A PTT zave dl do klini cké praxe Proctor a Rapaport (Procto r a Rap aport, 1961 ). Tromboplastinový test (Protro mbinový test - PT,

Quicků v

test )

Test zave dl v roce Armand Quick (Quick, 1935 ). Sledovaný systém: vněj ší cesta aktivace přeměny pro trombinu na trombin (vi z schéma část B). Zachycuje tyto složky koagulačního systému: faktory II, V, VII , X a fibrinogen. R eakční sm ěs: vyšetřovaná pla sm a Startovací reagencie: kalciový tromboplastin (ka lcium) Hodnoty kontrolni pla smy: 12- I5 sekund Fyziologické hodnoty: Hodn ota kontrolní plasm y ± 20 %

Reagencie: O Rekombinantni PT reagencie - obsahují: rekombinantní tkáňový faktor, ionty Ca 2+, fosfolipidy, pufr a stabilizátory. O Tkáiíové tromboplastiny - obsahují: relativně m álo č iš těný extrakt z tkání bohatý na tkáňov ý faktor (větši n o u z krá ličího mozku nebo lid ské pl acenty) a ionty C a2+. 142

Armand Quick

Sledovaný systém: vnitřní ce sta aktivace přeměny protrombinu na trombin (viz schéma č ás t A). Zachycuje tyto slo žky koagulačního systému: faktory II, V, VIII, IX, X, XI, XII , fibrinogen, prekalikrein a HMWK. R eakční směs: vyšetřovaná plasma, fosfolipid, aktivátor Startovací reagencie: chlorid vápenatý Hodnoty kontrolní plasmy: 28-42 sekund podle použitého systému (povrchový aktivátor + fosfolipid) napi: • kefalin + kaolin: 36-42 sekund • kefalin + silica: 30-36 sekund • platelin: 28-34 sekund Fy ziologické hodnoty: Hodnota kontrolní plasm y ± 10 %

Reagencie: •

Kontaktní aktivátory - zahrnují: negativně nabité povrchy, jako j sou kaolin, křemičitan y, elagová kyselina, polyfenoly nebo sulfatidy ( n eg ativně nabité sulfátované lipidy) kombinovan é s kaolinem.

143

'-----

Rapaport

•

•

Fosf olip idy - zahrnují: syntetické fosfolipidy, fosfolipidy izol ované ze zvířecích tká ní (nap ř. králičí mozek) nebo fosfo lipidy z rostlin ( n apř. soja). Obvykle se používají s mě s i r ůzn ých fosfol ipidů, které maj í optimál ní slože ní a zasto upe ní hl avně fosfa tidy lseri nu. Typ a ko ncen trace fos fol ip idů je pro provedení testu dů le­ ži tější, než n egati vn ě nabité povrchy. Reagenčn í profil však určuj e spíše ko mbinace obo u slože k spo leč ně s iontovo u silou pufro vacího systému a stabilizátory. Ca 2+ - d ůle ž itou úlohu může hrát i molarit a roztoku chl oridu vápenatého .

(T ro mbin Clo ting Ti me - TCT)

Trombinov y test použil v 1: 1957 Jim (Jim, 1957). Tro mbinový tes t je jednodu ch ý sc reeningový test ke stanovení pol ym erace fibrinu. Slou ží i jako kvalitativní test ke stanovení heparinu v pl a změ . Test detekuje kon centraci fib rinogenu v pl azmě a poruchu j eh o molekuly, příp adn ě i p řítomno st antitro mbinu.

Komerčně

• • •

j sou vyráb ěny reagencie se zvýšenou citlivostí k: Faktorům Lup us antikog ulans (LA) Hep ari n u

Trombinový test (TT)

Odlišení mez i nedostatečností

faktorů

a inhibitory nebo LA

Je-Ii zvýšená hodn ota APIT tes tu provede se s měs ný test s normáln í plas mo u ( I: I). Dojde- Ii k normalizaci čas u jedná se nejspíše o n ed o statečn o st n ě kterého z fak torů (snížená koncentrace neb o změn a v molekule faktoru). Je-li čas APTT i po s měs né m testu abnormá lní mů že jít o přítomn o st inhibitorů proti některé mu z fakto rů v n i třní cesty ak tivace p řem ěn y protrombinu na trom bin neb o o příto mn o st protilátek typu lupus antikoagulans.

Abnormální hodnoty TT: O Prodlouž ené časy: • V p řítom no s ti heparinu , doj de k rychlé ne utra lizaci

Abnor mál ní hodnoty APTT: O Zkrácen é časy : •

O

S ledovaný systém: přem ěn a fibrinogenu na fibrin a následná tvorb a fibri nové zá tky (viz sc héma část C) Reakčn í směs: vyšetřovaná plasma Startovací reagencie: roztok trombinu Hodnoty kontro lní plasmy: 14-1 6 se kund (hodnota je odvislá od koncentrace trombinu ) Fyz iologické hodnoty: Hodnota kontrolní ' - - - - - - - - - - - - - - - - - - ' plasm y ± 20 %

trombotické stavy

Prodlo užen ě časy :

• • • •

vrozené nebo získané nedostatečnosti F VIII (mohou být i při deficienci vWF) nedo statečnost faktorů IX, XI, příp adně i dalších , vyj ma faktory VII a XIII terap ie nefrakcionovaným heparinem , hirud inem a aprotininem dysfib rinogenem ie neb o afibrinogenemie

•

•

přidaného trombin u antitrombinem a výraz ně se pro dlouží koagulační čas. Vliv heparinu je mo žné vyvázat protamin sulfátem nebo roztok em toluidinové modii či polybrenem. Prodl ou žen é časy se také nach ází v přítomn o st i rel ati vn ě vys okých k oncentrací degradačníchproduktů fibrinogenu/fibrinu sledovaných při tromboIytické l éčb ě , u DIC neb o u jaterních nem ocí, případn ě u dysfibrinogen emie. Paraproteiny na př. u nemocn ých s myelomem moh ou také int erfero vat s tvorbou fib rinu a vés t k prodl ou žen í čas u TT.

O Čas APlT m ů že být mírn ě prodloužen i v piipadech, kdy je nemocny léčen ku-

mar inovymi preparáty či nizkomolekul árnimi hepariny. O APTT lIu/že být také využit ke sledování dysfu nkce systému proteinu C. Pou žívá se zde hadího j edu PROTA C, který je aktivátorem proteinu C. V testu se vyu žívá dvou systému bez a s p ťidánim PROTA Cu. Dostáváme tak dva rozdíln é systémy a rji šťujeme poměr obou čas ů . Je-li systém proteinu C funkční, dostáváme výram ě p rodloužení času APTT v p iipadě, že je použit PROTA C. Citlivost tohoto uspoidddni je velmi vysoká je -li piitomen Faktor V Leiden nebo pii dysf unkci p roteinu C (Be rtina, 1999). Pro změny v molekule prote inu S a osta tní trombofil ni mutac e j e citlivost snížena.

O Or álni an tikoagulancia nemaji vliv na hodnoty TY. O Trombinovy test n eni vho dny k monitorov áni hladiny h eparinu pii

léčbě nefrakcionovan ytn heparinem a to pro jeho malou specifičnost, závislost testu na systému piem ěny fibrinogenu na fibrin a pro velkou citlivost testu k heparinu (nepatrtui koncentrace nefrakciono van ěho heparin u vyvo lá velké prodloužení času TT).

Reptilázový test (Re ptilase tim e, Bat roxobin tim e)

Reptilázový test do klinické praxe zavedl Funk v roce 1971 (Fu nk a spol. , 1971).

144

145

Batroxob in neboli reptil áza je trombinu podobná proteáza získaná z hadíh o jedu , kter á je schopna přem ěnit fibrinogen na fibrin. Na roz díl od trombinu reptiláza o d š tě p uje z molekul y fibrinogenu jen fibrinopeptid A a nem á aktivitu k dalším trombinovým s u bs trátů m, jako jsou faktory V a VIII. Reptiláza není ov livně na antit rombinem, nefrakcionovaným heparinem a LMWH. Proto tento test mů že být pro v áděn i v přítomno sti těchto látek.

Sledovaný systém: přeměna fibrinogenu na fibrin. Výsledkem polymerace je des-A-fibrinová formace fibrino vého vlákna. Rea kčn í směs : vyše třo v aná plasm a Startovací reagencie: roztok jedu hada Bothrops atrox (reptiláza) Hodnoty kontrolní pla smy: 16-20 sek. Fyziologické hodnoty: Hodnota kontrolní pla sm y ± 20 %. Výsledek testu není ovlivněn l éčbou hep arinem.

3.3.3. S pec if i c k é Většin a

látek, které hrají pod statnou úlohu v diagnostice hem ostatických proc ez uveden ých metod. Sledují se vě tš i nou: O funkční charakteristiky dan ě látky: koagulačními met odami a spektro fotometrickými metod ami využívajícími chromogenních substr át ů, O množstvi látky (stanovení klotabilní bílkoviny nebo přít omnosti antigenu) kvantitativní stanovení: ELISA, LlA sů

Abnor m á ln í hodnoty reptilázového testu:

O

Prodlou žen ě časy:

• •

U

afibrinogeněmie

Při

ACT je výrazně o vlivněn nefrakcionovanym heparinem (pro dloužený čas je kon centraci heparinu). Test dále ovliviiuji tyto faktory: nevyvážen ost koag u lač níc h faktorů a inh ib itorů , lýza desti ček, zvýš ená hemodiluce, hyp otermi e nemocných a jiné. Test je závi slý hlavně na kontaktní fázi a získané čas y mohou mít značn ý rozptyl. Výhody tohoto testu jsou v jeho jednoduchém provedení a v pou žití přímo na klini ckém pra covi šti. ACT je využitelný jen pro nefrakcionovaný heparin. Citlivost k LMWH a hirudinu je velmi nízká a proto test nelze pou žít ke sledování hladiny tě chto substancí. úměrný

a v přítomn ost i tě žký ch nedostatečno stí fibrin ogenu hyperfibrinolyze (zvýšené hladiny FDP)

Aktivova ný koagula ční čas (Activated Cl otin g I ime - ACT)

Fibrinog en se chová v rámci koagul ačn ího a fibrinol ytického sys tém u j ako substrát. Metod y, které se z aměřuj í na stanovení fibrinogenu sleduj í buď schopnost jeho přeměny na fibrin nebo sledují pouze jeho množství ( pří tom n ost molekuly fibrinogenu ).

Metoda byla zavedena Hattersleyem v I: 1966 (Hattersley, 1966)

146

vyšetřuj e n ěkterou

3.3.3.1. Metod y ke stanovení fibrinogenll

•

Aktivovaný koagula ěni čas je metod a podobná svý m principem APTT. V testu se využívá kontaktních látek, j ako jsou silica, celite nebo kaolin, ale bez přidání fosfol ipid ů a ion tú Ca 2+. Kontaktní aktivátor y jsou umístěny ve speciá lních "cartriges", které se používají k měřen í hodn ot testu ve zv lášť k tomuto ú č elu u způ s oben ý ch pří­ strojích. Po přid ání vzorku do "cartriges" se iniciuje srážecí proc es a tvorba fibrinu je m ěřena elektro mechanický mi nebo opti ckými pří stroj i. Sledovaný systém: přeměna fibrinogenu na fibrin Reakční sm ěs: vy šetřovan á plasma + aktivátory Startovací reagencie: plazma

se

•

•

Metoda podle Clause. Fibrinogen se v této metodě stanovuj e jako množství .Jclotabilní bílkoviny". Jde o koagulačn í stanovení ře dě né plazmy v nadbytku trombinu. Stanovení ovlivňují j ak faktory, které působ í na aktivní místo trombinu, tak i faktory mající vliv na polymerizaci fibrinu . Při pou žití vysokých kon centrací trombinu a při nízké koncentraci fibrinogenu (zhruba 10krát méně , než je fyzi ologická konce ntrac e fibrinogenu v pl azmě) je gelačn í čas úměrný koncentraci fibrinogenu a nezávislý na mn ožství trombinu. Kinetické měření. Některé optické ko agul ometry, využívající nefelometr ickou nebo turb idimetrickou .end-p oínt" detekci odvozuj í koncentraci fibrin ogenu v plazm ě z kinetického m ěieni účinnostiprotrombinověho komplexu. Celkov é zvýšení turbidity systému je u těchto metod p římo úměrné koncentraci fibrinogenu jako klot abilní bílkoviny. Metoda velmi dobře koreluje s Clausovou metodou. Kinetická turbidimetrie. Met oda kinetické turbidimetrie využívá had ího jedu (Batrox obin - reptil áza). Batroxobin ajemu podobné zmij í enz ym y nejsou inhibovány anti trombinem, neakti vují desti čky a n ěkteré faktory ( např. V, VIII, XI, 147

•

XIII) . Metoda má vhodný měřící rozsah, velmi dobrou přesnost a může být snadno prováděna v automatických měřících systémech. Imunochemické metody. Imunochemickě metody nejsou schopny odlišit mezi funkčním fibrinogenem a inaktivní nebo pozměněnou formou fibrinogenové molekuly. Tyto metody poskytují většinou vyšší hodnoty, než funkční testy. ELISA testy ke stanovení fibrinogenu nenalezly v rutinní praxi významné uplatnění.

Fyziologické hodnoty: 2-4 g/l . Hodnoty se mírně zvyšují s přibývajícím věkem. Klinické použití: fyziologicky se zvýšené hladiny fibrinogenu nachází v průběhu těhotenství. Zvýšené hodnoty bývají u kuřáků, značně vyšší hodnoty (> 10 gll) jsou u těžkých zánětů a trombóz. U některých arteriálních nemocí (např. 1M) koresponduje zvýšená hladina fibrinogenu se zvýšenou viskozitou plazmy. Některé léky, náhle přerušení kouření a fyzická aktivita mohou snížit hladinu fibrinogenu v plazmě. Pokud koncentrace fibrinogenu < než 0,5 g/l dochází většinou ke krvácivým projevům. Také dysfibrinogen ěmie, která je dnes poměrně častá se může manifestovat krvácivými projevy.

o

Heparin podstatně neovlivňuje výsledek testu většinou interferuji s testem a mohou vést k falešně nízkým hodnotámfibrinogenu.

O FDP

3.3.3.2.

Funkční

aktivita složek koagulačního a Fibrinolvtického systému

Ke stanovení funkční aktivity složek koagulačního a fibrinolytického systému byla vyvinuta celá řada metod, které využívají chromogenních substrátů, ale nejčastěji se využívá jednofázové koagulační metody na principu APTT nebo PT. Tyto metody lépe obráží funkčnost celého koagulačního systému (Tripodi a Manucci, 1996). Jednofázové koagulační metody Využívají se zejména ke stanovení aktivity systému.

faktorů

plazmatického

Reakční směs: vyšetřovaná

plasma ředěná deficitní plazmou (pro testovaný faktor) v poměru I :10. Starto vací reagencie: podle použitého systému (většinou ionty Ca 2+). Hodnoty kontrolní plasmy: odlišné pro různé faktory Fyziologické hodnoty: odlišné pro různé faktory Deficitní plazma: neobsahuje vyšetřovaný faktor (faktor není zjistitelný použitou metodou) - ostatní faktory v této plazmě jsou v přebytku. většinou

Metody s chromogenními substráty Metody využívající chromogenní substráty se používají hlavně ke 'Zjištění funkčnosti serinovycb protedz: Tyto metody mají některé přednosti, ale i nedostatky v porovnání s koagulačními metodami: Přednosti: poměrně snadné, jednoduché a přesné stanovení. Ke stanovení je možné použít větší ředění vzorku, které eliminuje některé problémy, zejména interferenci některých látek při koagulačních stanoveních (Lupus antikoagulans, FDP, nespecifický heparin). Nevýhody: zjišťuje se schopnost katalytického místa serinové proteázy proteolyticky štěpit předem definovaný substrát na produkt. Štěpení probíhá v místě navázaného argininu na koncový chromofor. Metoda neřeší problematiku strukturálního uspořádání koagulačně aktivních komplexů. Z těchto důvodů se mohou v některých případech získat odlišné hodnoty od výsledků získaných koagulačními metodami (např. vyšší hodnoty v případě stanovení PIVKA faktorů) KOAGULAČNÍ METODA A METODA CHROMOGENNÍCH SUBSTRÁTŮ

koagulačního

V

Sledovaný systém: zjištění hladiny jednotVv~tfu'laná adIlU&i •Ufa livého faktoru ve vnitřní nebo vnější cestě aktivace přeměny pro trombinu na trombin v modifikaci PT nebo APIT testu. Těmito cestami se zjišťují : • Faktory vnější cesty aktivace plazmatického systému - F II, V, VII, X • Faktory vnitřní cesty aktivace plazmatického systému - F VIII, IX, XI, '--- - -- - - - - - - - - - - - ' XII, prekalikrein a HMWK

~

148

I

149

3.3.3.3. Odlišení nedostatku (aktont od

Ke stanovení se používají metody: • Přím é detekc e • Nepřímé detekce Využívá se větš i nou dvou až tří stupňové metody. Metody přímé detekce Složka, která se stanovuj e se aktivuje a aktivovaná forma chromogenní substrát na produkt a chromofor •

Jednostupňová

•

Faktor VlIl a

přímo štěp í p ří slu šný

bitorů:

Trombin

VIII ----------i.~

FX

fF IXa + F VlIla + Pl + Ca2+]

•

F VIIIa

chromogenní substrát - pNA J1~ peptid pNA Metody nepřímé detekce Složka, která se stanovuje se váže do komplexu s jin ou aktivní složkou. Nevyváza ná čás t aktiv ní složky š těpí substrát na produkt. AT

AT + UFH + trombin ~. [AT . UFH . trombin] v přebytku vyvázaný trombin nevyvázaný

•

chromogenní substrát - pNA J1~ peptid pNA 150

• •

inhibitor I typu - vykazuje lineární inhibiční kinetiku inhibitor II typu - nelineární typ inhibiční kinetik y

F Xa

t

o

faktorů m ů že

Stanovení titru inhibitoru Titr inhibitorů se dá určit speciá lními koag u lačn í mi testy jako jsou .Bethesda", " Nijmegen " nebo "Oxford" metody . V tomto testu je norm ální plazma (nebo kon centrát plazmy) inkubován s různý m i ře dě n í m i vzorku nebo normální kontrol y. Inhib itory inaktivují vyše třovaný faktor v normální plazm ě (nebo koncentrátu). Po 2 hodinové inkubaci při 37 "C se vy po č te titr inhibitoru. Titr o h odnotě 1,0 je definován jako 50 % inhibice cílového faktoru v normální p lazmě . Existují 2 typy inhi -

metoda F

být zp ů soben vrozeným nebo získan ým ned ostatkem. (autoprotilátek) je jedním z případ ů získaného nedostatku . K odlišení, zda jde o přítomnost inhibitorů nebo nedostatku faktorů lze využít třech ředění vy šetřo vané plazmy s norm ální plazmou . Optimalizace testu se do sáhne inkubací plazem při 37 "C. U vzorku s nedostatkem faktorů se bude hodnota postupně se vzrůstajícím zastoupením normální plazmy, blížit hodnotě normální plazmy, kdežto v přítomnosti inhibitoru se hodnota nebude výrazněj i m ěnit. Nedo statek

RVV

Dvoustupňová

inhibitont

Přítomnost inhibitorů

metoda

Faktor Xa

přítomnosti

Literatura Bertina. R.: Molecula r risk factors for thrombosis. Thromb. Haemost. 82, 1999, s. 60 1- 609.

Blutgerinnungsstudien mit der Thrombelastographie einem neuen Untersuchungsverfahren, Klin. Wochenschr. 26, 1948, s. 577-583.

Collen, D.: The plasminogen (fibrinolysis system). Thromb. Haemo st. 82, 1999, s.259-270.

Hatt ersley; P. S.: Aetivated eoagulation time of whole blood. l AMA 196, 1966, s.436-440.

Duke, W W: The relation of blood plate-

c; Shap iro, P. F.. Me lnick, P.: The bleeding tendeney in jaundice. Surg. Gynecol. Obstet. 60, 1935, s. 781-784.

lets to hemorrhagic disease: deseription of a method for determining the bleeding time and eoagulation time and report of three eases of hamorrhagíc disease relieved by transfusion. lAMA 55, 1910, s. 11 85-1192.

l vy. A .

Jim , R. T. S.: A study of plasma thrombin

time, r. Lab. CHn. Med. 50, 1957, s. 45-60.

Funk, c.. Cmiir; J., Herold, R. Straub. P. W : Reptilase-R - a new reagent in blood eoa gulation. Br. l . Haematol. 21, 197 1, č . I, s.43-52.

č.

I,

Kolde , H. J.: Haemostasis - Ph ysiology,

Pathology, Diagnostics. Pentapharm Ltd., s. 138 151

Basel

200 1,

Lee, R. /., White, P. D.: A c1inical study of th e coagulation time of blood. Am. J. Med. Scí. 145, 1913, s. 495- 503. Mal/ett, S. v. Cox, D. J. A.: Thrombelastogr a phy. Br. J. Anesthesia 69, 1992, s. 307- 3 13.

Soulier; J. P., Petit, P. , Le Bol/och, A. G.: Syndromes hémorrhagiques mortels avec incoagulabilité totale par défibrination et avec fibrinolyse. II. A la suite d'un avortement par injection intro-utérine d'eau de Javel: problěme des défibrinations en obstétrique et en gynécologie. Rev. hematol. 7, 1952, č . I, s. 48-54.

Proctot; R. R., Rapaport, S. /.: The partial thromboplastin time with kaolin. A simple screening test for the first stage plasma clotting factor deficiencies. Am. J. Path. 36, 1961, s. 212-2 19.

Spiess, B. D. et a/.: Thrombelastography as an indicator of post-ca rdiopulmona ry bypa ss coagulopathies. 3, 1987, s. 25-30. Tripodi, A. a Manucci, M.: Ma rkers ofactiva ted coagulation and their usefulne ss in the c1inical laboratory. Clin. Chem. 42, 1996, s. 684-689.

Quick, A. J.: On the relationship between complement and prothrombin in obst ructive jaundice. J. Biol. Chem. 109, 1935, s. 73- 74.

4. PATOFYZIOLOGIE HEMOSTÁZY Hemosuiza představuj e jeden z mech ani smů , které udržují integritu vn itřn ího proZa fyziologických poměrů hemostáza zajišťuj e fluiditu krve v intaktním cévním řeč iš ti a v případě poruchy kontinuity cévní s těny vede krevním srážením k zás tavě krvácení. Hemostatická rovnováha je výsledkem normální funkce cévní s těny, krevních destiček a plazmatických či n i telů zahrnujících systém koag u l ač ní, fibrinolytický ajejich aktivátory a inhibitory. Narušení hemostatické rovnováhy se může projevit jako: • krvácivý stav • tromboticky nebo trombofilni stav s tředí.

4.1. Krvácivé stavy Krvácivé stavy jsou charakterizovány spontánními krvácivými projevy nebo krvácením, které je neúm ěrn é s tavů m nebo podnětům , jež je vyvolaly. Krvácivé stav y vznikají narušením hemostatické rovnováhy v důsl edku poruchy některého z hemostatických mechani smů . Mezi tyto mechanismy patří: • funkce krevních destiček • funkce cévní stěny • plazmatický koagulační systém • fibrinolytický systém Případn ě mů že jít o narušení dvou, tří nebo všech č ty ř složek.

4.1.1. Krvácivé stavy z cévních

příčin

(purpury)

Normální funkce cévní stěny v hemostáze je výsledkem jednak neporušené struktury cévní s těny a jednak její metab olické aktivity, při které se tvoří řad a hemostaticky aktivních látek. Povrch souvislé endoteliální výstelky je za fyziologických podmín ek inertní ke krevním hemostatickým či ni te lů m . Selhán í některý ch funkcí cévní složky mů že být pří č in ou krvácivýc h p roj ev ů . Zánětl i vé a alergické z mě ny drobných cév bývaj í příč in ou zvýšené prostupnosti cévní s tě ny. Dochází k pronik ání krve do okolní tk án ě. Většinou se jedná o stavy, které postihují celý organismus, často s orgánovou akcentací. Na ků ži , případn ě na sliznicích jsou viditelné jas ně červe né drobn é krevní výro ny (petechie) s možnou alergickou reakcí okolní ků že nebo plošným podk ožním krvácením (ekochymóza).

Purpury Jde o skupinu krvácivých s tavů , u kterých je patogenetickým mechanismem porucha interakce cévní s těn y a krevních destič ek . Projevují se nej častěji kožním č i sl iznič n ím krvácením a jejich závažnost je dána vyvol ávající příčinou či lokalizací krvácení. Rozlišujeme poruchy cévní stěny: • vrozené - vrozené purpury • získané - získané purpury / 52

/ 53

4.1 .1.1. Vrozené purpUlY

4.1.1 .2. Získané purpUlY

RANDUAVA-OSLER OVA-WEBER OVA PURPURA Heredit ární hemorhagická teleangiektazie je autosomá l ně domin antní d ědi čn é o nemoc ně ní, které je charakter izováno přítom nos tí teleangiekt áziť, tj. dyspldzii pojivové složky st ěn drobnycli cév. U postižených se nachází cévní roz š ířenin y a výd utě s významným zte nče ní m cévní stěny. Cévy v m í stě výd u tě nejsou schopny vazokonstrikce a tím se ztěžuje tvorba des tič kové zátky. V zeslabených místech cévy snadno praskají a do chází k obtí žn ě zastavitelnému krvácení. Krvácivé projevy vyplývají ze snížené odolnosti s těny cévní a jsou če t nějš í se stoupajícím věke m . Patogeneze lézí není známa. Byla popsána souvislost s haploCévy u Ranhduobvy.osterovy C oro y typem HLA A2B w 17. Onemocn ění postihuje všechny rasy a obvykle se vyskytuje na rtech, bukální sliznici, ků ži kolem úst a nosu. Mů že před stavovat pouze kosmetický defekt. Léze mají vzhled tmavě červených až fialových podélných či oválných skvrnek velikos ti 0,5-3 mm. Polovina nemocných má známky krvácení do gastrointe stinálního traktu a šestina má mikroskopickou hematurii. Asi u 15 % nemocných se tvoří plicní arteriovenózní spojky, které vedou k hypoxémii, pravolevému zkratu a čas to k embolizacím do mozku . Nemocní s plicní lokalizací teleangiektázií mají sekundárn í polyglobulii a paličko vité prsty. Jatern í lokaliza ce o ne m oc ně n í vede k měst­ nav é s rd eč n í dekompenzaci a fibróze jater. Průběh onemocnění: Po pub ertě se objevují drobné, jasně červe né u zlíčky na rtech, brad ě , če le, tv ářích , nose, na nosní sliznici a sliznici dutin y ústní, na bří šk ách prstů i jinde na těl e. Bývají velikosti špendlíkové hl avi čky ( někdy více, jind y mén ě vyz nače né. Uzlíč ky jsou vlastně malé vý d utě drobných cév (tepének, žilek a vl áseč­ nic) vyvolané změn am i cévní s tě ny. Laboratorní nález:

Vy šetření

hemostázy - normální nález.

HENOCHOVA-SCHONLEINOVA P URPURA (Anafylaktoidní purpura, peliosis revmatic a) Henochova-Schiinleinova purpura je imunokomplexové onemoc nění se zvýš enou permeabilitou kapilár a orgánovými proje vy. Vyskytuje se n ej častěji v děts kém vě ­ ku a v dospívání. Výskyt v d o sp ělosti však není výji mkou. Postižení stěny cévní vzniká na podkl adě vaskulitidy drobn ých cév a kap ilár. Antigenní podn ěty vyvolávající vaskulitidu jsou n ej č astěji infekční (/3 hemol ytický streptokok, viry). Onemocněn í mívá významný nefrologický nález s postižen ím glomerulárních cév. Onemocn ění zač í ná zpravidla 1-3 týdny po proděl an é infekci hlavně horn ích dýchacích cest, ale mů že být i projevem alergie na léky či potra viny. Onemo cn ění se projevuje těmito příznaky: • tvorbou petechií na končetin ách (na extenzorové straně dolní končetiny a fernurové straně horní kon četiny) • kolikovými bolestmi břicha, někdy krvácením do GIT • bolestmi a otoky kloubů • kompletním močovým syndromem s hematurií, proteinurií a válci

Laboratorní nález: Test fragility kapilár je pozitivní Léčba: Je kauzální - odstranění infekce, léku či alergenu SKORBUT Skorbut je získaná purpura vyvolaná zvýšenou lomivostí kapilár při dlouhodob ém nedostatku č i chyb ění vitaminu C v potravě . Vitamin C je kofaktor hydro xylace prolinu a lysinu s vlivem zhruba na jednu č tvrti n u aminokyselin ve s tru kt uře kolagenu . Onemo cn ění vede ke kožnímu a s lizničním u krvácení z dásní. Defekt kolagenu vede k zastavení rů stu vl as ů . Onemocnění se mů že vyskytnout u osob se zvláštními dietními pravidly, u starýc h a zanedbaných osob, a l ko holi ků, u osob v malnu trici a lidí vystavených extremním podmínkám bez pří su nu vitaminu C.

Léčba: Léčba je p řev ážn ě p odpůrná, kauzální léčba chybí. Prognóza je určena lokalizací léze, če tnos tí krvácení a je větši no u dobrá. Opako vaná krvácení mohou vést k sideropenické anémii.

La bor a torní nález: Test fragility kapilár je pozitivní Léčba: Podání vitaminu C má zpravidla okamžitý efekt , nutná je ní podpora.

EHLERSÚV-DANLOSÚV SYNDROM

STEROIDNí PURPURA

Ehlers ův-Danlos ův

syndrom je vzácná vrozená příčina krvácení cévního původu, prov ázená z mě n am i ků že a jizvením. Pří činou krvácení je abnorm ální struktura kolagenu s tě n y cévní a onemocněn í je provázeno i destičkovými a ko agul ačními abnormalitami.

Kortikosteroidy mají vliv na syntézu kolagenu, tím že inhibují tvorbu mRNA (rnessenger RNA). Změny kolagenu se projevují i zvýšenou krvácivou tendencí zejm éna při postižení kolagenu s tě ny cévní a můžeme je v i dě t u Cushingova syndromu č i po terapii kortikoidy.

154

155

větš i no u

i

nutri č ­

Purpura simplex a purpura senilis patří mezi krvácivé stavy z cévních příčin, jsou klinicky nezávažné a vyskytují se především na končetinách u starých osob nebo jako následek nadměrného s lunění či po terapii kortikoidy.

4.1.2. Krvácivé stavy z poruchy krevních

•

destiček

Úloha krevních destiček v hemostáze je mnohostranná. Jsou nezbytné pro normální fu nkci cévní stěny, up latň ují se v procesu plazmatické koag ulace a mají klíčovou úlohu v primární hemostáze. Funkce trombo cy tů je podmíněna některými strukturálně fu nkčními zvláštnostmi. Nemoci krevních des tiček mohou být vyvo lány

změnou počtu

nebo funkce krevních

destiček:

O snížení počtu - trombocytopenie O zvýšení počtu - trombocytóza, trombocytemie O funkční nedostatečnost - trombocytopatie Jednotlivé stavy nelze přesně o ddělit, může docházet k so učasným změnám jak počtu, tak i funkce krevních destiček. V obou případech je tvorba primární hernostatické zátky narušena a koag u lační odpověď je nedostatečná.

vyšetieni kostní dieně: počet megakaryocytů normální nebo zvýšený pieživani destiček v obvodové krvi se zkracuje z těchto pitčin: - zvýšena spotieba destiček (koagulace) - rychlej ši odbourávání destiček (obvodová krev, tkáně) z nedostatečné produkce trombocytů - cen t r á 1n í (snížení tvorby megakaryocytů v kostní dieni a následné snížení destiček v cirkulaci) • vyšetieni kos tní dieně: počet megakaryocytů snížený '• •

•

ze zadržování (sekvestrace) destiček • zvýšené hromaděnídestiček ve slezině (zvětšená slezina)

(černá -

může

PŘEŽÍVÁNÍ KREVNÍCH DESTIČEK normální stav), červená (těžká trombocytopenie)

ra di oaktivita (log 'Io)

'--""'-

' h•

100

80 U trombocytopenií a trombocytopatií se vyskytují krvácivé projevy. Krvácení být z různ ých orgá n ů:

60

~

O

• • • • • •

z 110SU - epistaxis ze žaludku - hematemesis (zvracení krve) ze střev - z horní části GIT: melena (stolice černě zbarvená natrávenou krví) - Z dolní části GIT: enteroragie (piitomnost nenatrdveně krve ve stolici) z dělohy - metroragie z dásní kožní - petechie, ekchymozy; sufuze

:w OI 11 /2 = 3 hod.

\

K <. r-.r-.

O

20

1 1 /2 = 8 0 hod.

r.-. ~

\

O

I 10

4.1.2 .1. Tromboeytopenie

O

O trombocytopenii mluvíme tehdy , je-li snížen počet trombocyt ů v určitém objemu krve větš inou pod hodnotu 100 . 10 9/1. Roz lišují se trombocytopenie: • Vrozené (primárnů - pokles krevních de s ti č ek mů že být samostatnou primární chorobou z nejrůzn ějš ích příčin. • Získané (sekundánu) - vyskytují se jako druhotný projev různých patologických s tavů.

-..J

1

2

3

4

5

6

7

8

9

I'---

-

dny

Podle počtu destiček v obvodové krvi rozlišujeme trombocytopenii: • lehkou: 90-130 . 109/1 • středně těžkou: 50-90 . 10911 • těžkou: < 50 . 10911

Primární trombocytopenie mohou vznikat ze tří hlavních příčin: • z předčasného zániku trombocytů - per i f e r n í (tvorba destiček ve dieni je normální)

Za normálních oko lností krevní destičky kromě účasti v koagulačním procesu i nepropustnost cévní s těny pro erytrocyty. Pro to nejčastějším spo lečným příznakem sníženého počtu krevních destiček bývá spontánní krvácení do kůže a ze sliznic (ekchymosy). Krvácení může nas tat i po drobných úrazech.

156

157

zajišťují

Při krvácení do ků že se mohou vy tváře t drobné tečko v ité krevní výlevy - petech ie. Tvo rba petechii j e typická pro kr vácivé projevy při poruše primární hemostázy. Nacházíme je zejména v místech vě tšího hydrostatického tlaku (dolní končeti ny a pod.).

O Ne každé snížení krevních destiček vede ke krváceni. I velmi výrazné trombocytopenie (méně než 20 . 109/1) mohou být bez krvácivých p rojev ů . Rozdíly jsou velmi individuální, ziejmě se na nich podílí jak funk čn i stav destiček, tak i stav cévní složky.

4.1.2.1.1. T ROMBOCYTOPENIE Z

NEDOSTATEČNÉ PRODUKCE TROMBOCYTŮ

VRO ZENÉ Mohou být d ěděn y jako au toso mál ně dominantní, nebo recesivní o ne moc něn í č as to sdružené s dalšími anomáliemi. Mnohdy bývají s ouč ás tí syndromu s jin ými projevy (Fanconiho anémie, Mayova-Hegglinova a Aldricho va-Wiskottova anomálie). TROMBOCYTOPENIE při anomálii May-Heggl inově A nom álie Mayova-Heglinova je vrozená autosorná ln ě dominantní porucha, u které jso u ov liv ně ny neutrofily a krevní destičky. Ačkoliv j sou neutrofily morfologicky abnormální jejich funkce je normální (May, 1909; Hegglin, 1945 ). • Příčina: porucha vyzrávání megakaryocytů '-(h lav ně porucha jejich fragmentace). Snížený počet destiček je na úkor jejich velikosti. • Laboratorní nález

OKO: • přítomnost obrovských trombocytů (6- 15 11m), • Dohleho tělíska v granulocytech O Pie živdni destiček: normální

--'

• •

Příčina:

m egakary ocyty produkují málo destiček a destičky j sou malé. Klinický obraz: Trombocytopenie p om ěrn ě těžkého stu p ně , postihuj e hla vn ě chlap ce. Postižené děti trpí chronickým ekzémem a sníženou odolností vůč i infekcím (organismus u tohoto syndromu produkuje protein, který tyto odezvy vyvolává).

ZíS K ANÉ Mohou vznikat z různýc h příč in - infekce, chemikálie, léky, příp adn ě v dů sl ed ku j iného základního one mo c ně ní. O Trombocytopenie z chemických a fyzikálních příčin. Některé látky (chlorothiazid, est rogeny, interferon, alk ohol, cytostati ka) mohou pozvolna toxi cky p ů­ sobit na megakaryocyty a vyvolat tak trotnb ocytop enii. Některé léky pů s obí toxicky jen na trombopoézu, jiné obecně na hematopoézu. O Trombocytopenie při virových infektech. Viry mají přímý supresorový efekt na megakaryocytopoézu. Megakaryocyty mohou být sídlem replikace v i rů, což mů že vést k poruše jejich vyzrávání a následně k tromboc ytopenii. Poškození megakaryocytů a tromb ocytů zřej mě zp ů s o b uj í endotoxiny, případně splodiny metabolismu bakterií, případn ě prvoků. Krvácivé projevy se dostaví jen při tě ž ­ kém stupni trombocytopenie O Jiné příčiny vedoucí k potlačení megakaryocytopoézy: • toxi cké poškození (toxické látky, j edy ) - napl: n ěkteré těžké kov y (Bi, Hg) • zmnože ní patologických bu něčných kmen ů (leukemie, meta stázy ) • nedosta tek kyseliny listové a vitaminu B 12 - vyvo lá i p oru chu DNA v dozrá vání m egakaryocytů (megalob lastově anémi e)

4.1.2.1.2. TROMBOCYTOPENIE ZE ZVÝŠENÉ

DESTRUKCE TROMBOCYTŮ

Trombocvtopenie imunitní povahy

Mohou být vyvolány : větších

než erytrocyty

O autoprotilátkami O aloprotilátkami PŘEOCASNÝ ZÁNIK KREVNÍ OESTICKY VYVOLAN Ý PROTILÁTKOU

TROMBOCYTOPENIE při syndromu Wiskotově-Aldrichově Syndrom by l roku 1937 popsán Wiskott em, po zději Aldrichem (Wiskott, 1937; Aldrich a spo l., 1954) . Syndrom Wiskottllv-AldricJlllv je vrozeno u autoimunitni poruch ou . Imunitní defekt ov l iv ň uj e hl avně bun ěčn ou imun itu, spíše než imunitu humorální. 158

Trombocytopenie

159

I

AU TO IMUN I TN Í PROTIL ÁTKY (A UTOPR O TI L ÁT K Y ) U těchto stavů doch ází ke zvýšenému rozpadu krevních destiček v důsledku po šk ozen í membrány autoprotilátkami, či imunitními komplexy. Autoprotilátky mohou být zam ěřen y proti de sti čk ám , nebo cév ní s těně (cév ní s tě n a je destičkám antige n ně příbuzn á) . Příč ina mů že být buď známa nebo neznáma (Kelton, 1998) :

a) Známá

příčina tvorby

protilátek

O Trombocytopen ie vzniká ze známé příčiny : léky, těhoten ství, autoimunitní chorob y, AIDS , TKD. Stav označuj eme jako sekundární autoimunitní trombocytopenickou purpuru

b) Neznámá

příčina

tvorby protilátek

O U tohoto o nemoc něn í dochází ke zvýšenému rozpadu trombocytů z neznámé pří­ či ny za s po l u účas t i protil átek - idiopatická trombocytopenick ápurpura (ITP) .

IDIOPATICKÁ TROMBOCYTOPENICKÁ PURPURA - IT P Syn onyma : Autoimunitní trombocytopenická purpura, autoimunitní tromb ocytopenie, primární imunitní trombocytopenická purpura (George, 1996a). Chorobu popsal Werlhof (Werlhof, 1734) a nazval j i " MORBUS MACULOSUS HAEMORHAGICUS ", později označován a ja ko " MORBUS MA CULOSUS WERLHOF1". Na nedostatek krevních destiček u této nemoci upozornil j iž Krauss. Dnes po užíva ný název pochází od Franka z t: 1915 (Frank, 1915 ). • •

•

Definice: ITP je izolovaná trombocytopenie zp ůsoben á protilátkami na vázanými na membránědestiček. Příčina: nemocn ý z neznámých dů vodů vy tváří autoprotilátku proti vlastním trombocytům. Protilátka, kter á patří do podskup iny IgG 3 se váže na norm ální i pacientovy destičky, hlavn ě na jejich membránové glykoproteiny. Poškozené destičky s navázanou protil átkou jsou sekvestrovány slezi nou a následn ě fago cyto ván y v MFS (Geo rge, 1996b).

č í vy léč en ím

(spontánní remi se), nebo se mů že op ako vat. U čás ti nem ocn ých pře­ chází do chronické podoby (Lichtin. 1996). Dochází větš i nou i k p římému postižení cév ní s těn y. Nachází se petechie, purpura, sufuze , krv ácení ze sliznic, nen í splenome gálie. Jedná se o chorobu z přítomnosti cirkulujících imunokomplexů . Antigenem bývá větš i n o u virus, kter ý vyvolal infekci. Imu nok omplexy jsou vyvazovány na receptory krevních destiček a tyto agregáty j sou vyAkutní ITP - vznik imunokomplexů s krevními destičkami chytávány v MFS . a jejich vyvázání makrofágy

•

Výskyt: zej ména u dětí mezi 2-6 rokem , 10 piipadů/I ů ů 000 se vyskytuje vzácně (Lichtin , 1996).

Chron ická forma ITP Krvácení bývá méně rozsáhlé a větš i no u neohro žuje život. Příči­ nou bývají autoprotilátky proti antigenům krevních destiček, které jsou pak vychytává ny v MFS .

Rozlišujeme dvě form y ITP, které se liší etiopatogenezí a klinickým průb ěhem : • akutní • chronická

Ak utní for ma I T P Vzniká náhle vě tš i n o u navazuje na proběhlou virovou -'-~_... infekci a má prudký průběh s výrazný mi proje vy krv áce- '---'Petechie u IT P ní. Onem ocněn í trvá několik dnů až m ě s íc ů. Někdy kon160

.-tL

protilátka Chronická ITP - vychytávání protilátek vyváza ných na krevní destičky v MFS

Diagnostika ITP se zakl ád á na vy l uč ován í j iných příč in , protože žádný z dnes známých testů není dostatečn ě citli vý.

dětí ročn ě.

spělých

•

•

Výskyt: U dospělých ve vyskytuje u žen

věku

20-50 let,

častěji

se

Laboratorní nález : O KO : Normální morfologie červen é krvinky, normální zastoupení a morfologie bílé krvinky, výrazná trombocytopenie s větším i destičkami se spontánními krvácivými projevy při poklesu počtu pod 20 . 10 91/. O Doba krvácení: prodloužena (až na hodnoty kolem 20 minut , n ěkdy i del ší) 161

Chronická ITPvelké destičky

U do-

o

•

P ťe živ án i des tiček: p ol oč as

ménež polovina normá lní doby, často jen někol ik hodin O Kostní dteii: posun doleva v megakaryocytární řadě (zvýšený poč et meg akaryobl astů a promegak aryocy tů na úkor vyzrálých forem) Léčba : Potlačení tvorby protilátek imunosupr esivy (kortikoidy). Součástí léč b y závaž né trobocyto penie je i potlače ní krvácivýc h proj e v ů podáváním trombocytárních náplavů, nebo l é ků p otl ačuj í cích krvácení ( např. etamsylát). ně

•

• •

Chronická ITPzkrácené přežívání desti ček

A LOIMUNITNí PROTILÁTKY (A L O P R O T I L ÁT K Y)

•

Aloimunitní trombocytopenie vznikají podobně jako aloimunitní hemolytické anémie v dů sl ed ku inkompatibility (nesouhlasnosti) d estičko vých antig e nů: • u příjemce a dárce • u matky a plodu (novorozenecká trombocytopenická purpura)

•

Tromboc ytop enie neimunitn í povah v Trombocytopenie při chronickém onemocnění jater Objevuje se zejména u cirhózy jater. U tohoto o nemocně n í dochází ke zmnožení vaziva v j átrech - "tvrdnutí jater" . Při těchto stavech je ztížen pr ůtok krve játry. Krev se hromadí ve s lezi ně , kde dochází k odbourávání trombocytů .

4.1.2.1.3. T ROMBOCYTOPENIE ZE ZVÝŠENÉ

KONZUMPCE TROMBOCYTŮ

o

První popis tohoto onemocnění od Eli Moschcow itze pochází z I: 1924. Autor mylpovažoval znzifý materiál v cévách za erytrocytdrni drť (Moschcowitz, 1924). Později se zjistilo, že jde o nález destičko vých tromb ů.

ně

O Trombotická trombocytopenická purpura je závažné one moc ně ní s postižením čet ných orgánů , které neléčené vede ke smrti. O Při TTP jde o generalizova né postižení cirkulace krve. 162

na tomto o nemocnění se patogeneticky podílí deficit metaloproteinázy, která štěpí multimery vWF (ADAMTS 13), který m ů že být bu ď vrozený nebo získaný . Do krevního oběhu jsou u vol ň o v án y z Weibel-Paladeho tě lí se k cév ních endotélií nadměrn ě aktivní multim ery (vysoce polymerizovan ě agregáty) von Willebrandova faktoru (Ruggeri a spo l., 1983). Tyto multimery j sou pravděp o­ dobně š těpe ny na rů zné fragmenty, z nichž fragment o MW 176 kDa je aktivátorem de stičkovéh o povrcho vého integrinu GP Ilb/I ll a. Vznikající de sti č­ kové agregáty jsou dů sl edkem této aktivace. K tvorbě trombů doch ází po nastartování banálními virovými ataky. Výskyt: postihuje spíše mladší věkové kategorie Klinický obraz: O H oreč k a O Mikroa ngiopatická hemolytická anémie O Trombocytope nická purpura O Proměnliv á neurologická symptomatologie O Renální selhání Klinická interpretace: TTP mů že vzniknout ve spoji tosti s virózou nebo obecn ě s infe k čn ím o ne moc ně ní m , malignitou, chirurgickými výko ny, těh oten s t v ím , některými léky a s očková ní m . Léčba : Dříve to bylo smrtelné onemocnění. Léčba musí být okamžitá a jejím základním p ředp okl adem je provedení vysoko obje mové plazmaferézy a podání čerstvě mraže né plazmy. U poruchy vyvolané inhibitory se pokládá za vhodné podávání kortikoi dů.

Oproti TTP bývá DIK nastartován vážnou poruchou naru šujici flu idokoag u la č­ ní rovnováhu. Jde zejména o nemoci vedoucí k destrukci tkání - napi: rozpadající se tum ory, septický stav a ji né).

HEMOLYTlCKO-UREMICKÝ SYNDROM HUS - syndrom Gasser ův •

TROMBOTlCKÁ TROMBOCYTOPENICKÁ PURPURA TTP - syndrom Moschocowitz ův (Mikroangio pahita trombotica)

Piičina :

•

Výsky t: Na rozdíl od TIP se nachází n ejčastěji u dětí do 1 roku. Může se vyskytovat i v dos pěl o sti , u žen v těhotenství (Gasser a spol., 1955). Příčina: pravděpodobně vlivem cirkulujících imunitních komplexů a aktivovan ěho komplementu dochází u těchto stavů k poško zení kapilár (m ikroangiopatie) a dále k poškození regulačních m echanismů primární hemost ázy a koagulace. V ledvinách se tvoří agregáty krevních de st ič ek , které poškozují ledv iny, nás led ně dochází k jeji ch selhání. V mikrocirkulaci dochází k aktivaci krevního srážení, vytváří se tromby a prohlubují se změny v n i třní ho povrchu cév. Na takto změněné m endoteliálním povrchu dochází k hemolýze erytrocytů. Z naruše163

• •

• •

ných erytrocytů jsou vyplavovány ko agul ačn ě aktivní látky, které dále rozvíjejí poruchu krevního srážení. Další možnou vyvolávající příčinou mů že být i nedostatečn á produkce prostacyklínu v cévní s tě ně . Klinický obraz: selhání ledvin, trombocytopenie a hemolytická anémie Labora torní nález O KO : zvýšený nález schi stocy tů Léčba: Prostá infúze plasmy ( pravděpodobně dochází ke stimulaci tvorby prostacyklinu v cévní s tě ně) . Trombocytopenie při DI K: Dochází k aktivaci nitrocévního srážení krve. Krevní d esti č ky se shlukuj í - vznikají mikrotromby. V kostní dřeni n e stačí tvorba destiček kompenzovat jej ich zvýšenou sp otřeb u .

4.1.2.1.4. TROM BOCYTOPENIE

b ěhem

•

ZE ZTR ÁT TROMBOCYTŮ

Trombocytopenie po ma sivní transfúzi nebo vý měně krv e Při rychlé náhradě krve, u které během 24 hodin dodáme množství krve odpovídající obj emu krve nemocného , může dojít k trombocytopenii, protože v převedené skladované krvi není dostatečn ý po čet trombocytů .

•

O Má -li kostní dieii dostatečno u kapa citu dochází spíše k trombocytoze.

Trombocytopenie p ři m imotěln ím o běhu U mim otělního ob ěh u krve ( n apř. p ři operacích srdce, cytoferézác h, plasmaferézách) dochází v mimotělním oběh u ke snížení teploty krve až na hodnoty kolem 25 "C, Pod tuto teplotu mohou krevní desti čky s po n tán ně adherovat nebo agregovat. Trombocytopenie při splenomegaIii Je-li přítomn á splenomegalie ( zvětš ená slezina) dochází zpravidla ke zvýšenému skladování d e st i ček ve s lezi ně (v n ěk terých případech m ů že být ve s lez i ně uloženo až 90 % všech d e sti ček) . V obvodové krvi vzniká trombocytopenie. HEPARINEM INDUKOVANÁ TROMBOCYTOPENIE (HIT) Nejde o •

onemocnění,

ale o stav vyvolaný v průběhu

léčby

heparinem

Výskyt: u 0,5- 5 % všech pacient ů léčených nefrakcionovanym heparinem (Warkentin a spol., 1995). Dnes se používá většinou nirkoniolekuldrni heparin (LMWH) , u kterého k této poru še prakticky nedochází.

Rozlišujeme 2 typy HIT: • HIT I: (asi u 10 %) prostá interakce heparinu s trombocyty -lehký aglutinač­ ní ef ekt. Jde o benigní , klinicky nevýznamn ou trombocytopenii, která se objeví 164

prvních dnů lé čby. Počet desti ček neklesá pod 100 . 10911. HIT typ I mů že podle n ěkterých au torů přejít plynule v typ II (Gre inacher; 1995). Příčina : trombocytopenie vzniká jako následek n eimunitních reakcí. K poklesu trombo cytů dochází p ravděpodobn ě pří­ mým pů s ob ením heparinu na agregaci krevních desti ček. Heparin se nespecificky naváže na trombocyty v závislosti na molekulové hmotnosti heparinu a stupni sulfatace. Proagregačn ím efektem heparinu jsou z a -granulí desti ček uvolň ov ány proteiny schopné vázat heparin (zej ména PF4), které se váží na heparin navázaný na trombocytech. většinou

HIT II (HITT - HIT s trombózou): (asi u 0,5-5 %). Jde o vzácnou, ale závažnou komplikaci heparinové terapie , která přímo ohrožuje život nemocného. Kolem 7.-15 . dne léčby pře­ dev ším nefrakcionovaným kontakl heparinem dochází k výrazné kontakt trobocytope nii pod hodnoty 100.10911 , případně i méně. Příčina: trombocytopenie j e I vyvolána produkcí autop rotilátek typu IgM, IgG 2 a IgA , A které j sou cíleně zam ěien ě ::r.:" . k vyvázání PF4. Trombo,...,..--:~~~ genní mech anismy těchto autoprotilátek nejsou pln ě '----' objasněny. V přítomno sti heMechanismy vedoucí k poškození endotelu u HIT parinu se protilátky (Ab) váží do komplexu [Heparin . PF4 . Ab] - vznikají imunitní komplexy, které vyvolávají aktivaci a agregaci krevních destiček. Komplexy PF4 s heparinem před­ stavuj ící hlavní antigen. Tyto velké komplexy mohou vázat několik protilátek a vznikají tak imunitní komplexy, které aktivují destičky cestou jejich receptorů pro Fc fragment imunoglobulinu. Stejn é komplexy se vytvářejí na endoteliálních buňkách, což má za následek jejich poškození - aktivace endo telu . N e přím ý

Přim ý

•

165

Předpokládá se, že u postižených se jedná o genetickou odchylku destičkového faktoru (PF4), při které dochází k záměně aminokyseliny v pozici 131. Běžně je v proteinověm řetězci faktoru na tomto místě Arg, kdežto u faktoru s genetickou odchylkou His . Tato záměna výrazně zvyšuje riziko HIT. Homozygot má oba Arg zaměněné za His, takže incidence HIT je u něj velmi vysoká. Při interakci hraje podstatnou úlohu nejen vazba na PF4, ale i na chemokiny uvolněné společně s PF4 (např. interleukin 8 nebo neutrofily aktivující peptid 2). Uplatňuje se úloha imunitního systému . PF4 může tvořit mono až tetramer. Tetramer PF4 je "ideální" pro tvorbu imunitních komplexů. Několik tetramer ů PF4 váže 1 molekulu glykosaminoglykanu - GAG (část iet ězce heparinu).

Vyvolání imunitní reakce ovlivňuje: • délka GAG řetězců • doba expozice pacienta. • PF4 může být nahrazen i jiným proteinem vázajícím heparin. •

•

Laboratorní hodnoty: O HIT I : trombocyty < 150 a > než 100.10 9/1. Po vysazení heparinu se velmi rychle počet destiček upraví na normální hodnoty. Tento stav nevyžaduje následnou léčbu a nemocní nemají významnější klinické následky . O HIT II: trombocyty < než 100, někdy méně než 60.10 9/1. Léčba HIT II: Úplné vysazení heparinu (nebezpečné mohou být i preparáty LMWH). Místo heparinu se jako antikoagulancia podávají hirudin nebo danaparoid. V akutní fázi onemocnění není vhodné podávat preparáty kumarinového typu .

o

Soudí se na zkNženou reakci s heparansulfdtem nebo glykosaminoglykanem a poškození endotelidlnicli bun ěk j e pravděpodobným vysvětlením neobvykl ě lokalizac e trombotickych komplikací. Není jasné proč dochází k trombózám ve velkých a stiedn ě velkých arteriích spíše než v arterioldch. O Zvláště nemocni s trombotickymi komplikacemi dostávající heparin maji .Jiyperagregabilni" trombocyty, které snadno vytvdieji " shluky " in vitro.

4.1.2.2. Trombocytopatie U trombocytopatií je počet destiček většinou normální (případně lehce snížený nebo i zvýšený), ale je u nich narušena ultrastruktura destiček nebo je změněná jejich funkce či metabolismus. Funkční poruchy O vrozené O získané

destiček mohou

být:

4.1.2.2.1.

VROZENÉ TROMBOCYTOPATIE

Vrozené trombocytopatie jsou velmi vzácné. Většinou se projevují krvácivými syndromy: kožní a slizniční krvácení, krvácení po malých poraněních. Vrozené trombocytopatie bývají spojovány s poruchou:

1. membrány krevní destičky (hlavně membránových • tromboastenie Glanzmannova-Naegeliho • syndrom Bernard-Soulierův

2. skladovacích granulí • porucha skladovacího poolu (storage pool deficiency). Denzni granula obsahující serotonin a ADP buď chybí zcela nebo se vyskytují j en sporadicky. Chybí sekundární vlna agregace po ADP. • syndróm šedých destiček (gray platelet syndrome). Byl poprvé popsán v roce 1971. Klinicky může být přítomno krvácení. •

Příčina:

a- granula destiček bud chybí zcela nebo se vyskytují jen sporadicky. Může jít i o kombinovanou poruchu. Destičky mají méně než 15 % normálního obsahu (Xgranulí , získávají tím šedavé zabarvení. Proto se tento syndrom někdy označuje jako syndrom "šedých destiček". Dochází ke zkrácení doby přežívání destiček, destičky mají narušenou strukturu a chybí GP la a lb. V nátěru se nachází velké, špatně obarviteln é destičky a je přítomna trombocytopenie. Ve dřeni nacházíme šedé megakaryocyty s výraznou vakuolizací (tvar švýcarského sýru) a bývá fibróza. Do této skupiny patří: O Heřmanského-Pudlákův syndrom O syndrom šedých destiček

3. enzymových aktivit • chybění nebo funkční cyklooxygetuizy • chybění nebo funkční tromboxansyntetdzy 4. mobilizace

nedostatečnost

L---===--

---I

1i3i~""!f-....,.~......,.---.-=---~c=

Velké destičky bez granulí a s vakuolizací

nedostatečno st

nitrobuněčného vápníku.

Porucha cesty, kterou se stimuluje uvolvápníku, případně cest, které reagují na jeho zvýšenou hla(poruchy aktivace a stimulace kontraktilního aparátu)

nění nitrobun ěčn ěho

dinu

uvnitř buňky

5. snížení nebo 166

glykoproteinů).

chybění odpovědi na

TXA z. Jde o poruchy receptoru pro TXA 2, 167

neprob íhá jeho navázání na destičky a nedochází k následné stimulaci dalších - neprobíhá agreg ační impul s zp rostřed kov aný TXA 2 .

de stiček

6.

u volňovací

reakce. Desti čky obsahují všechny typy granulí s dostatečnou výbavou jedn otlivých složek v nich zastoupených. Neprobíhá stimula ce, která sm ěiuje k uvolnění obsahu granulí (poruchy receptorů , nebo stimulačních mechanismů ) .

•

1. Po ru chy m embrá ny GLANZMANNOVA-NAE GELlHO TROMBOASTENIE Porucha byla popsána I: 1918 Glan zmann em (Glanrmann; 1918). Jde o poměrn ě řídce se vyskytující autozomálně recesi vně dědi čné Dochází při n ěm k poruše tvorby desti čko vé zátky. •

onemocnění.

Příčina:

Defekt komplexu membránových glykopro tein ů lIb/lIla, který vede k narušení agregace destiček po ADP, kolagenu, arachidonové kyselině a trombinu.

Rozlišujeme 3 typy poruch: • Typ I - úplné chybění komplexu GP IIb/IIIa. V o-granulích destiček je velmi nízká koncentrace fibrinogenu . Je porušena agregace i retrakce • Typ II - snížený po čet těchto glykopro tein ů (10-20 %). Hladina fibrinogenu v desti čkách je jen lehce snížena, retrakce koagula je jen mírně narušena. • Typ III - fyziologické množství GP, ale porušena j e j eho f unkce. •

Laboratorní nález: OKO: MPV normální

O O O O

Doba krvácení: prodloužena Retrakce krevního a plasmatick ěho koagula : snížená Adh ezivita destiček: narušena A gregace destiček: po stimulaci ADP odpověď chybí

BERNARDÚV-SO ULlERÚV SYNDROM Bernard a Soulier v I: 1948 popsali vrozený autosomdln ě recesivní krvácivý stav charakterizo vany prodlouženou dobou krvácivosti, stiedn ě těžkou trombocytopenii a piitomnosti neobvykle velkých trombo cyt ů s poru šenou funkcí (Bernard a Soulier; 1948 ). Krácivé projevy se vyskytují zejména v dětství a zahrnují především s l i z n i čn í a kožní krvácení. U tohoto syndromu jde o poruchu tvorby primární hemostatické zátky -neprobl1lá adheze krevních destiček. •

Příčina:

defekt glykop rote inov ěho komplexu [Gplb- V-IX] spoje ný s mutací v genu složky Gplb, která je patologicky změněna. Komplex je receptorem pro vWF 168

a je složen ze 4 podjednotek GP (GP Iba., GP Ib~, GP IXa, GP V). Tento komplex se buď netvoii. nebo je piitomen, ale nenifunkční. Primární příčinou je pře­ stavba genu pro GPlb , které vede ke snížení jeho množství. Dále se nachází i monologické abnormality krevních destiček (Lopéy, 1994) . Adh eze, kteráje výsledkem interakce kompl exu [Gp Ib-V-IX] a von Willebrandova fakto ru neprobih á. Defekt tohoto komplexu je rovněž příčinou neschopností destiček agregovat v přítomnosti ristocetinu. Agregace po stimulaci ostatními stimulačními látkami probíhá normálně (Modderman a spol., 1992) . Laboratorní nález: O KO: Počet destiček - většinou snížen, MPV - velké abnormální destičky (makrotrombocytóza) O Krevní n átěr: nachází se dystrofické destičky s velkými vakuolami , které j sou nápadné svou velikostí ( p rů m ě r až 20 um ) a nahromaděním granulí ve středu trombocytu (vzniká dojem jádra - destičky připomínají lymfocyty). Atypické desti čky obsahují 2--4násobné množství proteinů a jsou v celkovém počtu trombocytů zastoupeny 30--40 % (Roth, 199/). O Doba krvácení: prodloužena O Adh ezivita destiček: narušena O Pie živ áni destiček: zkrácené O Agregace trombocyt ů : • ADP - normální křivka • Epinefrin - normální křivka • Ristocetin - agregační křivka chybí nebo je patologická. Agregace s ristocetinem je totiž závislá na interakci komplex u [GP Ib.V.IX] s vWF (Ruggeri a spol., 1983) .

2 . P oru chy skla d ov a cí ch gran ulí H EŘMANS KÉHO -PUDLÁKÚV SYNDROM

Syndrom byl t: 1959 popsán Heimanskym a Pudldkem u dvou nemo cnych. Je sdružen s albinismem. •

Příčina:

na rozdíl od tromboastenie probíhá adhezivita a primární agregace de- chybí však druhá agregační vlna po stimulaci ADP, protože destičky nejsou schopné uvoliiovat ADP z denzntclt granulí. Tvorba destičko­ vé zátky probíhá nedostate čně . Rozli šují se dva typy této poruchy: • nedostatek destičkového ADP • porucha u v olňo vání ADP z granulí stiček norm álně

169

•

Laboratorní nález: Doba krv áceni: prodlou žena Ag regace destiček: chybí druhá

agregační

Trombocytózy se vyskytují: • u infekcí nebo zánětlivých onemocnění • po splenektomii - nedoch ází k sekvestraci destiček ve s l ezi ně • při krvácení - v období 48-96 hodin po masivním krvácen í vzrů stá počet krevních

vlna při stimulaci ADP

4.1.2.2.2. Z íSKANÉ TROMBOCYTOPATIE Získané trombocytopatie vznikají sek u n dárně jako d ů sledek základn í poruchy, která ovlivtiuje funkci krevní destičky. Jsou pod statn ě ča stěj ším nálezem , než vrozené formy. Krvácivé projevy nebývají výrazné a vě tš i nou není ani nutná léčba. Trombocytopatie u myeloproliferativních onemocnění • Příčina: u některých nemocí , které mají vliv na krvetvorbu se mohou škozené nebo nefunkční krevní desti čky.

tvořit

po-

např. p ři

při

•

u

•

fyzické námaze a psychickém zvýšení nádorů - Hodgkino va choroba

vypětí

přechodn é

Léčba : většinou

není nutná, po

Trombocytóza v periferní krvi

odstranění

nebo

léčbě

prvotní

příčiny

tromb o-

cytóza vymizí.

Trombocytopatie u Iymfoproliferativních onemocnění • Příčina: některé nemoci produkují patologické bílkoviny, které se n ásledně mohou vázat na membránu krevní desti čky. Může docházet k poškození membrány, eventuálně sterické zábraně, která neumožní krevní desti čce p lně rozvinout s v ůj funkční potenciál. Trombocytopatie při anémii • Příčina: toxické látky a metabolické splodiny vznikaj ící ňují funkci krevních de stiček

destiček

•

urémii ovliv-

4.1.2.3.2. TROMBOCYTEMIE U trombocytemie jde o trvalé zvýšení počtu trombocyt ů (většinou na hodnoty 600- 1000.109/1, někdy i vyšší) vyvolané myeloproliferativním procesem. Trornbo cytemie se vyskytuje : • u chronické myeloidní leukémie (zejména v počátku onemocnění) • u pravé polycytémie • u esenciální trombocytemie - přetrvává nadprodukce trombocytů

o

Poléková trombocytopatie • Příčina: účinkem některých l éků dochází k utlumení, nebo poškození funkcí krevní des t ič ky. Mezi tyto léky se řadí: cytostatika, vysoké dávky antibiotik, G11tipyretika (aspi rin), analgetika • Klinické proje vy: drobn á krvácení s tvorbou petechií a výraz nější krvácení např. po úrazech.

Blíže o této problematice viz " Laboratorní hematologie v piehledu II - Ultrastruktura. fun kce.fyziologie a patofyziologie krevních b uněk" (kapitola: Mye lo prolifera tivni stavy).

4.1.3. Koagulopatie

U trombocytozy jde o sekundární zvýšení počtu krevních desti ček (obvykle na hodnoty 400-600.10 9/1, ale mohou se pohybovat až kolem I 000.109/1). V kostní dřeni se větš i nou nachází zvýšený počet megakaryocytů .

Úloha plazmatického koagulačního systému Výsledkem aktivace plaznuuickycb koagulačních faktorů je vytvoření stabilního fibrinu . Fibrin vytv áří fibrinovou s íť na tromb ocytární matrici, kterou tím zpevňuje . Vznik stabilního fibrinu je výsledkem vzájemného pů sobení koagulačních plazmatických protein ů . Přirozené inhibitory koagulace slouží ke zpomalení nebo zastavení koagulačního proce su, lokalizaci cévního poškození a chrání nepoškozené cévy proti trombóze. Snížené zastoupení nebo případné abnormality v moleku lách některých složek mohou vést ke koagulopatii. Koagulopatie jsou krvácivé stavy, u kterých je příčinou krvácení snížená kon centrace nebo aktivita plazmatických koagulačních faktorů . Mají většinou typický klinický obraz, projevují se spontánním krvácením předev ším do tkání a k ů že a tvoří se hematomy č i sufúze. Stupeň krvácení závisí větš i nou na poklesu koag u lač n í aktivity faktoru. Při výraz-

170

l 7l

4. 1.2.3. Trombocvtóza. trombo cytemie Trombocyt ázy a trombocytemie js ou stavy, u kterých se nachází zvýšené krevních desti ček v obvodové krvi.

počty

4.1 .2.3.1 . TROMBOCYTOZA

ném poklesu dochází k těžkým krvácivý m projevům, jinak bývají krvácivé proje vy mírn ěj š í pov ahy, čas to se projeví pouze při chirurgickém výkonu neb o p oranění. Diagn óza se stanov í přímým vyšetřením hladiny faktorů . Při terap ii se větš inou pod ávají krevní deri vát y.

Koagulopatie se nachází

při:

ned ostatku , či chyb ěn í jednoho neb o několika hemoko agul ačn íc h při výskytu koagu lačn ích faktorů s od lišnou mol ekul ární stav bo u při zvý šených hladinách inhibitorů

• • •

fak torů

krvácen í závisí větš i no u na poklesu k o agulačn í akti vity faktoru. Pii výrazném poklesu dochází k těžkým spontánním krvácivým proje vům, jinak bývaj í krvácivé projevy (podle hladiny koagula čn í aktivity fa ktoru) m írn ější povahy, čas to se projeví pouze p i"i chirurgickém zákroku. nebo poran ění. O Di agn óza se stanov í přím ým vyšetře n ím hladiny faktoru . Při léčb ě se v ětš inou pod ávají krevní deri váty. O

Stupe ň

Rozlišujeme koagulopatie: O vro zen é O získa né

4.1.3.1. Vro zen é koagu/opatie Vrozená absence většiny koagulačních faktorů je spojena s krvácením. Pouze ned ostate k nebo funkčn í defekt prek alikreinu a F XII nebývá spojen s klini cky nápadn ým krv ácen ím a dokonce se proj eví predi spozice k trombóze. V ROZENÉ DEFEK TY KOAGULACNí CH FA KTO RŮ JSOU POMĚRNĚ VZACNÉ A TÝKAJí SE VĚTSINOU J EN JED NOHO FAKTORU.

Z vrozených koagulopatií j sou n ej č as těj š í hemofilie A a B , které před stavují zhruba 95 % všech vrozených krvácivých stavů pla zmatického pů v odu (he mofílie A 85 %, B 10-12 %).

4.1.3.1.1.

H EMOFILIE

Odvozen o od řeckých slov haima - krev, fil ia - náchylnost, jinak řeče no " náchylnost ke krvdcenťř, Hemofilii jako diagno stickou jednotku poprvé popsal americký l ěkar Otto v roce 1803 (Th ompson a Chen, 1993) . Hemofilie je nevyléčiteln é onemocněn í, které provází lidstvo ji ž od jeho rann ěho vývoje. První zmínku o hemofilii nacházíme ji ž v 5. století p o Kristu v babylonském talmudu (Cahill a spol., 199 7). Ve st ťedověku pak zejména šlechtické rody, u kterých docházelo k minimálnímu mísení populace. trp ěly touto chorobou.

172

Zajímavý j e p iťb ěli britské královské rodin y začín ající král ovnou Viktorií (181 9-1901 ) j ako pťenaše č­ kou a zasahující další evropské královské rodiny. Královna měla jednoho h emofilick ěh o syna a j eho dcera rovněž j ednoho h em ofilick ěh o syna. D vě dcery královny Viktorie byly pienaše č­ katni a měly h emofilick ě syny a vnuky. Pravnuk králo vny Viktorie, syn ruského cara Mikuláše ll, ca revič Alexej tr- K.ooI . . . . _..-- -=---. pěl těžkou hemofili í. Hemofiliky a p ie Britská královská rodina (ve st ře d u královna Victorie) n a še čky z rodu královny Viktorie má mezi svými bezp rostiedn ůni p ie dky i současný španělský král Juan Carlo s. Hemofilie se vyskytuje po celém světě , nebyla zji štěn a rasov á záv islost. Ještě ve 40 . letech našeho století byla průměrná doba života hemofiliků 16,5 roku a byli nemocí těž­ ce invalidizováni. Prognóza hemofilie se začala měnit k lepšímu v 50 . letech minulého století, kdy byly zahájeny první pokusy s léčbou plasmou a později s koncentráty F VIII a F IX, zvláště pak v 60. a 70. letech, kdy začala průmyslová výroba těchto preparátů.

Od roku 1952, kdy byla zjištěna podstata hemofilie rozlišujeme: O hemofilii A (vroz ený nedostatek nebo funkční nedo statečnost F VIII) O hemofilii B (vrozený ned ostatek nebo funkčn í nedo statečnost FIX) Klinická manifestace Klinické projevy hemofil ie A i B j sou téměř toto žn é. Obě o ne m oc ně ní j sou ch arakterizován a zejmén a spo ntánními, opakovanými a protrahovan ými kr váci vými stavy . Bez správ ně vo lené l éčb y vede krv ácení do kl oub ů a svalů ke vzniku de generativní ch kloubních z měn tzv. progresivní artro pa tii a k os labení (atrofii) svals tva zejména končetinového. S krv ácivými příhodami se setká me u těžkéh o hemofilika n ej častěji už v prvém roce života. Do tří let věku se obvykle proj eví kloubní krv ácení. Kolísání hladin koagulačních faktorů u h emofiliků je běžné. Me zi faktory, které mohou ovli vnit tenden ci ke krv ácení mů že p atřit i emo ční a fyzický stres . D ěti krvácejí méně než dos pěl í. Krvácení z pupečníku nebo mozkové krvácení bezprostředně po narození j sou známkou velmi nízk é hladiny faktoru VIII.

HemofiIické defekty Hemofilie se kla sifikuje podle zbytkové aktivity defektního koagulačního faktom na hemofilii lehkého , s třed n í ho a těžkého stu p ně : • těžké formy (F VIII < I %, FIX < 2 %) Při těžkém hemofilickém defektu je hemost áza n edo state čná i pii nepatrnych 173

• •

úra zech a poraněních. Postižení jedinci trpí krvácením do kloubů , svalů, gastrointestinálního traktu a centrálního nervového systému. stiedniformy (F VIII: 1-5 %, FIX: 2-6 %) Středn ě těžké formy se projevují klinicky méně častým spontánním krvácením lehké formy (F VIII: 5-25 %, FIX: > 6 %) U lehčích případů se projevuje zvýšená pohotovost ke krvácení jen po t ěžkych poraněních a úrazech , popř. po operačních zásazích, např. po extrakcích zubů.

o

Z celko vého množství nemocnycli s hemofilií jich piibliin ě 50 % trp í hem ofilií stiedniho až těžkého s tupně, která vyžaduje léčbu n ěkolikrát ročně až n ěkolikrát m ěs íčn ě. U t ěžkych h em ofilik ů se on em ocn ění objevuj e ji ž v raném dětství, vět­ šinou do I roku života. Stiedn ě těžký stupe ií se objevuje v časném obdo bí dět­ ského věk u . Leh čí stupeii se objevuje většinou až po traum atu. O Prognóza zejména u t ěžkych f orem neni piiznivá, dochází ke krv ácení. Nejčas­ těj ši j e intrakranidlni krv ácení - j edna tietina všech úmrtí (Hemophilia, 199 7). Dalším i oblastmi vzniku maligního kr vácení j e hltan a bii šni dutina. Genetický základ hemofilie Hemofilie A i B jsou choroby s gonozomálně recesivním typem zané na pohlavní chromozóm 23 a to na chromozóm X.

o

•

•

dědičnosti

vá-

Geny p ro f akto ry Vll1 a IX j sou uloženy na vzdálenějším konci delšíh o ram énka chromo zómu X v pásech Xq 28a a Xq 27.1 (Scharrer a spo l., 1999). Gen pro FIX je lokalizován na dlouhém ram énku X chromozom u, zatímco gen p ro F Vlll j e um ístěn blíže k telom ěie chromozomu X. Žena: XX - zdědí-li žen a defektní chromozóm je jeden chromozóm z páru nefunkční eX), ale druhý (X) stačí pokrýt potřebu F VIII - ženy JSOll pienaše čka­ mi a chorobou samy netrpí. Muž: xy - zděd í-li mu ž defektní chromozóm (X) , nemůže produkovat F VIII anebo jej produkuje v men ší míře - rozvine se hemofilie.

Žen y jsou přenašečkami onemocnění a mohou mít ojediněle zvýšenou tendenci ke krvá cení při nízké koncentraci F VIII a IX. Pro diagnostiku hemofilie má zásadní význam rodinná anamnéza, přesto je asi 30 % nemocných s deficitem F VIII bez pozitivní rodinné anamnézy (sporadické hemofilie). Některé

o

Otec: zdráv/XY), matka: pienašečka (XX). Rodí se polovina zdravých s y n ů a dcer a polovina synů j sou hemofilici a polovina dcer j sou přenašečkami. O Otec: hemofilik (XY), matka: pienašečka (XX). Vzácná kombinace, většin o u k ní nedo chází vzhledem k n edoporučení početí v tako výchto p ťipadech. Léčba: Během posledních 20-30 let se léčba pacientů změnila. Možnosti léčby se rozšiřovaly od pou žití čerstvě zmražené plazmy (ČZP), kryoprecipitátu, přes vysoce purifikované plasmatické koncentráty faktorů (VIII a IX) až k rekombinantním formám. Díky této účinné léčbě se prodloužila dé lka života pacientů na průměr v populaci. U těžkých hemofiliků se v dětství používá preventivní léčba koncentráty faktorů . Náhradou postižených kloubů můžeme dále zlep šit kvalitu život a těchto nemocných.

Inhibitor II pacientů s hemofilií Potenciálním rizikem náhrady koagulačního faktoru je tvorba alloprotilátek (in hibitoru) Tato komplikace se vysk ytuje u 7-8 % nemocných s hemofilií A a u 2-5 % nemocných s hemofilií B (Scha rrer a sp ol., 1999). Jedná se většinou o protilátky typll IgG . Imunologický mechanismus potencující tvorbu inhibitoru nebyl dosud nalezen (Shapiro a Rajagopalan, 1996). Léčba pacientů s přítomností inhibitoru je obtížnější, neboť tradiční léčba náhradou koagulačního faktoru je částečně nebo zcela neúčinná. Hladiny inhibitoru j sou kvantifikovány pomocí mezinárodně standardizované jednotky - Bethesda Unit (BU). Výpočet titru je prováděn v BU (Kasper a spo l., 19 75). I BU/ml plazmy v yjadřuje 50 % zb ytkové akti vity F VIII nebo IX po dvouhodinové inkubaci při 37 "C. Hladina inhibitorů u větš i n y nemocn ých výrazně kolís á, č as to až k nulovým hodnotám. Při nové léčbě se vžd y rychle zvyš uj e. vzácn ě může objevit i u nehomofilicky ch pa cientů. Mlu vím e pak o tzv. získaném inhibitoru. Získaný inhibitor j e stav, pii n ěmž se u dop osud he mostaticky normálních osob vyvine tvorba inhibitoru koagulačníchfaktorů (vět­ šinou spíše auto-, než alloprotilátek). Objevuje se jen v n ěkolika málo piipadech/milion ob yvatel. 10 % nemocnycli se získaným inhibitorem umírá v pr ůběhu 1 roku (Ha y, 1998). P ťičinu vzniku získaného inhibitoru se podati odhalit asi u 50 % nemocnych. Piibli žn ě ve 20 % piipadů trpí pa cienti autoimunitním onemocn ěním nebo sys témovým on emocn ěním pojiva. v 7 % se na chází maligní on emocn ěn í, u 6 % netno cnyclt nastává vývin inhibitoru v so uv islos ti s probíhající farmakoterapií a u dal ších 7 % se vyv ine získaný inhibitor p o porodu (Gree n a Lechner; 1981 ).

O Inhibitor se

Nemocní s hemofilií by m ěli být sledováni v centrech pro hemofiliky, ve kterých je možná dokonalá diagnostika i odpovídající terapie.

možné kombinace

O Otec : hemofilik (XY), matka: zdráva (XX). Synové nej sou hemofilici. Dcery sa my nekrvdci, ale piend ši onemocnění na polovinu svých syn ů (stanou se hemofiliky) a na polovinu svýc h dcer (stanou se piena še čkami - p řenáší hemofilii stejn ě jako j ejich matky) - rodí se zdra ví synové a přenašečky. 174

KAŽDÝ HEMOFILIK BY MĚL NOSIT U SEBE PRŮKAZ S OZNAČENíM KREVNí SKUPINY A DOPORUČENÝM LÉČEBNÝM POSTUPEM!

175

HEMOFILIE A Jde o dědi čn ou chorobu s recesivním typem d ědi čno sti , vázanou na pohlavní chromosom 23. Gen pro F VJJJ obsahuje 186 kb (kilob ázi), jde o pom ěrn ě dlouhý gen a nezbytná genetická inf ormace j e obsažena v 9 exonech (Scharrer a spo l., 1999).

Příznaky u hemofilie B jsou podobné jako u hemofilie A (Ca/lil a spo l., 1997). Krvácení m ů že být stej ně závažné, záleží na tíži hemofilie (Thompson a Chen, 1993).

Příčina onemocnění:

u hemofilie B chybí

ko agulační

Výskyt: 4-5krát méně častý , než hemofilie A (I Příčina onemocnění:

Rozlišení hemofilie A - a A + • Hemofi lie A - (hladiny F VJJJ:C a F VJJJ:Ag jsou sníženy) • Hemofi lie A +(hladina F VllJ.·C je snížena a hladina F V1JJ.·Ag j e normální) případ

ch y běj íc í ho

Laboratorní nález • APTT: prodloužený čas (při poklesu F VIII pod 25 %) • Srážlivost krve: prodloužený čas (asi u 30 % vyše ttovanych] • F Vll1:C (fu nkční koagula čn í složka molekuly faktoru Vlll) - snížená hladina • F Vll1:Ag (mo lekula F Vll1 posuzovaná jako antigen) - sníže ná (A-) nebo normální hladina (A + ) O Hladina faktorů zů s tává během života p iibli žn ě na stejné úrovni (po léčbě časem klesne na hodnotu pied léčbou).

s u bstitučn í

L é čb a : Léčba

hemofilie je s u bs t i tuč n í (nahrazuje se pokles F VIII) a p odpůrn á . K výpo čtu pot řebn é dávky faktoru se používá jednotka koagul ačního faktoru, která je definována jako množství faktoru obsaženého v jednom ml č ers tvé plazmy.

o

(vylo učení přeno su i nfekč n íh o

50 000-100 000 obyvatel).

nebo parazitár-

F Vll1 má krátký biologický polo čas (8-12 hodin), proto je nutné dávky opako vat, hla vn ě p ťi perzistujicim krvácení.

HEMOFILIE B

proj evů

je

Laboratorní nález • APTT: prodloužený čas • F IX: snížená hladina Léčba: Léčb a

na 10 000-20 000 obyvatel (WFH, 1999 )

Substituce se provádí: • čištěným koncentrátem F VII I • rekombinantu ůn faktorem VIII ního agens)

případ na

Klinický obraz je podobný jako u hemofile A, ale závažnost krvácivých menší. V do spěl o sti se četno st krvácivých epizod zmenšuje

O Vrozený nedostatek F VIII - hemofilie A O Funkční porucha F VIII - hemofilie A +

Výskyt: I

aktivita faktoru IX.

4.1.3.1.2.

je podobná ja ko u hemofil ie A. Podávají se faktoru.

přípravky

s dostatkem

VON WILLEBRANDOVA NEMOC

VON WILLEBRANDO VA CHOROBA První p Npad nemoci by/ popsán von Willebrandem v 1: 1926 na A /andských ostrovec/I. Von WiUebrandova nemoc (vWch) je au tosomál ně dědi čn é o ne m ocně ní , které postihuje obě pohlaví, ale čas těji ženy. Nep atří mezi č is té koagulopatie. Stav je ro vn ěž provázen krvácivými projevy. Pro toto onemocn ěn í je typické krvácení slizn i čn í (z nosu - epistaxis). V případě těžkého defektu (při současném snížení F VIII) se přidru ží i krvácení typická pro hemofilii. U žen bývá silné men struační krvácení (dívka u které byla choroba poprvé popsána vykrvácela pii první menstruaci ).

Výskyt: vWch je nej ča stěji se vyskytující vrozené krvácivé onemocnění. Zji šťuj e se u 1,5 až 3,5 případů II 000 obyvatel, většinou bez klinických proje vů. Význ amn ěj ší krvácení asi u 125 případůll milion obyvatel , z toho léčbu vyžaduje n ěco kolem 6,5- 13 případů/milion. Tě žký typ vWch je p oměrn ě vzácný 0,5-3 případy/milion. Příčina onemocnění: Příčinou onemocnění je defekt (kvantitativní, fu nkč ní) adhezivního glykoproteinu - von WiIlebrandova faktoru (vWF), p ři kterém dochází k poruše funkce krevních destiček (nejde tedy o poruchu krevních desti ček) . Je narušena funkce vWF vprimární hemostdze a to jak adheze, tak i agregace krevních destiček. Sekundárně dochází ke snížení schopnosti vWF vázat koagula čni faktor VIII. Podle stupně snížení hladiny vWF a změn y jeho molekuly se může měnit charakter a průb ěh onemocnění.

O značo vaná také jako Christma sova choroba podle prvního známého pacienta s tímto typ em hemofilie (Biggs a spol., 1952). Gen pro f aktor IX má celkem 34 kb a nezbytná genetická inf ormace j e obsažena v 8 exonech (Giannelli a spol., 1997).

Typy von WiIIebrandovi nemoci Krvácivé projevy II této nemoci odvisí od nze postižení vWF a na jeho schop-

176

177

nosti vázat a udržet F VIII. Onemocnění je buď autosom áln ě dominantn í nebo recesivní. Podle snížení koncentrace vWF v plazmě a defektu jeho molekuly rozlišujeme celkem 3 typy von Willebrandovi nemoci: • Typ I (kvantitativní defekt ) - je nej častěj ší, autozom áln ě dominantn ě d ědi čn ý (60- 80 % všech vWch). Jde hl avn ě o sníženou hladinu vWF bez patrn ějšicli zm ěn ve strukturách multitn er ů . Dle relativního zastoupení multimerů jej d ělíme na podtypy la a lb. • Typ II (kvalitativní defekt) - funkční nedostatečn ost velkých multim erů. Děd i čn ost je dominantní i recesivní. Rozlišujeme 4 podtypy těchto multimerů IIa, lIb , IIc, lId : • Krvácivé projevy u subtypu IIa mohou připomínat krvácení u těžkého typu I. • U lIb jsou zachovány velké multimery v de stičk ách . • Subtyp IIc je charakterizován funkční nedo statečností velkých multimerů v pl azmě i destičkách. • Typ III ( těžký kvantitativní defekt ) - vyskytuje se jen zříd ka a je nejtěžš í. Je charakterizovaný absencí multim erů vWF. Nachází se u n ěj i kloubní krvácení.

Podle stupn ě snížení hladiny vWF a zm ěny jeho molekuly se může měnit charakter a průběh on e m o c n ě n í. Patofyziologická klasifikace von Willebrandovi nemoci (Sadlet; 1994) bere v úvahu patofyziologii defektu (typ mutace vWF) a dělí se rovněž na 3 typy. s u b en d ot elové struktury endotel

:---;;;~~===§§::::~;:= :::=; -'@ - =-----' I @ I @

r""1

membrána krevní destičky

Klinické projevy O Sli zni čn í krvácení (krvácení z nosu, dásní, po extrakci zubu) O Kožní (hematomy, peteclzie) O Krvácení při poranění (ob tížně stavitelné) O Krvácení typická pro hemofiliky (vyvolaná v tomto piipad ě sníženou schopností vWF vázat F VlIl)

•

Testy zaměieně na detekci vWF: FVIII , RiCo (ristocetin kofaktor ), RIPA (agregace po ristocetinu ), vWF:Ag, multime ry vWF - patologické hodnoty

Léčba: Léčba je závislá na typu vW nemoci a klinických proje vech krvácení. Podává se koncentrát s obsahem vWE Prognóza je při zvládnut í krvácivých komplikací dobrá. Biologický poločas vWF je 6-8 hodin.

Získaná von WilIebrandova nemoc Získaný von Willebrandův syndrom je vzácné získané onemocněn í, svým i projevy a obrazem podobn é vrozené vW nemo ci, ale s negati vní rodinn ou a osobní anamn ězou krvácivé cho roby. Poprvé byl tento syndrom popsán v r. 1968 u n em ocn ěh o se systémovým Lupu s erythematodes. Jde buď o sníženou tvorbu nebo piitomnost protilátek proti vWF. Příčina

získané von WilIebrandovy nemoci: zvýšená proteolýza (myeloproliferativní stavy), zvýšená spotřeba vWF, či jeho vyvázání na povrch maligních buněk tvorba protilátek (nejčastěji typu IgG), které: • vyvolají funkční poruchu vWF • zapří činí vychytávání vWF a tím snižují aktivitu FVIIIRCo • váží se na vWF a urychlí jeho odstraňován í z cirkulace. Laboratorní testy mají obdobné hodnoty jako u vrozené vWch.

• • •

Získaná forma von WilIebrandovy choroby se nachází především u: • Autoimunitních o nemocněn í (SLE, hypotyre óza, sklerodermie) • Nádorových onemocnění (myeloproliferativní a Iymfoproli ferativní onem o cn ění, solidní tumory) • Kardiova skulárního onemocnění (aortální stenóza, prolap s mitrální chlopně) • Angiodyspl ázie v GIT Výskyt: nejčastěji jsou postiženi lidé starší 60 let, více muži než ženy (3:2). D ěti jsou postiženy jen vyjí meč ně . Léčba: Většinou

l éčí

základn í onemocnění a

případné

akutní krvácení

Pseudo von WilIebrandova nemoc (Destičkový typ vWch) Tato forma je zapříč i ně na defektem GP lb/lX. Změněný GP váže multimery vWF a um dochází k jejich rychlému odstraněníz plazmy a ke zvýšené spotieb ě destiček. Vzniká lehká trombocytopenie a v obvodové krvi se nachází velké destič­ ky. Laboratorní nález je prakticky totožný s typem lIb u vWch .

4.1.3.1.3.

Laboratorní nález • APTT: prodloužený čas • Krvácivost: prodloužený čas

se

DEFEKTY OSTATNÍCH FAKTORŮ

Jsou to velmi vzácné, většinou autozom áln ě recesivnědědičné choroby. Stupeň krvácení závisí na stupni poklesu ko ag u lač n í aktivity faktoru, Při výrazném pokle178

179

su aktivity jsou nemocní postiženi těžkými krvácivými projevy. Při vyšších aktivitách většinou krvácivé projevy chybí nebo jsou jen velmi mírné. Přesnou diagnózu lze stanovit jen cíleným vy šetřením jednotlivých faktorů. Kauzální léčba neexistuje, ke zmírnění projevů onemocnění se podávají koncentráty daného faktoru.

Laboratorní nález • APl T: prodloužený čas • PT: prodloužený čas • FV: snížená hladina

DEFEKTY FIBRINOGENU

DEFEKT FVn Jde o autosomálně recesivní vrozené onemocnění z nedostatku F VII (pokles pod 10 %). Objevuje se zde náchylnost ke krvácení ze sliznic. Vyskytuje se v podobě krvácení z nosu, u žen jako nadměrné menstruační krvácení.

Defekty fibrinogenu • Chybění funkčního fibrinogenu (afibrinogenémie) • Snížen á hladina fibrinogenu v plasmě (hypofibrinogenémie) • Pozměn ěná funkce molekuly fibrinogenu (dysfibrinogenémie).

Laboratorní nález • PT: prodloužený čas • FVII: snížená hladina

Laboratorní nález • APTT: prodloužený čas • PT: prodloužený čas • TT: prodloužený čas • Fibrinogen: snížená hladina, nebo chybí

o

U afibrinogen

ěmii nemů žem e koagulační čas

DEFEKTFX Jde o autosomáln ě recesivní dědi čné onemocnění z nedostatku F X (pokles pod 10 % ).

zachytit (netvoii se fibrinov ě vláknoJ.

Léčba: přípr avky lidského fibrinogenu nebo čerstvě zmraženou plasmou (ČZP).

Vrozená afibrinogenémie Je velmi vzácné onemocněn í, které zejména v mladším věku končí Obvykle i rodiče postiženého dítěte mají sníženou hladinu fib rinog enu.

fatálně .

Dysfibrinogenémie Hladina fibrinogenu (jako bílkoviny) je většinou normální, ale jeho fukce v hemostáze je pozměněna . Byly pop sány již více než dvě desítky variant molekuly fibrinogenu ( ozna čují se podle m ěst, kde byly poprv é zjištěny - Baltimore, Paris, Oslo a jin é). DEFEKTF u Jde o autosomálně recesivní vrozené nu (pokles pod 40 %).

onemocnění

s poruchou molekuly protrombi-

Laboratorní nález • APTT: prodloužený čas • PT: prodloužený čas • FX: snížená hladina DEFEKTFXI Byl diive n ěkter ymi autory n esp rávn ě nazýván hemofilie C. Objevuje se velmi zi idka. Na rozdíl od hemofilie A se vyskytuje jak u mUŽLi, tak i u žen a to hlavn ě u semitské populace. Jde o autosomálně recesivní vrozené onemocnění z nedostatku F XI. Krvácivé projevy jsou mírného stupně, choroba postihuje i ženy a je značně geograficky i rasově omezená. V našich podmínkách se prakticky nevyskytuje.

Laboratorní nález • APTT: prodloužený čas • F Xl: snížená hladina Léčba:

podávání

čerstvé

plasmy

DEFEKT FXn Nedochází k projevům zvýšené krvácivosti, neboť krevní desti čky mohou aktivovat F XI přímo na svém povrchu. Tyto stavy nevyžadují léčbu.

Laboratorní nález • APTT: prodloužený čas • PT: prodloužený čas • Protrotnbin: snížená hladina DEFEKT FY Jde o autos omáln ě recesivní vrozené onemocnění z nedostatku FV (pokles pod 15 %). 180

Laboratorní nález • APTT: prodloužený čas • Test konzumpce protrombinu: zkrácený • F XII : snížená hladina 181

čas

VROZENÝ DEFEKT F XIII Jde o a u toso mál ně recesivní dědi čn é o nemoc ně ní z nedostatku F XIII - projevuje se jen u h om ozygotů (pokles hladin y F XIII pod 3 %). Krvácení se objev uje opožděně (až po 24 hodin ách). Heterozygoti nebývají vě tš i nou výraz ně poškozeny je n v ojed i nělých p říp adech se u žen mohou objev it spontánní potraty. Podle toho, které podjednotky jsou narušeny dělí se na 3 typy: • Typ I - kombinovaný deficit podjednotek A i B • Typ II - chy bí podjednotka A • Typ III - chybí podjednotka B P říčina onemocnění:

Nestabili zované fibrinové koagulum podléhá odbourává ní plasmin em d říve , než dojde k zahoje ní rány. Dochází k rozpadu rány a ke komplikovanému hojení.

Laboratorní nález • •

F X/ll: sn ížená hladina Ostatní koagulační testy bývají normální.

Léčba : pře vody

koncentrátu F XIII

4.1.3.2. Získan é koagu/ovatie N A ROZD íL OD VROZENÝCH SE ZíSKANÉ KOAGULOPATIE VYZNACUJí SNí2 ENíM NE J EDNOHO , ALE ZPRAVIDLA CELÉ SKUPINY KOAGULACNíCH FAKTOR O.

Získané koag ulopatie provázejí poruchy j atern ích funkcí, poruchy s třev n í resorp ce, po ruchy transportu ž l uče nebo některé otravy. Jsou čas tější než koagulopatie vrozené. U těc h to s tavů je možné vhodnou l éčbou základního one mocně n í dosáhnout u vě tši ny nemo cných vymizení přízn aků koagulopatie.

4.1.3.2.1.

PORUCHY RESORB CE A VY UŽ ITÍ VITAM INU

K

Poru chy resorbce a využití vitaminu K vedo u k n ed o st atečné syntéze koagulač­ ních faktorů závis lých na vitaminu K. K vitamin se podílí na tvorb ě fakto rů II, VII , IX, XI tím , že zpros tředk uje karboxylaci glut am ové kyselin y v y-oblast i. Ned ostatečn á syntéza faktorů závis lých na vitaminu K v jaterní bu ňc e mů že být n ej č as těji způs ob en a:

• • •

Destrukcí nebo ji ným poškozením jaterní bu ňky Poruchou tran sportu K vitaminu při obstrukč n í žloutence Poruchou resorpce K vitaminu ve střevě

o

Vitamin K člověk získává j ednak Z pot ravy, jednak jako p rodukt své normáln í bakteriáln í stievni flory. Ke vstie bdvdni vitaminu K Z obou zdrojů je potiebtui piůomnost žluči a zdravá střevn í sliznice. Proto se pii delším trván í p oru chy vstiebdvdni vitaminu K (onem ocněn í žlučn íku a tenkého stieva) m ů že objevit koa gulopatie ze snížené syntézy koagulačních fakto rů i pii zdravýc h játrech. PN nedostatku vitaminu K v p otravě zp ravidla koagulopatie nevzniká, protože vitamin K je normáln ě synte tizován bakteriální stievni fló rou. K avitaminóze m ů že dojít, je-li so uča sně potlačena tvorba vitaminu K ve s tievě (antibiotika, sulfo amidy ). Látky záv islé na vitaminu K jsou piitonuty v celé iad ě tkání - kosti, ledviny, pankreas , plíce, pla centa . Nejlépe pro studovány j sou plazmatické koagula ční f aktoI )' závislé na vitaminu K. O Pii p ostižení j aterní bulíky (napit hepato celul árni ikterus) nen i tran sp ort K vita minu k jatern í buiice na rušen, jaterní buňka jej však nedovede utilizovat a do chází k p oklesu na vitaminu K závislých koagula čn ích fakto rů . Kromě faktorů

vznikajíc ích v jaterní buň ce za p řítomn osti vitaminu K se m ů že jater snížit i hladin a faktorů , které vitamin K při své sy ntéz e nevyžadují (F V, VIII, fibrinogen a jiné) . Příčinou pokle su je jejich zvýš ená spo třeba v procesu chorobné aktivace srážení krve při pokročilém a těžkém onem ocnění j ater.

při o nemoc ně ní

PŘÍ CINY ZÍSKA NÝCH KOAGULOPATIÍ Faktory s poru šenou funkcí - defektní fakto ry

Laboratorní nález • • Zvýšení fibrinolytické aktivity

Zvýšená hladina

APTT: prodlou žený čas PT: p rodloužený čas

Nedostatek faktorů - poruch a syntézy hílkovin - zvýšená potřeha faktorů (DIK)

Léčba: U krvácivého stavu prov ázejícího těžká hepatocelul ární po stižení, kdy je nutná rychlá úprav a hladin koagulačníc h faktorů , je výhodn ěj ší substituce koa gulačních faktorů transfúzními přípravky (CZP, koncentrát faktorů protrombinového komp lexu ). U maloab sorpčního syndromu a bili árního ikteru se podává K vitamin (Kanavit). Vzhledem k biologickému poločasu na vitaminu K závislých faktorů lze o č ek ávat úpra vu faktorů protrombinového komplexu za 12- 24 hodin .

182

183

inhibitorů

4.1.3.2.2. AUTOIMUNITNÍ A ALOIM UNITNÍ U

n ěkterých

onemocn ění

vě tš i n o u

KOAGULOPATIE

IKoagulační

I~

interního charakteru, faktor mohou n ěkteří jedinci vytvoři t protil átku proti některému IgC z vlastních koagulačních fakto- ' - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - ' rů . Mluvíme pak o p řítomnosti cirkulujiciho antikoagulans. Předpokládáme, že cirkuluj ící antikoagulancia vznikají přev ážně mechanismy imunologickými, větši n o u však neznáme pře sn ý mechanismus jejich vzniku. Jako cirkuluj ící antikoagul ancia se označují látky proteinové povahy, ves m ěs imunoglobuliny třídy IgG, které omezují funkční schopnost koagul ačních faktorů . Nejvíce se vyskytují u nemocných se systémovým onemocn ěním pojiva, u myelomu a u Iymfoproliferativních chorob. Inhibiční účinek může být namířen proti kterémukoliv ko agul ačnímu faktoru. Historicky nejznáměj ším je cirkulující antikoagulans proti faktoru VIII:C - vzniká stav získané hemofilie A. Rovn ě ž nemocný s vrozeným defektem n apř. hemofilik A může při opakovaných trasfúzích vytvořit protilátku proti F VIII jiného jedince. V tomto případě jde o koagulopatii získanou aloimunizaci. Nemocní v přítomnosti těchto imunoglobulinů mají krvácivé projevy různé intenzity, od snadné tvorby modřin , až po krvácení, které se objevuje po chirurgických výkonech.

Tato skupina autoimunitn ích koagulopatií velmi špatně odpovídá na substiProtilátky vyvazují pří slu šn ý fun kční faktor a jeho hladina v plazme se

tu čn í l éčbu .

snižuje: Přidaný

KRVAcIVÉ STAVY Z JINÝCH PŘíČIN

Konzumpční koagulopatie (Difusni intra vaskul árni srážení, Diseminovand intravas kulárni koa gula ce - DIK, diseminovand intra vaskul árni fo rmace fibr inu - DIFF, Dissemin ated intra vascular coagulation - Dle)

Diserninovan á intravaskulární koagulace (DIK) před stavuje získanou koagul ačn í poruchu , při které dochází k významné aktivaci hemostázy s tvorbou nitroc évních mikrotromb ů , spotřebě koagulačních faktorů , aktivaci sekundární fibrinol ýzy a tendenci ke krvácení nebo významnému klinick ému krvácení. DIK se projevuje: • poklesem řady koagulačníchfaktorů a krevních destiček z důvodu jejich zvýšené s p otřeby. Nejcitlivěji reagují krevní desti čky, sníží se jejich počet. • uvolněním velkého množství trombinu , který štěp í fibrinogen . V krvi s pak objevují volné monomery fibrinu, které lze in vitro prokázat jejich precipitací s etanolem . • poklesem plazmatické hladiny, případně inaktivací inhibitorů krevniho srážení • aktivacífibrinolýzy Příčina onemocnění: Nadměrn á spotřeba

krevních destiček a plasmatických koapo dobu chorobné aktivace hemostázy. Aktivace bývá vyvolána záněty, rozpadem tkáně, poruchou krevniho oběhu. Syndrom DIK je doprov odným je vem závažných stav ů v řadě lékařských oborů . Klinicky může být němý , většinou se setkáváme s těžkými krváciv ými nebo trombotickými projevy, často s obojím s o uč as ně. Zejm éna u nemocných v šokovém stavu pů sob í DIK nepřízni vě svými patofyziologickými mechan ismy na rozvoj krvácivého stavu se s oučas no u blokádou mikrocirkulace a blokádou retikuloendoteliálního systému. gulačn ích faktorů

Laboratorní nález • A PTT: prodloužený čas • PT: prodloužený čas • TT: prodl oužený čas Léčba:

4.1.3.2.4.

faktor + protilátka - - - - -...~~ [faktor. protilátka] Komplex j e následn ě vyvázán MFS

Krvácivý stav může nastat při předávkování antikoagulancii kumarinového typu nebo p ři otravách některými jedy. Krvácivé stavy může vyvolat i přad ávkov ání heparinem . Blíže o kumarino vych preparátech a heparinu viz kapitola: Antitromb otická léčba.

Diseminovaná intravaskulární koagulace patří k poměrně častým poruchám hemostázy. Vzniká nejčastěji při: • t ěžkych. infekčních onemocněních různyct: orgán ů (sepse - endotoxíny). Poškození cévní výstelky drobných cév v nemocných orgánech vede k aktivaci srážení krve v těchto cévách a ke vzniku mikrotrombů . Masivní vznik mikrotrombů je příčinou n adměrné spotřeby koagulačních či nitel ů . • uvolnění velkého množství tkdiiověhofaktoru do krevniho oběhu. Příčinou bývá chorobný rozpad velkého množství buněk ( p ři leukémii a při nádorových one-mocněních, zadržený potrat a jiné). • uvolnění velkěho množstvťfosfolipidů (hemolýza). Po narušení buněčných a nitrobuněčných membrán dojde k uvolnění velkéh o množství fosfolipidů.

184

185

Terapie je závislá na koncentr aci inhibitoru. Při spontánním vymizení inhibitoru není l éčb a nutná, jinak se využívá plazmaferézy a imunosupresivní terapie. Při inhibici faktoru VIII se dnes nejčastěji podává F VIla.

4.1.3.2.3. OSTATNÍ

ZÍSKAN É PORUCHY KOAGULACE

V průběh u DIK r ozlišuj í • Hyperkoagulační • Hypokoagulační • Aktivace fibrinolýzy

někteří autoři

3 stádia:

Po dobu aktivace nitrocé vního srážení krve je úlohou aktivovaného fibrinolytického systému vzniklé tromb y odbourat. Je-Ii j ich mnoho , mů že se tento systém ro vněž vyčerpat.

H y p e r k o a g u l a č n stádium Klinické p rojevy: nemocný nemusí mít žádné potíže, mohou se objevit mikrotrombóz y orgánů, ale i velké trombózy a embólie. í

Laboratorní nález: • APn; Tl, PT v normě (APTT m ů že být i zkrácen) • Trombocyty, fibrino gen: v normě, nebo lehce sníženy • Fibrino vé monom ery: pozitivní • AT: hladina pozvolna klesá

LABORATORNí TEST Y, KTERÉ SE POUŽíVAjí u DIK rsou TESTY ZAMĚŘENÉ NA ZJIŠTĚNí AKTIVAČNíHO PŮSOBENí TROMBINU A PLAZMINU.

AT: pokles F-M: +

Léčba:

í

spotřeby

fak-

torů.

Léčba:

AT: snížen F-M: + APTT: prodloužen PT: prodloužen TT: prodloužen Fbg: snížen Pit: snížený počet

A k t iv a c e fibrinolýzy Aktivace fibrinolytického systému je s o učástí rozvinuté DIK Klinické projevy: následkem aktivace koagulace, v důsledku porušení zp ětnovazeb­ ných a koagulačních mechani smů , dojde k nekontrolované fibrinolý ze. Vyčerpají se všechny faktory a krev ztrácí schopno st se srážet - těžké krvácivé projevy

Léčba:

většina testů neměřitelná

Neměřitelné

hodnoty

antifibrinolytika

testů

Antitrombinová aktivita , jejíž úlohou je vyvázání aktivního enzymu trombinu (zejména působení antitrombin u) se může postupně vyčerpat. FDP naopak svým antipo lymeračním ú č inkem mohou poruchu hemostázy zhoršovat. 186

opatře ní.

vÝVOJ DIK

substituce, heparin

Laboratorní nález:

Terapie DIK je dána určitou strategií a podle klinických druhů a fází oneje možno volit u jednotlivých nemocných individuální taktiku, pokud jde o množství a rychlost podávaných přípravků , délku a intenzitu terapie . Intenzitu terapie ov livňuje mohutnost krvácivé ho stavu a orgánov é dysfunkce. Kauzá lní princip v l éč bě DIK musí být zachován , což v praxi před stavuje širokou škálu l é č eb n ýc h mocnění

H y p o k o a g u l a č n stádium Klinické projevy: objevují se krvácivé projevy v důsled ku zvýšené Laboratorní nález: • APTT: prodloužen • PT: prodloužen • TT: prodloužen • Fibrin ogen: snížen • Trombocyty: sníženy • Fibrin ové monomery a FDP: pozitivní test • AT: snížen • Fakt ory: sníženy

DIK může po stupně procházet všemi stádii, ale mů že mít i akutní průběh a proje vit se ihned krvácivým stavem s praktick y nesrážlivou krví. Diagnóza DIK musí být stanovena rychle , a proto všechny testy, které se k diagno stice DIK používají musí mít povahu statimových testů .

Zánět, rozpad tkáně, porucha koagul. systému

DIK Stad ium I Hyperkoagulační

..-.:J 11 ----. +

r

...."..tII....... HYPOko1agulační

.....MtI

htDh.a

lb." ·~ .......

Mikroa gregáty ..

DIK

Stadium II

~

DIK

Stad ium III Fibr inolytické

,-------('""~

otřeba Učel

~

1\=J

Krev ztrácí schopn ost se srážet (Těžké krvácivé projevy)

187

TDrob c

e ni~

Krvácivé stavy z aktivace primární fibrinolýzy Fibrinolytický systém plní řad u fyziologických funkcí, nejdůl ežitěj ší z nich je š těpen í fibrinu proteolytickým enzymem plazminem, který vzniká aktivací plazminogenu . Fibr inolytický systém udržuje v rovnováze inhibitory plazminu , které snižuj í i riziko degradace systémov ého fibrinogenu . Při fibrinol ýze vznikají š těp né produkty (FDP), které mohou ro vn ěž inhib ovat koagu laci. Výrazn ěj ší aktivace fibrino lytického systému může vést rov něž ke krvácivým projevům. Krvácivé fibrinolytické stavy se zvýšené fibrinolýzy Jde o krvácivé stavy vyvo lané zvýšenou fibrino lytickou aktivitou bez před cho zí intravaskulární tvorb y fibrinu. Vyskytují se poměrně vzác ně. Dochází při nich k aktivaci plazminového systému a lýze fibrin ogenu. Dále dochází k významnému vyplavení aktivátoru plazmin ogenu a součas ně je utlumen antiplazminový systém. Projeví se proteolytický efek t plazminu na fibrinogen a ostatní proteinové koagul ační fakto ry. M ů že jít i o vrozený nedostatek inhibitorů plazminu.

Klinické projevy: aktivace primární fibrinolý zy provází nádorová onemocnění prostaty, pankreatu , plic a stavy po operaci těchto nádorů. Onemocnění se projevuje kožním i s l izn ič n í m krvácením . Vyskytují se přev ážně sufúze a hematomy, nebývají přítomn y petechie , protože nebývá tromb ocytopenie. Laboratorní nález • F ibrin og en: snížen • FDP: zvýše ná hladina v plazmě • Euglobul inovd fibrin olyza: zkrácen ý

H a)', C. R.: Acquired Haemophilia. Baillie-

Cahill, M.R., Colvin, B. T.: Haemophilia. Postgrad. Med. J.. 73, 1997, s. 20 1-206.

re' s Clinical Haematology II , 1998, s. 287 - 303.

Frank, E.: Die essentielle Thrombopenie (Konstit utionelle Purpura-Pseudo-Hamophilie). I. Klinisches Bild. II. Pathogenese. Berlin. Klin . Wochen schr. 52, 1915, s. 45~58 (L), 490-494 (lL) .

Vzhledem ke zvýšené lýze proteinov ých koagulačních faktorů plazminem jsou prod loužen é č as y APTT a PT a bývá snížena hladina antitrombin u. Po odlišení DIK j sou u tohoto onemocnění základním lékem antifibrinolytika. Hemoterapie nebývá větš i n o u nutná.

Hemophilia. First Edition 1997, ed. New York: Chapman and HallMedical, 1997.

Gasser; C; Gautiet; E., Steck, A., Sie be nmalin, R. E., Oechslin, R.: Hamolytisch-urárnísche Syndrome: bilaterale Nierenrindennekrosen bei akuten erworbenen hamolytischen Anamien. Schweitz Med. Wochenschr. 85, 1955, č. 38/39, s. 905-909.

Kasp er; C. K., Aledo rt, L., A roson, D., C OU/lt S, R., Edson, J. R. et al.: Proceedings:

A more uniform measurement of factor VII I inhibitors. Thromb. Diath . Haemorrh. 34, 1975, č . 2, s. 6 12.

George, J. N.: Idiopathic Thrombocytopenic Purpura: Practice Guideline. (ASH): Blood 88, 1996(a), s. 3-40.

Kelton , J. G.: Antoimmune Thrombocytopenia. Educational Semin. lSH -EHA Congress Amsterdam 1998, s. 1-7 .

George, J. N. : Diagnosis, clinical course and management of ITP. Current Opinion. HematoI. 3, 1996(b), s. 335- 346.

Lichtin. A.: The ITP Practice Guideline.

Blood 88, 1996, s. 1-2. Lapě)', J. A.: The platelet glycoprotein lb-IX complex. Blood CoaguI. Fibrinolysis 5, 1994, s. 97

tations and sho rt additions and deletions. 7th edition. Nucleic Acid Res. 25, 1997, s. 133.

Ma)', R.: LeukocyteneinschIiisse. Kasuisti-

Glanzmann. E.: Hereditáre harnorrhagische Thromboasthenie. Ein Beitrag zur Pathologie der Blutplattchen, Jahrb . Kinderheilk 88, 1918, s. 1-42, 113-11 4.

sche Mitteilung. Deutsches Arch. Klin . Med. 96, 1909, s. 1- 6. Modderman, P. w. A dmiraal, L. G., Sonnenberg , A., VOli der Bome, A. E. : Glykoproteins Vand lb-IX form a noncovalent complex in the platelet membrane. J. BioI. Chem. 267, 1992, s. 364

Léčba:

Literatura Bernard, J., Soulier; J. P.: Sur une nouvelle variété de dystrophie thrombocytaire hémorragipare congénitale. Sem. Hop. Paris 24, 1948, s. 3217.

Aldric h, R. A., Steinbe rg, A. G., Campbell, D. C: Pedigree demonstrating a sex Iinked recessive condition characterized by draining ears, eczematoid dermatitis and bloody diarrhea. Pediatrics 13, 1954 , s. 133.

Grein acher; A.: Antigen generation in heparin - induced thrombocytopenia : The nonimmunologic type and the irnmunologic type are dosely linked in their pathogenesis. Semin. Thromb . Haernost., 2 1, 1995, č. l, s. 106-116.

Moschcowitz , E.: Hyaline thrombosis

of the terminal arterioles and capillaries: a hitherto undescribed disease. Proc. N.Y. PathoI. Soc. 24, 1924, s. 21- 23.

Gree n, D., Lechnet; K. A.: A survey of 215

non-haemophiliac patients with inhibitors to factor VIII. Thromb. Haemost. 45, 1981, s.200-203.

Roth , G. J.: Developing re lationships : Arterial platelet adhesion, glycoprotein lb, and leucine - rich glykoproteins. Blood 77, 1991, s. 5

Biggs, R. et al.: Christmas Disease. B. M. J. 2, 1952, s. 1378-1388.

188

2,

Hegglin, R.: Gleichzeitige Konstitutionelle Veranderungen an Neutrophilen und Thrombozyten. Helv. Med. Acta 12, 1945 , s. 439-440.

Gian nel li, F., Green. P. M. , Sommer; S. S. et al: Hemophilia B: Database of point mu -

č as

č.

189

Ru ggeri , Z. M. , Marco, L. D., Gatt i, L., Badet: R., Mo ntgo m ery, R. R.: Platelets

have than one binding site for von Willebrand factor. J. Clin. Invest 72, 1983, s. 1983

Warkellt ill, T. E. , Le vine , M. N., H irch , J. et al.: Heparin - induced trombocytopenia in patients treated with low-molecular weight heparin or unfractionated heparin, N. Eng!. J. Med. 332, 1995, s. 1330- 1335.

Sadlet; J. E.: A revised cIasification of von

Willebra nd Disease. Thromb. Haemost. 71, 1994, č.4 , s . 520- 525. Sliap iro, S. S., Raj agopalan. v.: Hemorrhagic disorders associated with circulating inhibitors. In: Ratnof, O. D. Forbes, C. D. editors. Disorders of Hemostasis, New York, W.B. Saunders Company, 1996, s. 208-225. Scltarret ; t.. Bray, G. L., Ne utzli ng, O.: Incidence of inhibitors in hemophiIia A patients - a review of recent studies of recombinant and plasma - derived factor VIII concentrates. Haemophilia 5, 1999, č . 3, s. 145-154.

Werlh of, P. G.: Cautiones medicae de Iimitandis laudibus et uituperiis morborum et remediorum. Hannoverac: Sumtibus Haeredum Nicolai Foersteri, 1734.

4.2. Trombotické a trombofilní stavy Motto: Plížilo se to pozvolna, hlouběji a hlouběji . . . doprava - doleva - daleko a široko - se sténáním prokleté duše; k mému srdci plíživým krokem tygra. E. A. Poe: Jáma a kyvadlo

4.2.1. Trombotické stavy

Wisk ott, A .: FamiIia rer, angeborener Morbus Werlhofi? Monatsschr. Kinderheilkd. 68, 1937, s. 2 12-2 16.

Trombotickě stavy j sou chorobné stavy, charakterizované příhodami nitroc évního sráže ní (trombóza mi). Před sta vují opak s t a vů krváciv ých, u kterých se hem ostatická rovnováha narušuje opačn ým s měre m .

WFH - World federation of Hemophilia: Glob al Survey on Hemophilia 1999. World Federation of Hemophili a, Montreal, Quebec, Canada 1999

pravděpodobně tkví:

Obecně jejich příčina

• • •

Thotnpson, R., Chen, S. H.: Characterization of factor IX defects in hemophilia B pati ents. Methods Enzymol. 222, 1993, s. 143

V postižení cévní stěny V poru še hemodynamiky Ve složení a funkci krve • V poru še destičkových funkcí • V narušení plazmatického koa- L gulačního systému včetně inhi-

---.J

Virchovova triáda

bitorů

• V narušení fibrinolytických

o

mechanismů

Tuto triádu piičin možného narušení hemodynamiky, které mohou vést k trombóze postuloval Yirchow již v roce 1856 (Virchow, 1856).

U těchto s tavů nacházíme v krevním obě hu aktivované formy č i n i tel ů hemostázy a mů že docházet ke vzniku drobn ých, či vět š íc h trotnb ů . Tromb otický stav mů že provázet řad u cévních on em oc nění a ve svém kon ečn ém dů­ sledku mů že být příčinou tromboembolické piihody, to je stavu, při kterém dojde k uvolněn í trombu a následnému ucpání některé z důležitých cév uvolTrombus něným trombem - embolem (Alving, 1996). Z nejvážněj ších je to infarkt myokardu, zp ůs o ben ý většinou ucpáním věnči­ tých tepen trombem, plicní embolie a náhlá cévní příhod a mozková (ictus ). Patří sem i trombózy žil, hl avn ě kon četinov ých (Tabernero a spol., 1991). 190

191

o

Poprvé popsal diagnózu úplného letí Quian.

uzávěru věnčité tepny

v první polovině 19. sto-

Cévní onemocnění je dnes nejčastější příčinou úmrtí v civilizovaných zemích. Koronární trombóza, plicní embolie a onemocnění periferních cév tvoří polovinu všech úmrtí.

o

Podpora integrity cévní stěny vyžaduje normálnífunkci jak cévního endotelu, tak cirkulujících destiček (Frenette a spol., 1998). Ačkoli endotelově buiíky nemaji za normálních okolností trombogenni povrch mohou se stát prokoagulačnůni za určitých okolností. Napi: při stimulaci endotoxinem, interleukinem 1 (lL-i) nebo tumor nekrotizujicim faktorem (TNF-a). Endotelově bulíky syntetizující tkáiíový faktor a ostatní prokoagulačniproteiny, které mohou vyvolat trombózu u pacientů s chronickými zán ětli vým i procesy. O Stimulované endotelově buiiky také odhalují růsně adhezivní molekuly. Mezi ně patii selektiny uvolněné adhezivní interakcí mezi leukocyty, destičkami a endotelem (Frenette a spol., 1998). Pi-selektin je skladován ve Weibel-Paladeho tě­ lískách endotelovych buněk a va-granulích krevních destiček (Kansas, 1996; Teddel; 1995; Bevilacqua a spol., 1987).

ce, případně ze stagnačních městků v žilách dolních končetin a pánve. Embolizují do mozku buď z levého srdce, nebo vzácně z žil velkého oběhu v případě otevřené­ ho foramen ovale. Vzniklá koagula setrvávají po určitou dobu v místě svého vzniku, podle hemodynam ických okolností se však mohou posléze uvolnit a odcestovat s proudem krve jako emboly (Rodgers, 1998). Z těchto pohledů rozlišujeme trombózy: • žilní - jsou velmi úzce spjaty s hyperkoagulačními stavy. Při žilní trombóze dominuje především krevní stáza a hyperkoagulace v plazmatickém systému. • arteriální - při arteriální trombóze se uplatňuje především poškození endotelu a zvýšená agregabilita krevních destiček (Alving, 1993).

Z tohoto odlišného pohledu na oba systémy vyplývá i léčebná prevence těchto stavů:

• •

v žilním systému - nefrakcionovaný a nízkomolekulární heparin, kumariny v arteriálním řečišti - acetylsalycilová kyselina (Acetyl Salycilic Acid - ASA) a další inhibitory destičkových funkcí.

Hemostáza se může aktivovat v místě: • poškození cévní stěny • stagnujícího krevního proudu a) poškození cévní stěny Aterosklerotická cévní stěna (odtržený endotel, vyklenutý a popraskaný aterosklerotický plát a pod.) stimuluje krevní destičky. Dochází k jejich aktivaci a adhezi a současně k aktivaci zevního systému koagulační kaskády TF uvolněným z destabilizovaného plátu (Toshi a spol., 1997; Fernandez - Orti: a spol., 1994, Badimon a spol., 1999). Po změně konformace membránových glykoproteinů krevní destičky dochází k agregaci trombocytů s následnou tvorbou nástěnněho trombu) . Stabilita trombu je dána obsahem fibrinu, který je úměrný intenzitě aktivace koagulačního systému. Nástěnné tromby ve velkých tepnách, přisedlé k defektní stěně a vystavené rychlému toku okolní krve, jsou zdrojem embolů s převažujícím obsahem agregovaných trombocytů, s krystaly cholesterolu a ateromatózní drti (Topol a spol., 1997). K prevenci arteriálních trombóz se s výhodou využívá léčby antiagregačni. b) stagnující krevní proud V místech krevní stagnace je naopak převažujícím mechanismem vzniku trombózy hemokoagulace . Proti ní zaměřujeme léčbu antikoagulačni. Stagnačni tromby ; bohaté na fibrin a erytrocyty, pocházejí naopak spíše ze srd192

193

4.2.1.1 . Venózní trombózy

4.2.1.2. Arteriální trombózy

V klinické praxi jsou žilní tromboembolické komplikace daleko vácivé stavy.

čas tější

než kr-

Příčiny

•

•

•

• •

vzniku venóznÍ trombózy sniien á hladina inhibitorů krevniho srá-

žení. Jde hla vn ě o inhibitory plazmatického koagula čn íh o systému. Inhi bitory fib rinolýzy hrají m én ě výz namno u úlohu (Heijboe r a spol., 1990). únik tk á ůov ěho faktoru do krevního obě­ hu ( např. u chirurgických vý ko n ů) mů že vyvolat vznik trombu . Zanesení trombu do pravého srdce a odtud do plic je potom pří­ č i n o u plicní embolie. zpomalení cirkulace krve žilním řeči štěm může při spět k aktivaci nitrocévního srážení krve. hluboké a rozsáhlé poškození krevních kapilár rozpad CéVlll110 endotelu vyvo laný bakteriemi, č i jin ými toxiny vede k silnému p odn ětu ke spuš tění hemostatické reakce , při které vznikají mikrotromby v cév ním řeč iš ti .

Trombotická mikroangiopatie má za následek

•

•

• Prvn í zmínka o případu venózní trombózy v písemnictví přeru šení

cirkul ace v postižené Vznikají-Ii tromby v ka-

Získané rizikové faktory venóznÍ trombózy Věk nad 45 let Obezita Velké operace a opera ce ortopedické Poranění (včetně popálenin) Imobilizace Nádorová onemocnění Tromboembolická nemoc (TEN) v anamnéze Varixy

Kouření

vzniku arteriální trombózy byla stěžejní úloha připisována ateromatéznůn cévní. Tyto patologické procesy s měřuj ící k trombóze se rozvíjej í větš i no u až ve druhé pol o vině života.

Stadia aterosklerotického procesu

oblasti s eve ntuálním postupn ým od u mře ní m okolní tkán ě. pilárách u vě tšího po čtu tkání a orgánů , ho v o říme o DIK.

• • • • • • • • • • •

Při

zm ěnám stěny

Venózní trombus

•

zvýšen é vystavení stěny cévy chemickým nebo biologickým vliv ům. • z chemických vlivů p iispivaji k po škození endotelu: vyšší hladina LDL a hotnocys teinu, tabákový koui; nedostatek kys líku v organismu. • Z biologických vlivů postihuje endotel cytomeg alovirus a n ěkter ě další infekce. • Dal šími piičinami bývají mechanická poškození endotelu. porucha funkce a poškození endotelu . V tomto stádiu se zhorší možnost roz šiťit pr ůsvit cévy (relaxace ) a zvýší se piilnavost endotelovýc h bun ěk. vznik pěnových buněk z monocytů a makrofágů a tvorba aterosklerotického plátu . D ůsledkem tohoto jevu j e sklon k vazokonstrikci cév, k tvorbě destičko vé krevní sraženiny (trombu) a kon ečn ě k proniknutí zán ětlivých bun ěk do cévní stěny. porušení stability a prasknutíplátu

L-

-----'

l-

-----.J

Tvorba trombu na roztrženém aterosklero tickém plátu před st avuj e hlavní patogenetický mechanismu s vzniku akutních koronárních syn drom ů - infarktu myok ardu (lM) a anginy pectoris: O 1M j e d ůsledkem úplného u závěru koron árTvorba trombu ní arterie na aterosklerotickém plátu O angina pectoris j e pie vá žn ě zp ůsobena tvorbou trombu na cévní stěně s neúplným uzávěrem koronární arterie. Do chází k zúžení p r ůsvitu arterie, ne k jejímu uzávěru. Metabolicky velmi aktivn í pláty se vyznač ují z n ač n o u aktivitou polymorfonukleárních leukocytů a monoc ytů . Nejčastěji praskají m ěkké pláty s tenkým krytem, které jsou bohaté na lipidy a makrofágy .

Horm onální léčba Těh otenství

194

195

Na vzniku koron ární tromb ózy se podílí interakce cirkuluj ících e le me n tů , pře­ devším m on o c ytů a krevních de st i č ek . Aktivo vané mon ocyty po stimulaci P-selektinem ex primují TF, řad u cytokinů a matrixové metaloproteinázy. Met aloprotein ázy š těpí ko lage n v krytu plátu a vyplavují TF do cé vního řeč iště (Demers a spo l., 1992). Krom ě u volňov án í z atero matózního plátu je TF produ kován též akti vovanými krev ními elementy. TF pak hraje klíčo vou roli při vzniku koron árniho trombu: 1. Vy tvoře ní komplex u [TF. VIl a] 2. Aktivace F X na Xa 3. Tvorba kom plexu [TFPI . Xa] 4. Inaktivace komplexu [TF . VIl a] komplexem [TFPI . Xa] za vzniku tetramerního ko mplex u [TF . VIla . TFPI . Xa] Tento komplex je reverzibilní a pom ěr mezi jeho genezí a uvoliiov án ůn jednotlivých složek určuje aktuální stav protrombotickyclt a antitrombotickych pochodil.

o

Ve studiích bylo prokázáno, že heparin snižuje produkcí TF in vitro a vyvolá pokl es prokoagula čni akti vity m on ocytů.

Mechanismus vzniku tepenného trombu

so učasně

Mech ani smu s vzniku trombu v tepenn ém 'JII"""'"1;;iiiii~~~~ je odlišný od tvorby hemostatické zátky. Vznik arte riálního trombu prob íhá n ásled o vn ě: 1. adh eze desti ček 2. aktivace a kontrakce destič ek 3. adh erenc e k rozp oznaným tromb oaktivní m substrátům poškozen é části arteriální cév ní . . . .liiiili s těny ( např. vWF, vlákna kolagenu, fibro nektin, vitronektin, laminin) 4. rozprostran ění de sti ček na poškozeném cév ním povrchu 5. agr egac e dalších přil ehl ýc h de sti č ek 6. aktivace koagulačníka skády s tvorbou fibrinu 7. vznik bil ěho trombu tv ořeného p řev ážně krevními de sti čkami - překrý v á vrstvy nejbližší k poškozené cévní s tě ně 8. vychytává ní erytro cytů , neutrofil ů a oj ed i nělé monocytů v dalších vrstvác h vznikaj ícího červeného trombu. řeč iš t i

Úloha krevních destiček při vzniku arteriální trombózy Krevní de sti čky se uplatňují nejen při samotném vzniku arteriální trombo žy, ale podílej í se také na z ánětlivých zm ěnách , které probíhají v koron árním plátu . Při poškozen í cévní Řez tepnou s drobnými agregáty destiček (šipky)

196

s těny doch ází k adhezi krev ních desti ček na místa s c hy běj ící endoteliální výs telkou. Vrstva adherov aných desti ček v místě poškozen í p řed stavuje v zás ad ě j ednu ze slože k, které se snaží zaj istit rep arati vní proces. V tomt o proc esu do ch ází k ob nově průtoku cévní s těnou . Záleží pak na rovnováze proagreg ačn ích a proti agregačníc h m echani smů , zda tento děj pře s toupí do tvorby dest ičkovéh o trombu.

Aktivace krevních •

•

destiček může

probíhat dvojí cestou:

Zvýšení střižních sil v intaktní endoteliálni vrstvě - v dů sledku vazo ko nstrikce nebo při vzniku výz namné koron árn í stenózy. Tent o pochod je zp rostřed kován vWF a GP Ib/lX a GP lIb/lIla. Reparativni proces - zp rostředkován vazbo u vWF na GP Ib/lXN neb o vazbou na kolagen .

Nejsilnější aktivátory cirkulujících neaktivních de sti ček j sou ateromatózní lipidové části plátu, kolagen, trombin a cirkulující katecholaminy , Dal ší akti vátor destiček - ADP je uvolňován jednak z hemolyzovaných červenýc h krvinek a jednak ze samotných krevních destiček. Uvolněný serotonin a tromboxan A 2 POdPOlUjí další agregaci destiček a navíc i koron ární vazokonstrik ci. Dochází k aktivaci destičkové proteinkindzy C a prostřednictvím aktivace cesty cyk looxygenázy i k expozici destič­ kových fibrino genových receptorů - glykoproteinového komplexu GP lIb/lIla.

o

Na povrchu krevní des tičky j sou receptory pro adhezivníproteiny, Ze skup iny integrin ů jsou to pie devšim GP lIb/lIla, GP Ia/Ila, GP Ic/Ila, fibron ektinovy a vitronektinovy receptor: Na klidové destičce je p ťitomen i receptor pro vWF (G P lb ), který zprostiedkovdv á adh ezi destiček k obnaže ným subendote lid lnim vrstvám. O D ů ležirym receptorem na aktivovaných krevních destičkách je glykopro tein lIb/llIa, který je receptorem pro fib rinogen.fibronec tin, vWF, vitrone ktin a trombospo din. Fibrinogen má dvě místa, kterými rozeznává receptor GP lIb/lIla a proto m ů ž« zprostředkovat interakce dvou destiček mezi sebou a j e základním mechanism em vedoucím k agregací destiček. O Zcela zásadní roli p ii vzniku tepe nného tromb u hraj e i proteolytický enzym trombin. Jak již bylo uvedeno, j e j edn ím za hla vních akti v átor ů destiček a navíc tím, že odštěpuje Z fi brinogenu fib ri nope ptidy A a B se podílí na tvorbě nerozpustné/zafibrinu. Vyt vol'ená vlákna fibrinu zpeviiuji destičko vý trombus.

4.2.1.3. Laboratorní markelY trombogene ze a trombofilie Zavedení nových vyšetřovacích metod pro stanovení molekulových m arkerů ovlivnilo možno sti v diagnostikování a pre venci trombogeneze a trombofilie. Molekulové markery j sou molekuly nejčastěji na bázi protei nů . Umo žňují v mnoh ých případech stanovit změny herno statickýc h mechani smů in vivo.

p odstatně

197

Molekulové markery popisují fyziologii a patofyziologii hemostázy: • Při dysfun kci endotelu - endotelov ě markery (vWF, trombomodulin, solubilní TF, TFPI, adhezivní proteiny: E-selektin , ICAM-l , VCAM- l ). Endotelové markery slouží k odlišení čas né endotelové dysfunkce (aktivace endotelu) od jeho pozděj šího závažnějš ího poškození. vWF byl pů vodně zaveden jako marker poškození endotelu, v souč as nosti je spíše považován za známku chronické aktivace endotelu . Zvýšené hladiny trombomodulinu a TFPI jsou známkami výrazněj šíh o poškození endotelu. Zvýšené hladiny TFPI se nachází při vaskulopatiích v souvislosti s poškozením povrchových endoteliálních proteoglykanů. Vzhledem k tomu, že jeho hladina se mění v závislosti na hyperlipidémii je vhodnějš í vyš etřovat antigen volného TFPI. Hladina solubilního TF má klinický vztah k různý m vaskulopatiím a indukcím endotelové exprese TF zánět l ivý m i látkami in vitro. tPA je považován též za endotelový marker, protože je tvořen a u skl adněn v endotelu v granulích odlišných od Weibel-Paladeho (WP) tělí sek . • Při aktivaci krevních desti ček - markery krevních destiček (povrchové antige ny, a dále PF4, ~-TG , TXA2) . Trombocytové markery jsou proteiny u skladněné va-granulích krevních destiček a jsou uvolňovány z krevních deti ček při jejich aktivaci . Výhodou těchto parametrů je, že odráží stav aktivace desti ček in vivo. • Při aktivaci koagulačních procesů - markery aktivace koagulace (stanovují se aktivač n í peptidy plasmatických faktorů nebo komplexy faktorů s inhibitory F I + 2, TAT kompl exy, fibrinopeptid A, aktivač ní peptidy faktorů IX a X, fibrinové monomery, F VIl a) • Při aktivaci fibrinolýzy - markery aktivovanéfibrinolyzy (FDP, D-diméry, PAP kompl exy - [plasmin.antiplasmin], celková fibrinol ytická aktivita).

4.2.2. Trombofilní stavy (Trombofilie z řeckého" thrombophilia" - je predispozice ke vzniku trombóz, podobně jako hemofilie z řeckého .Jiaemophilia" je predispozicí ke vzniku krvácivých stavů .) V posledn ích letech se podařilo prokázat u celé poloviny nemocn ých s tromboembolickou nemocí vrozenou poruchu v regulaci procesu krevniho srážení, která způsobuje zvýšené riziko této nemoci. Tyto stavy se objev ují zejm éna u jedinc ů mladšiho věku (pod 40 let) a často mají charakter rodinného onemocnění. TROMBOFILlE JE TEDY VROZENÁ NEBO Zt SKANÁ PORU CHA HEMOSTATlCKÉHO MECHANISMU, KTERÁ JE PRAVDĚPODOBNOU PŘtČINOU ZVÝŠE NÉ TENDEN CE K TROMBÓZE.

Rozlišujeme trombofilní stavy: O vrozené (kongenit áln ů O získané (sek undán u) 198

4. 2. 2.1. Vrozené (ko n gen itáln í) trombofilní stavy B ěhem posledních 30 let bylo zjiš tě no celkem 7 genetických fakt o rů spojovaných se zvýše ným rizikem venózní trombó zy a nachází se další: • Dysfibrinogenémie: byla popsána Beckem a spo lupracovníky v roce 1965 (Beck a spol., 1965). Od té doby bylo zjištěno celkem 15 různých mutací genů fi brinogenu a, f3 a y, které vedou k syndromu dysfibrinogeněmie. Nejzn áměj ši j e mutace f3-fibrinogenu (455 G-A ), pil které dochá zí ke zvýšení hladiny fibrin ogenu v pla zm ě, zvýše ní viskozity krve a pla zmy a ke zvýšené agregaci erytrocytů. • Rezistence na aktivovaný protein C (APC-R): jde o genetické def ekty spojované s je dno bodovo u mut ací genu, který gene ruje fa ktor V (Be rtina a spo l., 1994 ). A PC rezistence byla poprvé popsána v roce 1993 Dahlbiickem (Sve nso n a Dahlbii ck, 1994) . • Deficience antitrombinu byla poprvé oznámena Egebergem v roce 1964 (Egebe rg, 1967). Je to autosonuiln ě dom inantni porucha u h eterozygot ů . Podle kvantity, aktivity a schopnos ti vázat heparin se dělí na 3 typy. Defekt se projevuj e hlavn ě tromb ózami hlub okých žil, většin ou dolních končetin a plicní embolií. První proj evy se obj evuj í v pubertě, u žen v období těhotenství. • Deficience proteinu C byla pop rvé popsána v roce 1981 Griffinem a spo !. (Griffin a spo!., 1981). Proj evuj e se již v dětství jako závažná predispozic e. Jedná se o geneticky velmi různo rodě onemocněn í, u kterého známe více než 160 muta cí genu proteinu C (Re itsma a spo !., 1995). Klinickým výrazem poruchy systému proteinu C bývaj í žilní, ale i arteriální tromb ózy (Engesser a spo !., 198 7). Zvláštním syndromem je purpura fulminans nov oro zenců u h om ozy g otů a tzv. kumarinové nekrózy při zavádě n í l éčby perorálními antikoagulancii (Devine a Brigden, 1996). • Deficience proteinu S byla poprv épopsána Competn a spo !. v roce 1984 (Comp a spol., 1984). Také u proteinu S j e znám o kolem 70 muta cí genu (Aia ch a spo l., 1995). • Mutace protrombinu spojovaná s 20210 A alelou protrombin o v ěho genu - F II 20210. Byla poprvé popsána v roce 1996 Poortem a spo l. (Poo rt a spol.. 1996). • Homocystein - nachází se hyperhom ocystěm ie, která je charakte rizována zvýšenou hladinou homocysteinu v krvi. • Některé další polymorfismy vedoucí k arteriální nebo venó zní trombóze: • GP la - mutace v gen u se záměn ou C 807 T. Zvyšuje se riziko infarktu myokardu zej ména u mladých jedinců. • TFPl - muta ce jl genu se záměnou C 536 T. Zvy šuje se riziko ven ozni trombózy mutace jl TM a EPCR (endotelový receptor pro PC) • PAl 1 - muta ce v genu se zám ěn o u 4G/5G. Mů ž« zvyšo vat riziko dvěma rů z­ ným i mechanismy: • Depozita fibrinu tvoiici základ ateroskl erotických plátů sp olu s vysokou lokální konce ntraci PAl 1 podp orují tvo rbu ateroskl erotických p la ků.

199

•

Mec hanismus u infarktu myokardu je odlišný . Trombóza vzniká v místě ruptury aterosklerotického plátu . Zvýšené koncentrace PAl dejmě zp ůso­ bují koronární trombózu vyvoláním protrombotick ěho stavu .

Prevalence u jednotlivých rizikových

faktorů

trombofilie:

FV-Leiden (Svenson a Dahlbiick, 1994) defekty proteinu C (Griffin a spol. , 1993) defekty antitrombinu (Demers a spol., 1992) defekty proteinu S (Engesser a spol., 1987) antifosfolipidový syndrom (Devine a Brigden, 1996) deficience fibrinogenu abnormality fibrinolýzy* defekt protrombinu spojovaný s jednobodovou mutací alely A2021 O protrombinového genu hyperhomocystémie (> než 18,5 mmol/l) neznámé faktory

Prevalence trombofilie 20-50 % 2-5 % 2-4 % 2-5 % 2-3 % 1% 10-15 %

15-20 % 7-10 % 3-5 %

* patii k nim abnormality plazminogenu, 4.2.2.1.1.

REZISTENCE NA AKTIVOVANÝ PROTEIN

t-PA, nebo PAl

C (APC-R)

Rezistence na aktivovaný protein C představuje nedostatečnou nebo vůbec žádnou odpověď na aktivovaný protein C. Popisuje tedy odolnost koagulačního systému vůči inhi bičnímu vliv u proteinu C na koagulačně aktivní faktory Va a VlIla (Poort a spol. , 1996).

(Leidenská mutace, Cambridge mutace) postižení dnes neznámým defektem

90-95 % piipadů 5 - lO % p ťipadů

FAKTOR V-LEIDEN (Factor V-Leiden mutation (F-V-LM) )

Mutace vznikla asi pied 20-30 tisíci lety, pravděpodobně již po oddělení asijské populace (proto se u asijské populace prakticky nevyskytuje). U evropské populace se vyskytuje II 3-5 % jedinc ů (Topol, 1997). Geneticky se u postižených nachází FV mutace faktoru V (Bertina , 1997). Jde F V Lelden o bodovou mutaci v exonu 10 genu '----200

F V Q S06 (Leiden)

FV

C AA

C GA

Arp - GlII - Gly

Arp - Arg - Gly

U Leidenské mutace je snížený inhivliv APC na aktivovaný koagulač­ ní systém dán výskytem patologického faktoru Va (faktor Va-Le iden). Tento faktor má normální prokoagulační aktivitu, ale nedá se proteolyticky štěpit ak tivovaným proteinem C. Varianta F V, která má v pozici 506 místo aminokyseliny argininu glutamin má výrazně sníženou kofaktorovou aktivitu a inaktivace faktorů Va a VlIla v sys tému [APC . PS . Ca 2+ . PI] je velmi pomalá: biční

ArgS06

Účinek FV a FV Leiden v systému Proteinu C

~ Gin )»>»»»» I F Va RS06Q I

- -.......

Vlivem této mutace ne- ,-------- - - - - - - - - -- -- -- - --,

Vrozená APC-R může být vyvolána: • jednobodovou mutací genu pro koagulačnífaktor V •

k ódujícím F V, kde v pořadí nukleotidů dochází k záměně G za A (G 1691 A) . Vzniklý triplet kóduje v proteinu (F V) v pozici 506 místo aminokyseliny argininu (Arg), glutamin (Gin):

probíhá v systému proteinu C štěpení těžkého řetězce faktoru Va. Faktor zůstává ve své aktivované podobě, nedochází k jeho inaktivaci a může se podílet v komplexu protrombinázy na zvyšování hladiny trombinu.

Faktor ValVa-Leiden

Těžký řetězec

H,N

-I

'-----.:---"--.....,....- - - - '

Lehký

řetězec

CAMBRIDGE MUTA CE (Faktor V-Cambridge)

Ser-Leu-Asp-Arg-G1y-lle-Gln . Ser-Leu-Asp-Gln-Gly-lIe-Gln . ----'

V tomto prípadě jde o jednobodovou mutaci faktoru V (Williamson a spol. , 1998), kte rý má v pozici 306 místo aminokyseliny argininu (Arg) aminokyselinu threonin (Thr) : 201

Arg306

~~ Thr >>)>)>>>>>>> IF Va R506Q I

- -....

Výskyt: asi u 2-3 % mutací faktoru V Vliv AP C -R na funkci aktivovaného proteinu C Protože se sníží rychlost š těpe n í fak toru Va vlivem APC , doch ází jen poz volna k jeho inakt ivaci (Badimon a Badimon, 1996). To zvyšuje stabilitu protrombinového komplexu a mů že dojít k rozvinutí hyperkoagulačního stavu a k riziku trombózy.

o

Vrozená rezistence na akti vovaný protein C j e hlavním rizikovým faktorem pro vznik venozni trombózy (Ber tina, 199 7). Byla zji št ěna u 20-60 % nemocnych touto chorobou a u 2-7 % jedinc ů běžn é populace. Homozygoti mají vyšší riziko vzniku trombózy než heterozygoti, u kterých j e 50 % F V s normální skladbou amin okyselin.

Získaná APC-R Zí skaná APC-R nastává v dů sledku stavů , které způsobují dysbalanci mezi prokoagulačními a antikoagulačními proteiny hemostázy ovlivňující reakce používaných laboratorních vyšetření (zv ýšení hladiny F VIII , zánět , těhoten ství , hormonální antikoncepce, antikoagulační léčb a, lupus antikoagulans, defekty proteinu C a S). Zí skaná APC-R je provázena stej ný m rizikem vzniku trombózy a klinické projevy se pod obají kla sické APC-R.

D EFEKT

20210 A ALELY PROTROMBINU (FIl 20210)

Tento defekt byl poprvé pop sán Poortem a spol. v roce 1996 ( POOrl a spol., 1996). Jde o pol ymorfismu s ge nu pro tvorbu protrombinu v 5. exonu , spoj ený s vysoko u hladinou protrombinu. Podobn ě jako APC-R je i tento defekt vyvolán jednobod ovou mutací. Defekt je spojený se záměno u G za A v pozici 20210 protrombinov éh o genu (G 20210 A). TCCCAATAA AAGTGACTCTCAGCGAGCC

+mutace

TCCCAATAAAAGTGACTCTCAGCAAGCC

4.2.2 .1.3.

HYPERHOMOCYSTEINÉMIE

Porucha spojená s homocysteinem se projevuje zvý šenou hladinou homocysteinu v krvi - hyperhomocystémií. Je vyvolána genetickou mutací n ěkterého enzymu cyklu methioninu, nejčastěji 5,10 methylentetratetrahydrofolát reduktázou, 202

• • •

Cysthationin- f3-syntáza (CBS) Methionin-synt áza (MS) 5,10 methylentetrahydrofoldt reduktdza (MTHFR) CYKLUS METHIONINU

* N 5-metyl-THF

Methionin

---+ S-adenosylmethionin

~CH3 THF (glu)n

HomojYstein

~+

+- ~~~~~~:~in

Cystathionin

!

Cystein

Laboratorní stanovení APC - R • Funkční testy (koag u l ačn í, chromog enní substráty) • Vy šetření ge notypu

4.2.2.1.2.

Homocystein je metabolit degradace methioninu . Za normálních okolností může být metylován zpětně na methi onin enzymem methi onin synt ázou. V metabolismu ho moc ysteinu hrají výz namnou roli 3 enzymy:

Fyziologické meze homocysteinu: < 30 let 30 - 59 let ženy: mu ži: > 59 let Hyperhomocysteinemie

může

4,6-8,1 umol/I 4,5-7,9 umol/I 6,3-11 ,2 umol/I 5,8-11 ,9 umol/I

být:

O vrozená O získaná Vrozená hyperhomocystemie je vyvolána větši n ou přítomno stí mutované termolabil ní formy MTHFR. Mutace s po čí v á v záměně v genu generujícím tento enzym (C 677 T). Z metabolismu homocysteinu vyplývá, že hyperhomocysteinemie m ů že být způ s ob en a : a) deficitem nebo sniženou aktivitou některých enzYllll1 a v méně případech defekty enzymu cystathion-Ba yntd zy b) deficitem vitaminů - vitaminy skupiny B j sou kofaktory na listová, vitaminy B 6, a B d . 203

většinou

MTHFR

těchto enzymů (kyse li-

o

Homozygotní defekty jsou spoj ovány s těžkou liyperhomocystein ěmii a jsou doprovázeny ladou defekr ů (neurologických a psychických a časn ou chorobou cév, včetně TEN) . U heterozygotů se objevuje lehká až stiedn ě těžká forma hyperho-

• •

m ocyst ěm ie

O Hyperhomocystemie j e nezávislým rizikovým faktorem cévních chorob. Ukazuje se, že by mohla být i rizikovým f aktorem pro žilní trombózy. Mechani smy, kterými se hyperhomocystemi e podílí na atero, či trombogenezi nej sou dostatečn ě známy. Piedpoklddá se poškození endotelu, prolifera ce bun ěk hladkého svalst va a zes ílení intimy: Hyperhom ocystemie se projevuje jako rizikový faktor hlavn ě u mladších lidí.

•

Poměrně vzácný je tzv. katastrofický APS, u kterého dochází v důsledku nezvládnutelné trombofilní tendence k akutnímu stavu s obrazem multiorgánového selhání.

Laboratorní diagnostika: Je založena na kombinaci závislých na fosfolipidech a ELISA testech.

laboratorních

Klinická interpretace: Tvorba protilátek může být vyvolána léky, bakteriální a virovou infekcí. Velmi často se APS zji šťuje u nemocn ých s revmatick ým onemocněn ím .

ovlivňují

homocystémii

4.2.2.2. Získané trombofilní sta vy

4.2.2.2.1 . A NTIFOSFOLlPIDOVÝ SYNDROM (APS) Antifosfolipidovy syndrom (APS - Anti Phospholipide Syndrome) je char akterizován p řítomn o stí venózních i ateriálních trombóz v mikrocirkulaci, předčasn ě uk on čen ý ch těhoten stv í a tromb ocytopenie v přítomnosti antifosfolipidových protilátek. Tyto látky tím, že vyřazuj í fosfolipid y ze hry v rámci ko ag u l ač n íc h procesů vý zna m ně a různ ým způ sobem zasahují do procesu krevního srážení a výsledkem tohoto pů sobení bývá zpravidla tromboft1ie. U APS se vytváří protilátky proti negativněnabitým fosfolipídovým povrch ům, protein ům vázajícím fosfolipidy nebo protein ům (kofaktor ům) v případě, že fosfolipidy nejsou piůomuy.

Mechanismy účinku V příp ad ě APS se předpoklád á n ěkolik mechanismů účinku antifosfolipidových protilátek:

•

ko agulačních

testů

Stavy a léky, které

•

APA zvyšují možnost trombózy inhibicí účinku prekalikreinu a následné poškození fibrinové "C!earence". APA inhibuji p ů sobeni trotnbom odulinu při aktivaci proteinu C trombinem, a tím se ztrácí zpětn ovazebn á inhibice koagulace. Přímé poškození trombocyt ů protilátkami typu Lupus anti coa gulans, což vede ke zvýšení jej ich adhezivní schopnosti a následn ě k trombóze.

APA se napojují nafosfolipidové složky protrombinov ěho kompl exu koagulační kaskády, tím vzniká hyperko agulační stav. APA zabraiiuji uvoliio vdni kyse liny arachidonové Z endotelu krevních cév, což vede ke snížení tvorby prostacyklinu jako přirozeně se vyskytující antikoagul ační slož ky, zvýší se agrega ce desti ček a dochází k následné trombóze. 204

Léčba: Hlavními klinickými komplikacemi spojenými s přítomností APA jsou vaskulární okluze, opakovaný spontánní potrat a trombocytopenie. Snahou je co nejrychleji odhalit diagnózu a snížit koagulační potenciál, aby se co nejrychleji eliminovala rizika spojená s tímto syndromem. K léčb ě se používá kortikosteroidů (prednison), orální antikoagulancia, antiagregační léky nebo heparin.

O Není jisté, zda APA pouze doprovází nezná onemocnění, nebo zda mají s různymi patologickými stavy piičinnou souvislost. Piičina tvorby APA je komplexní, j e pravděpodobn ě následkem poruchy imunitního systému. Nejsou zatím známy mechanismy, kterými tyto protilátky vyvolávají hyperkoagula čni stav a tromb ózu. Piedpokl ádá se účast v inhibici uvoliio vdni kyseliny ara chidono v ě z membrány endotelii a následné snížení produkce prostacyklinu. Literární prameny se zmi iíují o tom, že APA p ravděpodobně pozitivn ě ovlivtiuji syntézu destičkového aktiva čního f aktoru - PAF (platelet activatin g f actor), který následn ě zes iluje agregaci krevních destiček. Další cílovou strukturou APA by mohly být membránové fo sf olipidy u krevních destiček primárně lokalizované na vnitin im povrchu membrán y, které se po jejich piedchozi aktivaci nebo poškození dostávají na vněj­ ší po vrch. Jako jiná možnost p ůsobeni APA se popisuje zesílení adheze krevních destiček společn ě s u voln ěním prokaagula čniho faktoru a tromboxan ů. Na kauzální účast APA p ii vzniku trombu uka zuje i modelo vý pokus, kdy bylo u experimentálního zviiete vyvoláno standartnim způsobem po ško zení f em orální artérie. Po infúzi APA tiid IgG, IgM i IgA byl pozorován dramatický n árůst trombu i doby j eho trvání.

4.2.2.3. Sekundární (m'::idruženéJ trombofilní stavy Sekundární trombofilni stavy se objevují v patobiologických situacích, mezi gravidit a, nebo jsou následkem známého patologického proce su (hepatopatie, nefrotický syndrom, DIK rozličné geneze). ně ž patří např.

205

Literatura Aiach, M., Gandrille, S; Emtnerich, J.: A review oť mutations causing deficiencies oť an titrombin, protein C, protein S. Thromb. Haemost. 74, 1995, s. 81-89 .

Bevilacqua, M. P. , Po ber; J. S., Mendrick. D. L. et al.: Identification oť an inducible en-

dothelial-Ieukocyte adhesion molecule. Prac . Nat\. Acad. Sci. USA , 84, 1987, s.9238.

Alving, B. M. : The hypercoagulable states. Hosp. Pract. 28, 1993, č . 2, s.109- 114.

Dem ers , C , Ginsberg , J. S., Hi rs h, J. et al: Thrombosis in antithrombin III deficient persons: reports oť large kindred and Iiterature review. Ann. Intern. Med. 11 6, 1992, č. 9, s.754-76 I.

Comp , P. C, Nixon, R. R., Coope r; M. R., Esmon, C T.: Familial protein S deficiency is associ ated with reccurent thrombosis. J. Clin. Invest. 74, 1984, s. 2082-2088.

Devine, D. v. Brigden , M. L.: The antipho spholipid synd rome: When does the presence oť antiphospholipid antibodies require therapy? Postgrad. Med. 99, 1996, č .6 , S. 105-108.

Badimon, L., Badimon, J. J.: Interaction oť platelet activation and coagulation. ln: F uste r, V., Topol, E. J., eds . Atherosklerosis and Coronary Artery Disease. Lippinc ott - Raven Publishers, Philadelphia 1996, s. 639-656.

Egebe rg, O.: Inherited antithrombin III deficiency causing thrombophilia.Thromb. Diath. Haemorrh. 13, 1967, s. 516-530.

Badinton, J. J., Lettino, M., Toshi, V. et al.: Local inhibition oť tissue ťactor reduces the trombogenicity oť disrupted human atherosclerotic plaques: eťťects oť tissue ťa ctor pathway inhibitor on plaque thrombogenicity under tlo w conditions. Circulation 99, 1999, s. 1780-1787.

Engesset; L., Broekmans, A. W , Briet, E. et al.: Hereditary protein S deficiency: c1i-

nieal maniťestation s. Ann. Intern. Med. 106, 1987, č. 5, s. 677-682. Fernande z-Ortiz: A., Badimo n, J. J., Falk, E., et al.: Characterization of the rela tive

Beck, E. A., Charache, P. , Jackson, D. P. : A new inherited coagulation disorder cau sed by abnormal fibrinogen (fibrinogen Baltimore). Nature 208, 1965, s. 143-145.

thrombogenicity of athero scleroti c plaque components: implications for consenquence of plaque rupture. J. Am. Col\. Cardio\. 23,1994, S. 1562- 1569.

Bertina, L., Koeleman, B. P. , Kostel; T., Rosendall, F R., Driven, R. J., de Ronde, H. et al: Mutation in blood coagulation ťac­

Frenette, P. S., Moyana, C , Hartwell, D. W, Lowe, J. B. , Hynes, R. O. and Wagllel; D. D.:

tor V associated with resi stance to activated protein C. Nature 369, 1994, s.64-67.

Platelet - endothelial int eraction in intlamed mesenterie venules. Blood, 9 1, 1998, č . 4, s. 1318-1324.

Bertin a, R. M.: Factor V Leiden and other coagnlation ťactor mutations aťťecting thrombotic risk. Clin. Chem. 43, 1997, č . 9, s. 1678-1 683.

Griffin. G. H., Evatt, B., Zinunerman, T. S., Kleis, A. J., Widemall, C: Deficiency of protein C in congenital thrombotie disease. J. Clin. Invest. 68, 1981, S. 1370-1373.

206

Griffi n, J. H., Evatt, B., Widemall, C et al.: Antieoagulat protein C pathway deťective in majority oť thrombophilic patients. Blood 82, 1993, č , 7, s. 1989 - 1993.

Svenson, P. J., Dahlbiick, B.: Resist ance to activated protein C as a basis for venous thrombosis. N. Eng\. J. Med. 330, 1994, č . 8, S. 5 17-522.

Heijboet; H. , Brandj es, D. P., BII/lel; H. R. et al.: Deficiensies oť coagulation - inhibiting and fibrinol ytie proteins in outpatients with deep vein thrombosis. N. Eng\. Med. 323, 1990, č. 22, s. 1512- 15 16.

Tabernero , M. D., Tom as, J. F., Alberca , J. et al.: Incidence and clinical characteristie s of hereditary disorders associated with venous th rombosis. Am. J. Hernatol., 36, 1991, čA, S. 249-254.

Kansas, G.S. : Selections and next Iigands: Current concepts and contraversies. Blood 88, 1996, S. 3259.

Tedder; T. F : Thes selectins: Vascular a dhesion molecules. Fase b, J. 9, 1995, s. 866.

Poort, S. R., Rosenda/l, F R., Reitsma, P. H., Bertina , R. M.: A common genetie variation in the 3-utranslanted region oť the protrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis. Blood 88, 1996, s. 3698- 3703. Reitsma, P. H., Bernard i, F , Doig, R. G., Gandrille, S., Gre engard, J. S., lreland, H. et al.: Protein C deficiency: a database oť mutations, 1995 update. Thromb. Haemost. 73, 1995, S. 876-889.

Topol, J. E. et al: For the EPIC In vestigator Group. Long-term protection from myocardial ischemie events in a randomized trial oť brieť integrin blockade with percutaneous coronary intervention . JAM A 278,1 997, S. 479--484. Toshi, v., Ga /lo, R., Lettino, M., et al.: Tissue factor modulates the thrombogenicity of hu man atherosclerotic plaques. Circulation 95, 1997, s. 594-599. Yirchow, R.: Gesammeltes abhandlungen zur wissen schaftlichen medicin. Franfurkt 1856. Meidinger & Sohn Co.

Rodgers, G.: Hemostatie properties of normaI and perturbend vascular cells. Faseb, J. 2, 1998, s. 116.

207

Williamsoll , D., Brown, K., Luddingtott, R. et al.: Fa ctor V Ca m br id ge : A New mutation (306: Arg-Thr) associ ated with resi stance to activated Protein C. Blood 91, 1998, čA, S. 1140-1144.

4.3. Antitrombotická

4.3.2. Antikoagulační léčba

léčba

Hemostatické mechani smy jsou fyziologickým procesem. Za určitých podmín ek je aktivace hemostatických mech ani smů nežádoucí a život ohrožující a je potřeba jej í aktivitu tlumit. K inhibici primární hemostázy j sou k dispozici protide stičkové léky a ke tlumení sekundární hemostázy antikoagulancia. Spontánní fibrinolýzu fibrinového trombu, s p o č í v aj ící v aktivaci plazminogenu na plazmin , je možné terapeuticky poten covat podáním t-PA nebo lze přímo podat p řirozená fibrinolytika , č i jej ich analoga (Bultas a Karetová, 2004) . L éčeb né

Antikoagul ační l éčba zabra ňuje vzniku trombu, tím že brání genezi trombinu a následné přeměně fibrinogenu na fibrin. Antik oagulační léčbou se potlačuje aktivace koagulačních faktorů tím, že se jednak brání vzniku pln ě hodnotných fak torů (p repardty kumarinov ěho typu) nebo se potencuje ú činek antitrombinu k nepřímé ­ mu vyvázá ní trombinu (nefrakcion ovany heparin), č i k vyvázaní aktivovaného F Xa (frakcionovany heparin) . Sníženou tvorbou nebo vyvazováním trombinu z koagul ačního děje se výrazně omezuje i riziko aktiv ace trombocytárního sys tému.

ka může: • zabránit zvětšován í trombu , případn ě rozpustí jeho fibrinovou složku • zamezit dalšímu shluková ní trombocytů • snížit hyperkoagulabil itu systému

EJ

Shlukování trombocyt ů Sn ížení hyp erkoagul ability -

Trombus ...,

I Antikoagulace

Hlavním zamerem antikoagulační léčby je co nejrychlej ší dosažení stabilní dávky, udržení této dávky v terapeutických mezích a vy loučení vý-

účinné léčebn é

-

Rorpu št ěnifibrin o v ě s ítě

léčbu:

4.3.1. Monitorování léčby Laboratorní hodnoty použitých testů by se b ěhem antitrombotick é l éčby měly pohybovat v l éčeb n é m rozmezí. Jsou-li nižší ( n ed os tatečný č as) je nemocný ohrožen tromboembolickými piihodami, jso u-li naopak vyšší ( nad měrný Tl!lmll!l:!;] čas) je nemocný ohrožen krvácivými komplikacemi. V dolní části je uveden příklad monitorování léčby kumariny po- L_-=::::::::~_J mocí protromb inového testu:

•

...

1\

----

-

Nadm ěrný čas

INR

4 :

.

I

Léčebné rozm ěz í

3 : I

2 : 1 :

Nedostatečný čas

~--- - - - - - - - - - - - - - - - ------ - - - - - -

1

2

3

208

STOP>

Fibrin

,.....

Rozlišujeme antitrombotickou O antikoag u lač ní O tromb olytickou O an tiag regač ní

n

Fibrinogen

zákroky u projevů trombogeneze vychází z toho , že podaná účinná lát -

doba léčby

(měsíce)

zn amnějšího před ávko vání antikoagu lačním pů sobkem .

Inhibice koagulace lze dosáhnout řadou způsobů: • Inhibice iniciální fáze koagulace • inhibit ory TF (TFPI) • inhibitory ostatních koagu lačních faktorů • Zamezením přeměny protrombinu na trombin • inhibitory F IXa • inhibitory F Xa • Blokádou účinku trombinu • přímé inhibitory • nepřímé inhibitory : blokují trombin zprostředkovan ě zvýšení účinku antitrombinu (UFH, LMWH) • Posílení přirozené antikoagulační odpovědi organismu • rekombinantní fyziologické protein y s ant i koag u l ační aktivitou (rekombinantní protein C, rekombinantní tromb omodulin ). Tyto faktory stimulují p ři­ rozenou an ti koag u l ačn í schopnost organismu. • Potlačení geneze faktorů závislých na vitaminu K • antagonisté vitaminu K (kumarinové preparáty)

4.3.2.1. Nepřímé inhibitOlY trombinu Nepřímé inhibitory trombinu vyžadují další substanci, která jim umožní připojit se k molekule trombinu. Mezi látky, které u sn adňují připoj en í inhibitoru k molekule trombinu patří heparin.

209

Heparin byl objeven Mc Leanem v roce 1916 (Mcl.ea n, 1916). Je to při rozen ý mukopol ysacharid s výrazněj ší m zastoupením síry (polysulfonovaný glykosa minoglykan). Jako anionický polysacharid obsahuje zbytky kyseliny uronov é. Tvoří se v lidských tkáních, hl avn ě v játrech, plicích a ve s třevě. Samotný heparin má minimální antikoagul ační ú činky. Antikoagul ační ú činek heparinu je zprostředkov án 2 cestami : • Antitrombinem - viz kapitol a " Systémy inhibitor ů hemostazy " • TFPI - uv olňuje TFPI (dochází k inhibici dimérního komplexu [FVIIa . TF])

o

V systému hemostdzy nepotencuje heparin pouze inhibici aktivovaných koagulačních faktorů,

ale ovliviíuje také primární hemostdzu, endotel a fibrinolyzu. Je známo, že určitá část heparinu se spotiebuje k nezbytné saturaci endotel u. Heparin se so učasně váže na různ ě látky a buněčn é systémy, které sp o lup ůsob í v heinostdze. D ůle žit á j e schopnost heparinu vázat se na granulocy ty, lymfocyty a makrofágy, což se projevuj e zej ména u zánětli vých stav ů . Heparin j e schopen se vázat i na různ ě mak romolekulární látky v organi zmu, jako js ou lipoprot einy, enzymy a l ěky. O PN podávání heparinu j e známa celá řada lékových interakcí, které j e nutno pťi této l ěčb ě brát v úvahu , ovlivněn í potravinami neni známé.

Heparin se získává frakcionovaným enzymatickým sliznice.

štěpením prasečí

nebo ho-

vězí

fV\I\I\IV\ NV\

/VV\ P ři

frakcionaci dochá zí k postupnému heparinových ře tě zc ů na nízkomolekulární složky (LMWH, LLMWH - low molecular weight hepar in, low LMWH) , příp adn ě až na jednotlivé oligosacharid y. š těpen í

Rozlišujeme 2 druhy heparinů: Název : Ozna čen í: nefrakciono vaný heparin DFH nízkomolekulární heparin LMWH Nefrakcionovaný heparin (Unfrakcíoned heparin - UFH)

Nefrakcionovaný heparin, tak jak je využíván v klinické praxi, je heterogenní s měs pol ysacha ridooso; oso; vých ře tězc ů rů zné molekulové L Část řetězce UFH hmotnosti v rozmezí od 3 000 do 40 000 daltonů . Obsahuje průměrn ě 45 monosacharidových jednotek. Jen asi jedna třetina ietězc ů UFH obsahuje pentasacharidovou sekvenci, která se váže na antitrombin. Jinou sekvencí se pak váže na trombin v poměru 1 : 1. DFH může L NHSOj

Ott

NHSOj

Otl

NHSOj

NHSO j

oso;

NHSO ;

--'

--'

Pentasacharidová sekvence

potencovat úč inek AT i k jin ým serinovým proteázám ( n apř. inhibice F Xa). V těchto případech se váže svou pentasacharidovou sekvencí k AT, ale neváže se k F Xa. DFH dále snižuje produk ci TF in vitro (stericky omezuj e jeho expozici na monocytech). I přes tyto jeho výhodné vlastno sti má jeho praktické využití n ě koli k závažných ned ostatků : • Dlouhé molekuly UFH se nepiedvůlateln ě váží na řadu protein ů piůomnyclt v plazmě, dále na destičky, bulíky endotelu a makrofágy (A nde rsso n a spo l., 1979). Výsledkem těchto interakcí je výrazná variab ilita antikoagu lačního ú čin­ ku s nutností čas téh o monitorování a úpravy dávkování. • Jedním z protein ů inhibujících účinek heparinu je PF4. Prasklý atero sklerotický plát s aktivovanými tromboc yty, které u volňují PF4 tak mů že být parado xně místem, které je v ůč i a n t i k oagu l ač ním u ú činku heparinu rezistentní. • Další podstatnou nevýhodou DFH je jeho neschopnost inaktivovat trombin vázaný na fibrin, což mů že vést k n epříjemné reaktivaci koagul ačního procesu po náhlém přeru šení terapie (rebound fenomen). Pro rychlost svého účinku se hodí hepa rin spíše k oš etření akutních s tav ů při vzniku cévní příh ody. Heparin se aplikuje parenterálně, jeho účinek lze o věřo vat pomocí APTT. Nízkomolekulární heparin (Low molecular weight heparin - LMWH)

LLMWH

o ligo s ac ha ridy

ců ,

210

Monitoro ván í l ě b č y: APIT aktivita Anti Xa

M W'

3-40 tisíc Da 4,5-6 tisíc Da

Nízkomolekulámí heparin y jsou heterogenní s měs í kratších heparinov ých ře tě z­ které vznikají chemickou nebo enzymatickou depolymerací UFH . Jejich pr ů211

měrn á molekul ová hmotnost se pohybuj e v roz mezí 4 500- 6 000 Daltonů. Není to jen délka řetězce, kterou se výc hoz í a koneč ný produkt depolymerace odlišují. Při depolymeraci doch ází k modi fik aci monosacharidovýc h jednotek v místech š tě pen í a k tvorb ě nových koncových skupin. Výsledk em je různá biologická aktivita konečn ých p roduktů , které se pak v zájem ně liší schopností váz at trombin, uv olňovat TFPI, vázat se na heparinový kofaktor II, uvolňovat PAI-l a ovlivňovat adh ezi destiček . Rozdílné jsou i farm akokinetické vlastnosti a jejich inaktivace protaminem. U LMWH je p odobně jako u UFH antikoagul ační účinek podmín ěn potlačením tvorb y trombinu. LMWH velmi účinně potencuj e v přítomno sti AT inhibi ci faktoru Xa . Vazba pentasacharidové sekve nce LMWH na antitrombin mění konformaci molekuly a usnadní vazb u F Xa k této molekule. Dojde k výraznému zesíle ní inhibičního efektu a ke sniž ení produkce tro mbinu, zatímco aktivace ostatními mechanismy je v tomto případě zachována.

4.3.2.2.

Kratší h eparinově řetězce, které obsahují méně než 18 monosacharidovycb jednotek, kterých je ve směsi 50-75 %, nejsou schopné vázat AT i trombin současně a proto trombin neinhibuji. Z těchto důvodů j e inaktivace trombinu 4 x menší než inaktivace faktoru Xa.

•

Hirudin V roce 1884 obje vil J. B. Hay craft antikoagula čni akti vitu u pijavice l ěka ťsk ě Hirud o medicinalis. Hirudiny j sou známy jako nej silněj ší inhibitory trombinu. Hirudin tvoří s trombinem dimérní komplex [hirudin . trombin). Takto vyvázaný trombin ztr ácí své proteolytic ké schopnosti a to jak v hemostatických procesech, tak i mimo ně . Léčebný an ti koag u lační ú činek hirudinu je srovnatelný s LMWH. Hirudin

•

Hl avní předno stí nízkomolekul árních nost úč i n k u a lepší snáše nlivost.

heparinů

je

p oměrně

dobr á

pře d víd atel ­

Pentasacharidy Pentasacharidy, zprostiedkovan ě přes antitrombin selektivně blokují F Xa. Jsou to syntetické látky, analo ga pentasach aridové sekvence heparinu , které zprostředkuj í interakci s AT a vznik trimerního komplexu. Jedná se o krátký řetě zec obsahující sek venci 5 monosacharid ů . Výhoda: j ednoduché dávkování, dlouh á doba účinku , který je dobře snáše n a je předvídatelný.

Nevýhody : není známo antidotum. 212

•

v lidském oganismu:

formaci koagula - přeměnu fibrinogenu na fibrin , aktivaci F XIII aktivaci faktorů V a VIII trombocyty - inhibuje jejich agregaci, uvolňovací reakci a syntézu TXA 2 leukocyty - inhibuje produkci cytokinů makrofágy - inhibuje chemotaxi

v cévní stěně

• • •

Rozdíl mezi UFH a LMWH

ovlivňuje některé pochody

v krvi:

•

Krátké heparinové řetězce LMWH j sou ve srovnání s UFH: • v mnohem menší míře vázány na plazmatické bílkoviny a buněčné pov rchy, proto mají delší plazmatický poločas. • LMWH j sou také méně vázány na destičky a k PF4 . Tím se vys v ě tl uje nižší incidence heparinem induk ované tromb ocyt openie v po rovnání s UFH. • Ale ani léčba LMWH není optimální, terapie neovli vní trombin vázaný fibrinem.

inhibit01Y trombinu

Přím é inhibitory trombinu inhibuj í trombin tak, že se váží přím o na j eho molekulu bez pů­ sobení další zp ro středkující látk y.

• • • • •

Inaktivace F Xa je zachová na a to i v případě, že je tento vyvázán na fosfolipidovou membránu krevních destiček. Inaktivace F Xa zpo malí koagul ační proces j iž v jeho ranné fázi aktivace.

Přímé

endotelové bu ňky - inhib uje syntézu a u volň ování prostacyklínu, EDRF, t-PA, endotelinu, TF, inhibuje aktiva ci proteinu C fibrobl asty - inh ibuje j ej ich proliferaci hladké svaly - inhibuj e jej ich kontrakci a mitogenezi srdečn í sval - inhibuje pozitivní inotrompismus

mimo to hirudin: •

ovlivňuje

nádorové

buňky

- inhibuje jejich adhezi, tvorbu metastáz a

růst

buněk

• •

ovlivňuje neurony - inhibuje regulaci tvorbou komplexu [hirudin . trombin]

rů stu vyřazuj e

ze hry antitrombin

Využití hirudinu v diagnostice • Stan ovení tromb inu a protrombinu • Odli šení trombinu od ostatních plazmatických proteáz • Testo vání tromb inem indukovaných bun ěk a funkcí krvinek • Stabilizace krve (může sloužit jako antikoagulans) Nekovalentní inhibitory trombinu • MEGALATRAN (XIMELAGATRAN). Tyto látk y jsou účinné i peroráln ě. Výhody: není nutné monitorování léčby a neváže dal ší plazmatické proteiny - lze s výhodou využít při l é čbě heparinem indukované trombocytopenie. Nevý hody: není známo specifické antidotum. 213

o

Kovalentní inhibitory trombinu • syntetické tripeptid y, které se váží na aktivní místo trombinu vnitřní

~

Strukturn í vzorec vitaminu K

Podle terapeutického účinku dělíme dikumariny na: • preparáty s krátkým biologickým poločasem (2-8) hodin - dří ve hoj n ě pou žívané preparáty Pelentan , Pelentan ettae. • preparáty s del ším biologickým poločasem (2- 5) dnů - Wmfarin, Coumadin , Ma rcumai:

Protein (TAP) Antistasin DX-9065a DPC906 Hírudin Bivalirudin Argatroban Ximelagatran

Dicumarol I

Přímé

Vitamin Kl je obsažen v chloroplastech zelených rostlin. Proto se u nemocných léčených dikum ariny n edopo ručuje pit í bylinných odva rů, n eboť dochází ke zm írněn í antikoag u lačnicli účinků dikum arin ů. Rozšiie no bylo hla vně pití kop iivo v ěh o čaje.

a

nepřímé

Phenprocoumon

I.

Warfarin sodný o

W

",, 11.ó

inhibitory trombinn a faktoru Xa

ONa

yH

-O ~

t?

CH

I 3 CO I

4.3.2.3. Potlačení geneze [aktont závislých na vitaminu K M ezi antagonisty vitaminu K patří preparáty kumarinu. Tyto látky snižuj í jaterni syntézu faktorů závislých na vitaminu K (blíže viz kapitola plazmatické koag u lační fakto ry). Ustáleného stavu plaz ma tickýc h hlad in p rep arát ů kumarinového typu se docílí teprve po několika dnec h od zahájení léčby, úči ­ nek l éč by je možné monitorovat protrombinovým testem.

ONa

CH 3

,--:==-=:;iii.;----l 4.3.2.4. Monitorování antikoagulační léčby kumarin y

Kumarinové preparáty a jejich na hemostázu

Účinek dikumarinů

Vitamin K je nezbytný k syntéze koag u lač n ích faktorů závislých na vitamínu K. Jedná se zejména o faktory II, VII, IX, X, protein C a S v játrech. Deriváty kumarinu a indandionu mají stru kturální podobnost s vitaminem K a omezují jeho účinek při gama-karboxylaci glutamové části ko agulačních faktorů (klesá nejdříve hladina faktoru VII, pak X, IX a nakonec protrombinu). Jejich účinkem vznikají faktory, které nemají plnou fyziologickou funkci při vazbě na fosfolipidovou matrix - tzv. PIVKA faktory (PIVKA = rrotein [nduced by Yitamin K Antagonist). 214

xxx co

Protrombinový test Test zachycuje v nější cestu aktivace koag u lač ní ho děj e , při kterém přeměna fibrinogenu na fibrin není ov liv něna faktory XII, XI, IX, VIII a fosfoli pidy krevních desti ček. Test je startován p řid án ím kalciového tromb oplastinu (s měs tromboplastinu a iontů Ca 2+) .

účinek

NH XX XX

CH2

I

CH2

PI VKA (n efun kcnifIJklor )

I

.L V ita min K

coo-

.

It'" I

cyklus

v itamin KH~itaminu K .,..earboxylasa . CO l ' O) vita m m K

I

XXX fO N H

CH2

I

xxx x... ......

CH .COO·

_

l

inhibiCfJ

[ ~ rá ln jml anUkoaglJJancij

I

coo-

(unkčnl koogulačnf fak tor

i

T vor ba fibrinového vlákna

I

INR a ISI Po dop oru čen í ICSH (Mezinárodní výbor pro standardizaci v hematologii) a WHO byl v r. 1982 zaveden pro vyjádře n í tromboplastinového testu: Mezinárodní normalizovaný poměr - INR (International Normalized Ratio) Výsledek laboratoře je vyjádřen poměrem tromb oplastino vého času nernocn ého (t p ) a času s měs né kontrolní plasmy (tN ) . Podle rozhodnutí WHO jsou labo ratorní výsledky vyj ad řovány v mezinárodních normalizovaných poměrech - INR. Tento zp ůs ob je jednotný v celém světě . 215

INR vyjadřuje p oměr tp/tNzískaný s tromb oplastinem BCT 67/40 ( referen ční reage ncie WHO od I: 1978, lidský tromboplastin uložený v lyofilizo van ě form ě v kapalném dusíku ). U ostatních t romb opl astinů se zj išťuj e pomocí kalib race. INDEX CITLIVOSTI - ISI Clnternational Senzitivity Index)

-

-

-

-

-=-

-

-

- --

-

-

- - --

-

-

- -- - - - ,

:J

Ak tiv ovaný parciální tromboplastinový test (APTT)

~

1,7

g." .c

1,6 -I----------------==--~~....~-----_____i

,g

1,5 -

.,g 'e:

1,4 -+---------_-_'S-I~I--IIl---------____i

E

"E"

"O l:

~

1,3 -1- -

js ou je dnak v polyvalentním ú činku heparinu a dále v testu samotném. je důle žité zajistit vyváženou hladinu nefrakcionovanéh o hep arinu, která je schopna udržovat efektivní h ypokoagul ační stav a s ouč as ně neoh rozí pacienta krvácením . B ěhem léčb y

Monitorování léčby nefrakcionovaným heparinem (UFH) Nižší léčebn é dávky nefrakcionovaného heparinu se sledují pomocí aktivovaného parciálního tromboplastinového testu (APIT). U těchto dávek se předpokl ádá, že koag u lač n í č as tohoto testu je přímo úměrný hl adin ě heparinu v pl azmě nemocného.

Kalibrace tromboplastinu 1,8 .---

Příčin y

APIT popisuje hl avně vn itřní cestu koag uděj e . V p řítomno sti fo s fo li p i d ů krevních desti č ek a po kontaktní aktivaci plasmy chud é na d e sti čky se test startuje přid áním chloridu vápenatého. l ačn ího

-

-

-

-

-

_.,:;-

y= 1,18x -0,16 1,2 +------./~-------------''---'-'-'-:..:..:---'-'-'-=-----1 Iť= 0,96 1,1

o

Tvorba fibrinového vlákn a

Monitorování l é čb y heparinem předsta vuj e stále velký problém. Dosud není k dispozici test, který by odrážel antitrombotické pů sobení heparinu u nemocného.

Heparin má pon ěkud odlišné vlastnosti v systému in vivo a in vitro, ke kterým j e nutné b ěh em mo nitorování p ťihližet. V sys tému in vivo j e heparin Z části vyva zován PF4 u vo ln ěným z krevníc h destiček. Dále j e nutné brát odlišnou účast v systému an titrom b in o v ě a anti Xa aktivity. K an tikoagula čnim u efektu pii spivaji i n ěkteré daší fyziologické fa ktory j ako je tělesná hm otn ost, pla sm atick ě proteiny (zej ména v dob ě zánětu ), cirkadiál ní rytmus. Toto vše so u h rnně piispiv á k citli vosti reagencií v piipad ě vyhodno cení terap eutického účinku heparinu v systému APTT. O V některých pťipadecli zejména tam, kde dochází k výrazn ějšímu vyva zování heparinu na plasmatick ě proteiny, m ů že dochá zet k tomu , že dávky a hladiny A PTT nekoreluj í. V takových piipadech j e vhodné sledovat hladinu heparinu v plazm ě j inými metodam i (napi: chromogenni metodou ). O Běh em monitorování hladin heparinu, zej ména p ťi antikoagula čni terapii žiln í trombózy mz/že docházet k následujícím p rob l ém ů m: J. Jde o akutnístav , který je provázen vzestupem bílkovin ran n ě f áze, které soutěží s AT o vazbu na UFH. Jedná se zej ména o tyto slo čen iny: vitrone ctin, na histidi n bohatý glykoprotein - HRG (histidin rich glycop rotein) , PF4. 2. Pokles AT - pii poklesu pod 50 % m ů že docházet k tzv. " heparino vé rezistenci" - tj nedostatku AT, pii kterém nedochází ke vzniku ternárního komplexu fAT . trombin. hepar in]. Zji šťuji se kratší časy APTT, než by odpovídalo dané léčbě. V těchto ptipadech j e nutn é podat intraven ózně AT. 3. Zvýšené hladiny F VlIl a fibrinogenu (vyvo lané akutním sta vem ). Doch ází ke zkrácení časů APTT i pii terape utických dávkách heparinu , díky zvýšené

216

217

~

.2

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

1,7

log (I) kalibrovaného Iromboplaslinu

Index citli vosti - ISI udává s měrni c i používaného trornb oplastinu , která byla získána poro vnáním referenčn ího tromboplastinu s trombopl atinem kalibro vaným. Hodnota INR pro daný vzorek a aktuální tromb oplastin se vy p oč te ze vztahu:

INR=

[

tp] tN

ISI

lSI - hodn ota indexu citlivosti použitého tromboplastinu l p, tN - časy pa cienta a nornuilu (kontro ly) Fyziologické rozmezí lNR:

n el éč ení l éčení

0,8-1 ,2

(piihltii se k diagnóze)

4.3.2.5. Monitoro vání antikoagulačnÍ léčby preparáty heparinu

aktivitě

FVIIl a zvýšeným hladinám fibrin ogenu. Hovotime o tzv. " nepravé hepa rino v ě rezistenci". 4. Dochází k prodlouženíAPTT a to: - extrémně: pii deficitu F XII a faktorů kontaktní fáze (plná korekce po p ťidáni normální plazmy). - méně výrazně: v piůomnosti protilátek typu LA (nedojde ke korekci). Při heparinizaci krve u mimotělních oběhů se využívá vysokých dávek hepari nu, které nejsou m ěřitelné APTT. V těchto případech se léčba heparinem monitoruje pomocí aktivovaného koagulačního testu - ACT.

Aktivova ný koagulační test (Activated .c;Joting Iime - ACT) ACT je metod a zavedená v r. 1966 Hattersleyem a podobn á svým principem APIT, ale provádí se na rozdíl od APIT přímo s krví. Metoda využívá kontaktních látek, jako jsou silica , celite nebo kaolin, ale bez přidání fosfolipidů . Kontaktní aktiváto ry jsou umístěny ve speciálních "cartriges", které jsou uzpůsobeny k měření ACT pomocí zvláště k tomuto účelu uzpůsobených přístrojů . Po přidání vzorku do .cartriges" se iniciuje kontaktní fáze srážecího procesu a tvorba fibrinu je m ěřena mechanickými nebo optick ými přístroji.

o • • • • •

Si/ica , celite, kaolin jsou r ům ě form y jemně drcených kiemi čitan ů s velkými kontaktními po vrchy

Monitorování léčby LMWH LMWHjsou hepariny vyrobené řízenou enzymatickou frakcionaci. Maj í proto přibližně strukturovanou délku polysacharidového řetězce a a z toho vyplývá, že mají i lépe definovatelnou molekulovou hmotnost. Nízkomolekulární hepariny vykazují, vzhledem ke své struktuře (nedostatek sacharidových jednotek pro vznik komplexu [AT . LMWH . trombin)), méně interakcí s trombinem a přednostně in aktivují F Xa . Na základě těchto skutečností je účinnost nízkomolekulárních heparinů předví­ datelnější, než účinnost UFH . Navíc LMWH mají nižší afinitu k endotelu, plazmatickým bílkovin ám, makrofágům a destičkám . Na podkladě anti Xa aktivity nízkomolekulárních frakcí heparinu je zalo žen princip jeho stanovení v plazmě. Nízkomolekulární heparin tvoří s antitrombinem dimerní komplex [AT . LMWH], který vyvazuje v nadbytku dodané definované množství čistého F Xa. Zbytkové množství F Xa lze měřit koagu lačně nebo metodou chromogenních substrátů. Pokles faktoru Xa je nepřímo úměrný koncentraci LMWH . S testem neinterferují FOP a zvýšené hladiny F VIII. Tyto složky výrazně ovlivňují APIT a ACT. Terapeutické hodnoty: 0,3-0,7 anti Xa U/ml

Tvorba ribrinového vlákna

Sledovan ý systém: přeměna fibrinogenu na fibrin Reakční směs: vyšetřovaná krev + aktivátory Starto vací reagenci e: krev Časy kontrolní plasm y: 120-180 s Terap eutické hodnoty: 300-600 s

ACT je výrazně ovlivněn hladinou heparinu (prodloužený čas je úměrný koncentraci heparinu). Test dále ovli vňují tyto faktory: nevyváženost aktivovaných koagulačních faktorů a inhibitorů , lýza destiček , zvýšená hemodiluce , hypotermie nemocných a jiné. Test je závislý hlavně na kontaktní fázi a získané časy mohou mít značný rozptyl. Výhody tohoto testu jsou v jeho jednoduchém provedení a v použití přímo na klinickém pracovi šti ke kontrole heparinové dávky. ACT je využitelný jen pro nefrakcionovany heparin, který je podáván ve vysokých dávkách při mimotělověm oběhu , tak jak je tomu při hrudní chirurgii nebo u dialýzy. APIT nelze v těchto pří218

padech použít, protože monitoruje nižší hladiny heparinu . Citlivost k LMWH a hirudinu je velmi nízká a proto test nelze využít ke sledování hladiny těchto přípravků .

V PRAXI SE

VĚTSINOU OBEJDEME BEZ LABORATORNí KONTROLY!

4.3.2.6. Monitorování léčby hirudinem Když vyloučíme APTT, který je v případě hirudinu spojen s řadou prob lémů, zbývá několik testů , kterými lze přesně stanovit hladinu hirudinu v plazmě ( např. chromogenní metoda, ELISA aj .). V praxi se však nejčastěji používá ecarinový test.

Sta novení hlad iny hirudinu (Ecarinov ý test, Eca rin .c;Joting I est - ECT) Ecarinový test byl publikován Novakem a Buchou v roce 1996 (Novak a Bucha , 1996). • Sledovan ý systém: po aktivaci koagulačního systému ecarinem dochází k přeměně protrombinu na trombin a následně fibrinogenu na fibrin. 219

Tvorba fibrinového vlákna

•

Reakčn í směs :

•

plas ma Sta rtovací reagencie: ecarin

o

vyšetřova ná

a tím se plasm inogen dostává do vni třních struk tur tro mbu. Po aktiv aci srážecího procesu dochází ke zvýšení kon centrace trombinu , který uvolní t-PA z endotelových buněk . Rovn ěž při vazo kons trikc i se může uvoln it určité množství tká ňo véh o aktivátoru plazminogenu . Ten se váže na fibrin a spo leč ně s plasminogenem vzniká trimerní komplex [plasminoge n . fibri n . t-PA] . Komplex zahájí p řem ěnu plazm inogenu na pla sm in, který zp ůso b í lýzu fibrinu u vnitř trombu. Alfa, antiplas min neinhibuje komplex [plasmin . fibr in], tak že fibrinolýza uvnitř trombu může volně probíhat.

E cari n j e me taloprote áza z je du hada Echis carinatus, ktery akti vuje piem ěnu protrombinu na trombin v prostiedi nezávislém na fosfolipidech a Ca2+.

4.3.3.2. Tromb olytika Rozdíl mezi

účinkem

pr otrombinázy a Ecarinu

Při

reakci se nejp rve tv oří mezotrom bin, který je rychle inak tivován ecarinem na mezotro rnbin -des -F l , jež s pontá n ně přech ází na a -trom bin. Trombin pak vyvo lá pře měn u fibri noge nu na fibrin. Heparin n eo vli v ňuj e výs ledek testu. ECT mů že být vyše tře n v plné krvi nebo pl azm ě.

P rotrom biná zou vyvolaný koagula ční test (Erot hro minase [ndu ced Qoting lest - PiCT ) PiCT je nový test vyvinu tý Calatzisem v t: 2000 , kte/ý je možné pou žít k monitorování všech tYP/I h epa rin ů a in h ihito rů trombinu , jako je hirudin . Test je založen na aktivaci plazmy enzymem jedu Russelovy zmije, který aktivuje pouze F V (RVV-Va). V přítomnosti fosfoli pidů, Ca 2+ a přidaného F Xa dojd e k tv orbě prot rombin ázy na povrc hu aktivovaných desti ček . Po urč ité době inkubace se nastartuj e tvorba trombinu, kter á vede k následn é p řeměn ě fibrinoge nu na fibrin.

4.3.3. Trombolytická

Trombolytika jsou látky, které vyv olávají a tím aktiv ují fibrinolytický proces.

Trombolytická léčba j e vedle chirurgické léčby jedinou aktivní m etodou léčby trombóz. Úspěš nost trombolytické l éčby odvisí na čas né m začátku (Marder a She rry, 1988). Trombolytika aktivujifibrinolytick ě vlastno sti krve zej ména voblasti trombu. Aktivace probíhá při ú č as t i endogenních nebo exogenních aktivátorů plazminogen u. Cílem trombolytické léčby je zprůchod nění tepny nebo žíly, bypas su či di aly z a č n íh o zkrat u. D ů s l e d kem včas né úpravy cirku lač níc h p om ěrů je zlepšení funkce postiženého orgá nu či ko nče ti ny, a tím sníže ní mort ality ( úmrt nosti) .

plazminogenu na plazmin

Ideální trombolytikum by měl o být: • specifické ke štěpení fibrinu • s rychl ým nástup em fibrin olytické aktivity • s dlouhým plazmatickým poločasem • nemělo by být antigenní Všechny požadavky zatím nespliiuje žádné z trombolyti k užívaných v klinic e. PN rozhodování o výběru některého Z dost upných prepardtů j e tie ba posuzo vat jeho vlastnosti s ohledem na okolnosti, za nichž bude pou žito.

Trombolytika dělíme na: • Přímá tromb olytika • Nepřímá tromb olytika

O

léčba

přeměnu

Dříve se používalo generace.

4.3.3.3.

Nepřímá

dělení

podle

účinnosti

a historického vývoje na léky 1.-111.

trombolytika

Streptokináza, streptáza

Vznik trom bu je výs ledke m interakcí mezi aktivními složka mi krve, endote lem a případně subendotelový mi strukturami. B ěh em srážení krve dochází k navázání asi 4 % plasminogenu na fibri nová vlák na. Fibrinová depozita jsou součástí trom bu

Je to n eenzymovy protein o MW 47 000 produkov ány určitými typy {3-/zemolytickýc/z streptokoků . Str eptokin áza nem á vlas tní proteolytickou aktivitu a aktivuje fibrinolytický systém nepiůno . Má vysokou afi nitu k plazm inogenu , s ním ž v poměru I : I v ytv áří komplex [plasmin ogen . streptokináza], kter ý je ú činným aktivá torem plazminogenu , Takto p ro storo vě u sp ořád aný komplex pak š tě pí plasminogen volný i vázaný v trombu na plazmin . Předp okl adem jeho ú č inn o s ti j e do statečn é množství volného plazminogenu. Plazmatický pol očas je udáván v roz mezí od 18 do 30 min.

220

221

4.3.3. 1. Mechanismus trombolÝzy

Streptokináza obsahuje 2 komponenty: • rychlá složka (biologický p ol očas 18 minut) - vazba na protilátky • pomalá složka (biologický poločas 83 minut) - odráží systémovou clearence Streptokináza + Plazminogen

- - - - ----1.. ~

Biochemicky jde o polypeptid existující ve dvou formách : • urokináza s MW 54 000, H-UK: vyšší fibrinolytická aktivita • urokináz a s MW 33000, L-UK : nižši fibrinol ytická aktivita

[plasminogen . streptokináza]

Plazminogen

~

.. Plazmin

Nevýhody: • cizorodá látka - pů sob í jako antigen. Indukuje tvorbu neutralizačních protilátek, které limituj í možnost opakovaného podání (od 5 dn ů do I roku). Dnes existují vý h rad ně purifikované formy streptokinázy a pře sn ě definovanou MW, bez pří ­ m ěsi balastních látek. • odbourává i fibrinogen a nemocný je ohrožen krvácením. Při

klinick ém podávání musí být nejprve nasycen bolus protilátek vůči streptokináze (tzv. aiuistreptolysin ů) . Tato hodnot a je u každého jedince jiná a kolísá mezi 25 000-3 000 000 jednotek. Proto se v klinické praxi mohou vyskytnout případy, kdy stejná dávka trombol ytika je u jedné osoby ú činn á a u druhé způ sobuj e systémový Iytický stav. Zvýšení titru protilátek proti streptokin áze po její aplikaci znemo žiiuje většinou opakované podání u stejného netnocn ěho.

Antistreptáza, ani streptáza (APSAC - Anisolated Plasminogen Streptoki nase Acti vator ~omp lex ) APSAC je komplex streptokin ázy a lidského plazminogenu, jehož aktivní centrum je reverzibilně inaktivováno acylací. V pl azmě je acylová skupina hydrolyzována a katalytic ká aktivita se obnoví. V nízkých dávkách nutných k dosažení reperfuze ob d ob ně jako u streptokinázy mů že docházet k depleci fibrinogenu a s tím spojených krvácivých komplikací. Též se mohou vyskytovat alergické reakce a hypotenze. Plazmatický polo čas je 70 minut (50-90 min.). Molekulová hmotnost je 131 kDa.

urokin áza Plazminogen - - - - - -....~ plazmin

Výhody: • neni antigenní, nevyvolává tvorbu protil átek , takže léčb a není doprovázena alergickými komplikacemi a mů že být kdykoliv opako vána.

4.3 .3.4. PFímá trombolytika Tkáňový aktivátor

plaz min ogenu (t-PA - Iissue Elasminogen Activator)

Tkáňov ý aktivátor plazminogenu (t-PA), je syntetizován endoteliálními buňka­ mi a ke klinickému užití je získáván rekombinantní DNA technologií (rekombinantní: rt-PA). Struktura jeho molekuly má vazebné místo pro fibrin (NH rterminální řetězec) a katalytické místo, které konvertuje plazminogen na plazmin (Mark a spol., 1995). Biologick ý p ol oč as < 10 minut.

Vyskytuj e se ve dvou formách: • j ednořetězco vá altepláza (single chain tissue : set-PA) • dvouřetězc o vá dutepláza (two chain tissue: tet-PA), t-PA se s vysokou afinitou, zej ména ve vnitřních strukturách trombu, specificky váže na fibrin . Vzniká komple x [fibrin . t-PA], který indukuje přeměnu plazminogenu na plazmin . Teoretický předp oklad snížení krvácivých komplikací nebyl při praktickém užití potvrzen . Krátký plazmatický poločas, 4-6 minut, umožňuje č as n é pro v ád ění invazivních vý ko n ů . Molekulová hmotnost je 68-72 kDa.

Výhody : • Protože je humánním enzymem , neindukuje antigenní odpověď.

Urokináza Mc Farlane a Pilling popsali fibrin olytickou aktivitu normální m oči ji ž v 50. letech minulého století. Urokinázaje enzym tvořený epiteliáln ůni buiikami močového traktu . Vyskytuje se v moči zdravých lidí, ze které se také připravuje . Plazminogen aktivuje na rozdil od streptokindzy přímo , což usnadňuj e říze n í n ěkte rý ch léčebn ých p o stupů. Urokináza nepů s obí lytick y jen na fibrin . Plazmatický p ol o č as je průměrn ě 15 min. (10-30 min.). 222

J iná trombolytika V praxi se dnes používají další trombolytika, jako je n apř. retepláza (single-chain urokina se plasminogen activator: scu-PA), prourokin áza (PUK) a staphylokináza (STA-r, rekombinatní).

Vlastnosti nově vyvíjených trombolytik: • jednoznačná specificita pro fibrin 223

• • •

4.3.3.5. Monitoro vání trombolvtické léčby

omezené krvácivé komplikace vyšší % rekanalizací opakovaná aplikace

o

NEJŠiRŠíHO UŽITí DOZNALA STREPTOKINÁZA. NEVÝHODOU TÉTO LÉCBY JE PO-

Jednorázové podání trombolytika Indikace: infarkt myokardu do 6 hodin od vypuknutí obtíží (retrosterná lní bolesti) Léčba: Jednorázová dávka trombolytika (streptáza 1-1 ,5 milionu j ednotek

MĚRNĚ DLOUHÁ DOBA PŘETRVÁVÁNí ANTIGENNíCH PRODUKTŮ. TUTO NEVÝHODU

+ hydrokortison)

LZE ELIMINOVAT NÁSLEDNÝM POUŽITíM

t·PA

Monitorování: neprovádí se

NEBO UROKINÁZY.

o SCHÉMA PŮSOBENÍ SOUCASNÝCH TROMBOLYTIK

Kontinuální podávání trombolytika Indikace: arteriální a žilní uzávěry, plicní embolie Léčba:

kontinuální dávkování trombolytik a (streptáza 3-5 milionu jednotek

+ hydrokortison ) Monitorování: trombinovy test Léčebn é rozmezí: 30-90 sekund

Terapeutický zásah

o C§OCé~

(2romS>

plazminogen

[plazminogen • fibrin]

plazmin

---------+ ~

[plazmin . fibrin]

intravenózní fibrinolýza fibrinogenolýza plazminogenolýza

Indikace k použití trombolytik • • •

arteriální a žilní uz ávěry (infarkt myok ardu, periferní arteriální plicní embolie hluboké žilní trombózy

Nežádoucí účinky trombolytické

uzávěry )

léčby

O krvácivé komplikace - krvácení bývá závislé na dávce a způ s o b u aplik ace O alergické reakce - nejč astěji se vyskytují při aplikaci streptokinázy 224

Hydrokortison má zabránit alergické reakci

4.3.4. Antial:rel:ačnÍ

léčba

Přijdou-li kre vní desti čky během cirkulace do styku s obnaženým kolagenem v subendoteliální vrs tv ě cé vní s těny v dů­ sledku ruptury aterosklerotického plátu, dochází v tomto místě k jejich adhezi. Zále ží na rovnováze proagregačních a antiagregačních mechanismů, zda tento děj přestoupí do tvorby destičkového trombu (Vojáček, 2002) . V současnosti dostupné proti destičkové léky interferují s rů zn ými kroky aktivačních procesů, včetně adheze, uvolňov ací reakce nebo agre gace a snižuj í riziko arteriální trombózy, ale mohou zvýšit riziko krvácení při jejich předávkování. Indikace prot idestičko vé léčby vyplývá p řede v ším z přítomnosti rizikov ých faktorů tepenné okluze. Antiagregačniléčba je zaměřena na omezení shlukovaci schop nosti krevních destiček (Badimon a Badimon, 1996 ). Akti vace krevních destiček nabízí vzhledem k počtu z úč as tně n ý m faktorů n ěkolik úrovní, ve kterých je mo žno farmakologicky zasáhnout a léčbu je možné kombinovat.

Trombocyty je možné inhibovat ve fázi adheze, aktivace nebo agregace, padě můžeme potencovat jejich stabilitu: • Blokáda adheze krevních destiček na subendoteliálni matrix - blokátory GP IblIIa - antagonisté vWF 225

popří­

•

• •

Blokáda aktivačních cest a cykl ů - inhibitory COX (cyklus kyseliny arachidonov ěi - antago nisté TXA2 - blokáda ADP cesty - blokáda trombino vého receptoru Stabilizace krevních destiček - zvýšení dest i čko vé cAMP a cOMP Blokáda agregace krevních destiček - blokátory GP lIb/lIla - fragmen ty monoklonálních protilátek - syntetické peptido vé inhibitory OP lIb/lIla - nepeptidové inhibitory OP lIb/lIla (fibany)

4.3.4.1. Blokáda adheze krevních

destiček

na subendoteliální matrix

Ve fázi adheze lze inhibovat vazbu na obnažená kolagenní vlákna bu ď na úrovni d estičkov ý ch re c eptor ů nebo blokádou vWF, který tuto vazbu zpro s třed kuj e. • blokátory GP lb/Ua: zkouší se blokáda kyselinou aurinkarboxylovou , heterogenní směsí polykarboxylových polymerů nebo proteiny izolovanými z jedu B othrops jararaca. • antagonisté vWF : používaj í se nefunk čni fragm enty vWF , které obsazují vazebná místa. Blokáda na tomto místě zabrzdí vazbu tromboc ytů na obnažená kolagenní vlákna, zabrání jejich adhezi, aktivac i a po zděj š í agregaci.

4.3.4.2 . Blokáda aktivačn ích cest a 4.3.4.2. 1. BLOKÁDA ENZYMŮ

cyklů

CYKLU KYSELINY ARACHIDONOVÉ (TVORB A TXA:0.

Blokace acetylsalicylovou kyselinou (ASA) A n tiagregač ní úči nek ASAje dán interferencí s biosyntézo u cyklických pro stan oid ů v cyklu kyseliny arachidonové (Awtly a Loscalzo, 2000) . ASA vyvolá nevratnou inhibici cyklooxygetuizy a následné potlače ní syntézy tromboxanu A2 a dalších p ro stagl andin ů (Hilmerovti a Fi/ipovský, 2004) . ASA je p oměrn ě rychle deacetylována já try - plazmatický pol o č as je asi 20 minut. V roce 1991 byly zji štěn y 2 izoformy cyklooxygenázy: COX-l a COX-2 (Sainama a Elalamy, 2000). COX- I se nachází v krevních d est i č kách , kdežto COX-2 hl a vn ě v monocytech a makrofázích, ve kterých se tv oří "de novo". Obě izoformy cyklooxygená-

226

COX- 1

zy jso u membrán o vě vázané enzymy, které tv oří úzký a dlouhý hydrofobní kanál, do kterého vstupuje kyselina arachidonová uvolněná z poškoze né membrány . Enzymy katalyzují přeměnu této kyseliny na prostaglandiny. COX-l vzniká expre sí genu o velikosti 22 kB na chromosomu 2 nebo 9, kdežto COX-2 je kódová n genem o velikosti 8,3 kB lokalizovaným na chromosomu 1. Bílkovinné ře tězce obou cyklogenáz mají stej nou molekulovou hmotnost (72 kDa) a vykazují 63 % homologii v sekvenci aminokyselin (Vane a spol., 1998). ASA je 50-100krát účinn ěj š ím inhibitorem desti čkové COX-I, než monocytární COX-2. Pře sto že plazmatický p ol oč as ASA je p om ěrn ě krátký, stač í za tuto dobu inhibovat prakticky všechny destičky. Navíc se předp okl ád á , že ASA inaktivuje COX i v rel ati vně zralých megakaryocytech, ve kterých jso u již přítomny zárodky krevních dest iček (Aw tlY a Losca lzo, 2000) . Inhibice je nevrat ná a vzhledem k tomu, že de sti čky nedokáží COX syntetizovat, přetrvává po celou dobu biologického života trombocyt u (10-12 dní). V so učasné době se používá terapeutické dávky ASA v rozmezí 50- 100 mg za den. Tato léčb a by m ěla zajistit ú činnou blokaci syntézy tromboxanu Al> aniž by součas ně blokovala endoteliální produk ci P0l 2 . Účinek ASA na krevní destičky a endotelové buňky: • Ireverzibi lně acetyluj e cyklooxygendzu (CaX- I) v cyklu kyseliny arachidonové Molekulární mechanismus této inhibice spočívá v bl o k ádě COX kanálu v důs ledku acetylace hydroxylové skupiny serinového rezidua v m ístě Ser 529 . Tím je zabrán ěno p ří stupu substrátu ke katalytickému místu enzy mu (Patrono a spol., 2001) . • Ireversibiln ě inakti vuje COX-l v krevních destičkách, tím zamezuAcetylace ser inového rezidua COX -I je arachidonové kysel i ně se vázat částí své molekuly ke COX- I (Samama a Elala nty, 2000) . • Acetyluje CaX-I v endo telo vych bll1íkách a zamezuje tak následné konverzi arachidonové kyseliny na výrazné vazodilatátory, zejména na prostacyklin POI2 .

o kyselina arachidonová nenl blokována, prob íhá syntéza L-

p rosta gl andi n ů ----"'==='-------'

CaX-I (prostaglandin H synt áza: PGHS-I) j e exprimovd na mnoha tkán ěmi a buiikami, zahrnuj ící krevní destičky, endotelové buiiky, buiíky stievni sliznice a jiné. O Inhibiční vliv ASA k CaX-I j e závislý na dá vce. Jednorázová dávka 160 mg ASA nebo denní dávka 30-50 mg ASA po dobu 7-10 dmi by měla p lně inhibovat destičkovou

cox.t.

227

o

V n ěkte rych zemích se využívá inhibice triflusalem, který podobn ě jako A SA blo kuje cyk looxygendz u. Výhodou j e, že inhibice j e ome zena na cyklooxygendzu krevních destiček a cyklooxygetuiza endo telii neni ovlivněna. Syntéza prostacyklinu je tak plně zachována. O A cety lsali cy lová kyselina: již Hippok rates COOH COOH používal 400 let pied Kristem jako analgetikum a antipyretikum odvar Z vrbové k ůry, který obsahuje salicin - název odvoze n od latin ského názvu vrb y - Salix (Dalen, I 99 I) . Ital ský cheKyselina Kyselina mik Raffa el Piria vyluhoval Z extraktu vrbové salicylová ac etylsalicy lová lAS A) k ůry kyselinu sa licylov ou (Mc Kee a spol., 2002 ). V roce I 897 syntetizova l Felix Hoffm ann kyselinu acetylsalicy lo vou (Samama a Elalamy, 2000). Vliv Acetylsa licylové kyseliny na krevní destičky publikoval v roce 1967 Morris.

0°"

Existuje fenomen, který se nazývá "rezistence na A SA u. O tomto jevu lze hovoz klinického pohledu - jako o selhání protektivn ího účinku ASA před trombotickou komplikací, nebo ji lze definovat laboratorně - jako neschopno st způ s obit in vitro prok azatelnou inhibici desti čkov ých funkcí (Hilmerov áa Filipovský, 2004) . Blokace trom bo xansyntetá zy

Receptory trombinu : používají se - Blokátory trombinových destičkových receptorů PAR-I: jejich ú činek je založen na principu protil átek proti vlastn ímu receptoru . - Trombostatin: jedná se o degradační oligopeptidový produkt bradykininu o S aminokyselinách, který se váže přímo na aktivn í místo receptoru.

Komplexní in h ibitory

Jsou

•

l éč i va

s komplexním

pů s oben ím.

Anagrelid: inhibuje aktivaci po řadě podn ětů (ADP, trombin, kyselina arac hidonová, kolagen a j .). Po dlouhodobém podávání se může objevit trombo cytopen ie.

4.3.4.3. Blokáda agrega ce krevních

destiček

blokátory GP Ilb//Ila

4.3.4.3.1. BLOKÁTORY RECEPTOR Ů GP lIB/lIlA Inhibitory glykoproteinových receptypu IIb/llla zasahují v m ístě k oneč­ ného a s pol ečného bodu všech cest vedoucích k aktivaci krevních desti ček a v dů sledku toho blokují agregaci destiček , která je vyvolána všemi ago nisty. Inhibitory blokuj í připojen í fibrino genu k receptoru IIb/llIa na krevních destičkác h tím, že obsadí receptorové místo na kon form ačn ě změn ěné molekule GP IIb/III a. torů

Využívá se imidazo lových přípravků ( n apř. VAPIPROST nebo RIDOGREL). Jedná se o kombinované blokátory receptorů TXA 2 a tromboxa nsyntázy.

4.3.4.2.2. BLOKÁDA MEMB RÁNOVÝCH RECEPTOR Ů Se lektivn í inhibitory

KREVNÍCH DESTIČEK

o

Anta gonista

Receptory A DP : ADP je v yluč o v aný z denz ních granulí desti ček a z aktivova ného cévního subendotelu

TICLOPIDIN A CLOPIDOGREL jsou thienopyrimidinové deriváty, které ireversibiln ě blokuj í receptory aktivace d e sti č ek pro ADP typu P2Y,. Jin é cesty aktiv ace ZlJstávají neovli vn ěn y. De sti čk y nemocn ých , kte ří užívají tyto léky nejsou schopné agregovat po stimulaci ADP, ale

•

OOCOC",

ři t buď

•

zachovávají si schopnost změn y tvaru po přid án í ADP. Blok áda receptorů P2Y I není schopna inhibovat všechny ADP receptory aktivace de st i ček . Je snaha najít inhibitory receptorů P2Y A D '

tj

Recept or ADP

•

'H.

o~o

~N OO~s "s--V rr~M ~CI U ti

Ii clopi din L-

cl opidogrel --'

228

Blokátory GP IIblIlla blokují spojování destiček přes můstky Ca 2 + a fibrinogen

Inhibitory na bázi monoklondlni protilátky: A BCIX IMA B (chimerická myší/lidská monoklon ální protilátka blokující nespecificky stericko u zábranou desti čkov ý receptor GP lIb/IIIa)

tJ tj

Antag onista Recept or G P IIblllla

O ABCIXIMAB blokuje i vitron ectinovy recep tor (aJ3J ) endo telii, buněk hladkého sva lu a destiček a váže se i na (Mac -I ) receptor m on o cytů, n eutrofil ů a NK bun ěk (natural kil/er ce lls) . •

au/32

Inhibitory s malou molekulou - Tyto látky napodobuj í RGD sekvenci ami nokyselin fibr inogenu a váží se specificky na recept or krevních d e sti č ek IIb/IIIa.

229

Rozlišujeme tyto nízkomolekul ární látky: • Peptidové inhibitory - EPTlFlBATID: cyk lický heptapeptid odvozený z hadího jedu pygm ejo v ěh o chie sty še. Má nahrazen Lys za A rg. Jedn á se tedy o sekvenci KGD , která napodobuje RGD sekvenci a váže se s vysok ou afinitou na GP lIb/lIla. • Nepeptidově inhibitory - TlROFlBA N: nepeptidovy de rivát ty- '--ro sinu - LAMIFIBAN

Inhibitory GP lib/lila

vazby '

V)W)08 apectIIck.t GP IIlr/llla

tekYenc:e~

l'3 te!ězcem

neGPI Ib1I I&. ~ --'--'-~=-=---J

I NHIBI TORY GP R ECEPTORŮ JSOU V SOUCASNÉ DOBĚ NEJÚCINNĚJŠ1M I PROTIDESTlCKOVÝMI LÉKY.

4.3.4 .3.2. •

(PPP) pla sm y. M ěří se výš ka maximáln í amplitudy (ma), rychl ost náb ěhu agre gač n í křivky (rns-s lope) a doba potřebn á k do sažen í 50 % ma (T50). Je-Ii to mo žné změří se agregační odpověď před podáním protidesti čkové ter apie (ASA) a pak se provádí pravidelná měření v průbě­ hu terapie, dokud se nedosáhne optim álního snížení hodnoty slo pe . Kontrol y po do sažení této hodn ot y je potom možné pro v ádět v del ších čas ovýc h interva lech.

3llJJM CPG p řed l éčbou

ISklon = 110 I

N izkom olek uldrni hepariny - LMWH: v přítomnosti AT potencují jeh o účinek na aktivovaný faktor Xa a tím snižuj í produkci aktivátoru kre vních desti ček trombinu . Aktivace d estič ek os tatními mech ani sm y zůs tává zac hová na (Vojáček, 2003).

o

l0" 0 1~'"

I

900"

I

li Go Agregační křivka

4.3.4.4.2. SLEDOVÁNÍ

po kolagen u

I I I

:~

(fibrinogenový receptor)

I

jj

kyselina acetylsalicylová

INHIBI CE AGREGAČNÍ KŘIVKY STIM ULOVANÉ

KATIONICK ÝM PROPYLGALÁTEM

Sleduje se agregačn í kři vka po stimulaci kationickým propylgalátem (CPG). Stanovení prob íhá v optické m agregometru za pou žití desti čkami boh até (PRP) a chudé 230

2

3

4

5

6

7

8

10

PROTIDESTICKOvA LÉCBA - MECHANISMY ÚCINKU

Zml nalnru

,

1

o

\

t+-il-f- ~

Zji stí se hodnota agregačn í křivk y po stimulaci kola30 '1" genem p řed zahájením léčby a n ásledn ě se tato hod~ -lbI"" nota sleduje po celou dobu l éčby přibližně v m ě s íč­ ~: 50"'0 ~ I ních int ervalech e 6 0"'0 ~ I Léčebn é rozmezí: 15-30 % maxim a křiv ky před léč ­ ''''' I 800" bou . I

9

-=4-0'1

11

12

Agregace s propylgalátem - křivka před (vlevo) a po podání ASA (vprav o)

Fa,.~b'~ --r-,--r

E

KŘIVKY STIM ULOVANÉ KOLAGENEM

' IS-k-Io-n

m inuty

4 .3.4.4. Monitorování antiagregační léčby INHIBIC E AGREGAČN Í

/ /

.. '

Heparin do hodn oty 4,0 IU/ml nemd vliv na výs ledek vy šetie ni. O Počty destiček pod 100 . 10 9/1 mohou významně ovlivnit výsledek testu . O Nelze stan ovit vzorky s chylozni, ikterickou a hemo lyti ckou pla zmou.

BLOKÁTORY AKTiVÁTORU AGR EGACE KREV. DESTiČEK - TROM BIN U

4.3.4.4.1 . SLEDOVÁNÍ

24 hodin po pod án i ASA

100

231

Literatura Anders son, L. o., Borro wcliffe, T. W,

Seznam zkratek

c:

Hol-

McKee, S. A., Sane, D. Della rgyris, E. N.: Aspir in resistance in cardiovascular diseases: A review of prevalence , mechanisms and clinical signifi ca nce. Thromb. Haemos t. 88, 2002, S. 711-7 15.

mel ; E., et al.: Molecula r weight depen-

dency of the heparin potentiated inhibition of thrombin and activated factor X. Effect of heparin neutralization in pla sma. Thromb. Res. 115, 1979, s. 531-5 41.

McLean, J.: The thromboplasti c action of cephalin. Am. J. Physiol. 4 1, 1916, s. 250-257.

AlVtry, H . A . a Loscalzo, J.: Aspiri n .

Circ ulation, 101, 2000, s. 1206-1218. Badimon, L. a Badimon, J. J.: Interaction of platelet activation and coagulation. ln: Fuster, v., Topol, E. J., eds. Atherosklerosis and coro nary artery disease. Lippincott - Raven Publi shers, Phil adelph ia 1996, s. 639- 656. Bultas, J. a Ka retovd, D.: Léčba trombotických stavů - kde jsme a kam se ubíráme. Remedia 14, 2004, č . 2 , s. 182-200. Dalen, J. E.: An apple a da y or an aspirin a day. Arc h. Intern . Med. 151, 1991, S. 1066-1069.

No vak, J. a Bucha, S.: E ca r in test. Semin. Thrombos. Haemostas. 22, 1996, S. 197- 202. Pat rono, C; Collet; 8. , Dal en, J. E. et al.: Platelet - Active Drugs, The relationship among dose, effectiveness and side effects. Chest 119, 2001, S. 39-63. Samama, M .M. a Elalamy, J.: Aspir ine et hémostase. Rev. Méd. Interne 2 1, 2000, Suppl. I, S. 27 - 34. Valle, J. R., Bakhle, Y. S., Botting, R. M. : Cy k looxy genases 1 a 2. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 38, 1998, s. 97- 120.

Hilmerovd, J. a Filipovsky, J.: Klinický význam aspirinové rezistence. Vnitř. Lék., 50, 20 04,č . 6, s. 462-469.

Vojáček, J.: Inhibitory desti čkových glykoproteinových receptorů typu IIblllla. Remedia 13, 2003, č . 2 , S. 84-92.

Marder; v.J. a She rry, S.: Thrombolyt ic therapy: Cu rrent status (2). New Engl. Med. 318,1988, S. 1512-1520.

Vojáček,

Hladina

Mark, D. B. et al.: Effectiveness of thrnmbolytic therapy with tissue pla sminogen activator as compared with streptokinase fo I' acute m yacardial infarction. New Engl. J. Med. 332, 1995, S. 141 8-1424.

J., Mal ý, M., Hraboš, V. et al.: tkáňového

faktoru, inhibitoru a solubilního P-selektinu u nemocných s akutním koronárním sy nd r omem, Cor. Vasa 44 , 2002, S. 148-151. tkáňového faktoru

232

AA ACLA ADP ACT AP APA APC AP C-R APS APTT ASA AT BM BU C-I INH cAMP CD cGMP CML CO X CPG ČZP

DIK DNA EC T EID ELI SA EP CR F l -XIII Fc FDP F 1+2 FPA a FPB

GIT Gla GP HC II HDL, LDL, VDL HEP HlT-1 a II HMW HMWK HUS ICHS lL 1 1M

aminokyselina antikardiolipinové protilátky adenosindifosfát aktivovaný koagu lační čas (acivated coag ulation time) ak ti vač n í peptid antifolipidové protilátky aktivovaný protein C rezistence na aktivovaný protein C antifosfolipidový syndro m aktivovaný parciální tromboplastinový test acetylsalicylová kyselin a (aspirin) antitrombin bazální membrána Bethesda jednotky, (Bethesda Unit) CI-inhibitor cyklický adenosinmonofosfát nomenklatura CO znaků cyklický quanosinmonofosfát chronická myeloidní leukém ie cyklooxygenáza kationický propylgalát čers tvě zamraže ná plazma diseminovaná intravaskulární koagulace deoxyribonukleová kyselina ekari nový test (ecarin cloting test) elektroimunodifuze enzymimunoanalýza endoteliální receptor proteinu C faktory plazmatického koagu l ačního systému fragment imunoglobuli nu fibrin/fibrinogen degradač n í produk ty fragmenty 1+2 fibrinope ptidy A a B gastrointestiná1ní trakt oblast zahrnující gamakarboxylovo u skupinu glutamové kyse liny glykoproteiny heparinový kofaktor II frakce lipoproteinů heparin heparinem indukovaná trombocytopenie vysokomolekulární složka (Heavy Molecular Weight) vysokomolekul ární kininogen hemolytic kouremický syndrom ischemická choroba srdeč n í interleukin I infarkt myokardu

233

IN R ISI ITP LA

LlA LMWH MFS MTHFR MW UFH PAI-l PAP PAR-l PC PCI PC R PGl z PIVKA PI PPP P RP PS PT R IA RiCo RI PA RNA RVVT SLE TAT TAFI TEG TEN TF TFPI TG TM TNF TKD t-PA TT T TP TXA2 u-Pa vWF

mezinárodní normalizovaný poměr u antikoagu lač ní léčby (international normalized ratio) index citlivosti tromboplastinu idiopatická trombocytopenická purpura Lupus antikoagu lans světelná nebo laserová imunoanalýza nízkomolekulární heparin (low molecular weight heparin) monocytomakrofágový systém methylentetrahydrofolát reduktáza molekulová hmotnost (molecular weight) nefrakcionovaný heparin inhibitor akt ivátorů plazmi nogenu plasmin -antiplasmin komplex proteolytický aktivovaný receptor jed nořetězcový plazmatický glykoprotein inhibitor aktivova ného proteinu C polymerázová řetězová reakce prostacyklin neaktivní koag u lač ní faktory fosfolipidová matrix plazma chudá na d est i č ky (platelet poor plasma) palzma bohatá na des tičky (plateled rich plasma) protein S protrombinový test (quick test) radio imunoanalýza ristocetin kofaktor agregace stimulovaná ristocetinem ribonukleová kyseli na Test s jedem Russelovy zmije systémový lupus erythematodes trombin-antitrombin komplex tromb inem aktivovaný inhibitor fibrinolýzy thrombelastogram tromboembolická nemoc tkáňo vý faktor inhibitor tkáň ového faktoru tromboglobulin trombomodulin tumor nekrotizuj ící faktor transplantace kostní dřeně tkáňo vý aktivátor plasminogenu (tissue plasminogen activator) trombinový test (thrombi n test) trombotická trombocyto penická purpura (thrombo tic thrombocythopenic purpura ) tromboxan A2 urokináza von Willebra n dův faktor

Rej střík A

G glykoproteiny 36 glykosa minog1ykany 20

B blokátory - GP IblIIa 226 - GP IIb/l ll a 229 b uňky

- endote lové 22-23

C cévní s těna 19, 28 - aterosklerotická cévy 13, 21 cytometrie 136 C4-b BP 100

192

D des tičky

196 - adheze 196 - agregace 196 - aktivace 197 dikumarin 214 dysfibrinogenémie 180 D-dimery 82

E endotel

234

F faktory koag u lační 29, 39, 50, 53-62, 200 fáze koagulace - i niciač ní 63 - am plifi kačn í 68 , 69 - propagační 69-72 fibrin 70-72, 94-95 - monomer 59 - nerozpustný 60 - polymerovaný 59 fibrinogen 48,70,94, 180 fibrinolýza 96 - aktivace 96 FDP 81

afibrinogené mie 146 agregační křivky 230 aktivátory 13 1 - t-PA 90, 75, 78 - urokináza 75,77 anagrelid 229 anémie - vrozené 158 antiplazmin 115-116 antifosfolipidový syndrom 200, 204 angina pectoris 195 antigen 129, 134, 135 anistreptáza 221 antitro mbin 9 1,99, 100,210 antitrypsin 124, 111

H hemofil ie 172, 174, 176 hemokoagulace 27, 72 hemos táza 26-28,32-33,35,37,131,192 - fetá lní 27 - neonatá1ní 27 - primar ní 22-24 heparin 2 12 - nefrakcionovaný 2 11 - nizkornoleku l árn í 21 1 hepari nový kofaktor II 91, 92 hirudin 213,219 homocystein 203 hyperfibri no1ýza 96 hyperhomocysteinemie 203-204 hypofibrinolýza 96

I inhibitor 83, 98-99, 116-11 8, 123-125, 15 1, 175, 209, 2 13,229- 230 - tkáňového faktoru 102 ITP 209

13,22-23

235

K kalci um 41 kapi láry 15-16 kardio lipin 125 kininy 64 kininogen 64 koag ulace 184 - aloimunitní 184 - komplexy 32-34 - kon zu m pčn í 185 - vnější systém 55 - v ni třní systém 56-58 koagulo patie 171, 172 koagulometry 125-127, 137 kofaktory 44 kuniny 99 L l éčba

- an ti agregač ní 192, 225, 230 - anti koag u lač n í 184, 192 , 209 - antitro mbo tická 208 - mon itorování 208 ,219 - trom bolytická 220, 193 leukocyty 36 lupus antikoagu lans 113,125-126

N nemoc - von Willebrandova 177, 179 p

plazmin 91, 92-93 plazm inogen 87-89,9 1-93 proteáza 41 protein C 105-1 11, 99 protein S 111-1 12 protilátky - antifosfolipidové 125 - antikardiolipinové 128 protro mb in 49 , 65, 69 protrom bináza 69 purpury 153- 155, 162 - vrozené 154 - získané 155

-APlT 131, 132, 19 - fibri nolýza 130 - konzumpce pro trom binu 128 - krvácivost 128 - Lee-White 128 - na hirudin 192 - protrombinový (Quick) 130 - reptilázový 134 - retra kce 129 - thromb oelastograf 129 - trombinový 133 tkáň o vý fak tor 38-40, 64, 65, 66 , 68 trombin 49-50, 65 , 72, 2329 trombocytemie 170-171 trom bocytóza 170-171 trom bocytopatie 166-168, 170 trombocy topenie 156, 158, 159, 161, 164 trom bofilie 197 tromb omodulin 113 trom bolyt ika 221 , 223 , 225

tromb ospondin 18 trombózy 194-195 - arteriální 166-168 - venózní 166 TIP 2 11 turbidimetrie 132

V vazo dilatace 2 1 vazokonstrikce 21 vláseč nice 16-17 vita mín K 183, 2 14 vitro nectin 31

Ž žilky 18 žíly 18

R radioimunoa nalýza 135 rece ptory ADP 228 rezistence na aktivovaný protein C 200

S M makroglobu lin 122-1 23 markery 197 - aktivace koag ulace 198 - aktivované fibrinolýzy 198 - krevních de st i ček 198 - molekulové 198 - trom bogeneze a trombofilie 197 metody - koagu lační 119 - gelifika ční 124 - imunochemické 123, 134, 148 - spektrofotometrické 132 - zákalové 131 mutace - Cambridge 174 - Leidenská 173 -MTHFR 175 - protrombi nu 175

serpiny 98 stavy - trombofilní 171 - trombotické 163-166 streptokináza 22 1, 222 syndro m - antifosfolipidový 176 - Bernard-Soulier 168 - hemolyticko-uremický 163 - Heřmanského Pudlákův 169

T TAFI 105-109 tenáza - vnější 67 - v n itřn í 67 tepénky 15 tepny 15 test -ACT 134,146, 191 236

237