Laboratoriumdiagnostiek van parasieten in faecesop basis van microscopie en antigentesten THOMAS MAENHOUT

Laboratoriumdiagnostiek van parasieten in faeces op basis van microscopie en antigentesten THOMAS MAENHOUT

LABORATORIUMDIAGNOSTIEK INLEIDING

Microscopie • Direct of na concentratietechniek • Specifieke kleuringen

Immuno-gebaseerde testen • ELISA • Rapid antigen test

PCR-gebaseerde technieken • Real-time qPCR • Multiplex voor heel veel darmpathogenen

OVERZICHT

LABORATORIUMTECHNISCH Microscopie Antigen testen in faeces ORGANISATIE VAN HET LABORATORIUM Workflow GERICHT AANVRAGEN Optimalisatie aanvraagprofiel

Gastro-intestinale parasieten

Protozoa

Wormen

• • • • •

• Cestoda • Trematoda • Nematoda

Amoeben Flagellaten Coccidiën Microsporidia Blastocystis hominis

Amoeben

Darmprotozoa: Pathogenen

Blastocystis hominis

• Entamoeba histolytica/dispar

Entamoeba histolytica ≈ 50 mil mensen per jaar geïnfecteerd In België/Nederland: 10-tallen per jaar Endemisch in tropen en subtropen (Afrika & Azië) Amoebendysenterie tot invasieve amoebiasis!

Flagellaten • Giardia lamblia • Dientamoeba fragilis

Coccidiën Microsporidia

• Cryptosporidium spp. • Cyclospora spp. • Isospora belli Bron: http://www.parasitologie.nl

LABORATORIUMTECHNISCH Entamoeba histolytica Macroscopisch Bloederig/slijmerig Microscopie Onderzoek naar trofozoïeten: • • • •

Op zeer verse of vers (SAF-)gefixeerde faeces (sterven snel af) Aanwezigheid van veel erythrocyten (+ hematofage amoebe ZELDZAAM) Karakteristieke beweging met pseudopodiën in vers staal Permanente kleuringen: Chlorazol Black, Iron Haematoxylin Kinyoun

20-40 µm

LABORATORIUMTECHNISCH Entamoeba histolytica Microscopie Onderzoek naar cysten (chronische stadia): • •

Ongekleurd of na Dobell O’Connor Iodine kleuring Belangrijk onderscheid te maken met apathogene species: •

• •

Entamoeba hartmanii, coli, polecki en dispar (+ Endolimax nana, etc…)

Meest betrouwbaar om verschillende species te onderscheiden Onderscheid op basis van grootte en aantal kernen

LABORATORIUMTECHNISCH Entamoeba histolytica Antigentesten

TECHLAB ENTAMOEBA II ELISA

Remel PROSPECT

RIDASCREEN ENTAMOEBA

LABORATORIUMTECHNISCH Entamoeba histolytica Buss et al 2008:

RIDASCREEN ENTAMOEBA ELISA TECHLAB ENTAMOEBA II ELISA

N = 110

50/53 E. histolytica

34/53 E. histolytica

28 positief met beide testen 57 negatief met beide testen Discrepanties: 6 Ridascreen+/Techlab-: 3x E. histolytica, 2x E. dispar & 1x negatief op PCR 22 Techlab+/Ridascreen-: 22x E. histolytica bevestigd met PCR

LABORATORIUMTECHNISCH Entamoeba histolytica TECHLAB = Entamoeba ‘histolytica’ specifieke test!! Capture ELISA Target: galactose or N-acetyl-D-galactosamine-binding lectin ≈ adhesin Polyklonale antilichamen tegen het adhesine zitten gecoat op de well (adhesin is gelijkaardig tussen E. dispar/histolytica


Het conjugaat bevat monoklonale antilichamen specifiek gericht tegen adhesin E. histolytica

Bron: Techlab package insert

LABORATORIUMTECHNISCH Entamoeba histolytica


Sensitiviteit NIET beter dan microscopie!

Sensitiviteit = 79% Specificiteit voor E. histolytica = 96% Gonin et al. 2003 Roy et al. 2005

LABORATORIUMTECHNISCH Entamoeba histolytica

TECHLAB ENTAMOEBA QUIK CHECK

Gebruikt zelfde monoklonale capture AL als Techlab Entamoeba II ELISA

LABORATORIUMTECHNISCH Samenvatting performantie immunoassays/sneltesten

Sensitiviteit Techlab Entamoeba II ≈

Quik Check Entamoeba

ProspecT ELISA

R-Biopharm Ridascreen

Specificiteit Enige E. histolytica specifieke Ag-test Vaak positief bij E. dispar mist “geen” E. histolytica

Amoeben




Giardia lamblia Cosmopolitische verspreiding + (sub)tropen Meest voorkomende ziekmakende parasiet Endemisch vooral bij jonge kinderen (kinderdagverblijf!) Seizoensgebonden Chronische verloop




LABORATORIUMTECHNISCH Giardia lamblia Macroscopisch Bleke en vettige stoelgang bij malabsorptie Microscopie Onderzoek naar trofozoïeten: • • •

Vooral in dunne ontlasting, duodenaal vocht Op zeer verse of onmiddellijk (SAF-)gefixeerde faeces Typisch morfologie (peervorm, “zuignap”, flagellen, 2 kernen)

Onderzoek naar cysten: • •

Vaak in grote getale, echter onregelmatige uitscheiding! Concentratie (formol-ether) zeer efficiënt

Amoeben




Cryptosporidium spp. Belangrijk importpathogeen In Nederland en België ook endemisch voorkomend Belangrijke pathogeen bij immuundeficiëntie (AIDS) Seizoensgebonden Waterige diarree (niet zelflimiterend bij immuundef.)




LABORATORIUMTECHNISCH Cryptosporidium parvum/hominis Macroscopisch Waterdunne diarree Microscopie Onderzoek naar oöcysten: • • • •

Concentratie zeer efficiënt Zéér klein (3-5 µm gemiddeld) Zonder additionele kleuring moeilijk te onderscheiden Zuurvaste of safranine-kleuring noodzakelijk voor sensitief en specifiek onderzoek

LABORATORIUMTECHNISCH Giardia lamblia & Cryptosporidium spp. Antigentesten

LABORATORIUMTECHNISCH Giardia lamblia & Cryptosporidium spp. Evaluatie AZ Delta Roeselare

Pos Neg Pos Neg Pos Neg

CRYPTO Microscopie Pos Neg 2 1 3 21 5 0 0 22 5 0 0 2

GIARDIA Microscopie Pos Neg 2 3 1 21 3 1 0 23 1 1 0 5

Pos Neg Pos Neg Pos Neg

Microscopie Pos Neg 1 0 3 8 4 0 0 8 3 0 1 8

Microscopie Pos Neg 4 0 4 4 8 0 0 4 8 0 0 4

Kleine validatiestudie

Prospectief op 27 routine stalen

Coris Techlab Rida Quick

Retrospectief op 12 ingevroren stalen

Coris Techlab Rida Quick

LABORATORIUMTECHNISCH Giardia lamblia

Test

TECHLAB Quik Check

Compared to Microscopy (IFA) Microscopy

Commercial ELISA

ELISA and PCR PCR Microscopy/PCR Microscopy (IFA) Microscopy Microscopy MERIDIAN Immunocard STAT ELISA and PCR Composite reference PCR Microscopy/PCR Microscopy THERMO-SCIENTFIC ELISA and PCR PCR Xpect Microscopy R-BIOPHARM Microscopy Microscopy/PCR Rida Quick PCR Microscopy Microscopy CORIS Microscopy/PCR

n

Spec 791 100 200 30 849 307 117 18 31 246 45 30 117 148 18 31 45 117 18 160 30 31 160 45 30 31

Sens 1,00 0,99 0,99 1,00 0,99 1,00 1,00 1,00 1,00 0,99 1,00 1,00 0,94 1,00 0,44 1,00 0,96 0,98 0,78 0,95 1,00 1,00 0,94 1,00 1,00 1,00

Reference 0,99 Cacciola et al (poster ASTMH) 1,00 Van Meensel et al (poster techlab) 0,93 Alexander et al. (Parasitology international 2013) 1,00 Van den Bossche et al. (Poster) 0,99 Producer 1,00 Haque et al. (poster Techlab) 0,94 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) 0,78 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) 0,93 Van den Bossche et al. (Poster) 0,81 Johnston et al. (J Clin Microbiol 2003) 0,89 van Dommelen et al (poster) 0,83 Van den Bossche et al. (Poster) 0,94 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) 0,93 Elsafi et al. (Parasitol Res 2013) 0,78 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) 0,74 Van den Bossche et al. (Poster) 0,89 van Dommelen et al (poster) 0,88 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) 0,56 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) 0,73 Goni et al. (Eur J Microbiol Infect,.2012) 0,83 Van den Bossche et al. (Poster) 0,78 Van den Bossche et al. (Poster) 0,70 Goni et al. (Eur J Microbiol Infect, 2012) 0,72 van Dommelen et al (poster) 0,58 Van den Bossche et al. (Poster) 0,61 Van den Bossche et al. (Poster)

LABORATORIUMTECHNISCH Cryptosporidium spp.

Test

TECHLAB Quik Check

Compared to Microscopy (acid-fast stain)

Commercial ELISA ELISA and PCR PCR Microscopy (acid-fast stain)/PCR Microscopy (acid-fast stain)

MERIDIAN Immunocard STAT ELISA and PCR Composite reference standard PCR Microscopy (acid-fast stain)/PCR Microscopy (acid-fast stain) THERMO-SCIENTFIC ELISA and PCR Xpect PCR Microscopy (acid-fast stain) R-BIOPHARM Microscopy (acid-fast stain)/PCR Rida Quick PCR Microscopy (acid-fast stain) CORIS Microscopy (acid-fast stain)/PCR PCR

n

Spec 791 100 200 30 307 117 18 31 246 45 30 117 148 18 31 45 117 18 160 30 31 160 45 30 31 505

Sens Reference 0,99 1,00 Cacciola et al (poster ASTMH) 0,98 1,00 Van Meensel et al (poster techlab) 0,99 0,87 Alexander et al. (Parasitology international 2013) 1,00 1,00 Van den Bossche et al. (Poster) 1,00 1,00 Haque et al. (poster Techlab) 1,00 1,00 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) 1,00 1,00 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) 1,00 1,00 Van den Bossche et al. (Poster) 0,99 0,68 Johnston et al. (J Clin Microbiol 2003) 1,00 0,25 van Dommelen et al. (poster) 1,00 1,00 Van den Bossche et al. (Poster) 0,97 1,00 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) 0,99 0,95 Elsafi et al. (Parasitol Res 2013) 0,50 1,00 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) 0,95 1,00 Van den Bossche et al. (Poster) 1,00 0,50 van Dommelen et al. (poster) 1,00 0,82 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) 1,00 0,58 Minak et al. (J Clin Microbiol 2012) 0,99 0,97 Goni et al. (Eur J Microbiol Infect, 2012) 1,00 1,00 Van den Bossche et al. (Poster) 0,98 1,00 Van den Bossche et al. (Poster) 0,99 0,91 Goni et al. (Eur J Microbiol Infect, 2012) 1,00 0,75 van Dommelen et al. (poster) 1,00 0,92 Van den Bossche et al. (Poster) 0,95 0,67 Van den Bossche et al. (Poster) 0,98 0,78 Vastert et al. (Poster)

LABORATORIUMTECHNISCH Samenvatting performantie sneltesten

Sensitiviteit Techlab Meridian Thermo-Scientific R-Biopharm Coris

Specificiteit

Sensitiviteit

Specificiteit

Amoeben




Dientamoeba fragilis Verspreiding heel variabel (∼ detectiemethode) Pathogeniciteit discutabel Grotere genetische variatie Voornamelijk kinderen Meestal asymptomatisch tot buikpijn & diarree




LABORATORIUMTECHNISCH Dientamoeba fragilis Microscopie Onderzoek naar trofozoïeten (geen cysten!!): • • •

Op zeer verse of vers (SAF-)gefixeerde faeces (sterven af binnen 60 min) Trofozoïeten vaak twee-kernig Permanente kleuringen: Chlorazol Black, Iron Haematoxylin Kinyoun

PCR?

3 – 18 µm

Amoeben




Cyclospora cayetanensis & Isospora belli Importpathogenen uit (sub)tropen (Amerika+Azië) Epidemie Cyclospora door geïmporteerd besmet fruit Chronische diarree vaak zelf-limiterend Isospora infectie ernstiger bij immuundeficiëntie




LABORATORIUMTECHNISCH Cyclospora cayetanensis & Isospora belli Microscopie Onderzoek naar oöcysten: • • •

Zonder additionele kleuring moeilijker te onderscheiden Zuurvaste (ZN of auramine) kleuring noodzakelijk voor sensitief en specifiek onderzoek Auto-fluoresecentie

Cyclospora cayetanensis

Isospora belli

Amoeben




Microsporodia Minstens 15 verschillende pathogene species Vaak opportunistische pathogenen (AIDS-ptn!) Komen wereldwijd voor Kliniek variabel, maar diarree meest voorkomend




LABORATORIUMTECHNISCH Microsporidia (Enterocytozoon bieneusi) Microscopie Onderzoek naar oöcysten: • • • •

Concentratie zeer nuttig Zéér klein (1-2 µm gemiddeld) contrast met bacteriën klein Screenen met fungifluor of optische witstof (Uvitex 2B) Confirmatie met trichroom/giemsa kleuring of PCR

Amoeben




Blastocystis hominis Cosmopolitische verspreiding Meest gevonden parasiet in stoelgang ≈ commensaal Pathogeniciteit discutabel Aanwezigheid in grote getale wijst op ontregelde darmflora




LABORATORIUMTECHNISCH Blastocystis hominis Microscopie Onderzoek naar blastocysten: • • • •

Op zeer verse of vers (SAF-)gefixeerde faeces soms zonder kleuring te zien Karakteristieke dubbelwandige begrenzing van het organisme Concentratiemethoden niet nuttig Permanente kleuringen: Chlorazol Black, Iron Haematoxylin Kinyoun

5 – 30 µm

OVERZICHT


ORGANISATIE LABORATORIUM Welke testen gebruiken? Sensitiviteit Screening Inheemse parasiet Kosten …

Specificiteit Confirmatie Reizigersdiarree Baten …

ORGANISATIE LABORATORIUM Welke testen gebruiken? Privélaboratorium

* Berekend uit data verzameld in 2013 in patiënten met chronische diarree

Ziekenhuislaboratorium

Referentielaboratorium

Algemene populatie

Algemene populatie

Confirmatie

Screeningsfunctie

Vaker immuundeficiëntie

Epidemiologie

Prevalentie-afhankelijk

Prevalentie-afhankelijk

Esoterische testen

Parasiet Giardia lamblia Cryptosporidium spp Entamoeba coli Entamoeba histolytica/dispar Blastocystis hominis Ascaris lumbricoïdes Negatief TOTAAL

Aantal Prevalentie* 17 20 8 0/8 6 2 1125 1165

1,50% 1,72% 0,34% 0,34% 0,52% 0,09% 96,52%

Parasiet Giardia lamblia Cryptosporidium spp Entamoeba coli Entamoeba histolytica/dispar Enterobius vermicularis Taenia saginata Negatief TOTAAL

Aantal Prevalentie* 14 12 8 0 4 1 1203 1223

1,14% 1,06% 0,65% 0,00% 0,33% 0,08% 98,36%

ORGANISATIE LABORATORIUM Welke testen gebruiken? Bayesiaanse statistiek Specificiteit en sensitiviteit: • Sterk studie-afhankelijk • Houden GEEN rekening met prevalentie van de aandoening Negatief en positief predictieve waarde • Prevalentie-afhankelijk • Nuttig voor aanvragende arts • Kunnen berekend worden uit prevalentie, specificiteit en sensitiviteit

ORGANISATIE LABORATORIUM Predictive values in Belgium Quik Check Giardia/Crypto/Entamoeba Ag test 1

0,9

0,8

Predictive value

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

PPV Quik Check Giardia NPV Quik Check Giardia

0,2

PPV Quik Check Crypto NPV Quik Check Crypto

0,1

PPV Entamoeba histolytica/dispar NPV Entamoeba histolytica/dispar

0 0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

Prevalence

0,6

0,7

0,8

0,9

1

ORGANISATIE LABORATORIUM Predictive values in Belgium Quik Check Giardia/Crypto/Entamoeba Ag test

NPV > 99.9%

1

0,9

0,8

Predictive value

0,7

PPV Giardia = 64.2% 0,6

0,5

PPV Crypto = 48.8% 0,4 PPV Quik Check Giardia

0,3

NPV Quik Check Giardia PPV Quik Check Crypto

0,2

NPV Quik Check Crypto PPV Entamoeba histolytica/dispar

PPV Entamoeba= 23.6%

0,1

NPV Entamoeba histolytica/dispar

0 0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

Prevalence

0,06

0,07

0,08

0,09

0,1

ORGANISATIE LABORATORIUM

NPV > 99.9%

PPV Giardia < 90 % PPV Crypto < 80 %

Hoge NPV in combinatie met hoge sensitiviteit Negatief resultaat kan je vertrouwen voor Giardia & Cryptosporidium Entamoeba

Ag-test met hoge specificiteit, echter in laag prevalente populatie best confirmatie (microscopie blijft aangewezen*) *additionele microscopie belangrijk voor MLT competentie

PPV Entamoeba < 30%

PPV relatief laag (lage prevalentie) +onderscheid Entamoeba histolytica dispar niet mogelijk Pre-test probability (dus ook PPV) verhogen door relevante klinische info (bv. tropenreis)?

ORGANISATIE LABORATORIUM Wat met andere, zeldzamere parasieten?

Bron: Ten Hove et al. 2009)

ORGANISATIE LABORATORIUM Welke testen gebruiken? Belang van KLINISCHE INFORMATIE Met antigen (of PCR) test sporen we minder prevalente parasieten NIET op • Importpathogenen uit (sub-)tropen • Worminfecties • Opportunistische pathogenen Op basis van klinische informatie kan specifiek naar andere parasieten gezocht worden • Nog steeds nood aan goed getrainde laboranten voor microscopie • Informeren van de aanvragende arts omtrent gastro-intestinale parasieten als veroorzakers van chronische diarree • Aansporen van de aanvragende arts tot verschaffen klinische informatie zodat gericht naar parasieten kan gespoord worden

ORGANISATIE LABORATORIUM Welke testen gebruiken? TRIPLE FAECES TEST

Sensitiviteit verhogen?

ORGANISATIE LABORATORIUM Welke testen gebruiken? TRIPLE FAECES TEST

PCR? Niet- pathogenen+++

Werklast+++

OVERZICHT


GERICHT AANVRAGEN Optimalisatie aanvraagprofiel

GERICHT AANVRAGEN Optimalisatie aanvraagprofiel

TAKE HOME MESSAGES Nieuwe antigentesten hebben hoge specificiteit Crypto/Giardia Vaak geen onderscheid mogelijk tussen E. histolytica/dispar Sensitiviteit is afhankelijk producent (Techlab superieur)!

Kennis van microscopie mag niet verloren gaan voor die gevallen waar minder courante parasitaire infecties worden vermoed

Afhankelijk van de bestudeerde populatie dient de antigentest vooralsnog geconfirmeerd te worden

Met aangepast aanvraagprofiel kan men klinische informatie verkrijgen van de aanvragende arts om gericht te zoeken

Laboratoriumdiagnostiek van parasieten in faecesop basis van microscopie en antigentesten THOMAS MAENHOUT

Recommend Documents