Valkuilen in de laboratoriumdiagnostiek van middelengebruik Dr F. Martens Laboratorium AZ Groeninge Kortrijk
Vervalsing van een analyseresultaat
Welke vorm van laboratoriumdiagnostiek
Bewaringsvoorwaarden urine
In vivo vervalsing
In vitro vervalsing
Opsporen van vervalsingen
Algemene voorzorgen en besluit
1
Targets
Vormen van laboratoriumdiagnostiek: Immuno-assays (1)
Enzyme immuno assays : homogene testen
EMIT : enzyme multiplied immunoimmuno-assay test Gebaseerd op de absorbantieverandering door de afname van NADH door de omzetting van glucoseglucose-6-fosfaat naar 66-fosfogluconolacton door G6PDH na een competitief reactieproces tussen het vrije drug uit de urine urine en het enzyme gemerkte drug uit het reagens. De hoeveelheid ongebonden gemerkt antigen is bepalend voor de katalytische activiteit van het enzyme. enzyme.
Kwetsbaarheid Enzyme als proteï proteïne moet intact blijven Enzyme is gevoelig voor inhibitoren Het specifieke AL moet in de gepaste hoeveelheden aanwezig zijn
2
Vormen van laboratoriumdiagnostiek: Immuno-assays (2)
Enzyme immuno assays : homogene testen CEDIA: CEDIA: Cloned Enzyme donor immunoimmuno-assay ß-galactosidase bestaande uit 2 polypeptiden waarvan de grootste keten optreedt als een enzyme acceptor (EA) en de kleinste keten optreedt als een enzyme donor (ED). Wanneer een tetrameer (4EA(4EA-ED) wordt gevormd dan pas wordt het enzyme katalytisch actief en hydrolyseert chlorophenolroodchlorophenolrood-ß-galactopyranoside met absorbantoetoename bij 420 nm bij 420 nm (rode kleur). kleur). De drug uit de urine voert een competitie met de EDED-gemerkte drug uit het reagens. reagens. Wanneer dit laatste bindt aan het AL kan geen tetrameer worden gevormd. gevormd.
Kwetsbaarheid Het enzyme als proteine Inhibitie van het enzyme Interferentie met colorimetrie
CEDIA EA + EDED-drug + AL (reagens) + drug uit urine (ED)AL + (EA ED-drug)AL drug)AL + (drug (drug)AL (EA--EDED-drug) drug)4 + substraat
Geen reactie
+ substraat
rode kleur bij 420 nm
3
Vormen van laboratoriumdiagnostiek Immuno-assays (3)
Enzyme immuno assays : heterogene testen ELISA Enzyme linked immunosorbant assay AL zijn gelinked aan een vaste fase (parel of cup). Een competitie tussen drug uit urine en enzyme gemerkte drug uit het reagens. De hoeveelheid gebonden drugdrug-enzyme complex staat in relatie tot de omzetting van het substraat en de absorbantietoename. absorbantietoename.
Kwetsbaarheid Interferentie met enzymewerking en spectrofotometrie
Vormen van laboratoriumdiagnostiek: Immuno-assays (4)
Homogene immunoimmuno-assay met fluorofoor als merker FPIA : Fluorescence Polarization ImmunoImmuno-assay Competitieve reactie tussen drug uit urine en drug gemerkt met een een fluorofoor (Ag*) (Ag*).. Door de tragere rotatie van het Ag* Ag*-AL complex zal de fluorofoor licht uitstralen in hetzelfde polarisatievlak als het exciterende licht, licht, terwijl de sneller roterende vrije Ag* Ag* in een ander polariserend vlak emitteren. Dus hoe meer drug aanwezig is hoe lager de gemeten fluorescentie.
Kwetsbaarheid Antilichamen als intacte proteï proteïnen Complex AgAg-AL Background interferentie
4
Vormen van laboratoriumdiagnostiek: Immuno-assays (5)
Heterogene immunoimmuno-assay met partikels als merker KIMS : Kinetic Interaction of Microparicles in a Solution Drug uit urine bindt zich aan ALAL-latex micropartikel. Hoe meer drug gebonden wordt hoe meer turbiditeit. turbiditeit.
Kwetsbaarheid Proteï Proteïne gebonden op de latex Stabiliteit van de latexsuspensie
Confirmatietesten
Bewaring en voorbehandeling
Deconjugatie door enzymen, zuren(morfine) of basen(cTHC basen(cTHC))
Extractie : L/L; SPE; SPME; SPME; SBE
Derivatisatie: acylering, acylering, silylering, silylering, methylering
Chromatografische analyse : GCGC-MS; MS; GCGC-(MS)n LCLC-MS; MS; LCLC-MSMS Hematologische bepalingen : Htc
Capillaire electroforese (EPO)
5
Bewaringsvoorwaarden OK? Vooraleer de betrokkenheid van vervalsingen na te gaan :
Onder welke omstandigheden werd de urinecollectie uitgevoerd ? Toezicht? Toezicht?
Tijdsverloop tussen vermoeden van gebruik en urinecollectie
Tijdsverloop tussen afname en aankomst in het laboratorium
Hoe bewaard? Gekoeld (4 °C)? Ingevroren bij -20 °C of bij -80 °C?. Bij koeling ontstaat neerslag : CaCa-fosfaat Behoorlijk afgesloten container met gepaste identificatie? Werd onmiddellijk na de collectie het aspect van de urine geobserveerd geobserveerd : temperatuur? kleur? geur? Bij aankomst in het laboratorium : ook aspect controleren eventueel eventueel onder de microscoop : kristallen? bacterië bacteriën? cellen? Slecht bewaarde urine heeft ook een ammonikale geur.
In vivo vervalsingen Vals negatieve resultaten door
Overmatig water drinken na voorafgaandelijke blaaslediging Overmatig gebruik van alcohol en cafeï cafeïne (diurese (diurese)) Overmatig water drinken + inname van creatine (compensatie) Diuretica Excretievertragende medicatie (probenicid (probenicid)) In vivo alkalinisering van de urine (bicarbonaat) 5-α reductase inhibitoren (finasteride) finasteride) Toevoegen van 1919-norandrostenedion (daling norandrosterone) norandrosterone) Inname van ibuprofen (competitie met derivatisatie bij GCMS) GCMS) Acetylsalicylzuur (salicyluric acid doet NADH dalen) Fluoroquinolonen
6
In vitro vervalsingen (1) Vals negatieve resultaten door substitutie
Aanbrengen van andere urine in blaas via catheter Reservoir met urine voorzien van leiding tot de schaamstreek Condoom met urine; wordt geopend door aangescherpte nagel Condoom met urine in de vagina Bereiding van drugvrije urine uit poeder (gelyofiliseerd (gelyofiliseerd))
In vitro vervalsingen (2) Vals negatieve resultaten door externe toevoeging van water
Toevoegen van leidingswater, leidingswater, mineraal water, fysiologische oplossing. Daling van creatininecreatinine- en ureumconcentratie. Criteria : verdacht bij d <1,003 en creatinine < 0,10 g/L. Interne dilutie wordt verdacht vanaf <0,20 g/L Ondanks het hoge CaCa-gehalte in leidingswater (30 °F) valt de uiteindelijke Ca2+ concentratie binnen de fysiologische grenzen.
7
In vitro vervalsingen (3) Toevoeging van stoffen met pH wijziging
Zuren : Sterke zuren zoals HCl (= muratic acid = AmberAmber-13), HNO3, H2SO4,… met eind pH <2 Zwakke zuren zoals azijnzuur, citroensap,.. Effect : Indien bij een EMIT de pH van het reactiemengsel in de cuvet lager is dan 4 dan werkt het G6PDH suboptimaal. Bovendien zullen alle betrokken enzymen deels denatureren en worden de gezochte moleculen moleculen gevoeliger voor oxidatie.
Alkali: Sterke basen : NaOH, NaOH, KOH, KOH,… zwakke basen : ammonia (zelden) Effect: Indien eindreactiemengsel pH> 11, suboptimale werking van enzyme. enzyme. Alkalinisering sterk genoeg om bufferende capaciteit van reagens te overstijgen.
In vitro vervalsingen (4) Toevoeging van stoffen met oxiderende werking :
Gehalogeneerde verbindingen (javelwater (javelwater,, jodiumtinctuur) :
Chloor, Hypochloriet, chloraat, chloraat, perchloraat, perchloraat, broom, iodium, iodium, periodaat. periodaat. Door de onmiddellijke inwerking zal een groot deel van de toegevoegde toegevoegde substantie uitgewerkt zijn. Dit vereist een aangepaste opsporingsopsporings-procedure. procedure. De oxidatie zal efficië efficiënter zijn naarmate de pH van de urine lager is. Effect : slechts matig of geen effect op de werkzaamheid van het IA reagens. reagens. Eerder oxidatieve transformatie van drugmolecule waardoor detectie met GCMS gemist wordt. Jodium vernietigd morfine en 6MAM quasi onmiddellijk. Ook cTHC is zeer gevoelig.
Nitrieten en nitraten (Klear (Klear = KNO2, Whizzies = NaNO2)
Geen effect op de IA testen. Alles gericht op de oxidatie van de cTHC. cTHC. Problemen met GCMS. GCMS.
Chromaten (Urine Luck, Luck, uropyrine): uropyrine):
Chlorochromaat + pyridine (pyridinium (pyridinium complex), chromaat, chromaat, bichromaat. bichromaat. Effect op de IA testen. Alles gericht op de oxidatie van de cTHC. cTHC.
Peroxiden + peroxydasen (Stealth): Stealth):
Peroxiden (H2O2, persulfaat, persulfaat,…) zijn pas efficië efficiënt na toevoeging van een peroxidase (Horseradish, Horseradish, black mustard seeds) seeds) of een katalysator zoals het Fenton’ Fenton’s reagens (Fe(II)). Vrijstelling van natieve zuurstof is essentieel. Effect : oxidatie van doelmoleculen. Problemen met confirmatietesten (uitkijken (uitkijken naar minimale response van IS van cTHC). cTHC). Door tijdig toevoegen van NaHSO3 kan oxidatie vermeden worden.
8
UrineLuck® UROPYRINE Complex van chroom(VI chroom(VI)) en pyridine in sterk zuur midden (HCl (HCl))
In vitro vervalsingen (5) Kleurstoffen
Fluorescerende stoffen Eosine, Eosine, fluoresceï fluoresceïne, rhodamine
Plantaardige kleurstoffen Golden seal tea : donkere urine Effect : minimaal. Bedoeling is te interfereren met de spectrofotometrie door absorptiebackground te verhogen. Is echter gemakkelijk op te sporen (UV ). Geen of verwaarloosbaar effect (UV). van fluorescerende stoffen op de FPIA test.
9
In vitro vervalsingen (6) Stoffen met een denaturerende werking
Glutaraldehyde (Instant Clean ADDADD-ITIT-ive, ive, UrinAid) UrinAid)
Formaldehyde, metaldehyde (geur!) Effect : Draagt vooral bij tot toename van background fluorescentie in de FPIA test. Reactie met alle moleculen met een vrije aminoamino- en thiolfunctie. thiolfunctie. Denaturatie van enzymen en destabilisering van de Ag). Ag-AL binding (EMIT (EMIT). Bij KIMS: KIMS: Kans op een vals positief resultaat voor cTHC. cTHC. Weinig of geen invloed op RIA testen wegens voldoende uitverdunning uitverdunning van de urine in het reagens.
In vitro vervalsingen (7) Detergenten en ontsmettingsmiddelen
Quats
Quaternaire ammonium derivaten (Benzalkoniumchloride (Benzalkoniumchloride,, …). Effect: daling van cTHC bij RIA. RIA. Interactie met boraatbuffer. Invloed op oplosbaarheid.
Vloeibare handzeep
Anionische en niet geï geïoniseerde formules. Effect : Minimaal. Urine verkrijgt een troebel aspect en een herkenbare geur. Herkenbaar door gemakkelijke schuimvorming. Door verlaging van tensioactiviteit invloed op stabiliteit van latexsuspensie (KIMS (KIMS)) en interferentie met turbidimetrie. turbidimetrie. Vals positieve BE bij FPIA. FPIA.
Dettol ( Chloroxyfenol) Chloroxyfenol)
Invloed op cTHC concentratie.
Denture cleaning tablets (Steradent) Steradent)
Bevattende 1,5 % Na perboraat; perboraat; vanaf een concentratie van 0,3 g poeder per mL urine beginnen alle testen op de TDx af te wijken.
10
In vitro vervalsingen (8) Enzymen
Peroxidasen Steeds samen met actieve zuurstofdonoren (Stealth (Stealth)) met effect op IA als confirmatietesten.
Papaï Papaïne (CLP) CLP) Cysteine protease uit de latex van de papayaplant. papayaplant. Effect: matig op FPIA als EMIT. EMIT. Mogelijks zou naast het enzymeenzyme-effect van de papaine ook een bijdrage zijn van de latex matrix uit CLP (Crude (Crude Latex Papain). Papain). Een concentratie van 10 mg CLP/mL urine zou voldoende zijn om cTHC op de helft te brengen.
Proteasen tegen EPO Kan geneutraliseerd worden met protease remmers
In vitro vervalsingen (9) Toevoeging van neutrale zouten
NaCl Toevoeging van grote hoeveelheden keukenzout. Effect: pas vanaf concentraties van > 50 g/L is er invloed op de EMIT test test voor cTHC. cTHC. Bij meer dan 120 g/L is interferentie met FPIA beschreven. Zodra de dichtheid > 1,030 kg/L opzoeken van overmaat Na+ en Cl- door middel van ISE na 10x verdunnen met aq.dest. aq.dest.
11
Opsporen van vervalsingen (1)
Eenvoudige testen Temperatuur : onmiddellijk na collectie Kleur : groen? Oranje? Rood? Geur: Geur: aromatische stoffen ( geparfumeerde zepen, cosmetica?) Helderheid: Helderheid: kristallijn neerslag? vloeibare zeep,.. Schuimtest : even schudden pH : toevoeging van zuren of basen Creatinine: Creatinine: bepaling met enzymatische methode of Jaffé Jaffé methode Dichtheid met refractometer Osmolaliteit met osmometer
Opsporen van vervalsingen (2) Glutaraldehyde
Spottest of HPLC na reactie met 2,4 dinitrophenylhydrazine
Groene fluorescentie na reactie met thiobarbituraat in een zure fosfaatbuffer en extractie met n-butanol. butanol. Onder UV na druppel op porseleinschaaltje. Semikwantitatieve fluorescentie test met TDx in photo Check mode
12
Opsporen van vervalsingen (3) Nitrieten
Diazotatiereactie : nitriet + naftol + anilineaniline-analoog = paarse kleurprincipe van de dipstick. Vrijstelling van nitreuze dampen na toevoeging an sterk zuur en verwarmen IonIon-uitwisselings Chromatografie 100 µL urine in 5 ml eluent (bicarbonaat buffer) op Dionex kolom
Opsporen van vervalsingen (4) CCP : Chroom(VI)pyridinium Chroom(VI)pyridinium complex (UrineLuck (UrineLuck))
2,5 diphenylcarbazone in aceton : vorming van paarse kleur
FAAS : AAS met grafietoven. Bepaling na 1000 x verdunnen
Pyridine met HSHS-GCMS
Geur detectie na alkaliniseren
13
Opsporen van vervalsingen (5) Bepaling van Iodide/ Iodide/ iodium
Bepaling van het intacte jodium (I2)
Reactie met ABTS (alle andere oxidantia reageren ook) Complexvorming met zetmeel : diepblauwe kleur Extractie met CCl4 of CHCl3: paarse kleur
Bepaling van het jodide (I-), vaak is geen jodium meer aanwezig Oxidatie met nitriet, overmaat wegreageren met sulfaminezuur en onstane jodium bepalen met ABTS. ABTS.
2HNO2 + 2KI + 2H2SO4 I2 + ABTS
I2 + 2NO + 2H2O + K2SO4 ABTS+ + 2I-
Opsporen van vervalsingen (6) Perboraten uit Steradent
Turmeric reagent op Boor (Clarke (Clarke,, Moffat) Wordt bereid uit tinctuur van de rhizoma’ rhizoma’s van Curcuma longa (Zingiberaceae) Zingiberaceae) ook Indische saffraan genoemd. Dient als een geel kleurreagens voor opsporing van boraten in zuur midden. Bij een positieve reactie ontstaat een bruinrode kleur. kleur. Na bevochtigen met ammonia wordt de kleur donkergroen. donkergroen.
14
Opsporen van vervalsingen (7) Hormonen Opsporen van finasteride en zijn metaboliet carboxyfinasteride Tegelijk met interpretatie van het patroon van gewijzigde steroidenexcretie. steroidenexcretie. Na inname van 5 mg is finasteride nog steeds aantoonbaar na 94 uur.
Opsporen van vervalsingen (8) Verhouding van hormoonconcentraties Verhouding van testosterone over epitestosterone > 6
Verhouding van testosteron over LH is een betere indicator Vermits in dit geval testosteron stijgt naast een daling van het LH
15
Dipstickmethoden
Intect 7 : haalt goede score AdultaCheck4 : niet gevoelig genoeg voor Stealth
Tot besluit Alles begint met waterdicht toezicht op de urinecollectie
16
Tot besluit Elk staal wordt als potentieel vervalst beschouwd wanneer
Het aspect van de urine verdacht is Een aspecifieke geur wordt waargenomen Een onbewaakte fase in het transport voorkomt Een discrepantie wordt opgemerkt tussen de resultaten van de orië oriënterende testen en de confirmatie Vermits het probleem zich hier stelt bij vals negatieve stalen ontbreekt (achteraf bekeken) vaak nuttige informatie uit de confirmatietest. Voorzie je lab van een minimum aan controletesten.
DANK VOOR UW AANDACHT
17
