Gyógyszerhatástani és Biofarmáciai Intézet, Szegedi Tudományegyetem, Gyógyszerésztudományi Kar
Kísérletes diabetes mellitus hatása a patkány uterus adrenerg funkcióira
Ph.D. tézis öszefoglaló
Spiegl Gábor
Témavezető: Prof. Falkay György
Szeged 2010
1
TARTALOMJEGYZÉK
BEVEZETÉS ______________________________________________________________ 3 CÉLKITŰZÉSEK___________________________________________________________ 4 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ________________________________________________ 4 Kísérleti állatok ________________________________________________________________ 4 [3H]noradrenalin felszabadulás ___________________________________________________ 5 Izolált szervi kísérletek __________________________________________________________ 5 RT-PCR ______________________________________________________________________ 6
EREDMÉNYEK ____________________________________________________________ 6 Hiperglikémia _________________________________________________________________ 6 Szöveti radioaktivitási értékek: ___________________________________________________ 7 Elektromos stimulációra történő [3H]noradrenalin felszabadulás _______________________ 7 Agonista által indukált kontrakció és relaxáció ______________________________________ 7 Az oxitocin hatása ______________________________________________________________ 9 Az elektromos térerőingerlés hatása _______________________________________________ 9 RT-PCR vizsgálatok ____________________________________________________________ 9
DISZKUSSZIÓ____________________________________________________________ 10
2
BEVEZETÉS A terhesség olyan diabetogén állapot, mely emelkedett inzulin rezisztenciával és ennek hatására bekövetkező fokozott β-sejt válasz miatti hiperinzulinémiával jellemezhető. A szénhidrát- és lipidmetabolizmusban bekövetkező változások célja a fejlődő magzat tápanyagellátásának folyamatos biztosítása a szakaszos anyai táplálékfelvétel mellett is. Gesztációs diabetes mellitus (GDM) akkor következik be, amikor az anyai β-sejt funkciók elégtelen mivoltából fakadóan az inzulin szekréció nem képes kompenzálni a megnövekedett inzulin rezisztenciát. A GDM tehát egy olyan szénhidrát intolerancia, mely terhesség alatt jelentkezik először, vagy akkor detektálják. Egy metabolikus kompenzációs elégtelenség, melyet relatív inzulin hiány és fokozott inzulin rezisztencia jellemez és a terhességek körülbelül 7%-át érinti. Oka heterogén, a kor, elhízás és a genetikai hajlam egyaránt szerepet játszanak a kialakulásában, a szülés után pedig gyakran spontán elmúlik. A GDM az anyára és a magzatra nézve is kockázati tényezőt jelent. Az anya szempontjából a legfontosabbak a szülés közbeni komplikációk úgy, mint a pre-eclampsia, vagy a posztpartum vérzések kockázata, de fokozottabb a veszélye a respirációs distress szindrómának is. Hosszútávú következményként II. típusú diabetes is kifejlődhet. A magzat szempontjából a legfontosabb kockázati tényező a macrosomia, illetve az ebből fakadó egyéb, szülés közbeni komplikációk, traumák. Az ilyen gyermekeknél a későbbi élet során nagyobb eséllyel jelentkezik glükóz intolerancia, obezitás, vagy II. típusú diabetes. A kezelés célja a normoglikémia fenntartása és a ketózis kivédése. Az első lépés általában diéta, de ha ezzel nem érhető el a kívánt vércukorszint, akkor inzulin terápia következik. Az aspart, illetve lispro inzulin analógok nagy biztonsággal alkalmazhatók, mivel a humán inzulinhoz hasonlóan nem jutnak át a placentán. Orális antidiabetikumok használata jelenleg nem javasolt, bár a szulfanilureákkal kapcsolatban néhány tanulmány bíztató eredményekről számol be. A GDM pontos hatása a terhes uterus kontraktilitására nem teljesen ismert. A kontraktilitás két fő meghatározó tényezője a hormonális rendszer, illetve a beidegzés. Terhesség alatt mindkettő jelentősen megváltozik, az emelkedett progeszteron koncentráció konstans uterinális vérátáramlást tart fenn, míg a fellépő adrenerg denerváció a spontán kontrakciók gátoltságához vezet. Ebben az érzékeny rendszerben egy esetlegesen fellépő GDM pedig még mindezeken felüli újabb változásokat indukálhat. Az adrenerg rendszer mindemellett fontos célpontja a tokolitikus terápiának is. Diabetes alatt bekövetkező adrenerg
3
változások ezért nem kívánt hatásmódosulásokhoz vezethetnek, és mindenképp figyelmet érdemelnek a terápia szempontjából.
CÉLKITŰZÉSEK A bevezetésben összefoglaltak alapján a következő kísérleti célokat határoztuk meg: •
Kísérletes állatmodell létrehozása GDM vizsgálatához.
•
Az uterin adrenerg szabályozás preszinaptikus oldalának vizsgálata szuperfúziós kísérletekkel GDM alatt. Az uterus transzmitter felvevő képességének és az elektromos stimulációra történő leadásának változása a terhességi idő függvényében, különbséget téve az implantáció helyéről, illetve az interimplantációs helyekről származó szövetminták között.
•
Az myometriális adrenerg szabályozás posztszinaptikus oldalának vizsgálata szelektív αés β-adrenerg agonistákkal, illetve elektromosan végzett ingerléssel izolált szervi körülmények között, a terhességi idő függvényében, GDM mellett.
•
Az oxitocinnal kiváltható kontrakciós válaszok vizsgálata izolált szervi körülmények között GDM során.
•
Az α- és β-agonistákkal, valamint az oxitocinnal kiváltott ingerlésre kapott eredmények igazolása RT-PCR technikával. A befolyásolt receptorok mRNS-szintű expressziójának mérése a szövetmintákból annak eldöntésére, hogy a kapott kontraktilitásbeli változások mutatnak-e összefüggést az adott receptorstátuszok változásával.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Kísérleti állatok A kísérleteket nőstény Sprague-Dawley patkányokkal (200-250 g) végeztük. A megtermékenyülés detektálására a natív vaginális kenetet vizsgálatuk mikroszkóp alatt. A fogantatás napját tekintettük ezek után a terhesség első napjának. A streptozotocin egy olyan diabetogén ágens, mely szelektíven felhalmozódik a hasnyálmirigy β-sejtjeiben és DNS alkilációval, valamint reaktív oxigéngyökök képzésével károsítja azokat. A diabetest az állatokban 60 mg/kg intravénás streptozotocin injekcióval indukáltuk. A nem terhes kontroll vizsgálatokat a diabetes indukció után 12 nappal végeztük. A vércukorszintet, a kezelést követően enzimatikus kolorimetriás kit segítségével mértük. A
4
terhes állatok esetében a 7. 14. és 21. terhességi napokat vizsgáltuk. A diabetes indukció a terhesség 5. napján történt, kivéve a 7 napos terhes csoportnál. Ebben az esetben a terhesség második napján alkalmaztuk a streptozotcin kezelést. [3H]noradrenalin felszabadulás Az állatokat széndioxid kamrában túlaltattuk, majd az uterusból szövetmintákat metszettünk (20-30 mg). Terhes állatok esetében különbséget tettünk az implantációs és az interimplantációs helyekről származó minták között. A kötőszövettől és endometriumtól megtisztított mintákat felaprítottuk és 10-7M [3H]noradrenalinnal 37°C-on 60 percig inkubáltuk. Ezután de Jongh pufferrel mostuk, majd szuperfúziós kamrába helyeztük őket, ahol 1 ml/perces folyamatos áramoltatás mellett monoamin oxidáz inhibitort, noradrenalin reuptake inhibitort és extraneuronális reuptake inhibitort tartalmazó puffert áramoltattunk keresztül rajtuk 60 percen keresztül. Végül 22 darab 3 perces frakciót gyűjtöttünk, az 5. és a 15. frakció alatt elektromos erőtéringerlést alkalmaztunk. A frakciók [3H] tartalmát folyadék szcintillációs spektrométer segítségével határoztunk meg. Izolált szervi kísérletek Az állatokat széndioxid kamrában túlaltattuk, majd az uterusból gyűrűket metszettünk, melyeket 37°C-os, oxigenizált de Jongh puffert tartalmazó szervfürdőbe helyeztünk. A gyűrűket 1,5g-s kezdeti feszüléssel feszülésmérők közé rögzítettük és 90 percig inkubáltuk. A kísérletek során a szövetfürdőbe adagolt α- és β-adrenerg agonisták, illetve oxitocin jelenlétében rögzítettünk 5 perces regisztrátum szakaszokat, melyek görbe alatti területéből (AUC) dózis-hatás görbéket szerkesztettünk. Az α-adrenerg funkciók diabetes alatt bekövetkező változásainak vizsgálatához kumulatív dózis-hatás görbét vettünk fel noradrenalinra, propranolol (10-6M) jelenlétében. A kísérlet végén 5 perces KCl-al (70mM) kiváltott tónusos kontrakció AUC értékét tekintettük 100 %-nak. A β-adrenerg funkciók diabetes alatt bekövetkező változásainak vizsgálatához terbutalinnal vettünk fel kumulatív dózis-hatás görbét. Ebben az esetben a kísérlet elején váltottunk ki tartós kontrakciót KCl segítségével (50mM), majd regisztráltuk a terbutalinra bekövetkező relaxációt. A KCl-al kiváltott kontrakciót tekintettük a motoros aktivitás 100 %ának.
5
Az oxitocin esetében nem kumulatív dózis-hatás görbéket vettünk fel 10-9 – 10-6M tartományban. A dózis-hatás görbék hatásmaximumát és EC50 értékét minden esetben Graphpad Prism 4-es szoftverrel számoltuk. Izoláltszervi körülmények között elektromos erőtéringerlést is alkalmaztunk. A kísérletek során a szövetet háromszor ingereltük 3 percen keresztül, 40 V feszültségű, 0,6 ms jelszélességű és 50 ms periódusidejű elektromos impulzussal, majd végül KCl (70mM) segítségével maximális kontrakciót indukáltunk. Minden 3 perces stimulált periódushoz 3 perc ingermentes periódust is regisztráltunk, majd a szövetek elektromos ingerelhetőségét az ezekhez tartozó AUC-k hányadosával jellemeztük. RT-PCR Az RT-PCR kísérletek során csak azokat a terhességi napokat vizsgáltuk, melyek során az izolált szervi kísérletek a legnagyobb különbséget mutatták a diabeteses és a kontroll szövetminták viselkedésében. Az α1 és β2 adrenerg receptorok mRNS szintjének méréséhez a nem terhes mintákat használtuk, míg az oxitocin receptor esetében a 15 napos terhes állatokból vett szövetminták receptorstátuszának meghatározása nyújtotta a legtöbb információt. A szövetmintákból Chomczynski és Sacchi szerint RNS-t extraháltunk, amit denaturáltuk 70°C-on 5 percig, majd lehűtés után reverz transzkriptáz és ribonukleáz inhibitor mellett inkubáltuk. Az RT-PCR során 5 µl cDNS-t, 25 µl ReadyMix REDTaq PCR reakciós elegyet, az α and β adrenerg receptorok, valamint az oxitocin receptor 2 µl 50 pM-os sense és antisense primerét, illetve 16 µl DN-áz és RN-áz mentes desztillált vizet használtunk. Belső kontrollként minden mintánál patkány β-aktin próbát alkalmaztunk (GeneID: 81822). Az RT-PCR termékeket 2%-os agaróz gélen választottuk szét, etidium-bromiddal festettük és UV-transzilluminátor alatt fényképeztük, mérésük fluorimetriás esszével történt. A szemi-kvantitatív analízist a gél denzitometriás szkennelésével végeztük.
EREDMÉNYEK Hiperglikémia A hiperglikémiát 12 mM-nál nagyobb plazma vércukorként definiáltuk. Nem terhes állatokon végzett kísérletek alapján a vércukorszint ezt már a STZ kezelést követő 4. napon meghaladta, a kezelést követő 7. naptól pedig már állandósult a hiperglikémia.
6
Szöveti radioaktivitási értékek: A szöveti aktivitás (dpm/mg szövetben kifejezve) a szövet [3H]noradrenalin felvevő képességét írja le. A nem terhes állatok myometriumának ezen paramétere a diabetes hatására szignifikánsan csökkent. A terhesség előrehaladtával további csökkenést figyeltünk meg, szignifikáns különbségekkel az implantációs és az interimplantációs helyekről származó minták között (1. ábra).
7. nap
Szöveti aktivitás (dpm/mg) ± SEM
9000
* 6000
14. nap
21. nap
# **
3000
**
## **
# ** Interimplantáció
Implantáció
Interimplantáció
Implantáció
Interimplantáció
Implantáció
Nem-terhes
0
1. ábra. A myometrium [3H]noradrenalin-felvevő kapacitása a terhességi idő és a STZ-kezelés függvényében. A világos és a sötét oszlopok a kontroll, illetve a STZ-kezelt állatok értékeket mutatják. * és ** p<0,05 és p<0,01 jelentenek a megfelelő kontroll értékekhez viszonyítva. # és ## p<0,05 és p<0,01 szignifikancia értékeket jelentenek ugyanazon kezelés különböző implantációs és interimplantációs helyei között.
Elektromos stimulációra történő [3H]noradrenalin felszabadulás Az alkalmazott elektromos térerő stimulusok közül a második (15. frakció) mindig kisebb transzmitter felszabadulást okozott, mint az első (5. frakció). Nem terhes esetben a diabetes szingifikáns csökkenést okozott az elektromos stimulus hatására bekövetkező transzmitter felszabadulásban (2. ábra). A 7. 14. és 21. terhességi napokon szintén megfigyelhető a tendencia a transzmitter felszabadulás csökkenésének irányában, diabetes mellett, azonban ezek a különbségek csak a 14. terhességi nap esetében voltak szignifikánsak. Agonista által indukált kontrakció és relaxáció A myometrium motoros funkcióinak változásait α- illetve β-adrenerg receptor agonisták jelenlétében felvett kumulatív dózis-hatás görbéken vizsgáltuk. Nem terhes esetben a diabetes fokozta a noradrenalinra adott kontrakciós választ. Ugyanakkor a β-adrenerg
7
receptor agonista terbutalin hatására szingifikánsan alacsonyabb relaxáló hatást tapasztaltunk diabeteses állatokból származó mintákon (3. ábra). Terhesség 7. 14. illetve 21. napját megvizsgálva azonban nem kaptunk szignifikáns kontraktilitásbeli különbséget a diabeteses
Transzmitter felszabadulás (%) ± SEM
és az intakt uterusgyűrűt összehasonlítva.
1.5
** 1.0
*** 0.5
0.0 0
5
10
15
20
25
Frakciók
2. ábra. Elektromos tér ingerlés által kiváltott [3H]noradrenalin felszabadulás nem terhes, kontroll (■) és diabeteses (□) patkányok myometriális mintáiból. ** és *** p<0,01 és p<0,001 szignifikancia értékeket jelentenek, a nem kezelt kontroll értékekhez viszonyítva.
100
Relaxáció (%) ± SEM
Kontrakció (%) ± SEM
20 15 10 5 0 -11
75 50 25 0
-10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-9
-8
-7
-6
-5
-4
Log Terbutalin (M)
Log NA (M)
3 ábra. A noradrenalin (NA) és terbutalin hatása nem terhes kontroll (■) és diabeteses (□) állatok uterus gyűrűinek motor-aktivitására.
8
Az oxitocin hatása Az oxitocin hatásait csak a terhesség harmadik trimeszterében vizsgáltuk, mivel az első két trimeszterben a patkány uterus oxitocin receptor expresziója minimális. Diabetes mellett a 3. trimeszter elején (15. terhességi nap) az oxitocin szignifikánsan erőteljesebb uterotonikus hatást fejtett ki a nem diabeteses állapothoz képest, ugyanakkor ez a különbség
80
15. nap
Kontraktilitás (%) ± SEM
Kontraktilitás (%) ± SEM
terminusra megszűnt (4. ábra).
p<0,001
60 40 20 0 -11
-10
-9
-8
-7
-6
80
21. nap 60
p<0,01
40 20 0 -11
-10
Kontraktilitás (%) ± SEM
-9
-8
-7
-6
Log Oxytocin (M)
Log Oxytocin (M) 80
22. nap 60 40 20 0 -11
-10
-9
-8
-7
-6
Log Oxytocin (M)
4. ábra. Az oxytocin hatása STZ-kezelt és kontroll állatok myometriális kontraktilitására.
Az elektromos térerőingerlés hatása Diabetes hatására mind a nem terhes, mind a terhes állatokból származó minták elektromos ingerelhetősége is szignifikánsan csökkent. Terminusra a csökkenés mérséklődött, ugyanakkor terminusban már az egészséges állatok myometriális kontraktilitása is minimális szintre csökken az adrenerg denerváció miatt, a kísérletes diabetes ezt már nem volt képes tovább befolyásolni. RT-PCR vizsgálatok Az α1-adrenerg receptor altípusok, valamint a β2-receptor mRNS-szintű expresszióját nem terhes myometriumból, az oxytocin-receptorét 15 napos terhes uterusból határoztuk meg.
9
A nem terhes uterusban az α1A- és a β2-receptor esetében nem találtunk diabetesfüggő eltérést, míg az α1B-altípusra emelkedett, az α1D-altípusra pedig csökkent mRNS mennyiséget regisztráltunk a diabeteses állatok mintáiban. A 15 napos terhes diabeteses állatokból nyert mintákban magasabb volt az oxytocin-receptor PCR termék mennyisége a kontrollhoz viszonyítva (5. ábra).
15 10 5 0 Kontroll
*
40 30 20 10
Kontroll
300 bp
* 7.5 5.0 2.5 0.0
0
DM
Kontroll
DM
400 bp
400 bp 304 bp α 1D AR
375 bp OTR
300 bp
313 bp β-actin
300 bp
300 bp
DM
400 bp 300 bp
400 bp
400 bp 313 bp β-actin
PCR termék µ g/ml
*
20
PCR termék µ g/ml
PCR termék µ g/ml
10.0
50
25
301 bp α1B AR
Oxytocin receptor
α 1D-receptor
α 1B-receptor
400 bp 313 bp β-actin
300 bp
5. ábra. A diabetes hatása a myometriális α1B-, α1D-adrenerg receptorok és az oxytocin-receptor mRNS-szintű expressziójára patkányban. *: p<0,05 a kontrollhoz viszonyítva. A grafikonok alatt reprezentatív gélfotók láthatók.
DISZKUSSZIÓ A terhes myometrium kontraktilitását meghatározó három fő fiziológiás faktor az oxitocin, a prosztaglandinok és a szimpatikus idegrendszer. Mindhárom tényező fontos célpontja a klinikumban használt tokolitikus szereknek. Az oxitocin és a prosztaglandinok diabetes alatti hatásmódosulásáról terjedelmes irodalmi adat áll rendelkezésre, ezért munkám során a myometrium adrenerg rendszerében experimentális diabetes hatására bekövetkező funkcionális változásokra fókuszáltam. Terhesség alatt az uterus mélyreható változásokon megy keresztül, mely magában foglalja a myometriumot és vaszkulatúráját ellátó idegrostok fokozatos degenerációját. Ezen terhességi denervációnak feltételezett fiziológiás jelentősége a fötoplacentáris egység funkcionális izolálása, védelme. Terminusra az uterus gyakorlatilag denervált szervnek tekinthető, mely azonban a szülés után reinnerválódik, bár az innerváció szinje a kezdeti állapotét nem fogja elérni. Jelen kísérletsorozat feltárta, hogy a diabetes jelentősen befolyásolja a myometrium adrenerg transzmissziójának preszinaptikus oldalát, azaz a transzmitter felvételt és annak stimulációra történő felszabadítását. A GDM egy kifejezettebb adrenerg denervációt okoz,
10
mintegy felgyorsítva annak folyamatát. Ezen eredményeknek metodikai jelentőséget is tulajdonítunk, az idegkutatásban rutinszerűen használt szuperfúziós technikát sikerült a myometrium funkcionális vizsgálatára optimalizálni. Az elektromos térerő ingerléses kísérletek során, az ingerelhetőség diabetes mellett észlelt csökkenés is az idegi funkciók károsodására enged következtetni. A transzmisszó posztszinaptikus oldalán bekövetkező változások az adrenerg agonisták hatásain keresztül jól jellemezhetőek. Nem terhes esetben a diabetes fokozta a noradrenalinnal kiváltható kontrakciókat és csökkentette a terbutalin relaxáló hatását, ezzel a kontraktilitás fokozódás irányába mutató eredő hatást váltott ki. A terhesség során nem észleltünk hasonlóan markáns diabetesüggő eltéréseket az adrenerg agonistákra adott kontrakciós válaszokban. Diabetes hatására az uterus oxitocinnal szembeni érzékenysége korábban megmutatkozott, ami alátámasztható volt a receptorexpresszió mRNS-szintű emelkedésével is. Eredményeinket összegezve azt találtuk, hogy streptozotocinnal kiváltott diabetes mintegy „felgyorsítja” a terhesség indukálta uterinális változásokat, mind az adrenerg, mind az oxitocin rendszer tekintetében. Ez egyben azt is jelenti, hogy – hasonló humán viszonyok esetén – diabetessel szövődött terhességek fokozott koraszülési kockázatának elhárítására az oxitocin rendszer tűnik alkalmasabbnak.
11
FÜGGELÉK Az értekezés alapját képező közlemények: 1. Falkay G, Spiegl G, Csonka D, Zupkó I: Effects of streptozotocin-induced diabetes on the uterine adrenergic nerve function in pregnant rats A superfusion study. Neurochem Int 51: 306-10 (2007) IF2007: 2.975 2. Spiegl G, Minorics R, Csík G, Zupkó I, Falkay G: A kísérletes diabetes hatása a patkány uterusának terhesség által indukált adrenerg denervációjára és farmakológiai reaktivitására. Magy Nőorv L 71: 253-60 (2008) 3. Spiegl G, Zupkó I, Minorics R, Csík G, Csonka D, Falkay G: Effects of experimentally induced diabetes mellitus on pharmacologically and electrically elicited myometrial contractility. Clin Exp Pharmacol Physiol 36: 884-91 (2009) IF2008: 2.196 Az értekezéshez kapcsolódó előadások, prezentációk: 1. Spiegl G, Csonka D, Zupkó I, Falkay G: A gesztációs diabetes myometriális hatásainak vizsgálata patkányban. Gyógyszerkutatási Szimpózium 2005, Pécs, 2005. XI. 4-5. 2. Spiegl G, Zupkó I, Falkay G: Experimental gestational diabetes decreases noradrenaline release in the myometrium of the rat. 15th World Congress of Pharmacology, Beijing, China, 2006. VII. 2-7. [Acta Pharmacol Sin 27 Suppl 1: P280074 (2006)] 3. Zupkó I, Spiegl G, Falkay G: Effects of streptozotocin-induced diabetes on the contractility of the uterus in the rat. 8th Congress of the European Association for Clinical Pharmacology and Therapeutics, Amsterdam, The Netherlands, 2007. VIII. 29.-IX. 1. [Basic Clin Pharmacol Toxicol 101 Suppl 1: P408 (2007)] 4. Gáspár R, Zupkó I, Gál A, Spiegl G, Csík G, Falkay G: Effects of streptozotocininduced diabetes on the uterine denervation and contractility in pregnant rats. 5th International Symposium on Diabetes and Pregnancy, Sorrento, Italy, 2009. III. 26-28. 5. Minorics R, Zupkó I, Spiegl G, Falkay G: Az uterus adrenerg funkciói kísérletes diabetes modellben 6. Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XIV., Budapest, 2009. XI. 13-15. [Gyógyszerészet 53 Suppl 1: S51 (2009)] 7. Zupkó I, Minorics R, Spiegl G, Falkay G: Effects of streptozotocin-induced experimental diabetes on pharmacological action of drugs affecting myometrial contractility of the rat. 5th International Symposium on Diabetes and Pregnancy, Sorrento, Italy, 2009. III. 26-28.
12
