KAJIAN KEAMANAN DAN AKTIVITAS IMMUNOMODULATOR EKSTRAK DAUN KUMIS KUCING (Orthosiphon stamineus Benth) DAN BUNGA KNOP (Gomphrena globosa L

KAJIAN KEAMANAN DAN AKTIVITAS IMMUNOMODULATOR EKSTRAK DAUN KUMIS KUCING (Orthosiphon stamineus Benth) DAN BUNGA KNOP (Gomphrena globosa L.)

TRI HARI AQUARINI

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006

2

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Kajian Keamanan dan Aktivitas Immunomodulator Ekstrak Daun Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus Benth) dan Bunga Knop (Gomphrena globosa L.) adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Januari 2006 Tri Hari Aquarini NIM P09500014

3

ABSTRAK TRI HARI AQUARINI. Kajian Keamanan dan Aktivitas Immunomodulator Ekstrak Daun Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus Benth) Dan Bunga Knop (Gomphrena globosa L.). Di bawah bimbingan FRANSISKA RUNGKAT ZAKARIA dan MAGGY THENAWIJAYA SUHARTONO Daun kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth) dan bunga knop (Gomphrena globosa L.) telah lama digunakan secara tradisional untuk mencegah atau mengobati berbagai macam penyakit. Daun kumis biasa digunakan untuk mencegah infeksi kandung kemih, kencing batu, infeksi saluran kemih dan mengobati diabetes melitus, rematik, dan asam urat. Bunga knop biasa digunakan untuk mengobati sesak napas karena asma, batuk rejan, radang saluran napas, disentri dan sakit panas. Walaupun demikian, belum ada informasi ilmiah mengenai keamanan kedua produk ini untuk dikonsumsi. Tujuan dari penelitian ini adalah menentukan metode pengeringan terbaik untuk membuat bubuk daun kumis kucing dan bunga knop dan untuk menguji pengaruh ekstrak kedua produk ini terhadap proliferasi sel limfosit manusia. Metode pengeringan terbaik untuk kumis kucing adalah pengeringan dengan sinar matahari, ditunjukkan oleh nilai rataan konsentrasi total fenol sebesar 123.434 + 12.159 mg fenolik/g berat kering yang lebih tinggi dari pada nilai rataan total fenol pada pengeringan dengan oven sebesar 16.918 + 0.174 mg fenolik/g berat kering dan oleh nilai rataan aktivitas antioksidan yang dinyatakan sebagai Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC) sebesar 1354.756 + 1.515 mM/g berat kering dan 470.441 + 61.670 mM/g berat kering. Metode pengeringan terbaik untuk bunga knop adalah pengeringan dengan oven ditunjukkan oleh nilai rataan konsentrasi total fenolnya 3.069 + 0.168 mg fenolik/g berat kering yang lebih tinggi dari pada nilai rataan total fenol pada pengeringan dengan sinar matahari sebesar 2.239+0.055 mg fenolik/g berat kering dan oleh nilai rataan aktivitas antioksidannya berturut-turut sebesar nilai TEAC 108.346+14.166 mM/g berat kering dan 56.070 + 7.085 mM/g berat kering. Pengujian keamanan ekstrak air daun kumis kucing dan bunga knop dilakukan menggunakan sel limfosit manusia yang dikultur dengan menambahkan ekstrak keduanya dan atau mitogen. Untuk ekstrak daun kumis kucing peningkatan konsentrasi dari 1.203 mg/ml menjadi 2.406 mg/ml kemudian menjadi 4.812 mg/ml meningkatkan rataan indeks stimulasi (IS) berturut-turut sebesar 1.518 + 0.124 menjadi 1.819+0.031 kemudian menjadi 2.389+0.148. Untuk bunga knop peningkatan konsentrasi dari 0.4115 mg/ml menjadi 0.823 mg/ml juga meningkatkan rataan IS berturut-turut sebesar 1.011+0.082 dan 1.071 + 0.122. Sebaliknya, peningkatan konsentrasi menjadi 1.646 mg/ml kemudian menjadi 3.292 mg/ml menghambat proliferasi sel limfosit sebesar 0.938 + 0.041 dan 0.780 + 0.142. Tampaknya bubuk daun kumis kucing tidak bersifat racun terhadap sel limfosit, sebaliknya mempunyai aktivitas imunomodulator. Bubuk bunga knop pada konsentrasi yang lebih tinggi tampaknya bersifat racun. Kata kunci: daun kumis kucing, bunga knop, total fenol, aktivitas antioksidan, proliferasi sel limfosit.

4

© Hak cipta milik Tri Hari Aquarini, tahun 2006 Hak cipta dilindungi Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam bentuk apapun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm dan sebagainya

5

KAJIAN KEAMANAN DAN AKTIVITAS IMMUNOMODULATOR EKSTRAK DAUN KUMIS KUCING (Orthosiphon stamineus Benth) DAN BUNGA KNOP (Gomphrena globosa L.)

TRI HARI AQUARINI

Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Pangan

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006

6

Judul Tesis : Kajian Keamanan dan Aktivitas Immunomodulator Ekstrak Daun Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus Benth) dan Bunga Knop (Gomphrena globosa L.) Nama : Tri Hari Aquarini NIM : P09500014

Disetujui Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Ir. Fransiska R. Zakaria, M.Sc. Ketua

Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono Anggota

Diketahui Ketua Program Studi Ilmu Pangan

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. Ir. Betty Sri Laksmi Jenie, M.S.

Prof. Dr. Ir. Syafrida Manuwoto, M.Sc.

Tanggal Ujian : 12 Oktober 2005

Tanggal Lulus :

7

PRAKATA Alhamdulillah segala puji bagi Allah yang dengan seizinnya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis ini, yang berjudul Kajian keamanan dan aktivitas immunomodulator ekstrak daun kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth) dan bunga knop (Gomphrena globosa L.). Pada kesempatan ini, penulis menyampaikan terima kasih kepada : 1. Prof. Dr. Ir. Fransiska R. Zakaria selaku ketua komisi pembimbing yang selalu memberi semangat, motivasi dan bimbingan pada penulis dalam melaksanakan penelitian dan penulisan tesis ini. 2. Prof. Dr. Maggy T. Suhartono, selaku anggota komisi pembimbing yang juga selalu memberi semangat dan bimbingan selama penelitian dan penulisan tesis ini. 3. Ir. Didah Nur Faridah, MSi., atas segala bantuan dan bimbingannya selama penelitian dan penulisan tesis ini. 4. Prof. Dr. Ir. Betty Sri Laksmi Jenie, MS, selaku ketua Program Studi Ilmu Pangan. 5. Program Hibah B Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian IPB yang telah mensponsori penelitian ini. 6. Ibu Prof. Dr. Aisjah Girindra yang terus memberi semangat agar penulis dapat menyelesaikan studinya. 7. Teman-teman di LPPOM-MUI atas segala dukungan dan doanya. 8. Laboran dan pegawai di Lab. PAU BIOTEK, Mbak Ika, Mbak Eni dan Novi yang selalu memberi semangat dan bantuan bila ada kesulitan selama penulis bekerja di laboratorium. 9. Teman-teman di Lab. Mikrobiologi PAU BIOTEK, Mbak Eko, Mbak Yuyun, Emma, Dina, Siti, Agnes, Rudi, Bobby, Eni dan Darta yang selalu berbagi ilmu dan saling mendukung. 10. Adik-adik satu penelitian Nora dan Inggrid yang selalu saling menyemangati dan bekerja sama. 11. Teman-teman pada Program Studi Ilmu Pangan yang selalu bersedia membantu dan memberi semangat kepada penulis untuk menyelesaikan penelitian. 12. Papa dan Mama juga Bapak (Soedibjo N.H) dan Ibu (Sumarti) atas segala dukungan dan bantuannya. 13. Suamiku tercinta Mas Upi dan anak-anakku tersayang Mbak Ima, Mbak Ifa, Mas Fawzan dan Adek Ira atas segala pengorbanan dan pengertiannya selama Ibu kuliah. 14. Kakak-kakakku Mas Eko, Bu Nien, Mbak Yanti dan Aa Bagus serta adikadikku De Ida dan Joko, De Ika dan Gandjar, De Dewi, dan De Rudi dan Fika atas segala doa dan dukungannya. Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penulisan tesis ini, oleh karena itu penulis mohon kritik dan saran untuk kesempurnaan tesis ini. Semoga penelitian ini bermanfaat bagi kita semua. Amin. Bogor, Januari 2006 Tri Hari Aquarini

8

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor, pada tanggal 18 Februari 1969 sebagai anak terakhir dari tiga bersaudara putra Bapak Prof. Dr. Harimurti Martojo dan Ibu Rastini Rasjid, MSc. Penulis menempuh pendidikan SD sampai SMA di Bogor. Tahun 1987 diterima di Institut Pertanian Bogor dan tahun 1988 diterima di Jurusan Teknologi Industri Pertanian, Fateta IPB. Penulis menyelesaikan studi Sarjananya pada tahun 1992. Sejak 1993 sampai sekarang penulis bekerja paruh waktu di Lembaga Pengkajian Pangan dan Obat-obatan-MUI (LPPOM-MUI). Penulis telah menikah dengan dr. Supriyadi Bektiwibowo SpA dan dikaruniai empat orang anak, Fathimah Hanun Syifaul Jannah, Hanifah Sakinatun Khalidah, Muhammad Khalid Fawzan ’Adziima dan Khadijah Zhafirah Nurul Ramadhani.

9

DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL .............................................................................................. 11 DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... 12 DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... 13 PENDAHULUAN .............................................................................................. 14 Latar Belakang ........................................................................................... 14 Tujuan ....................................................................................................... 15 TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................................... 16 Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus Benth) ........................................ 16 Bunga Knop (Gomphrena globosa L.) ....................................................... 18 Pengeringan ............................................................................................... 21 Senyawa Fenolik ........................................................................................ 23 Keamanan Pangan ..................................................................................... 25 Limfosit dan Proliferasi Sel Limfosit ......................................................... 26 Immunomodulator ...................................................................................... 29 Kultur Sel ................................................................................................... 30 BAHAN DAN METODE .................................................................................. 32 Bahan dan Alat .......................................................................................... 32 Metode Penelitian ....................................................................................... 33 Pembuatan Bubuk Daun Kumis Kucing dan Bubuk Bunga Knop ... 33 Metode Pengeringan Oven ....................................................... 33 Metode Pengeringan Sinar Matahari ...................................... 33 Pembuatan Ekstrak Air Daun Kumis Kucing dan Bunga Knop Segar dan Bubuk .............................................................................. 33 Analisa Total Fenol modifikasi metode Chandler dan Dodds (Shetty et al. 1995)....................................................................................... 34 Analisa Aktivitas Antioksidan (Kubo et al. 2002) ......................... 34 Analisa Proksimat (Apriyantono et al. 1989).................................. 35 Analisa Proliferasi Limfosit ............................................................. 37 Persiapan Larutan Ekstrak Daun Kumis Kucing dan Bunga Knop Serta Larutan Mitogen ……………………………....... 37 Persiapan Medium Kultur Sel Limfosit (Koesitoresmi 2002), Isolasi Limfosit (Nurrahman 1999) dan Penghitungan Sel ..... 38 Kultur Limfosit ........................................................................ 40 HASIL DAN PEMBAHASAN........................................................................... 42 Daun Kumis Kucing ................................................................................. 42 Metode Pengeringan ......................................................................... 42 Total Fenol dan Aktivitas Antioksidan............................................. 44 Analisa Proksimat Bubuk Daun Kumis Kucing Hasil Pengeringan Dengan Sinar Matahari ................................................................... 49 Pengujian Ekstrak Daun Kumis Kucing Terhadap Proliferasi Sel Limfosit Dengan Metode MTT.........................................................49

10

Bunga Knop................................................................................................ 53 Metode Pengeringan......................................................................... 53 Total Fenol dan Aktivitas Antioksidan............................................ 55 Analisa Proksimat Bubuk Bunga Knop Hasil Pengeringan Dengan Oven ................................................................................................ 59 Pengujian Ekstrak Bunga Knop Terhadap Proliferasi Sel Limfosit Dengan Metode MTT........................................................................ 60 SIMPULAN DAN SARAN ................................................................................ 65 Simpulan ................................................................................................. 65 Saran ......................................................................................................... 65 DAFTAR PUSTAKA.......................................................................................... 66 LAMPIRAN ...................................................................................................... 72

11

DAFTAR TABEL Halaman 1 Mitogen-mitogen ”nonspecific” yang mengaktivasi sel limfosit manusia ... 28 2 Bahan-bahan yang ditanam ke dalam kultur sel............................................. 41 3 Perbandingan total fenol pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak air daun kumis kucing segar ....... 45 4 Perbandingan aktivitas antioksidan pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak air daun kumis kucing segar ..................… .................................................................. 47 5 Hasil analisa proksimat bubuk daun kumis kucing hasil pengeringan dengan sinar matahari .............................................................................................. 49 6 Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah ekstrak daun kumis kucing dengan mitogen (Con A, LPS dan PK) dengan yang ditambah ekstrak daun kumis kucing saja pada konsentrasi C2 (1.203 mg/ml) ,C4 (2.406 mg/ml) dan C8 (4.812 mg/ml) ..................... 50 7 Perbandingan total fenol pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak air bunga knop segar................. 54 8 Perbandingan aktivitas antioksidan pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak air bunga knop segar.......................................................................................................…… 57 9 Hasil analisa proksimat bubuk bunga knop hasil pengeringan dengan oven ............................................................................................................... 59 10 Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah ekstrak bunga knop dengan mitogen (Con A, LPS dan PK) dengan yang ditambah ekstrak bunga knop saja pada konsentrasi C1 (0.4115 mg/ml), C2 (0.8230 mg/ml), C4 (1.646 mg/ml) dan C8 (3.292 mg/ml)...................... 60 11 Perbandingan hasil penelitian ekstrak daun kumis kucing dengan bunga knop .............................................................................................................. 64 12 Hasil analisa total fenol dan aktivitas antioksidan.......................................... 77 13 Hasil analisa MTT ekstrak bunga knop ......................................................... 77 14 Hasil analisa MTT ekstrak daun kumis kucing... .......................................... 78 15 Absorbansi untuk Trolox (mM)... ................................................................. 79 16 Absorbansi untuk asam tanat... ..................................................................... 80

12

DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Tanaman kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth) .............................. 16 2 Tanaman bunga knop (Gomphrena globosa L.) ............................................ 19 3 Pengambilan darah secara aseptis................................................................. 39 4 Bubuk daun kumis kucing ............................................................................ 43 5 Ekstrak air bubuk daun kumis kucing........................................................... 43 6 Perbandingan total fenol ekstrak air masing-masing perlakuan pada daun kumis kucing ................................................................................................ 46 7

Perbandingan analisa aktivitas antioksidan masing-masing perlakuan pada daun kumis kucing ....................................................................................... 47

8 Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah ekstrak daun kumis kucing saja dengan yang ditambah mitogen (Con A, LPS dan PK ) saja dan dengan ekstrak daun kumis kucing ditambah mitogen ... 52 9 Bubuk bunga knop ........................................................................................ 54 10 Ekstrak air bubuk bunga knop.......... ........................................................... 54 11 Perbandingan total fenol ekstrak air masing-masing perlakuan pada bunga knop ............................................................................................................. 57 12 Perbandingan analisa aktivitas antioksidan masing-masing perlakuan pada Bungaknop................................................................................................... 58 13 Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah ekstrak bunga knop saja dengan yang ditambah mitogen (Con A, LPS dan PK ) saja dan dengan ekstrak bunga knop ditambah mitogen .........................

61

14 Kurva standar Trolox .................................................................................. 79 15 Kurva standar Asam Tanat ......................................................................... 80

13

DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Dosis dasar jumlah penggunaan daun segar dan bubuk daun kumis kucing untuk membuat ekstrak air …..…………………………………….

72

2 Dosis dasar jumlah penggunaan bunga segar dan bubuk bunga knop untuk membuat ekstrak air .........……………………………………………

73

3 Contoh Perhitungan Konsentrasi Ekstrak Daun Kumis Kucing .................. 74 4 Contoh Perhitungan Konsentrasi Ekstrak Bunga Knop ................................ 75 5 Penentuan konsentrasi larutan mitogen (LPS, Con A dan Pokeweed) ........... 76 6 Master tabel data penelitian ......................................................................... 77 7 Tabel absorbansi dan kurva standar trolox .................................................... 79 8 Tabel absorbansi dan kurva standar asam tanat............................................. 80 9 Daftar singkatan ............................................................................................ 81 10 Hasil uji statistik (ANOVA) kadar total fenol ekstrak air daun kumis Kucing ..................................................................................................….... . 82 11 Hasil uji statistik (ANOVA) aktivitas antioksidan ekstrak air daun kumis Kucing .......................................................................................................... 84 12 Hasil uji statistik (ANOVA) indeks stimulasi ekstrak daun kumis kucing .... 86 13 Hasil uji statistik (ANOVA) kadar total fenol ekstrak air bunga knop .....… . 90 14 Hasil uji statistik (ANOVA) aktivitas antioksidan ekstrak air bunga knop.... 92 15 Hasil uji statistik (ANOVA) indeks stimulasi ekstrak bunga knop ........….. 94

14

PENDAHULUAN Latar Belakang Seiring dengan semboyan kembali ke alam, akhir-akhir ini minat masyarakat untuk menggunakan bahan-bahan alami semakin meningkat. Hal ini terbukti dengan semakin banyaknya industri-industri baik industri kecil maupun besar yang menggunakan tumbuh-tumbuhan yang banyak terdapat di Indonesia. Kenyataan ini mendorong dilakukannya penelitian-penelitian tentang tumbuhantumbuhan yang secara tradisional sering digunakan untuk mencegah atau mengobati berbagai penyakit. Di hutan tropik Indonesia terdapat sekitar 30.000 spesies tumbuhan berbunga. Dari jumlah tersebut, diperkirakan tidak kurang dari 9.606 spesies diketahui berkhasiat obat (Mahendra dan Fauzi 2005), diantaranya kumis kucing dan bunga knop (Dalimartha 2000). Dalam kehidupan sehari-hari, masyarakat biasa mengkonsumsi kumis kucing dan bunga knop dalam bentuk air rebusan. Kumis kucing secara tradisional biasa digunakan untuk mencegah infeksi kandung kemih, kencing batu, infeksi saluran kemih dan mengobati diabetes melitus, rematik, batu kemih, batu ginjal dan asam urat (Mahendra dan Fauzi 2005). Bunga knop secara tradisional biasa digunakan untuk mengobati sesak napas karena asma, batuk rejan (pertusis), radang saluran napas, radang mata, sakit kepala, disentri dan sakit panas (Dalimartha 2000). Daun kumis kucing dan bunga knop segar mempunyai kandungan air yang tinggi, sehingga tidak dapat disimpan dalam waktu yang relatif lama. Berdasarkan kenyataan tersebut, perlu dilakukan pengawetan terhadap kedua komoditas ini yaitu dalam bentuk bubuk.

Penelitian perlu dilakukan untuk

membuat bubuk dengan metode terbaik, sehingga komponen-komponen penting yang terkandung di dalam daun kumis kucing dan bunga knop tidak banyak yang hilang. Produk dalam bentuk bubuk ini dapat dikembangkan sebagai suatu produk minuman seduhan, sehingga dapat memberi nilai tambah terhadap daun kumis kucing dan bunga knop.

Mengingat berbagai fungsinya secara tradisional,

15

minuman seduhan kedua komoditas tersebut dapat dijadikan sebagai minuman fungsional. Sebelum dapat dikonsumsi secara aman, minuman seduhan daun kumis kucing dan bunga knop terlebih dahulu harus diuji keamanannya ddan fungsi biologis lainnya. Untuk itu perlu diketahui dosis yang aman untuk dikonsumsi sehari-hari dengan cara pengujian secara in vitro terhadap proliferasi sel limfosit manusia. Penggunaan sel limfosit manusia adalah karena limfosit merupakan sel yang sangat rentan terhadap bahan kimia, sehingga pengujian dengan limfosit ini dapat memberikan hasil yang akurat dan sensitif. Di samping itu, penggunaan sel limfosit dapat menggambarkan adanya aktifitas immunomodulator, yaitu memacu atau menekan respon imun (Pranoto 2003 ; Wahyuni 2004 ; Lin et al. 2005). Penelitian-penelitian yang menggunakan sel limfosit untuk pengujian keamanan pangan antara lain cincau hijau (Zakaria dan Prangdimurti 2001 ; Koesitoresmi 2002), jahe (Tejasari et al. 2000 ; Nurrahman 1998) dan makanan jajanan (Zakaria et al. 1997). Tujuan Tujuan penelitian ini adalah 1) memilih metode pengeringan terbaik untuk membuat bubuk seduhan daun kumis kucing dan bunga knop 2) menentukan dosis yang aman dari kedua komoditas tersebut dengan pengujian secara in vitro terhadap proliferasi sel limfosit manusia 3) Menunjukkan adanya aktivitas immunomodulator dari kedua komoditas tersebut.

16

TINJAUAN PUSTAKA Kumis Kucing (Orthosiphon stamineus Benth) Tanaman kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth) diduga berasal dari daerah Afrika tropik, kemudian menyebar ke wilayah Georgia (Kaukasus), Kuba, Asia dan Australia Tropik. Penyebarannya di Indonesia, yaitu di Jawa sejak 1928, India, Malaysia, Vietnam dan Thailand (de Padua et al. 1999).

Gambar 1 Tanaman kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth) Menurut Dalimartha (2000) kumis kucing tersebar di Sumatera dengan nama daerah kumis kucing (bahasa Melayu), di Jawa dengan nama daerah kumis kucing (bahasa Sunda) atau remujung (bahasa Jawa) dan soengoet koceng (bahasa Madura). Sentra produksi kumis kucing yaitu Jawa Tengah (Ambarawa, Kopeng dan Blora), Jawa Barat (Sukabumi dan Bogor), Jawa Timur, Sumatera Barat, Sumatera Utara, Aceh dan Sulawesi Utara (Mahendra dan Fauzi 2005). Berdasarkan ilmu taksonomi (Mahendra dan Fauzi 2005) tata nama kumis kucing adalah sebagai berikut. Divisi

: Spermatophyta

Subdivisi

: Angiospermae

Kelas

: Dicotyledonae

Subkelas

: Sympetalae

17

Ordo

: Tubiflorae

Famili

: Labitae (Laminaceae)

Genus

: Orthosiphon

Spesies

: Orthosiphon stamineus Benth

Tanaman kumis kucing berakar tunggang, termasuk tanaman tahunan, tumbuh tegak dengan tinggi mencapai 100-150 cm. Batang berbentuk persegi empat agak beralur, bercabang-cabang, berambut pendek atau gundul, berwarna hijau atau keunguan dan berdiameter sekitar 1.5 cm. Daun berbentuk bulat telur, lonjong, lanset atau belah ketupat dengan permukaan berbintik-bintik dan licin karena adanya kelenjar dalam jumlah banyak dan berwarna hijau keunguan. Panjang daun sekitar 10 cm dan lebar 3-5 cm (Mahendra dan Fauzi 2000). Bunga majemuk dalam tandan yang keluar di ujung percabangan, berwarna ungu pucat atau putih, benang sari lebih panjang dari tabung bunga. Buah berupa buah kotak, bulat telur, masih muda berwarna hijau, setelah tua berwarna coklat. Biji kecil, masih muda berwarna hijau, setelah tua berwana hitam Kumis kucing biasa tumbuh liar di sepanjang anak sungai dan selokan atau ditanam di pekarangan sebagai tumbuhan obat. Tumbuhan ini dapat ditemukan di daerah dataran rendah sampai ketinggian 700 m diatas permukaan laut (Dalimartha 2000). Menurut Mahendra dan Fauzi (2005) serta Dalimartha (2000), kumis kucing mengandung banyak komponen bioaktif seperti orthosiphon glikosida, tanin, minyak atsiri, minyak lemak, saponin, sapofonin, garam kalium (0.6-3.5%) , myoinositol dan sinensetin. Berdasarkan hasil penelitian Olah et al. (2003), kumis kucing mengandung polifenol yaitu polymethoxylated flavonoid dan turunan caffeic acid. Identifikasi lebih lanjut menunjukkan adanya kandungan caffeic acid, cichoric acid, rosmarinic acid, sinensetin dan eupatorine. Loon et al. (2005) melakukan penentuan tiga jenis flavonoid dari kumis kucing di dalam plasma mencit dengan metode HPLC dan deteksi dengan sinar ultraviolet. Ketiga jenis flavonoid tersebut adalah sinensetin, eupatorin dan 3’-hydroxy5,6,7,4’tetramethoxyflavone.

Kumis kucing rasanya manis sedikit pahit dan

sifatnya sejuk. Penelitian yang dilakukan terhadap efek yang ditimbulkan setelah seorang responden yang sehat meminum teh kumis kucing adalah dapat mencegah

18

asam urat dan terbentuknya batu yang mengandung asam urat dalam kandung kemih.

Hal ini disebabkan oleh meningkatnya alkalinitas urin (Nirdnoy dan

Muangman 1991).

Hasil penelitian Isparyanto (1999)

menunjukkan bahwa

pemberian infus daun kumis kucing berdosis 12.85 g/kg bobot badan selama 7 hari dapat menurunkan asam urat darah tikus dengan efek yang sama dengan pemberian obat kimia Alopurinol 42.85 mg/kg bobot badan. Efek diuretik dari ekstrak air kumis kucing pada mencit menunjukkan adanya peningkatan pengeluaran urin (Casadebaig-Lafon et al. 1989; Beaux et al. 1999) .

Kandungan Natrium dalam urin mencit juga meningkat dengan

pemberian ekstrak air kumis kucing (Beaux et al. 1999). Berdasarkan penelitian Sari (1985) efek maksimal terhadap sifat diuretikum dari rata-rata 1 ml infus dengan kandungan 5%, 10% dan 20% daun kumis kucing berturut-turut adalah 275.22%, 376.64% dan 646.12%. Hasil penelitian ini juga menunjukkan bahwa kumis kucing mengandung Kalium yang berfungsi sebagai pelarut batu ginjal dan batu saluran kemih. Dibandingkan dengan batangnya potensi diuretikum daun kumis kucing lebih baik. Volume urin rata-rata kelinci yang diberi infus daun kumis kucing sebesar 27.0 ml sedangkan volume urin rata-rata kelinci yang diberi infus batang sebesar 22.4 ml (Garnadi 1998). Daun kumis kucing juga dapat berfungsi sebagai anti bakteri.

Hasil

penelitian Sofiani (2003) menunjukkan adanya sifat anti bakteri dari ektrak daun kumis kucing terhadap bakteri Staphylococcus epidermidis dan Eschericia coli dengan daya penghambatan yang berbeda. Sinensetin yang terkandung di dalam daun kumis kucing juga menghambat relatif besar

terhadap Staphylococcus

epidermidis. Tanaman ini yang biasa digunakan adalah daun atau seluruh bagian tanamannya, baik segar maupun sudah dikeringkan (Anonim 2005). Bunga Knop (Gomphrena globosa L.) Bunga knop (Gomphrena globosa L.) berasal dari Amerika (Dalimartha 2000 ; Anonim 2005) dan Asia (Anonim 2005).

Tanaman ini tumbuh liar di

ladang yang cukup mendapat sinar matahari dan dapat ditemukan pada ketinggian 1- 1.300 m di atas permukaan laut (Dalimartha 2000).

19

Gambar 2 Tanaman bunga knop (Gomphrena globosa L.) Di Indonesia, bunga knop tersebar di Sumatera dengan nama daerah bunga knop, kembang puter dan ratnapakaja. Nama daerahnya di Jawa adalah adasadasan, kembang gundul dan bunga kancing

Selain itu dikenal pula di Bali

dengan nama daerah ratna serta di Gorontalo dengan nama daerah taimantulu (Dalimartha 2000). Berdasarkan ilmu taksonomi (Anonim 2000), tata nama bunga knop adalah sebagai berikut : Divisi

: Spermatophyta

Subdivisi

: Angiospermae

Kelas

: Dicotyledonae

Bangsa

: Caryophyllales

Suku

: Amaranthaceae

Marga

: Gomphrena

Jenis

: Gomphrena globosa L.

Tanaman ini berupa perdu dengan batang hijau kemerahan, berambut dan bercabang-cabang serta tinggi mencapai 60 cm (Anonim 2005). Daun tunggal, bertangkai pendek, letak berhadapan bersilang. Helaian daun bentuknya bulat

20

telur sungsang sampai memanjang, ujung meruncing, tepi rata, berwarna hijau, berambut kasar berwarna putih di permukaan atas dan berambut halus di permukaan bawah.

(Dalimartha 2000).

Bunga bentuk bonggol seperti bola,

berwarna merah tua keunguan, putih (Anonim 2005) atau merah muda (Dalimartha 2000). Bijinya banyak dengan ukuran kecil-kecil panjang (Anonim 2005), sedang buahnya buah kotak berbentuk segi tiga terbungkus oleh lapisan tipis berwarna putih, berbiji satu (Dalimartha 2000). Menurut Mahendra dan Fauzi (2005) serta Dalimartha (2000), bunga knop mengandung gomphrenin I, II, III, V dan VI, amaranthin, minyak atsiri, saponin dan flavon.

Menurut Cai et al (2001), bunga knop banyak mengandung

komponen pigmen alami yaitu dari kelompok betasianin sebesar 1.3 mg/g sampel segar.

Betasianin ini terdiri dari komponen gomphrenin I (betanidin 6-0-â-

glukosida) sebesar 16.9%,

isogomphrenin I (isobetanidin 6-0-â-glukosida)

sebesar 8.8%, gomphrenin II (betanidin 6-0-(6’ -0-E-4-coumarooyl)-â-glukosida) sebesar 11.1%, isogomphrenin II (isobetanidin 6-0-(6’ -0-E-4-coumarooyl)-âglukosida) sebesar 3.5%, gomphrenin III (betanidin 6-0-(6’ -0-E-4-feruroyl)-âglukosida) sebesar 40.8% dan isogomphrenin III (isobetanidin 6-0-(6’ -0-E-4feruroyl)-â-glukosida).

Menurut Cai et al (2001), betasianin merah yang terdiri

dari betanin dan amaranthin bersifat tahan terhadap panas dalam sistem buffer, tetapi bersifat tidak stabil pada suhu di atas 40oC dan bersifat lebih stabil pada suhu 40oC tanpa adanya udara dan sinar. Penelitian yang dilakukan terhadap Amaranthus spinosus L., yaitu tanaman yang biasa digunakan sebagai obat di Afrika menunjukkan adanya kandungan betalain utama yang diidentifikasi sebagai amaranthin dan isoamaranthin. Selain itu tanaman ini juga mengandung hidroksisinamat, quersetin dan kaempferol glikosida yang semuanya merupakan senyawa fenolik (Stintzing et al. 2004). Warna bunga dan buah tanaman dari famili Caryophyllales berasal dari betalain yang berwarna merah-ungu untuk betasianin dan kuning untuk betaxanthin, keduanya menggantikan anthosianin. Betalain biasa digunakan sebagai pewarna makanan dan mempunyai sifat antioksidan yang dapat mencegah stress oksidatif (Strack et al. 2003).

Pengujian terhadap kandungan polifenol Amaranthus sp.

menunjukkan bahwa penambahan ekstrak Amaranthus sp. dengan konsentrasi

21

polifenol sampai dengan 0.2 µg/ml dapat meningkatkan perlindungan terhadap stress oksidatif oleh H2O2 yang menginduksi kerusakan DNA dari limfosit (Kapiszewska et al. 2005). Aurone I (E) -3’ –O - ß- D- glucopyranosy l-4,5, 6,4’ - tetrahydroxy -7,2’ dimethoxyaurone dan dua senyawa lain yaitu aurantiamide acetate dan tiliroside diisolasi dari ekstrak etanol Gomphrena agretis.

Evaluasi terhadap aktivitas

biologis ekstrak etanol Gomphrena agretis dan ketiga senyawa di atas menunjukkan adanya penghambatan terhadap pertumbuhan Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis dan Pseudomonas aeruginosa (Ferreira et al. 2004).

Ekstrak petroleum eter dari Gomphrena martiana dan Gompohrena

boliviana yang kemudian difraksinasi menghasilkan lima jenis 5,6,7-trisubstituted flavon.

Pengujian secara terpisah terhadap hasil fraksinasi ini menunjukkan

aktivitas antimikrobial yang tinggi terhadap M. Phlei dengan minimum inhibitory concentration (MIC) 15, 20 dan 75 µ/ml, mendekati hasil yang didapat dengan bakterisida komersial (Pomilio et al. 1992). Kultur sel dari sel endotel tali pusat manusia (HUVEC) yang diberi ekstrak Amaranthus sp. menunjukkan tidak dihasilkannya IL-1 sebagai proinflamatory sitokin yang menginduksi aktivasi AP-1. Mekanisme aktivitas penghambatan ini belum jelas, tetapi kemungkinan kandungan polifenol dari tanaman merupakan salah satu mediatornya (Stalinska et al. 2005). Bunga knop rasanya manis, sifatnya netral dan biasa digunakan sebagai obat batuk, obat sesak, obat astma, obat bronkhitis kronis, peluruh dahak, panas pada anak, disentri dan penambah nafsu makan. Tanaman ini yang biasa digunakan adalah bunga atau seluruh bagian tanamannya

baik segar maupun sudah

dikeringkan (Anonim 2005). Pengeringan Pengeringan bahan-bahan pertanian seperti sayuran dan buah-buahan adalah suatu cara untuk mengawetkan bahan-bahan pertanian (Imre 1995).

Produk

pertanian yang sudah dikeringkan berkurang kadar air dan kelembabannya, sehingga tidak memberi kesempatan pada mikroorganisme seperti bakteri dan

22

kapang untuk hidup (Sokhansanj dan Jayas 1999; Jayaraman dan Das Gupta 1995). Menurut Jayaraman dan Das Gupta (1995), faktor-faktor yang mempengaruhi pemilihan metode pengeringan adalah bentuk dari bahan mentah dan sifatsifatnya, karakteristik dan bentuk fisik yang diinginkan untuk produk akhirnya dan biaya operasional. Tiga cara yang biasa digunakan untuk mengeringkan buah-buahan dan sayur-sayuran adalah pengeringan dengan sinar matahari, pengeringan atmosfirik baik secara batch (tower atau cabinet dryers) atau kontinyu (tunnel, belt, Spray atau pemanasan dengan microwave) serta dehidrasi subatmosfir (vacuum shelf belt dan freeze dryer). Perubahan warna, aroma dan penampakan terjadi pada produk yang dikeringkan. Pengeringan dapat pula meningkatkan kualitas dan nilai nutrisi suatu produk pangan dan pakan, seperti rasa yang lebih enak dan daya cerna serta perubahan metabolik yang meningkat (Sokhansanj dan Jayas 1995).

Selama

pengeringan terjadi degradasi senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun seperti klorofil yang memberi warna hijau pada daun.

Degradasi klorofil

tergantung pada ph, waktu, kerja enzim, oksigen dan cahaya (Jayaraman dan Das Gupta 1995). Pengeringan dengan sinar matahari adalah suatu metode pengeringan tradisional yang telah berabad-abad dilakukan. Pengeringan ini dilakukan pada waktu matahari bersinar dengan suhu produk sewaktu dikeringkan berkisar antara 5-15oC di atas suhu ambient (Sokhansanj dan Jayas 1999).

Masalah yang

mungkin timbul pada pengeringan dengan sinar matahari antara lain adalah terjadinya hujan atau mendung, kontaminasi oleh debu, serangga, burung dan binatang lainnya, kurangnya pengawasan sehinga terjadi pengeringan melewati batas dan kemungkinan terjadi pembusukan baik secara kimiawi, enzimatis atau mikrobiologis karena waktu pengeringan yang lama (Jayaraman dan Das Gupta 1995).

Selain itu dapat terjadi penurunan mutu selama penyimpanan karena

terjadi ketidakseragaman pengeringan (Imre 1995). Menurut Mahendra dan Fauzi (2005) pengeringan daun kumis kucing dengan sinar matahari dilakukan selama 2-3 hari (bila matahari bersinar penuh) dan dapat pula dilakukan dengan menggunakan oven yang dapat diatur suhunya sebesar 60oC selama 3 – 6 jam.

23

Senyawa Fenolik Senyawa fenolik dalam bahan pangan meliputi asam-asam fenolik, polimer fenolik yang dikenal sebagai tanin dan flavonoid. Asam-asam fenolik terdiri dari kelompok asam hidroksibenzoat dan asam hidroksisinamat. Senyawa polimer fenolik adalah senyawa dengan berat molekul tinggi seperti tanin.

Flavonoid

adalah kelompok fenolik terbanyak yang terkandung dalam tanaman dan biasanya ditemukan dalam bentuk glikosida. Fenol adalah antioksidan terbanyak dalam tumbuhan yang berperan sebagai antioksidan pemutus rantai. Hal ini disebabkan oleh adanya gugus –OH yang menghalangi senyawa radikal yang reaktif seperti radikal peroksil (RO2’) -OH + RO2’

R-O’ + ROOH

Hasil reaksi di atas menghasilkan radikal fenoksil yaitu R-O’ yang cenderung mempunyai sifat kurang reaktif karena terjadi delokalisasi elektron ke cincin aromatik. Hal ini menyebabkan radikal reaktif RO2’ berkurang kereaktifannya. Fenol kadangkala mempunyai mekanisme reaksi antioksidan tambahan seperti reaksi mengkelat ion logam transisi (Halliwell 2002). Penelitian yang dilakukan Cai et al. (2004) terhadap 112 tanaman yang biasa digunakan dalam pengobatan kanker secara tradisional di Cina menunjukkan adanya hubungan yang positif dan berbanding lurus antara aktivitas antioksidan dengan kandungan total fenolik dalam tanaman-tanaman tersebut. Nilai TEAC tanaman-tanaman tersebut berkisar antara 46.7 sampai 17,323 µM dan GAE sebesar 0.22 sampai 50.3 g GAE/100g berat kering. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa- senyawa fenolik merupakan senyawa antioksidan yang dominan dalam tanaman-tanaman tersebut. Senyawasenyawa fenolik utama yang terkandung di dalam tanaman-tanaman tersebut yang telah diidentifikasi dan dianalisa adalah asam-asam fenolik, flavonoid, tanin, coumarin, lignan, quinon, stilbene dan curcuminoid. Tanaman-tanaman tersebut dengan demikian kemungkinan merupakan sumber potensial antioksidan alami dan kemopreventif untuk mencegah kanker. Penelitian yang dilakukan terhadap aktivitas antioksidan pigmen betalain dari

beberapa

tanaman

yang

termasuk

famili

Amaranthaceae

dengan

menggunakan metode DPPH (1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl) yang dimodifikasi menunjukkan adanya aktivitas antioksidan yang tinggi untuk semua tanaman yang

24

diteliti. Betasianin tipe gomphrenin (rata-rata = 3.7 µM) dan betaxanthin (ratarata = 4.2 µM) menunjukkan aktivitas antioksidan tertinggi, 3-4 kali lebih tinggi dari asam askorbat (13.9 µM) dan lebih tinggi dari rutin (6.1 ì M) dan catechin (7.2 µM).

Penelitian ini juga mempelajari hubungan antara struktur kimia

dengan aktivitas antioksidan betalain.

Aktivitas antioksidan dari betalain

biasanya meningkat dengan meningkatnya jumlah gugus hidroksil/imino dan juga tergantung dari posisi gugus hidroksil dan glikosilasi dari aglikon dalam molekulnya (Cai et al. 2003). Aktivitas radical scavenging beberapa senyawa terhadap DPPH memberikan hasil sebagai berikut aktivitas asam kafeat > asam sinapat > asam ferulat > ester asam ferulat > asam p-kumarat (Kwon et al. 2003). Aktivitas antioksidan biasanya meningkat dengan adanya peningkatan jumlah gugus hidroksil dan menurun dengan adanya glikosilasi (Fukumoto dan Mazza 2000). Penelitian yang dilakukan dengan membandingkan tiga metode yaitu metode DPPH, static headspace gas chromatography (HS-GC) dan beta-carotene bleaching test (BCBT)

untuk menentukan aktivitas antioksidan menunjukkan

bahwa metode DPPH paling cocok digunakan uintuk menentukan aktivitas antioksidan karena dapat dilakukan dengan cepat, mudah dan tidak tergantung pada kepolaran sampel (Koleva et al. 2002). Flavonoid bukan hanya dapat dianggap sebagai antioksidan, karena pada kondisi reaksi tertentu dapat pula menunjukkan aktivitas prooksidan. Sifat yang tidak diinginkan ini dapat dijadikan penjelasan terhadap toksisitas dari beberapa flavonoid secara in-vivo (Kessler et al. 2003). Penelitian Kang et al. (2003) terhadap ekstrak heksan, etilasetat, n-butanol dan air dari 10 herbal yang biasa digunakan sebagai obat di Korea menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan ekstrak dengan pelarut yang bersifat lebih polar (n-butanol dan air) relatif lebih tinggi dari aktivitas antioksidan ekstrak dengan pelarut bersifat non-polar (heksan dan etil asetat). Penggunaan asam tanat sebagai standar untuk memenentukan total fenol menggunakan metode Folin-Ciocalteau berdasarkan reaksi reduksi asam fosfomolibdat oleh fenol dalam larutan alkali. Metode ini menentukan total gugus fenolik bebas dengan demikian juga menentukan total fenolik terlarut. Kelemahan metode ini adalah tidak dapat membedakan antara tanin dan fenolik

25

lain yang bukan tanin. Senyawa seperti asam askorbat, tirosin dan mungkin juga glukosa ikut terukur (Waterman dan Mole 1994). Keamanan Pangan Keamanan

pangan adalah suatu kebijakan yang menentukan keamanan

suatu bahan pangan untuk dapat dikonsumsi. Suatu bahan pangan diminimalkan resikonya yang dapat menyebabkan sesuatu yang mambahayakan bagi kesehatan, karena tidak ada bahan pangan yang 100% bebas dari kontaminan (Finley dan Robinson 1992). Untuk mengevaluasi resiko atau keamanan dari suatu bahan pangan atau bahan yang digunakan sebagai komposisi dalam bahan pangan yang baru, maka perlu dilakukan penentuan tipe bahaya potensial yang dapat ditimbulkan oleh bahan tersebut.

Sebagai contoh, untuk suatu bahan yang merupakan komposisi

dalam suatu bahan pangan harus ditentukan bahaya potensial baik yang bersifat kimiawi maupun biologis yang berhubungan dengan bahan tersebut. Bila ada bahaya yang dikandung suatu bahan, perlu ditentukan konsentrasi dimana bahan tersebut dapat bersifat toksik.

Hal lain yang perlu juga diperhatikan adalah

pengaruh bahan tersebut terhadap nilai nutrisi bahan pangan dan pengaruhnya terhadap penyerapan nutrien-nutrien lainnya (Finley dan Robinson 1992). Bahan pangan yang aman tidak dapat mengesampingkan adanya toksikan alami baik yang terkandung secara alami dalam bahan maupun yang diinduksi karena adanya bahan-bahan lainnya.

Makrokomponen di dalam suatu bahan

pangan terutama lemak dan protein serta komponen-komponen anti kanker dan penghambat kanker yang banyak terdapat dalam bahan pangan tampaknya berinteraksi dengan komponen-komponen bahan pangan lainnya yang dapat memodulasi resiko kanker. Komponen-komponen yang secara alami terkandung dalam bahan pangan pada konsentrasi tertentu mempunyai aktivitas anti kanker, tetapi pada konsentrasi yang lebih tinggi menjadi bersifat toksik dan seringkali batas antara konsentrasi yang menguntungkan dan yang toksik sangat kecil (Shank dan Carson 1992). Penentuan dosis merupakan suatu hal yang kritis untuk menguji senyawasenyawa yang bersifat immunomodulator. Dosis tinggi yang dapat menyebabkan

26

toksisitas atau menurunnya berat badan harus dicegah, sebaliknya dosis terlalu rendah yang menyebabkan stress dan malnutrisi sehingga memodulasi fungsi imun tertentu juga harus dicegah (Dean et al. 1989). Penelitian untuk mengetahui efek immunomodulator suatu komponen dapat dilakukan dengan menggunakan limfosit darah tepi manusia. Limfosit ini diisolasi kemudian diinkubasikan secara in vitro dalam kultur yang telah banyak digunakan untuk menguji fungsi immun.

Komponen yang akan diuji efek

immunomodulatornya kemudian ditambahkan ke dalam kultur ini (Dean et al. 1989).

Hasil penelitian Duthil et al. (2003) menunjukkan bahwa beberapa

polifenol dapat bersifat toksik dan mutagenik di dalam suatu sistem kultur sel tertentu. Limfosit dan Proliferasi Sel Limfosit Sistem yang berfungsi melindungi tubuh manusia dari unsur-unsur patogen disebut sistem imun. Sistem imun terdiri dari komponen genetik, molekuler dan seluler yang berinteraksi secara luas dalam merespon antigen endogenus dan eksogenus. Salah satu jenis sel yang berfungsi dalam merespon antigen adalah sel darah putih (Baratawidjaja 2000).

Leukosit atau sel darah putih merupakan salah

satu bagian dalam sistem imun yang ukurannya lebih besar dari eritrosit dan bebas bergerak (Roitt 1991). Menurut Baratawidjaja (2000) leukosit terdiri dari 75% sel granulosit dan 25% sel agranulosit yang terbentuk di dalam sumsum tulang. Granulosit terdiri dari sel limfosit dan monosit sedang agranulosit terdiri dari basofil, neutrofil dan eusinofil (Roitt 1991). Limfosit adalah kunci pengatur sistem imun dan merupakan 20% dari semua leukosit dalam sirkulasi darah orang dewasa. Sel limfosit dibentuk dalam kelenjar timus dan sumsum tulang, merupakan sel nongranulosit berukuran kecil, berbentuk bulat dengan diameter 7 – 15 µm. Sel limfosit selain dalam darah terdapat pula paada organ limfoid seperti limpa, kelenjar limfe dan

timus

(Baratawidjaja 2000). Sel limfosit terdiri atas sel T dan sel B. Sel T yang dibentuk di dalam sumsum tulang, tetapi berproliferasi dan berdiferensiasi di dalam kelenjar timus berperan dalam sistem imun spesifik seluler untuk pertahanan terhadap bakteri

27

yang hidup intraseluler, virus, jamur parasit dan kanker (Baratawidjaja 2000). Sel T merupakan 65-80% dari jumlah sel limfosit yang ada di dalam sirkulasi darah (Kresno 1991). Sel T terdiri dari tiga populasi utama yaitu sel Thelper (Th), sel Tsupressor (Ts) dan Tcytotoxic (Tc). Masing-masing populasi sel T mengekspresikan pertanda permukaan atau Cluster Determinant (CD) berupa molekul glikoprotein yang berbeda-beda. Subset Th ditandai oleh glikoprotein CD4, sel Tc oleh glikoprotein CD8, sedangkan semua subset sel T ditandai oleh molekul CD3. Sel Th membantu sel B dalam memproduksi antibodi, sel Ts menekan pembentukan antibodi dan sel Tc berfungsi menghancurkan sasaran (Roitt 1991). Sel T berproliferasi menjadi sel T memori dan berbagai sel efektor yang mensekresi berbagai limfokin. Limfokin ini dapat mengaktivasi sel B, sel Tc, sel NK (Natural Killer) dan sel lain yang terlibat dalam respon imun (Roitt 1991). Sel B yang berasal dari sel asal multipoten berperan dalam sistem imun spesifik humoral. Bila sel B dirangsang oleh benda asing, maka sel tesebut akan berproliferasi dan berkembang menjadi sel plasma yang dapat menghasilkan antibodi.

Antibodi inilah yang mempunyai fungsi utama

melawan infeksi

ektraseluler virus dan bakteri serta menetralisir toksinnya (Baratawidjaja 2000). Sel B merupakan 5-15% dari limfosit dalam sirkulasi darah (Kresno 1991). Proliferasi sel limfosit dapat distimulasi oleh bahan-bahan alamiah yang disebut mitogen. Glikoprotein (lectin) asal tanaman yaitu concanavalin A (Con A) dan phytohemaglutinin (PHA) merupakan mitogen poten untuk sel T dan berguna untuk identifikasi dan mempelajari fungsi sel tersebut. Lipopolisakarida (LPS) yang diperoleh dari dinding sel bakteri gram-negatif mempunyai efek mitogen terhadap sel B sedangkan pokeweed merupakan mitogen baik untuk sel B maupun sel T (Baratawidjaja 2000). Macam-macam mitogen yang biasa digunakan untuk menentukan fungsi limfosit manusia dapat dilihat pada Tabel 1. Sebanyak 50-60% limfosit T mampu memberikan respon terhadap stimulasi dengan mitogen misalnya Phytohemaglutinin (PHA) dan concanavalin A (Con A). Respon terhadap mitogen dianggap menyerupai respon terhadap antigen, sehingga uji

transformasi limfosit

dengan

rangsangan

mitogen

banyak

dipakai

28

untuk menguji fungsi limfosit. Stimulasi limfosit dengan antigen atau mitogen menimbulkan berbagai reaksi biokimia di dalam sel, diantaranya fosforilasi nukleoprotein, pembentukan DNA dan RNA serta peningkatan metabolisme Tabel 1. Mitogen-mitogen ”nonspecific” yang mengaktivasi sel limfosit manusia Mitogen

Singkatan

Phytohemaglutinin Concanavalin A

PHA

Sumber biologis Phaseolus vulgaris

Con A

Canavalia ensiformis

Antilympcyte globulin

ALG

Heterologous antisera

Staphylococcus protein A

SpA

S aureus

PWM

Phytolacca americana

Pokeweed mitogen Stites (1991)

Spesifisitas relatif sel T sel T (subset yang berbeda dengan PHA) sel T dan sel B sel B sel T-independent sel B sel T-independent

lemak dan lain-lain. Secara morfologik perubahan tersebut tampak menyerupai sel blast yaitu sel bersitoplasma biru dengan zone perinuklear yang terang, berinti besar dan beranak inti. Sel ini pada umumnya dapat dibedakan dengan limfosit yang tidak terangsang, namun kadang-kadang sulit membedakan sel yang terangsang dengan limfosit besar, sehingga penilaian morfologik kadang-kadang meragukan.

Puncak respon limfosit normal terjadi pada hari ketiga setelah

rangsangan. Limfosit B juga dapat memberi respon terhadap rangsangan mitogen, tetapi puncak respon limfosit B biasanya terjadi lebih lambat yaitu pada hari kelima atau keenam

(Kresno 1991).

Fungsi sel imun ditentukan oleh

keseimbangan oksidan-antioksidan terutama untuk memelihara integritas dan fungsi lipida

membran, protein selular dan asam-asam nukleat serta untuk

pengaturan signal transduksi dan ekspresi gen di dalam sel-sel imun (Wu dan Meydani 1998). Tejasari (2000) melakukan pengujian efek komponen oleoresin jahe terhadap respon proliferatif limfosit (sel B dan T). Pada kondisi tanpa stress oksidatif penambahan senyawa oleoresin dengan konsentrasi 50 µg/ml meningkatkan proliferasi sel B tertingi sebesar 456%, sedangkan penambahan senyawa gingerol dengan konsentrasi 150 µg/ml secara nyata meningkatkan proliferasi sel T sebesar 39%.

29

Pengaruh aktivitas ekstrak tanaman cincau hijau terhadap proliferasi sel limfosit manusia menunjukkan adanya proliferasi sel limfosit yang ditunjukkan oleh nilai indeks stimulasi.

Penambahan ekstrak air akar heksan daun kultur

dengan konsentrasi 0.13655 mg/ml memberikan nilai indeks stimulasi sebesar 1.03, sedangkan penambahan ekstrak heksan akar dengan konsentrasi 0.08683 mg/ml dan sebesar 0.34732 mg/ml memberikan indeks stimulasi berturut-turut sebesar 1.31 dan 1.06 (Pandoyo 2000). Immunomodulator Immunonodulator adalah senyawa-senyawa yang secara langsung merubah fungsi imun spesifik atau memberikan efek baik positif maupun negatif terhadap aktivitas sistem imun (Jaffe dan Sherwin 1991). Menurut Baratawidjaja (2000) Immunomodulator bekerja menurut 3 cara, yaitu melalui immunostimulasi dan immunosupresi.

immunorestorasi,

Immunorestorasi dan immunostimulasi

disebut immunopotensiasi atau up regulation, sedangkan immunosupresi disebut juga down regulation. Penggunaan immunomodulator yang memberikan efek positif (stimulasi) terhadap aktivitas sistem imun diantaranya adalah untuk mengobati defisiensi imun seperti pada pengobatan penderita AIDS, sedangkan yang memberikan efek negatif (menekan) terhadap fungsi imun yang normal atau berlebihan seperti pada pengobatan penyakit autoimun (Jaffe dan Sherwin 1991). Faktor-faktor

yang

mempengaruhi

suatu

komponen

bersifat

immunomodulator antara lain adalah dosis, cara dan waktu pemberian. Bentuk dan lokasi terjadinya mekanisme immunomodulasi juga berperan terhadap sifat immunomodulator suatu komponen (Tzianabos 2000). Pengujian ekstrak air dari Amaranthus sp. terhadap sel splenosit dari mencit BALB/c menunjukkan kemampuan ekstrak ini untuk menstimulasi proliferasi sel splenosit. Sel B yang diisolasi dapat distimulasi juga oleh ekstrak ini. Pemurnian ekstrak air dari Amaranthus sp menghasilkan protein (GF1) dengan berat molekul 313kDa. GF1 mempunyai aktivitas immunomodulator 309 kali ekstrak air yang belum dimurnikan.

Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak air

Amaranthus sp. mempunyai aktivitas immunomodulator dengan secara langsung

30

menstimulasi aktivitas proliferasi sel B dan proliferasi subset sel T secara in vitro (Lin et al. 2005).

Penelitian terhadap aktivitas immunomodulator dari suatu

polisakarida tertentu menunjukkan adanya pengaruh terhadap respon imun selama proses penyembuhan penyakit infeksi. Polimer-polimer ini dapat mempengaruhi imunitas spesifik dan non spesifik melalui interaksinya dengan sel T, monosit, makrofag dan limfosit polimorfonuklear (Tzianabos 2000). Penelitian mengenai aktivitas immunomodulator dari ekstrak akar Echinacea spp. menunjukkan bahwa ekstrak Echinacea spp. dapat menstimulasi proliferasi sel mononuklear darah tepi manusia, tetapi aktivitas immunomodulator ini dapat berubah bila sebelumnya Echinacea spp. ini disimpan pada 40C selama 4 hari. (Senchina et al. 2005). Kultur Sel Kultur sel adalah suatu teknik untuk memelihara atau mengembangbiakkan sel di luar tubuh (in vitro). Tujuan dari pemeliharaan sel atau jaringan ini adalah untuk mempelajari sifat-sifat sel di luar tubuh. Kultur sel mempunyai beberapa keuntungan antara lain dapat dikontrolnya lingkungan tempat hidup sel, seperti pH, tekanan osmosis, tekanan CO2 dan O2 yang menjadikan kondisi fiologis kultur relatif konstan. Selain itu kultur sel juga mempunyai kelemahan, seperti hilanganya spesifisitas sel, karena sel di luar tubuh bekerja sendiri-sendiri sedang di dalam tubuh (in vivo) bekerja secara terintegrasi di dalam satu jaringan (Freshney, 1995). Kondisi kultur harus disesuaikan dengan kondisi

di dalam tubuh untuk

menunjang pertumbuhan sel yang optimal. Kultur sebaiknya berada pada pH sekitar 7.4 dan tidak di bawah 7.0, karena pH di bawah 6.8 akan menghambat pertumbuhan sel. Sistem buffer dalam kultur biasanya menggunakan sistem CO2bikarbonat yang analog dengan sistem dalam darah. Sistem ini masih berada di bawah kondisi optimum fisiologis sehingga masih diperlukan tambahan CO2 5% pada bagian headspace kultur untuk menjaga stabilitas pH. Stabilitas pH juga dapat dijaga dengan menggunakan buffer yang bersifat zwitterion seperti buffer bikarbonat dan HEPES (N-2-hidroksimetil-piperazin-N-2-etan-sulphonic acid) (Freshney 1995).

31

Medium standar yang biasa digunakan untuk kultur sel adalah Dulbecco’s modified Eagle’s (DME) dan RPMI 1640. Medium ini diperkaya dengan 10% Fetal Bovine Serum (FBS). FBS digunakan karena mengandung molekul IgG dengan konsentrasi yang sangat rendah. Suplemen pertumbuhan lainnya tidak diperlukan kecuali bila jumlah sel yang tumbuh sangat rendah (kira-kira di bawah 103 sel/ml).

Antibiotik yang biasa ditambahkan ke dalam medium adalah

penisilin dan streptomisin. Penisilin efektif untuk membunuh bakteri gram positif sedang streptomisin efektif membunuh bakteri gram negatif (Harlow dan Lane 1988).

32

BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Pada penelitian ini, bahan-bahan yang digunakan adalah daun kumis kucing dari kebun di Kampus IPB Darmaga, bunga knop kebun Tanaman Obat Karyasari, Leuwiliang Bogor dan darah manusia dari responden terpilih. Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah K2SO4 (Kanto Chemical, Jepang), HgO (Merck, Jerman), H2SO4 pekat (Kanto Chemical, Jepang), batu didih, H3BO3 (Kanto Chemical, Jepang), metilen merah (Kanto Chemical, Jepang) metilen biru (Kanto Chemical, Jepang), NaOH-Na2S2O3, (Merck, Jerman), HCl (Merck, Jerman), dietil eter (Merck, Jerman), air bebas ion, buffer asetat (Merck, Jerman), akuades, air bebas pirogen, standar asam tanat (Merck, Jerman), Na2CO3 (Merck, Jerman), folin-ciocalteau 50% (Sigma, USA), etanol 95% (Merck, Jerman), metanol p.a. (Merck, Jerman), DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) (Sigma, USA), trolox® (Sigma, USA), tryphan blue (Wako, Jepang), larutan Ficoll-histopaque (Sigma, USA), phosphat buffer saline (PBS) (Sigma, USA), medium RPMI-1640 (Gibco, USA), NaHCO3 (Merck, Jerman),

fetal bovine serum (FBS) (Sigma, USA),

penicillin-streptomycin (Sigma, USA), concanavalin A (Sigma, USA), pokeweed (Sigma,USA), lipopolisakarida S. typhosa

(Sigma, USA), MTT (3(4,5-

dimethylthiazol-2-5-diphenyl-tetrazolium bromide)) (Sigma, USA) dan HClisopropanol (Merck, Jerman). Alat-alat yang digunakan adalah wadah seng, oven, timbangan, neraca analitik, hot plate, cawan alumunium, desikator, alat destilasi, labu kjeldahl, labu lemak, alat ekstraksi soxhlet, kondensor, cawan porselen, tanur, blender, vortek, pH-meter, alat-alat gelas, , saringan vakum, kertas saring Whatman no. 41, stopwatch, mortar, freeze drier, alumunium foil, sentrifuse, pipet mikro, tip, hemasitometer, mikroskop Zeiss Germany ID 03, spektrofotometer, vacutainer, filter 0.2 µm, pipet pasteur, micro plate, laminar flow, inkubator (5% CO2, RH 95%, suhu 37oC) dan microplate reader.

33

Metode Penelitian Pembuatan Bubuk Daun Kumis Kucing dan Bubuk Bunga Knop Metode Pengeringan Oven Daun kumis kucing segar dicuci bersih kemudian dikeringanginkan, sedangkan untuk bunga knop segar tidak perlu dicuci. Setelah itu dikeringkan dengan oven pada suhu 50oC sampai kadar airnya mencapai 7%. Produk yang telah dikeringkan kemudian diblender selama 2 menit untuk menghasilkan bubuk. Bubuk ini kemudian dianalisa proksimat. Metode Pengeringan Sinar Matahari Daun kumis kucing segar dicuci bersih kemudian dikeringanginkan, sedangkan untuk bunga knop segar tidak perlu dicuci. Setelah itu dikeringkan di bawah sinar matahari tetapi tidak secara langsung sampai kadar airnya mencapai 7%. Produk yang telah dikeringkan kemudian diblender selama 2 menit untuk menghasilkan bubuk. Bubuk ini kemudian di analisa proksimat. Pembuatan Ekstrak Air Daun Kumis Kucing dan Bunga Knop Segar dan Bubuk Daun kumis kucing segar dan bunga knop segar dihaluskan dengan mortar kemudian diekstraksi dengan akuades mendidih dengan perbandingan berturutturut sebesar (1.1835 g : 220 ml) dan (3.6720 g : 80 ml) dan didiamkan selama 5 menit. Hasil ekstraksi diaduk kemudian disaring menggunakan saringan vakum dengan kertas saring Whatman no. 41.

Dasar penggunaan perbandingan antara

daun kumis kucing segar dengan akuades dapat dilihat pada Lampiran 1 dan untuk bunga knop segar pada Lampiran 2.

Ekstrak air daun kumis kucing dan bunga

knop dianalisa total fenol dan aktivitas antioksidannya. Bubuk daun kumis kucing dan bubuk bunga knop diekstraksi dengan menggunakan akuades mendidih dengan perbandingan sebesar (1 g : 257 ml) dan (0.8667 g : 80 ml) dan didiamkan selama 5 menit. Pembuatan ekstrak air ini dilakukan dengan perbandingan yang sama, baik untuk bubuk hasil pengeringan oven maupun bubuk hasil pengeringan sinar matahari. Hasil ekstraksi diaduk kemudian disaring menggunakan saringan vakum dengan kertas saring Whatman no. 41.

Dasar penggunaan perbandingan antara bubuk daun kumis kucing

34

dengan akuades dapat dilihat pada Lampiran 1 dan untuk bubuk bunga knop pada Lampiran 2. Ekstrak air daun kumis kucing dan bunga knop dianalisa total fenol dan aktivitas antioksidannya. Analisa Total Fenol modifikasi metode Chandler dan Dodds (Shetty et al. 1995) Ekstrak air daun kumis kucing dan bunga knop baik segar maupun bubuk sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi 1 ml etanol 95%. Setelah itu 5 ml air bebas ion ditambahkan ke dalam 50%, divortek dan didiamkan selama 5 menit. Kemudian 1ml Na2CO3 5% ditambahkan ke dalam tabung reaksi tersebut, divortek dan disimpan delam ruang gelap selama 60 menit. Selanjutnya sampel divortek kembali dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 725 nm. Kurva standar dipersiapkan dengan menggunakan asam tanat standar yang dilarutkan dengan etanol 95%. Sebagian ektrak air sampel disimpan dalam ruang gelap pada suhu kamar untuk dianalisa lagi kandungan total fenol sampel setelah penyimpanan 24 jam. Analisa Aktivitas Antioksidan (Kubo et al. 2002) Buffer asetat 0.1M (pH 5.5) sebanyak 1 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 1.87 ml etanol p.a. dan 0.15 ml senyawa radikal bebas DPPH (1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 3mM dalam metanol. Campuran ini divortek. Sebanyak 0.03 ml ekstrak air daun kumis kucing dan bunga knop baik segar maupun bubuk dimasukkan ke dalam tabung reaksi tersebut kemudian di vortek dan disimpan dalam ruang gelap pada suhu kamar (25oC) selama 20 menit. Setelah 20 menit absorbansi yang dihasilkan dibaca pada 517 nm. Untuk blanko digunakan akuades sebagai pengganti sampel, sedangkan untuk kontrol DPPH diganti dengan metanol dan sampel diganti akuades.

Penurunan absorbansi

menunjukkan adanya aktivitas scavenging atau aktivitas antioksidan.

Untuk

pembuatan kurva standar digunakan Trolox®, dengan satuan TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity). Sebagian ekstrak air sampel disimpan dalam ruang gelap pada suhu kamar untuk dianalisa lagi aktivitas antioksidan sampel setelah penyimpanan 24 jam.

35

Analisa Proksimat (Apriyantono et al. 1989) Analisa kadar air yang dilakukan dengan metode oven adalah sebagai berikut. Cawan aluminium dikeringkan dalam oven selama 15 menit dan didinginkan dalam desikator selama 10 menit, kemudian ditimbang. Bubuk daun kumis kucing dan bubuk bunga knop ditimbang kurang lebih 5 gram dalam cawan. Selanjutnya cawan beserta isinya ditempatkan dalam oven selama 6 jam. Kemudian cawan dipindahkan ke desikator, lalu didinginkan.

Setelah dingin

ditimbang kembali dan proses pengeringan dalam oven diulang sampai diperoleh berat yang tetap. Perhitungan : Berat sampel (g)

= W1

Berat sampel setelah dikeringkan (g)

= W2

Kehilangan berat (g)

= W3

Kadar air (basis kering) (%)

= W3 x 100% W2

Kadar air (basis basah) (%)

= W3 x 100% W1

Pengukuran Kadar Protein dilakukan dengan cara menimbang sejumlah bubuk daun kumis kucing dan bubuk bunga knop dan dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl lalu ditambahkan 2 g K2SO4, 50 mg HgO, 2 ml H2SO4 pekat dan batu didih. Sampel didekstruksi selama 1-1.5 jam hingga jernih, lalu didinginkan. Secara perlahan ditambahkan 2ml air dan didinginkan kembali. Cairan hasil dekstruksi (cairan X) dipindahkan ke dalam alat destilasi dan labu dibilas dengan air. Erlenmeyer berisi 5 ml H3BO3 dan 2 tetes indikator (metilen merah : metilen biru = 2:1) diletakkan di ujung kondensor alat destilasi. Cairan X ditambah dengan 10 ml NaOH-Na2S2O3 dan didestilasi sampai larutan dalam erlenmeyer ± 5 ml.

Kemudian larutan dalam erlenmeyer dititrasi dengan HCl 0.02 N.

Perhitungan : Volume HCl untuk titrasi sampel (ml) = Vs Volume HCl untuk titrasi blanko (ml) = Vb Konsentrasi HCl (N) Berat sampel (mg)

=C =W

36

Kadar N (%) = (Vs-Vb)x N x 14.007 x 100% W Kadar protein (%) = % N x 6.25 Pengukuran Kadar Lemak dilakukan dengan cara sebagai berikut. Labu lemak yang telah bebas lemak dikeringkan di dalam oven. Setelah kering labu didinginkan kemudian ditimbang. Bubuk daun kumis kucing dan bubuk bunga knop dibungkus dalam kertas saring dan dimasukkan ke dalam alat ekstraksi soxhlet, kemudian kondensor dan labu lemak dipasang pada ujung-ujungnya. Pelarut dietil eter dimasukkan ke dalam alat lalu sampel direfluks selama 5 jam. Setelah itu pelarut didestilasi dan ditampung di dalam wadah lain. Lemak dan labu lemak dikeringkan di dalam oven pada suhu 105oC. Labu lemak kemudian dipindahkan ke desikator, lalu didinginkan. Setelah dingin labu lemak ditimbang kembali dan diulang proses pengeringan dalam oven sampai diperoleh berat yang tetap. Perhitungan : Berat sampel (g)

= W1

Berat lemak (g)

= W2

Kadar lemak (%)

= W2 x 100% W1

Pengukuran Kadar Abu dilakukan dengan cara sebagai berikut. Cawan porselin dibakar dalam tanur selama 15 menit kemudian didinginkan di dalam desikator. Setelah dingin cawan ditimbang. Bubuk daun kumis kucing dan bubuk bunga knop sebanyak 5 g ditimbang di dalam cawan lalu diabukan di dalam tanur sampai didapatkan abu berwarna abu-abu dan beratnya tetap.

Pengabuan

dilakukan dalam 2 tahap, yaitu : tahap pertama suhu 400oC lalu dilanjutkan pada suhu 550oC. Cawan kemudian didinginkan di dalam desikator lalu ditimbang. Perhitungan : Berat sampel (g)

= W1

Berat abu

= W2

(g)

Kadar abu (%)

= W2 x 100% W1

37

Analisa Proliferasi Limfosit Persiapan Larutan Ekstrak Daun Kumis Kucing dan Bunga Knop Serta Larutan Mitogen Persiapan ekstrak daun kumis kucing dan bunga knop dilakukan dengan cara terlebih dahulu membuat stock ekstrak Pembuatan stock ekstrak adalah dengan cara membuat ekstrak air bubuk hasil pengeringan terbaik yang dibuat sesuai dengan perbandingan pada Lampiran 1 untuk daun kumis kucing dan Lampiran 2 untuk bunga knop.

Hasil ekstraksi disaring menggunakan saringan vakum

dengan kertas saring Whatman no. 41. Setelah itu hasil ektraksi dikeringbekukan dengan freeze drier.

Tabung freeze drier ditimbang (X1), setelah itu hasil

ekstrak air dimasukkan ke dalam tabung dan dikeringbekukan menggunakan freeze drier selama 48 jam. Selama dikeringbekukan tabung freeze drier ditutup dengan alumunium foil untuk menghindari terjadinya oksidasi. Hasil freeze dry (X2) ditimbang untuk menentukan rendemen.

Rendemen didapatkan dari

perhitungan : Berat bubuk sampel awal (g)

= W1

Berat hasil freeze dry (g)

= X2 - X1 = W2

Rendemen sampel (basis basah) (%)

= W2 x 100% W1

Rendemen yang didapat merupakan dasar untuk menghitung konsentrasi ekstrak yang akan dimasukkan ke dalam kultur sel. Perhitungan selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 3 untuk daun kumis kucing dan Lampiran 4 untuk bunga knop. Rendemen ini adalah stock ekstrak yang digunakan untuk membuat larutan stock ekstrak daun kumis kucing dan bunga knop Pembuatan Larutan Stock Ekstrak (Daun Kumis Kucing dan Bunga Knop) dan Larutan Stock Mitogen (LPS, ConA dan pokeweed) dilakukan dengan cara : 1. Pembuatan larutan stock ekstrak (daun kumis kucing dan bunga knop) Sebanyak 0.2 g hasil freeze dry dilarutkan dengan sedikit medium RPMI-1640 takar

(medium pencuci), kemudian

dimasukkan ke dalam

labu

5 ml. Medium RPMI-1640 (medium pencuci) ditambahkan sampai

tanda tera, sehingga didapatkan larutan stock dengan konsentrasi 40 mg/ml.

38

2. Pembuatan larutan stock LPS dan Con A Sebanyak 1 mg bubuk mitogen dilarutkan dengan sedikit medium RPMI1640, kemudian dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml. Medium RPMI-1640 ditambahkan sampai tanda tera, sehingga didapatkan larutan stock dengan konsentrasi 200 µg/ml. 3. Pembuatan larutan stock Pokeweed Sebanyak 0.005 g bubuk pokeweed dimasukkan ke dalam tabung eppendorf dan eppendorf 1 ml,

dilarutkan dengan medium RPMI-1640 sampai volume sehingga didapatkan larutan stock dengan konsentrasi

5000 µg/ml. Larutan-larutan stock ini kemudian diencerkan sesuai dengan konsentrasi larutan ekstrak (daun kumis kucing dan bunga knop) serta larutan mitogen yang diinginkan. Pembuatan larutan ekstrak (daun kumis kucing dan bunga knop) yang akan diuji serta larutan mitogen (LPS, Con A dan Pokeweed) dari larutan Stock dilakukan dengan cara mengencerkan larutan stock dengan medium RPMI-1640 sesuai dengan konsentrasi ekstrak yang diujikan dan konsentrasi larutan mitogen yang diinginkan. Misal untuk membuat 5 ml (V2) ekstrak kumis kucing dengan konsentrasi 0.6015 mg/ml (M2), maka larutan stock dengan konsentrasi 40 mg/ml (M1) yang harus diambil (V1) adalah : V1 x M1 = V2 x M2 V1 x 40 mg/ml = 5 ml x 0.6015 mg/ml V1 = 0.075 ml = 75 µl Jadi sebanyak 75 µl larutan stock diambil dan dimasukkan ke dalam labu takar 5 ml dan ditambah dengan medium RPMI-1640 sampai tanda tera. Persiapan Medium Kultur Sel Limfosit (Koesitoresmi 2002), Isolasi Limfosit (Nurrahman 1999) dan Penghitungan Sel Medium yang digunakan untuk kultur dan pemeliharaan sel limfosit adalah 16.2 g RPMI-1640 bubuk yang telah mengandung L-glutamin dan 0.25 mM HEPES. Bubuk ini dilarutkan dengan air bebas pirogen sehingga diperoleh 1 liter larutan medium RPMI-1640. Kemudian ditambahkan 2 g NaHCO3 dan 1%

39

penicillin-streptomycin. Medium yang telah diperkaya ini kemudian disterilisasi kering dengan membran filter 0.2 µm dan digunakan sebagai medium pencuci. Untuk medium kultur sel limfosit digunakan medium RPMI-1640 di atas dengan penambahan fetal bovine serum (FBS) 10% steril. Pembuatan medium dan tahaptahap selanjutnya dalam isolasi limfosit dilakukan di dalam laminar flow yang steril dengan sistem pengaliran udara laminar. Sebelum digunakan, laminar flow ini disinari dahulu dengan sinar UV selama 15 menit.

Gambar 3 Pengambilan darah secara aseptis Darah seorang wanita sehat berusia 22 tahun diambil secara aseptis sebanyak 50 ml dengan menggunakan needle dan vacutainer yang telah mengandung heparin. Darah dari dalam vacutainer dipindahkan ke dalam tabung sentrifuse steril, kemudian di sentrifuse dengan kecepatan 1500 rpm selama 10 menit. Bagian tengah (lapisan buffycoat) yang berisi sel-sel limfosit diambil perlahan-lahan dengan pipet pasteur steril kemudian ditambah dengan 5 ml medium RPMI-1640. Larutan Ficoll-histopaque dimasukkan ke dalam tabung sentrifuse, kemudian dimasukkan perlahan-lahan campuran lapisan buffycoat dan medium RPMI di atasnya dengan perbandingan 1: 1. Selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 2500 rpm selama 30 menit. Hasil sentrifuse didapatkan lapisan putih seperti cincin antara larutan ficoll-histopaque dan RPMI-1640. Lapisan putih tersebut diambil dengan pipet pasteur ke dalam tabung sentrifuse dan ditambah dengan 5 ml RPMI-1640 (medium pencuci), kemudian

40

disentrifuse dengan kecepatan 2000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil dan ditambahkan RPMI-1640 (medium pencuci), disentrifuse pada 2000 rpm selama 10 menit. Pencucian limfosit ini dilakukan 2 kali sehingga diperoleh kemurnian suspensi sel limfosit yang tinggi. Sebelum

dilakukan

kultur

sel

limfosit,

terlebih

dahulu

dilakukan

penghitungan sel limfosit dengan menggunakan pewarna tryphan blue. Sejumlah sel ditempatkan ke dalam sumur microplate dan ditambah dengan tryphan blue. Penghitungan

sel limfosit dilakukan dengan menggunakan hemasitometer di

bawah mikroskop cahaya Zeiss Germany ID 03 dengan perbesaran 10 kali. Untuk dapat dikultur, jumlah sel limfosit yang dapat dihitung harus lebih besar dari 95% berupa sel limfosit hidup yang berwarna terang. Limfosit yang diperoleh akan digunakan untuk pengujian proliferasi sel B dan sel T. Penghitungan sel limfosit dengan hemasitometer dapat dilakukan dengan menggunakan rumus sebagai berikut : N = A x FP x 104 sel/ml Keterangan :

N

= jumlah sel limfosit/ ml

A

= jumlah sel hidup rata-rata per bidang pandang

FP = faktor pengenceran 104 = jumlah sel per luas bidang pandang (1.0 mm x 1.0 mm x 0.1 mm) Kultur Limfosit Jumlah sel limfosit dari responden ditepatkan menjadi 2 x 106 sel/ml dengan medium RPMI-1640.

Untuk microplate 96 sumur, agar volume total masing-

masing sumur menjadi 100 µl, maka bahan-bahan yang dipersiapkan untuk ditanam ke dalam kultur dapat dilihat pada pada Tabel 2.

Setiap perlakuan

dilakukan tiga kali ulangan. Penentuan konsentrasi mitogen dapat dilihat pada Lampiran 5.

Kultur diinkubasi selama 72 jam dalam inkubator bersuhu 37oC

dengan atmosfer yang mengandung 5% CO2 dan RH 95%.

41

Pengujian proliferasi sel limfosit dilakukan dengan menggunakan metode MTT.

Enam jam sebelum masa inkubasi berakhir, ke dalam masing-masing

sumur ditambahkan 10 ì l pewarna MT T 0.5% dan diinkubasi kembali pada Tabel 2. Bahan-bahan yang ditanam ke dalam kultur sel

Perlakuan Kontrol limfosit Kontrol mitogen* Kontrol ekstrak** Ekstrak**+ mitogen*

RPMI (µl)

Suspensi limfosit dalam RPMI (µl)

Mitogen* (µl)

Ekstrak (µl)

FBS (µl)

20

70

-

-

10

-

70

20

-

10

-

70

-

20

10

-

70

10

10

10

*Mitogen : Lipopolisakarida (LPS), concanavalin A (conA) dan pokeweed (PK) ** Ekstrak : Ekstrak daun kumis kucing dan bunga knop dengan konsentrasi Sesuai dengan Lampiran 3 untuk daun kumis kucing dan Lampiran 4 untuk bunga knop kondisi yang sama selama 6 jam. Pada akhir masa inkubasi, ditambahkan 80 ì l HCl-isopropanol 0.04 N, setelah itu dilakukan pembacaan sel dengan alat microplate reader pada panjang gelombang 570 nm. -

Nilai indeks stimulasi (IS) untuk semua perlakuan penambahan ekstrak daun kumis kucing, bunga knop maupun mitogen : IS = OD perlakuan OD kontrol Pengujian ekstrak kumis kucing dan bunga knop dalam kultur sel limfosit

ini menggunakan Rancangan Acak Kelompok (RAK). Hasil pengujian dianalisis dengan Analisis Sidik Ragam Satu Arah (ANOVA) dengan menggunakan program SPSS versi 12.

42

HASIL DAN PEMBAHASAN Daun Kumis Kucing Metode Pengeringan Daun kumis kucing setelah dikeringkan dengan dua macam metode pengeringan, maka didapatkan hasil yang terbaik.

Hasil terbaik ini dinilai

berdasarkan analisa total fenol dan analisa aktivitas antioksidan bubuk hasil pengeringan kedua metode. Bunga knop bila dilihat dari warna bubuk dan warna ekstrak airnya, kumis kucing,

Bila dilihat dari warna bubuk dan warna ekstrak air daun

hasil metode pengeringan dengan sinar matahari memberikan

warna yang lebih baik dibandingkan hasil metode pengeringan dengan oven. Bubuk terlihat masih berwarna hijau, sedangkan warna ekstrak airnya coklat pekat. Pada metode pengeringan dengan sinar matahari, sebelum dikeringkan di bawah sinar matahari daun terlebih dahulu dikeringanginkan untuk memberi kesempatan daun menutup stomatanya. Menurut Mahendra dan Fauzi (2005) menutupnya stomata pada daun merupakan suatu sistem yang alami pada tumbuhan untuk mencegah penguapan zat-zat yang terkandung dalam daun. Selain itu, pada metode pengeringan dengan sinar matahari daun tidak langsung terkena matahari, sehingga lebih sedikit panas yang menyebabkan terdegradasinya klorofil.

Warna hijau ini menunjukkan

bahwa dengan pengeringan matahari sampai kadar air 7% zat-zat hijau daun yang terkandung dalam daun kumis kucing masih banyak (Jayaraman dan Das Gupta 1995). Senyawa fenol yang terkandung di dalam daun kumis kucing adalah orthosiphon glikosida, tanin, saponin, sapofonin, myoinositol dan sinensetin (Mahendra dan Fauzi 2005; Dalimartha 2000), polifenol yaitu polymethoxylated flavonoid dan turunan caffeic acid. (Olah et al. 2003). Identifikasi lebih lanjut menunjukkan adanya kandungan caffeic acid, cichoric acid, rosmarinic acid, sinensetin dan eupatorine. Selain itu menurut Loon et al. (2005) kumis kucing juga mengandung tiga jenis flavonoid yaitu sinensetin, eupatorin dan 3’ -hydroxy5,6,7,4’ tetramethoxyflavone. Warna ekstrak air bubuk daun kumis kucing yang berwarna coklat pekat kemungkinan karena adanya proses oksidasi selama

43

Sinar matahari

Oven

Gambar 4 Bubuk daun kumis kucing

Sinar matahari (1 g bubuk : 257 ml air)

Oven (1 g bubuk : 257 ml air)

Gambar 5 Ekstrak air bubuk daun kumis kucing

44

pengeringan, seperti halnya pada teh hitam menurut Rijken et al (2002) perubahan oksidatif yang terjadi selama produksi teh hitam menyebabkan perubahan catechin monomerik yang tidak berwarna menjadi flavonoid oligomerik yang berwarna oranye kekuningan dan merah kecoklatan.

Pada pengeringan dengan

sinar matahari kemungkinan terjadi proses oksidasi yang lebih lama sehingga memberi warna ekstrak yang berwarna merah kecoklatan.

Hasil yang didapat

pada metode pengeringan dengan oven terlihat warna bubuk kecoklatan dan warna ekstrak airnya coklat terang. Warna bubuk yang kecoklatan kemungkinan karena terdegradasinya klorofil karena pengeringan dengan oven. Warna ekstrak air daun kumis kucing yang dihasilkan dengan pengeringan dengan oven warnanya coklat terang. Hal ini kemungkinan karena dengan pengeringan oven selain suhunya yang relatif stabil juga tinggi yaitu 50oC, sehingga daun kumis kucing lebih cepat mencapai kadar air 7%, sehingga proses oksidasi senyawasenyawa fenol yang terjadi lebih sedikit dibanding dengan daun yang dikeringkan dengan sinar matahari. Total Fenol dan Aktivitas Antioksidan Analisa total fenol dilakukan untuk mengukur kandungan fenol dalam ekstrak air daun kumis kucing. Penggunaan asam tanat sebagai standar untuk menentukan total fenol menggunakan metode Folin-Ciocalteau berdasarkan reaksi reduksi asam fosfomolibdat

oleh fenol dalam larutan alkali.

Metode ini

menentukan total gugus fenolik bebas dengan demikian juga menentukan total fenolik terlarut (Waterman dan Mole 1994). Berdasarkan analisa kadar total fenol dan analisa aktivitas antioksidan dalam ekstrak air bubuk daun kumis kucing, terbukti bahwa kadar rataan total fenol dan aktivitas

antioksidan ekstrak air bubuk daun kumis kucing yang

dikeringkan dengan sinar matahari lebih tinggi yaitu 123.434 + 12.159 mg fenolik/g berat kering sampel dan TEAC sebesar 1354.756 + 1.515 mM/g berat kering sampel bila dibandingkan dengan yang dikeringkan dengan oven 16.918 + 0.123 mg fenolik/g berat kering sampel dan TEAC sebesar 470.441 + 61.699 mM/g berat kering sampel (Tabel 3 dan 4).

45

Bila dibandingkan dengan kadar rataan total fenol ekstrak air daun kumis kucing segar pada saat perlakuan 0 jam dan 24 (48.566 + 11.481 dan 42.514 + 12.901 mg fenolik/g berat kering sampel), maka kadar rataan total fenol pada ekstrak air bubuk daun kumis kucing yang dikeringkan dengan sinar matahari terlihat lebih tinggi yaitu 123.434 + 12.159 dan 87.624 + 6.785 mg fenolik/g berat kering sampel (secara statistik bermakna p 0.001 dan p 0.018), sedangkan ekstrak air bubuk hasil pengeringan oven terlihat lebih rendah yaitu sebesar 16.918 + 0.174 dan 14.086 + 0.250 mg fenolik/g berat kering sampel (tidak bermakna secara statistik p 0.085 dan p 0.125). Hal ini kemungkinan menurut Sokhansanj dan Jayas (1995), terjadi karena pengeringan dapat meningkatkan kualitas suatu produk pangan dan pakan di antaranya adalah perubahan metabolik yang meningkat.

Pengeringan dengan sinar matahari dapat meningkatkan kualitas

ekstrak air daun kumis kucing. Kadar total fenol yang tinggi pada ekstrak air bubuk daun kumis kucing yang dikeringkan dengan sinar matahari menunjukkan kandungan fenol yang tinggi. Senyawa fenolik adalah senyawa antioksidan. Kandungan senyawa ini di dalam daun kumis kucing tinggi, dengan demikian kandungan antioksidan di dalam daun kumis kucingpun tinggi. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak air bubuk kumis kucing merupakan sumber potensial antioksidan alami. ` Tabel 3. Perbandingan total fenol pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak air daun kumis kucing segar

Perlakuan KKS1 KKS2 KKM1 KKM2 KKO1 KKO2

Total fenol

Mean

p

SD

0 jam

24 jam

0 jam

24 Jam

0 jam

24 jam

0 jam

24 jam

56.685 40.448 132.031 114.836 17.041 16.796

51.636 33.391 92.422 82.826 14.262 13.909

48.566

42.514

11.481

12.901

123.434

87.624

12.159

6.785

0.001*

0.018*

16.918

14.086

0.123

0.250

0.085

0.125

Penelitian lainnya terhadap aktivitas antioksidan beberpa jenis buah-buahan dan sayuran memberikan hasil sebagai berikut. Buah berry TEAC 3700, sayursayuran TEAC 450-1400 serta buah-buahan TEAC 600-1700 (Miller et al. 2000).

46

Bila dibandingkan dengan nilai TEAC terutama untuk sayuran, maka nilai TEAC ekstrak air bubuk daun kumis kucing cukup tinggi, terutama yang pengeringannya dilakukan dengan sinar matahari (1354 .756 + 1.515).

*p 0.01

130.000 120.000

Lama Penyimpanan 0 Jam 24 Jam

110.000

Total Fenol (mg fenolik/g berat kering sampel)

100.000

*p 0.018

90.000 80.000 70.000

KKS : Kumis Kucing segar KKM : Pengeringan dengan sinar matahari KKO : Pengeringan dengan oven

60.000 50.000 40.000 30.000 20.000 10.000 0.00

KKS

KKM

KKO

Gambar 6 Perbandingan total fenol ekstrak air masing-masing Perlakuan pada daun kumis kucing. Penyimpanan ekstrak air daun kumis kucing selama 24 jam mempengaruhi kadar total fenol. Setelah 24 jam, kadar rataan total fenol ekstrak air daun segar mengalami penurunan dari 48.566 + 11.481 mg fenolik/g berat kering sampel menjadi 42.514 + 12.9 mg fenolik/g berat kering sampel. Kadar

rataan

total

fenol untuk ekstrak air bubuk kumis kucing hasil pengeringan matahari mengalami penurunan yaitu dari 123.434 + 12.159 mg fenolik/g berat kering sampel menjadi 87.624 + 6.785 mg fenolik/g berat kering sampel, sedangkan ekstrak air bubuk kumis kucing hasil pengeringan oven juga mengalami penurunan kadar rataan total fenol yaitu dari 16.918 + 0.174 mg fenolik/g berat kering sampel menjadi 14.086 + 0.250 mg fenolik/g berat kering sampel, seperti terlihat pada Tabel 3 dan Gambar 6. Penurunan ini disebabkan oleh adanya reaksi oksidasi selama penyimpanan dan kemungkinan juga terjadi perubahan pH

47

ekstrak air. Hal ini sesuai dengan pendapat Jayaraman dan Das Gupta (1995) yang menyatakan bahwa degradasi klorofil tergantung pada pH, waktu, kerja enzim, oksigen dan cahaya. Tabel 4. Perbandingan aktivitas antioksidan pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak air daun kumis kucing segar

Perlakuan KKS1 KKS2 KKM1 KKM2 KKO1 KKO2

mM trolox

Mean

p

SD

0 Jam

24 jam

0 jam

24 Jam

0 jam

24 jam

2474.837 1922.311 1353.685 1355.827 514.069 426.813

2491.622 2188.022 1348 1344 429.715 375.275

2198.574

2339.822

390.695

214.678

1354.756

1346

1.515

470.441

402.495

61.699

2500.000

0 jam

24 jam

2.828

0.027*

0.012*

38.495

0.001*

0.000*

Lama Penyimpanan

2400.000

0 Jam

2300.000

24 Jam

2200.000 2000.000 1900.000

KKS : Kumis Kucing segar KKM : Pengeringan dengan sinar matahari KKO : Pengeringan dengan oven

1800.000 1700.000

*p 0.027 *p 0.012

1600.000 1500.000 1400.000 1300.000 1200.000 1100.000 1000.000 900.000

*p 0.001

800.000

*p 0.000

mM/g berat kering sampel (TEAC)

2100.000

700.000 600.000 500.000 400.000 300.000

KKS

KKM

KKO

Gambar 7 Perbandingan analisa aktivitas antioksidan masingmasing perlakuan pada daun kumis kucing.

48

Pada Tabel 4 dan Gambar 7 terlihat kadar rataan aktivitas antioksidan pada perlakuan 0 dan 24 jam dalam ekstrak air daun kumis kucing segar yaitu TEAC sebesar 2198.574 + 390.695 dan 2339.822 + 214.678 mM/g berat kering sampel lebih tinggi dari pada kadar rataan aktivitas antioksidan dalam ekstrak air bubuk hasil pengeringan sinar matahari (1354.756 + 1.515 dan 1346 + 2.828 mM/g berat kering sampel) maupun ekstrak air bubuk hasil pengeringan oven (470.441 + 61.699 dan 402.495 + 38.495 mM/g berat kering sampel), dengan uji statistik perbedaan rataan aktivitas antioksidan yang diperlihatkan oleh ekstrak air daun kumis kucing segar dengan rataan aktivitas antioksidan ekstrak air bubuk hasil pengeringan sinar matahari maupun seduhan bubuk hasil pengeringan oven menunjukkan hasil yang bermakna (p < 0.05).

Hal ini

kemungkinan karena fenol yang terkandung dalam daun segar walaupun lebih sedikit tetapi mempunyai sifat antioksidan yang lebih baik dibandingkan dengan kandungan fenol yang terdapat dalam bubuk hasil kedua metode pengeringan. Penyimpanan ekstrak air daun kumis kucing selama 24 jam mempengaruhi aktivitas antioksidan. Setelah 24 jam, aktivitas rataan antioksidan ekstrak air bubuk kumis kucing hasil pengeringan matahari mengalami penurunan yaitu dari TEAC

sebesar 1354.756 + 1.515 mM/g berat kering sampel menjadi TEAC

sebesar 1346 + 2.828 mM/g berat kering sampel, sedangkan ekstrak air bubuk kumis kucing hasil pengeringan oven juga mengalami penurunan aktivitas rataan antioksidan yaitu dari TEAC sebesar 470.441+ 61.699 mM/g berat kering sampel menjadi TEAC sebesar 402.495 + 38.495 mM/g berat kering sampel. Penurunan ini disebabkan adanya degradasi klorofil, reaksi oksidasi selama penyimpanan dan kemungkinan juga terjadi perubahan pH seduhan. Hal ini sesuai dengan pendapat Jayaraman dan Das Gupta (1995) yang menyatakan bahwa degradasi klorofil tergantung pada pH, waktu, kerja enzim, oksigen dan cahaya. antioksidan ekstrak air

Aktivitas rataan

daun segar setelah penyimpanan selama 24 jam

mengalami kenaikan dari TEAC sebesar 2198.574 + 390.695 mM/g berat kering sampel menjadi TEAC sebesar 2339.822 + 214.678 mM/g berat kering sampel. Hal ini seseuai dengan penelitian Kwon et al. (2003) yang menunjukkan bahwa ekstrak batang dan akar Hibiscus syriacus yang dipanaskan pada 100oC

49

selama 24 jam lebih efektif mereduksi senyawa radikal bebas DPPH dibandingkan yang tidak diberi perlakuan pemanasan, dengan demikian menunjukkan aktivitas antioksidan yang lebih baik. Analisa Proksimat Bubuk Daun Kumis Kucing Hasil Pengeringan Dengan Sinar Matahari Hasil analisa proksimat bubuk daun kumis kucing hasil pengeringan dengan sinar matahari dapat dilihat pada Tabel 5. Hal ini dilakukan karena kadar air daun kumis kucing segar cukup tinggi yaitu sebesar 81.42%, sehingga agar dapat disimpan dalam jangka waktu yang relatif lama diperlukan pengurangan kadar air sampai 7%. Penentuan ini berdasarkan SNI produksi teh dalam kemasan yang kadar airnya maksimum 8% (SNI 01-3836-2000). Tabel 5. Hasil analisa proksimat bubuk daun kumis kucing hasil pengeringan dengan sinar matahari Analisa

Hasil (%)

Kadar air

7.00

Kadar abu

7.89

Kadar lemak

5.09

Kadar protein

17.41

Pengujian Ekstrak Daun Kumis Kucing Terhadap Proliferasi Sel Limfosit Dengan Metode MTT Pengujian ekstrak daun kumis kucing

terhadap proliferasi sel limfosit

memberikan hasil seperti terlihat pada Gambar 8. Pengujian proliferasi sel ini dilakukan dengan metode pewarnaan MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5diphenyl-tetrazolium), dimana MTT dirubah oleh aktivitas enzim suksinat dehidrogenase mitokondrial dalam sel hidup menjadi formazan, yang kemudian diukur absorbansinya dengan Spectrophotometer Microplate Reader. Kandungan suksinat dehidrogenase ini relatif konstan di antara berbagai sel dengan tipe spesifik, sehingga menurut Wilson (1995) jumlah formazan yang terbentuk proporsional terhadap jumlah sel hidup. Pemberian ekstrak daun kumis kucing

50

dengan konsentrasi 1.203 mg/ml meningkatkan proliferasi sel limfosit 1.518 + 0.124. Untuk kumis kucing, semakin tinggi konsentrasi ekstrak (sampai 4.812 mg/ml) yang ditambahkan, semakin meningkat pula proliferasi sel limfosit berturut-turut sebesar 1.819 + 0.031 (2.406 mg/ml) dan 2.389 + 0.148 (4.812 mg/ml).

Pemberian mitogen saja menunjukkan IS yang lebih kecil dari pada

penambahan ekstrak saja maupun dibandingkan dengan perlakuan kombinasi antara penambahan ekstrak dengan mitogen. Hal ini kemungkinan karena pada waktu dilakukan pengambilan darah responden, keadaan sistem imun dalam tubuh responden sedang menurun. Tabel 6. Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah ekstrak daun kumis kucing dengan mitogen (Con A, LPS dan PK ) dengan yang ditambah ekstrak daun kumis kucing saja pada konsentrasi C2 (1.203 mg/ml), C4 (2.406 mg/ml), C8 (4.812 mg/ml) Perlakuan C2 C2+ConA C2+LPS C2+PK C4 C4+ConA C4+LPS C4+PK C8 C8+ConA C8+LPS C8+PK

Indeks stimulasi 1

2

3

1.540 1.438 1.789 1.340 1.853 1.811 2.242 1.977 2.457 2.702 2.174 2.574

1.385 1.675 1.770 1.328 1.792 1.955 1.872 1.977 2.491 2.523 1.808 2.377

1.630 1.396 1.796 1.585 1.811 1.815 1.596 2.075 2.219 2.253 2.913 2.853

Mean

SD

1.518 1.503 1.785 1.418 1.819 1.860 1.903 2.001 2.389 2.493 2.298 2.601

0.124 0.150 0.013 0.145 0.031 0.082 0.324 0.057 0.148 0.226 0.563 0.239

Mean Diff

p

0.015 0.267 0.101

1 0.944 1

0.042 0.085 0.191

1 1 0.995

0.104 0.091 0.212

1 1 0.989

Bila dibandingkan dengan penelitian-penelitian sebelumnya, nilai % IS sel limfosit ekstrak air kayu secang (Caesalpina sappan Linn) sebesar sampai 150% (Puspaningrum 2003). Nilai % IS sel limfosit mencit sampel teh daun cincau (Cyclea) sebesar 141% dan bubuk gel cincau (Cyclea) sebesar 122% (Setiawati 2003). Nilai % IS filtrat bebas sel yang dipanaskan selama 20 menit 60oC dan diinkubasikan pada substrat kitosan DD 85% selama 1 jam sebesar 288.06% (Wahyuni et al 2004; Wahyuni et al 2005) dan nilai IS kitinase 0.1 IU/mg kitin yang direaksikan selama 3 jam untuk pembuatan oligomer kitosan dengan konsentrasi 85 ì g/ml sampel sebesar 1.35 (Agustine 2005), makanilai I S tertinggi

51

2.389 (238.9%) untuk penambahan ekstrak daun kumis kucing dengan konsentrasi 4.812 mg/ml menunjukkan bahwa ektrak daun kumis kucing tidak bersifat toksik, bahkan mampu menstimulasi proliferasi sel limfosit. Dengan demikian peningkatan konsentrasi ekstrak daun kumis kucing dapat menstimulasi proliferasi sel limfosit, dengan kata lain mempunyai fungsi sebagai immunomodulator. Mekanisme

yang

mungkin

terjadi

adalah

karena

adanya

efek

immunomodulator dari antioksidan yang cukup besar yang terkandung dalam ekstrak daun kumis kucing terutama dari senyawa-senyawa fenol yang dikandungnya.

Menurut Wu dan Meydani (1998) antioksidan dapat

mempengaruhi produksi molekul-molekul seperti IL-2 yang berpengaruh terhadap pertumbuhan sel limfosit dan sangat penting untuk mengaktivasi sel limfosit. Senyawa-senyawa fenol spesifik yang terkandung di dalam ekstrak daun kumis kucing yang dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit belum diketahui. Pada Gambar 8 dapat dilihat

Indeks Stimulasi (IS) untuk perlakuan

kombinasi antara penambahan ekstrak daun kumis kucing dan

mitogen

lipopolisakarida (LPS), concanavalin A (con A) dan pokeweed (PK) dibandingkan dengan penambahan ekstrak saja. Ekstrak daun kumis kucing yang ditambah dengan mitogen rata-rata meningkatkan proliferasi sel limfosit baik limfosit B maupun limfosit T walaupun tidak bermakna peningkatannya (p>0.05). Peningkatan

IS ini menurut Paraskevas and Foerster (1999) karena mitogen

merupakan substansi yang dapat menginduksi proliferasi sel limfosit. Pada perlakuan penambahan ekstrak daun kumis kucing konsentrasi 1.203 mg/ml ditambah con A (1.503 + 0.150) dan pokeweed (1.418 + 0.145) memang terlihat rataan IS lebih kecil dari pada rataan IS untuk penambahan ekstrak daun kumis kucing saja dengan konsentrasi yang sama (1.518 + 0.124), tetapi tampaknya juga tidak nyata perbedaannya (Tabel 6). Hal ini kemungkinan terjadi karena kondisi sistem imun dalam tubuh responden yang sedang kurang baik, sehingga mempengaruhi pula terhadap proliferasi limfositnya, selain itu setiap mitogenpun mempunyai pengaruh yang berbeda terhadap proliferasi sel limfosit. Menurut Paraskevas dan Foerster (1999) aktivasi oleh mitogen memerlukan reseptor yang cocok, yang merupakan tahap awal dari aktivasi limfosit. Untuk

52

3.000 2.800 2.600 2.400

2.000 1.800 1.600 1.400 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200

Ekstrak + PK

PK

Ekstrak + LPS

LPS

Ekstrak + Con A

Con A

0.00

Ekstrak

Indeks Stimulasi

2.200

Gambar 8 Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah ekstrak daun kumis kucing saja dengan yang ditambah mitogen (con A, LPS dan PK ) saja dan dengan ekstrak daun kumis kucing ditambah mitogen Konsentrasi ekstrak Kumis Kucing 1.203 mg/ml 2.406 mg/ml 4.812 mg/ml

konsentrasi ekstrak daun kumis kucing 4.812 mg/ml ditambah LPS nilai rataan IS 2.298 + 0.563 yang lebih kecil dibanding rataan IS penambahan ekstrak daun kumis kucing saja (2.389 + 0.418), tetapi tidak bermakna perbedaannya (p>0.05) (Tabel 6). Hal ini kemungkinan karena pada konsentrasi ini ekstrak daun kumis kucing bila ditambah dengan LPS dapat menyebabkan reaksi yang menurunkan proliferasi sel limfosit seperti penurunan kepekaan reseptor membran sel terhadap mitogen atau tidak meningkatkan aktivitas/reaksi biokimiawi dalam proses

53

proliferasi, misalnya aktivitas enzim protein kinase C yang berperan dalam transduksi sinyal faktor pertumbuhan. Pada masing-masing perlakuan dengan penambahan mitogen baik lipopolisakarida (LPS), concanavalin A (Con A) maupun pokeweed (PK) bila dilakukan penambahan ekstrak kumis kucing, peningkatan konsentrasi dari 1.203 mg/ml ke 2.406 mg/ml sampai 4.812 mg/ml meningkatkan pula rataan IS (Tabel 6 dan Gambar 8). Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak daun kumis kucing dan mitogen bersifat sinergis untuk meningkatkan proliferasi sel limfosit. Jika dilihat dari penambahan mitogen yang berbeda terhadap konsentrasi ekstrak kumis kucing yang sama, pada konsentrasi ekstrak 1.203 mg/ml penambahan LPS memiliki rataan IS tertinggi (1.785 + 0.013)

Pada konsentrasi

2.406 mg/ml dan 4.812 mg/ml penambahan Pokeweed memiliki rataan IS tertinggi berturut-turut sebesar 2.001 + 0.05 dan 2.601 + 0.239 walaupun perbandingan nilainya juga tidak bermakna (p>0.05).

Hal ini menunjukkan

bahwa pada konsentrasi ekstrak daun kumis kucing yang rendah hanya sel B yang distimulasi proliferasinya, sedang pada konsentrasi ekstrak daun kumis kucing yang lebih tinggi dapat menstimulasi proliferasi baik sel T maupun sel B. Bunga Knop Metode Pengeringan Bunga knop setelah dikeringkan dengan dua macam metode pengeringan, maka didapatkan hasil yang terbaik. Hasil terbaik ini dinilai berdasarkan analisa total fenol dan analisa aktivitas antioksidan bubuk hasil pengeringan kedua metode. Bunga knop bila dilihat dari warna bubuk dan warna ekstrak airnya, hasil metode pengeringan oven memberikan warna yang lebih baik dibandingkan hasil metode pengeringan dengan sinar matahari. Bubuk terlihat lebih terang, sedangkan warna ekstrak airnya merah terang. Pada pengeringan dengan sinar matahari terlihat warna bubuk lebih kusam dan warna ekstrak airnya merah kusam. Metode pengeringan terbaik untuk mempertahankan kadar senyawasenyawa yang terkandung di dalam bunga knop adalah pengeringan dengan oven.

54

Sinar matahari

Oven

Gambar 9 Bubuk bunga knop

Sinar matahari (0,8667 g bubuk : 80 ml air)

Oven (0,8667 g bubuk : 80 ml air)

Gambar 10 Ekstrak air bubuk bunga knop

55

Bunga knop tampaknya tahan terhadap panas oven 50oC karena bentuknya yang mempunyai bonggol di bagian tengah.

Menurut Jayaraman dan Das Gupta

(1999), salah satu faktor yang mempengaruhi pemilihan metode pengeringan adalah bentuk dari bahan mentah dan sifat-sifatnya.

Pada metode pengeringan

dengan oven bunga knop lebih cepat mencapai kadar air 7% dibandingkan dengan metode pengeringan dengan sinar matahari.

Kecepatan pengeringan juga

berpengaruh terhadap degradasi zat-zat yang terkandung dalam suatu bahan hasil pertanian (Jayaraman dan Das Gupta 1995).

Pada pengeringan dengan sinar

matahari karena bentuknya yang mempunyai bonggol, bunga knop memerlukan waktu yang lebih lama untuk mencapai kadar air 7%. Hal ini menyebabkan semakin lama waktu yang diperlukan pada pengeringan dengan sinar matahari, padahal menurut Jayaraman dan Das Gupta (1995) kemungkinan dapat terjadi pembusukan baik secara kimiawi, enzimatis atau mikrobiologis karena waktu pengeringan yang lama. Selain itu dapat terjadi penurunan mutu selama penyimpanan karena terjadi ketidakseragaman pengeringan (Imre 1995). Total Fenol dan Aktivitas Antioksidan Berdasarkan analisa kadar total fenol dan aktivitas antioksidan dalam ekstrak air bubuk bunga knop, terlihat bahwa kadar total fenol dan aktivitas antioksidan dalam ekstrak air bubuk bunga knop yaitu 3.069 + 0.168 mg fenolik/g berat kering sampel dan TEAC 108.345 + 14.166 mM/g berat kering sampel yang dikeringkan dengan oven lebih tinggi dibandingkan dengan yang dikeringkan dengan sinar matahari 2.239 + 0.055 mg fenolik/g berat kering sampel dan TEAC 56.070 + 7.085 mM/g berat kering sampel (Tabel 7 dan 8, Gambar 11 dan 12). Kandungan senyawa fenolik dalam bunga knop belum banyak diteliti tetapi senyawa yang utama adalah gomphrenin I, II, III, V dan VI, amaranthin, minyak atsiri, saponin dan flavon (Mahendra dan Fauzi 2005; Dalimartha 2000). Menurut Cai et al. (2001), bunga knop banyak mengandung komponen pigmen alami yaitu dari kelompok betasianin sebesar 1.3 mg/g sampel segar. Selain itu menurut Stintzing et al (2004) famili bunga knop (Amaranthus spinosus L.) mengandung senyawa hidroksisinamat, quersetin dan kaempferol glikosida dan senyawa Aurone I (E) -3’ -O –ß –D –glucopyranosyl -4,5,6,4’

-tetrahydroxy -7,2’ -

56

dimethoxyaurone dan dua senyawa lain yaitu aurantiamide acetate dan tiliroside yang diisolasi dari ekstrak Gomphrena agretis (Ferreira et al. 2004). Besarnya kadar total fenol ekstrak air juga dipengaruhi oleh proses pengeringan sebelumnya. Kadar total fenol ekstrak air bubuk hasil pengeringan dengan oven lebih tinggi daripada ekstrak air bubuk hasil pengeringan matahari kemungkinan karena

pada pengeringan dengan oven, bunga knop lebih cepat

Tabel 7. Perbandingan total fenol pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak bunga knop segar

BKS1 BKS2 BKM1 BKM2 BKO1 BKO2

Mean

0 jam

24 jam

0 jam

24 jam

0 jam

24 jam

3.446 3.536 2.277 2.200 2.950 3.187

1.874 2.117 2.035 1.781 2.735 3.088

3.491

1.996

0.064

0.172

2.239

1.908

0.055

3.069

2.911

0.168

3.600 3.400

*p 0.002

3.200

Total Fenol (mg fenolik/g berat kering sample)

p

SD

3.000 2.800 2.600 2.400

*p 0.010

Perlakuan

Total fenol

0 jam

24 jam

0.179

0.002*

0.992

0.250

0.231

0.010*

Lama Penyimpanan

2.000 1.800 1.600 1.400 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000

BKM

24 Jam

BKS : Bunga knop segar BKM : Pengeringan dengan sinar matahari BKO : Pengeringan dengan oven

2.200

BKS

0 Jam

BKO

Gambar 11 Perbandingan total fenol masing-masing perlakuan pada bunga knop.

57

mencapai kadar air 7%, sehingga hanya sedikit zat-zat yang terkandung dalam bunga knop yang terdegradasi. Kadar total fenol bunga knop segar paling tinggi (3.491 + 0.064 mg fenolik/g berat sampel kering) dibandingkan dengan ekstrak air bubuk hasil pengeringan baik dengan oven maupun matahari, hal ini mungkin karena bunga knop segar tidak mengalami pengeringan sehingga senyawasenyawa yang terkandung di dalamnya tidak terdegradasi. Walaupun kadar total fenol ekstrak air bunga knop segar paling tinggi, tetapi tidak dipilih untuk penelitian selanjutnya karena salah satu tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan bubuk hasil pengeringan bunga knop. Tabel 8. Perbandingan aktivitas antioksidan pada 0 jam dan 24 jam antara ekstrak air masing-masing perlakuan dengan ekstrak bunga knop segar

Perlakuan BKS1 BKS2 BKM1 BKM2 BKO1 BKO2

mM trolox

Mean

p

SD

0 jam

24 jam

0 jam

24 jam

0 jam

24 jam

0 jam

24 jam

19.803 28.664 61.080 51.060 118.363 98.329

39.836 40.990 39.750 46.450 88.036 89.575

24.234

40.413

6.266

0.816

56.070

43.100

7.085

4.738

0.032*

0.999

108.345

88.806

14.166

1.088

0.000*

0.004*

Setelah penyimpanan ekstrak air selama 24 jam terjadi penurunan rataan kadar total fenol. Pada seduhan bubuk hasil pengeringan sinar matahari terlihat penurunan rataan kadar total fenol dari 2.239 + 0.055 mg fenolik/g berat kering sampel menjadi 1.908 + 0.179 mg fenolik/g berat kering sampel. Penurunan ini lebih besar dibandingkan dengan penurunan kadar total fenol ekstrak air bubuk hasil pengeringan oven dari 3.069 + 0.168 mg fenolik/g berat kering sampel menjadi 2.911 + 0.250 mg fenolik/g berat kering sampel (Gambar 11). Hal ini kemungkinan terjadi karena pengeringan bunga knop dengan sinar matahari memerlukan waktu yang lama untuk mencapai kadar air 7%, sehingga menurut Jayaraman dan Das Gupta (1995) terjadi pembusukan baik secara kimiawi, enzimatis atau mikrobiologis karena waktu pengeringan yang lama. Selain itu dapat

terjadi

penurunan

mutu

selama

penyimpanan

karena

terjadi

ketidakseragaman pengeringan (Imre 1995). Ekstrak air bunga knop segar juga

58

mengalami penurunan total fenol setelah penyimpanan yaitu dari 3.491 + 0.064 mg fenolik/g berat kering sampel menjadi 1.996 + 0.172 mg fenolik/g berat kering sampel. Aktivitas antioksidan dalam ekstrak air bunga knop segar rataannya lebih rendah dari pada rataan aktivitas antioksidan dalam ekstrak air bubuk hasil pengeringan sinar matahari maupun ektrak air bubuk hasil pengeringan oven, yaitu TEAC sebesar 24.234 + 6.266 mM/g berat kering sampel (Tabel 8). Hal ini kemungkinan terjadi karena ada senyawa-senyawa fenol tertentu

yang

mempunyai sifat antioksidan lebih baik yang terbentuk karena adanya proses pemanasan. Penelitian lainnya terhadap aktivitas antioksidan beberapa jenis buah-buahan dan sayuran memberikan hasil sebagai berikut. Buah berry TEAC 3700, sayursayuran TEAC 450-1400 serta buah-buahan TEAC 600-1700 (Miller et al. 2000). Bila dibandingkan dengan nilai TEAC terutama untuk sayuran, maka nilai TEAC ekstrak air bubuk daun kumis kucing cukup tinggi, terutama yang pengeringannya

*p 0.000

dilakukan dengan sinar matahari (1354 .756 + 1.515).

120.000 115.000

*p 0.004

110.000 105.000 100.000 90.000 85.000 80.000

*p 0.032

mM/g berat kering sampel (TEAC)

95.000

75.000 70.000 65.000 60.000

Lama Penyimpanan 0 Jam 24 Jam BKS : Bunga knop segar BKM : Pengeringan dengan sinar matahari BKO : Pengeringan dengan oven

55.000 50.000 45.000 40.000 35.000 30.000 25.000 20.000 15.000 10.000 5.000 0.000

BKS

BKM

BKO

Gambar 12 Perbandingan analisa aktivitas antioksidan masing-masing perlakuan pada bunga knop

59

Penyimpanan ekstrak air selama 24 jam mempengaruhi aktivitas antioksidan. Setelah 24 jam, rataan aktivitas antioksidan untuk ekstrak air bubuk bunga knop hasil pengeringan matahari mengalami penurunan yaitu dari TEAC sebesar 56.070 + 7.085 mM/g berat kering sampel menjadi TEAC sebesar 43.100 + 4.738 mM/g berat kering sampel, sedangkan ekstrak air bubuk bunga knop hasil pengeringan oven juga mengalami penurunan rataan aktivitas antioksidan yaitu dari TEAC sebesar 108.345 + 14.166 mM/g berat kering sampel menjadi TEAC sebesar 88.806 + 1.088 mM/g berat kering sampel. Penurunan ini disebabkan adanya reaksi oksidasi selama penyimpanan dan kemungkinan juga terjadi perubahan pH seduhan. Rataan aktivitas antioksidan seduhan daun segar setelah penyimpanan selama 24 jam mengalami kenaikan dari TEAC sebesar 24.234 + 6.266 mM/g berat kering sampel menjadi TEAC sebesar 40.413 + 0.816 mM/g berat kering sampel, tetapi kenaikannya tidak bermakna (p>0.05). Analisa Proksimat Bubuk Bunga Knop Hasil Pengeringan Dengan Oven Hasil analisa proksimat bubuk bunga knop hasil pengeringan dengan oven dapat dilihat pada Tabel 9. Dari hasil analisa bunga knop segar didapatkan kadar air yang cukup tinggi yaitu sebesar 73.13%, sehingga agar dapat disimpan dalam jangka waktu yang relatif lama diperlukan pengurangan kadar air sampai 7%. Penentuan ini berdasarkan SNI produksi teh dalam kemasan yang kadar airnya maksimum 8% (SNI 01-3836-2000). Tabel 9. Hasil analisa proksimat bubuk bunga knop hasil pengeringan dengan oven Analisa

Hasil (%)

Kadar air

7.00

Kadar abu

7.18

Kadar lemak

0.83

Kadar protein

7.16

60

Pengujian Ekstrak Bunga Knop Terhadap Proliferasi Sel Limfosit dengan Metode MTT Pengujian ekstrak bunga knop terhadap proliferasi sel limfosit memberikan hasil seperti terlihat pada Tabel 10 dan Gambar 13. Pemberian ekstrak bunga knop dengan konsentrasi 0.4115 mg/ml menaikkan rataan IS sel limfosit sebesar 1.011 + 0.082. Untuk bunga knop sampai 0.8230 mg/ml proliferasi sel limfosit masih meningkat 1.071 + 0.122 setelah itu peningkatan konsentrasi ekstrak bunga knop 1.646 mg/ml dan 3.292 mg/ml menghambat proliferasi sel limfosit berturutturut sebesar 0.938 + 0.041 dan 0.789 + 0.142. Tabel 10. Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah ekstrak bunga knop dengan mitogen (Con A, LPS dan PK ) dengan ekstrak bunga knop saja pada konsentrasi C1 (0.412 mg/ml), C2 (0.823 g/ml), C4 (1.646 mg/ml) dan C8 (3.292 g/ml) Perlakuan C1 C1+ConA C1+LPS C1+PK C2 C2+ConA C2+LPS C2+PK C4 C4+ConA C4+LPS C4+PK C8 C8+ConA C8+LPS C8+PK

Indeks stimulasi 1

2

3

1.095 0.781 0.945 0.976 1.201 0.718 0.992 0.842 0.974 0.728 0.900 0.868 0.940 0.562 0.813 0.749

1.008 0.757 0.974 0.976 1.053 0.794 0.995 0.931 0.894 0.654 0.884 0.934 0.670 0.562 0.847 0.778

0.931 0.760 0.815 1.016 0.958 0.691 1.005 0.905 0.945 0.702 0.873 0.887 0.731 0.633 0.760 0.620

Mean

SD

1.011 0.766 0.911 0.989 1.071 0.734 0.997 0.893 0.938 0.695 0.886 0.896 0.780 0.586 0.807 0.716

0.082 0.013 0.085 0.023 0.122 0.053 0.007 0.046 0.041 0.038 0.014 0.034 0.142 0.041 0.044 0.084

Mean Diff

p

0.245 0.1 0.022

0.006* 0.877 1

0.336 0.073 0.178

0.000* 0.989 0.123

0.243 0.052 0.041

0.007* 1 1

0.195 0.026 0.065

0.063 1 0.997

Bila dibandingkan dengan penelitian-penelitian sebelumnya, nilai % IS sel limfosit ekstrak air kayu secang (Caesalpina sappan Linn) sebesar sampai 150% (Puspaningrum 2003). Nilai % IS sel limfosit mencit sampel teh daun cincau (Cyclea) sebesar 141% dan bubuk gel cincau (Cyclea) sebesar 122% (Setiawati 2003). Nilai % IS filtrat bebas sel yang dipanaskan selama 20 menit 60oC dan diinkubasikan pada substrat kitosan DD 85% selama 1 jam sebesar 288.06% (Wahyuni et al 2004; Wahyuni et al 2005) dan nilai IS kitinase 0.1 IU/mg kitin

61

yang direaksikan selama 3 jam untuk pembuatan oligomer kitosan dengan konsentrasi 85 ì g/ml sampel sebesar 1.35 (Agustine 2005), maka nilai rataan I S tertinggi 1.071 + 0.122 (107.1% + 0.122) untuk penambahan ekstrak bunga knop dengan konsentrasi 0.8230 mg/ml menunjukkan bahwa ektrak bunga knop walaupun nilai rataan IS nya lebih kecil dari pada hasil-hasil penelitian lainnya tetapi mempunyai kemampuan menstimulasi proliferasi sel limfosit.

1.200 1.100

*p 0.006 *p 0.000 *p 0.007

1.000 0.900

0.700 0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100

Ekstrak + ConA

Ekstrak + LPS

PK

Ekstrak

LPS

0.00

Con A

Indeks Stimulasi

0.800

Gambar 13 Perbandingan indeks stimulasi antara kultur yang ditambah Ekstrak bunga knop saja dengan penambahan mitogen (Con A, LPS dan PK ) saja dan dengan ekstrak bunga knop ditambah mitogen Konsentrasi Ekstrak Bunga Knop

0.412 mg/ml

1.646 mg/ml

0.823 mg/ml

3.292 mg/ml

Pengujian ekstrak air dari Amaranthus sp. (famili bunga knop) terhadap sel splenosit dari mencit BALB/c menunjukkan kemampuan ekstrak ini untuk menstimulasi proliferasi sel splenosit. Sel B yang diisolasi dapat distimulasi juga oleh ekstrak ini. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak air Amaranthus sp. mempunyai aktivitas immunomodulator dengan secara langsung menstimulasi

Ekstrak + PK

62

aktivitas proliferasi sel B dan proliferasi subset sel T secara in vitro (Lin et al 2005). Dengan demikian peningkatan konsentrasi ekstrak bunga knop sampai 0.8230 mg/ml dapat menstimulasi proliferasi sel limfosit, dengan kata lain mempunyai fungsi sebagai immunomodulator. Mekanisme

yang

mungkin

terjadi

adalah

karena

adanya

efek

immunomodulator dari antioksidan yang terkandung dalam ekstrak bunga knop terutama dari senyawa-senyawa fenol yang dikandungnya.

Menurut Wu dan

Meydani (1998) antioksidan dapat mempengaruhi produksi molekul-molekul seperti IL-2 yang berpengaruh terhadap pertumbuhan sel limfosit dan sangat penting untuk mengaktivasi sel limfosit. Senyawa-senyawa fenol spesifik yang dapat meningkatkan proliferasi sel limfosit belum diketahui. Peningkatan konsentrasi ekstrak bunga knop lebih besar dari 0.8230 mg/ml menurunkan proliferasi sel limfosit atau bersifat toksik terhadap sel limfosit. Hal ini kemungkinan terjadi karena pada konsentrasi tersebut senyawa-senyawa fenol dalam bunga knop menunjukkan aktivitas prooksidan.

Sifat yang tidak

diinginkan ini menurut Kessler et al. (2003) dapat dijadikan penjelasan terhadap toksisitas dari beberapa flavonoid secara in-vivo. Senyawa-senyawa fenol spesifik yang menyebabkan terjadinya toksisitas ekstrak bunga knop terhadap limfosit belum diketahui. Salem et al. (2004) melakukan penelitian terhadap daun bunga knop yang diinokulasi dengan virus Prunus Necrotic Ringspot Virus (PNRSV). Hasil inokulasi ini menunjukkan ketahanan daun bunga knop terhadap virus tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa daun bunga knop mengandung anti virus atau bersifat toksik terhadap virus.

Senyawa ini kemungkinan terdapat juga

dalam bunganya yang kemungkinan dengan konsentrasi tertentu dapat menghambat proliferasi sel limfosit. Pada Gambar 13 dapat dilihat rataan IS untuk perlakuan kombinasi antara penambahan ekstrak bunga knop dan

mitogen lipopolisakarida (LPS),

concanavalin A (Con A) dan pokeweed (PK). Ekstrak bunga knop yang ditambah dengan mitogen semua menghambat proliferasi sel limfosit bila dibandingkan dengan perlakuan penambahan ekstrak bunga knop saja, tetapi yang berbeda bermakna menghambat proliferasi hanya penambahan concanavalin A (p<0.05) Hal ini kemungkinan terjadi karena kondisi sistem imun dalam tubuh responden

63

yang sedang kurang baik, sehingga mempengaruhi pula terhadap proliferasi limfositnya, selain itu kemungkinan karena adanya reaksi yang menyebabkan ketidakcocokan mitogen untuk berpasangan dengan reseptor, karena menurut Paraskevas dan Foerster (1999) aktivasi oleh mitogen memerlukan reseptor yang cocok, yang merupakan tahap awal dari aktivasi limfosit. Penambahan LPS saja mempunyai indeks stimulasi yang lebih tinggi dari pada untuk penambahan concanavalin A (Con A), dan pokeweed (PK)

saja

(Gambar 13). Pada penambahan LPS peningkatan konsentrasi ekstrak bunga knop dari 0.4115 mg/ml ke 0.8230 mg/ml meningkatkan IS.

Hal ini menunjukkan

bahwa dalam kultur tersebut ekstrak bunga knop yang berperan meningkatkan IS. Setelah itu peningkatan konsentrasi ekstrak bunga knop dengan penambahan LPS, Con A maupun pokeweed dengan konsentrasi yang sama menurunkan IS. Hal ini menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi penambahan bunga knop bersifat menghambat proliferasi sel limfosit dan bersama-sama dengan LPS, Con A dan pokeweed sinergis menghambat proliferasi sel limfosit. Selain itu, Con A sendiri menurut Stites (1991) dapat mengaktifkan sel Ts yang dengan demikian dapat menghambat proliferasi sel limfosit di dalam kultur tertentu.

64

Tabel 11. Perbandingan hasil penelitian ekstrak daun kumis kucing dengan bunga knop Daun Kumis kucing (Orthosiphon stamineus Benth) Metode pengeringan Terbaik

Bunga knop (Gomphrena globosa L.)

sinar matahari

Senyawa kimia yang orthosiphon glikosida(1), tanin(2) dikandung minyak atsiri(3) ,minyak lemak(4) , saponin(5), sapofonin(6), garam kalium (0.6-3.5%)(7), myoinositol(8), sinensetin(9). Eupatorin(10), Polymethoxylated flavonoid (11) turunan caffeic acid(12), hydroxy-5,6,7,4’ tetramethoxyflavone.(13), Flavonoid aglikon(14)

oven Gomphrenin I,II,III,V,VI(15), amaranthin(16), saponin(17) minyak atsiri(18), flavon(19)

Aktivitas biologis mencegah dan mengobati asam urat(20) mencegah batu yang mengandung asam urat(21) pelarut batu ginjal dan batu kandung kemih(22) efek diuretikum(23), anti bakteri(24)

anti bakteri(25) anti inflamasi(26), obatbatuk(27), obat sesak(28), penurun panas(29), disentri(30)

Kadar total fenol Tertinggi (mg fenolik/g bk)

123.220

3.068

Aktivitas antioksidan tertinggi (mM/gr bk (TEAC))

2339.822

108.343

Konsentrasi ekstrak yang diuji mg/ml

1.203, 2.406 dan 4.812

Konsentrasi ekstrak (mg/ml) dengan Indeks Stimulasi (IS) tertinggi

4.812 2.4

0.412, 0.823, 1.646 dan 3.292 0.823 1.071

(1), (2), (3), (4), (5), (6), (7), (8), (9), (15), (16), (17), (18) dan (19) Mahendra dan Fauzi (2005) (10), (11), (12) Olah et al. (2003) (13), (14) Loon et al. (2005) (25) Ferreira et al. (2004) (26) Stalinska et al. 2005) (27),(28), (29) dan (30) Anonim (2005)

65

SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Berdasarkan hasil yang diperoleh dapat disimpulkan : 1. Metode pengeringan terbaik untuk daun kumis kucing adalah pengeringan dengan sinar matahari sedang untuk bunga knop adalah pengeringan dengan oven 2. Peningkatan konsentrasi ekstrak daun kumis kucing yang ditambahkan berturut-turut dari 1.203 mg/ml, 2.406 sampai 4.812 mg/ml meningkatkan IS. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak daun kumis kucing sampai konsentrasi setara 4.812 mg/ml masih aman untuk dikonsumsi karena masih bersifat meningkatkan proliferasi sel limfosit. 3. Peningkatan konsentrasi bunga knop yang ditambahkan berturut turut dari 0.4115 mg/ml sampai 0.8230 mg/ml meningkatkan konsentrasi selanjutnya sebesar 1.646

IS.

Peningkatan

mg/ml sampai 3.292

mg/ml

menghambat proliferasi sel limfosit. Konsentrasi ekstrak bunga knop yang aman untuk dikonsumsi adalah sampai konsentrasi 0.8230 mg/ml, karena masih bersifat meningkatkan proliferasi sel limfosit. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui peningkatan sel NK, CD4 (penanda permukaan untuk Th) dan Tc.

Peningkatan ketiganya

menunjukkan adanya peningkatan proliferasi sel limfosit yang menunjukkan pula keamanan terhadap sel limfosit, baik sel B maupun sel T dalam sistem imun dengan adanya penambahan ekstrak daun kumis kucing.

Mekanisme

imunomodulator dengan adanya penambahan ekstrak daun kumis kucing ke dalam kultur sel juga perlu diteliti lebih lanjut. Untuk bunga knop, terjadi penghambatan proliferasi sel limfosit dengan adanya penambahan ekstrak bunga knop ke dalam kultur sel.

Hal ini

menunjukkan adanya sifat sitotoksik dari ekstrak bunga knop tersebut. Untuk mengetahui mekanisme penghambatan proliferasi sel limfosit atau adanya aktivitas anti inflamasi dengan penambahan ekstrak bunga knop ke dalam kultur sel perlu dilakukan penelitian lebih lanjut.

66

DAFTAR PUSTAKA Anonim. Materi Pelatihan Profesional Tanaman Obat (Kelas Profesional Tanaman Obat 2). 2005. Edisi Baru. Jakarta : Yayasan Pengembangan Tanaman Obat Karyasari Mengabdi Bagi Pengembangan Tanaman Obat Indonesia. Anonim. 2000. GomphrenaglobosaL. http://kambing.ui.edu/bebas/v12/artikel/ttg_tanaman_obat/depkes/buku3/3041.pdf#search=’bunga%20knop’ [8 Februari 2005]. Agustine H. 2005. Pengujian aktivitas immunoenhancing oligomer kitin yang diproduksi secara enzimatik [skripsi]. Bogor : Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Apriyantono A, Fardiaz D, Puspitasari NL, Yasni S, Budiyanto S. 1989. Analisis Pangan. Bogor : PT Penerbit IPB (IPB Press). Baratawidjaja KG. 2000. Imunologi Dasar. Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.

Jakarta : Balai Penerbit

Beaux D, Fleurentin J, Mortier F. 1999. Effects of extract of Orthosiphon stamineus Benth, Hieracium pilosella L. Sambucus nigra L. and Arctostaphylos uva-ursi (L.) Spreng in rats. Phytother Res 13(3):222-5. Cai Y, Sun M, Schliemann W, Corke H. 2001. Chemical stability and colorant properties of betaxanthin pigments from Celosia argentea. J Agric Food Chem 49(9):4429-35. Cai Y, Sun M, Corke H. 2001. Identification and distribution of simple and acylated betacyanins in the Amaranthaceae. J Agric Food Chem 49(4):1971-8. Cai Y, Sun M, Corke H. 2003. Antioxidant activity of betalains from plants of the Amaranthaceae. J Agric Food Chem 51(8):2288-94. . Cai Y, Luo Q, Sun M, Corke H. 2004. Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plant associated with anticancer. Life Sci 74(17):2157-84. Casadebaig-Lafon J, Jacob M, Cassanas G, Marion C, Puech A. 1989. Adsorbed plant extract, use of extracts of dried seeds of Orthosiphon stamineus Benth. Pharm Acta Helv 64(8):2204. Dalimartha S. 2000. Atlas Tumbuhan Obat Indonesia. Jilid ke-2. Jakarta: Trubus Agriwidya.

67

Dean JH, Cornacoff JB, Rosenthal GJ, Luster MI. 1989. Immune system : evaluation of injury. Di dalam : Hayes AW, editor. Principles and Methods of Toxicology. New York : Raven Press Ltd. Hlm 741-760. De Padua LS,Bunyaprahatsara N, Lemmens RHMJ, editor. 1999. Medicinal and poisonous plants 1. plant Resources of South-East Asia 12(1):368-371. Duthil GG, Gardner PT, Kyle JA. 2003. Plant polyphenols : are they the new magic bullet ?. Proc Nutr Soc 62: 599-603. Ferreira EO, Salvador MJ, P ral EM, Alfieri SC, Ito IY, Dias DA. 2004. A new heptasubstituted (E) - aurone glucoside and other aromatic compounds of Gomphrena agrestis with biological activity. Z Naturforsch [C] 59(7-8):499-505. Finley JW, Robinson SF. 1992. Food safety assessment : introduction. Di dalam Finley JW, Robinson SF, Amstrong DJ, editor. Food Safety Assessment. Washington DC : Library of Congress Cataloging –in -Publication Data. Hlm 2-7. Frehsney RI . 1995. Introduction to basic principles. Di dalam : Freshney RI, editor. Animal Cell Culture : A Practical Approach. Ed ke-2. Oxford : Oxford University Press. hlm 1-14. Fukumoto LR, Mazza G. 2000. Assessing antioxidant and prooxidant activities of phenolic compounds. J Agric Food Chem 48(8):3597-604. Garnadi Y. 1998. Perbandingan potensi diuretic antara infusa daun dan batang tumbuhan kumis kucing (Orthosiphon aristatus BI. Mig.) pada kelinci secara oral [skripsi]. Bandung : Fakultas Kedokteran, Universitas Padjadjaran. Halliwell B. 2002. Food –derived antioxidant : how to evaluate their importance In food and in vivo. Di dalam : Cadenas E, editor. Handbook of Antioxidants. New York : Marcel Dekker Inc. hlm 1-33. Harlow E, Lane D. 1988. Antibodies A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor : Cold Spring Harbor Laboratory. Imre L. 1995. Solar drying. Di dalam : Mujundar AS, editor. Handbook of Industrial Drying. Volume ke-1. Ed ke-2. New York: Marcel Dekker, Inc. hlm 373-451. Isparyanto W. 1999. Pengaruh infusa daun kumis kucing (Orthosiphon Aristatus BI. Mig.) terhadap asam urat darah tikus putih [skripsi]. Yogyakarta : Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada.

68

Jaffe HS, Sherwin SA. 1991. Immunomodulators. Di dalam : Stites DP, Terr AI, editor. Basic and Clinical Immunology. Edisi ke-7. New Jersey : Prentice-Hall International Inc. hlm 780-785. Jayaraman KS, Das Gupta DK. 1999. Drying of fruits and vegetables. Di dalam: Mujundar AS, editor. Handbook of Industrial Drying. Volume ke-1. Ed ke-2. New York: Marcel Dekker, Inc. hlm 643-690. Kang DG, Yun C, Lee HS. 2003. Screening and comparison of antioxidant activity of Solvent extracts of herbal medicines used in Korea. J Ethnopharmacol 87(2) : 231-6. Kapiszewska M, Soltys E, Visioli F, Cierniak A, Zajac G. 2005. The protective ability of the Mediterranean plant extracts against the oxidative DNA damage. The role of the radical oxygen species and the polyphenol content. J Physiol Pharmacol 56 Suppl 1:183-97. Kessler M, Ubeaud G, Jung L. 2003. Anti- and pro- oxidant activity of rutin and quercetin derivatives. J Pharm Pharmacol 55(1):131-42. Koesitoresmi A. 2002. Kapasitas antioksidan ekstrak batang dan daun cincau hijau (Cyclea barbata L. Miers) pada sel limfosit manusia secara in vitro [skripsi]. Bogor: Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Koleva II, van Beek TA, Linssen JP, de Groot A, Evstatieva LN. 2002. Screening of Plant extracts for antioxidant activity : a comparative study on three testing methods. Phytochem Anal 13(1):8-17. Kresno SB. 1991. Imunologi. Diagnosis dan Prosedur Laboratorium. Jakarta : Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Kubo IN, Masuoka P, Haraguchi H. 2002. Antioxidant activity of dodecyl gallate. J Agric Food Chem 50:3533-3539. Lin BF, Chiang BL, Lin JY. 2005. Amaranthus spinosus water extract Directly stimulates proliferation of B lymphocytes in vitro. Int Immunopharmacol 5(4):711-22. Loon YH, Wong JW, Yap SP, Yuen KH. 2005. Determination of flavonoids from Orthosiphon stamineus in plasma using a simple HPLC method with ultraviolet detection. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 816 (1-2):161-6. Mahendra B, Fauzi RH. 2005. Kumis Kucing, Pembudidayaan dan Pemanfaatan Untuk Penghancur Batu Ginjal. Jakarta: Penebar Swadaya.

69

Miller HE, Rigelhorf F, Marquat L, Prakash A, Kanter M. 2000. Antioxidant Content of whole grain breakfast cereal, fruits and vegetables. J Am Coll Nut 90003(19):3128-3198. Nirdnoy M, Muangman V. 1991. Effects of Folia orthosipohonis on urinary stone promoters and inhibitors. J Med Assoc Thai 74(6):318-21. Nurrahman. 1998. Pengaruh konsumsi sari jahe terhadap perlindungan limfosit dari stres oksidatif pada mahasiswa pondok pesantren Ulil Albaab di Bogor [tesis]. Bogor: Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Olah NK, Radu L, Mogosan C, Hanganu, D, Gocan S. 2003. Phytochemical and pharmacological studies on Orthosiphon stamineus Benth. (Lamiaceae) hydroalcoholic extracts. J Pharm Biomed Anal 33(1):117-23. Pandoyo AS. 2000. Pengaruh aktivitas ekstrak tanaman cincau hijau (Cyclea barbata L. Miers) terhadap proliferasi sel limfosit darah tepi manusia secara in vitro [skripsi]. Bogor : Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Paraskevas F, Foerster J. 1999. The lymphatic system. Di dalam : Lee GR, Foerster J, Lukens J, Paraskevas F, Greer JP, Rodgers GM, editor. Wintrobe’s Clinical Hematology. Ed ke - 10. Philadelphia : Lippincott Williams & Wilkins. hlm 430-465. Pomilio AB, Buschi CA, Tomes CN, Viale AA. 1992. Antimicrobial constituents of Gomphrena martiana and Gomphrena boliviana. J Ethnopharmacol 36(2):155-61. Pranoto BA. 2003. Aktivitas antitumor dan immunomodulator dari produk cincau hijau Cyclea barbata L. Miers dan Premna oblongifolia Merr. terhadap pertumbuhan tumor kelenjar susu mencit C3H [tesis]. Bogor : Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Puspaningrum R. 2003. Pengaruh ekstrak kayu secang (Caesalpinia sappan Linn) terhadap proliferasi sel limfosit limpa tikus dan sel kanker K562 (Chronic Myelogenous Leukimia) secara in vitro [skripsi]. Bogor : Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Roitt IM. 1991. Essential Immunology. Edisi ke - 7. Scientific Publication.

Oxford : Blackwell

Sari PW. 1985. Efek penyuntikan campuran infus daun Meniran (Phyllanthus niruri Linn) dan daun Kumis Kucing (Orthosiphon aristatus BI. Mig.) terhadap jumlah tetes urine kelinci terbius. Laporan penelitian. Yogyakarta : Lembaga Penelitian Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada.

70

Senchina DS, McCann DA, Asp JM, Johnson JA, Cunnick JE, Kaiser MS, Khut ML. 2005. Changes in immunomodulatory properties of Echinacea spp. root infusions and tintures stored at 4 degrees C for four days. Clin Chiom Acta 355(1-2):67-82. Setiawati R. 2003. Pengaruh produk daun cincau hijau Cyclea barbata L.Miers dan Premna oblongifolia Merr, terhadap kapasitas antioksidan limfosit mencit C3H bertumor kelenjar susu [skripsi]. Bogor : Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Shank FR, Carson KL. 1992. What is safe food?. Di dalam : Finley JW, Robinson SF, Amstrong DJ, editor. Food Safety Assessment. Washington DC : Library of Congress Cataloging –in -Publication Data. hlm 26-34. Shetty K, Curtis OR, Levin RE, Witkowsky R, Ang W. 1995. Prevention of vitrication associated with in vitro shoot culture of oregano (Origanum vulgare) by Pseudomonas spp. J Plant Physiol 147: 447-451. SNI 01- 3836- 2000. Teh kering dalam kemasan. Jakarta : Badan Standardisasi Nasional. Sofiani YS. 2003. Isolasi, pemurnian dan uji aktivitas antibakteri senyawa Sinensetin dari daun kumis kucing (Orthosiphon aristatus BI. Mig.) [skripsi]. Bogor : Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Sokhansaj S, Jayas DS. 1995. Drying of foodstuffs. Di dalam : Mujundar AS, editor. Handbook of Industrial Drying. Volume ke -1. Edisi ke -2. New York : Marcel Dekker, Inc. hlm 589-625. Stalinska K, Guzdek A, Rokicki M, Koj A. 2005. Transcription factors as targets of the anti-inflammatory treatment. A cell culture study with extracts from some Mediterranean diet plants. Physiol Pharmacol 56 Suppl 1:157-69. Stintzing FC, Kammerer D, Schieber A, Adama H, Nacoulma OG, Carle R. 2004. Betacyanins and phenolic compounds from Amaranthus spinosus L. and Boerhavia erecta L. Z Naturforsch [C] 59(1-2):1-8. Stites DP. 1987. Clinical laboratory methods for detection of cellular immunity. Di dalam : Stites DP dan Terr AI, editor. Basic and Clinical Immunology. Edisi ke-7. New Jersey : Prentice-Hall International Inc. hlm 263-283 Strack D,Vogt T, Schliemann W. 2003. Recent advances in betalain research. Phytochemistry 62(3):247-69.

71

Tejasari. 2000. Efek proteksi komponen bioaktif oleoresin rimpang jahe (Zingiber officinale Roscoe) terhadap fungsi limfosit secara in vitro. [disertasi]. Bogor : Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Tejasari, Zakaria FR, Sayuthi D. 2002. Aktivitas stimulasi komponen rimpang Jahe (Zingiber officinale Roscoe) pada sel limfosit B manusia secara in vitro. J Teknologi dan Industri Pangan 13(1):47-53. Tzianabos AO. 2000. Polysaccharides immunomodulators as therapeutic agents : structural aspects and biological function. Clin Microb Rev. 13(4):523-33. Wahyuni S, Zakaria FR, Witarto AB, Syah D, Suhartono MT. 2004. Aktivitas oligomer kitosan sebagai immunoenhancer. Seminar Nasional PATPI. Jakarta, Desember 2004. Wahyuni S, Zakaria FR, Witarto AB, Syah D, Suhartono MT. 2005. Aplikasi oligomer kitosan sebagai anti kanker. Seminar Nasional PERSADA (Persatuan Alumni Jepang). Agustus 2005. Waterman PG, Mole S. 1994. Analysis of phenolic plant metabolites. Oxford : Blackwell Scientific Publications. Wilson AP. 1995. Cytotoxicity and viability assays. Di dalam : Freshney RI, editor. Animal Cell Culture : A Practical Approach. Ed ke-2. Oxford : Oxford University Press. hlm 263-304. Zakaria FR, Meilasanti MA, Sanjaya, Pramudya SM, Richards AL. 1997. Aktivitas proliferasi limfosit darah tepi konsumen makanan jajanan di Bogor, Jawa Barat. Bul. Teknologi dan Industri Pangan. 8(2):57-65. Zakaria FR, Prangdimurti E. 2001. Kajian aktivitas biologis dari pengkayaan gel cincau hijau (Cyclea barbata L. Miers). Laporan Penelitian. Bogor: Proyek QUE FTSP.

72

Lampiran 1 Dosis dasar jumlah penggunaan daun segar dan bubuk daun kumis kucing untuk membuat ekstrak air * Untuk ekstrak air daun segar : Dosis yang digunakan berdasarkan Anonim (2005) yaitu dosis daun segar yang digunakan untuk mengobati infeksi kandung kemih dan batu dalam kandung kemih. 5-10 helai daun kumis kucing segar diekstraksi dengan ½ gelas air mendidih (110ml) Dikonversikan untuk dosis pencegahan 5 helai daun dalam 220 ml air (berat 5 helai daun = 1.1835 gr) Jadi perbandingan yang didapatkan untuk pembuatanekstrak air adalah : 1.1835 gr daun segar : 220 ml air * Untuk ekstrak air bubuk : Dosis yang digunakan berdasarkan Anonim (2005) yaitu dosis bubuk daun kumis kucing untuk pencegahan infeksi kandung kemih, kencing batu, dan infeksi saluran kemih, yaitu : 1-3 sendok takar (3-10 gr) per hari diekstraksi dengan 3.5 gelas air mendidih (770 ml) Diambil takaran 3 gr dalam 770 ml air, karena terlalu pekat maka diencerkan dengan mengurangi takaran menjadi 1 gr dalam 257 ml air. Jadi perbandingan yang didapatkan untuk pembuatan ekstrak air adalah 1 gr bubuk : 275 ml air

73

Lampiran 2 Dosis dasar jumlah penggunaan bunga segar dan bubuk bunga knop untuk membuat ekstrak air * Untuk ekstrak air bunga segar : Dosis yang digunakan berdasarkan Anonim (2005) yaitu dosis bunga segar yang digunakan untuk menambah nafsu makan, yaitu : 20 gr bunga segar (33 kuntum) diekstraksi dengan 3 gelas air mendidih direbus Sampai tersisa 2 gelas (440 ml). Karena terlalu pekat, maka diambil dosis untuk pengobatan asthma broncial sebanyak 10 kuntum Dikonversikan untuk dosis pencegahan 5 kuntum bunga dalam 80 ml air (berat 5 helai daun = 3.6720 gr) Jadi perbandingan yang didapatkan untuk pembuatan ekstrak air adalah : 3.6720 gr bunga segar : 80 ml air * Untuksekstrak air bubuk : Dosis yang digunakan berdasarkan Anoni m (2005) yaitu dosis bunga segar yang digunakan untuk menambah nafsu makan (sama dengan untuk ektrak air bunga segar). Berdasarkan ektrak air b unga segar (kadar air bunga segar 73.13%), maka didapatkan bubuk (kadar air 7%) sebesar : N x 93 = 3 gr x 26.87 N = 0.8667 gr bubuk Jadi perbandingan yang didapatkan untuk pembuatan ektrak air adalah : 0.8667 gr bubuk : 80 ml air

74

Lampiran 3 Contoh Perhitungan Konsentrasi Ekstrak Daun Kumis Kucing Contoh : Konsentrasi ekstrak bubuk daun kumis kucing yang dikonsumsi seharihari -

Asumsi konsumsi seduhan bubuk daun kumis kucing per hari = 770 ml

-

Dari 0.6226 gr bubuk daun kumis kucing yang diekstraksi dengan 80 ml air mendidih didapatkan 0.15 gr hasil freeze dry.

-

Untuk konsumsi sehari-hari bubuk yang digunakan untuk pembuatan ekstrak air adalah :

0.6225 gr x 770 ml 80 ml - Rendemen = 24% (berat basah)

= 5.9925 gr

- Sehingga jumlah ekstrak daun kumis kucing yang setara dengan 5.9925 gr bubuk adalah : 5.9925 gr x 24% = 1.4436 gr - Volume darah manusia dalam tubuh = 6 liter = 6000 ml -

Konsentrasri teoritis ekstrak di dalam darah bila semua ektrak bubuk diserap adalah 1.4436 gr = 2.406x 10-4 gr/ml = 0.2406 mg/ml 6000 ml darah

-

Bila volume ekstrak dalam kultur (0.1 ml) adalah 20 µl maka konsentrasi ekstrak yang harus dipersiapkan adalah : V1 x M 1

=

V2 x M2

0.1 ml x 0.2406 mg/ml = 0.02 ml x M2 M2

= 1.203 mg/ml (2 x dosis awal)

di C1 (dosis awal) adalah = 0.6015 mg/ml -

C1 adalah konsentrasi ekstrak untuk dosis referensi yang dikonsumsi seharihari Penentuan dosis ekstrak daun kumis kucing pada taraf yang lainnya adalah dengan menmgalikan C1 dengan kelipatan yang diinginkan. Pada penelitian ini digunakan C2, C4 dan C8. C2 = 1.203 mg/ml C4 = 2.406 mg/ml C8 = 4.812 mg/ml

75

Lampiran 4 Contoh Perhitungan Konsentrasi Ekstrak Bunga Knop Contoh : Konsentrasi ekstrak bubuk bunga knop yang dikonsumsi sehari-hari -

Asumsi konsumsi seduhan bubuk bunga knop per hari = 440 ml

-

Dari 2.3834 gr bubuk bunga knop yang diektraksi dengan 110 ml air mendidih didapatkan 0.247 gr hasil freeze dry.

-

Untuk konsumsi sehari-hari bubuk yang digunakan untuk pembuatan ekstrak air adalah

2.3834 gr x 440 ml 110 ml - Rendemen = 10.36% (berat basah)

= 9.5336 gr

- Sehingga jumlah ekstrak bunga knop yang setara dengan 5.9925 gr bubuk adalah : 9.5336 gr x 24% = 0.9876 gr - Volume darah manusia dalam tubuh = 6 liter = 6000 ml -

Konsentrasri teoritis ekstrak di dalam darah bila semua ekstrak bubuk diserap adalah 0.9876 gr = 1.646 x 10-4 gr/ml = 0.1646 mg/ml 6000 ml darah

-

Bila volume ekstrak dalam kultur (0.1 ml) adalah 20 µl maka konsentrasi ekstrak yang harus dipersiapkan adalah : V1 x M1 = V2 x M2 0.1 ml x 0.1646 mg/ml = 0.02 ml x M2 M2

= 0.8230 mg/ml (2 x dosis awal)

di C1 (dosis awal) adalah = 0.4115 mg/ml -

C1 adalah konsentrasi ekstrak untuk dosis referensi yang dikonsumsi seharihari Penentuan dosis ekstrak bunga knop pada taraf yang lainnya adalah dengan menmgalikan C1 dengan kelipatan yang diinginkan. Pada penelitian ini digunakan C1, C2, C4 dan C8. C1 = 0.4115 mg/ml C2 = 0.823 mg/ml C4 = 1.646 mg/ml C8 = 3.292 mg/ml

76

Lampiran 5 Penentuan konsentrasi larutan mitogen (LPS, Con A dan Pokeweed) 1. Bila mitogen yang ditanam ke dalam kultur sebanyak 10 µl Dalam sumur dengan volume 100µl (V1) untuk mendapatkan konsentrasi mitogen (M1) sebesar 10 µg/ml, maka konsentrasi mitogen sebanyak 10 µl (V2) yang ditanam ke dalam kultur adalah : V1 x M1 = V2 x M2 100 µl x 10 µg/ml = 10 µl x M2 M2 = 100 µg/ml 2. Bila mitogen yang ditanam ke dalam kultur sebanyak 20 µl Dalam sumur dengan volume 100µl (V1) untuk mendapatkan konsentrasi mitogen (M1) sebesar 10 µg/ml, maka konsentrasi mitogen sebanyak 20 µl (V2) yang ditanam ke dalam kultur adalah : V1 x M1 = V2 x M2 100 µl x 10 µg/ml = 20 µl x M2 M2 = 50 µg/ml

77

Lampiran 6 Master tabel data penelitian Tabel 12. Hasil analisa total fenol dan aktivitas antioksidan

PERLAKUAN KKS KKM KKO BKS BKM BKO

TOTAL FENOL mg fenolik/g berat kering sampel 0 JAM 24 JAM 47.202 41.319 123.220 87.620 16.918 14.319 3.491 1.995 2.238 1.907 3.068 2.911

ANALISA ANTIOKSIDAN mM/g berat kering sampel 0 JAM 24 JAM 2198.533 2339.822 1354.763 1346.528 470.448 406.350 24.231 40.413 56.072 43.204 108.343 88.825

Tabel 13. Hasil analisa MTT ekstrak bunga knop

OD

PERLAKUAN C1 C1+LPS C1+Con A C1+PK C2 C2+LPS C2+Con A C2+PK C4 C4+LPS C4+Con A C4+PK C8 C8+LPS C8+Con A C8+PK KONTROL LPS Con A PK

I 0.415 0.358 0.296 0.370 0.455 0.376 0.272 0.319 0.369 0.341 0.276 0.329 0.356 0.308 0.213 0.284 0.400 0.372 0.272 0.363

II 0.382 0.369 0.287 0.370 0.399 0.377 0.301 0.353 0.339 0.335 0.248 0.354 0.254 0.321 0.213 0.295 0.362 0.356 0.270 0.361

III 0.353 0.309 0.288 0.385 0.363 0.381 0.262 0.343 0.358 0.331 0.266 0.336 0.277 0.288 0.240 0.235 0.375 0.373 0.269 0.376

x 0.383 0.345 0.290 0.375 0.406 0.378 0.278 0.338 0.355 0.336 0.263 0.340 0.296 0.306 0.222 0.271 0.379 0.367 0.270 0.367

IS 1.011 0.910 0.765 0.989 1.071 0.997 0.734 0.892 0.937 0.887 0.694 0.897 0.781 0.807 0.586 0.715 0.968 0.712 0.968

78

Tabel 14. Hasil analisa MTT ekstrak daun kumis kucing

OD

PERLAKUAN C2 C2+LPS C2+Con A C2+PK C4 C4+LPS C4+Con A C4+PK C8 C8+LPS C8+Con A C8+PK KONTROL LPS Con A PK

I 0.408 0.474 0.381 0.355 0.491 0.594 0.480 0.524 0.651 0.576 0.716 0.682 0.266 0.245 0.267 0.284

II 0.367 0.469 0.444 0.352 0.475 0.496 0.518 0.524 0.669 0.479 0.669 0.630 0.265 0.267 0.273 0.265

III 0.432 0.476 0.370 0.420 0.480 0.423 0.481 0.550 0.588 0.772 0.597 0.756 0.266 0.282 0.269 0.280

x 0.402 0.473 0.398 0.376 0.482 0.504 0.493 0.533 0.636 0.609 0.661 0.689 0.265 0.265 0.270 0.276

IS 1.517 1.785 1.502 1.419 1.819 1.902 1.860 2.011 2.400 2.298 2.494 2.600 1.000 1.019 1.042

79

Lampiran 7 Tabel absorbansi dan kurva standar trolox Tabel 15. Absorbansi untuk Trolox (mM) No

Trolox (mM)

Absorbansi

1 2

0.0 1.25

0.0000 0.0315

3 4

2.5 5.0

0.2025 0.4575

0.5000

Y= 0.097 X – 0.038 R2 = 0.968

absorbansi

0.4000

0.3000

0.2000

0.1000

0.0000 0.0000

1.0000

2.0000

3.0000

4.0000

trolox

Gambar 14 Kurva standar Trolox

5.0000

80

Lampiran 8 Tabel absorbansi dan kurva standar asam tanat Tabel 16. Absorbansi untuk Asam Tanat No

Asam Tanat (ug/ml)

Absorbansi

1 2

5 10

0.0580 0.0745

3 4

25 50

0.1775 0.4185

5 6

100 150

0.9430 1.4445

7

200

1.7785

2.0000

Y= 0.009 X – 0.015 R2 = 0.996

absorbansi

1.5000

1.0000

0.5000

0.0000 0.0000

50.0000

100.0000

150.0000

200.0000

AsamTanat

Gambar 15 Kurva standar Asam Tanat

81

Lampiran 9 Daftar singkatan DPPH = 1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl TEAC = Trolox Equivalent Antioxidant Capacity GAE = Gallic Acid Equivalent HEPES = N-2-hidroksimetil-piperazin-N-2-etan-sulphonic acid FBS = Fetal Bovine Serum MTT = (3-[4,5-dimethythiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) Con A = Concanavalin A LPS = Lipopolisakarida PK = Pokeweed

82

Lampiran 10 Hasil uji statistik (ANOVA) kadar total fenol ekstrak air daun kumis kucing. Descriptives

N

Mean

Std. Deviation

95% Confidence Interval for Mean

Std. Error

Minimum

Maximum

1

2

48.56640

11.481151

8.118400

Lower Bound -54.58765

2

2

123.43380

12.158560

8.597400

14.19348

3

2

16.91840

.173665

.122800

15.35808

18.47872

16.796

17.041

12

2

42.51355

12.900951

9.122350

-73.39690

158.42400

33.391

51.636

22 32

2 2

87.62410 14.08585

6.784972 .249679

4.797700 .176550

26.66354 11.84257

148.58466 16.32913

82.826 13.909

92.422 14.262

12

55.52368

41.150401

11.879097

29.37797

81.66940

13.909

132.031

Total

Upper Bound 151.72045

40.448

56.685

232.67412

114.836

132.031

Multiple Comparisons

Tukey HSD

(I) perlakuan

(J) perlakuan

1

2 3

2

3

12

22

32

Mean Difference (I-J)

Std. Error

Sig.

95% Confidence Interval

-74.867400(*) 31.648000

9.057320 9.057320

.001 .085

Lower Bound -110.91415 -4.39875

Upper Bound -38.82065 67.69475

12

6.052850

9.057320

.979

-29.99390

42.09960

22

-39.057700(*)

9.057320

.035

-75.10445

-3.01095

32

34.480550

9.057320

.060

-1.56620

70.52730

1

74.867400(*)

9.057320

.001

38.82065

110.91415

3 12 22

106.515400(*) 80.920250(*) 35.809700

9.057320 9.057320 9.057320

.000 .001 .051

70.46865 44.87350 -.23705

142.56215 116.96700 71.85645

32

109.347950(*)

9.057320

.000

73.30120

145.39470

1

-31.648000

9.057320

.085

-67.69475

4.39875

2

-106.515400(*)

9.057320

.000

-142.56215

-70.46865

12

-25.595150

9.057320

.178

-61.64190

10.45160

22 32 1

-70.705700(*) 2.832550 -6.052850

9.057320 9.057320 9.057320

.002 .999 .979

-106.75245 -33.21420 -42.09960

-34.65895 38.87930 29.99390

2 3

-80.920250(*) 25.595150

9.057320 9.057320

.001 .178

-116.96700 -10.45160

-44.87350 61.64190

22

-45.110550(*)

9.057320

.018

-81.15730

-9.06380

32

28.427700

9.057320

.125

-7.61905

64.47445

1 2 3

39.057700(*) -35.809700 70.705700(*)

9.057320 9.057320 9.057320

.035 .051 .002

3.01095 -71.85645 34.65895

75.10445 .23705 106.75245

12

45.110550(*)

9.057320

.018

9.06380

81.15730

32

73.538250(*)

9.057320

.001

37.49150

109.58500

1

-34.480550

9.057320

.060

-70.52730

1.56620

2

-109.347950(*)

9.057320

.000

-145.39470

-73.30120

3 12 22

-2.832550 -28.427700 -73.538250(*)

9.057320 9.057320 9.057320

.999 .125 .001

-38.87930 -64.47445 -109.58500

33.21420 7.61905 -37.49150

83

* The mean difference is significant at the .05 level.

Keterangan : 1 2 3 12 22 32

Kumis kucing segar 0 jam Kumis kucing matahari 0 jam Kumis kucing oven 0 jam Kumis kucing segar 24 jam Kumis kucing matahari 24 jam Kumis kucing oven 24 jam

84

Lampiran 11 Hasil uji statistik (ANOVA) aktivitas antioksidan ekstrak air daun kumis kucing. Descriptives

N

Std. Deviation

Mean

Std. Error

95% Confidence Interval for Mean Lower Bound

Minimum

Maximum

Upper Bound

1

2

2198.57400

390.694881

276.263000

-1311.68024

5708.82824

1922.311

2474.837

2

2

1354.75600

1.514623

1.071000

1341.14765

1368.36435

1353.685

1355.827

3

2

470.44100

61.699309

43.628000

-83.90530

1024.78730

426.813

514.069

12

2

2339.82200

214.677619

151.800000

411.02012

4268.62388

2188.022

2491.622

22

2

1346.00000

2.828427

2.000000

1320.58759

1371.41241

1344.000

1348.000

32

2

402.49500

38.494893

27.220000

56.63211

748.35789

375.275

429.715

12

1352.01467

794.668989

229.401177

847.10608

1856.92325

375.275

2491.622

Total

Multiple Comparisons

Tukey HSD

(I) perlakuan

(J) perlakuan

1

2 3 12

2

12

22

32

Std. Error

Sig.

95% Confidence Interval Lower Bound 109.92029 994.23529 -875.14571

Upper Bound 1577.71571 2462.03071 592.64971

.026

118.67629

1586.47171

.001

1062.18129

2529.97671

184.403510

.027

-1577.71571

-109.92029

184.403510 184.403510 184.403510

.022 .013 1.000

150.41729 -1718.96371 -725.14171

1618.21271 -251.16829 742.65371

843.818000(*) 1728.133000(*) -141.248000

184.403510 184.403510 184.403510

.027 .001 .964

22

852.574000(*)

184.403510

32

1796.079000(*)

184.403510

1

-843.818000(*)

3 12 22

884.315000(*) -985.066000(*) 8.756000

32 3

Mean Difference (I-J)

952.261000(*)

184.403510

.015

218.36329

1686.15871

1

-1728.133000(*)

184.403510

.001

-2462.03071

-994.23529

2 12

-884.315000(*) -1869.381000(*)

184.403510 184.403510

.022 .000

-1618.21271 -2603.27871

-150.41729 -1135.48329

22 32 1

-875.559000(*) 67.946000 141.248000

184.403510 184.403510 184.403510

.023 .999 .964

-1609.45671 -665.95171 -592.64971

-141.66129 801.84371 875.14571

2

985.066000(*)

184.403510

.013

251.16829

1718.96371

3 22

1869.381000(*) 993.822000(*)

184.403510 184.403510

.000 .012

1135.48329 259.92429

2603.27871 1727.71971

32

1937.327000(*)

184.403510

.000

1203.42929

2671.22471

1 2 3

-852.574000(*) -8.756000 875.559000(*)

184.403510 184.403510 184.403510

.026 1.000 .023

-1586.47171 -742.65371 141.66129

-118.67629 725.14171 1609.45671

12

-993.822000(*)

184.403510

.012

-1727.71971

-259.92429

32

943.505000(*)

184.403510

.016

209.60729

1677.40271

1

-1796.079000(*)

184.403510

.001

-2529.97671

-1062.18129

2

-952.261000(*)

184.403510

.015

-1686.15871

-218.36329

3 12 22

-67.946000 -1937.327000(*) -943.505000(*)

184.403510 184.403510 184.403510

.999 .000 .016

-801.84371 -2671.22471 -1677.40271

665.95171 -1203.42929 -209.60729

85

* The mean difference is significant at the .05 level.

Keterangan : 4 5 6 13 22 32

Kumis kucing segar 0 jam Kumis kucing matahari 0 jam Kumis kucing oven 0 jam Kumis kucing segar 24 jam Kumis kucing matahari 24 jam Kumis kucing oven 24 jam

86

Lampiran 12 Hasil uji statistik (ANOVA) indeks stimulasi ekstrak daun kumis kucing. Descriptives

N

Mean

Std. Deviation

Std. Error

95% Confidence Interval for Mean Lower Bound Upper Bound 1.21048 1.82619

Minimum

Maximum

C2

3

1.51833

.123929

.071550

1.385

1.630

C4

3

1.81867

.031214

.018022

1.74113

1.89621

1.792

1.853

C8

3

2.38900

.148203

.085565

2.02084

2.75716

2.219

2.491

C2+ConA

3

1.50300

.150429

.086850

1.12931

1.87669

1.396

1.675

C4+ConA

3

1.86033

.082008

.047347

1.65661

2.06405

1.811

1.955

C8+ConA

3

2.49267

.226032

.130499

1.93117

3.05416

2.253

2.702

C2+LPS

3

1.78500

.013454

.007767

1.75158

1.81842

1.770

1.796

C4+LPS C8+LPS

3 3

1.90333 2.29833

.324138 .562895

.187141 .324987

1.09813 .90003

2.70854 3.69664

1.596 1.808

2.242 2.913

C2+PK

3

1.41767

.145039

.083738

1.05737

1.77796

1.328

1.585

C4+PK

3

2.00967

.056580

.032667

1.86911

2.15022

1.977

2.075

3

2.60133

.239174

.138087

2.00719

3.19548

2.377

2.853

36

1.96644

.431492

.071915

1.82045

2.11244

1.328

2.913

C8+PK Total

Multiple Comparisons

Tukey HSD

(I) perlakuan

(J) perlakuan

11

12 13 21

12

Mean Difference (I-J)

Std. Error

Sig.

95% Confidence Interval Lower Bound

Upper Bound

-.300333 -.870667(*) .015333

.185933 .185933 .185933

.887 .004 1.000

-.97074 -1.54107 -.65507

.37007 -.20026 .68574

22

-.342000

.185933

.782

-1.01241

.32841

23

-.974333(*)

.185933

.001

-1.64474

-.30393

31 32

-.266667 -.385000

.185933 .185933

.944 .646

-.93707 -1.05541

.40374 .28541

33

-.780000(*)

.185933

.013

-1.45041

-.10959

41

.100667

.185933

1.000

-.56974

.77107

42

-.491333

.185933

.311

-1.16174

.17907

43

-1.083000(*)

.185933

.000

-1.75341

-.41259

11

.300333

.185933

.887

-.37007

.97074

13 21 22

-.570333 .315667 -.041667

.185933 .185933 .185933

.149 .853 1.000

-1.24074 -.35474 -.71207

.10007 .98607 .62874

23

-.674000(*)

.185933

.048

-1.34441

-.00359

31

.033667

.185933

1.000

-.63674

.70407

32

-.084667

.185933

1.000

-.75507

.58574

33

-.479667

.185933

.342

-1.15007

.19074

41 42

.401000 -.191000

.185933 .185933

.592 .995

-.26941 -.86141

1.07141 .47941

43

-.782667(*)

.185933

.013

-1.45307

-.11226

87

13

21

22

23

31

11

.870667(*)

.185933

.004

.20026

1.54107

12

.570333

.185933

.149

-.10007

1.24074

21

.886000(*)

.185933

.003

.21559

1.55641

22 23 31

.528667 -.103667 .604000

.185933 .185933 .185933

.223 1.000 .105

-.14174 -.77407 -.06641

1.19907 .56674 1.27441

32

.485667

.185933

.326

-.18474

1.15607

33 41

.090667 .971333(*)

.185933 .185933

1.000 .001

-.57974 .30093

.76107 1.64174

42

.379333

.185933

.665

-.29107

1.04974

43

-.212333

.185933

.989

-.88274

.45807

11

-.015333

.185933

1.000

-.68574

.65507

12

-.315667

.185933

.853

-.98607

.35474

13

-.886000(*)

.185933

.003

-1.55641

-.21559

22

-.357333

.185933

.736

-1.02774

.31307

23 31 32 33

-.989667(*) -.282000 -.400333 -.795333(*)

.185933 .185933 .185933 .185933

.001 .921 .594 .011

-1.66007 -.95241 -1.07074 -1.46574

-.31926 .38841 .27007 -.12493

41

.085333

.185933

1.000

-.58507

.75574

42

-.506667

.185933

.273

-1.17707

.16374

43 11

-1.098333(*) .342000

.185933 .185933

.000 .782

-1.76874 -.32841

-.42793 1.01241

12

.041667

.185933

1.000

-.62874

.71207

13

-.528667

.185933

.223

-1.19907

.14174

21

.357333

.185933

.736

-.31307

1.02774

23

-.632333

.185933

.077

-1.30274

.03807

31

.075333

.185933

1.000

-.59507

.74574

32

-.043000

.185933

1.000

-.71341

.62741

33 41 42 43

-.438000 .442667 -.149333 -.741000(*)

.185933 .185933 .185933 .185933

.468 .453 .999 .022

-1.10841 -.22774 -.81974 -1.41141

.23241 1.11307 .52107 -.07059

11

.974333(*)

.185933

.001

.30393

1.64474

12

.674000(*)

.185933

.048

.00359

1.34441

13

.103667

.185933

1.000

-.56674

.77407

21

.989667(*)

.185933

.001

.31926

1.66007

22

.632333

.185933

.077

-.03807

1.30274

31

.707667(*)

.185933

.032

.03726

1.37807

32 33

.589333 .194333

.185933 .185933

.123 .995

-.08107 -.47607

1.25974 .86474

41

1.075000(*)

.185933

.000

.40459

1.74541

42 43 11

.483000 -.108667 .266667

.185933 .185933 .185933

.333 1.000 .944

-.18741 -.77907 -.40374

1.15341 .56174 .93707

12 13

-.033667 -.604000

.185933 .185933

1.000 .105

-.70407 -1.27441

.63674 .06641

21

.282000

.185933

.921

-.38841

.95241

22

-.075333

.185933

1.000

-.74574

.59507

23

-.707667(*)

.185933

.032

-1.37807

-.03726

88

32

33

41

42

43

32

-.118333

.185933

1.000

-.78874

33

-.513333

.185933

.257

-1.18374

.55207 .15707

41

.367333

.185933

.704

-.30307

1.03774

42

-.224667

.185933

.983

-.89507

.44574

43

-.816333(*)

.185933

.008

-1.48674

-.14593

11 12 13 21

.385000 .084667 -.485667 .400333

.185933 .185933 .185933 .185933

.646 1.000 .326 .594

-.28541 -.58574 -1.15607 -.27007

1.05541 .75507 .18474 1.07074

22

.043000

.185933

1.000

-.62741

.71341

23

-.589333

.185933

.123

-1.25974

.08107

31

.118333

.185933

1.000

-.55207

.78874

33

-.395000

.185933

.612

-1.06541

.27541

41

.485667

.185933

.326

-.18474

1.15607

42

-.106333

.185933

1.000

-.77674

.56407

43 11

-.698000(*) .780000(*)

.185933 .185933

.036 .013

-1.36841 .10959

-.02759 1.45041

12

.479667

.185933

.342

-.19074

1.15007

13 21 22

-.090667 .795333(*) .438000

.185933 .185933 .185933

1.000 .011 .468

-.76107 .12493 -.23241

.57974 1.46574 1.10841

23 31

-.194333 .513333

.185933 .185933

.995 .257

-.86474 -.15707

.47607 1.18374

32

.395000

.185933

.612

-.27541

1.06541

41

.880667(*)

.185933

.004

.21026

1.55107

42

.288667

.185933

.910

-.38174

.95907

43

-.303000

.185933

.881

-.97341

.36741

11

-.100667

.185933

1.000

-.77107

.56974

12

-.401000

.185933

.592

-1.07141

.26941

13 21

-.971333(*) -.085333

.185933 .185933

.001 1.000

-1.64174 -.75574

-.30093 .58507

22 23 31

-.442667 -1.075000(*) -.367333

.185933 .185933 .185933

.453 .000 .704

-1.11307 -1.74541 -1.03774

.22774 -.40459 .30307

32

-.485667

.185933

.326

-1.15607

.18474

33

-.880667(*)

.185933

.004

-1.55107

-.21026

42

-.592000

.185933

.119

-1.26241

.07841

43

-1.183667(*)

.185933

.000

-1.85407

-.51326

11

.491333

.185933

.311

-.17907

1.16174

12 13

.191000 -.379333

.185933 .185933

.995 .665

-.47941 -1.04974

.86141 .29107

21

.506667

.185933

.273

-.16374

1.17707

22

.149333

.185933

.999

-.52107

.81974

23

-.483000

.185933

.333

-1.15341

.18741

31 32 33

.224667 .106333 -.288667

.185933 .185933 .185933

.983 1.000 .910

-.44574 -.56407 -.95907

.89507 .77674 .38174

41

.592000

.185933

.119

-.07841

1.26241

43

-.591667

.185933

.120

-1.26207

.07874

11

1.083000(*)

.185933

.000

.41259

1.75341

89

12

.782667(*)

.185933

.013

.11226

13

.212333

.185933

.989

-.45807

.88274

21

1.098333(*)

.185933

.000

.42793

1.76874

22

.741000(*)

.185933

.022

.07059

1.41141

23

.108667

.185933

1.000

-.56174

.77907

31 32

.816333(*) .698000(*)

.185933 .185933

.008 .036

.14593 .02759

1.48674 1.36841

33 41 42

.303000 1.183667(*) .591667

.185933 .185933 .185933

.881 .000 .120

-.36741 .51326 -.07874

.97341 1.85407 1.26207

Keterangan : 11 12 13 21 22 23 31 32 33 41 42 43

C2 C4 C8 C2+ConA C4+ConA C8+ConA C2+LPS C4+LPS C8+LPS C2+PK C4+PK C8+PK

1.45307

90

Lampiran 13 Hasil uji statistik (ANOVA) kadar total fenol ekstrak air bunga knop Descriptives N

Mean

Std. Deviation

Std. Error

95% Confidence Interval for Mean Lower Bound

Minimum

Maximum

Upper Bound

1

2

3.49095

.063710

.045050

2.91854

4.06336

3.446

3.536

2

2

2.23870

.054589

.038600

1.74824

2.72916

2.200

2.277

3 12

2 2

3.06855 1.99550

.167655 .171968

.118550 .121600

1.56223 .45043

4.57487 3.54057

2.950 1.874

3.187 2.117

22

2

1.90785

.179393

.126850

.29607

3.51963

1.781

2.035

32

2

2.91135

.249538

.176450

.66934

5.15336

2.735

3.088

12

2.60215

.627384

.181110

2.20353

3.00077

1.781

3.536

Total

Multiple Comparisons (I) perlakuan

(J) perlakuan

Mean Difference (I-J)

Std. Error

Sig.

95% Confidence Interval Lower Bound

Tukey HSD

1

2

3

12

22

32

Upper Bound

2 3

1.252250(*) .422400

.162876 .162876

.002 .231

.60403 -.22582

1.90047 1.07062

12

1.495450(*)

.162876

.001

.84723

2.14367

22 32

1.583100(*) .579600

.162876 .162876

.001 .079

.93488 -.06862

2.23132 1.22782

1

-1.252250(*)

.162876

.002

-1.90047

-.60403

3 12 22

-.829850(*) .243200 .330850

.162876 .162876 .162876

.016 .681 .421

-1.47807 -.40502 -.31737

-.18163 .89142 .97907

32 1

-.672650(*) -.422400

.162876 .162876

.043 .231

-1.32087 -1.07062

-.02443 .22582

2

.829850(*)

.162876

.016

.18163

1.47807

12

1.073050(*)

.162876

.005

.42483

1.72127

22 32 1

1.160700(*) .157200 -1.495450(*)

.162876 .162876 .162876

.003 .914 .001

.51248 -.49102 -2.14367

1.80892 .80542 -.84723

2

-.243200

.162876

.681

-.89142

.40502

3

-1.073050(*)

.162876

.005

-1.72127

-.42483

22

.087650

.162876

.992

-.56057

.73587

32 1 2 3

-.915850(*) -1.583100(*) -.330850 -1.160700(*)

.162876 .162876 .162876 .162876

.010 .001 .421 .003

-1.56407 -2.23132 -.97907 -1.80892

-.26763 -.93488 .31737 -.51248

12

-.087650

.162876

.992

-.73587

.56057

32

-1.003500(*)

.162876

.006

-1.65172

-.35528

-.579600 .672650(*)

.162876 .162876

.079 .043

-1.22782 .02443

.06862 1.32087

1 2

91

3 -.157200 12 .915850(*) 22 1.003500(*) * The mean difference is significant at the .05 level.

Keterangan : 7 8 9 14 22 32

Bunga knop segar 0 jam Bunga knop matahari 0 jam Bunga knop oven 0 jam Bunga knop segar 24 jam Bunga knop matahari 24 jam Bunga knop oven 24 jam

.162876 .162876 .162876

.914 .010 .006

-.80542 .26763 .35528

.49102 1.56407 1.65172

92

Lampiran 14 Hasil uji statistik (ANOVA) aktivitas antioksidan ekstrak air bunga knop. Descriptives

N

Mean

Std. Deviation

Std. Error

95% Confidence Interval for Mean Lower Bound

1

2

2

2

56.07000

7.085210

3

2

108.34600

14.166177

12 22

2 2

40.41300 43.10000

.816001 4.737615

32

2

88.80550

12

60.16133

Total

24.23350

6.265673

4.430500

Minimum

Maximum

Upper Bound

-32.06134

80.52834

19.803

28.664

5.010000

-7.58809

119.72809

51.060

61.080

10.017000

-18.93205

235.62405

98.329

118.363

.577000 3.350000

33.08152 .53421

47.74448 85.66579

39.836 39.750

40.990 46.450

1.088237

.769500

79.02808

98.58292

88.036

89.575

31.007629

8.951131

40.46003

79.86264

19.803

118.363

Multiple Comparisons (I) perlakuan

(J) perlakuan

1

2 3

Mean Difference (I-J)

Std. Error

Sig.

95% Confidence Interval Lower Bound

Tukey HSD

2

3

12

22

32

Upper Bound

-31.836500(*) -84.112500(*)

7.239182 7.239182

.032 .000

-60.64734 -112.92334

-3.02566 -55.30166

12

-16.179500

7.239182

.341

-44.99034

12.63134

22 32

-18.866500 -64.572000(*)

7.239182 7.239182

.228 .001

-47.67734 -93.38284

9.94434 -35.76116

1

31.836500(*)

7.239182

.032

3.02566

60.64734

3 12 22

-52.276000(*) 15.657000 12.970000

7.239182 7.239182 7.239182

.003 .368 .530

-81.08684 -13.15384 -15.84084

-23.46516 44.46784 41.78084

32 1

-32.735500(*) 84.112500(*)

7.239182 7.239182

.029 .000

-61.54634 55.30166

-3.92466 112.92334

2

52.276000(*)

7.239182

.003

23.46516

81.08684

12

67.933000(*)

7.239182

.001

39.12216

96.74384

22 32 1

65.246000(*) 19.540500 16.179500

7.239182 7.239182 7.239182

.001 .205 .341

36.43516 -9.27034 -12.63134

94.05684 48.35134 44.99034

2

-15.657000

7.239182

.368

-44.46784

13.15384

3

-67.933000(*)

7.239182

.001

-96.74384

-39.12216

22

-2.687000

7.239182

.999

-31.49784

26.12384

32 1 2 3

-48.392500(*) 18.866500 -12.970000 -65.246000(*)

7.239182 7.239182 7.239182 7.239182

.004 .228 .530 .001

-77.20334 -9.94434 -41.78084 -94.05684

-19.58166 47.67734 15.84084 -36.43516

12

2.687000

7.239182

.999

-26.12384

31.49784

32

-45.705500(*)

7.239182

.006

-74.51634

-16.89466

1 2

64.572000(*) 32.735500(*)

7.239182 7.239182

.001 .029

35.76116 3.92466

93.38284 61.54634

3

-19.540500

7.239182

.205

-48.35134

9.27034

93

12 48.392500(*) 22 45.705500(*) * The mean difference is significant at the .05 level.

Keterangan : 10 11 12 15 22 32

Bunga knop segar 0 jam Bunga knop matahari 0 jam Bunga knop oven 0 jam Bunga knop segar 24 jam Bunga knop matahari 24 jam Bunga knop oven 24 jam

7.239182 7.239182

.004 .006

19.58166 16.89466

77.20334 74.51634

94

Lampiran 15 Hasil uji statistik (ANOVA) indeks stimulasi ekstrak bunga knop. Descriptives

N

Mean

Std. Deviation

Std. Error

Minimum

95% Confidence Interval for Mean

Maximum

C1

3

1.01133

.082051

.047372

Lower Bound .80751

C2

3

1.07067

.122460

.070702

.76646

1.37487

.958

1.201

C4

3

.93767

.040501

.023383

.83706

1.03828

.894

.974

C8

3

.78033

.141599

.081752

.42858

1.13209

.670

.940

C1ConA

3

.76600

.013077

.007550

.73352

.79848

.757

.781

C2ConA

3

.73433

.053407

.030835

.60166

.86700

.691

.794

C4ConA

3

.69467

.037541

.021674

.60141

.78792

.654

.728

C8ConA

3

.58567

.040992

.023667

.48384

.68750

.562

.633

C1LPS

3

.91133

.084678

.048889

.70098

1.12168

.815

.974

C2LPS

3

.99733

.006807

.003930

.98042

1.01424

.992

1.005

C4LPS

3

.88567

.013577

.007839

.85194

.91939

.873

.900

C8LPS

3

.80667

.043844

.025314

.69775

.91558

.760

.847

C1PK

3

.98933

.023094

.013333

.93196

1.04670

.976

1.016

C2PK

3

.89267

.045764

.026422

.77898

1.00635

.842

.931

C4PK

3

.89633

.033975

.019616

.81193

.98073

.868

.934

C8PK

3 4 8

.71567

.084109

.048560

.50673

.92461

.620

.778

.85473

.142439

.020559

.81337

.89609

.562

1.201

Total

Upper Bound 1.21516

.931

1.095

Multiple Comparisons

Tukey HSD

(I) perlakuan

(J) perlakuan

11

12 13

-.059333 .073667

.053895 .053895

.999 .989

-.25918 -.12618

.14051 .27351

14

.231000(*)

.053895

.012

.03115

.43085

21

.245333(*)

.053895

.006

.04549

.44518

22

.277000(*)

.053895

.001

.07715

.47685

23

.316667(*)

.053895

.000

.11682

.51651

24 31

.425667(*) .100000

.053895 .053895

.000 .877

.22582 -.09985

.62551 .29985

32

.014000

.053895

1.000

-.18585

.21385

33

.125667

.053895

.605

-.07418

.32551

34 41

.204667(*) .022000

.053895 .053895

.040 1.000

.00482 -.17785

.40451 .22185

42

.118667

.053895

.690

-.08118

.31851

43

.115000

.053895

.732

-.08485

.31485

44 11

.295667(*) .059333

.053895 .053895

.000 .999

.09582 -.14051

.49551 .25918

13 14 21

.133000 .290333(*) .304667(*)

.053895 .053895 .053895

.516 .001 .000

-.06685 .09049 .10482

.33285 .49018 .50451

22

.336333(*)

.053895

.000

.13649

.53618

12

Mean Difference (I-J)

Std. Error

Sig.

95% Confidence Interval Lower Bound

Upper Bound

95

13

14

21

23

.376000(*)

.053895

.000

.17615

.57585

24

.485000(*)

.053895

.000

.28515

.68485

31

.159333

.053895

.243

-.04051

.35918

32

.073333

.053895

.989

-.12651

.27318

33

.185000

.053895

.094

-.01485

.38485

34 41

.264000(*) .081333

.053895 .053895

.002 .973

.06415 -.11851

.46385 .28118

42

.178000

.053895

.123

-.02185

.37785

43

.174333

.053895

.142

-.02551

.37418

44

.355000(*)

.053895

.000

.15515

.55485

11

-.073667

.053895

.989

-.27351

.12618

12

-.133000

.053895

.516

-.33285

.06685

14

.157333

.053895

.259

-.04251

.35718

21 22 23 24

.171667 .203333(*) .243000(*) .352000(*)

.053895 .053895 .053895 .053895

.157 .043 .007 .000

-.02818 .00349 .04315 .15215

.37151 .40318 .44285 .55185

31

.026333

.053895

1.000

-.17351

.22618

32

-.059667

.053895

.999

-.25951

.14018

33

.052000

.053895

1.000

-.14785

.25185

34

.131000

.053895

.540

-.06885

.33085

41

-.051667

.053895

1.000

-.25151

.14818

42

.045000

.053895

1.000

-.15485

.24485

43 44

.041333 .222000(*)

.053895 .053895

1.000 .018

-.15851 .02215

.24118 .42185

11

-.231000(*)

.053895

.012

-.43085

-.03115

12

-.290333(*)

.053895

.001

-.49018

-.09049

13

-.157333

.053895

.259

-.35718

.04251

21

.014333

.053895

1.000

-.18551

.21418

22

.046000

.053895

1.000

-.15385

.24585

23 24 31

.085667 .194667 -.131000

.053895 .053895 .053895

.959 .063 .540

-.11418 -.00518 -.33085

.28551 .39451 .06885

32 33

-.217000(*) -.105333

.053895 .053895

.023 .832

-.41685 -.30518

-.01715 .09451

34

-.026333

.053895

1.000

-.22618

.17351

41

-.209000(*)

.053895

.033

-.40885

-.00915

42 43

-.112333 -.116000

.053895 .053895

.761 .721

-.31218 -.31585

.08751 .08385

44

.064667

.053895

.997

-.13518

.26451

11

-.245333(*)

.053895

.006

-.44518

-.04549

12 13

-.304667(*) -.171667

.053895 .053895

.000 .157

-.50451 -.37151

-.10482 .02818

14

-.014333

.053895

1.000

-.21418

.18551

22

.031667

.053895

1.000

-.16818

.23151

23

.071333

.053895

.992

-.12851

.27118

24

.180333

.053895

.113

-.01951

.38018

31 32

-.145333 -.231333(*)

.053895 .053895

.375 .012

-.34518 -.43118

.05451 -.03149

96

22

23

24

33

-.119667

.053895

.678

-.31951

34

-.040667

.053895

1.000

-.24051

.08018 .15918

41

-.223333(*)

.053895

.017

-.42318

-.02349

42

-.126667

.053895

.593

-.32651

.07318

43

-.130333

.053895

.548

-.33018

.06951

44 11

.050333 -.277000(*)

.053895 .053895

1.000 .001

-.14951 -.47685

.25018 -.07715

12

-.336333(*)

.053895

.000

-.53618

-.13649

13

-.203333(*)

.053895

.043

-.40318

-.00349

14

-.046000

.053895

1.000

-.24585

.15385

21

-.031667

.053895

1.000

-.23151

.16818

23

.039667

.053895

1.000

-.16018

.23951

24

.148667

.053895

.340

-.05118

.34851

31 32

-.177000 -.263000(*)

.053895 .053895

.128 .002

-.37685 -.46285

.02285 -.06315

33 34 41

-.151333 -.072333 -.255000(*)

.053895 .053895 .053895

.314 .991 .004

-.35118 -.27218 -.45485

.04851 .12751 -.05515

42

-.158333

.053895

.251

-.35818

.04151

43

-.162000

.053895

.222

-.36185

.03785

44

.018667

.053895

1.000

-.18118

.21851

11

-.316667(*)

.053895

.000

-.51651

-.11682

12

-.376000(*)

.053895

.000

-.57585

-.17615

13 14

-.243000(*) -.085667

.053895 .053895

.007 .959

-.44285 -.28551

-.04315 .11418

21

-.071333

.053895

.992

-.27118

.12851

22

-.039667

.053895

1.000

-.23951

.16018

24

.109000

.053895

.796

-.09085

.30885

31

-.216667(*)

.053895

.023

-.41651

-.01682

32

-.302667(*)

.053895

.000

-.50251

-.10282

33

-.191000

.053895

.073

-.39085

.00885

34 41 42 43

-.112000 -.294667(*) -.198000 -.201667(*)

.053895 .053895 .053895 .053895

.765 .000 .054 .046

-.31185 -.49451 -.39785 -.40151

.08785 -.09482 .00185 -.00182

44

-.021000

.053895

1.000

-.22085

.17885

11

-.425667(*)

.053895

.000

-.62551

-.22582

12 13

-.485000(*) -.352000(*)

.053895 .053895

.000 .000

-.68485 -.55185

-.28515 -.15215

14

-.194667

.053895

.063

-.39451

.00518

21

-.180333

.053895

.113

-.38018

.01951

22 23

-.148667 -.109000

.053895 .053895

.340 .796

-.34851 -.30885

.05118 .09085

31

-.325667(*)

.053895

.000

-.52551

-.12582

32

-.411667(*)

.053895

.000

-.61151

-.21182

33

-.300000(*)

.053895

.000

-.49985

-.10015

34

-.221000(*)

.053895

.019

-.42085

-.02115

41

-.403667(*)

.053895

.000

-.60351

-.20382

42

-.307000(*)

.053895

.000

-.50685

-.10715

97

31

32

33

34

43 44 11

-.310667(*) -.130000 -.100000

.053895 .053895 .053895

.000 .552 .877

-.51051 -.32985 -.29985

-.11082 .06985 .09985

12 13

-.159333 -.026333

.053895 .053895

.243 1.000

-.35918 -.22618

.04051 .17351

14

.131000

.053895

.540

-.06885

.33085

21

.145333

.053895

.375

-.05451

.34518

22 23

.177000 .216667(*)

.053895 .053895

.128 .023

-.02285 .01682

.37685 .41651

24

.325667(*)

.053895

.000

.12582

.52551

32

-.086000

.053895

.958

-.28585

.11385

33

.025667

.053895

1.000

-.17418

.22551

34

.104667

.053895

.838

-.09518

.30451

41

-.078000

.053895

.981

-.27785

.12185

42

.018667

.053895

1.000

-.18118

.21851

43 44

.015000 .195667

.053895 .053895

1.000 .060

-.18485 -.00418

.21485 .39551

11 12 13

-.014000 -.073333 .059667

.053895 .053895 .053895

1.000 .989 .999

-.21385 -.27318 -.14018

.18585 .12651 .25951

14

.217000(*)

.053895

.023

.01715

.41685

21 22

.231333(*) .263000(*)

.053895 .053895

.012 .002

.03149 .06315

.43118 .46285

23

.302667(*)

.053895

.000

.10282

.50251

24

.411667(*)

.053895

.000

.21182

.61151

31

.086000

.053895

.958

-.11385

.28585

33

.111667

.053895

.768

-.08818

.31151

34

.190667

.053895

.074

-.00918

.39051

41

.008000

.053895

1.000

-.19185

.20785

42 43

.104667 .101000

.053895 .053895

.838 .869

-.09518 -.09885

.30451 .30085

44

.281667(*)

.053895

.001

.08182

.48151

11

-.125667

.053895

.605

-.32551

.07418

12 13 14 21

-.185000 -.052000 .105333 .119667

.053895 .053895 .053895 .053895

.094 1.000 .832 .678

-.38485 -.25185 -.09451 -.08018

.01485 .14785 .30518 .31951

22

.151333

.053895

.314

-.04851

.35118

23

.191000

.053895

.073

-.00885

.39085

24 31

.300000(*) -.025667

.053895 .053895

.000 1.000

.10015 -.22551

.49985 .17418

32

-.111667

.053895

.768

-.31151

.08818

34

.079000

.053895

.979

-.12085

.27885

41

-.103667

.053895

.847

-.30351

.09618

42

-.007000

.053895

1.000

-.20685

.19285

43

-.010667

.053895

1.000

-.21051

.18918

44

.170000

.053895

.167

-.02985

.36985

11 12

-.204667(*) -.264000(*)

.053895 .053895

.040 .002

-.40451 -.46385

-.00482 -.06415

98

41

42

43

13

-.131000

.053895

.540

-.33085

.06885

14

.026333

.053895

1.000

-.17351

.22618

21 22 23

.040667 .072333 .112000

.053895 .053895 .053895

1.000 .991 .765

-.15918 -.12751 -.08785

.24051 .27218 .31185

24

.221000(*)

.053895

.019

.02115

.42085

31

-.104667

.053895

.838

-.30451

.09518

32 33

-.190667 -.079000

.053895 .053895

.074 .979

-.39051 -.27885

.00918 .12085

41

-.182667

.053895

.103

-.38251

.01718

42

-.086000

.053895

.958

-.28585

.11385

43

-.089667

.053895

.942

-.28951

.11018

44

.091000

.053895

.935

-.10885

.29085

11

-.022000

.053895

1.000

-.22185

.17785

12

-.081333

.053895

.973

-.28118

.11851

13 14

.051667 .209000(*)

.053895 .053895

1.000 .033

-.14818 .00915

.25151 .40885

21

.223333(*)

.053895

.017

.02349

.42318

22

.255000(*)

.053895

.004

.05515

.45485

23 24 31 32

.294667(*) .403667(*) .078000 -.008000

.053895 .053895 .053895 .053895

.000 .000 .981 1.000

.09482 .20382 -.12185 -.20785

.49451 .60351 .27785 .19185

33

.103667

.053895

.847

-.09618

.30351

34

.182667

.053895

.103

-.01718

.38251

42

.096667

.053895

.901

-.10318

.29651

43

.093000

.053895

.924

-.10685

.29285

44

.273667(*)

.053895

.001

.07382

.47351

11

-.118667

.053895

.690

-.31851

.08118

12 13

-.178000 -.045000

.053895 .053895

.123 1.000

-.37785 -.24485

.02185 .15485

14

.112333

.053895

.761

-.08751

.31218

21

.126667

.053895

.593

-.07318

.32651

22 23

.158333 .198000

.053895 .053895

.251 .054

-.04151 -.00185

.35818 .39785

24

.307000(*)

.053895

.000

.10715

.50685

31 32 33

-.018667 -.104667 .007000

.053895 .053895 .053895

1.000 .838 1.000

-.21851 -.30451 -.19285

.18118 .09518 .20685

34 41

.086000 -.096667

.053895 .053895

.958 .901

-.11385 -.29651

.28585 .10318

43

-.003667

.053895

1.000

-.20351

.19618

44

.177000

.053895

.128

-.02285

.37685

11

-.115000

.053895

.732

-.31485

.08485

12

-.174333

.053895

.142

-.37418

.02551

13

-.041333

.053895

1.000

-.24118

.15851

14

.116000

.053895

.721

-.08385

.31585

21 22

.130333 .162000

.053895 .053895

.548 .222

-.06951 -.03785

.33018 .36185

99

23

.201667(*)

.053895

.046

.00182

.40151

24

.310667(*)

.053895

.000

.11082

.51051

31

-.015000

.053895

1.000

-.21485

.18485

32

-.101000

.053895

.869

-.30085

.09885

33 34 41

.010667 .089667 -.093000

.053895 .053895 .053895

1.000 .942 .924

-.18918 -.11018 -.29285

.21051 .28951 .10685

42 44

.003667 .180667

.053895 .053895

1.000 .111

-.19618 -.01918

.20351 .38051

11

-.295667(*)

.053895

.000

-.49551

-.09582

12

-.355000(*)

.053895

.000

-.55485

-.15515

13

-.222000(*)

.053895

.018

-.42185

-.02215

14

-.064667

.053895

.997

-.26451

.13518

21

-.050333

.053895

1.000

-.25018

.14951

22

-.018667

.053895

1.000

-.21851

.18118

23 24

.021000 .130000

.053895 .053895

1.000 .552

-.17885 -.06985

.22085 .32985

31

-.195667

.053895

.060

-.39551

.00418

32

-.281667(*)

.053895

.001

-.48151

-.08182

33

-.170000

.053895

.167

-.36985

.02985

34

-.091000

.053895

.935

-.29085

.10885

41 -.273667(*) 42 -.177000 43 -.180667 * The mean difference is significant at the .05 level.

.053895 .053895 .053895

.001 .128 .111

-.47351 -.37685 -.38051

-.07382 .02285 .01918

44

Keterangan : 11 12 13 21 22 23 31 32 33 41 42 43

C2 C4 C8 C2+ConA C4+ConA C8+ConA C2+LPS C4+LPS C8+LPS C2+PK C4+PK C8+PK