INFLAMMATOIRE PARAMETERS VAN ZIEKTEACTIVITEIT BIJ MULTIPLE SCLEROSE: IMMUNOLOGISCHE EN POSITRON EMISSIE TOMOGRAFISCHE STUDIE 3

INHOUDSTAFEL

INFLAMMATOIRE PARAMETERS VAN ZIEKTEACTIVITEIT BIJ MULTIPLE SCLEROSE: IMMUNOLOGISCHE EN POSITRON EMISSIE TOMOGRAFISCHE STUDIE DANKWOORD SITUERING VAN HET PROEFSCHRIFT

I. OMTRENT MULTIPLE SCLEROSE (MS) I. ASPECTEN ROND MS

1 Historiek van Multiple Sclerose. 2 Diagnose van Multiple Sclerose 3 Het natuurlijk verloop en epidemiologie van Multiple Sclerose 4 Genetische aspecten van Multiple Sclerose 5 Ziekte-specifieke therapieën bij Multiple Sclerose II IMMUNOLOGISCHE ASPECTEN VAN MS

1) Het EAE model 2) Cellulaire immuniteit 3) Humorale immuniteit 4) Cytokines 5) Caspasen 6) Matrix metalloproteïnasen III BEELDVORMING IN MS

1) Magnetische Resonantie 2) Magnetische Resonantie Spectroscopie 3) Magnetische Transfer Imaging 3) Magnetische Transfer Imaging 4) Functionele Magnetische Resonantie beelden (fMRI) 4) Functionele Magnetische Resonantie beelden (fMRI) 5) Positron Emissie Tomografie

3 5 7

9 9

9 12 16 19 21 29

31 31 33 33 34 35 37

37 39 39 41 41 43 45

II. DOELSTELLING

55

III. STUDIES

59

I. IN VITRO TNF-Α, IL-2 AND IFN-Γ PRODUCTION AS MARKERS OF RELAPSES IN MULTIPLE SCLEROSIS 60 II. SEMIQUANTIFICATION OF THE PERIPHERAL-TYPE BENZODIAZEPINE LIGAND [11C]PK11195 IN NORMAL HUMAN BRAIN AND APPLICATION IN MULTIPLE 70 SCLEROSIS PATIENTS III. PET VISUALIZATION OF MICROGLIA IN MULTIPLE SCLEROSIS PATIENTS USING [11C]PK11195 91 IV. MICROGLIAL IMAGING WITH POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY AND ATROPHY MEASUREMENTS WITH MAGNETIC RESONANCE IMAGING IN 107 MULTIPLE SCLEROSIS: A CORRELATIVE STUDY

debruyne j.

1

IV. DISCUSSIE 1 CYTOKINEN IN BLOED EN INFLAMMATIE BIJ MS 2 MICROGLIA EN INFLAMMATIE IN MS 3 NIEUWE INZICHTEN EN TOEKOMSTPERSPECTIEVEN OMTRENT IMMUNOLOGISCHE PARAMETERS IN MS EN BEELDVORMING MET [11C]-(R)-PK11195 PET SCAN

125 125 128 133

V SAMENVATTING, SUMMARY, RESUMÉ

139

VI. REFERENTIES

149

VII BIJLAGE

175

1 MULTIPLE SCLEROSE TIJDSCHR. VOOR GENEESKUNDE, 50, NR. 16, 1994 2 RISKS OF MULTIPLE SCLEROSIS IN RELATIVES OF PATIENTS IN FLANDERS, BELGIUM JOURNAL OF NEUROLOGY, NEUROSURGERY, AND PSYCHIATRY 1997;62: 329-333 3 DE IMMUNOLOGIE VAN MULTIPLE SCLEROSE TIJDSCHR. VOOR GENEESKUNDE, 55, NR. 23, 1999 4 INTERFERON-BETA THERAPIE BIJ MULTIPLE SCLEROSE TIJDSCHR. VOOR GENEESKUNDE, 55, NR. 23, 1999

VIII LIJST MET AFKORTINGEN

2

177 183 188 194

200

debruyne j.

INFLAMMATOIRE PARAMETERS VAN ZIEKTEACTIVITEIT BIJ MULTIPLE SCLEROSE: IMMUNOLOGISCHE EN POSITRON EMISSIE TOMOGRAFISCHE STUDIE Deze titel berust op de volgende studies: I. IN VITRO TNF-α, IL-2 AND INF-γ PRODUCTION AS MARKERS OF RELAPSES IN MULTIPLE SCLEROSIS Jan Philippé Dereuck a

a,c

, Jan Debruyne

b,c

, Geert Leroux-Roels b, Annick Willems b, Jacques

a

Labaratory of Clinical Chemistry, Microbiology and Immunology, Ghent University Hospital De Pintelaan 185, B-9000 Ghent, Belgium b .Department of Neurology, Ghent University Hospital, De Pintelaan 185, B-9000 Ghent, Belgium c Both authors contributed equally to this manuscript

Clinical Neurology and Neurosurgery 98 (1996) 286-290 II. SEMIQUANTIFICATION OF THE PERIPHERAL-TYPE BENZODIAZEPINE LIGAND [11C]PK11195 IN NORMAL HUMAN BRAIN AND APPLICATION IN MULTIPLE SCLEROSIS PATIENTS Jan C. Debruyne1,7, Koen J. Van Laere2,7, Jan Versijpt2, Filip De Vos3, Johan Keppens Eng2, Karel Strijckmans4, Patrick Santens1, Eric Achten5, Guido Slegers3, Jacob Korf6, Rudi A.Dierickx2, Jacques L. De Reuck1 1

Department of Neurology, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium Division of Nuclear Medecine, Ghent University Hospital 3 Laboratory of Radiopharmacy, Ghent University 4 Laboratory of Analytical Chemistry, Institute for Nuclear Sciences, Ghent University 5 Department of Radiology, MR-Unit, Ghent University Hospital 6 Department of Biological Psychiatry, Groningen, the Netherlands 7 Both authors contributed equally to this manuscript 2

Acta neurol.belg. 2002, 102, 127-135.

debruyne j.

3

III. PET VISUALIZATION OF MICROGLIA IN MULTIPLE SCLEROSIS PATIENTS USING [11C]PK11195 J.C. Debruynea,g, J. Versijptb,g, K. J. Van Laereb, F. De Vosc, J. Keppensb,K. Strijckmansd, E. Achtene,G. Slegersc, R.A. Dierckxb, J. Korff and J. L. De Reucka a

Department of Neurology, Ghent University Hospital, Ghent , Belgium; bDivision of Nuclear Medecine, Ghent University Hospital; cLaboratory of Radiopharmacy, Ghent University; dLaboratory of Analytical Chemistry, Institute for Nuclear Sciences, Ghent University; eDepartment of Radiology, MR-Unit, Ghent University Hospital, and f Department of Biological Psychiatry, University Hospital, Groningen, The Netherlands; g Both authors contributed equally to this manuscript Eur J Neurol 2003, 10: 257-264 IV.MICROGLIAL IMAGING WITH PET AND ATROPHY WITH MRI IN MS: RELATIONSHIP AND CLINICAL CORRELATES J. Versijpt PhD1,6,7, JC Debruyne MD2,7, KJ Van Laere PhD3, F.De Vos PhD3, J.Keppens Eng1, K Strijckmans PhD4, E Achten PhD5, G Slegers PhD3, RA Dierickx PhD1, J Korf PhD6, JL De Reuck PhD2 1

Division of Nuclear Medecine, Ghent University Hospital Department of Neurology, Ghent University Hospital 3 Laboratory of Radiopharmacy, Ghent University 4 Laboratory of Analytical Chemistry, Institute for Nuclear Sciences, Ghent University 5 Department of Radiology, MR-Unit, Ghent University Hospital 6 Department of Biological Psychiatry, University Hospital, Groningen, The Netherlands 7 Both authors contributed equally to this manuscript 2

Multiple Sclerosis, in press

4

debruyne j.

Dankwoord Een proefschrift maken tijdens een professionele carrière, tussen de dagelijkse activiteiten en huiselijke beslommeringen door, is voor een klinisch neuroloog geen sinecure. De agenda staat vol, de praktijk en patiënten hebben hun rechten, vergaderingen en verplichtingen kunnen niet worden uitgesteld. Het tot stand brengen van dit werk heeft gedurende vier jaar mijn activiteiten in een hoge mate beïnvloed. Ik wist duidelijk niet waaraan ik begon, dat is mij de daaropvolgende jaren zeer duidelijk geworden. Wetenschappelijk werk verrichten was evenwel een uitzonderlijke gelegenheid om een meerwaarde te leveren aan mijn klinisch werk in MS. Het resulteerde uiteindelijk in een grote betrokkenheid met de individuele patiënt. Ik heb de kans die me geboden werd om dit boeiend thema uit te werken met beide handen aangegrepen en ervaren als een positieve uitdaging om een bijdrage te kunnen leveren aan de medische research in een domein dat mij dierbaar is. De eerste episode van 2 jaar bestond uit wekelijkse consultaties met klinisch onderzoek, bloedprik en analyses. Dit heb ik gedaan in samenwerking met Jan Philippé, klinisch bioloog, in de dienst klinische biologie van Prof. G. Leroux-Roels. Een schoolvoorbeeld hoe een wetenschappelijke samenwerking dient te verlopen: sportief, kameraadschappelijk en degelijk. Ik heb zeer goede herinneringen aan deze periode. Een tweede episode was deze van de PET - en MR scanning in het centrum van Nucleaire Wetenschappen in de Proeftuinstraat en de MR unit. De samenwerking tussen die 2 diensten verliep, tot mijn grote voldoening zeer vlot. Dit was alweer een zorg minder, gezien mijn ingewikkelde taak voor het organiseren van de opeenvolgende onderzoeken. Elke donderdagnamiddag kon ik rekenen op de medewerking van een vast team met onder meer Karel Strijckmans, Filip de Vos, , Johan Keppens. Een samenwerking waar ik met veel genoegen op terugblik. Aan problemen heeft het nochtans niet ontbroken: defecten aan toestellen waren legio en soms liep de analyse van de radioligand mis. Regelmatig dienden patiënten onverrichter zake terug te keren naar huis. Er ontstond ook vaak tandengeknars bij het coördineren van de afspraken tussen de verschillende actoren. Het ontdekken van een MR-scan met gadolinium captatie bij de MS patiënt kwam bijvoorbeeld altijd onverwacht maar werd een dringend sein voor het in gang zetten van de ganse carrousel: patiënt in spoed verwittigen, de PET camera reserveren, het team oproepen. Dat dit allemaal lukte dank ik aan de flexibiliteit en maximale goodwill van alle betrokken partijen. De derde episode was voorbestemd voor hersenarbeid. Voor het belangrijke technische en statistische gedeelte van de studie kon ik beroep doen op Jan Philippé, Koen Van Laere en Jan Versijpt (dienst Nucleaire Geneeskunde Dir. Prof. Dr. Dierickx), zeer onderlegde en toegewijde collegae, zonder wiens hulp en steun ik dit werk niet tot een goed einde had kunnen brengen. Mijn erkenning voor hun medewerking is van harte en welgemeend. Ik ben ook veel dank verschuldigd aan al de patiënten die belangeloos en met grote inzet aan mijn studie hebben meegewerkt. Ze werden niet vergoed en er was geen direct therapeutisch nut aan verbonden. Niettegenstaande hun fysische handicap moesten zij soms verre verplaatsingen maken en een ganse namiddag blijven voor onderzoek. Ze bleven steeds enthousiast en belangstellend mijn project volgen. Mijn dank gaat naar mijn promotor Prof. Jacques. De Reuck. Hij wist dat dit project een lang en lastig traject zou afleggen. Hij heeft mij steeds aangespoord om in moeilijke momenten de moed niet te verliezen. debruyne j.

5

Mijn grootste dank en genegenheid gaat naar mijn dierbare echtgenote en kinderen. Niemand beter dan zij weten welke opoffering zo’n werk inhoudt. Zelden thuis, ’s avonds en op zaterdag studie, en dit gedurende 4 jaar. De zondag werd door mijn vrouw opgeëist om samen bij de kinderen te zijn. Ik ben hen allen dankbaar voor hun moed en volharding om in mij te geloven en geduldig te blijven wachten tot op betere tijden. Ik erken dat ik tegenover hen veel goed te maken heb.

6

debruyne j.

Situering van het proefschrift Als gevolg van mijn interesse voor MS, die meer dan 10 jaar geleden resulteerde in het organiseren van een MS-polikliniek leek het niet meer dan logisch dat de keuze voor een onderwerp voor een doctoraat zich op dit vlak zou situeren. Hoe langer en intensiever ik bij dit thema betrokken ben hoe meer ik bewust werd van de complexiteit van deze aandoening die personen met MS fysisch en psychisch zo wezenlijk aantast. In de algemene introductie worden in een eerste deel enkele aspecten rond MS behandeld. In een tweede gedeelte wijd ik wat uit over de basiskennis omtrent immunologie en beeldvorming bij MS. Dit is belangrijk om de 2 specifieke thema’s van mijn thesis: namelijk: cytokines in bloed en inflammatie bij MS en microglia en inflammatie bij MS, beter te begrijpen. Daarbij aansluitend zal ik verwijzen naar mijn eigen artikelen over deze onderwerpen in een bijlage achteraan in het proefschrift. Bij de doelstellingen van de studie zullen een aantal hypothesen worden aangereikt. In het immunologisch gedeelte zoeken wij naar de relevantie van een aantal biologische markers voor de ziekteactiviteit in het verloop van MS. In het bijzonder willen wij nagaan of TNF-α in de praktijk een bruikbare waarde kan hebben in het voorspellen van een klinische opstoot bij MS. In het beeldvorminggedeelte vertrekken wij van de inflammatoire eigenschappen van de geactiveerde microglia in MS. Met [11C]PK11195 PET-scan willen wij de rol van de microglia aantonen in het demyelinisatieproces in de focale letsels en in de normaal ogende witte stof. PK11195 is een selectieve ligand van de benzodiazepine receptoren op de microglia. Tenslotte onderzoeken wij of er een verband bestaat tussen microgliale activiteit en hersenatrofie. Deze hypothesen zullen worden uitgewerkt in 4 studies. Het eerste artikel is gefocust op het immunologische thema: in een longitudinale studie meten wij in vitro concentraties van cytokinen bij MS patiënten en vergelijken ze met gezonde personen. De overige 3 artikels zijn PET studies. In het eerste artikel beschrijven we een semi-kwantitatieve methode voor het meten van de concentratie van de ligand opnamen in gezonde personen en personen met MS. In de volgende artikels bestuderen wij het pathofysiologisch gedrag van geactiveerde microglia in MS door middel van [11C]PK11195 PET in een cross - sectionale studie over een ziekteverloop van 30 jaar. Daarna gaan wij de relatie na tussen de microgliaal geïnduceerde neuroinflammatie en hersenatrofie. In het eerste deel van de discussie wordt besproken hoe pro-inflammatoire cytokinen zoals INF-γ en IL-2 gestegen zijn en bloed monocytaire cellen geactiveerd zijn tijdens de exacerbaties en wat het nut is van seriële bepalingen van in vitro TNF-α productie in het voorspellen van klinische opstoten. Tevens wordt een link gelegd naar de huidige inzichten in het immuno-pathogenetische mechanisme van MS en de recente beschikbare biologische markers van inflammatie in MS. In het tweede deel benadrukken we de potentieel immune capaciteiten van de microglia cellen zowel als antigen presenterende cellen als intrinsieke effector cellen door produktie van myelinotoxische factoren. We bespreken de eigenschappen en beperkingen van debruyne j.

7

[11C]PK11195 PET scan als in vivo merker van inflammatie en progressie in MS en verwijzen naar recente studies van neuropathologische beeldvorming. In de samenvatting tenslotte wordt gewezen op de belangrijke rol van neuroinflammatie in het ziekteproces van MS, hoe neuroinflammatie axonale beschadiging voorafgaat en het axonaal verlies aan de basis ligt van hersenatrofie. Niettegenstaande de dringende noodzaak werden tot op heden geen specifeke markers van ziekteactiviteit ontwikkeld.

8

debruyne j.

I. OMTRENT MULTIPLE SCLEROSE (MS) I. ASPECTEN ROND MS

1 Historiek van Multiple Sclerose. De eerste beschrijving van de aandoening in het centrale zenuwstelsel die wij nu als multiple sclerose (MS) beschouwen werd gepubliceerd door R Carswell (1793-1857) in 1838 [Carswell 1838], kort daarop gevolgd door J Cruveilhier (1791-1874) die een atlas publiceerde in 1842 met anatomische beelden van plaques in de hersenen en het ruggenmerg [Cruveilhier 1842]. De eerste relapsingremitting gevallen en zelfs J. Cruveilhier mentale stoornissen werden beschreven door W.Valentiner in 1856 [Valentiner 1856]. De demyelinisatie letsels werden voor het eerst aangetoond door C. Fromann in 1864 [Fromann 1864]. Met andere woorden, de belangrijkste karakteristieken van MS werden reeds herkend in het midden van de jaren 1800. Een belangrijke bijdrage daartoe halen wij uit de nauwkeurige notities van een beroemde patiënt: namelijk, A d’Esté (1794-1848), een onwettige zoon van George III en dus beschouwd als neef van Koningin Victoria. Zijn dagboek begon nog 16 jaar voor de beschrijving van R. Carswell. Zijn ziekte eindigde fataal 20 jaar voor de bijdrage van J.M.Charcot [Firth 1949]. Het was dus wachten op J M Charcot (18251893) werkend in de Salpêtrière in Parijs, toen hij in 1868 verschillende observaties bij elkaar bracht en een precieze pathofysiologische interpretatie gaf van de aandoening [Charcot 1868]. Van hem is de triade bekend waarbij nystagmus, gescandeerde spraak en intentietremor als pathognomonisch werd beschouwd voor de ziekte. Charcot merkte dat axonale en neuronale aantasting in het pathologisch proces aanwezig waren. Het belang van deze hypothese werd recentelijk terug onder de aandacht gebracht als een bijlangrijk mechanisme in het verloop van de J.M. Charcot debruyne j. 9 R. Carswell

ziekte onder meer door histopathologisch werk van B Trapp [Trapp et al. 1998]. J.M.Charcot was er reeds van overtuigd dat demyelinisatie de oorzaak was van de symptomen bij MS. Dit was volgens hem te wijten aan het onderbreken van electrische conductie. Dit werd proefondervindelijk aangetoond door D. Denny-Brown [Denny-Brown and Brenner 1944] in 1944 en pathofysiologisch door A Huxley in 1949 [Huxley and Stämpfli 1949]. Leerlingen van J.M.Charcot, zoals J.Babinski, toonden in hun histologisch werk de aanwezigheid aan van macrofagen langsheen de gedemyeliniseerde axonen [Babinski 1885]. Omtrent de juiste etiologie was in de tijd van J.M.Charcot niets bekend. Op het einde van de 20ste eeuw evenwel dacht P.Marie dat er een infectie aan de basis van MS lag bv door spirocheten, de zogenaamde ”spherula insularis” [Marie P. 1895]. Later werd de hypothesis van een virale infectie naar voorgebracht, evenwel zonder objectieve bewijzen. Een primaire virale infectie werd nooit in de hersenen van MS patiënten aangetoond niettegenstaande demyeliniserende hersenziekten, veroorzaakt door een virale infectie, bij dieren werden beschreven. In de 20ste eeuw werd, dank zij nieuwe research technieken en het ontstaan van nieuwe disciplines in de geneeskunde, zoals fysica, moleculaire biologie en genetica, de complexiteit van MS erkend. In 1906 beschreef O.Marburg een acute, snelle en fataal evoluerende vorm van MS [Marburg 1906] en in 1916 leverde J.Dawson (1870-1927) het histologisch beeld van de ziekte waarbij hij de voortschrijdende perivasculaire inflammatiehaarden beschreef. De bekende “Dawson Fingers” [Dawson 1916]. T Broman toonde de aanwezigheid van de bloedhersen-barriére aan in 1947. Een cruciale stap in het J. Dawson onderzoek van de MS plaque [Broman 1951]. Daarna was het wachten tot de jaren 1960 met de introductie van nieuwe technieken zoals de elektronenmicroscopie, histochemie en immunohistochemie. In de laatste 3 decaden werden de immunopathologische veranderingen in letsels en in normaal ogende witte stof gedocumenteerd door H. Lassmann [Lassmann 1983] en C Raine [Raine 1994]. Het bestaan van verschillen in de gliale cellijn tussen knaagdieren en volwassen personen werd aangetoond door M. Raff en collega’s in de jaren ’80 [Raff 1989]. Hun gedrag van celdeling, differentiatie tot astrocyten, microglia en oligodendrogliacellen, hun migratie en hoe ze reageren in normale en pathologische condities van het centrale zenuwstel werden beschreven door A.Compston [Compston 1998] in de jaren ’90. Remyelinisatie, waardoor de conductieblok hersteld werd, werd aangetoond door M.Bunge in 1961.[Bunge GE et al. 1961] T. Broman

10

debruyne j.

De diagnose van MS werd in de loop van de vorige eeuw stapsgewijze verfijnd. In het begin werd de diagnose op louter klinische basis gesteld. De meest gebruikte criteria tot begin de jaren 1980 waren deze van G.Schumacher [Schumacher 1974]. Vanaf 1891 werd de lumbaal vocht analyse geïntroduceerd door Quincke [Quincke H 1891]. In 1925 werd de lumbaal vochtanalyse toegepast bij MS waarbij men een speciale abnormaliteit waarnam, namelijk: “de paretische colloïdale goudkurve“ [Greenfield JG 1925]. Een abnormaliteit die nu bekend staat als oligoclonale banden in het IgG gebied, bij de toepassing van de isoelectric focusing. Voor het eerst werden geëvoceerde potentialen door averaging opgewekt in 1960 na perifere stimulatie door J. Dawson [Dawson 1954]. Tenslotte werd in 1981 de magnetische resonantie (MR) geïntroduceerd [Young et al. 1981]. Deze techniek betekende een revolutie in de diagnose van MS. Dit onderzoek toonde namelijk letsels in meer dan 95% van patiënten met klinisch definitieve MS. Niettegenstaande er in de 19de eeuw een consensus bestond omtrent de pathologische veranderingen bij MS was dit niet het geval voor de pathogenesis waarbij Charcot dacht aan een hyperplasie van de glia en E. Rindfleisch aan “primaire inflammatie” [Rindfleisch E. 1863]. Deze laatste hypothesis werd meer en meer gesteund door recente immunohistochemische studies waar een T-cell gemedieerde demyelinisatie kon worden aangetoond in overeenstemming met de bevindingen bij experimentele allergische encephalomyelitis (EAE) [Lassmann 1983b]. Naast de immunologische studies speelde de introductie van de MRI en de MRS in de jaren ’80 en ’90 een bijlangrijke rol in het aantonen van deze inflammatie in de nieuwe letsels door het capteren van gadoliniumDTPA te wijten aan de doorbraak van de bloedhersen barriere. Momenteel wordt algemeen aanvaard dat MS een auto-immuun gemedieerde inflammatie ziekte is waarbij bepaalde subsets van geactiveerde T lymfocyten een proinflammatoire rol spelen in de demyelinisatie. H. Lassmann en collega’s hebben evenwel kunnen aantonen op postmortem materiaal dat inflammatie en demyelinisatie zich onafhankelijk van elkaar afspelen en dat op die basis 4 verschillende pathogenetische mechanismen zich kunnen manifesteren [Lucchinetti et al. 1996]. Reeds in 1903 kon worden aangetoond dat de prevalentie van de ziekte volgens geografische distributie verschilt [Bramwell B. 1903]. Verschillende epidemiologische studies hebben aangetoond dat de frequentie van de ziekte afhangt van de plaats van de geboorte, woonplaats, migratieleeftijd en dat algemeen, de grootste prevalentie aanwezig is in het noorden terwijl de prevalentie laag is in het zuidelijk halfrond [Kurtzke 1980]. Onbekende omgevingsfacoren blijken daarbij een rol te spelen zoals aangetoond in de studie van J. Kurtzke waarbij clusters van hoge prevalentie werden aangetroffen in de Faroe-eilanden [Kurtzke and Hyllested 1979]. Genetische factoren blijken eveneens aanwezig. In het begin van de 20ste eeuw werd er een hogere concordantie vastgesteld bij de monozygote (30%) dan bij dizygote tweelingen (2%). Het genetisch patroon blijft tot op heden onbekend. Huidige internationale studies hebben aangetoond dat er geen afzonderlijk vatbaarheidsgen bestaat en dat meerdere genetische factoren, buiten de HLA regio, een rol spelen [Compston 1999]. Op het einde van de 19de eeuw werd MS behandeld met kwik-derivaten. In die tijd deelde men de algemene opvatting van P. Marie [Marie P.1895] dat MS een infectie was. Het gevolg was dat er eveneens een tonsillectomie werd aanbevolen [Baker et al. 1963]. Wegens enig succes in de behandeling van syphilis en de hypothese dat een spirocheet het infectieus agens was bij MS werden organische arsenicum producten toegediend [Buzzard EF. 1911]. Deze behandeling werd nog tot 1950 door Mc Alpine toegepast niettegenstaande de spirocheet theorie reeds in 1929 was verlaten. In 1924 schakelde men over op debruyne j. 11

antimalaria middelen, intramusculaire thyfoïdvaccin-injecties en zelfs op injecties met steriele melk. Dit laatste, om koorts te induceren die, naar men dacht, gunstig was voor de ziekte. Deze behandelingen, meermaals toegepast door Denny-Brown, werden later door hem als obsoleet beschouwd [Denny-Brown 1952]. Een andere behandelingsvorm zoals met jodium, wees naar de “sclerosis” van J.M.Charcot [Marie P.1895]. Anticoagulantia en hyperbare zuurstof in 1930 werden toegepast in de veronderstelling dat MS een ischemische ziekte was. Deze behandelingen werden toegepast tot in de jaren 1980 [Putman TJ. 1937]. Nadien werd nog gedacht aan een metabole pathogenese resulterend in een dieet met poly-onverzadigde vetzuren [Baker et al. 1963]. Deze behandelingsmethoden met de zwakke wetenschappelijke basis waarop zij berustten waren de oorzaak van de negatieve resultaten en de soms desastreuze gevolgen die zij met zich brachten. Momenteel vormen de huidige klinische trials, multidisciplinair, multicentrisch, dubbelblind, placebo-gecontroleerd en gerandomiseerd met intrede van beeldvorming, meer betrouwbare klinische, cognitieve en levenskwaliteitscores, meer garantie voor de betrouwbaarheid van de primaire eindpunten. Het succes van de recente klinische trials hypotheceert evenwel, paradoxaal, toekomstige klinische onderzoeken. Gegeven dat de nieuwe behandeling de ziekteactiviteit negatief beïnvloedt, wordt het steeds moeilijker placebo-gecontroleerde studies, om ethische redenen, te verrechtvaardigen. Daardoor zal een nieuwe aanpak van de studies een nieuwe uitdaging betekenen voor de toekomst.

2 Diagnose van Multiple Sclerose De diagnose van definitieve MS is eerder gemakkelijk: het vaststellen van fysische afwijkingen die overeenstemmen met 2 verschillende plaatsen in het centraal zenuwstelsel (CZS) in een individu met een voorgeschiedenis van op zijn minst 2 episoden van neurologische uitval en waarbij geen betere uitleg voor het klinisch beeld kan worden gevonden dan door MS [Schumacher 1966]. Deze essentiële criteria voor de diagnosis van MS kunnen zelfs op zuiver klinische basis worden vervuld. De meeste neurologen verkiezen evenwel een bevestiging van de diagnose door klinische onderzoeken zoals een abnormale MRI, abnormale geëvoceerde potentialen (EP’s) en liquoranalysis. Nieuwe criteria zijn evenwel noodzakelijk wegens de nieuwe inzichten in de pathogenese van de ziekte. Steeds meer onderzoek wordt uitgevoerd met ziekte-specifieke behandelingen in de eerste stadia van de aandoening waarin spreiding in tijd en ruimte minder duidelijk is. Daarenboven is er de ontwikkeling van nieuwe technologische mogelijkheden zoals de MRI voor het vroegtijdig vaststellen van de diagnose. Nieuwe criteria werden in 1983 voorgesteld door C. Poser [Poser et al. 1983]. De EP’s en de liquoranalysis werden geïncludeerd. Er was toen evenwel nog te weinig ervaring met de nieuw geïntroduceerde MRI om dit onderzoek in de criteria te betrekken. De toegenomen kennis en waarde van dit onderzoek, zelfs voor vroege diagnostiek, is momenteel dermate toegenomen dat de bestaande criteria, door incorporatie van de MR werden herzien met de bedoeling de klassificatie te vereenvoudigen in het licht van de hedendaagse kennis van MS.

12

debruyne j.

In juli 2000 werd een internationaal comité opgericht, samengesteld uit de US Nationale Vereniging voor MS en de MS Internationale Federatie onder leiding van Professor I Mc Donald. Het doel was nieuwe diagnostische criteria voor MS te ontwikkelen. Het resulterend manuscript werd gepubliceerd in the Annals of Neurology in juli 2001 [McDonald et al. 2001]. De algemene conclusies van deze criteria waren: dat de diagnose van MS enkel kan gesteld worden op objectieve bevindingen van letsels verspreid over de tijd en de plaats. De MRIbevindingen kunnen daartoe bijdragen om deze spreiding aan te tonen. Andere onderzoeken die kunnen bijdragen tot de diagnose zijn de de liquoranalyse en de visueel geëvoceerde potentialen [Gronseth and Ashman 2000]. De diagnostische categoriëen werden ingedeeld in mogelijke MS, waarbij de screening onvolledig is of niet alle diagnostische criteria vervuld zijn, definitieve MS of geen MS. Om 2 exacerbaties te kunnen onderscheiden zijn 30 dagen noodzakelijk. De MRI in deze nieuwe diagnostische criteria speelt een bijlangrijke rol. De richtlijnen van J. Barkhof en M. Tintoré bleken de beste combinatie te verschaffen voor de specificiteit en sensitiviteit van het onderzoek [Barkhof et al. 1997; Tintoré M 2000].

debruyne j.

13

14

debruyne j.

Aan 3 van de 4 criteria (zie figuur) dient te worden voldaan (criteria van F. Barkhof en M. Tintoré): 1) minstens 1 gadolinium-capterend letsel of 9 T2 hyperintense letsels 2) tenminste 1 infratentoriëel letsel 3) tenminste 1 juxtacorticaal letsel 4) minstens 3 periventriculaire letsels. Een medullair letsel kan 1 hersenletsel vervangen. Als er oligoclonale banden in de liquor aanwezig zijn, zijn 2 T2-letsels, typisch voor MS, voldoende. Voor spreiding in de tijd kan de MRI eveneens bijlangrijk zijn. Bijvoorbeeld wanneer een MRI 3 maanden of meer na een klinische aanval een nieuw gadolinium letsel aantoont, wijst dit op een nieuwe inflammatie, daar gadolinium-captatie gewoonlijk minder dan 6 weken aanwezig blijft. In het geval dat er geen gadolinium captatie aanwezig is, maar wel een nieuw T2 letsel dan is een controle MRI noodzakelijk na 3 maanden om een nieuw T2 letsel of gadoliniumcapterend letsel aan te tonen. Een nieuw T2 letsel binnen de 30 dagen na een exacerbatie kan niet beschouwd worden als een nieuwe opstoot daar er een periode van 30 dagen noodzakelijk is om 2 verschillende klinische exacerbaties van elkaar te onderscheiden. Door de nieuwe criteria wordt de sensiviteit en specificiteit voor seriële MRI, in de voorspelling van de conversie van klinisch geïsoleerde syndromen naar definitieve MS duidelijk aangetoond, vergeleken met de criteria van Poser [Dalton et al. 2002]. Waarschijnlijk zal door deze nieuwe MS criteria de incidentie van MS niet toenemen, maar de diagnose zal vroeger gesteld worden en zal er een verandering ontstaan in de populatie van patiënten die aan klinische trials deelnemen. Een vroege diagnose van MS geeft de mogelijkheid tot een vroege behandeling van de aandoening. Een onmiskenbare vooruitgang, verwijzend naar de resultaten van de CHAMPS studie [Jacobs et al. 2000] en de ETOMS studie [Comi et al. 2001]. In deze studies werd namelijk aangetoond dat een conversie naar definitieve MS door vroege behandeling wordt uitgesteld. Momenteel is het reeds mogelijk om myeline basisch proteïne (MBP) materiaal in de urine op te sporen. De belangrijkste biologische component werd geidentificeerd als Pcresolsulfaat. Er werd vastgesteld dat deze stof normaal is bij relapsing-remitting (RR) MS maar gestegen bij secondair-progressieve (SP) MS en in minder mate bij PP MS [Bashir and Whitaker 1999]. Deze bevinding correleert dus niet met de ziekteactiviteit bij MS. De stijging van de concentratie heeft wel zijn betekenis bij de overgang van RR naar SP MS [Whitaker et al. 2001]. Deze stof kan dus dienen als een merker van de overgang naar een progressieve vorm van MS. Als conclusie kunnen we stellen dat MS de laatste 10 jaar een ziekte geworden is die behoort tot de partiëel behandelbare neurologische aandoeningen. Daarenboven bewijzen verschillende studies een toenemende tendens om zo snel mogelijk te starten met behandelen eens de diagnose gesteld is. We hanteren nu nieuwe diagnostische richtlijnen die gecorreleerd worden aan onze toenemende ervaring met MRI die zullen leiden tot een snellere diagnose en behandeling.

debruyne j.

15

3 Het natuurlijk verloop en epidemiologie van Multiple Sclerose 1) Het natuurlijk verloop van MS Het natuurlijk verloop van MS is tegenwoordig goed gedocumenteerd door talrijke grote studies [Wingerchuk and Weinshenker 2000]. De prognose van MS dekt het ganse spectrum van asymptomatische, tot goedaardige en kwaadaardige gevallen. Het probleem blijft evenwel om een accurate prognose te maken bij een individuele patiënt. Een aantal klinische voortekenen die vroegtijdig in de ziekte aanwezig zijn blijkt toch een De klassificatie van het begin en het verloop van belangrijke bijdrage te leveren Multiple Slerosis [Myhr et al. 2001]. Een grote kans op een goede prognose kan bijvoorbeeld worden voorspeld bij een jonge vrouwelijke patiënte met een neuritis optica of met sensibele symptomen, een relapsing- remitting verloop een lang interval tussen de eerste 2 opstoten en een lange periode tussen het begin van de ziekte en het bereiken van een score 3 op de EDSS (Expanded Disability Status Scale) [Kurtzke 1983]. Momenteel wordt er meer en meer gebruik gemaakt van de Multiple Sclerosis Functional Composite Scale (MSFC) omdat naast de motorische afwijkingen eveneens een noodzaak bestaat om de mentale gevolgen van de ziekte in score te brengen. Gebleken is namelijk dat de MSFC beter correleert met de T1 en T2 gewogen letseldichtheid bij de magnetische resonantie beelden (MRI) en met hersenatrofie dan de EDSS [Kalkers et al. 2001]. De aanwezigheid van oligoclonale banden in het gammagebied, vroeg in de aandoening, blijkt geassocieerd te zijn met een slechte prognose [Amato and Ponziani 2000]. Het HLA-DR15 allele staat voor een goede prognose [Hensiek et al. 2002]. Het omgekeerde fenomeen werd aangetoond met het apolipoproteïne E4 allele. Dit allele wordt geassocieerd met een snelle progressie van de ziekte [Chapman et al. 2001]. De voorspellende waarde van de MRI wordt gelimiteerd door zijn lage specificiteit (T2 letsels) en lage sensitiviteit (contrastcapterende letsels). Een 2de MR uitgevoerd na 3 maanden bij monosymptomatische patiënten deed de positieve predictieve waarde en specificiteit voor het ontwikkelen van een definitieve MS toenemen wegens het verschijnen van nieuwe T2 gewogen hyperintensiteiten [Brex et al. 2001]. De veranderingen in de letseldichtheid gezien op een MRI van de hersenen tijdens de eerste 5 jaar correleert met de EDSS na 14 jaar follow-up. [Brex et al. 2002] Meer recent heeft men door middel van nieuwe pathologische studies kunnen aantonen dat de progressie van de ziekte veroorzaakt wordt door chronische diffuse neurodegeneratie [Evangelou et al. 2000] en dat de normaal ogende witte stof (NAWM) door middel van magnetisatie transfer beeldvorming (MTI) en magnetische resonantie spectroscopie(MRS) [Ciccarelli et al. 2001; Arnold 1999] eveneens 16

debruyne j.

strukturele en biochemische afwijkingen vertoont. Vele van deze afwijkingen nemen toe tijdens het ziekteverloop. Hersenatrofie kan bijvoorbeeld reeds worden geobserveerd in de vroege jaren van de ziekte [Rudick et al. 1999]. In de grote Lyon MS-studie over het natuurlijk verloop van MS bij 1844 patiënten werd aangetoond dat vanaf score 4 tot score 7 op de EDSS schaal de graad van progressie van irriversibele invaliteit niet essentieel beïnvloed wordt door de aan- of afwezigheid van een voorafgaande relapsing-remitting fase. Diezelfde studie toonde bovendien aan dat gesuperponeerde aanvallen gedurende de progressieve MS fase eveneens de snelheid van progressie niet wezenlijk veranderden. Daaruit zou men kunnen afleiden dat opstoten niet essentieel zijn voor een irriversibele handicap die ontstaat tijdens het verloop van de ziekte [Confavreux et al. 2000]. De classificatie van Lublin [Lublin and Reingold 1996] van het natuurlijk verloop van het ziekteproces wordt momenteel algemeen toegepast. Er is een verschil tussen de relapsing fase van MS en de secundaire progressieve fase. Er bestaat eveneens een primair progressieve fase, doch zowel bij de secundaire progressieve (SP) als bij de primaire progressieve fase (PP) kunnen zich in de loop van de ziekte relapsen superponeren. Het enige verschil is dat de primair progressieve fase een progressie kent vanaf het begin terwijl er zich bij de SP patiënten eerst een fase van opstoten voordoet. Het fysiopathologisch verschil bestaat erin dat bij de SP MS meer neuroinflammatie voorkomt en dat bij de PP het neurodegeneratief proces meer op de voorgrond staat. Zowel bij de SP MS als bij de PP MS kunnen relapsen voorkomen [Confavreux et al. 2000]. Deze beide categorieën lijken op klinisch gebied sterk op elkaar. Het gevolg van de neuro-inflammatie zijn de klinische aanvallen en het gevolg van de neurodegeneratie is de progressie van de ziekte. Daar de inflammatiefase door behandeling gedeeltelijk kan worden afgeremd, is het belangrijk om ons de komende jaren te concentreren op de neurodegeneratie waarbij gezocht moet worden naar middelen om het CZS te beschermen tegen axonaal verlies en het herstel van de myeline te beïnvloeden. Bijvoorbeeld door het toepassen van autologe stamcellen, door het stimuleren van remyelinisatie [Scolding 2001], of het stimuleren van oligodendrocyten-precursoren [Chang et al. 2002]. 2) Epidemiologie van MS In de zoektocht naar de oorzaak van MS werd de meeste aandacht geschonken aan de rol van een infectieuze component, aan de genetische constellatie van de individuen en meer recent aan een combinatie van genetische en omgevingsfactoren en de invloed ervan op het immuunsysteem. Een definitief antwoord blijft evenwel tot op heden uit. MS blijkt een zeer complexe aandoening te zijn. Het begrijpen van predisponerende factoren die tot MS leiden zou meer inzicht verschaffen in de immunopathogenese van de ziekte. De distributie van MS over de wereld is zeer divers. Genetische en raciale factoren leveren hun bijdrage tot deze heterogene verdeling. Toch zijn er gebieden die, niettegenstaande zij geografisch dicht bij mekaar liggen met een relatief homogene populatie, grote verschillen vertonen voor risico voor MS. De globale prevalentie over de wereld ligt tusssen <5 en >150 gevallen per 100.000 mensen. Er bestaat een breedtegraad gradiënt waarbij de incidentie en prevalentie ratios toenemen naarmate men verder van de evenaar leeft. De variatie tussen de Noord-Zuid gradiënt is evenwel zo groot dat studies van genetisch homogene populaties, wonend in verschillende geografische condities, verder moeten ondernomen worden. Een duidelijke Zuid-Noord gradiënt werd bijvoorbeeld aangetoond in Oost-Australië waar een homogene populatie aanwezig is. Toch werd er een discrepantie in prevalentie aangetoond ten voordele van het Zuiden, niettegenstaande dezelfde debruyne j. 17

genetische constitutie, bepaald door de aanwezigheid van het HLA-DR2 antigen [McLeod et al. 1994]. Het blijft een moeilijke materie als men ziet dat colonkanker, de ziekte van Parkinson en prostaatkanker eveneens een geografische gradiënt vertonen [Schwartz 1992]. Socioculturele condities, industrialisatie, verhoogde hygiëne en vaccinaties werden zonder succes onderzocht. De rol van virussen zoals de Canine Distemper die de capaciteit zou hebben om acute demyelinisatie te induceren [Cook et al. 1995], het Epstein Barr virus met inductie van autoimmuniteit [Campadelli-Fiume et al. 1999; Kimberlin and Whitley 1998], Herpes virus type VI als trigger van een infectie [Cook, Rohowsky-Kochan, Bansil, and Dowling1995], bleven zonder aanknopingspunten. Neurotoxiciteit door hepatitis B infectie werd eveneens enige tijd vooropgesteld [Pirmohamed and Winstanley 1997]. Nadien bleek er evenwel geen causale relatie tussen MS en hepatitis vaccinatie. Hepatitis vaccinatie.zou integendeel meer bescherming dan risico bieden [Tosti et al. 1999]. Hypothesen die rekening houden met de biologische klok, endocrinologische, sympatische, immunologische systemen, licht of vitamine D3 met zijn immunoregulatorische effecten dienen verder te worden onderzocht. Emotionele stress kan het immunologisch systeem aantasten door het gedrag van immunologische cellen te beïnvloeden. Zijn specifieke rol in MS activiteit dient evenwel nog te worden aangetoond [Karaszewski et al. 1993]. Normale effecten, in de zin van normaal dysmorfisme van sekshormonen kunnen een invloed hebben op het immuunsysteem en andere autoimmune ziekten [Beeson 1994]. Zwangerschap veroorzaakt variaties in ziekteactiviteit door veranderingen van sekshormonen en immuniteit. Confavreux toonde in de Europese multicentrische zwangerschapstudie in MS (PRIMS) een vermindering van de relapsfrequentie aan voornamelijk tijdens de laatste 3 maanden van de zwangerschap. Evenwel trad er een opflakkering op tijdens de 3 daaropvolgende postpartum maanden. Zwangerschap lijkt de relaps chronologie positief te beïnvloeden hoewel de aanvalsfrequentie dezelfde blijft vergeleken met het jaar voor de zwangerschap rekening houdend met de postpartum periode [Confavreux et al. 1998]. De rol van omgevingsfactoren op MS is één van de meest complexe aspecten van de ziekte. Hoe zij het risico in MS kunnen beïnvloeden bij genetische vatbare personen en het immunologische apparaat destabiliseren blijft tot nu toe een onopgeloste vraag.

18

debruyne j.

4 Genetische aspecten van Multiple Sclerose 1) Inleiding In het begin van de 21ste eeuw werd de hypothese aangehouden dat MS een polygenetische aandoening was, waarbij verschillende genen bijdragen tot de vatbaarheid van de aandoening, zonder de invloed van omgevingsfactoren daarbij uit te sluiten. Niettegenstaande er onweerlegbare evidentie is dat genetische factoren een rol spelen in MS, is het tot op heden onmogelijk te voorspellen welke consequentie dit zal bieden voor de behandeling van deze ziekte. 2) Genetische epidemiologie De genetische epidemiologie heeft het belang van genetische factoren aangetoond in het risico voor het krijgen van MS. Er is namelijk een toegenomen familiaal risico. Bij monozygote tweelingen van 30% en bij heterozygote tweelingen van 2 tot 5% vergeleken bij het risico die wij terugvinden bij de gewone populatie van 0,1%. Een eerder relatieve bijdrage van de genetica bij MS dient evenwel te worden onderstreept als men weet dat zelfs bij identieke tweelingen waarvan 1 door MS is aangetast er nog steeds 70% kans is dat de ander de ziekte niet krijgt. Daaruit moeten we besluiten dat zelfs in het geval van een volledige opheldering van de genetica bij MS een prenatale diagnose nooit de basis zal vormen voor een gedetailleerd genetisch advies. Het genetisch patroon in MS gelijkt niet op dit van typische ziekten die klassiek dominant, recessief of X-gebonden vormen van overerving met hoge of lage penetrantie vertonen. Wanneer MS voorkomt in de familie gebeurt dit op een onvoorspelbare wijze. Het aantal aangetaste individuen in de familie is eerder klein, statistisch gezien is het risico tijdens het leven onder de 5%. Dit geldt voor de meeste verwanten van MS patiënten. Voor een eerstegraadsverwant betreft dit 3 tot 5%, voor een tweede- en derdegraadsverwant 1,5-2,5% [Sadovnick and Baird 1988]. In uitzonderlijke gevallen evenwel is het risico hoger. Vb. ééneiige tweelingen, beide ouders met MS (“conjugal MS”), een broer/zus plus een ouder met MS.Er zijn ook zeldzame families waarin meer dan 2-3 personen, verspreid over meerdere generaties, getroffen worden door MS. [Dyment et al. 2002]. Door A. Sadovnick kon eveneens worden aangetoond dat het risico voor MS bij halfbroers en halfzusters niet verschilt afhankelijk of zij samen (1-2%) of apart (1-5%) werden opgevoed. Dit bewijst in dit geval dat de omgeving geen rol speelt. Daarnaast werd aangetoond dat een gemeenschappelijke vader of moeder geen invloed heeft op de incidentie van MS bij de nazaten. Dat bewijst dat mitochondriale of x-gebonden vatbaarheid geen rol speelt bij familiale MS [Sadovnick et al. 1996]. In een recente studie van G. Ebers wordt aangetoond dat halfbroers en –zussen van een MS patiënt met een gemeenschappelijke moeder een hoger risico lopen dan halfbroers en – zussen met een gemeenschappelijke vader. Een mogelijke verklaring kan zijn omgevingsfactoren, imprinting maar ook bv mitochondriale vatbaarheid [Ebers et al. 2004]. 3) Kandidaatgenen in MS: 3.1) HLA klasse II Buiten HLA klasse II staat er nog geen enkel ander vatbaarheidsgen vast. Dit feit is in essentie 30 jaar bekend. Er zijn recent een aantal sterke claims gemaakt. Het MBP-gen zou een vatbaarheidsgen zijn dat beperkt is tot een bepaalde subpopulatie in Finland. CD45 werd in één studie gerapporteerd, maar werd niet bevestigd door verschillende andere studies. CD24 werd ook recent gerapporteerd maar er zijn nog geen studies die dit bevestigen of tegenspreken. debruyne j.

19

In het midden van de jaren ’80 ontstond de techniek van het klonen van het HLA klasse II gen [Larhammar et al. 1982]. Sindsdien werd het klasse II polymorfisme bestudeerd door genomische methoden op basis van PCR technieken. Op deze wijze werd bij HLA klasse II gen een MS-specifiek geassocieerd haplotype ontdekt namelijk het Dw2 haplotype met als volledige genomische naam DRBI*1501, DRB5*0101, DQA1*0102, DQB1*0602. In Noord-Amerika en in Europa varieert de frequentie van MS volgens de distributie van het Dw2 haplotype. Het risico voor MS zou daardoor 3 tot 4 keer toenemen. Dit haplotype wordt beschouwd als een merker van een genetische pool van Scandinavische oorsprong [Ebers 1986]. Een mogelijke link naar MS zou kunnen zijn dat het Dw2 fenotype zijn invloed kan aanwenden bij de presentatie van antigenetische peptiden in de periferie of door het orkestreren van een zekere selectie uit het repertoire van T-cel receptoren in de thymus. Daar echter de affiniteit van de binding van de T-cel receptor met de peptide dragende HLA klasse II molecule laag is vergeleken met factoren anders dan deze van het trimoleculaire complex, de zogenaamde tweede signalen(second signals), namelijk de interacties van de moleculen B7-1 en B7-2 op de antigen presenterende cellen (APC’s) met de moleculen CD28 of CTLA-4 op de T-cel, is de rol van HLA klasse II molecule, zelfs met de bijdrage van de gunstige omgevingsfactoren, onvoldoende om de ziekte te veroorzaken. 3.2) Nieuwe kandidaatgenen De laatste jaren is er een bijlangrijke vooruitgang geboekt in de genoomstudies zodat er heden sterke vermoedens zijn van een aantal bijkomende kandidaat-genen en chromosomale regio’s. N. Risch en J. Phillips hebben door middel van koppelingsstudies en de snelheid waarop het risico afneemt met de graad van verwantschap hypothesen over het aantal vatbaarheidsgenen uitgewerkt voor MS. Daarbij kwamen zij tot het besluit dat er ongeveer 5 tot 10 vatbaarheidsgenen bestaan [Risch 1990; Phillips JT. 1993]. Ze zijn gelokaliseerd op de korte armen van de chromosomen 2, 3, 5 en 7 en de lange armen van chromosomen 2, 17, 19. Het betreft gebieden die eveneens genen bevatten die een predispositie voor andere autoimmune aandoeningen vertonen, zowel bij experimentele diermodellen als bij humane autoimmune ziekten [Becker et al. 1998]. In 9 verschillende populaties werden genetische koppelingsstudies van het hele genoom uitgevoerd. In totaal werden meer dan 700 families en meer dan 1500 MS patiënten bestudeerd. In een meta-analyse bereikte de HLA regio het criterium voor genoomwijde significantie en voldeden de regio’s op de lange arm van chromosoom 17 en 22 aan het criterium voor suggestieve koppeling. Vier andere regio’s, met name op de korte arm van chromosoom 2, 10, 11 en 16, waren ook nog veelbelovend. Daarnaast kwamen onder andere de chromosoomregio’s 5p, 7q en 19q opvallend vaak naar voor in de individuele studies. [GAMES and the Transatlantic Multiple Sclerosis Genetics Cooperative. 2003]. In het kader van een Europese samenwerking met de naam Genetic Analysis of Multiple Sclerosis in EuropeanS of GAMES werd in 19 verschillende studiepopulaties, waaronder een Belgische, een associatiestudie van het hele genoom uitgevoerd. Ondanks een aantal technische beperkingen, waaronder de onvoldoende densiteit van de markers, vielen een aantal regio’s op die verder onderzoek verdienen. In de Belgische studie kwamen 3 markers uit de HLA klasse II regio naar voor, die beschouwd kunnen worden als een positieve controle. Daarnaast werd een sterke associatie gevonden met een merker in de HLA klasse I regio [Goris et al. 2003]. Dit komt overeen met andere studies die een vatbaarheidsgen in deze regio suggereren dat onafhankelijk is van het nabijgelegen HLA klasse II [Fogdell20

debruyne j.

Hahn et al. 2000]; [Marrosu et al. 2001]; [Rubio et al. 2002]. Tenslotte werden nog bijkomende markers weerhouden, waarvan sommige in de nabijheid van genen die coderen voor elementen van het immuunsysteem, die verder geverifieerd moeten worden. Momenteel is een meta-analyse van de resultaten van de 19 verschillende populaties, met in totaal meer dan 5000 MS patiënten en meer dan 5000 controles lopende. 4) Conclusie Samenvattend kunnen wij stellen dat bij MS zowel genetische als omgevingsfactoren een rol spelen. De ziekte vertoont een verandering in incidentie over de tijd met een ongelijke geografische distributie over verschillende streken in de wereld. De etiologische bijdrage van de omgevingsfactoren wordt bevestigd uit de migratiestudies waardoor de pathogenese alleen nog complexer wordt. Sadovnick en Ebers hebben aangetoond dat de vatbaarheid voor autoimmune ziekten voor muizen een zaak is van een polygenetische overerving met een penetrantie die sterk wordt beïnvloed door leeftijd, de homogeniteit van de omgeving en virale contaminatie van zich voortplantende generaties. Al deze factoren zijn relevant bij het voorkomen van MS [Sadovnick and Ebers 1993]. Bij risico-analysen blijken geslacht, leeftijd, familiale achtergrond, etnische oorsprong, DR II positiviteit en waarschijnlijk geografische spreiding een rol te spelen. Men kan stellen dat alle MS patiënten een reeks van genotypes bezitten die hen vatbaar maakt voor de ziekte en dat verschillende van deze genotypes geassocieerd zijn met verschillende fenotypes en dat daarvan ongeveer 1/3 de ziekte zal ontwikkelen, 2/3 niet omdat zij enerzijds inhibitorische, protectieve genen bezitten en anderzijds omdat zij niet in contact komen met de noodzakelijke triggerfactoren in hun omgeving.

5 Ziekte-specifieke therapieën bij Multiple Sclerose 1) Inleiding Ongeveer 85% van de gevallen van MS zijn initieel relapsing-remitting vormen. Alle huidige erkende ziekte-specifieke behandelingen zijn partieel effectief bij patiënten met deze subvormen van MS [1993; Jacobs et al. 1995; Blumhardt 1999]. Recent hebben een aantal studies aangetoond dat sommige van deze behandelingen eveneens effectief zijn bij de progressieve vormen van MS [IFNBMSSG(1993)]. Algemeen wordt evenwel aangenomen dat het effect van de behandeling op de progressieve variant van de ziekte minder significant is. Globaal kan men stellen dat patiënten met RR MS ongeveer 1 relaps per jaar hebben die gevolgd wordt door een zekere graad van spontane recuperatie. Deze relaps is gebaseerd op een inflammatie-opstoot in het CZS. Evenwel niet alle inflammaties resulteren in een klinische aanval. Tijdens het ziekteverloop vertoont de patiënt steeds minder aanvallen en treedt hij in een secundair progressieve fase van de aandoening waarbij, in het begin althans, zich nog relapsen voordoen. In ieder stadium van de ziekte kan het moeilijk zijn, zelfs voor een ervaren clinicus, uit te maken of patiënt wel degelijk een relaps vertoont. Daarnaast moeten er nog een aantal belangrijke factoren, die noodzakelijk zijn voor het selecteren van patiënten voor ziekte-specifieke behandeling, in rekening worden gebracht. Ten eerste, het pathogenetisch mechanisme, verantwoordelijk voor een relaps, kan verschillend zijn van patiënt tot patiënt. Meestal is het de T cel-gemedieerde immuniteit die verantwoordelijk is voor de inflammaties [Calopa et al. 1995]. Bij andere patiënten is er eerder immunoglobuline-gemedieerde hersenschade [Zaffaroni et al. 1995]. Het is dan ook niet verwonderlijk dat door deze verschillende mechanismen van inflammatie er een verschillende benadering van behandeling mogelijk is. Voorlopig zijn we beperkt tot een debruyne j. 21

empirische benadering van de behandelingsstrategiëen die gebaseerd zijn op klinische en MRI bevindingen. Ten tweede is het zo dat klinische opstoten behandeld worden waarbij de inflammatie gelegen is ter hoogte van klinisch belangrijke gebieden zoals de n.opticus, de hersenstam en het ruggenmerg. Nochtans komen inflammatoire opstoten ongeveer 7 à 10 keer meer voor bij een follow-up met beeldvorming [Filippi et al. 1995]. Klinische relapsen zijn dus geen goede markers van ziekteactiviteit of ernst van de ziekte. Om een beter inzicht te hebben op de ziekteactiviteit bij behandelde patiënten, zou het logischer zijn om seriële MR’s uit te voeren [Isaac et al. 1988]. Meestal begint de ziekte met inflammatoire activiteit, doch terzelfdertijd, en na afname van de inflammatie, ondervinden de patiënten, in een latere fase, een verdere progressie van hun ziekte als resultaat van axonale en neuronale degeneratie. Dit is belangrijk bij de selectie van de patiënten voor de behandeling. De ideale kandidaat voor de huidige ziekte-specifieke monotherapiëen is die patiënt die zeer vroeg wordt behandeld, weinig of geen invaliditeit heeft en een lage T2 concentratie in de hersenen vertoont [O'Riordan et al. 1998]. Bij deze patiënten werd bewezen dat de ontwikkeling van de invaliditeit duidelijk werd vertraagd, alhoewel op langere termijn, mogelijks combinatietherapieën zullen nodig zijn om de ziekte beter te stabiliseren. Anderzijds, hebben patiënten met een langdurende ziekte, uitgebreide T2 letseldichtheid op de MR, een progressief verloop, fulminante klinische symptomen en cerebrale atrofie op de MR, minder kans dat monotherapie hun ziekte gunstig zal beïnvloeden. In deze gevallen is MR monitoring belangrijk om het effect van de behandeling te volgen. 2) Behandeling van de exacerbaties Gewoonlijk worden steroïden gebruikt voor een MS relaps. De behandeling met steroïden hangt af van het subtype van MS. Er zijn geen studies die het belang aantonen van een steroïden behandeling in progressieve vormen van MS. Het potentiële risico voor bijwerkingen op langere termijn is superieur aan de gunstige effecten. Een studie van Barnes et al [Barnes et al. 1997] toonde aan dat er geen verschil van doeltreffendheid zou bestaan tussen oraal of intraveneus toegediende steroïden. Bij gebrek aan placebo-gecontroleerde klinische trials werd uit het resultaat van een recent overzichtsartikel in de UK een consensus aanvaard voor een behandelingsschema met toediening van steroïden bij relapsen: intraveneuze methylprednisolone 1g/dag gedurende 3 dagen of 500mg/dag gedurende 5 dagen; ofwel een orale prednisolone taper van 60mg gedurende 3 weken en afbouw om de 5 dagen [Tremlett et al. 1998]. Sommige, maar niet alle trials, suggereren dat een orale taper na een hoge dosis intraveneuze steroïden inname de ziekteprogressie en de relapsfrequentie vermindert. In feite kunnen we stellen dat er geen universeel consensus protocol bestaat over de dosis en de wijze van toediening van steroïden. 3) Ziekte-specifieke behandeling van MS Momenteel zijn er vier immunologische medicaties als partieel effectief erkend bij MS: recombinant interferon-beta-1a(IFN-β1a) (Avonex® en Rebif®); recombinant interferonbeta-1b (IFN-β1b) (Betaferon®); glatirameracetaat (Copaxone®) en het anti-neoplastisch middel: Mitoxantrone (Novantrone®) [Johnson 1995; Hartung et al. 2002a]. Deze medicaties beogen een vermindering van de relapsfrequentie, een daling van de ziekteactiviteit op de MRI en wat de IFN-β1a betreft, een vertraging van de progressie van de ziekte. Onze dienst neurologie heeft met sommige van deze producten reeds 8 jaar ervaring: een aangehouden activiteit, tolerantie en veiligheid op lange termijn kunnen worden aangenomen. Nochtans zijn er verschillen in voorkeur tussen de verschillende 22

debruyne j.

therapieën voor individuele patiënten. Over het algemeen wordt de voorkeur gegeven aan IFN-β1a voor IFN naïeve patiënten. De meeste patiënten kiezen voor de éénmalige toediening per week van IFN-β1a (Avonex), mede wegens de afwezigheid van de huidreacties ter hoogte van de injectieplaats. Er zijn eveneens biologische redenen. IFNß1a is identiek met humane IFN-β met lage incidentie van neutraliserende antilichamen (NAB’s) als gevolg. IFN-β1b is een niet-gesuikerde, serine-gesubstitueerde versie van INF-β die gemakkelijk aggregatievorming geeft en een hoge incidentie van NAB’s. Groeiende evidentie toont aan dat NAB’s voor IFN-β in het serum interfereren met het biologisch effect en de klinische resultaten van de behandeling. Studies wezen uit dat NAB vorming met neutraliserende eigenschappen vooral voorkomt bij patiënten met een agressieve ziekte en bij patiënten die een hoge in vitro productie van IgG’s voor het begin van de behandeling vertoonden [Oger J 1997]. Er zou tevens een kruisreactie bestaan van NAB’s met de andere beta-interferonen. De NAB’s ontstaan meestal na 18 maanden behandeling. Ze hebben, niettegenstaande hoge titers, in sommige gevallen geen enkele invloed op de activiteit van IFN-β. De hoge titers van de NAB’s kunnen trouwens spontaan terug verdwijnen [Rice et al. 1999]. Glatirameracetaat in RR MS geeft eveneens een reductie van de relapsfrequentie. De effecten op de MRI activiteit is evenwel minder uitgesproken dan bij interferonen [Comi G 1999]. Studies met IFN-β1b en IFN-β1a vertonen een snelle en continue reductie van de gadolinium capterende letsels en de T2 gewogen letselactiviteit [Paty and Li 1993]. Glatirameracetaat kan gebruikt worden als alternatieve behandeling bij MS patiënten die lijden onder de bijwerkingen van IFN-β en bij patiënten die neutraliserende antilichamen hebben ontwikkeld. Prospectieve, gerandomiseerde, dubbelblinde, placebo-gecontroleerde studies hebben het gunstig effect aangetoond van IVIg in de ziekteactiviteit en de invaliditeit bij patiënten met RR MS [Fazekas et al. 1997]. De effecten zijn eerder bescheiden, minder uitgesproken dan deze van IFN-β. Het mechanisme dat de effectiviteit van IVIg in MS verklaart is niet duidelijk [Lisak 1998], waarschijnlijk betreft het een combinatie van immunomodulerende acties en een mogelijk positieve werking op remyelinisatie [Rodriguez and Lennon 1990]. Er blijven vele vragen onopgelost en er is nog onvoldoende wetenschappelijke evidentie voor de toediening van IVIg in andere subgroepen dan RR MS. Onlangs verscheen een studie in The Lancet in verband met positieve resultaten van mitoxantrone bij secundair progressieve of refractaire RR MS patiënten met monotherapie. De resultaten toonden een vermindering van de frequentie van nieuwe opstoten, een lichte verbetering en verminderde progressie van de invaliditeit en een gedaalde accumulatie van nieuwe MRI letsels in de hersenen [Hartung et al. 2002b]. 4) Nieuwe experimentele therapeutische strategieën Preliminaire trials met nieuwe agentia zijn momenteel in onderzoek zowel wat het antiinflammatoire aspect betreft als strategieën tegen de neurodegeneratieve component van de aandoening. T-cell receptor-immunotherapie beoogt als target het trimoleculair complex zijnde de T cel receptor (TCR), de majeure histocompatibiliteitscomplex moleculen (MHC) en de specifieke epitoopfragmenten. Deze hypothese werd ontwikkeld begin de jaren ’80 met het MBP als target in EAE, met het doel encephalitogene T-cellen te inactiveren [Ben Nun et al. 1981]. Het is evenwel niet duidelijk of deze immunotherapeutische principes voor EAE eveneens kunnen toegepast worden voor MS patiënten. De spreiding en diversificatie van de autoimmune antwoorden naar andere myeline antigenen zoals PLP en MOG doet de vraag rijzen naar de toepasbaarheid van deze specifieke anti-TCR behandeling. Een studie van Zipp heeft bijvoorbeeld reeds eerder de diversiteit aangetoond van het immune antwoord op de anti-T-cell receptor [Zipp et al. 1998]. debruyne j. 23

Behandeling met gehumaniseerde monoclonale antilichamen heeft als doel een depletie te veroorzaken van de specifieke subsets van de T-lymfocyten in de bloedcirculatie en zodoende de celmigratie en de inflammatie in het CZS te verhinderen. Deze studie werd reeds uitgevoerd met antilichamen tegen myeline–specifieke T helper-cellen. Niettegenstaande er een effectieve vermindering ontstond van de circulerende CD4 Tcellen in de behandelende groep werd geen effect genoteerd in de frequentie van de MRI activiteit [van Oosten et al. 1997]. Er werden eveneens proeven uitgevoerd met monoclonale antilichamen tegen de CD52 T-cellen met CAMPATH-1H. Deze studie werd onderbroken wegens een uitgesproken lymfopenie en een acute, transiënte toename van de symptomen van vorige klinische episoden [Moreau et al. 1994]. Het afscheiden van pro-inflammatoire cytokines door de Th1 cellen en immunomodulerende cytokines door de Th2 cellen deed de gedachte rijpen om de expressie van de cytokines van de Th1 cellen te inhiberen en deze van de Th2 cellen te activeren. Het probleem bleek dat de rol van de Th1 en Th2 cellen onvoldoende begrepen is en dat hun effect varieert volgens verschillende omstandigheden. Preliminaire behandelingen werden uitgevoerd met anti-TNF-α monoclonale antilichamen. TNF-α is een pro-inflammatoir cytokine afgescheiden door de Th 1-cellen. Deze studie toonde een toename van de MRI activiteit en meer afwijkingen in de liquor [van Oosten et al. 1996]. Niettegenstaande deze molecule het effect van TNF-α neutraliseerde, was het resultaat dat patiënten meer en ernstiger relapsen vertoonden dan de placebo-groep. Immunomodulerende cytokines, zoals TGF-β, gesecreteerd door Th2 T cellen, toonden na toegenomen expressie, klinische noch MRI-effecten in een fase I studie met 11 patiënten [Calabresi et al. 1998]. Beenmergtransplantatie is gebaseerd op de veronderstelling dat MS een immuungemedieerde aandoening is. Ze heeft als rationale de autoreactieve lymfocyten uit het immuunsysteem te verwijderen door een ablatie van het beenmerg en daarna een transplantatie van autologe stamcellen uit te voeren, met de bedoeling een regeneratie te bekomen van een nieuw immuun systeem naïef met betrekking tot de encephalitogene autoantigenen. Autologe stamcellen worden gezuiverd van T-cellen door T-cel specifieke monoclonale antilichamen (CD3) [Burt 1997; Burt et al. 1997] of door andere T-cell manipulaties zoals met anti-thymocyt globuline [Fassas et al. 1997]. De procedure om stamcellen uit het beenmerg te bekomen is veel moeilijker dan het mobiliseren van perifere stamcellen. Voor dit laatste zijn cytokines zoals granulocyt-colony stimulerende factor (gCSF) nodig. Deze cytokines kunnen potentieel MS letsels veroorzaken, dit probeert men tegen te gaan door cyclofosfamide behandeling te associëren. De ablatie van beenmerg gebeurt samen met hoge dosissen van cytotoxische producten zoals busulfan of BEAM (BCNU+Etoposide+cytosine Arabinoside+Melfalan). De potentiële bruikbaarheid van deze behandeling is totnogtoe onvoldoende gebleken. Er bestaan hoogstens een aantal pilootobservaties met variaties in de methodologie (patiënten selectie, beenmergablatie, transplant preparatie). De bestaande gegevens laten enkel toe om gecontroleerde fase II trials te concentreren in gespecialiseerde centra, daar er in de verschillende pilootstudies tot op heden talrijke complicaties van de immunosuppressie, zelfs met fatale afloop zijn voorgekomen. Er zijn daarenboven gedocumenteerde gevallen van MS exacerbaties na “succesvolle transplantaties” [Jeffery D 1998]. Nieuwe studies met adhesiemoleculen worden uitgevoerd, meer bepaald met monoclonale antilichamen tegen alfa 4 beta-1(α4 β1) integrine, ook VLA-4 (very late antigen-4) genaamd. Dit is een adhesiemolecule die gelegen is op de T-lymfocyten en een adhesie aangaat met vasculaire adhesiemolecule-1 (VCAM-1) gelegen op de endotheliale cellen. 24

debruyne j.

De rationale van deze procedure is dat daardoor de autoimmune T-cellen niet meer door de (BBB) kunnen penetreren. Een pilootstudie met het monoclonale antilichaam natalizumab (Antegren®), een α4 integrine antagonist heeft namelijk aangetoond dat deze behandeling een reductie veroorzaakt van de accumulatie van contrastcapterende letsels op de MRI en een vermindering van klinische opstoten [Miller et al. 2003]. Deze klinische trial bestaat uit een maandelijkse intraveneuze toediening van natalizumab in 213 pt met RR MS en SR MS. Ze belooft gunstige resultaten doch dient in de eerstkomende jaren te worden gevaloriseerd. Matrix metalloproteïnasen (MMPs) zijn een grote groep van proteolytische enzymes die betrokken zijn bij het herstel van de extracellulaire matrix. Een verhoogde expressie van de MMP’s, in antwoord op een aantal stimuli, veroorzaakt een weefseldestruktie bij MS en de passage van cellen doorheen de BBB. MMP’s lijken eveneens betrokken in de regulatie van een aantal pro-inflammatoire enzymes zoals TNF-α. In een recente studie van Lee werd de toename van een speciale MMP, namelijk gelatinase B en een aantal weefselinhibitoren van MMP’s (TIMP), namelijk TIMP-1 en TIMP-2 waargenomen. In een groep van 21 patiënten met RR MS bleek dat gelatinase B expressie significant hoger was gedurende een klinische opstoot vergeleken met episoden waarin de patiënt klinisch eerder in een stabiele episode verkeerde. Er was eveneens een significante positieve correlatie tussen een verhoogde spiegel van gelatinase B en het aantal T1 gewogen gadolinium letsels op de MR [Lee et al. 1999]. Het lijkt onwaarschijnlijk dat een behandeling met TIMP een ziektemodulerend effect zal hebben daar grote hoeveelheden van de TIMP’s een verhoogde expressie vertonen in vivo in patiënten die, niettegenstaande deze verhoging, toch klinische aanvallen vertonen. Misschien bestaat de mogelijkheid dat een behandeling in een zeer vroegtijdig stadium in het inflammatoir proces de verhoogde expressie van de MMP’s kan tegengaan en de activatie van andere proteïnasen kan verhogen. Er is wat succes geboekt met de TIMP’s in de behandeling van EAE [Liedtke et al. 1998]. Dezelfde resultaten bij humane MS zijn evenwel nog niet aangetoond. Demyelinisatie, remyelinisatie en axonale degeneratie verschillen voortdurend op gegeven tijdstippen bij individuele MS patiënten rekening houdend met de verschillende histopathologische subtypes bij MS [Lassmann et al. 2001]. Dit suggereert de aanwezigheid van verschillende pathogenetische mechanismen bij het ontstaan van de MS letsels. Demyelinisatie wordt dus door verschillende immunologische mechanismen geïnduceerd verantwoordelijk voor een specifiek patroon van de strukturele pathologie van de letsels. Deze patronen blijken bovendien vrij typisch en constant te zijn voor specifieke individuen.. Een nieuwe benadering is het promoten van spontane remyelinisatie. In hoeverrre evenwel deze remyelinisatie in staat zal zijn om de functionaliteit van de banen in het CZS te herstellen is totnogtoe onbekend. Het promoten van de remyelinisatie is duidelijk een complex mechanisme dat terzelfdertijd moet gepaard gaan met het remmen van de inflammatoire component waarbij mogelijks IVIg een belangrijke rol kan spelen in de inflammatoire fase van de ziekte. De potentiële rol in remyelinisatie van IVIg werd aangetoond in een observatie waarbij een verhoogde remyelinisatie voorkwam bij dieren met Theiler’s murine encephalomyelitis virus na behandeling met immuun serum [Rodriguez et al. 1987]. Evenwel is het belang van IVIg in de behandeling van MS tot op heden onvoldoende bewezen [Noseworthy et al. 2000]. Hoop wordt gesteld op de stimulatie van de progenitorcellen van de oligodendrocyten die in staat zijn om te migreren en te remyeliniseren. Oligodendrocyten-precursoren van een patiënt kunnen in vitro, in aanwezigheid van groeifactoren, prolifereren tot een cellijn en geïmplanteerd worden in het letsel waar een klinisch deficiet aanwezig is. Het experiment debruyne j. 25

werd toegepast voor het bekomen van een selectieve remyelinisatie van de pedunculus cerebellaris superior bij patiënten met een ernstige rubrale tremor [Compston 1998]. Tenslotte dient verder werk te worden gemaakt van de preventie van axonale schade daar dit fenomeen een belangrijke pathologische betekenis heeft in de evolutie van het degeneratieve aspect van MS. Wanneer we veronderstellen dat inflammatie in de hersenen als eerste pathologisch fenomeen bij MS voorkomt zal secundaire axonale schade het meest efficiënt worden voorkomen door vroegbehandeling [Comi G 2000]. Deze neuroprotectieve strategieën kunnen enkel werken wanneer de destructieve inflammatoire componenten van de ziekte kunnen gecontroleerd worden. Dus theoretisch kan het probleem enkel opgelost worden door een combinatie van anti-inflammatoire en neuroprotectieve behandelingen. Belangrijke actoren in dit proces zijn de zogenaamde trofische factoren; bijvoorbeeld van ciliaire neutrofische factor (CNEF) werd aangetoond dat het een belangrijke overlevingsfactor is voor de oligodendrocyten en voor de neuronale populatie [Louis et al. 1993]. Deze gegevens tonen aan dat zelfs onafhankelijk van immuungemedieerde aanvallen op de myelineschede of axonen, de genetisch gedetermineerde structurele en moleculaire integriteit van de axon-glia interactie een belangrijk impact heeft op de functie van deze structuren in inflammatoire ziekten zoals MS [Owens et al. 2001]. Stikstofoxide (NO), geproduceerd door macrofagen op de plaats van inflammatie maakt de axonen bijzonder kwetsbaar voor degeneratie veroorzaakt door een gestoorde mitochondriale functie [Smith et al. 2001]. Dit proces leidt tot een gestoorde elektrolieten homeostasis, meer bepaald, een onevenwicht in de natrium-calcium interactie, met als gevolg een calcium gemedieerde degeneratie van het axonale cytoskelet. Calpaïne, een neutraal proteïnase, in expressie gebracht in de microglia van het ruggenmerg in EAE Lewis rats tijdens een klinische aanval, is mogelijk verantwoordelijk voor de degeneratie van het axonale cytoskelet. Calpaïne activiteit neemt toe door het vrijstellen van vrij intracellulair calcium [Banik et al. 1997]. Geactiveerde macrofagen en microglia dragen dus bij tot axonale schade door het afscheiden van MMP’s, cytokines, protëinasen en componenten van de plasminogen-activator cascade [Gimsa et al. 2000; Gveric et al. 2001]. Deze macrofaag producten zijn betrokken in de regulatie van de BBB functie en de hermodulering van de extracellulaire matrix. De bijdrage tot beschadiging of herstel in de micro-omgeving van een inflammatoir letsel hangt af van hun staat van activiteit en zelfs door verschillen in de tijdsmoment [Hummel et al. 2001]. Het spreekt vanzelf dat meer inzicht noodzakelijk is vooraleer TIMP’s kunnen gebruikt worden als een potentiële medicamenteuze strategie in MS. Er bestaat een therapeutische rationale dat neurotrofe factoren een bijlangrijke rol spelen bij MS: 1): Ze zijn belangrijk in remyelinisatie wegens hun stimulerende rol bij oligodendrocyten en andere typen van neuronen 2): Ze doen dienst als immunocomponente moleculen in de actieve MS letsels 3): Ze vertonen modulerende effecten op verschillende immunologische cellen 4): Er werd aangetoond dat deficiëntie in sommige neurotrofe factoren geassocieërd is met een ernstig verloop in EAE modellen en MS [Linker R 2004]. Voor de praktische toepassing van neurotrofe factoren in klinische studies dienen evenwel een aantal hindernissen te worden overwonnen. Namelijk: verdere karakterisering van neurotrofe receptor-expressie profielen; een beter begrip van de interacties tussen de neurotrofe factoren en de immunologische celfunctie in de inflammatoire letsels, een transportmethode voor continu lokale applicaties in de letsels. In normale omstandigheden worden neurotrofe factoren continu geproduceerd in de onmiddellijke nabijheid van hun functioneel doel. In pathologische omstandigheden is er evenwel een disconnectie waardoor het therapeutische effect niet kan worden uitgeoefend. In dit verband werd een in 26

debruyne j.

vitro studie met niet getransduceerde antigen-specifieke T-cellen en de gewenste neurotrofe factor uitgevoerd. Na activatie van de cellen en intraveneuze toediening werd de migratie nagegaan waarbij de specifieke neurotrofe factor doelgericht naar de beoogde inflammatiehaard werd geleid [Flugel et al. 2001]. Eén van de meest controversiële medicaties die momenteel worden onderzocht zijn de cannabinoïden. De ontdekking van specifieke cannabinoïd-receptoren in het immunologisch systeem heeft de laatste jaren veel aandacht gekregen [Guzman et al. 2001]. De resultaten van de lopende studies van het effect van canabinoïden op tremor en spasticiteit bij MS patiënten zijn nog niet bekend. Het effect blijkt evenwel slechts matig te zijn. Downregulatie van inflammatoire cytokines in verschillende cell-types, suppressie van NO productie in neuronen en humane monocyten, protectie van neuronen tegen glutamaatoverstimulatie en oxidatieve schade werden experimenteel aangetoond [Stefano et al. 1996]. Verder onderzoek in verband met cannabinoïd-gebaseerde behandelingsstrategiëen, ontdaan van ongewenste psychotrofe effecten, zijn nodig vooraleer zij objectief kunnen worden geëvalueerd en gebruikt kunnen worden als ziekte modifiërende medicatie in MS.

debruyne j.

27

28

debruyne j.

II IMMUNOLOGISCHE ASPECTEN VAN MS Pathogenese van MS

T-cellen worden in de periferie geactiveerd door specifieke antigenen aangeboden door APC’s, in de contekst van MHC moleculen. Deze peptiden zijn de oorzaak van moleculaire nabootsing van sommige myeline antigenen. De geactiveerde T-lymfocyten ondergaan transcriptionele veranderingen die resulteren in de expressie van adhesiemoleculen en proteolytische enzymen die adhesie en doorbraak veroorzaken van deze T-cellen doorheen het basaal membraan van de capillaire bloedvaten van de bloed-hersen barriere (BBB). In het CZS worden zij gereactiveerd door microgliacellen die functioneren als APC’s voor myeline antigenen. Deze tweede activatiestap veroorzaakt een nieuwe opflakkering van inflammatie waarbij talrijke cytokinen, chemokinen en andere moleculen zoals NO, glutamaat en vrije radicalen worden geproduceerd. Dit proces wordt onderhouden door een positieve feedback op effectorcellen en resulteert eventueel in beschadiging van myeline, oligodendrogliacellen en neuronen.

debruyne j.

29

30

debruyne j.

1) Het EAE model De etiologie van MS is tot op heden onbekend. Nochtans hebben uitgebreide studies op diermodellen, meer bepaald bij experimentele autoimmune encephalomyelitis (EAE), ons inzicht in de pathogenese bij MS sterk verbeterd. Lange tijd werden MS en EAE beschouwd als gelijkaardige ziekten, maar nu is het duidelijk dat zowel MS als verscheidene EAE modellen een heterogeen spectrum van fenotypes en verloop hebben. Bij de EAE hangt dit af van het soort dier, het geïnduceerde myeline antigen en de keuze van het adjuvant [Zamvil and Steinman 1990]. Typische voorbeelden zijn de acute monofasische, inflammatoire EAE in de Lewis rat en de demyeliniserende chronische en relapsing EAE in de SJL muis [Wekerle et al. 1994]. EAE kan worden geïnduceerd door de injectie van myeline of myeline componenten samen met een bijhorende adjuvant. De ziekte wordt hoofdzakelijk gemedieerd door encephalitogene T cellen. De belangrijkste observaties van het EAE onderzoek kunnen als volgt worden samengevat: EAE kan worden overgebracht door encephalitogene CD4+T cellen, daarentegen is adoptieve transfert van CD8+T cellen en humorale factoren, zoals antilichamen niet voldoende om de ziekte te veroorzaken. Met andere woorden: EAE is een T cel gemedieerde ziekte [Wekerle et al. 1994]. De T cellen hebben een T helper fenotype met pro-inflammatoire eigenschappen door de secretie van interferon γ (INF-γ) en tumor necrosis factor-α en ß (TNF-α/ ß). De vatbaarheid voor EAE in specifieke diersoorten is hoofdzakelijk bepaald door hun MHC klasse II achtergrond, hoewel een aantal andere genen eveneens kunnen bijdragen [Butterfield et al. 1998]. In iedere diersoort kan EAE worden geïnduceerd door specifieke myeline peptiden of peptiden afkomstig van de belangrijkste myeline proteïnen zoals de myeline basische proteïne (MBP), de proteolipid lipoproteïne (PLP), de myeline oligodendroglia glycoproteïne (MOG), de myeline oligodendrocyt basische proteïne (MOBP), de oligodendrocyt-specifiek proteïne (OSP) en aB-crystalline, een kleine heat shock proteïne [Tuohy et al. 1988; Amor et al. 1996; Thoua et al. 2000]. Andere hersenproteïnen, zoals de astrogliale S-100 beta proteïne kunnen eveneens klinische en histopathologische EAE induceren [Wekerle et al. 1994]. Zelfs indien het pathogenetisch proces initieel gericht is tegen één enkel myeline peptide, kan in een later stadium een epitoopspreiding ontstaan zodat nieuwe myeline peptiden en proteïnen in het pathogenetisch proces kunnen worden betrokken. Dit bemoeilijkt de evaluatie van de immune antwoorden in EAE en MS en de ontwikkeling van specifieke immunotherapieën [Lehmann et al. 1992].

2) Cellulaire immuniteit T cellen zijn niet de meest prominente celtypen in de verschillende histopathologische patronen bij MS [Lucchinetti 2000]. Evenmin is de aanwezigheid van autoreactieve T cellen voldoende om de ziekte te veroorzaken. Toch is er weinig twijfel dat encephalitogene T cellen de belangrijkste type cellen zijn in de initiatie van de ziekte [Raine 1994]. Uit nieuwe immunologische studies werd meer inzicht verkregen over de rol van de CD4+T cellen in MS en EAE. Het verlies van oligodendrocyten en neuronen reeds vroeg in de aandoening kan moeilijk worden uitgelegd door het T helper type I cel concept. Oligodendrocyten en neuronen die enkel MHC klasse I moleculen voortbrengen kunnen geen antigenen presenteren aan CD4+T cellen. De hypothese rijst dat de microgliacellen de

debruyne j.

31

enige celpopulatie zijn die MHC klasse II moleculen tot expressie brengen in het CZS en myeline antigenen presenteren aan de T helper cellen. CD8+T cellen die antigenen herkennen door middel van MHC-klasse I presentatie lijken meer en meer een rol te spelen in de pathogenese van MS [Redwine et al. 2001]. Er werd aangetoond dat CD8+T cellen oligodendrocyten en neuronen kunnen vernietigen [Jurewicz et al. 1998; Medana et al. 2000]. Daarenboven kunnen CD8+T cellen neuronen aanvallen die leiden tot axonaal verlies met spheroïdvorming zoals gezien wordt in MS letsels [Medana et al. 2000]. De rol van CD8+T cellen in MS werd verder aangetoond door Sun en collega’s waarbij progressieve en destructieve EAE werden geïnduceerd door gezuiverde myeline-specifieke CD8+T cellen [Sun et al. 2001]. Adoptieve overbrenging van T cel klonen van het CD8 type specifiek voor (MBP)-peptiden induceerden EAE waardoor de encephalitogene werking van deze T cellen werd aangetoond [Huseby et al. 2001]. Interessant bij dit model is dat de letsels voornamelijk gelokaliseerd waren in de hersenen en niet in het ruggenmerg zoals meestal gezien wordt bij EAE modellen geïnduceerd door CD4 T cellen en dat daarenboven de letsels gekenmerkt werden door weinig inflammatie maar massieve periventriculaire celdood en demyelinisatie. Naast de pro-inflammatoire rol van de T en de B lymfocyten in het immuunproces zijn er eveneens immunomodulerende mechanismen. Daarbij wordt aandacht geschonken aan de “natural killer” T cellen (NKT cellen) in studies in MS en in EAE. Ze vertegenwoordigen namelijk een populatie van T cellen die oppervlaktemarkers en karakteristieken vertoont gelijkend op deze van NK cellen (CD3-1, CD56+16+) [Porcelli and Modlin 1999]. NKT cellen kunnen snel grote hoeveelheden cytokinen zoals IL-4 en IFN-γ afscheiden en daarbij een belangrijke regulerende rol spelen om het immuunproces te doen afwijken naar het T helper II type [Porcelli and Modlin1999]. Deze hypothese lijkt belangrijk doch dient in humane studies nog verder te worden uitgewerkt. Het concept van behandeling van MS door een toename van de regulatoire T cellen lijkt aantrekkelijk. Naïeve T cellen hebben 2 belangrijke signalen nodig voor activatie. Eén signaal wordt bezorgd via de T cel receptor met MHC klasse II antigen complex. Het tweede signaal komt van een groep van celoppervlakte moleculen die zich manifesteren op de antigen presenterende cellen (APC), zoals: CD80 en CD86 (de B7 familie) en CD40 die in interactie gaan met T cel receptoren: CD28, CDLA4 en CD40L [Lu et al. 1997]. Autoreactieve T cellen tegen MBP, PLP en MOG worden evengoed gevonden in het perifere bloed van gezonde personen [Hellings et al. 2001]. Er is dus een verdere inductie nodig van deze autoreactieve T cellen om hersenschade te veroorzaken door de klassieke inflammatoire cascade tussen T cellen, APC’s en het vormen van het trimoleculair complex met bijhorende co-stimulerende molecules, zowel gelegen op de APC’s als op de T cel, waardoor uiteindelijk de myeline, de oligodendrocyten en de axonen worden aangetast [Noseworthy et al. 2000]. Er bestaat een dichotomie tussen de acties van de microglia en astrocyten en hun respectievelijke fysiopathologische rol in de MS letsels. In de literatuur is er discussie welke van de 2 de belangrijkste APC is: astrocyten of microglia. Vele onderzoekers beschouwen astrocyten als een zwakke APC wegens het feit dat deze cel geen MHC klasse II moleculen tot expressie kan brengen en wegens de afwezigheid van co-stimulerende moleculen. Astrocyten zouden dan eerder een rol spelen in de inhibitie van de inflammatie door het induceren van T cel suppressie en apoptose. Ze zijn een bron van mediatoren, zoals TGF-ß, die MHC klasse II antigenen en intercellulaire adhesiemoleculen 1 expressie inhiberen in de microglia [Hailer et al. 1998]. Recent werd evenwel ontdekt dat astrocyten een brede waaier van receptoren bevatten met als neurotransmittoren: norepinefrine, glutamaat en vasoactieve intestinale polypeptide specifieke liganden. Experimenteelgeïnduceerde demyeliniserende aandoeningen veroorzaakt door het Canine Distemper virus 32

debruyne j.

toonden aan dat β2-adrenergische receptoren afwezig waren op astrocyten zowel in acute als chronisch demyeliniserende letsels en in normaal ogende witte stof(NAWM) [Sutin and Shao 1992; De Keyser et al. 2001]. Het gevolg was dat er toch een expressie van de MHC klasse II antigenen in de randen van de letsels werd geobserveerd. Uit deze studie zou kunnen besloten worden dat virussen in genetisch vatbare personen aan de basis kunnen liggen van het verlies van de β2 adrenergische receptoren op de astrocyten in MS. De observatie dat astrocyten in MS selectief hun β2-adrenergische receptoren verliezen doet het vermoeden rijzen dat specifieke regulatoire defecten de oorzaak zijn van de onderliggende ziektemechanismen waarbij MS patïenten opstoten van inflammaties vertonen door onvoldoende tegengewicht van inhiberende regulatiemechanismen. Herhaalde episodes van inflammaties kunnen leiden tot epitopenspreiding die op hun beurt, door toegenomen contact met geactiveerde astrocyten, microglia en macrofagen, een uitbreiding van de autoimmune cascade kan veroorzaken in het CZS [De Keyser et al. 1999].

3) Humorale immuniteit De potentiële pathogenetische rol van de antilichamen wordt erkend sinds het ontdekken van de intrathecale immunoglobulinesynthese in MS [Cross et al. 2001]. Het voorkomen van gestegen antilichamen en oligoclonale IgG banden in de liquor is nog steeds de meest waardevolle diagnostische parameter van de ziekte. De rol van de antilichamen voor de ziekteprogressie werd aangetoond in EAE en MS. Iglesias bewees dat myeline specifieke antilichamen de ernst van de EAE deed toenemen en dat een grote intrathecale antilichaamproductie een negatieve predictor is voor de ziekteprogressie [Iglesias et al. 2001]. Een positieve correlatie tussen de intrathecale B-cell dominantie en het ziekteproces werd recentelijk aangetoond [Cepok et al. 2001]. Dit werd bevestigd door Villar en collega’s waarbij een correlatie werd gevonden tussen de aanwezigheid van oligoclonale IgM banden in de liquor en een hoge activiteit van het ziekteproces [Villar et al. 2002].

4) Cytokines Cytokines vervullen een belangrijke rol in de pathogenese van MS. Er is een actieve infiltratie van de T cellen doorheen de bloedhersen-barrière (BBB) waarbij adhesiemoleculen op endotheelcellen een belangrijke rol spelen. Die worden tot expressie gebracht door pro-inflammatoire cytokines, vooral INF- γ. Ook bij astrocyten wordt MHCklasse I getriggerd door INF-α/β en MHC-klasse II getriggerd door INF-γ, TNF-α, LT (Lymfotoxine) en IL-1. Astrocyten kunnen door hun productie van IL-3 microglia stimuleren en anderzijds IL-2 productie door T cellen induceren evenals IL-2R expressie op diezelfde T cellen. Zoals de EC kunnen MHC+astrocyten functioneren als APC’s en tussenkomen in de immunoregulatie van het lokale inflammatoire antwoord. De secretie van TNF-α, wordt beschouwd als cruciaal in de cascade van gebeurtenissen die leiden tot demyelinisatie [Zamvil and Steinman1990]. Genetische modellen met wisselende TNF-α expressie vertonen een heterogeniteit, een overexpressie van TNF-α in het centrale zenuwstelsel (CZS) resulteert meestal in een spontane demyelinisatie of op zijn minst in ernstiger EAE activiteit. Disruptie van het TNF-α gen beïnvloedt de vatbaarheid en de ernst van de ziekte, hoewel EAE inductie mogelijk is in alle knock out modellen [Steinman 1997]. Het immuun-gedevieerde proces in MS, zoals bestudeerd in EAE lijkt voornamelijk de T cellen van het T helper type I subset en monocyten te betrekken. Pro-inflammatoire debruyne j.

33

cytokines zoals INF-γ, TNF-α en IL-12 worden geproduceerd door deze immuun cellen en blijken een belangrijke rol te spelen [Balashov et al. 1997; Boxel-Dezaire et al. 2001]. Anderzijds worden anti-inflammatoire cytokines zoals IL-4, IL-10 en TGF-β geassocieerd met een down-regulatie van de inflammatie en met remissie [Kalman B 2004]. De meeste research heeft zich toegespitst op IL-12 en IL-10 als mogelijke markers van ziekte-activiteit in MS. IL-12 speelt een centrale rol in de regulatie van cellulaire immune antwoorden, voornamelijk door zijn mogelijkheid om de productie van INF-γ op directe en indirecte wijze te beïnvloeden. Bij MS patiënten werd een toegenomen IL-12 expressie in de perifere bloed monocyten gevonden correlerend met klinische invaliditeit gemeten volgens de EDSS en ziekteactiviteit, dit laatste door het aantonen van gadoliniumcaptatie op de MR [Makhlouf et al. 2001]. Toegenomen expressie van IL-12mRNA werd gevonden in acute MS plaques [Windhagen et al. 1995] en in de perifere bloed monocyten bij RR en SP patiënten, maar niet bij PP MS patiënten [Boxel-Dezaire et al. 2001]. Een significante toename in de perifere bloed monocyten van IL-12mRNA concentraties gaat een klinische relaps vooraf en wordt gevonden zowel bij patiënten met RR als bij SP MS gedurende de ontwikkeling van actieve inflammaties op de MRI [Boxel-Dezaire et al. 1999]. Serumproteïne concentraties van IL-12 zijn gestegen bij patiënten met SPMS [Nicoletti et al. 1996] en een gestegen expressie van IL-12p40 subunit werd gevonden in het cerebrospinaal vocht bij patiënten met RR MS en actieve plaques op de MR [Fassbender et al. 1998]. IL-10, geproduceerd door de T helper type II cellen is een inhibitor van de proinflammatoire cytokines. In de PBMC werd een onderdrukte IL-10mRNA expressie gevonden bij MS patiënten met een actieve RR en SP vorm. IL-10mRNA vermindert significant voordat een klinische opstoot optreedt en er zich actieve inflammaties in de hersenen voordoen [Karp et al. 2001]. Serum IL-10 concentraties stijgen bij RRMS patiënten correlerend met het verdwijnen van gadolinium-capterende letsels [Waubant et al. 2001]. Onlangs werd aangetoond dat er een verhoogde IL-13 secretie aanwezig is door de CD4+ en CD8+ T cellen tijdens een relaps. De intracellulaire productie van IL-5 en IL-13 werd flowcytometrisch geanalyseerd in de perifere bloed CD4+ en CD8+ T-cellen. De IL-13 productie steeg significant bij T-cel subsets bij een relaps en deze concentratie werd terug normaal bij een remissie [Ochi et al. 2002]. De meeste van de antigenen die betrokken zijn bij MS kunnen in expressie worden gebracht in de thymus zoals aB-crystallin, S100-β, (PLP. Andere zoals MOG, zowel de α als de β isoformen worden niet tot expressie gebracht in de thymus. Dit suggereert de mogelijke rol van de centrale tolerantie bij MS, maar niet voor de MOG. Dit is conform met het klassieke concept waar de rol van MOG als epitoop bij autoimmuun ziekten bekend is [Bruno et al. 2002].

5) Caspasen In een recente studie van Zubair Ahmed werd de rol van Caspase 1 en 3 in de pathologie in EAE bestudeerd [Ahmed et al. 2002]. De caspasen, behorende tot de familie van de cysteïne proteasen, zijn voornamelijk betrokken in het proces van apoptose [Cohen 1997]. In deze studie kan worden aangetoond dat deze doorgaans inactieve pro-enzymen catalytisch geactiveerd kunnen worden waardoor zij cellulair export van pro-inflammatoire cytokinen bevorderen. Overexpressie van Caspase-1 is verantwoordelijk voor apoptose van inflammatoir geactiveerde microglia. Geactiveerde Caspase-3 is de belangrijkste effector van neuronale celdood in EAE, na contact met cytokinen geproduceerd door geactiveerde microglia [Ahmed et al. 2002; Eldadah and Faden 2000]. Het selectief blokkeren van 34

debruyne j.

Caspase-3 verhindert de apoptose, dit kan een potentieel doelwit zijn in de behandeling van EAE en MS.

6) Matrix metalloproteïnasen Matrix metalloproteïnasen (MMPs) zijn een familie van enzymen die betrokken zijn bij het remodelleren van de extracellulaire matrix bij fysiologische en pathologische condities [Massova et al. 1998]. Bij MS en EAE lijken zij een rol te spelen bij de doorbraak van de bloedhersen-barrière, bij demyelinisatie en epitoopspreiding [Galboiz et al. 2001]. Er werd een verhoogde expressie van MMP-2, MMP-7, en MMP-9 aangetroffen in inflammatoire letsels in MS [Maeda and Sobel 1996] en in PBMC van RR patiënten [Lichtinghagen et al. 1999]. Recent werd aangetoond dat er verhoogde expressie aanwezig is van MMP-2 en MMP-7mRNA in perifere bloed monocyten bij RR patiënten en MMP-7mRNA bij SP patiënten terwijl geen verandering werd vastgesteld van de MMP-9 concentratie. Verhoogde MMP-9 expressie leek evenwel te correleren met ziekteactiviteit in RR patienten, aangetoond door de aanwezigheid van gadolinium letsels op de MRI [Lindberg et al. 2001]. IFN-β behandeling doet de MMP9 concentratie in het serum bij RR MS patiënten dalen [Trojano et al. 1999]. Op basis van deze rapporten kan het profiel van de MMP expressie een potentiële perifere biomerker zijn voor het type en de activiteit van de aandoening en het antwoord op de behandeling.

debruyne j.

35

36

debruyne j.

III BEELDVORMING IN MS

1) Magnetische Resonantie Zoals reeds eerder besproken in het overzichtsartikel over MS neemt de magnetische resonantie (MRI) een belangrijke plaats in bij de diagnosestelling van MS. Dit onderzoek stelt ons namelijk in staat letsels aan te tonen verspreid in plaats en in tijd [Brex PA 2001]. Klinisch silentieuze letsels kunnen worden gezien, een patroon van waxing en waning die soms onafhankelijk van het klinisch beeld kunnen bijdragen aan het natuurlijk verloop van de ziekte. Gadolinium-T1 beelden en de letsel-dichtheid op T2 gewogen beelden zijn prominente factoren voor prognose bepaling in the fase III klinische studies [Comi G 2001]. Niettegenstaande er een verband bestaat tussen toename van letsels en de progressie van het klinisch beeld blijft toch het probleem van de “klinico-radiologische paradox” onopgelost. Verschillende problemen zijn daarvan de oorzaak: a) Ontoereikbaarheid van de huidige klinische schalen. De onvolmaaktheden van de EDSS (Expanded Disability Status Scale) zijn bekend [Barkhof 1999]. Deze schaal overkoepelt onvoldoende de functionele afwijkingen van het centrale zenuwstelsel. Bovendien is er een belangrijke waarnemers variabiliteit. Rekening houdend met deze onvolmaaktheden werd een meer omvattende klinische schaal ontwikkeld, namelijk: de MSFC (Multiple Sclerose Functional Composite scale) waarbij verschillende klinische domeinen worden geëvalueerd zoals de motoriek van de onderste en de bovenste ledematen en een aantal cognitieve testen. Deze cognitieve functies correleren sterk met MRI-metingen [Zivadinov et al. 2001]. Bovendien toonde Kalkers aan dat de klinico-radiologische relatie nauwer verwand is met het hersenvolume dan focale letsels, met andere woorden, MSFC correleert beter met MRI parameters dan de EDSS [Kalkers et al. 2001]. Door Rudick werd trouwens aangetoond dat er een significante relatie bestaat tussen de MSFC en hersenatrofie [Rudick 2001]. b) Onduidelijkheid van de histopathologische specificiteit van de letsels. Niettegenstaande de duidelijke correlatie van de T2 gewogen hyperintense topografie van de letsels van MS plaques bij postmortem onderzoek vergeleken met MRI, bestaat er een slechte correlatie tussen de letseldichtheid met de invaliditeit [Filippi M 1995]. Hyperintense T2 gewogen letsels vertegenwoordigen zowel focale gebieden van inflammatie, oedeem, gliosis, demyelinisatie en axonale aantasting. Enkel deze laatste componenten lijken verantwoordelijk voor irriversibele aantasting. c) Een andere verklaring is dat de EDSS eerder een niet-lineaire schaal is voor ruggenmergpathologie en dat kleine soms microscopische letseltjes een grotere impact hebben op het klinisch beeld dan de grote letsels in de hersenen. 4) Onderschatting van de schade in de normaal ogende witte en grijze hersenstof (NAWM en NAGM). Neuropathologisch wordt deze namelijk gekenmerkt door niet zichtbare microscopisch kleine inflammaties [Filippi M 1995; Comi G 2001]. 5) Het maskeren van cortico-subcorticale letsels. Deze zijn namelijk moeilijk te ontdekken in de grijze stof en de subcorticale U-vezels door MRI, zelfs door het gebruik van nieuwe sequenties [Bakshi et al. 2001].

debruyne j.

37

6) Compensatie mechanismen door corticale adaptatie. Deze plasticiteit kan elegant worden aangetoond door functionele MRI (fMR): bijvoorbeeld bij patiënten met axonale aantasting van de motorische cortex wordt een verhoogde activatie waargenomen in de ipsilaterale motorische cortex om de motorische functie maximaal te behouden [Reddy et al. 2000]. Nieuwe MRI toepassingen worden ontwikkeld om deze klinico-radiologische paradox te verklaren waardoor de sensitiveit van de MRI en de correlatie met de klinische schalen toeneemt. De nieuwe technieken die zich hebben ontwikkeld in het kielzog van de MRI zijn de magnetische resonantie spectroscopie (MRS), de magnetisatie transfer factor (MTF) en de fMRI.

38

debruyne j.

2) Magnetische Resonantie Spectroscopie In vivo proton magnetische resonantie(H-MRS) meet weefselmetabolieten en dus biochemische veranderingen in de letsels (T1-Gd, T2W, black holes en NAWM) in MS patiënten. Verschillende resonantiepieken kunnen worden gedetecteerd: stikstofacetylaspartaat (NAA), choline, creatine en lactaat. NAA wordt exlusief in de neuronen gevonden en is een parameter voor axonale beschadiging [McDonald 1994]. The cholinepiek vertegenwoordigt het vrijkomen van lipiden en de afbraak van myeline. Een toename van mobiele lipidenpieken wordt geobserveerd in MS letsels en NAWM in de afwezigheid van focale inflammatie en bloedhersen-barrière doorbraak [Arnold et al. 1998]. NAA is verminderd in de focale letsels en NAWM van de MS-patiënt en de reductie is zelfs groter in SPMS dan RRMS patiënt [Husted CA 1994] De nauwkeurige correlatie tussen NAA en de klinische handicap voedt de axonale hypothesis, waarbij eerder axonaal verlies dan demyelinisatie verantwoordelijk is voor de functionele invaliditeit in MS. De resultaten met MRS en de recente bevindingen van axonale transectie in MS letsels suggereren dat axonaal verlies reeds vroegtijdig tijdens het ziekteproces voorkomt, het proces progressief blijkt en toenemende handicap als gevolg heeft [Ferguson B 1997; Trapp et al. 1998].

H-MRS van normale witte stof en een contralateraal actief MS letsel.

debruyne j.

39

40

debruyne j.

3) Magnetische Transfer Imaging Magnetische transfer beeldvorming (MTI) meet de magnetisatie tussen 2 polen: Gebonden (macromoleculaire) protonen en vrije (mobiele) protonen in weefsels [Wolff and Balaban 1989]. De signaalintensiteit van het beeld is verminderd wanneer er een overdrachtsreactie ontstaat tussen de 2 proton polen. De magnetisatie transfer ratio (MTR) is het procent van vermindering in signaal-intensiteit op beelden bekomen met maximale saturatie vergeleken met normale beelden. Oedema en inflammatie verstoren het evenwicht tussen beide polen met als gevolg een vermindering van 3 à 5% in MTR. Demyelinisatie, axonaal verlies en weefseldestructie veroorzaken een sterke reductie van de MTR [Dousset et al. 1992]. Weefsels met uitgebreide weefseldestructie (black holes) tonen extreem lage MTR’s vergelijkbaar met de MTR van CSF. In cross-sectionele studies werd bewezen dat er een omgekeerde correlatie bestaat tussen MTR van de letsels en klinische invaliditeit. Verschillende longitudinale studies hebben aangetoond dat er een statistisch significante vermindering van de MTR aanwezig is voor de doorbraak van de bloedhersen-barrière wat impliceert dat het letsel reeds voorkomt onder de detectiedrempel van de conventionele MRI [Filippi et al. 1998]. Abnormale MTR waarden werden eveneens waargenomen in de NAWM, waardoor het pathologisch substraat bewezen wordt [Loevner et al. 1995]. Om een globaal beeld te hebben van de ziekteactiviteit van de witte stof hebben van Buchem en collega’s MTR waarden gemeten van iedere voxel en de distributie van al deze waarden geplot op een MTR histogram waarbij de hoogte van de histogram peak in MS patiënten lager was dan normale controles [van Buchem et al. 1996]. Deze lage waarden correleren met cognitieve en fysische handicap [van Buchem et al. 1998]. MTR histogram bij controles (blauw) en MS patiënten.

debruyne j.

41

42

debruyne j.

4) Functionele Magnetische Resonantie beelden (fMRI) In functionele MRI wordt de corticale activatie gemeten veroorzaakt door motorische of sensoriële stimuli. Deze stimuli zijn het resultaat, op basis van een normaal fysiologisch antwoord, van een toename van de corticale doorbloeding. Dit leidt tot een gelokaliseerde bloedpooling, die zuurstof afgeeft aan de functioneel geactiveerde corticale gebieden met als resultaat een verminderde concentratie van deoxyhemoglobine, een paramagnetische stof die in staat is veranderingen in signaal intensiteiten te visualiseren. Verschillende fMRI studies zijn reeds gerapporteerd bij MS patiënten [Yousry et al. 1998; Gareau et al. 1999]. Dit onderzoek zou een sensitieve methode kunnen zijn voor het opsporen van reversibele versus irreversibele functionele letsels bij MS patiënten, om klinische trials te evalueren en het testen van cognitieve functies. Een nieuwe techniek om veranderingen in de corticale activiteit te monitoren mede door de ontwikkeling van de snelle beeldvorming.

Een fMRI met een 3D-rendering van taal op hersenen. Het gebruikte paradigma is woordgeneratie gecontrasteerd met tellen. De patient heeft een bilaterale taalrepresentatie voor deze taak die vooral de expressieve taalzones toont.

debruyne j.

43

44

debruyne j.

5) Positron Emissie Tomografie Algemene beschouwingen Positron Emissie Tomografie (PET) maakt gebruik van radio-isotopen die ingebouwd worden in een molecule [Wilson MA 1998; Murray IP 1998]. Deze gemerkte molecule in kleine hoeveelheden aan de patiënt toegediend, dient in hoge concentraties opgenomen te worden in het te bestuderen orgaan. Bij PET beeldvorming wordt voornamelijk gebruik gemaakt van isotopen die positronen vrijgeven. De eerste toepassing van de PET gebeurde bij de beeldvorming van de hersenen, namelijk detectie van epileptische foci, activatiestudies en tumordetectie. Bij PET worden positron-emittors gebonden aan moleculen, deze worden via injectie of via inhalatie in het lichaam van de patiënt gebracht en door hun specifieke moleculaire structuur en affiniteit opgenomen in bepaalde organen of weefsels. Positron-emittors, radio-isotopen, die bij verval een positron uitsturen dat met een elektron uit de nabije omgeving annihileert. Hierbij worden 2 fotonen uitgestuurd in een onderlinge hoek van ongeveer 180 graden. Wij kunnen evenwel veronderstellen dat de fotonen en de plaats van annihilatie zich op één lijn bevinden en dat de fotonen zich op gelijke tijdstippen even ver van de plaats van de annihilatie bevinden waardoor dus de plaats van de annihilatie kan worden bepaald. De camera bepaalt de annihilatieplaats door 2 detectoren, die symmetrisch liggen tegenover elkaar en tegelijkertijd worden getroffen door een foton. De computer die met de camera is verbonden kan onrechtstreeks de plaats van de isotoop reconstrueren en uiteindelijk de ganse ruimtelijke verdeling van de positronstraler binnen de camera. De meest gebruikte positronstralers zijn 11C, 15O en 18F. Gezien het korte half-leven van deze radio-actieve kernen, die uiteindelijk met een isotopen gemerkt worden, globaal gezien vrij kort is, is de procedure intensief. De ruimtelijke verdeling van de isotoop geeft een beeld van de functionele processen in het lichaam zoals de doorbloeding, metabolisatie van bepaalde stoffen, opname in bepaalde cellen. De procedure is zeer gevoelig omdat de functieveranderingen bij een ziekteproces reeds vroeg optreden, nog voor anatomisch iets abnormaals waar te nemen valt. Een nadeel van de functionele beeldvorming is dat dikwijls anatomische herkenningspunten in het beeld ontbreken waardoor beeldfusietechnieken dienen te worden toegepast om het functionele beeld te correleren met het anatomische beeld van dezelfde patiënt [3D'Asscher PA van den Elsen 2004]. De isotopen worden ingebouwd in een tracermolecule of ligand, die kan worden geïnjecteerd of geïnhaleerd, waardoor de verdeling ervan in het lichaam kan worden gevolgd. De meest gebruikte liganden in het onderzoek van de hersenen zijn H2 15 O, C15O2, 15O2, C15O, 18F-fluoro-2-deoxy-D-glucose (18FDG) [Costa et al. 1999]. C15O2 en 15O2 worden toegediend via inhalatie om de cerebrale doorbloeding en het zuurstofverbruik te kwantificeren. C15O2 wordt in de longcapilairen omgezet tot bicarbonaat en vervolgens tot H2O dat via de circulatie de hersenen bereikt. Dit H2O komt in evenwicht met de waterpool van het hersenweefsel. Na enige tijd van inhalatie ontstaat een steady state tussen de aan-en afvoer van het gemerkte H2O en radioactief verval. Via een mathematisch model kan uit de radioactiviteit in het bloed en de gemeten hersenactiviteit een regionele doorbloeding worden berekend. Op een analoge manier wordt na inhalatie van 15O2 een berekening gemaakt van de zuurstofextractie uit het bloed. Een combinatie van doorbloeding en zuurstofextractie laat ons toe een absolute kwantificatie te maken van de regionale zuurstofmetabolisme [Frackowiak et al. 1980]. C15O wordt eveneens geïnhaleerd en wordt gebruikt om het regionale bloedvolume te bepalen. Dit kan noodzakelijk zijn om te corrigeren voor intravasculaire activiteit, zoals soms nodig is voor studies van neuroreceptoren-liganten en zelfs voor de steady state debruyne j.

45

techniek in de bepaling van de regionale cerebrale doorbloeding [Frackowiak, Lenzi, Jones, and Heather1980]. 18FDG intraveneus toegediend, is een analoog dat in hersenweefsel wordt opgenomen doch die, in tegenstelling tot glucose, slechts een partiële intracellulaire afbraak ondergaat tot FDG-6-fosfaat, daarna wordt het niet verder gemetaboliseerd. Deze gemerkte stof blijft intracellulair aanwezig vooral in weefsels die veel 18FDG opnemen. Een absolute kwantificatie met het glucose metabolisme kan met een mathematisch model opnieuw worden berekend [Lammertsma et al. 1987; Piert et al. 1996]. De keuze van model speelt een bijlangrijke rol in de uitkomst van de resultaten. De methodologie is bijgevolg in vele gevallen, afhankelijk van de aard van de pathologie (focaal, diffuus). Daarom dienen vele PET studies zich noodgedwongen te beperken tot een semikwantitatieve analyse bij gebrek aan een normale referentiezone (voorbeeld MS). PET in MS PET kan eveneens informatie verschaffen i.v.m. aangetaste neuronale netwerken door lesies op verschillende lokalisaties. Reeds eerder werd aangetoond dat een globaal verminderd glucose metabolisme correleerde met de totale letseldichtheid en cognitieve dysfunctie. Tevens werd aangeduid dat veranderingen in de corticale neuronale functie een weerspiegeling zijn van de ernst van de witte stofletsels [Blinkenberg et al. 2000]. De correlatie met cognitieve dysfunctie werd aangetoond door studies met 18FDG en PET. Een onderzoek door Paulesu en medewerkers toonde aan dat MS patiënten met verbale en/of spatiale geheugenstoornissen, vergeleken met personen met een normaal neuropsychologisch onderzoek, een bilateraal verminderd glucose metabolisme vertoonden ter hoogte van de gyrus cinguli, de thalamus, de associatieve occipitale cortex en het cerebellum in afwezigheid van zichtbare letsels op de MRI [Paulesu et al. 1996]. Bij een gedeelte van deze patiënten met neuropsychologische tekenen van frontale dysfunctie werd bilateraal bijkomend glucose hypometabolisme gevonden, onder meer ter hoogte van de prefrontale en pariëtale cortex en de basale ganglia. Dit onderzoek toonde verder een hypometabolisme aan van de thalamus en de diepe grijze cortex ter hoogte van de temporale kwab bij MS patiënten met episodische geheugenstoornissen. Globaal kunnen wij stellen dat MS patiënten met frontale cognitieve stoornissen geassociëerd zijn met een verspreide vermindering van glucose metabolisme. Dezelfde bevindingen werden vastgesteld in een groep van 20 definitieve MS patienten met een 15O PET onderzoek in combinatie met een MRI. Men stelde een duidelijke vermindering vast van de regionale cerebrale doorbloeding (rCBF) en het regionaal cerebrale zuurstofmetabolisme (rCMRO2). Deze verminderde doorbloeding in de witte en grijze stof correleerde significant met het aantal en de grootte van de witte stofletsels op de MRI. De ernst van het cerebrale hypometabolisme en de cognitieve dysfunctie was eveneens gerelateerd aan de aanvalsfrequentie [Sun et al. 1998]. Een PET studie in 47 MS patiënten met 18F-fluorodeoxyglucose kon aantonen dat er een verminderd glucosemetabolisme aanwezig was in de frontale cortex en de basale ganglia bij patiënten met pathologische vermoeidheid [Roelcke et al. 1997]. Tenslotte toonde een PET studie met 18FDG, gecombineerd met MRI en MRS van de witte stof aan dat bij stabiele MS de meeste grote T2 letsels relatief een verhoogd glucose metabolisme, en een verminderde N-acetylspartaat (NAA) concentratie vertoonden en dat bij de NAWM er een significante vermindering van NAA aanwezig was vergeleken met de normale witte stof (NWM), maar geen verandering in het glucose metabolisme. Bij actieve letsels echter werd eveneens een hypermetabolisme van glucose waargenomen [Roelcke et al. 1997]. 46

debruyne j.

PK11195, De perifere type benzodiazepine receptoren(PBR) en microglia De grootste densiteiten van PBR bevinden zich in de perifere organen zoals de bijnier, de speekselklier, testis en ovarium, neusepithelium, long, nieren en strukturen die een rol spelen in de stereogenesis. In tegenstelling met het centrale type van benzodiazepine receptoren, zijn slechts een klein gedeelte van de PBR aanwezig in de hersenen. Ze kunnen specifiek aangetoond worden met de ligand PK11195, een isoquinoline carboxamide derivaat (1-2-chlorophenyl)-N-methyl-N-(1-methylpropyl)-3-isoquinolinecarboxamide) [Marangos et al. 1982; Benavides et al. 1983]. In normale hersenen van katten en mensen komen de grootste hoeveelheden van PBR voor in de grijze stof. Ze zijn eveneens diffuus verspreid bijvoorbeeld in de extrapyramidale, motorische, vestibulocerebellaire, visuele en auditieve neuronale verbindingen en bloeddruk regulerende structuren [Benavides et al. 1984; Doble et al. 1987]. De natuurlijke endogene ligand voor de PBR, gelegen op mitochondriae, cytosolstrukturen en celkernen, blijken de porfyrinen te zijn [Anholt et al. 1986]. De mitochondriae zijn de initiële en finale stap in de biosynthesis van porfyrines. De fysiologische rol van de PBR zou iets te maken hebben met epileptogenesis. Meer bepaald bij het induceren van epileptische aanvallen zouden de receptoren een pro-convulsief effect hebben. Dit kan geïnhibeerd worden door PK11195 [Mestre et al. 1984]. Niettegenstaande hersenen van ratten en muizen normaal lage spiegels van PBR bevatten, ontstaat er een snelle toename van de densiteit tengevolge van hersenletsels. Toename van 400 procent en meer komen bijvoorbeeld voor na intrastriatale of systemische injecties van neuronale excitotoxines [Benavides et al. 1987; Kish et al. 1983]. Toename van PBR wordt geassocieerd met proliferende gliacellen [Schoemaker et al. 1982] na neuronale destructie. Grote densiteiten van PBR komen bijvoorbeeld voor in gliale hersentumoren [Starosta-Rubinstein et al. 1987]. PBR spelen eveneens een rol in de toename van de oxidatieve eigenschappen van macrofagen [Zavala and Lenfant 1987], in de chemotaxis van monocyten [Ruff et al. 1985] en de toename van prolactine dependente mitogenesis in lymfocyten [Laird et al. 1989]. Activatie van de receptoren kunnen intracellulaire mechanismen en interacties op biologische signalen beïnvloeden. In het centrale zenuwstelsel zijn de PBR gelegen op de microglia/macrofagen lijn, fagocytaire hersencellen die in normale omstandigheden een geramifieërd uitzicht vertonen. Deze gliale celpopulatie, gelegen in de grijze en witte stof, veranderen in geactiveerde hersenmacrofagen, een dynamisch genetisch geïnduceerde expressie; een monocytaire lijn met immuno-gemedieerde antigen producerende cellen (APC) [Barron 1995]. In pathologische omtandigheden worden de microgliacellen geactiveerd en veranderen ze in antigen expressieve cellen. Bij neurogene schade fagocyteren zij de cellulaire katabolieten en scheiden zij cytotoxische stoffen af [Kreutzberg 1996], zoals proinflammatoire cytokines, complement componenten en reactieve intermediairen zoals peroxiden, anionen, hydroxyl, radicalen, hydrogenperoxiden. Deze neurotoxische stoffen kunnen schade aanbrengen die leidt tot neuronaal verlies zelfs evoluerend naar retrograde Wallerse degeneratie [Banati et al. 1993]. Microglia behoren tot beenmerg afgeleide elementen die aangetroffen worden in het CZS. Ze bevatten MHC klasse 1 moleculen, zijn perivasculair en parenchymaal gelegen. Ze vertolken een bijlangrijke rol in het neuroimmuun proces, waarschijnlijk als APC [Hickey et al. 1992]. Microglia zijn dus residentiële APC’s van het CZS gezien rond de perivenulaire gebieden in de nabijheid van de endotheliale cellen, doch eveneens verspreid in het parenchym [Sriram and Rodriguez 1997].

debruyne j.

47

48

debruyne j.

HLA-DR expressie in geactiveerde microglia in de normaal ogende witte stof in MS hersenen

CD68 expressie in macrophagen en geactiveerde microgliale cellen in de witte stof aan de rand van een actief letsel.

HLA-DR expressie op schuimcelmacrophages in een actief demyeliniserend MS letsel

Met dank aan Prof H.Lassmann voor de histologische beelden debruyne j.

49

50

debruyne j.

PK11195 in vitro en in vivo pathologie Autoradiografische studies De lokalisatie van de PBR werden radiografisch onderzocht in normale hersenen van de kat en de mens [Benavides, Savaki, Malgouris, Laplace, Daniel, Begassat, Desban, Uzan, Dubroeucq, Renault, and .1984; Doble et al. 1987]. De ligand [3H] PK11195 bindt specifiek, reversibel en gesatureerd op de PBR gelegen op de microglia/macrofagen met een specificiteit van 80%. Deze bindingen zijn heterogeen verdeeld in de grijze stof en quasi afwezig in de witte stof. De fysiologische betekenis van deze regionale distributie is onbekend. De hoogste densiteiten van deze ligand bevinden zich in de diëncefale structuren bijvoorbeeld in de thalamische en hypothalamische kernen. Door middel van de autoradiografie kan men de toegenomen densiteit opsporen van de specifieke ligand van de PBR in verschillende pathologiëen. Daar de PBR voornamelijk aanwezig zijn in mononucleaire cellen, weerspiegelt de verhoogde densiteit macrofagen invasie en gliale proliferatie. Deze techniek kan ook van toepassing zijn bij verschillende neurologische aandoeningen. Een duidelijke topografische correlatie tussen de histologische aflijning van een meningeoom, hersenmetastasen en astrocytomen en hoge densiteiten van PBR bindingen werden aangetoond [Black et al. 1989]. Evenwel is deze techniek niet beperkt tot hersentumoren daar er eveneens verhoogde PBR ligand densiteiten worden aangetoond in uiteenlopende vormen van hersenpathologie, inclusief degeneratieve ziekten zoals bijvoorbeeld de ziekte van Huntington [Schoemaker et al. 1982], en de ziekte van Alzheimer [Diorio et al. 1991]. Bij epilepsie werd een correlatie aangetoond tussen verhoogde concentratie van PK11195 en de graad van gliosis [Kumlien et al. 1992]. Bij ischemische letsels is er een verhoogd signaal van PK 11195. Dit wijst op een verhoogde aanwezigheid van macrofagen op de plaats van het letsel [Myers et al. 1991]. Tenslotte kon bij MS een tot 10 x verhoogde concentratie van de PBR aangetoond worden vergeleken met de normale witte stof in de periferie van de actieve plaques met een perfect spatiale correlatie tussen de verhoogde densiteiten en de histologische uitgebreidheid van het demyeliniserend letsel [Benavides et al. 1988]. Door middel van hoge resolutie microautoradiografie in MS en EAE weefsel in combinatie met immunohistochemische celidentificatie bewees Banati en zijn medewerkers dat PBR gelegen zijn op in loco invaderende monocyten op plaatsen van focale inflammatie en op geactiveerde microgliacellen verwijderd van de inflammatoire focus [Banati et al. 1997]. Na een axotomie van de nervus facialis kon retrograde neuronale aantasting worden aangetoond zonder dat apoptosis optrad waarbij de bloedhersen barrière intact bleef. Het waren voornamelijk de geactiveerde microglia die de bron waren van het geïnduceerde letsel door een verhoogde PK11195-binding ter hoogte van de faciale nuclei. Hetzelfde werd aangetoond na een transsectie van de nervus ischiadicus bij een proefdier: namelijk een antegrade neuronale aantasting van de nucleus gracilis. De microautoradiografie bevestigde de selectieve binding van PK11195 op de geactiveerde microglia onafhankelijk van een doorbraak van de bloedhersen-barriere noch van de aanwezigheid van macrofagen en inflammatoire cellen [Banati, Myers, and Kreutzberg1997].

debruyne j.

51

[11C] PK11195 en PET In normaal hersenweefsel zijn microglia residerende, stille, alomtegenwoordige, geïsoleerde bewakers zonder enig onderling celcontact, gesitueerd in het ganse normale CZS. Bij ziekte, hetzij metabool of structureel, veranderen zij echter snel in geactiveerde cellen die de plaats van het ziekteproces binnendringen. Dit geeft hun een belangrijke diagnostische waarde voor het aantonen van de spatiale lokalisatie van eender welke actieve ziekte, zowel acuut als chronisch. Het isoquinoline PK11195 is een relatief selectieve cellulaire ligand voor de PBR op de geactiveerde microgliacellen gelegen. Wanneer zij radioactief gelabeld worden met C11 [Camsonne et al. 1984] kunnen zij als PET tracer gebruikt worden om inflammatoire en neurodegeneratieve hersenziekten in vivo aan te tonen en te bestuderen door een significante stijging van [11C]PK11195 signalen die correleren met al dan niet klinisch functieverlies. Door middel van dit PET onderzoek kunnen geactiveerde microglia in het letsel, in de penumbra en zelfs op afstand, langs anterograde of retrograde neuronale projectiebanen worden aangetoond [Banati 2002b]. Deze data tonen aan dat hersenletsels niet statisch zijn en zelfs subtiele gliale antwoorden kunnen uitlokken in anatomische verwijderde gebieden. Dit impliceert dat de gliale activatie niet alleen een teken is van hersendestructie maar mogelijks ook een teken van ziekte-geïnduceerde adaptatie of plasticiteit. Dezelfde bevindingen worden geïllustreerd in een studie met PET en [11C]PK11195 tracer bij focaal geïnduceerde ischemie bij bavianen. Er werd een vertraagde (tussen 20 en 40 dagen na de occlusie van de arteria cerebri media), transiënte toename van de PBR aangetoond in en rond de infarctzone [Banati2002; Sette et al. 1993]. Bij Rasmussen’s encephalitis werden hoge densiteiten van [11C]PK11195 ligand waargenomen ter hoogte van het inflammatoir proces [Gunn et al. 1997], die door conventionele MRI inconsistent als inflammatoir weefsel kan worden gevisualiseerd. In een studie van Cagnin werd een verhoogde concentratie van [11C]PK11195 bindingen in milde en vroege vormen van Alzheimer dementie ontdekt. Dit suggereert dat microgliale activatie een vroeg proces is in de pathogenese van deze ziekte [Cagnin et al. 1999; Cagnin et al. 2001]. Bij herpes encephalitis werd eveneens een verhoogde concentratie van geactiveerde microglia aangetoond zowel ter hoogte van de acute focale letsels als ter hoogte van de omliggende gebieden en zelfs in het verloop van de aangetaste neuronale systemen [Cagnin et al. 2001]. In dezelfde zin kan worden aangetoond dat na denervatie van een onderste lidmaat, er een verhoogd thalamisch signaal aanwezig is tot vele jaren na de zenuwaantasting. Deze gliale activatie wijst op een blijvende reorganisatie van de thalamus, ondanks de thalamus en de somatosensoriële cortex morfologisch normaal bleken te zijn op MRI beelden. Tenslotte werd eveneens het nut bewezen van [11C]PK11195 en PET bij cerebrale vasculitis en bij studies van refractaire epilepsie [Goerres et al. 2001a]. [11C] PK11195 PET in MS De laatste jaren hebben een aantal studies het belang van geactiveerde microgliacellen en focale macrofagen infiltratie in MS aangetoond door middel van PET en [11C]PK11195 [Myers et al. 1998]. Door coregistratie met overeenkomende MRI kan men de anatomische lokalisatie van de verhoogde densiteit van PBR aantonen zowel in focale inflammaties als in de normaal ogende witte stof(NAWM). Als gevolg van een verbeterde signaal-ruis verhouding bij een 3-D PET kunnen de beelden worden geoptimaliseerd waardoor men verhoogde signalen kan zien, bijvoorbeeld ter hoogte van de bepaalde gedeelten van de 52

debruyne j.

thalamische nuclei en ter hoogte van de hersenstam. Deze beelden zijn dikwijls niet aantoonbaar met MRI en tonen soms secundair functionele aantasting aan langs neuronale banen afkomstig van primaire letsels. Als voorbeeld de tractus spinothalamicus lateralis bij een persoon met hypoesthesie, het corpus geniculatum lateralis bij een patiënt met een neuritis opticus, een verhoogd signaal in de fasciculus longitudinalis medialis bij een patiënt met een internucleaire optalmoplegie [Banati et al. 2000n]. Met PET werd een verhoogde opname van de ligand [11C]PK11195 op plaatsen van actieve MS letsels gedetecteerd door een coregistratie met MRI [Vowinckel et al. 1997a]. In in-vivo studies werd bewezen dat [11C]PK11195 zich bevindt op de geactiveerde microgliacellen. De astrocyten bevatten bij in vivo studies geen verhoogde ligand. Dit werd aangetoond in een studie met patiënten met hippocampale sclerosis [Banati, Myers, and Kreutzberg1997]. Een belangrijke bevinding met PET in MS was de verhoogde PBR expressie langs anatomische tracti door geramifieerde microglia. Dat impliceert immers dat gedurende een auto-immune aandoening microglia een wijdverspreide vroegtijdige activatie in de witte stof vertonen, onafhankelijk van autoreactieve T-cellen en zodoende reeds vroeg in het demyelinisatieproces betrokken zijn [Cuzner ML. 1997]. Het is niet onmogelijk dat regionale microglia, zelfs indien zij nog niet ontwikkeld zijn tot volwassen macrofagen reeds geactiveerd zijn en lokaal actieve cytotoxische factoren vrijstellen [Li et al. 1996]. Deze bevinding is cruciaal voor het proces van vroegtijdige demyelinisatie die leidt tot een “dying back” gliopathie [Rodriguez and Scheithauer 1994]. De preferentiële migratie van geactiveerde microglia in de NAWM langs de witte stof tracti en focale proliferatie, zoals bijvoorbeeld in het geval van de nervus facialis axotomie, tonen aan dat er een snelle activatie en proliferatie van microglia aanwezig is langsheen de neuronale weg van de aangetaste zenuw en ter hoogte van de faciale nuclei in afwezigheid van aantasting van de bloedhersen barrière en neuronale apoptosis [Kreutzberg 1996a]. Hetzelfde kan gezegd worden van de aantasting van de tractus spinothalamicus en de thalamus, van het corpus geniculatum lateralis en de neuritis optica door een geprojecteerd neuroinflammatoir antwoord. De activiteit van de microglia is wel het hoogst waar de bloedhersen-barrière onderbroken is, namelijk in de gadolinium-capterende T1-gewogen letsels op de MRI [Nesbit et al. 1991a]. Ter hoogte van oude letsels zoals de black holes [Truyen et al. 1996] ziet men slechts een lage binding. Gedurende een opstoot evenwel zien wij dat er een vernieuwde lokaal verhoogde expressie van de PBR in oude letsels ontstaat. De verhoogde expressie van [11C]PK11195 buiten de focale letsels gelegen in gebieden verwijderd van bloedhersenbarrière aantasting zoals ter hoogte van de NAWM doet veronderstellen dat het ziekteproces wijd verspreid is en kan een verklaring zijn van de discrepantie tussen het klinisch beeld en de MRI bevindingen [Riahi et al. 1998]. In dit opzicht zou [11C]PK11195 PET als functionele beeldvorming mogelijks een betere parameter van de klinische evolutie kunnen betekenen dan MRI en nieuwe pathofysiologische inzichten kunnen bijbrengen.

debruyne j.

53

54

debruyne j.

II. DOELSTELLING Hoewel de etiologie van MS nog niet bekend is, wordt de ziekte algemeen beschouwd als een chronische, inflammatoire aantasting van de myeline. Algemeen wordt aangenomen dat het een T-lymfocyt gemedieerde autoimmune aandoening is, gekenmerkt door infiltratie van lymfocyten en macro-fagen in het centrale zenuwstelsel (CZS) leidend tot demyelinisatie met neurologische uitvalverschijnselen als gevolg. De magnetisch resonantie (MR) van de letsels en inflammatoire activiteit in de hersenen en het ruggenmerg heeft onze kennis van de pathologie in het CZS aanzienlijk verbeterd. Er blijft evenwel een discrepantie bestaan tussen de radiologische bevindingen en klinische of histologische uiting van de ziekte [De Groot et al. 2001]. Daarom is er een dringende noodzaak aan biologische markers van ziekteactiviteit in urine, bloed en cerebrospinaalvocht. Continue verfijning van de beeldvormingstechnieken en het ontwikkelen van onderzoeken voor opzoeken van biologische markers zouden elkaar kunnen aanvullen om de ziekteactiviteit te evalueren. Identificatie van betrouwbare biologische markers voor ziekteactiviteit en ziekteprogressie is cruciaal voor het begrijpen van de etiologie en pathogenese van de ziekte, voor de diagnose en monitoring van de behandeling. Talrijke studies werden reeds uitgevoerd. Zo werd aangetoond dat een verhoogde expressie van adhesiemoleculen op circulerende mononucleaire cellen niet indicatief is voor ziekteactiviteit niettegenstaande verhoogde spiegels van oplosbare adhesiemoleculen zoals VCAM-1 en ICAM-1 predictieve waarden zouden hebben [Rieckmann et al. 1997; Archelos and Hartung 1997]. Matrix metalloproteïnasen waaronder gelatinase B (MMP-9) werden eveneens actief onderzocht als mogelijke markers van het ziekteactiviteit. De studies daaromtrent zijn controversieel [Leppert et al. 1998; Leppert et al. 1996]. Verschillende andere studies vermelden dat pro-inflammatoire cytokinen gestegen zijn in fasen van klinische relaps en progressie. Een aantal onderzoekers zoals Chofflon vermoedt zelfs dat de aanvallen kunnen veroorzaakt worden door verhoogde concentraties van circulerende cytokinen zoals TNF-α en INF-γ [Chofflon et al. 1992]. Dit werd trouwens aangetoond in een klinische studie door Panitch in 1991 waarbij INF-γ, intrathecaal toegediend, de oorzaak bleek van een dramatische toename van het aantal klinische aanvallen [Panitch 1991; Chofflon, Juillard, Juillard, Gauthier, and Grau1992]. Toch blijven er belangrijke tegenstrijdigheden bestaan in de resultaten van de verschillende onderzoeksgroepen. Moleculen van macrofagen werden eveneens onderzocht als markers en Giovannoni en medewerkers toonden aan dat neopterine-spiegels in de urine correleren met de inflammatoire component van MS [Giovannoni et al. 1997]. De immunopathologische mechanismen in het CZS weerspiegelen zich in de perifere circulatie met verhoogde circulatie van cytokinen en monocyten. Reder en Sarchielli toonden reeds eerder aan dat perifere bloedmonocyten een cruciale rol spelen in de inflammatie bij MS. Perifere bloed monocytaire cellen secreteren prostaglandines voorafgaand aan een MS aanval en er werd daarbij eveneens aangetoond dat de spiegel van TNF-α toeneemt [Reder et al. 1998]. Mononucleaire cellen worden geactiveerd als indirecte merker van ziekteactiviteit bij MS met een verhoogde vrijstelling van stikstof oxyde (NO) en pro-inflammatoire cytokinen [Sarchielli et al. 1997] Tot nu toe werd geen uniforme test voor opsporing van biologische markers van ziekteactiviteit ontwikkeld. MS is namelijk geen homogene ziekte. De klassieke presentatie en gedetailleerde neuropathologische studies hebben een aanzienlijke heterogeniciteit tussen de individuele patiënten aangetoond [Lucchinetti, Bruck, Rodriguez, and debruyne j.

55

Lassmann1996]. Voortdurende de- en remyelinisatie leidt tot schijnbare tegenstrijdige fluctuatie in ziektemarkers. Door het feit dat de ziekte multifactorieel is, een gestoorde immune homeostasis vertoont en een grote variabiliteit in de progressie van het chronisch inflammatoir proces, lijkt het onwaarschijnlijk dat dit ingewikkeld gebeuren kan gerelateerd worden aan enkele specifieke biologische parameters. Rekening houdend met de variatie van de ziekte bij individuele patiënten zijn biologische studies met een follow-up periode van minstens 24 maanden noodzakelijk. In onze studie gingen wij de evolutie na van de ziekteactiviteit in het verloop van MS door middel van biologische markers. Daarvoor werden 22 MS patiënten maandelijks klinisch en biologisch gevolgd gedurende 2 jaar. In deze longitudinale studie onderzochten wij de rol van de T-lymfocyten en de monocyten met hun pro-inflammatoire cytokines zoals INF-γ, IL-2 en TNF-α in functie van de ziekteactiviteit en in relatie met relapsen. We gingen na in hoeverre TNF-α een in de praktijk bruikbare predictor is van een relaps. Cytokinen werden in vitro gestimuleerd op het bloed dat maandelijks werd afgenomen. De metingen gebeurden door middel van een enzym immunoassay. Neopterine-spiegels als markers van monocyten werden bepaald door middel van een radio-immunoassay. De monocyten en witte bloedcellen differentiatie werden automatisch gegenereerd door een perifeer bloedonderzoek en de geactiveerde T-lymfocyten tenslotte door middel van flowcytometrie. Recent wordt meer en meer aandacht besteed aan de rol van de macrofagen in het inflammatoire proces van MS, temeer daar deze cellen overvloedig aanwezig zijn in het CZS van patiënten en EAE modellen. Ze vertonen talrijke effectoractiviteiten, bijvoorbeeld: productie van pro-inflammatoire cytokinen zoals TNF-α en afscheiding van myelinotoxische factoren zoals metalloproteïnasen, vrije radicalen, NO en glutamaat die leiden tot myelineafbraak [Anthony et al. 2000; Pitt et al. 2000]. Hun aanwezigheid in MS-plaques en normaal ogende witte stof werd in vitro aangetoond door middel van hoge resolutie microautoradiografie met [3H]PK11195 en immunocytochemische kleuring [Vowinckel et al. 1997b; Benavides et al. 1987a; Banati, Myers, and Kreutzberg1997]. Reeds in vroegtijdige actieve letsels met hoge demyeliniserende activiteit werd een belangrijk proliferatie van macrofagen/microglia aangetoond [Schonrock et al. 1998]. Onlangs bleek een toegenomen belangstelling voor hersenatrofie in MS. Er werd vastgesteld dat, reeds in het begin van het verloop van de ziekte, er een belangrijk neocorticaal volumeverlies is bij MS patiënten, zowel bij relapsing remitting als bij primair progressieve vormen. Deze neocorticale pathologie is grotendeels secundair aan witte stof inflammatie en demyelinisatie en speelt een belangrijke rol in de toename van de invaliditeit [De Stefano et al. 2003]. Trapp en medewerkers van het Lerner Research Institute in Cleveland toonden in een postmortem studie van NAWM deze verhoogde axonale transsectie en microgliale activiteit aan [Trapp, Peterson, Ransohoff, Rudick, Mork, and Bo1998b]. Hersen- en ruggenmergatrofie zijn een teken van irreversibele hersen- en ruggenmergschade. Zij zijn het gevolg van verlies van axonale densiteit. Bij MS is er een belangrijke reductie van het hersenvolume, deze reductie ligt tot 3 tot 5x hoger dan bij controle personen. In een tweede luik van onze studie onderzochten wij het gedrag van geactiveerde microglia in het verloop van het ziekteproces. Dit deden wij door middel van positron emissie tomografie en de specifieke radioligand [11C]PK11195 van de perifere benzodiazepinereceptoren op de microglia gelegen. Voor het meten van de ligandopname 56

debruyne j.

werd een semi-kwantitatieve methode ontwikkeld bij normale personen en toegepast bij MS patiënten. De bedoeling was de rol van de microglia te bestuderen in acute inflammaties, in de normaal ogende witte stof, tijdens het acute stadium en tijdens het chronisch progressief verloop van de ziekte. Tenslotte wensten wij de relatie aan te tonen van neuroinflammatie met hersenatrofie om zo een bijkomend inzicht te krijgen in het immuno-fysiopathologisch gebeuren in MS. Atrofie metingen met MR werden in het verleden uitgevoerd met manuele aflijning of semi-automatische threshold segmentatietechnieken. Die bepalingen zijn minder betrouwbaar gebleken te wijten aan factoren zoals interindividuele variaties in hoofdomtrek en intracranieel volume, inconsistenties bij sequentie bepalingen zoals metingen van voxelvolume en dikte van de sneden, bewegingsartefacten, variaties in het instellen van technische parameters. Wij gebruikten een reproduceerbare, automatische, statistische segmentatie binnen het pakket SPM99, waarbij de hersenatrofie kan gemeten worden zonder manuele interventie en waarbij het volume van gesegmenteerde hersenbeelden kan worden bepaald. Deze methode werd geïntroduceerd door Chard van de MR research Unit van de University College in Londen voor het meten van witte en grijze stof parenchymfracties in vroege stadia van relapsing-remitting MS, gebruik makend van 3-dimensionele beelden [Chard et al. 2002]. Het zoeken naar inflammatoire parameters van ziekteactiviteit in MS is een belangrijk thema in de fysiopathologie van de aandoening. Het probleem blijft actueel daar tot op heden geen gevoelige, ziektespecifieke en gemakkelijk toegankelijke biologische merker werd gevonden. Een onderzoek in PubMed met als trefwoorden: “multiple sclerosis” en “biological markers” leverde 1718 artikels op in de periode van 1998 tot 2004. In onze studie hebben wij een aantal hypothesen opgebouwd die in de doelstellingen werden uiteengezet en die als volgt kunnen worden samengevat. In een eerste artikel hebben wij vooral de proinflammatoire cytokinen zoals TNF-α, INF-γ en IL-2 bestudeerd. We willen aantonen in hoeverre zij markers zijn van inflammatie en in aanmerking komen in het voorspellen van een klinische aanval. Vervolgens bestuderen wij de microgliacellen door middel van een beeldvormingstudie. Meer bepaald volgen wij het in vivo fysiopathologisch gedrag van geactiveerde microgliacellen met een PET scan studie met de radiogemerkte ligand PK11195. Wij willen weten hoe deze cellen deelnemen aan het neuroinflammatoir proces zowel bij actieve letselvorming als tijdens het chronisch verloop van de ziekte.

debruyne j.

57

58

debruyne j.

III. STUDIES Deze hypothesen hebben wij in 4 studies uitgewerkt. De eerste studie: “IN VITRO TNF-α, IL-2 AND INF-γ PRODUCTION AS MARKERS OF RELAPSES IN MULTIPLE SCLEROSIS” is een longitudinale immunologische studie waar wij de waarde onderzoeken van een aantal cytokinen als biologische markers van ziekteactiviteit bij 22 patiënten met klinisch definitieve MS. De TNF-α productie steeg vanaf 4 weken voor een exacerbatie. Seriële analyse van TNF-α bleek zinvol bij het voorspellen van relapsen bij sommige MS patiënten. Niettegenstaande INF-γ en IL-2 eveneens verhoogd waren tijdens de exacerbaties bleken deze cytokinen toch geen predictieve waarde te hebben. In de volgende 3 artikels volgen wij het in vivo gedrag van geactiveerde microglia met [11C] PK11195 PET scan in het verloop van MS in een heterogene populatie van 22 klinisch definitieve MS patiënten over een ziekteduur van 30 jaar In het eerste deel “SEMIQUANTIFICATION OF THE PERIPHERAL-TYPE BENZODIAZEPINE LIGAND [11C]PK11195 IN NORMAL HUMAN BRAIN AND APPLICATION IN MULTIPLE SCLEROSIS PATIENTS” onderzoeken wij de bruikbaarheid van een semi-kwantitatieve methode voor de opname meting van [11C] PK11195, een selectieve ligand van de perifere benzodiazepine receptoren op de microglia gelegen en een merker van microgliale activiteit. Deze methode wordt getest op 7 normale personen. We zien dat de opname van de ligand in de hersenen zeer laag is en dat de variatie van de waarde tussen de proefpersonen voldoende klein is om deze semikwantitatieve methode toe te passen op MS patiënten in de actieve en chronische fase van de ziekte. In het tweede deel van de [11C] PK11195 PET-studie, “PET VISUALIZATION OF MICROGLIA IN MULTIPLE SCLEROSIS PATIENTS USING [11C]PK11195”, passen wij de semi-kwantitatieve methode, die wij uitgetest hebben op normale personen, toe op een groep van 22 MS patiënten met een ziekteverloop van 30 jaar. We vinden, door een verhoogde ligand opname, dat de activiteit van de microglia zeer hoog is in de T1-gadolinium letsels. De activiteit daalt evenwel in de T2 letsels op de MR, om terug te stijgen in actieve fasen (klinisch of MR) van de ziekte. Daarenboven zien wij een gestage toename van [11C] PK11195 opname in de normaal ogende witte stof (NAWM), waardoor verondersteld wordt dat de werkelijke ziekteactiviteit zich in de NAWM afspeelt. Tenslotte, in het derde deel: “MICROGLIAL IMAGING WITH PET AND ATROPHY WITH MRI IN MS: RELATIONSHIP AND CLINICAL CORRELATES” onderzoeken wij het verband tussen neuroinflammatie, met als merker microgliale activiteit, en hersenatrofie. Voor de atrofie maken wij gebruik van de atrofie index. Wij hebben kunnen vaststellen dat hersenatrofie significant groter is in MS patiënten vergeleken met controle personen en dat de toename van [11C] PK11195 opname in de NAWM evenredig is met de toename van de hersenatrofie, ziekteduur en invaliditeit.

debruyne j.

59

I. IN VITRO TNF-α, IL-2 AND IFN-γ PRODUCTION AS MARKERS OF RELAPSES IN MULTIPLE SCLEROSIS Jan Philippé1*3 , Jan Debruyne2 3, Geert Leroux-Roels1 , Annick Willems1, Jacques Dereuck2 1

Laboratory of Clinical Chemistry, Microbiology and Immunology, University Hospital Gent, De Pintelaan 185, B-B-9000 Gent, Belgium 2 Department of Neurology, University Hospital Gent, De Pintelaan 185, B-9000 Gent, Belgium * Corresponding author: Centraal Laboratorium, UZ Gent, De Pintelaan 185, B-9000 Gent, Belgium, Tel: 32-9-240.34.08, Fax: 32-9-240.49.85, e-mail: [email protected] Abstract In 22 patients with definite multiple sclerosis (MS) we determined with monthly intervals over a period of 24 months the in vitro tumor necrosis factor-α (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ), and interleukin-2 (IL-2) production and the serum neopterin levels. The results were compared with normative data collected from 14 healthy controls over the same period. Twenty-nine relapses in 12 patients were noticed. We found increased in vitro TNF-α production from 4 weeks on prior to the day of an exacerbation. There was a significant correlation with in vitro IFN-γ release, the absolute blood monocyte count and the serum neopterin levels, suggesting that monocytes stimulated by IFN-γ play an important role in the TNF-α production. Serial analysis of in vitro TNF-α production proved to be a helpful tool in predicting relapses in MS patients. Furthermore, elevated levels of IFN-γ and IL-2 after stimulation with OKT3 during exacerbations were demonstrated. Serial analysis of these two biological markers revealed to be of no value in predicting relapses.

Keywords: Multiple Sclerosis, Interferon-γ, Tumor necrosis factor-α, Interleukin-2, Neopterin

1. Introduction The arguments for multiple sclerosis (MS) to be an immune-mediated process are circumstantial [1]. One of the major proofs for this statement is the presence of lymphocytes and macrophages in the perivenular infiltrates in the central nervous system in MS. Besides the local immunological events in the central nervous system (CNS), viral infections and the immune response they induce may provoke exacerbations in MS [2, 3]. Non-specific stimuli may activate the immunocompetent cells in general and the myelin-specific T-cells in particular. Once activated these cells acquire the capacity to penetrate the blood-brain barrier. This can explain the association between viral upper respiratory infections and acute attacks of MS [2]. In another study a threefold exacerbation rate was found during or after a viral infection [3]. Yednock et al. [4] showed that the expression of VCAM-1 plays a pivotal role in the adhesion of activated lymphocytes to the endothelial cells of the vessels in the CNS. The expression of VCAM-1 is upregulated by tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interferon-γ (IFN-γ) which can be produced by the activated lymphocytes. We assume that viral infections, even if their course is subclinical, activate the circulating immune cells, resulting in an increased cytokine production. It is extremely difficult to detect small variations (increase or decrease) of in vivo cytokine production for several reasons. The assays to quantify cytokines in serum probably lack the sensitivity to detect small changes. Furthermore, most cytokines have short half-lives and they mostly act locally in an auto- or paracrine fashion. Many cytokines are rapidly bound to soluble receptors, which can interfere with the detection. Therefore it may be necessary to find alternative ways to measure the priming of circulating 60

debruyne j.

immunocompetent cells. In the past few years the responsiveness to in vitro stimuli has become popular to overcome the abovementioned difficulties. Recently, three longitudinal studies in MS patients have been published that show an increase of the in vitro TNF-α or IFN-γ production preceding a relapse [5-7]. Recently, a model with transgenic mice clearly showed the importance of TNF-α in inflammatory demyelinating disease [8]. The aim of our longitudinal study was to explore if in vitro cytokine induction was increased before or during relapses. We selected IFN-γ and TNF-α, two pro-inflammatory cytokines. IFN-γ is a cytokine mainly produced by the lymphocytes of the TH1 subset. To evaluate the more general involvement of the TH1 lymphocyte subset also IL-2 production was measured. TNF-α is in the first place a monocyte product, but is also secreted by activated Tlymphocytes. To sort out if the monocytes take part in an increased TNF-α production we enumerated the circulating monocytes and measured the plasma-neopterin levels since neopterin is a specific marker of IFN-γ mediated monocyte/macrophage activation [9, 10]. Finally, we examined whether correlations between the biological parameters could be detected.

2. Patients and methods 2.1 Patients Patients were included in whom definite MS was diagnosed according to the criteria of Poser [11]. Patients were enrolled after informed consent was obtained and further followed during 24 months. Every month, the patients were questioned about the progress of their disease and disability, the occurrence of relapses, and they were clinically examined by one single neurologist. On each visit the Kurtzke's expanded disability status scale (EDSS) [12] was calculated and heparinized (endotoxin-free) and EDTA blood samples were collected. For comparison reasons, blood was drawn from 14 healthy persons who were also monitored on a monthly basis during the same period. A relapse was defined as an acute appearance of neurologic dysfunction during at least 48 hours causing an acute worsening of the clinical status of the patient. It is important to notice that many of the recurrent relapses only temporarily deteriorate ambulation without a permanent change in EDSS.

2.2 Whole blood mitogen-stimulation assays Stimulations in whole blood cell cultures were performed with purified phytohaemagglutinin (PHA) (Murex Diagnostics, Erembodegem, Belgium) or with anti-Tpan cells/CD3 monoclonal antibodies (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany). Final concentrations were 5µg/mL for PHA and 2.5 µg/mL for anti-CD3. For IL-2 and IFN-γ measurements, heparin blood was diluted 1/10 with RPMI 1640 medium supplemented with 2 mM L-glutamine, 50 U/mL penicillin and 50 µg/mL streptomycin (all from Life Technologies, Inc., Grand Island, NY). Supernatants were collected after a 48-hour incubation period. TNF-α stimulations were performed with PHA in non-diluted EDTA blood, and EDTA-plasma was collected after a 2hour incubation period. All samples were kept at -20°C until analysis.

2.3 Biochemical analyses Cytokine analyses for IFN-γ, TNF-α and IL-2 were performed with enzyme immunoassays, generously provided by Medgenix (Fleurus, Belgium), according to the manufacturer's guidelines. Neopterin levels were measured in heparin plasma with a radio immunoassay (Henning Berlin GMBH, Berlin, Germany). Complete blood cell counts and differential white cell counts were performed on a STKS from Coulter (Coulter, Hialeah, USA). To evaluate the number of activated T-lymphocytes the expression of HLA-DR on CD-3 positive lymphocytes was measured flow cytometrically on a Profile II (Coulter, Hialeah, USA). The monoclonal antibodies, T3 and anti-HLA-DR were also purchased from Coulter. debruyne j.

61

2.4 Statistics Comparisons were made between samples collected from 4 weeks prior to, until the day of an exacerbation, on the one hand, and samples collected at a distance of at least three months of an exacerbation, on the other hand. Therefore a paired Wilcoxon rank sum test was applied. Comparisons were also made with the healthy controls using a Mann-Whitney U test. Twotailed tests of significance were used. Correlations were studied with the Spearman's rank correlation coefficient.

3. Results 3.1 Patients Twenty-two patients with clinically definite MS Table 1 were included, 13 males and 9 females, mean Baseline and final EDSS scores and age 40 ± 12 (mean ± SD). They were compared the number of exacerbations with 14 age- and sex-matched healthy registered in the active MS patients individuals selected from the laboratory personnel (8 males and 6 females), mean age 39 Patient Baseline Final Number of ± 9. None of the patients suffered from other Number EDSS EDSS exacerbations chronic diseases or received an Relapsing remitting patients immunosuppressive therapy. According to the 1 1 2 1 clinical follow-up, patients were divided in 2 4 5,5 4 inactive (n=6) and active MS (n=16) patients. Six patients remained stable 3 3 3,5 3 throughout the observation period and their 4 3 4 6 EDSS scores did not change (three patients with 5 4 4 2 1.5, one patient with 4.5, and two patients with 6 4 5,5 4 6.5). Six patients showed a relapsing remitting pattern with at least one relapse, defined by a Relapsing progressive patients neurological decline for at least 48 hours. A total number of 20 relapses were recorded in 1 5,5 6 0 this group. Nine patients were classified as 2 7 7 2 relapsing progressive, defined as secondary 3 4,5 6,5 1 progressive with superimposed relapses. One 4 5 5,5 0 patient showed a typical primary chronic 5 6 6,5 2 progressive pattern, defined as progressive MS 6 5,5 6,5 1 without superimposed relapses from the beginning. In the relapsing progressive group 7 3 4 1 three patients showed no relapses and 9 relapses 8 4 4,5 0 were observed in six others. In about half of the 9 6 7 2 patients relapses were accompanied by a permanent change in EDSS. The baseline and Primary progressive patients final EDSS scores are shown in table 1. On 7 1 6 7,5 0 occasions patients consulted the neurologist on the day a relapse started. The blood drawn during these visits was used for analysis. For the evaluation of the 22 remaining relapses the blood drawn during the visit preceding the relapse was used for analysis. A time span from 1 to 27 days was recorded between the bleeding and these relapses. 62

debruyne j.

3.2 Biochemical markers Results of the peripheral complete blood cell counts are shown in figure 1. WBC counts were significantly increased in the active MS patients (n=16) when compared to controls (8140 ± 1990 /µL versus 6750 ± 970 /µL, respectively; p=0.02). This difference was mainly due to increased neutrophil polymorphonuclear cell counts in the MS patients (5390 ± 1860 /µL versus 3910 ± 880 /µL; p=0.01). The highest levels (>10000/µL) were found in patients 3 and 4 of the relapsing remitting group and patients 3 and 6 of the relapsing progressive group. There was also a tendency for monocytes to be increased (660 ± 190 /µL versus 550 ± 90 /µL; p=0.08). For lymphocyte absolute counts no differences were found, however, proportionally a decrease was found (25.4 ± 5.7 % versus 30.1 ± 6.1 %; p=0.04). The levels were remarkably stable throughout the observation period and there was no relationship with exacerbations. No differences were found in circulating activated T-lymphocytes between controls and patients (fig. 1), nor between levels measured during exacerbations and remissions. Within the group of* the active MS patients a comparison of the in vitro TNF-α production was made between the samples drawn during (or immediately preceding) an exacerbation and the samples obtained 3 months before (T-3) and 3 months after (T+3) the clinical relapse. Five relapses succeeded one another so quickly that comparisons with T-3 and T+3 could not be made. TNF-α levels were *found to be elevated during the relapses (1130 ± 810 pg/mL versus 740 ± 340 pg/mL at T-3, p<0.01, and 750 ± 460 at T+3, p=0.02) (fig. 2). The TNF-α production measured on the day of the relapse did not differ significantly from that measured during the latest visit in a period of shorter than one month preceding the relapse. Similar comparisons were done for IL-2 and IFN-γ but did not result in significant differences, probably because of lack of power of the study. Comparisons between healthy controls and patients with stable MS or with active MS are shown in table 2. In the MS patients we found that TNF-α levels correlated significantly with the absolute monocyte counts (r=0.69) and with IFN-gamma levels (PHA-stimulated) (r=0.62). Neopterin levels are shown in table 2. Neopterin levels correlated with TNF-α production (r=0.81), monocytes (r=0.69) and IFN-γ production (r=0.57), but there was no clear relationship with relapses.

debruyne j.

63

Table 2

Comparisons in cytokine production between healthy controls, patients with relapses and stable patients including the patients during remission periods Means of stable Healthy controls From 4 weeks patients and patients before until a (mean values, during remission relapse (n=29) n=14) periods (n=21) INF-γ (PHA) 64 ± 24 76 ± 70 61 ± 52 (IU/ml) 445 ± 355 INF-γ (OKT3) 145 ± 210 (p=0.02, vs. 227 ± 251 (IU/ml) healthy controls) IL-2 (PHA) 7.7 ± 4.1 8.1 ± 5.8 9.4 ± 4.0 (IU/ml) 0,87 ± 0,57 IL2(OKT3) 0.41 ± 0.33 (p<0.01, vs. 0.52 ± 0.45 (IU/ml) healthy controls) TNF-α (PHA) 715 ± 340 1140 ± 850 740 ± 525 (pg/ml) Serum6.4 ± 1.5 6.2 ± 1.4 (p=0.03, vs. neopterin 5.5 ± 0.9 (p<0.01, vs. healthy controls) (nmol/l) healthy controls) Results are presented as mean ±SD

64

debruyne j.

Fig. 1. The red bars represent the mean ±SD for the active MS patiënts. The stippled bars represent the mean ±SD for the healthy controls. PMN: neutrophil polymorphonuclear cells. The arrows indicate the γaxis to use. *: p<0.05.

Fig. 2. In vitro production of TNF-α in relation to relapses, 3 months before, in a period of one month preceding and 3 months after a relapse. Concentrations are given in pg/ml.

debruyne j.

65

66

debruyne j.

4. Discussion In patients with active MS, we found increased in vitro TNF-α production during or immediately preceding (less than 1 month) clinical relapses. The correlations of this in vitro TNF-α production with the absolute blood monocyte count and the serum neopterin levels suggest that monocytes play a role in this phenomenon. Since the circulating monocyte count was not significantly increased during relapses we assume that the preactivation state of these cells rather than the number is of importance. The increase in TNF-α mRNA in PBMC found by Rieckmann et al. [13] is in agreement with our results. This authors measured in blood, which is a more direct approach. They showed a high correlation between TNF-α mRNA expression in blood mononuclear cells from MS patients and the levels of TNF-α secreted into the supernatant from the same cells stimulated with PHA/LPS. This is an indication of the translation of the mRNA into the protein. However, they did not prove the predicted value of the TNF-α protein for relapses, this is what we did in our study. However, they did not make the distinction between monocytes and lymphocytes, which would have been interesting with reference to our results. The increased TNF-α production and circulating neopterin correlated strongly with the in vitro IFN-γ production which makes it tempting to think about a causal role of IFN-γ in the activation of the monocytes. The EDSS is far from perfect in assessing disease activity. Many of the new appearing white matter lesions on T2 weighted and gadolinium T1 weighted MRI scans are not reflected in clinical disability [14]. This may explain the rather poor correlation between clinical course and biological parameters. The increased IFN-γ and IL-2 in vitro production during exacerbations reveal a T-cell activation in our patients. IFN-γ and IL-2 are produced mainly by the TH1 subset of CD4+ helper T-cells. A large body of evidence indicates that MS may be mediated by a in loco TH1dominated response which is extensively reviewed by Olsson [15]. It is important to notice that stimulations with OKT3 resulted in a more pronounced difference between controls and patients than stimulations with PHA. It is not easy to explain this difference since both stimuli act in a non-specific way. Whether differences in signal transduction can throw light upon this phenomenon remains to be established. The serial analysis of these two cytokines turned out to be useless as a predictor of a relapse. The T-cell activation was also illustrated in another study [16] by the high levels for cL-selectin that were found in serum from patients with active and stable MS. Our results show that the changes in cytokine production are not reflected by any change in the number of circulating activated T-lymphocytes. A remarkable result was the continuously increased number of circulating neutrophils in a number of MS patients. One of the most common causes for elevated neutrophil counts in MS patients are urinary tract infections. However, this problem was not found in the 4 patients with the highest scores. The increase is possibly the consequence the chronic inflammatory state. The 4 patients mentioned above showed a course of disease with numerous relapses or a marked increase in EDSS. Chronically increased neutrophil counts have also been described in many chronic inflammatory diseases, including rheumatoid arthritis and ulcerative colitis. They have also been observed during emotional stress or mania [17]. The high levels of polymorphonuclear cell counts in our patients could not be due to repeated corticosteroid treatment for relapses since their administration occurred remote from blood sample collection. Based on this observation, MS can be added to the list of differential diagnosis in the case of neutrophilia. Whether a change in polymorphonuclear leukocyte functions was present, as described previously [18], was not tested in our study. We conclude that in vitro TNF-α production can be helpful in predicting a relapse in MS patients. The TNF-α produced in vitro is probably the consequence of an increased stimulation debruyne j.

67

of the monocytes by IFN-γ, produced by the TH1 lymphocytes. This hypothesis is endorsed by the strong correlations found between circulating neopterin levels and in vitro TNF-α and IFNγ production. The increased in vitro IL-2 production further points towards an involvement of the TH1 lymphocytes. The high circulating neutrophil counts illustrate the chronic inflammation present in active MS but this parameter is not useful in predicting relapses.

References 1. Martin, R., McFarland, H.F. and McFarlin, D.E. Immunological aspects of demyelinating diseases. Annu Rev Immunol 1992; 10: 153-187. 2. Panitch, H.S., Bever, C.T.J., Katz, E. and Johnson, K.P. Upper respiratory infections trigger attacks of multiple sclerosis in patients treated with interferon-ß. J Neuroimmunol 1991; 35 (Suppl. 1): 125. 3. Sibley, W.A., Bamford, C.R. and Clark, K. Clinical viral infections and multiple sclerosis. Lancet, 1985; i: 1313-1315. 4.Yednock, T.A., Cannon, C., Fritz, L.C., Sanchez-Madrid, F., Steinman, L. and Karin, N. Prevention of experimental auto-immune encephalomyelitis by antibodies against α4β1 integrin. Nature 1992; 356: 63-66. 5.Haahr, S., Moller-Larsen, A., Justesen, J. and Petersen, E. Interferon induction, 2'-5' oligo A synthetase and lymphocyte subpopulations in out-patients with multiple sclerosis in a longitudinal study. Acta Neurol. Scand 1986; 73: 345-351. 6.Beck, J., Rondot, P., Catinot, L., Falcoff, E., Kirchner, H. and Wietzerbin, J. Increased production of interferon gamma and tumor necrosis factor precedes clinical manifestation in multiple sclerosis: Do cytokines trigger off exacerbations? Acta Neurol. Scand. 1988; 78: 318323. 7.Chofflon, M., Juillard, C., Juillard, P., Gauthier, G. and Grau, G.E. Tumor necrosis factor α production as a possible predictor of relapse in patients with multiple sclerosis. Eur Cytokine Netw 1992; 3: 523-531. 8.Probert, L., Akassoglou, K., Pasparakis, M., Kontogeorgos, G. and Kollias, G. Spontaneous inflammatory demyelinating disease in transgenic mice showing central nervous systemspecific expression of tumor necrosis factor α. Proc Natl Acad Sci. 1995; 92: 11294-11298. 9.Shoedon, G., Troppmair, F., Adolf, G., Huber, C. and Niederwieser, A. Interferon-gamma enhances biosynthesis of pterins in peripheral blood mononuclear cells by induction of GTPcyclohydrolase I activity. J Interferon Res 1986; 6: 697-703. 10.Ott, M., Demisch, L., Engelhardt, W. and Fischer, P-A. Interleukin-2, soluble interleukin-2 receptor, neopterin, L-tryptophan and β2-microglobulin levels in CSF and serum of patients with relapsing-remitting or chronic-progressive multiple sclerosis. J Neurol 1993; 241: 108114. 68

debruyne j.

11.Poser, C.M., Paty, D.W., Scheinberg, L., McDonald, W.I., Davis, F.A., Ebers, G.C., Johnson, K.P., Sibley, W.A., Silberberg, D.H. and Tourtelotte W.W. New diagnostic criteria for Multiple Sclerosis: guidelines for research protocols. Ann Neurol 1983; 13: 227-231. 12.Kurtzke, J. Rating neurological impairment in MS: an Expanded Disability Staus Scale (EDSS). Neurology 1983; 33: 1444-1452. 13. Rieckmann, P., Albrecht, M., Kitze, B., Weber, T., Tumani, H., Broocks, A., Luer, W., Helwig, A. and Poser, S. Tumor necrosis factor-alpha messenger expression in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis is associated with disease activity. Ann Neurol 1995; 37: 82-88. 14.Harris, J.O., Frank, J.A., Patronas, N., Mc Farlin, D.E. and McFarland, H.F. Serial gadolinium-enhanced magnetic resonance imaging scans in patients with early relapsingremitting multiple sclerosis: implications for clinical trials and natural history. Ann Neurol 1991; 29: 548-555. 15.Olsson, T. Role of cytokines in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. Eur J Neurol 1994; 1: 7-19. 16.Rieckmann, P., Martin, S., Weichselbraun, I., Albrecht, M., Kitze, B., Weber, T., Tumani, H., Broocks, A., Luer, W. and Helwig, A. Serial analysis of circulating adhesion molecules and TNF receptor in serum from patients with multiple sclerosis: cICAM-1 is an indicator for relapse. Neurology 1994; 44: 2367-2372. 17.Kronfol, Z., Turner, R., House, J.D. and Winokur, G. Elevated blood neutrophil concentration in mania. J Clin Psychiatry 1986; 47: 63-67. 18.Podikoglou, D.G., Lianou, P.E., Tsakanikas, C.D. and Papavassiliou, J.T. Polymorphonuclear leukocyte functions and multiple sclerosis. Neurology 1994; 44: 129-132.

debruyne j.

69

II. SEMIQUANTIFICATION OF THE PERIPHERAL-TYPE BENZODIAZEPINE LIGAND [11C]PK11195 IN NORMAL HUMAN BRAIN AND APPLICATION IN MULTIPLE SCLEROSIS PATIENTS Jan C. Debruyne MD1,7, Koen J. Van Laere MD PhD DrSc2,7, Jan Versijpt MD2, Filip De Vos PhD3, Johan Keppens Eng2, Karel Strijckmans PhD4, Patrick Santens MD1, Eric Achten MD PhD5, Guido Slegers PhD3, Jacob Korf PhD6, Rudi A. Dierckx MD PhD2, Jacques L. De Reuck MD PhD1 1

Department of Neurology, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium Division of Nuclear Medicine, Ghent University Hospital 3 Laboratory of Radiopharmacy, Ghent University 4 Laboratory of Analytical Chemistry, Institute for Nuclear Sciences, Ghent University 5 Department of Radiology, MR-Unit, Ghent University Hospital 6 Department of Biological Psychiatry, Groningen, the Netherlands 7 Both authors contributed equally to this manuscript 2

Author for correspondence: J. Debruyne MD Department of Neurology, Ghent University Hospital, De Pintelaan 185, B-9000 Ghent, Belgium Phone: +32 9 240 45 29 Fax: +32 9 240 49 71 E-mail: [email protected] Acta Neurologica Belgica, 2002, 102, 127-135 Running title: [11C]PK11195 uptake in normal brain and MS

70

debruyne j.

SUMMARY Objectives - [11C]PK11195 is a peripheral-benzodiazepine-receptor radioligand used for detection of microglial inflammation. Normal uptake by means of semiquantification was measured in order to establish reference data. The applicability of this semiquantitative approach was tested in three multiple sclerosis patients. Materials and methods - Seven controls and three patients underwent MR and PET scanning. Coregistered static scans 40 minutes postinjection of [11C]PK11195 were used for assessment of relative ligand uptake by comparison to whole-brain uptake. Results - For static scans acquired in near steady state, the relative ligand uptake was significantly higher in gray matter structures as compared to the whole brain (ratio: 1.041 +/- 0.06, p = 0.036) whereas it was comparable in white matter (1.010 +/- 0.035). Intersubject reproducibility was 11.4% and 12.9% for white and grey matter. Intrasubject reproducibility was of the same order : 14.0% and 14.5% respectively. In two clinically active patients with Gadolinium-positive T1-weighted lesions on MRI the focal ligand uptake was significantly increased (1.36 and 1.14, p = 0.001). In one clinically stable patient, the uptake value corresponding with a T2-weighted MR lesion was not different from normal brain measurements. Conclusion - The current investigations show that normal brain uptake of [11C]PK11195 is very low and shows the feasibility of a semiquantitative method which can be applied to larger cohorts of patients subgroups. Keywords: [11C]PK11195, semiquantification, positron emission tomography, healthy volunteers, multiple sclerosis.

debruyne j.

71

INTRODUCTION PK11195 [1-(2-chlorophenyl)-N-methyl-N-(1-methylpropyl)-3-isoquinolinecarboxamide] is a specific high-affinity ligand for the peripheral-type benzodiazepine binding site (PBBS) [1998]. In humans and animals, PBBS are mainly distributed in peripheral tissues such as heart, adrenal gland, testis, liver and hemopoietic cells[Woods and Williams 1996] [Woods and Williams1996] but they have also been discovered in glial cells of the central nervous system [Marangos et al. 1982]. In normal human and cat brain, PK11195 exhibits only minimal binding [Benavides et al. 1983]. Autoradiographically, binding sites are restricted to grey matter and absent in white matter [Benavides et al. 1984; Doble et al. 1987] Histological observations showed that resting microglia in the adult human brain form a stable population of ramified cells, where more microglia are found in grey than white matter [Lawson et al. 1990]. In pathological conditions however, microglia rapidly transform into an activated state with proliferation and ensuing increases of PBBS [Banati et al. 2000; Dubois et al. 1988 ]. In human post-mortem tissue and animal models of brain damage, high densities of PK11195 were demonstrated, reflecting glial proliferation [Benavides. et al. 1988; Diorio et al. 1991; Myers et al. 1991] Activated microglia are the predominant site of PK11195 binding as confirmed by photo-emulsion micro-autoradiography in lesions causing a retrograde neuronal reaction [Banati et al. 1997]. PK11195 has been labelled with 11C for the in vivo study of normal and lesioned brain by positron emission tomography (PET) [Camsonne.et al. 1984]. In order to use [11C]PK11195 as a tool for PET imaging of microglial activation in acute and chronic pathology, a baseline level of ligand uptake in a control population is required. No generally accepted model of absolute quantification of [11C]PK11195 specific binding in normal brain has been validated yet [Banati et al. 1999; Banati et al. 2000l] The heterogeneous distribution of microglia even in brain regions without pathology and the inconsistent blood flow hamper the selection of a reference tissue in brain and the establishment of a model for absolute quantification. For selected cases, a cluster analysis based on assumption of a receptor free region may provide an approach to absolute quantification, as has been elaborated by Banati et al. [Banati. et al. 1999; Banati et al. 2000]. However, in a number of pathological conditions where brain inflammation is likely involved in a widespread fashion, such as multiple sclerosis, true receptor-free regions are not present. Therefore, in the present study, a straightforward semiquantitative method for measuring the uptake of [11C]PK11195 in normal brain was tested, in order to establish normative baseline data with an estimate of the reproducibility. The semiquantitative method is based on measuring an activity ratio at a fixed time interval after tracer injection under the assumption of subject-independent near steady-state between brain regions. A second aim was to test the applicability of this semiquantitative approach for the in vivo detection of significant [11C]PK11195 uptake value increases in a feasibility study of three multiple sclerosis (MS) patients with chronic and active white matter lesions on MR imaging.

72

debruyne j.

MATERIALS AND METHODS Subjects The study was approved by the Ethical Committee of the Ghent University Hospital. Written informed consent was obtained from each subject. Seven consecutive healthy volunteers with a normal physical examination [4 female, 3 male, average age 33 yrs (SD 7.5, range 2341 yrs)] and three MS patients with definite proven MS referring to new MS diagnostic criteria of McDonald et al [McDonald et al. 2001] [average age 43.5 yrs (SD 7.0, range 37-51 yrs)] were included. All three patients had relapsing-remitting MS. No treatment with antiinflammatory drugs such as steroids and β-interferon was applicated. Patient 1 and 2 had a relapse at the time of [11C]PK11195 scanning and both showed one Gd-enhancing lesion on T1-weighted MR images, in the left frontal periventricular region for patient 1 and the centrum semiovale for patient 2, respectively with an extent of 15/15 ml and 5/5 ml. Patient 3 was ‘clinically stable’ at the time of [11C]PK11195 scanning. The MR scan revealed no T1 - weighted Gd-uptake. The three patients had several T2-weighted paraventricular hyperintensities on the T2 - weighted MR and the FLAIR sequences. The lesion load was rather low and there was minimal disability. Radiochemistry PK11195 was obtained from RBI (Natick, MA, USA). [11C]PK11195 was synthesized according to a procedure described by Camsonne et al.[Camsonne et al. 1984]. Briefly, 3 µmol N-desmethyl PK11195 was dissolved in 150 µL dimethylsulphoxide, containing 3 µmol tetrabutylammonium hydroxide. After trapping of [11C]CH3I, the vial was closed and heated at 80°C for 3 min. Purification was done by HPLC using a RP-C18 column (Econosil, 250 x 10 mm, 10 µm particle size) and an ethanol/water (70/30) mixture as mobile phase. Radiochemical yield towards [11C]CH3I was 57 +/- 2.35%. Finally, 3.7 GBq [11C]PK11195 was obtained with a specific activity of 25 GBq/µmol. Chemical and radiochemical purity were higher than 99%. All subjects were injected intravenously with 370 +/- 10% MBq [11C]PK11195 with a slow bolus in a time course of 30 s. For regional cerebral blood flow (rCFB) imaging in PET the steady state technique using [15O]CO2 was applied [Frackowiak et al. 1980]. Its automated production and quality control is described elsewhere [Strijckmans et al. 1985]. The absorbed dose for the [15O]CO2 scan yields 16 mGy for the lung, which is considered as the dose-limiting or critical tissue. The effective dose-equivalent is 6 mSv [Bigler et al. 1983]. Data acquisition and reconstruction All subjects underwent MR and PET scanning. To determine intrasubject reproducibility, five volunteers were submitted twice to another PET session within one week. Both MR and the first PET scan were carried out on the same day. MR imaging was performed on a 1.5 T commercial MR scanner (Siemens, Magnetom 1.5 T, SP4000). Prior to the administration of gadolinium (Gd), standard spin-echo imaging was carried out in 5 mm thick axial planes (pixel size = 0.9 * 0.9 mm2) with proton-density (TR/TE/NEX = 2170/20/1), T2-weighted (TR/TE/NEX=2170/80/1) and T1-weighted (TR/TE/NEX=600/12/1) contrast. Five min after Gd injection, the axial slices were rescanned with T1-weighting (TR/TE/NEX=800/20/1). PET studies were performed on a Siemens ECAT 951/31 PET scanner with a transaxial resolution (FWHM) of 5.8 mm and an axial resolution of 5 mm, values provided by Siemens, Knoxville, TN, USA operating in 2D mode. All subjects were placed in supine position with dimmed lights and low ambient noise. Realignment of the head to the orbitomeatal line was performed by laser guidance. Recontruction was done using filtered back projection with a debruyne j.

73

Hanning filter with cut - off 0.5 cycles/cm. Sequential transmission scanning was performed using a germanium-68/germanium-68 ring source. Correction for scatter was done using the standard software provided by the manufacturer (CTI). Subsequently, cerebral blood flow images were acquired by [15O]CO2 inhalation at 900 MBq/min [Frackowiak et al., 1980]. Eight minutes later, a one-hour dynamic PET study was conducted following injection of 370 MBq [11C]PK11195. Thirty-one planes of 3.375 mm thickness and 19 frames were recorded over 60 min with an increasing duration of 2 * 5 s, 5 * 10 s, 4 * 1 min, 2 * 3 min, 1 * 4 min, 1 * 5 min, 4 * 10 min. Data obtained from 40-60 min postinjection were summed and defined as activity on the static scans. Automatic radioactive decay correction was applied to all images. Individual coregistration of perfusion data in the MRI orientation was achieved using SPM99 (Statistical Parametric Mapping, Functional Imaging Laboratory, The Wellcome Department, London, UK) [Friston et al. 1991]. The same spatial transformation parameters were subsequently applied to the PK11195 data.

74

debruyne j.

Descriptive kinetics and semiquantification In three volunteers, a tissue time-activity curve (TAC) of the [11C]PK11195 uptake over 60 minutes was determined for three global regions, namely white matter, cortical grey matter and subcortical grey matter, normalised to the final frame whole brain uptake value. The data for these regions are the weighted average of the individual normalised VOI data. Since no generally accepted model of absolute quantification of specific binding of [11C]PK11195 in normal brain has been widely validated and moreover, and as no dynamic data for all volunteers were available and no arterial sampling was carried out, a semiquantitative approach was carried out on the static images. Volumes-of-interest (VOIs) were defined on each individual subject’s reoriented high-resolution MR scans and automatically transferred on the reoriented [11C]PK11195 scans. Three global regions were defined namely, white matter, cortical and central grey matter (thalamus and striatum) (figure 1). The latter was done because high labelling of [3H]PK11195 was described in diencephalic structures notably in several thalamic nuclei [Doble et al. 1987; Le Fur et al. 1983]. The relative activity normalised to the mean activity per volume unit in the total brain was taken as outcome parameter. This was attained by defining a single whole-brain volume-of-interest (VOI) on the MR anatomic template. Care was taken to avoid the carotid and major cerebral arteries,. ventricles and venous sinuses which was verified in each individual case Statistical analysis Data were analysed by means of the software package SPSS v10.0 for Windows (SPSS, Heverlee, Belgium). Unless specified otherwise, data are expressed as mean +/- one SD. For descriptive kinetics, a non-linear bi-exponential least-square fitting of the time-activity curves was used to produce TAC parameters for white and grey matter. Intersubject reproducibility was defined as the standard deviation of the normalised [11C]PK11195 uptake in the various brain regions. This intersubject reproducibility estimate might be able to differentiate individuals with abnormal [11C]PK11195 uptake from normal subjects. The intraindividual reproducibility is defined as one standard deviation (%) in [11C]PK11195 uptake obtained from scan 1 and scan 2 from all subjects in whom repeated scanning was performed [Jonsson et al. 2000]. This measure is based on the intra - individual difference defined as 200 * (scan 1 - scan 2) / (scan 1 + scan 2) (%). Differences between groups were calculated by means of the Wilcoxon Rank Sum test. To explore significant ratios, a t-test was performed after Kolmogorov-Smirnov testing for normality. Uptake values in MS patients were assessed by means of a one-sample t-test.

debruyne j.

75

76

debruyne j.

FIGURE 1: ROI localization on three different regions (grey, white, and subcortical grey matter) in coregistered MR - [11C]PK11195 scan pairs.A: cerebellar cortex, B: cerebellar white matter, C: temporal cortex, D: frontal white matter and striatum, E: thalamus, F: occipital cortex, G: parietal white matter. Arrowheads represent “aspecific activity” in extracerebral structures (figure A: retro - orbital fat tissue figure B: masticatory muscles). Color scales are given for the [11C]PK11195 image and the grey scales for MR.

debruyne j.

77

78

debruyne j.

RESULTS Descriptive kinetics and time-activity curves Figure 2 shows a representative example of a TAC for one volunteer (white matter and cortical grey matter) and one clinically active MS patient (corresponding with T1-weighted Gd white matter lesion). A fast decay of [11C]PK11195 before reaching steady-state is seen with an uptake half-life of 1.40 min (95% asymptotic confidence interval 1.12 – 1.84) for white matter, 2.63 min (2.06 – 4.10) for grey matter and 2.88 min (2.13 – 4.42) for subcortical grey matter. The second exponential component was characterized by a half-life value over 2 hours for all regions. 6

Normalized activity

5 4 3 2 1 0 0

600

1200

1800

2400

3000

3600

Time (sec) FIGURE 2: A representative sixty - minutes time activity curve from one volunteer and patient 11 (patient 1) after injection of [ C]PK11195. Lines of data represent bi-exponential fits through measured activity data. Static scans were obtained between 40 and 60 min.(2400 – 3600 sec). * = normal white matter, ‫ = ٱ‬normal cortical grey matter, + = lesional activity white matter (patient)

debruyne j.

79

Intersubject reproducibility The average normalised activity in white and grey matter of the static scans for the first PET session of the seven volunteers is shown in figure 3. Intersubject reproducibility was 12.9% for grey matter, while it was 11.4% for white matter. When difference was made between cortical and subcortical grey matter, the intersubject reproducibility values were 12.6% and 13.7% respectively.

1.3

[11C]-PK11195 uptake

[11C]-PK11195 uptake

1.4

1.2 1.1 1.0 .9 .8 .7

Cortical grey

White

Subcortical grey

11

FIGURE 3: Intersubject reproducibility of [ C]PK11195 uptake(defined as relative to the intersubject mean value), partitioned as cortical and subcortical grey and white matter for seven healthy volunteers. Each bar represents one subject.

80

debruyne j.

Intrasubject reproducibility Intrasubject reproducibility was calculated by comparison of the values obtained from the single repeated scan in the five volunteers. The average intrasubject reproducibility for white and grey matter was 14.8 and 14.0% respectively (figure 4). There was no difference between neocortical and subcortical grey matter activity in normal volunteers. 40

Intra-individual difference (%)

30 20 10 0 -10 -20 -30 -40

Cortical grey

White

Subcortical grey

FIGURE 4: Box plot of the intrasubject differences of [11C]PK11195 uptake for five healthy volunteers. The standard deviation of these differences is defined as the intraindividual reproducibility. Each bar represents one subject.

debruyne j.

81

Overall uptake For all volunteers, a mean uptake value of 1.010 ± 0.035 in white and 1.041 ± 0.060 in grey matter was found. The latter normalised activity is significantly different from unity (t-test, p=0.036) (figure 5). However, white and grey matter did not differ significantly from each other (Mann-Whitney U, p=0.19). There were also no significant differences between cortical and central grey matter (Mann-Whitney U, p=0.70). 1.2

Normalized activity

1.1

1.0

.9 gray

white

FIGURE 5: Normalised relative [11C]PK11195 activity for the whole group of volunteers and in all regions, partitioned as grey and white matter.

82

debruyne j.

Application of semiquantitative approach in MS patients Patient 1 (figure 6) and 2 showed an intense focal uptake on the [11C]PK11195 images corresponding to the Gd enhancement on the coregistered T1-weighted MR scan. Normalised activity of the lesion yielded 1.36 for patient 1 and 1.14 for patient 2 which both differed significantly from normal white matter uptake (t-test, p<0.001). Patient 3 showed a lesion on the T2-weighed MR scan with a normalised [11C]PK11195 uptake of 1.02, which did not reach significance compared to normal subject measurements (p=0.4).

FIGURE 6: Pathological uptake of [11C]PK11195 in a focal white matter lesion observed on the corresponding T1-weighted Gd MR scan in a patient with active relapsing-remitting MS.

debruyne j.

83

84

debruyne j.

DISCUSSION PK11195 as marker for microgliosis. The rationale to use [11C]PK11195 as an in vivo marker of microgliosis is based on the demonstration in ample neuropathological and animal experimental work of the association of microglial proliferation and increased densities of PBBS in the lesioned brain [Benavides et al. 1983; Le Fur et al. 1983; Benavides et al. 1988; Streit and Kreutzberg 1988]. Displacement studies have proven that the human peripheral-type benzodiazepine receptor shows selective affinities for isoquinoline ligands [Rao and Butterworth 1997]. Although most of the PBBS are located in peripheral tissue and cells, nearly 10% binding of PK11195 is found in cerebral structures, mainly to microglia [Awad and Gavish 1991]. [Woods and Williams 1996] Specific immunocytochemical staining in the adult mouse brain has determined a considerable variability in the distribution and morphology of the microglial population. They are present in every region and occupy 5 to 12% of the total number of cells in the brain. Grey matter contains more microglia than white matter, especially in sensory, limbic and subcortical grey structures [Lawson et al. 1990], which is reflected in the present study where, although not significant, a slightly higher [11C]PK11195 uptake for the static scans was detected in grey matter. However, the heterogeneous distribution of [3H]PK11195 uptake in post-mortem human brain is less striking in the present in vivo study. High aspecific activity of the [11C]PK11195 ligand is consistently observed in extracerebral structures including the masticatory muscles, retro-orbital fat tissue, cavernous and sagittal sinuses, carotid artery and skull (figure 1). The functional role of resting microglia is not well understood yet in the normal adult nervous system. In pathology however, microglia rapidly transform into an activated state with cytotoxic and tissue destructive properties. As such, microglial activation is involved in most conditions associated with neuronal injury, ischemia, inflammation and neurodegeneration [Gehlert et al. 1997]. This has been extensively demonstrated in vitro by autoradiography using animal and human post-mortem tissue with focal brain damage. Also, high concentrations of [3H]PK11195 were observed in rat and human brain tumour, specifically in glioma where a striking correspondence of PBBS with the histological topography and the activity grade was demonstrated [Black et al. 1989]. Enhanced PBBS densities have been observed on the edge of active inflammatory lesions in MS [Banati et al. 2000; Benavides et al. 1988] and in stroke patients [Myers et al. 1991; Ramsay et al. 1992]. Moreover, a dramatic increase of [3H]PK11195 uptake was demonstrated in the facial nucleus a few days after facial nerve axotomy. Even with an intact blood-brain barrier, activated microglia are the predominant source of lesion - induced increases of PK11195 binding [Gehlert et al. 1997]. Focal PBBS upregulation was preferentially situated on activated but still ramified microglia suggesting a high and rapid expression of this receptor in the absence of blood-brain barrier damage. Even in chronic neurodegenerative disorders such as Alzheimer’s and Huntington’s disease, a significant increase in PBBS have been described, possibly due to a relative gliosis associated with neuronal loss [Diorio et al. 1991] [Messmer and Reynolds 1998]. The potential value of PET and [11C]PK11195 for the in vivo imaging of the lesioned brain is clearly demonstrated in human glioma [Junck et al. 1989]. High accumulation of [11C]PK11195 reached equilibrium in tumour tissue about 80 min postinjection. Most of the PBBS were occupied with high specificity, confirmed by displacement with saturating doses of cold ligand. The metabolisation of [11C]PK11195 has been studied in normal healthy volunteers [De Vos et al. 1999]. For humans, rapid metabolisation of [11C]PK 11195 was observed. at debruyne j.

85

5, 20 and 35 min post injection. 5%, 22% and 32% Respectively, of the plasma activity consisted of at least two more polar metabolites. Despite the extensive metabolisation rate in mice (up to 42% at 10 min post injection of [11C]PK 11195), no 11C-labelled metabolites could be detected by HPLC in the extracts of brain. In focal ischemic lesions, transient specific [11C]PK11195 uptake was found after occlusion of the middle cerebral artery in an experiment with anaesthetised baboons [Sette et al.1993]. A similar observation was made in MS where the high [11C]PK11195 uptake occurs in active white matter inflammation defined by MR and thus reflects the presence of activated microglia, which are known to be involved in autoimmune demyelinating diseases [Vowinckel et al.1997]. The latter findings were confirmed in the present study where significantly increased [11C]PK11195 uptake values were found in two patients with active inflammatory lesions. Methodological aspects. Until now there is no widely accepted method for the absolute quantitative measurement of [11C]PK11195 in diffuse brain pathology. The simplified reference tissue model [Gunn et al. 1997], recently applied in two cases of Rasmussen’s encephalitis [Banati et al. 1999] cannot be used in MS and other diseases with non-focal brain pathology due to a lack of a suitable region devoid of active binding for use as a single reference compartment. The recently introduced cluster analysis [Myers et al. 1999], applied to MS [Banati et al. 2000], has not been widely validated. Especially in MS patients with extensively affected white matter, the amount of healthy tissue, from which a normal input function needs to be derived for kinetic modelling, is too low [Banati et al. 2000]. For this reason we tested a more straightforward semiquantitative method in healthy volunteers for the eventual clinical detection of significant increases in [11C]PK11195 uptake values of MS patients without the need of full arterial sampling and dynamic scanning. Applying this semiquantitative procedure on VOI data, normalised on total brain activity with a careful avoiding of the large venous and arterial vessels, yielded accurate semiquantitative data in normal volunteers. Although patients and controls are not age-matched, we anticipate no differences in [11C]PK11195 uptake in normal brain that would influence the results. This is in spite of the demonstration of an increased [11C]PK11195-binding in the thalamus correlated with age by Cagnin et al [Cagnin, Myers, and Gunn 1999]. However, this finding, derived from a small sample of 10 healthy volunteers, was especially significant for the older ages above 60 years. It was demonstrated from the comparison of the inter - versus intrasubject reproducibility, that, with the current procedure, the strongest component of uncertainty in the [11C]PK11195 uptake is the measurement of background noise and not the physiological variability between subjects. In this respect, three-dimensional PET and [11C]PK11195 could be a more accurate tool for visualizing global increases of activated microglia due to the higher count rate and therefore image quality [Myers et al. 1998]. Concerning the kinetics, a fast decay of [11C]PK11195 was demonstrated suggesting aspecific binding both in grey and white matter. However, the fact that the time-activity curves for both volunteers and patients had a similar decline with a near-steady-state from 40 min postinjection on, indicates that a semiquantitative index of binding with normalisation on total counts is acceptable. This assumption is in concordance with the kinetic results of previous [11C]PK11195 PET studies by Sette et al where uptake ratios became stable approximately 20 minutes after injection, minimizing confounding effects of perfusion [Sette et al. 1993]. The difference in half-life between grey and white matter is 86

debruyne j.

confounded by perfusion dynamics and could not be fully evaluated in this study due to the lack of full kinetic modelling. As with any semiquantitative approach, the choice of the normalisation area affects the sensitivity of the method to detect significant changes. As no true reference region may be found in MS, globally increased PK11195 activity may be masked by normalisation on the total activity. Also for intense increased uptake, global normalisation may somewhat reduce the sensitivity of the method, but it was considered as a viable option in the absence of full kinetic data. Similar normalisation problems are present in non-absolutely quantified routine clinical PET and SPECT perfusion or metabolism evaluations [Van Laere et al. 2001]. The intersubject reproducibility range of [11C]PK11195 uptake resulted in an average standard deviation of 12.5%. These baseline data are able to detect significant pathological uptake of [11C]PK11195 as demonstrated in the three MS patients giving rise to a focal uptake in two patients with clinical relapse, strong enough to significantly rise above the signal-to-noise ratio. This high [11C]PK11195 uptake occurred in active white matter inflammation defined by gadolinium - enhanced T1 - MRI. The increased uptake for [11C]PK11195 in gadolinium lesions is in accordance with the known histology of the conventional MRI lesions where the blood-brain barriere breakdown is related to an extensive invasion of blood - borne cells such as macrophages.(Banati et al. 2000) On the other hand one patient without clinical attack did not reach significance concerning the [11C]PK11195 uptake values in focal T2-weighted MR lesions. Further studies with PET and [11C]PK11195, as are currently carried out in an extended series of multiple sclerosis patients, will evaluate the final sensitivity of this semiquantitative methodology in cerebral pathology.

CONCLUSION There is a minimal specific binding of [11C]PK11195 in normal brain. Near-steady-state [11C]PK11195 activity is not significantly different between grey and white matter. Since absolute quantification of [11C]PK11195 uptake remains problematic, reproducibility intervals for semiquantification may allow for the characterisation of physiological variability between subjects or even a measurement of signal-to-noise variation and thus knowledge of normal range values of [11C]PK11195 uptake. In our series of healthy volunteers, an intersubject reproducibility of 12.5% was found. This value allows definition of an accurate confidence interval for the detection of microglial activation in acute and chronic neuroinflammatory diseases, as indicated in the present study for focal white matter lesions in two clinically active MS patients. The simple approach by this semiquantification method might prove to be a feasible and useful application to measure the [11C]PK11195 uptake as a marker for the peripheral-type benzodiazepine receptor on the microglia in the course of the multiple sclerosis process in individual patients and provide additional information over other anatomical imaging modalities such as MR. This method opens a perspective in providing functional information in addition to anatomical imaging. Additional studies should further assess the usefulness of this simplified PET procedure in questionable cases.

debruyne j.

87

REFERENCES Awad M., Gavish M. Peripheral-type benzodiazepine receptors in human cerebral cortex, kidney, and colon. Life Sci, 1991, 49 : 1155-1161. Banati R. B., Goerres G. W., Myers R., Gunn R. N., Turkheimer F. E. et al. [11C](R)-PK11195 positron emission tomography imaging of activated microglia in vivo in Rasmussen's encephalitis. Neurology, 1999, 53 : 2199-2203. Banati R. B., Myers R., Kreutzberg G. W. PK ('peripheral benzodiazepine') - binding sites in the CNS indicate early and discrete brain lesions: microautoradiographic detection of [3H]PK11195 binding to activated microglia. J Neurocytol, 1997, 26 : 77-82. Banati R. B., Newcombe J., Gunn R. N., Cagnin A., Turkheimer F. et al. The peripheral benzodiazepine binding site in the brain in multiple sclerosis: quantitative in vivo imaging of microglia as a measure of disease activity. Brain, 2000, 123 : 2321-2337. Benavides J., Cornu P., Dennis T., Dubois A., Hauw J. J. et al. Imaging of human brain lesions with an ω3 site radioligand. Ann Neurol, 1988, 24 : 708-712. Benavides J., Quarteronet D., Imbault F., Malgouris C., Uzan A. et al. Labelling of "peripheral-type" benzodiazepine binding sites in the rat brain by using [3H]PK 11195, an isoquinoline carboxamide derivative: kinetic studies and autoradiographic localization. J Neurochem, 1983, 41 : 1744-1750. Benavides J., Savaki H. E., Malgouris C., Laplace C., Daniel M. et al. Autoradiographic localization of peripheral benzodiazepine binding sites in the cat brain with [3H]PK 11195. Brain Res Bull, 1984, 13 : 69-77. Bigler R. E., Sgouros G. Biological analysis and dosimetry for 15O-labeled O2, CO2, and CO gases administered continuously by inhalation. J Nucl Med, 1983, 24 : 431-437.Black K. L., Ikezaki K., Santori E., Becker D. P., Vinters H. V. Specific high-affinity binding of peripheral benzodiazepine receptor ligands to brain tumors in rat and man. Cancer, 1990, 65 : 93-97. Black K. L., Ikezaki K., Toga A. W. Imaging of brain tumors using peripheral benzodiazepine receptor ligands. J Neurosurg, 1989, 71 : 113-118. Cagnin A., Myers R., Gunn R. N. Imaging activated microglia in the ageing human brain. J Cereb Blood Flow Metab, 1999, 19 : S820. Camsonne R., Crouzel C., Comar D., Maziere M., Prenant C. et al. Synthesis of n-(C-11) methyl, n-(methyl-1 propyl), (chloro-2 phenyl)-1 isoquinoleine carboxamide3 (PK-11195) – a new ligand for peripheral benzodiazepine receptors. J Labelled Compd Rad, 1984, 21 : 985-991. De Vos F., Dumont F., Santens P., Slegers G., Dierckx R. et al. High - performance liquid chromatographic determination of [C-11]1-(2-chlorophenyl)-N-methyl-N-(1-ethylpropyl)-3-isoquinoline carboxamide in mouse plasma and tissue and in human plasma. J Chromatogr B, 1999, 736: 61-66. Diorio D., Welner S. A., Butterworth R. F., Meaney M. J., Suranyi-Cadotte B. E. Peripheral benzodiazepine binding sites in Alzheimer's disease frontal and temporal cortex. Neurobiol Aging, 1991, 12 : 255-258.

88

debruyne j.

Doble A., Malgouris C., Daniel M., Daniel N., Imbault F. et al. Labelling of peripheral-type benzodiazepine binding sites in human brain with [3H]PK 11195: anatomical and subcellular distribution. Brain Res Bull, 1987, 18 : 49-61. Dubois A., Benavides J., Peny B., Duverger D., Fage D. et al. Imaging of primary and remote ischaemic and excitotoxic brain lesions. An autoradiographic study of peripheral type benzodiazepine binding sites in the rat and cat. Brain Res, 1988, 445 : 77-90. Frackowiak R. S. J., Lenzi G. L., Jones T, Heather J. D. Quantitative measurements of regional blood flow and oxygen metabolism in man using 15O and positron emission tomography: theory, procedure and normal values. J Comput Assist Tomogr, 1980, 4, 727-736. Friston K. J., Frith C. D., Liddle P. F., Frackowiak R. S. Comparing functional (PET) images: the assessment of significant change. J Cereb Blood Flow Metab, 1991, 11 : 690-699. Gehlert D. R., Stephenson D. T., Schober D. A., Rash K., Clemens J. A. Increased expression of peripheral benzodiazepine receptors in the facial nucleus following motor neuron axotomy. Neurochem Int, 1997, 31 : 705-713. Gunn R. N., Lammertsma A. A., Hume S. P., Cunningham V. J. Parametric imaging of ligand-receptor binding in PET using a simplified reference region model. Neuroimage, 1997, 6 : 279-287. Jonsson C., Pagani M., Johansson L., Thurfjell L., Jacobsson H. et al. Reproducibility and repeatability of 99Tcm-HMPAO rCBF SPET in normal subjects at rest using brain atlas matching. Nucl Med Commun, 2000, 21 : 9-18. Junck L., Olson J. M., Ciliax B. J., Koeppe R. A., Watkins G. L. et al. PET imaging of human gliomas with ligands for the peripheral benzodiazepine binding site. Ann Neurol, 1989, 26 : 752-758. Lawson L. J., Perry V. H., Dri P., Gordon S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience, 1990, 39 : 151-170. Le Fur G., Perrier M. L., Vaucher N., Imbault F., Flamier A. et al. Peripheral benzodiazepine binding sites: effect of PK 11195, 1-(2- chlorophenyl)-N-methyl-N-(1-methylpropyl)-3-isoquinoline carboxamide. I. In vitro studies. Life Sci, 1983, 32 : 1839-1847. Marangos P. J., Patel J., Boulenger J. P., Clark-Rosenberg R. Characterization of peripheral-type benzodiazepine binding sites in brain using [3H]Ro 5-4864. Mol Pharmacol, 1982, 22 : 26-32. McDonald W. I., Compston A., Edan G., Goodkin D., Hartung H. P. et al. Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines from the International Panel on the diagnosis of multiple sclerosis. Ann. Neurol., 2001, 50 : 121-127. Messmer K., Reynolds G. P. Increased peripheral benzodiazepine binding sites in the brain of patients with Huntington's disease. Neurosci Lett, 1998, 241 : 53-56. Myers R., Banati R. B., Paulesu E., Thorpe J., Miller D. H. et al. Use of two-and three dimensional PET and [11C](R)-PK11195 to image focal and regional brain pathology. In : "Quantitative Functional Brain Imaging with Positron Emission Tomography". Carson R. E., Daube-Witherspoon M. E., Herscovitch P. eds., New York, Academic Press, 1998, 195-200. debruyne j.

89

Myers R., Gunn R. N., Cunningham V. J., Banati R. B., Jones T. Cluster analysis and the reference tissue model in the analysis of clinical [11C]PK11195 PET. J Cereb Blood Flow Metab 1999, 19 : S789. Myers R., Manjil L. G., Cullen B. M., Price G. W., Frackowiak R. S. et al. Macrophage and astrocyte populations in relation to [3H]PK 11195 binding in rat cerebral cortex following a local ischaemic lesion. J Cereb Blood Flow Metab, 1991, 11 : 314-322. Ramsay S. C., Weiller C., Myers R., Cremer J. E., Luthra S. K. et al. Monitoring by PET of macrophage accumulation in brain after ischaemic stroke. Lancet, 1992, 339 : 1054-1055. Rao V. L., Butterworth R. F. Characterization of binding sites for the omega3 receptor ligands [3H]PK11195 and [3H]RO5-4864 in human brain. Eur. J Pharmacol., 1997, 340 : 89-99. Sette G., Baron J. C., Young A. R., Miyazawa H., Tillet I. et al. In vivo mapping of brain benzodiazepine receptor changes by positron emission tomography after focal ischemia in the anesthetized baboon. Stroke, 1993, 24 : 2046-2057. Streit W. J., Kreutzberg G. W. Response of endogenous glial cells to motor neuron degeneration induced by toxic ricin. J Comp Neurol, 1988, 268 : 248-263. Strijckmans K., Vandecasteele C., Sambre J. Production and quality control of C15O2 for medical use. Appl Radiat Isot, 1985, 36 : 279-283.

15

O2 and

Strijckmans K., Sambre J., De Guchteneire F. Automated production and quality control of 15 O2 and C15O2. In: "Proc. 2nd Workshop on Targetry and Target Chemistry, Heidelberg, Germany, September 22-25, 1987". Ruth T., McQuarrie S., Helus F. Eds., Heidelberg, 1989, 182-184. Van Laere K., Versijpt J., Audenaert K., Koole M., Goethals I. et al. 99mTc-ECD brain perfusion SPET: variability, asymmetry and effects of age and gender in healthy adults. Eur. J Nucl. Med., 2001, 28 : 873-887. Vowinckel E., Reutens D., Becher B., Verge G., Evans A. et al. PK11195 binding to the peripheral benzodiazepine receptor as a marker of microglia activation in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Res, 1997, 50 : 345-353. Woods M. J., Williams D. C. Multiple forms and locations for the peripheral-type benzodiazepine receptor. Biochem Pharmacol, 1996, 52 : 1805-1814.

90

debruyne j.

III. PET VISUALIZATION OF MICROGLIA IN MULTIPLE SCLEROSIS PATIENTS USING [11C]PK11195 Jan C Debruyne MD*1,7, Jan Versijpt MD2,7, Koenraad J Van Laere MD PhD DrSc2, Filip De Vos Pharm PhD3, Johan Keppens Eng2, Karel Strijckmans MrSc PhD4, Eric Achten MD PhD5, Guido Slegers Apr MrSc PhD3, Rudi A Dierckx MD PhD2, Jakob Korf MrSc PhD6, Jacques L De Reuck MD PhD1 1

Department of Neurology, Ghent University Hospital, Ghent, Belgium Division of Nuclear Medicine, Ghent University Hospital 3 Laboratory of Radiopharmacy, Ghent University 4 Laboratory of Analytical Chemistry, Institute for Nuclear Sciences, Ghent University 5 Department of Radiology, MR-Unit, Ghent University Hospital 6 Department of Biological Psychiatry, University Hospital, Groningen, the Netherlands 7 Both authors contributed equally to this manuscript 2

Statistical reviewer: Jan Versijpt MD, Division of Nuclear Medicine, Ghent University Hospital Running title: Microglia in MS Key words: Multiple sclerosis, inflammation, microglia, positron emission tomography, peripheral benzodiazepine receptor, PK11195 *Author for correspondence: JC Debruyne, Department of Neurology, Ghent University Hospital, De Pintelaan 185, B-9000 Gent, Belgium Phone: +32 9 240 45 29; Fax: +32 9 240 49 71; E-mail: [email protected] Acknowledgments: This work was granted by the WOMS [Wetenschappelijk Onderzoek voor Multiple Sclerose, Scientific Research on Multiple Sclerosis - Flanders (Belgium)] and the FWO (Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek, Fund for Scientific Research Flanders). J Versijpt was financially supported by the “Internationale Stichting Alzheimer Onderzoek, International Foundation Alzheimer Research”.

debruyne j.

91

ABSTRACT Activated microglia are involved in the immune response of multiple sclerosis (MS). The peripheral benzodiazepine receptor (PBR) is expressed on microglia and upregulated after neuronal injury. [11C]PK11195 is a positron emission tomography (PET) radioligand for the PBR. The objective of the present study was to investigate [11C]PK11195 imaging in MS patients and its additional value over MRI concerning the immuno-pathophysiological process. Seven healthy and 22 MS subjects were included. Semiquantitative [11C]PK11195 uptake values were assessed with normalisation on cortical gray matter. Uptake in Gadolinium-lesions was significantly increased compared to normal white matter. Uptake in T2-lesions was generally decreased, suggesting a PBR downregulation. However, uptake values increased whenever a clinical or MR-relapse was present, suggestive for a dynamic process with a transient PBR upregulation. During disease progression, an increase of normal-appearing white matter (NAWM) uptake was found, propagating NAWM as the possible real burden of disease. In conclusion, [11C]PK11195 and PET are able to demonstrate inflammatory processes with microglial involvement in MS.

INTRODUCTION Microglia, the brain’s intrinsic macrophages, play a major role in the inflammatory process of autoimmune demyelinating diseases and particularly multiple sclerosis (MS). They initiate the immunological process in the early stages of the disease. More specifically, microglial activation in experimental allergic encephalomyelitis (EAE) and MS contributes to CNS damage through several mechanisms such as the production of proinflammatory cytokines (e.g. TNF-α), matrix metalloproteinases and free radicals, even as still ramified but activated cells [Benveniste 1997]. Indeed, by releasing myelinotoxic factors with direct injury to the oligodendrocyte-myelin unit, activated microglia stimulate this demyelinating process [Sriram and Rodriguez 1997]. Additionally, during relapses when the blood-brain barrier (BBB) opens, they are thought to act as antigen presenting cells having the capacity of activating perivascular myelin-reactive T lymphocytes by costimulatory molecules on their surface [Vowinckel et al.1997; Dangond et al. 1997]. One of the characteristic features of microglia is their rapid activation in response to brain injury with a concomitant higher expression of the peripheral benzodiazepine receptor (PBR) [Banati et al. 2000]. Visualisation of this PBR is possible by means of radiolabeled PK11195, a selective and specific high affinity ligand, allowing as such the assessment of microglial activity and providing more specific in vivo information concerning the underlying histopathological features. Indeed, high resolution microautoradiography combined with immunohistochemical cell identification in MS and EAE tissue demonstrated that in focal inflammation, when the BBB is disrupted, the PBR is expressed on invading blood-borne cells such as macrophages [Banati et al. 2000]. However in brain lesions without direct damage to the BBB, the predominant cell type expressing PBR binding sites is the activated microglial cell [Banati, Myers, and Kreutzberg1997]. PK11195 has been labeled with 11C for the study of the lesioned brain with positron emission tomography (PET) in various neuroinflammatory conditions like stroke, Rasmussen’s encephalitis and cerebral vasculitis [Ramsay et al. 1992; Goerres et al. 2001]. 92

debruyne j.

A previous feasibility study showed the value of a straightforward semiquantitative approach by means of defining an accurate confidence interval for the [11C]PK11195 uptake values in controls for the eventual detection of microglial activation in acute and chronic neuroinflammatory diseases [Debruyne et al., 2002]. Up till now, magnetic resonance imaging (MRI) has been widely used in MS to evaluate disease activity and to monitor clinical trials or the natural course of the disease process itself. Although MRI is of paramount value for diagnostic procedures, there remains a weak correlation between MRI parameters and disability as measured with the expanded disability status scale (EDSS). The reason for this clinicoradiological paradox may be the lack of histological specificity of conventional MRI lesions and the underestimation of disease burden in the normal-appearing white matter (NAWM) and spinal cord [Barkhof and van Walderveen 1999; Nijeholt et al. 1998]. The aims of the present study are, firstly, to assess the [11C]PK11195 uptake in MS patient subgroups with chronic and active white matter lesions on MRI and, secondly, to investigate the additional value of [11C]PK11195 imaging over MRI concerning the immuno-pathophysiological process during the disease course in this cohort of patients with different clinical manifestations and invalidity.

debruyne j.

93

PATIENTS AND METHODS Subjects Table 1 Clinical characteristics of the MS patients. Disease Age

Sex

Clinical

Sampled

Total

duration (yrs)

EDSS

relapse

Gd-lesions

T2-lesions

T2-lesions

2.3

3.0

no

7

4

32

44

M

Type RR

37

F*

RR

3.6

1.5

no

1

4

30

51

F

RR

22.7

2.5

yes

1

3

8

64

F

PP

13.7

7.0

no

-

2

9

45

F

PP

12.7

6.0

no

-

-

6

32

F*

RR

3.1

3.0

no

1

3

25

45

F

RR

14.8

3.0

no

1

4

30

27

M*

RR

3.8

1.0

yes

1

1

6

49

M

SP

8.8

7.0

no

-

3

33

50

F

SP

8.7

5.5

no

-

2

27

38

F

RR

0.3

1.5

yes

11

4

10

51

F

SP

23.7

4.5

no

-

2

28

36

M

RR

0.7

5.5

no

-

6

19

31

M

RR

13.2

3.5

no

-

5

41

35

F

SP

7.7

4.5

no

1

3

19

60

M

SP

32.7

6.5

no

-

6

21

64

F

SP

7.6

4.5

no

-

6

28

26

M*

RR

2.2

1.5

yes

-

2

2

45

F

SP

9.7

6.5

yes

2

6

16

42

M

RR

3.1

1.0

yes

1

2

12

37

M

RR

6.9

5.5

no

-

-

5

31

F

RR

3.5

3.0

no

-

1

15

EDSS, expanded disability status scale, Gd, gadolinium, * IFN-β treated patients

94

debruyne j.

The study was approved by the Ethical Committee of the Ghent University Hospital and written informed consent was obtained from each subject. Seven healthy volunteers (3 males, mean age 33 ± 8, range 23-41 yrs) and 22 out of 27 initially randomly included clinical definite and laboratory proven MS patients referring to the Poser criteria [Poser et al. 1983a] (mean age 43 ± 11, range 26-64 yrs) were finally included. Demographic and clinical parameters of the MS patients are described in table 1. Four MS patients were treated with IFN-ß at the time of inclusion. Thirteen patients had the relapsing-remitting type (RR) of the disease while 7 patients were secondary progressive (SP), having a continuous worsening of invalidity over a follow-up period of at least 6 months. Two patients had a primary progressive course (PP) without relapses from the very beginning of the disease. Six patients had a clinical relapse during the time of scanning, defined as the occurrence or worsening of neurological dysfunction lasting more than 24 hours. In 3 of them, corticosteroids needed to be administered after all imaging was performed. Ten patients showed Gd-enhancing lesions on the MR scan, 5 of them with a concomitant clinical relapse. One patient with the RR type of disease was scanned twice within a time interval of 4 months, the first imaging session at the time of a clinical relapse with Gdlesions and the second session at the time of remission. The average disease duration was 9.3 ± 8.3, range 0.3-32.7 yrs. The average EDSS was 4.0 ± 2.0, range 1.0-7.0. To assess differences between moderate and severe impairment, patients were, for some analyses, subdivided into a low and high invalidity category (cut-off EDSS 4.0). Radiochemistry PK11195 [1-(2-chlorophenyl)-N-methyl-N-(1-methylpropyl)-3-isoquinolinecarboxamide] was obtained from RBI (Natick, MA, USA). [11C]PK11195 was synthesized according to a procedure described by Camsonne et al. [Camsonne et al. 1984]. Briefly, 3 µmol Ndesmethyl PK11195 was dissolved in 150 µL dimethylsulphoxide, containing 3 µmol tetrabutylammonium hydroxide. After trapping of [11C]CH3I, the vial was closed and heated at 80°C for 3 min. Purification was done by HPLC using a RP-C18 column (Econosil, 250 mm x 10 mm, 10 µm particle size) and an ethanol/water (70/30) mixture as mobile phase. Radiochemical yield towards [11C]CH3I was 57 ± 2 %. Finally, 3.7 GBq [11C]PK11195 was obtained with a specific activity of 25 GBq/µmol. Chemical and radiochemical purity were higher than 99%. All subjects were injected intravenously with 370 ± 10 % MBq [11C]PK11195 with a slow bolus in a time course of 30 seconds. Data acquisition and processing All subjects underwent MR and PET scanning on the same day. MR imaging was performed on a 1.5 T commercial MR scanner (Siemens, Magnetom 1.5 T, SP4000; Erlangen, Germany). Prior to the administration of gadolinium (Gd), standard spin-echo imaging was carried out in 5 mm thick axial planes (pixel size=0.9 × 0.9 mm2) with proton density- (TR/TE/NEX=2170/20/1), T2- (TR/TE/NEX=2170/80/1) and T1weighted (TR/TE/NEX=600/12/1) contrast. Five minutes after Gd injection, the axial slices were rescanned with T1-weighting (TR/TE/NEX=800/20/1). PET studies were performed on a Siemens ECAT 951/31 PET scanner (Siemens, Knoxville, TN, USA) with a transaxial and axial resolution (FWHM) of 5.8 and 5 mm respectively, operating in 2D mode. All subjects were placed in supine position with dimmed lights and low ambient noise. Recontruction was done using filtered backprojection with a Hanning filter with a (cut-off 0.5 cycles/cm). Sequential transmission scanning was performed using a germanium - 68 / gallium - 68 ring source. debruyne j.

95

Correction for scatter was done using the standard software provided by the manufacturer (CTI). Subsequently, regional cerebral blood flow (rCBF) images were acquired by [15O]CO2 inhalation at 900 MBq/min. For this, the steady state technique using [15O]CO2 was applied [Frackowiak et al., 1980]. Eight min later, a one-hour dynamic PET study was conducted following the injection of 370 MBq [11C]PK11195. Nineteen frames each consisting of thirty-one planes of 3.375 mm thickness were recorded over 60 min with an increasing duration of 2 * 5 s, 5 * 10 s, 4 * 1 min, 2 * 3 min, 1 * 4 min, 1 * 5 min and 4 * 10 min. No partial volume correction was applied. Since a previous feasibility study showed that the time-activity curves for both volunteers and patients had a similar decline with a steady-state period from 40 min postinjection, data obtained from 40-60 min postinjection were summed (static scans). Automatic radioactive decay correction was applied to all images. Individual automatic coregistration of MR and perfusion PET data was achieved using SPM99 (Statistical Parametric Mapping, Functional Imaging Laboratory, Wellcome Department of Cognitive Neurology, Institute of Neurology, London, UK) [Friston et al. 1991]. Spatial normalisation was done on the normal templates for T1-weighted MR in MNI space (Montreal Neurological Institute), using non-linear warping with 7×8×7 basic functions (5 iterations), and to a voxel size of 3×3×3 mm3. T2-, Gd- and coregistered PET data underwent the same transformation as the original T1image. The same spatial transformation as for the perfusion PET studies was applied to all [11C]PK11195 data. Five patients were excluded because of head movement and subsequent incorrect coregistration between the perfusion and receptor PET scan. Volumes of interest and semiquantification Since no generally accepted model of absolute quantification of [11C]PK11195 specific binding in normal brain has been widely validated, and moreover, as no dynamic data for all volunteers were available and no arterial sampling was carried out, a straightforward semiquantitative approach was performed on the static scans. Volumes of interest (VOIs, on average 400 voxels ranging from 5 to more than 3000) were manually defined on the reoriented high-resolution MR scans in white and gray matter for volunteers and NAWM, gray matter, T2- and T1-Gd-lesions for MS patients and automatically transferred onto the reoriented [11C]PK11195 scans by means of PMOD, a kinetic modeling and image fusion environment tool in JAVA (Zurich, Switzerland) [Mikolajczyk et al. 1998]. When drawing VOIs, care was taken to avoid the carotid and major cerebral arteries as well as the ventricles and venous sinuses. For all controls, 52 VOIs were sampled in white matter and 264 in gray matter. For all MS patients, 153 VOIs were sampled in NAWM and 84 in gray matter. Gray matter was divided in cortical and central gray matter (thalamus and striatum) because higher binding of [3H]PK11195 was described in diencephalic structures notably in several thalamic nuclei [Doble et al.1987]. The normalised specific uptake for a particular VOI was defined as the mean number of counts per volume unit in this VOI divided by the mean number of counts per volume unit in cortical gray matter. Since there was a significant age difference between patients and controls, the effect of age in controls for white matter, cortical and subcortical gray matter, and thalamic [11C]PK11195 uptake values was studied.

96

debruyne j.

Statistical analysis Data were analysed by means of SPSS v10.0 for Windows (Chicago, IL, USA). For normality testing, a Kolmogorov-Smirnov test statistic was applied. For differences between groups, an independent samples t or a Mann-Whitney U test was applied when appropriate. A p-value lower than 0.05 was considered as significant while a value lower than 0.10 was considered as a meaningful trend. No Bonferroni correction was performed. Data are given as means ± one standard deviation.

debruyne j.

97

RESULTS [11C]PK11195 uptake values for MS patients versus controls and effect of age A [11C]PK11195 uptake value of 100.3 ± 9.9 in white matter and 100.5 ± 9.4 in gray matter for controls was found. In patients, NAWM and gray matter uptake was respectively 101.7 ± 11.1 and 101.0 ± 9.4, both higher, however, not statistically significant different from white and gray matter in controls (p=0.3 and 0.7 respectively). No effect of age was found in controls for white, cortical and subcortical gray matter, or thalamic [11C]PK11195 uptake values. In T2-lesions, the uptake tended to be lower compared to white matter in controls (97.3 ± 13.8, p=0.06). Regarding Gd-lesions, [11C]PK11195 uptake was significantly higher (p=0.001) compared to normal white matter (110.9 ± 14.7). Figure 1A shows the raised [11C]PK11195 uptake corresponding with a Gd-lesion on MRI. Figure 2 shows the mean [11C]PK11195 normalised uptake values for different types of MRI-lesions in MS patients. 150 140

Uptake value

130 120 110 100 90 80 70 N=

22

NAWM

22

gray matter

20

T2-lesions

10

Gd-lesions

FIGURE 2: Boxplot of [11C]PK11195 normalized uptake values in different types of MRIlesions. NAWM (101.7 ± 11.1), gray matter (101.0 ± 9.4), T2 lesions (97.3 ± 13.8 p=0.06), Gdlesions (110.9 ± 14.7 p=0.001). Uptake value normal white matter (100.3 ± 9.9), normal gray matter(100.5 ± 9.4). O = outlier value (cases with values between 1.5 and 3 box lengths from the upper or lower edge of the box. The box length is the interquartile range); * = extreme value (cases with values more than 3 box lengths from the upper or lower edge of the box)

98

debruyne j.

[11C]PK11195 uptake values for MRI-lesions subdivided according to the presence of a relapse (clinical or MR-relapse) A higher [11C]PK11195 uptake for T2-lesions was found in patients presenting at the time of scanning with an attack, defined as a clinical relapse or the presence of Gd-lesions on MRI (100.7 ± 14.2 versus 93.7 ± 12.5; p=0.01, figure 3). Also, when subdivided according to the presence of Gd-lesions on MRI or a clinical relapse separately, [11C]PK11195 uptake values were higher in both situations (respectively p= 0.05 and 0.02). Table 2 shows the T2-lesional [11C]PK11195 uptake values for the distinct conditions. The single patient with the RR type of disease, which was scanned twice, had a mean T2-lesional uptake value of 130.3, which dropped to 100.9 four months later at the time of remission. Figure 1 shows the raised [11C]PK11195 uptake corresponding with a T2-lesion in a patient with the RR type of disease during a clinical and MR-relapse. When the [11C]PK11195 uptake for Gd-lesions was subdivided according to the coinciding presence of a clinical relapse, uptake was higher when a relapse was present (104.4 ± 17.0 versus 115.4 ± 11.3; p = 0.05). No significantly different NAWM [11C]PK11195 uptake was found when a relapse was present.

FIGURE 1: Illustration of the remote projected neuroinflammatory response in the wake of a primary lesion elsewhere. Gd-lesion located in the right periventricular parietal region in a patient with active relapsing-remitting MS with the corresponding focally increased uptake on the [11C]PK11195 image (A). On a slightly higher level, the patient has a T2-weighted MR-lesion in the left periventricular parietal region corresponding with the concomitantly raised uptake on the [11C]PK11195 image (B). On the same image, the increased uptake of the upper border of the Gd-lesion in the right parietal region is still visible. Note the uptake in the frontal meningeal area on both [11C]PK11195 images, indicating the aspecific signal of [11C]PK11195. Both [11C]PK11195 images are superimposed on the corresponding proton density-weighted MR scan.

debruyne j.

99

100

debruyne j.

Table 2 [11C]PK11195 uptake values for T2-lesions, subdivided according to the presence of a relapse (clinical or MR-relapse). Clinical relapse present not present p-value

105.0 ± 16.6 94.6 ± 11.7 0.02

MR-relapse 101.7 ± 13.9 93.1 ± 12.5 0.05

Attack 100.7 ± 14.2 93.7 ± 12.5 0.01

Correlation of lesional [11C]PK11195 uptake values with disease duration and invalidity Concerning the relationship between NAWM [11C]PK11195 uptake values and disease duration, a steady rising slope during the progression of the disease was found (r=0.4; p=0.05; figure 4). Without the outlier value (see figure 4), the positive correlation remained, however, statistically non-significant (p>0.1). Concerning the correlation between gray matter [11C]PK11195 uptake and disease duration, subdivided according to high and low invalidity category patients, significance was reached for the high invalidity patients only (r=0.6; p=0.05). The correlations between [11C]PK11195 uptake values for both T2-weighted lesions and Gd-lesions on one side and EDSS or disease duration on the other side did not reach statistical significance. 160

T2-lesional uptake value

140

120

100

80

60 N=

33

no attack

36

attack

FIGURE 3: Boxplot of [11C]PK11195 uptake values for all T2-lesions subdivided according to the presence of an attack (clinical or MR-relapse) (value 93.7 ± 12.5 versus 100.7 ± 14.2 p=0.01). O = outlier (cases with values between 1.5 and 3 box lengths from the upper or lower edge of the box. The box length is the interquartile range); * = extreme value (cases with values more than 3 box lengths from the upper or lower edge of the box)

debruyne j.

101

Thalamic and NAWM [11C]PK11195 uptake in PP MS patients For the two patients with the PP type of MS, a substantially higher uptake was found both in the thalamus (mean values respectively 109.9 for PP, 104.0 for RR and 104.3 for SP; pvalue of 0.3 PP versus RR) and the NAWM (mean values for all lesions respectively 104.1 for PP, 99.8 for RR and 100.7 for SP; p-value of 0.1 PP versus RR).

NAWM uptake value

120

110

100

90 0

5

10

15

20

25

30

35

40

disease duration (yrs)

FIGURE 4: Correlation of NAWM [11C]PK11195 uptake and disease duration.

102

debruyne j.

DISCUSSION Radiolabeled PK11195 has been validated as a marker of microglial proliferation, with its ensuing increased PBR density, in ample neuropathological and animal experimental work involving lesions with or without BBB damage. Moreover, the full transformation of microglia into parenchymal phagocytes, absent in areas with chronic or subtle brain pathology, is not necessary to reach maximal levels of PK11195 binding [Banati, Myers, and Kreutzberg1997; Benavides et al. 1988]. An equal observation was made in a previous study in MS patients, where a high [11C]PK11195 uptake occurred in active white matter inflammation defined by MR, reflecting the presence of activated microglia [Vowinckel et al. 1997]. The latter findings were confirmed in the present study where significantly increased [11C]PK11195 uptake values were found in patients with active focal inflammatory lesions defined by Gd-enhanced T1-MRI (figure 1 and 2). The increased uptake in Gd-lesions is in accordance with the known histology of these conventional MR lesions. Indeed, in focal Gd-enhanced T1-weighted MRI lesions, the BBB breakdown is related to an extensive inflammatory response including macrophages and T-cells [Nesbit et al. 1991]. Microglia occupy 5 to 12% of the total number of cells in the normal brain. Gray matter contains more microglia than white matter, especially in sensory, limbic and subcortical gray matter structures [Lawson et al. 1990]. The latter was also demonstrated in a previous feasibility study where a higher mean gray matter [11C]PK11195 uptake was detected in seven controls [Debruyne et al., 2002]. Although a larger group of MS patients of the PP type is needed to make a clearer statement, the higher thalamic [11C]PK11195 uptake found in the present study could be explained by a projected neuroinflammatory response secondary to spinal cord long tract lesions such as in myelopathic syndromes, typically seen in this subgroup of MS patients [Banati et al. 2000; Sorensen et al. 1996; Andersson et al. 1999]. This hypothesis of a remote neuroinflammatory response in the wake of primary lesions elsewhere along a neural pathway was already formulated by Banati et al. where an increased thalamic [11C]PK11195 uptake was found in a patient with a spinal cord MRI lesion, and also in a case of EAE where PBR expression was induced in the midbrain caused by an injured spinothalamic tract [Banati et al. 2000]. T2-lesions on MRI are known for their high sensitivity but low specificity with regard to histopathology. The [11C]PK11195 uptake for T2-weighted lesions in the present study was low (figure 2). As such, these findings may be related to a PBR downregulation of chronic, immunologically less triggered microglia due to the disappearance of myelin fibers, which are over time replaced by axonal scars [Trapp et al. 1998; Schlumpf et al. 1993; Johnson et al. 1986]. Then, whenever a temporarily reactivation of the autoimmune process occurs, PBR expression will be higher compared to lesions in an existing steady state, as demonstrated in the present study where an overall global T2-lesional upgrading of [11C]PK11195 uptake was noticed when imaging was performed during a clinical or MRrelapse (figure 3). This upgrading of [11C]PK11195 uptake is illustrated in figure 1 and was also seen in the single RR patient who was scanned twice and showed a much larger mean T2-lesional [11C]PK11195 uptake value at the time of relapse compared to the time of remission. These findings confirm earlier in vitro and in vivo observations showing activated microglia remote from the primary inflammatory site [Banati et al. 2000]. As such, the molecular analogue of the natural disease course in which clinical and MR relapses are followed by periods of a relative stagnation is a waxing and waning phenomenon for the PBR expression in the T2-weighted lesions. debruyne j.

103

In the present study, a trend to a higher value of NAWM [11C]PK11195 uptake compared to white matter of controls was found, without any significantly different radioligand uptake when a relapse was present. This is also in agreement with histopathological studies, where an increased number of MHC class II microglia attributing to a loss of myelin extending far beyond visible detectable inflammatory foci was found [Hayes et al. 1987], as well as with autoradiographic studies both in EAE and human post-mortem tissue demonstrating regions of an increased number of non-phagocytic, still ramified, but activated microglia along NAWM tracts [Banati et al. 2000]. Also, a tendency to a rising of the NAWM [11C]PK11195 uptake during disease progression was found (figure 4). These findings are in line with the hypothesis that the demyelinating process is initiated by microglia from the very beginning of the disease, unrelated to BBB disruption and autoreactive T-cell function [Kesselring 1990], the latter being involved in clinical and MR-relapses [Miller et al. 1995]. As such, NAWM microglia would constitute the real burden of the disease, causing invisible demyelinisation independent from relapses. With this regard, Confavreux et al. recently concluded already that relapses do not significantly influence the progression of irreversible disability [Confavreux et al. 2000]. In conclusion, with [11C]PK11195 PET as a marker of the immuno-pathophysiological process, we in vivo confirmed the hypothesis that microglia play an important role in the immunopathogenesis of multiple sclerosis. For T1-Gadolinium-weighted MR lesions, the [11C]PK11195 uptake was significantly increased. Concerning T2-weighted MR lesions, the microglial activity was decreased suggesting a PBR downregulation related to the gradual vanishing of myelin fibers towards the chronic degenerative phase. An increased uptake in these lesions was found in patients with a clinical relapse or the presence of remote Gd-lesions, indicating a dynamic process with a transient upregulation following the natural course of the disease. In NAWM, the increase of [11C]PK11195 uptake with disease duration is in line with the theory proposing NAWM microglia as a real burden of the disease, causing invisible demyelinisation independent from relapses.

REFERENCES Andersson PB, Waubant E, Gee L, Goodkin DE. Multiple sclerosis that is progressive from the time of onset: clinical characteristics and progression of disability. Arch Neurol. 1999; 56: 1138-1142. Banati RB, Myers R, Kreutzberg GW. PK ('peripheral benzodiazepine') - binding sites in the CNS indicate early and discrete brain lesions: microautoradiographic detection of [3H]PK11195 binding to activated microglia. J Neurocytol 1997; 26: 77-82. Banati RB, Newcombe J, Gunn RN, Cagnin A, Turkheimer F, Heppner F, Price G, Wegner F, Giovannoni G, Miller DH, Perkin GD, Smith T, Hewson AK, Bydder G, Kreutzberg GW, Jones T, Cuzner ML, Myers R. The peripheral benzodiazepine binding site in the brain in multiple sclerosis: quantitative in vivo imaging of microglia as a measure of disease activity. Brain 2000; 123: 2321-2337. Barkhof F, van Walderveen M Characterization of tissue damage in multiple sclerosis by nuclear magnetic resonance. Philos.Trans.R.Soc.Lond B Biol.Sci. 1999. 354: 1675-1686.

104

debruyne j.

Benavides J, Cornu P, Dennis T, Dubois A, Hauw JJ, MacKenzie ET, Sazdovitch V, Scatton B). Imaging of human brain lesions with an site radioligand. Ann Neurol 1988; 24: 708-712. Benveniste EN Role of macrophages/microglia in multiple sclerosis and experimental allergic encephalomyelitis. J Mol.Med 1997; 75: 165-173. Camsonne R, Crouzel C, Comar D, Maziere M, Prenant C, Sastre J, Moulin MA, Syrota A Synthesis of n-(C-11) methyl, n-(methyl-1 propyl), (chloro-2 phenyl)-1 isoquinoleine carboxamide-3 (PK-11195) – a new ligand for peripheral benzodiazepine receptors. J Labelled Compd Rad 1984; 21: 985-991. Confavreux C, Vukusic S, Moreau T, Adeleine P Relapses and progression of disability in multiple sclerosis. N Engl J Med 2000; 343: 1430-1438. Dangond F, Windhagen A, Groves CJ, Hafler DA. Constitutive expression of costimulatory molecules by human microglia and its relevance to CNS autoimmunity. J Neuroimmunol. 1997; 76: 132-138. Debruyne JC, Van Laere KJ, Versijpt J, De Vos F, Eng JK, Strijckmans K, Santens P, Achten E, Slegers G, Korf J, Dierckx RA, De Reuck JL. Semiquantification of the peripheral-type benzodiazepine ligand [11C]PK11195 in normal human brain and application in multiple sclerosis patients. Acta Neurol Belg 2002; 102: 127-35. Doble A, Malgouris C, Daniel M, Daniel N, Imbault F, Basbaum A, Uzan A, Gueremy C, Le Fur G Labelling of peripheral-type benzodiazepine binding sites in human brain with [3H]PK 11195: anatomical and subcellular distribution. Brain Res Bul 1987. 18: 49-61. Frackowiak RS, Lenzi GL, Jones T, Heather JD Quantitative measurement of regional cerebral blood flow and oxygen metabolism in man using 15O and positron emission tomography: theory, procedure, and normal values. J Comput.Assist.Tomogr. 1980; 4: 727736. Friston KJ, Frith CD, Liddle PF, Frackowiak RS. Comparing functional (PET) images: the assessment of significant change. J Cereb Blood Flow Metab 1991; 11: 690-699. Goerres GW, Revesz T, Duncan J, Banati RB Imaging cerebral vasculitis in refractory epilepsy using [11C](R)-PK11195 positron emission tomography. Am J Roentgenol 2001; 176: 1016-1018. Hayes GM, Woodroofe MN, Cuzner ML Microglia are the major cell type expressing MHC class II in human white matter. J Neurol.Sci. 1987; 80: 25-37. Johnson MD, Wang JK, Morgan JI, Spector S Downregulation of [3H]Ro5-4864 binding sites after exposure to peripheral-type benzodiazepines in vitro. J Pharmacol Exp Ther 1986; 238: 855-859. Kesselring J The pathogenesis of multiple sclerosis. Schweiz Med Wochenschr 1990. 120: 1083-1090. Lawson LJ, Perry VH, Dri P, Gordon S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience 1990; 39: 151-170. Mikolajczyk K, Szabatin M, Rudnicki P, Grodzki M, Burger C. A JAVA environment for medical image data analysis: initial application for brain PET quantitation. Med Inform.(Lond) 1998; 23: 207-214.

debruyne j.

105

Miller SD, McRae BL, Vanderlugt CL, Nikcevich KM, Pope JG, Pope L, Karpus WJ. Evolution of the T-cell repertoire during the course of experimental immune-mediated demyelinating diseases. Immunol.Rev. 1995; 144: 225-244. Nesbit GM, Forbes GS, Scheithauer BW, Okazaki H, Rodriguez M. Multiple sclerosis: histopathologic and MR and/or CT correlation in 37 cases at biopsy and three cases at autopsy. Radiology 1991; 180: 467-474. Nijeholt GJ, van Walderveen MA, Castelijns JA, van Waesberghe JH, Polman C, Scheltens P, Rosier PF, Jongen PJ, Barkhof F Brain and spinal cord abnormalities in multiple sclerosis. Correlation between MRI parameters, clinical subtypes and symptoms. Brain 1998; 121: 687-697. Poser CM, Paty DW, Scheinberg L, McDonald WI, Davis FA, Ebers GC, Johnson KP, Sibley WA, Silberberg DH, Tourtellotte WW New diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines for research protocols. Ann Neurol 1983; 13: 227-231. Ramsay SC, Weiller C, Myers R, Cremer JE, Luthra SK, Lammertsma AA, Frackowiak RS Monitoring by PET of macrophage accumulation in brain after ischaemic stroke. Lancet 1992; 339: 1054-1055. Schlumpf M, Parmar R, Lichtensteiger W). Prenatal diazepam induced persisting downregulation of peripheral (omega 3) benzodiazepine receptors on rat splenic macrophages. Life Sci. 1993; 52: 927-934. Sorensen JC, Dalmau I, Zimmer J, Finsen B Microglial reactions to retrograde degeneration of tracer-identified thalamic neurons after frontal sensorimotor cortex lesions in adult rats. Exp Brain Res 1996; 112: 203-212. Sriram S, Rodriguez M. Indictment of the microglia as the villain in multiple sclerosis. Neurology 1997; 48: 464-470. Trapp BD, Peterson J, Ransohoff RM, Rudick R, Mork S, Bo L. Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis. N.Engl.J Med 1998; 338: 278-285. Vowinckel E, Reutens D, Becher B, Verge G, Evans A, Owens T, Antel JP. PK11195 binding to the peripheral benzodiazepine receptor as a marker of microglia activation in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Res 1997; 50: 345-353

106

debruyne j.

IV. MICROGLIAL IMAGING WITH POSITRON EMISSION TOMOGRAPHY AND ATROPHY MEASUREMENTS WITH MAGNETIC RESONANCE IMAGING IN MULTIPLE SCLEROSIS: A CORRELATIVE STUDY J Versijpt PhD1,6,7, JC Debruyne MD2,7, KJ Van Laere PhD1, F De Vos PhD3, J Keppens Eng1, K Strijckmans PhD4, E Achten PhD5, G Slegers PhD3, RA Dierckx PhD1, J Korf PhD6, JL De Reuck PhD2 1

Division of Nuclear Medicine, Ghent University Hospital Department of Neurology, Ghent University Hospital 3 Laboratory of Radiopharmacy, Ghent University 4 Laboratory of Analytical Chemistry, Institute for Nuclear Sciences, Ghent University 5 Department of Radiology, MR-Unit, Ghent University Hospital 6 Department of Biological Psychiatry, University Hospital, Groningen, the Netherlands 2

7

Both authors contributed equally to this manuscript

Key words: Positron Emission Tomography, [11C]PK11195, microglia, inflammation, atrophy, multiple sclerosis Running title: Relation of microglial and atrophy imaging in MS Author for correspondence: JC Debruyne, MD, Department of Neurology Ghent University Hospital; De Pintelaan 185; B-9000 Ghent, Belgium Phone: +32 9 240 45 29; Fax: +32 9 240 49 71; E-mail: [email protected]

ABSTRACT Objective: The objectives of the present study were to assess brain atrophy in MS patients during different disease stages and to investigate by PET and [11C]PK11195, a marker of microglial activation, the relationship between inflammation, atrophy, and clinically relevant measures. Methods: Eight healthy subjects and 22 MS patients were included. Semiquantitative [11C]PK11195 uptake values, with normalization on cortical gray matter, were measured for MRI T2- and T1-lesions and normal appearing white matter (NAWM). As atrophy index we used the ratio of the amount of white and gray matter divided by the ventricular size, using an optimized a priori based segmentation algorithm (SPM99). Results: Atrophy was significantly greater in MS patients compared to age-matched controls. A significant correlation was found between brain atrophy and both disease duration and disability, as measured with the expanded disability status scale (EDSS). For NAWM, [11C]PK11195 uptake increased with the amount of atrophy, while T2-lesional [11C]PK11195 uptake values decreased according to increasing brain atrophy. Conclusions: The present study suggests that brain atrophy, correlating with disease duration and disability, is directly related to NAWM and T2-lesional inflammation as measured by microglial activation. debruyne j.

107

INTRODUCTION In MS, neuroinflammation is the pivotal event that causes demyelination and oligodendrocyte cell death.1 Whereas over the past decade most attention was focused on the theory of a T-cell mediated autoimmune process,2 in vitro studies however showed that microglia also can be activated by various stimuli resulting in the expression of proinflammatory cytotoxic cytokines, matrix metalloproteinases, nitric oxide, and free radicals.3 In addition, activated microglia serve as the major antigen-presenting cell in the CNS, likely contributing to aberrant immune reactivity at this site. Accordingly, it has been hypothesized that demyelination may, at least partly, be the result of microglial activation leading to the release of myelinotoxic factors that directly injure the oligodendrocyte-myelin unit.4 As a consequence, it is believed that microglia play a prominent role in autoimmune mediated demyelinating disorders of the central nervous system.5 One of the characteristic features of microglia is their rapid activation in response to brain injury with a concomitant higher expression of the peripheral benzodiazepine receptor (PBR).6 In a recent study making use of an animal model of demyelination it was also shown that this increased PBR expression is directly related to the degree of demyelination and to the activation of glial cells, where this PBR level increase was even detectable prior to the observable demyelination.7 Visualization of the PBR can be performed by means of radiolabeled PK11195. This specific high-affinity ligand, allows as such the assessment of microglial activation giving more specific in vivo information concerning the underlying histopathological features due to neurodegeneration and neuroinflammation in general and to MS in particular.8 Indeed, based on the molecular specificity of radioligand-receptor interactions, positron emission tomography (PET) allows the quantitative in vivo functional assessment of cellular pathways and their specific involvement in disease. As such, PK11195 has been labeled with 11C for PET and applied in various neuroinflammatory conditions like Rasmussen’s encephalitis,9 cerebral vasculitis,10, Herpes simplex encephalitis,11 amyotrophic lateral sclerosis,12 corticobasal degeneration,13 and multiple system atrophy.14 Previously, we demonstrated characteristic [11C]PK11195 uptake patterns for chronic and active white matter lesions and normal appearing white matter (NAWM) in subgroups of MS patients, exemplifying an additional value of [11C]PK11195 imaging over MRI concerning the assessment and monitoring of the immuno-pathophysiological process in MS. Moreover, a significant steady rising amount of NAWM [11C]PK11195 uptake during disease progression was found, propagating NAWM as a major burden of the disease.15 Concordingly with the hypothesis that microglia can directly induce myelin damage through the release of proinflammatory mediators,16 this study suggested that during the disease process invisible demyelination is an increasingly ongoing NAWM process.

108

debruyne j.

On the other hand, atrophy of the brain and spinal cord at postmortem examination is considered to be a hallmark of irreversible CNS damage. Indeed, MS involves substantial loss of both axonal density and volume, in addition to the well-recognized loss of myelin within lesions.17,18 Whereas in healthy controls, the progressive loss of brain parenchyma occurs with magnitudes ranging from 0.1 to 0.3 % per year, for MS patients this reduction in brain volume is estimated at 0.4 to 5% per year where most published patient cohorts narrow this annual loss range to 0.6 to 1% per year,18-20 starting already in the earliest stage of the disease.21,22 The objectives of the present study were threefold: firstly, the assessment of brain atrophy in MS patients compared to age-matched normal controls, secondly, the correlation of brain atrophy with clinical measures, and thirdly and most importantly, the correlation of [11C]PK11195 uptake with brain atrophy measures.

debruyne j.

109

PATIENTS AND METHODS Subjects The study was approved by the Ethical Table 1 Clinical characteristics of the Committee of the Ghent University Hospital MS patients and written informed consent was obtained disease from each subject. Eight controls (3 men; mean age 37.2 ± 13, range 23-65 y) and 27 clinical Age Sex Type duration (y) EDSS definite and laboratory proven MS patients RR 2.3 3.0 referring to the criteria of the International 44 M Panel on the Diagnosis of Multiple Sclerosis 37 F RR 3.6 1.5 were randomly included [McDonald, F RR 22.7 2.5 Compston, Edan, Goodkin, Hartung, Lublin, 51 McFarland, Paty, Polman, Reingold, Sandberg64 F PP 13.7 7.0 Wollheim, Sibley, Thompson, van den, Weinshenker, and Wolinsky2001b]. Five 45 F PP 12.7 6.0 patients had to be removed from the study F RR 3.1 3.0 because of head movement and subsequent 32 coregistration errors between perfusion and 45 F RR 14.8 3.0 receptor PET scanning. Finally, 22 patients RR 3.8 1.0 were eligible (9 men, mean age 42.6 ± 11, range 27 M 26-64 y). There was no statistically significant 49 M SP 8.8 7.0 age difference between patients and controls (p F SP 8.7 5.5 = 0.3). Demographic and clinical parameters of 50 the MS patients are described in table 1. Four 38 F RR 0.3 1.5 MS patients were treated with IFN-ß at the time F SP 23.7 4.5 of inclusion. Thirteen patients had the 51 relapsing-remitting type (RR) of the disease 36 M RR 0.7 5.5 while 7 patients were secondary progressive RR 13.2 3.5 (SP), having a continuous worsening of 31 M invalidity over a follow-up period of at least 6 35 F SP 7.7 4.5 months Two patients had a primary progressive SP 32.7 6.5 course (PP) without relapses from the very 60 M beginning of the disease. Six patients had a 64 F SP 7.6 4.5 clinical relapse at the time of scanning, defined as the occurrence or worsening of neurological 26 M RR 2.2 1.5 dysfunction lasting more than 24 hours. In 3 of F SP 9.7 6.5 them, corticosteroids needed to be administered 45 after all imaging was performed. Ten patients 42 M RR 3.1 1.0 showed Gd-enhancing lesions on the MRI scan, RR 6.9 5.5 5 of them with a concomitant clinical relapse. 37 M The average disease duration was 9.3 ± 8.3 y 31 F RR 3.5 3.0 (range 0.3-33 y). The average expanded RR = relapsing-remitting; SP = disability status scale (EDSS) was 4.0 ± 2.0 secondary progressive; PP = primary (range 1.0-7.0). progressive; EDSS = expanded disability status scale; M= male, F= female

110

debruyne j.

Radiochemistry PK11195 [1-(2-chlorophenyl)-N-methyl-N-(1-methylpropyl)-3-isoquinoline carboxamide] was obtained from RBI (Natick, MA, USA). [11C]PK11195 was synthesized according to a procedure described by Camsonne et al.24 Briefly, 3 µmol N-desmethyl PK11195 was dissolved in 150 µL dimethylsulphoxide, containing 3 µmol tetrabutylammonium hydroxide. After trapping of [11C]CH3I, the vial was closed and heated at 80°C for 3 min. Purification was done by HPLC using a RP-C18 column (Econosil, 250 mm x 10 mm, 10 µm particle size) and an ethanol/water (70/30) mixture as mobile phase. Radiochemical yield towards [11C]CH3I was 57% (confidence interval 2 %, 30 experiments). Finally, 3.7 GBq [11C]PK11195 was obtained with a specific activity of 25 GBq/µmol. Chemical and radiochemical purity were higher than 99%. All subjects were injected intravenously with 370 ± 10 % MBq [11C]PK11195 with a slow bolus in a time course of 30 seconds. Data acquisition and processing All subjects underwent MR and PET scanning on the same day. MR imaging was performed on a 1.5 T MR scanner (Siemens, Magnetom SP4000; Erlangen, Germany). Prior to the administration of gadolinium (Gd), standard spin-echo imaging was carried out in 5 mm thick axial planes (pixel size of 0.9 × 0.9 mm2) with proton density(TR/TE/NEX=2170/20/1), T 2(TR/TE/NEX=2170/80/1) and T1-weighted (TR/TE/NEX=600/12/1) contrast. Five minutes after gadolinium injection, the axial slices were rescanned with T1-weighting (TR/TE/NEX=800/20/1). PET studies were performed on a Siemens ECAT 951/31 PET scanner (Siemens, Knoxville, TN, USA) with a transaxial and axial resolution (FWHM) of 5.8 and 5 mm respectively (values provided by Siemens, operating in 2D mode). All subjects were placed in supine position with dimmed lights and low ambient noise. Realignment of the head to the orbitomeatal line was performed by laser guidance. Reconstruction was done using filtered backprojection with a Hanning filter (cut-off of 0.5 cycles/cm). Sequential transmission scanning was performed using a 68Ge/68Ga ring source. Correction for scatter was done using the standard software provided by the manufacturer. Subsequently, regional cerebral blood flow (rCBF) images were acquired by [15O]CO2 inhalation at 900 MBq/min. For this, the steady state technique using [15O]CO2 was applied.25 Eight minutes later, a one-hour dynamic PET study was conducted after the injection of 370 MBq [11C]PK11195. Nineteen frames, each consisting of thirty-one planes of 3.375 mm thickness, were recorded over 60 min with an increasing duration of 2 × 5 s, 5 × 10 s, 4 × 1 min, 2 × 3 min, 1 × 4 min, 1 × 5 min and 4 × 10 min. Automatic radioactive decay correction was applied to all images. No partial volume correction was applied. Since a previous feasibility study showed that the time-activity curves for both volunteers and patients had a similar decline with a steady-state period from 40 min post-injection, data obtained from 40-60 min post-injection were summed (≈ static scans).26 Individual automatic coregistration of MR and perfusion PET data was achieved using SPM99 (Statistical Parametric Mapping, Functional Imaging Laboratory, Wellcome Department of Cognitive Neurology, Institute of Neurology, London, UK).27 Spatial normalization was done on the normal templates for T1weighted MR scans in MNI space (Montreal Neurological Institute), using a non-linear warping with 7×8×7 basic functions (5 iterations), and to a voxel size of 3×3×3 mm3. T2-, Gdand coregistered perfusion PET data underwent the same transformation as the original T1image. The same spatial transformation parameters as for the perfusion PET studies were subsequently applied to the [11C]PK11195 data.

debruyne j.

111

Volumes of interest and [11C]PK11195 uptake semiquantification Since no generally accepted model of absolute quantification of [11C]PK11195 specific binding in normal brain has been widely validated and no dynamic data for all volunteers were obtained neither was arterial sampling carried out, a validated semiquantitative approach was carried out on the static images obtained during the steady-state period of the [11C]PK11195 brain uptake.26 Volumes of interest (VOIs) were defined on the individual’s spatially standardized high-resolution MR scan in white and gray matter for volunteers and in NAWM, gray matter, T2- and T1-Gd-lesions for MS patients and automatically transferred onto the coregistered [11C]PK11195 scan by means of PMOD (University Hospital Zurich, Switzerland), a kinetic modeling and image fusion environment tool in Java.28 When drawing VOIs, care was taken to avoid the carotid and major cerebral arteries as well as the ventricles or venous sinuses. Three global regions were defined namely white matter, cortical and central gray matter (thalamus and striatum). The latter was done because high labeling of [3H]PK11195 was described in diencephalic structures notably in several thalamic nuclei.29 Although subject to a possible underestimation of uptake values due to the known rising involvement of gray matter in later stages of MS,30 the normalized specific uptake for a particular area of interest was defined as the mean activity per volume unit in this area divided by the mean activity per volume unit in cortical gray matter.

112

debruyne j.

Figure one Example of a segmented axial MR slice into gray and white matter and cerebrospinal fluid for a 37year old MS patient (panel A) and a 39-year old healthy control (panel B), after anatomical standardization

Atrophy measures Relative parenchymal fractions were assessed with the whole-brain probabalistic segmentation and volumetry module incorporated within SPM99. T1-weighted images were used. Since relative brain atrophy measures have shown to be superior to absolute measures for cross-sectional studies,31 images were first normalized to the MNI template, accounting for individual head size, using the default SPM spatial pre-processing method (normalization with bilinear interpolation, 7×8×7 nonlinear basic functions, 12 iterations and medium nonlinear regularization). Then, images were segmented, without lesion extraction, using the ‘lots of inhomogeneity correction’ option into gray and white matter and CSF maps for which the respective volume was determined as the proportion of voxels, worked out from a subregion of the volume that encloses the brain.32 Finally, the brain atrophy index was defined as the relative CSF volume divided by the relative white and gray matter volume. Figure one shows an image of a segmented axial MR slice of a 37year old MS patient (panel A) and a 39-year old healthy control subject (panel B). Statistical analysis Data were analyzed by means of SPSS v10.0 for Windows (Chicago, IL, USA). For normality testing, a Kolmogorov-Smirnov test statistic was applied. For differences between groups, an independent samples T test or a Mann-Whitney U test was applied whereas for the correlational analysis, a Pearson or Spearman correlation coefficient was calculated, when appropriate. A p value lower than or equal to 0.05 was considered as statistically significant. Data are given as means ± one standard deviation.

debruyne j.

113

RESULTS Atrophy measures for MS patients versus age-matched controls Table 2 shows the atrophy measures for the different brain compartments. Atrophy as measured by the atrophy index was significantly greater in MS patients compared to agematched controls (p = 0.04). When considering the brain compartments separately, the relative amount of gray matter, (normal appearing) white matter and CSF were all indicative of the loss of brain tissue for MS patients, however, only the difference in ventricular size (CSF) reached statistical significance (p = 0.04). Whereas for controls a significant correlation was found between age and the amount of gray matter, CSF and the atrophy index (p = 0.009, p = 0.03 and p = 0.02 respectively), no statistically significant correlation was found between age and any atrophy measure for patients. The presence of enhancing lesions or a clinical relapse did not significantly influence the amount of brain atrophy (p=0.9).

Table 2: Atrophy comparison between MS patients and age-matched controls

gray matter

MS patients age-matched controls 0.183 ± 0.011 0.186 ± 0.012

p-value 0.6

(normal appearing) white matter

0.102 ± 0.009

0.106 ± 0.007

0.3

CSF

0.089 ± 0.012

0.080 ± 0.007

0.04

0.314 ± 0.047

0.275 ± 0.034

0.04

CSF gray + white

114

debruyne j.

Correlation of lesional [11C]PK11195 uptake values with atrophy Figure one demonstrates the relation of NAWM [11C]PK11195 uptake with atrophy, indicating that the amount of NAWM microglial activation as measured with [11C]PK11195 PET scanning is statistically significant corelated to the amount of atrophy (r = 0.2; p = 0.03). It was also shown that the [11C]PK11195 uptake for T2-lesions decreases significantly with increasing brain atrophy (r = -0.3, p = 0.03; figure two). There was no relation between [11C]PK11195 uptake in gadolinium-enhancing lesions and brain atrophy (r = -0.01; p = 0.9).

NAWM radioligand uptake value

120

110

100

90 .2

.3

.4

.5

atrophy index

Figure one: Scatterplot of the NAWM [11C]PK11195 uptake value with atrophy as measured by the atrophy index

T2-lesional radioligand uptake value

140

130

120

110

100

90

80 .2

.3

.4

.5

atrophy index

Figure two: Scatterplot of the T2-lesional [11C]PK11195 uptake value with atrophy as measured by the atrophy index

debruyne j.

115

Correlation of the atrophy index with disease duration and disability As shown in figure three, there was a statistically significant correlation between disease duration and brain atrophy (r = 0.5; p = 0.03). The correlation between atrophy and disability as measured by the EDSS yielded also statistical significance (r = 0.4, p = 0.05; figure four).

atrophy index

.5

.4

.3

.2 -10

0

10

20

30

40

disease duration

Figure three: Scatterplot of atrophy as measured by the atrophy index with disease duration (y)

.5

atrophy index

.4

.3

.2 0

1

2

3

4

5

6

7

8

EDSS

Figure four: Scatterplot of atrophy as measured by the atrophy index with disability (EDSS)

116

debruyne j.

DISCUSSION In a previous study, we demonstrated a slightly higher NAWM [11C]PK11195 uptake compared to normal white matter where this NAWM [11C]PK11195 uptake showed a steady rising slope with disease progression indicating the growing amount of activated microglia, undetectable for MRI, in this brain area.15 The present study demonstrates the weak, however significant correlation between this rising NAWM [11C]PK11195 uptake during disease progression and the decrease in brain parenchymal volume. One of the reasons of the weak correlation could be the underestimation of the NAMW- and Gd-lesional [11C]PK11195 uptake due to the known rising involvement of gray matter in later stages of MS hampering the semiquantitative methodology used in the present study with the normalization on gray matter.30 Moreover, in a recent pathology study examining newly formed MS lesions it was shown that the earliest changes observed were a widespread oligodendrocyte apoptosis in which T cells, macrophages, activated microglia, reactive astrocytes, and neurons appeared normal.33 This contrasts with the hypothesis that inflammatory demyelination is a pivotal event in MS pathology and might also partly explain this rather weak correlation between inflammation and atrophy. Finally, it has to be noted however that this study was not a longitudinal study but rather a cross-sectional study of patients with a different disease duration, making it difficult to draw formal conclusions about disease progression and as such necessitating extrapolations. Yet, this is the first study to reveal in vivo the direct relationship between NAWM inflammation or microglial activation as measured with radiolabeled PK11195 on one hand and atrophy on the other hand and, although correlation does not imply causation, demonstrates that abnormalities in the NAWM are an important factor contributing to neurological impairment.34,35 The mechanism of neuroinflammation leading to atrophy is most probably mediated by a steady ongoing NAWM process of invisible demyelination by activated microglia. Indeed, a study by Yin et al. with myelin-associated glycoprotein (MAG) deficient mice demonstrated already this relationship between demyelination and atrophy where the absence of MAG leaded to chronic atrophy of myelinated axons and axonal degeneration.36 This process of (hypo)myelination seems pivotal in the evolution of brain atrophy and is maintained by the lack of neurotrophic factors like MAG in the myelin sheat which are important for the protection of the cytoplasmic collar and the periaxonal space.37 Recent MRI studies in MS have emphasized that brain atrophy is a robust and pivotal marker of disease progression, reflecting the destructive processes as a result of extensive axonal damage.20,21 However, the assessment of cerebral atrophy by MRI is difficult due to general factors such as (small) inter-individual variations in head size and intracranial volume, inconsistencies in the acquisition sequence like differences in the measured voxel size or slice thickness, movement artifacts, magnetic field inhomogeneities and variations in MR image intensity scales. In addition, also disease-specific aspects like fluctuations of tissue water content such as in vasogenic edema coupled to active lesions or the administration of an ‘antiinflammatory’ treatment are potential sources of error.38,39 Atrophy has been measured with MRI both by manual techniques as well as by semi-automated contour or thresholding segmentation techniques. Actual atrophy measures ranged from linear atrophy measures like the intercaudate distance, whole brain or ventricular width to absolute or relative volumes of ventricles, whole brain, hemisphere or some adherent slices, corpus callosum, or more specific brain structures like the cerebellum or brainstem.21,40-42 Ideally however, the measurement technique should be fully reproducible, automated, accurate and very sensitive. In the present study the statistical parametric mapping software package (SPM99) was used for the assessment of brain atrophy which is a relatively robust method and debruyne j.

117

requires no manual intervention.43 SPM software uses prior spatial information from a database of normal brain images to classify voxels, according to their location and signal intensity characteristics, as gray matter, white matter or CSF and can be applied to both 2D or 3D images. This method was recently introduced by Chard et al. for the measurement of brain parenchymal, white and gray matter fractions in early relapsing-remitting MS patients making use of three-dimensional fast spoiled gradient recall MR scans with a slice thickness of 1.5 mm.44 Measures of brain atrophy have been found to correlate to varying degrees with intellectual and memory dysfunction, dementia, and scores on neuropsychological tests.45,46 Concerning the relationship between atrophy and disability, several conflicting results have been reported, most likely also enhanced by varying atrophy measures throughout different studies. The present study found a significant correlation between atrophy and disability, as measured by the EDSS, which is in agreement with most previously reported findings.47-54 However, Wilson et al. found no correlation between cerebral volume and clinical disability while Ge et al. as well found no significant correlation between fractional white nor gray matter volume and disability in a group of 27 RR MS patients.55,56 Concerning the inverse relationship between T2-lesional [11C]PK11195 uptake and atrophy, this may be related to a PBR downregulation of chronic, immunologically less triggered microglia due to the disappearance of myelin fibers, which are over time replaced by axonal scars57,58.57,59 Indeed, in a previous study we found already that the overall [11C]PK11195 uptake for T2-weighted lesions was low where a global T2-lesional upgrading of [11C]PK11195 uptake was noticed when imaging was performed during a clinical or MR-relapse, possibly related to a higher PBR expression whenever this temporarily reactivation of the autoimmune process occurs.15 As such, the molecular analogue of the natural disease course in which clinical and MR relapses are followed by periods of a relative stagnation is a waxing and waning phenomenon for the PBR expression in the T2-weighted lesions. On the other hand, it needs to be noted that this correlation might also have been influenced methodologically by local partial volume effects (PVE) which are due to the limited resolution of the PET measurements, which results in an activity underestimation for smaller lesion volumes. No regional volumetric uptake correction was performed for individual lesions since a post-hoc correction for the PVE would need a plausible hypothesis on the relative contributions of the activity within a T2- or gadolinium-enhancing lesion coming from within the lesion itself and its surrounding (e.g. assuming all (or a known fraction) pathological [11C]PK11195 activity raise is due to the lesion itself). The inability to correctly determine this contribution factor could on its own introduce a bias in the measurement and was therefore not carried out. The present study did not reveal any correlation between T1-gadolinium-enhanced lesional [11C]PK11195 uptake and brain atrophy. This is in concordance with Saindane et al. where the relationship between the gadolinium-enhancing T1 lesion load and the development of whole brain atrophy over a 2-years period was investigated and no correlation was found.60 This would suggest that the breakdown in the blood-brain barrier could be considered as an epiphenomenon in the process of brain atrophy giving rise to localized inflammation with reversible edema and some degree of focal axonal damage. Moreover, both magnetization transfer and magnetic resonance spectroscopy studies established that a rather global process underlies atrophy in MS,60-62 which was confirmed in the present study indicating NAWM as a substantial contributor to brain atrophy.

118

debruyne j.

The results of this study implicate the role of activated microglia in the overall demyelinating process especially in NAWM and emphasize the important long-term relationship between neuroinflammation and brain atrophy, the latter evolving by mechanisms that are at least partly independent of those mechanisms responsible for MRI lesions.

ACKNOWLEDGMENTS This work was granted by the WOMS [Wetenschappelijk Onderzoek voor Multiple Sclerose, Scientific Research on Multiple Sclerosis - Flanders (Belgium)] and the FWO (Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek, Fund for Scientific Research - Flanders). J Versijpt is financially supported by the “Internationale Stichting Alzheimer Onderzoek, International Foundation Alzheimer Research”.

debruyne j.

119

REFERENCES 1. Dinter H, Onuffer J, Faulds D, Perez HD. Phosphodiesterase type IV inhibitors in the treatment of multiple sclerosis. J Mol Med 1997; 75: 95-102. 2. Awad M, Gavish M. Peripheral-type benzodiazepine receptors in human cerebral cortex, kidney, and colon. Life Sci 1991; 49: 1155-61. 3. Gebicke-Haerter PJ, Van Calker D, Norenberg W, Illes P. Molecular mechanisms of microglial activation. A. Implications for regeneration and neurodegenerative diseases. Neurochem Int 1996; 29: 1-12. 4. Sriram S, Rodriguez M. Indictment of the microglia as the villain in multiple sclerosis. Neurology 1997; 48: 464-70. 5. Neumann H. Molecular mechanisms of axonal damage in inflammatory central nervous system diseases. Curr Opin Neurol 2003; 16: 267-73. 6. Agnello D, Carvelli L, Muzio V, Villa P, Bottazzi B, Polentarutti N et al. Increased peripheral benzodiazepine binding sites and pentraxin 3 expression in the spinal cord during EAE: relation to inflammatory cytokines and modulation by dexamethasone and rolipram. J Neuroimmunol 2000; 109: 105-11. 7. Chen MK, Baidoo K, Verina T, Guilarte TR. Peripheral benzodiazepine receptor imaging in CNS demyelination: functional implications of anatomical and cellular localization. Brain 2004; 127: 1379-92. 8. Vowinckel E, Reutens D, Becher B, Verge G, Evans A, Owens T et al. PK11195 binding to the peripheral benzodiazepine receptor as a marker of microglia activation in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Res 1997; 50: 345-53. 9. Banati RB, Goerres GW, Myers R, Gunn RN, Turkheimer FE, Kreutzberg GW et al. [11C](R)-PK11195 positron emission tomography imaging of activated microglia in vivo in Rasmussen's encephalitis. Neurology 1999; 53: 2199-203. 10. Goerres GW, Revesz T, Duncan J, Banati RB. Imaging cerebral vasculitis in refractory epilepsy using [11C](R)-PK11195 positron emission tomography. Am J Roentgenol 2001; 176: 1016-8. 11. Cagnin A, Myers R, Gunn RN, Lawrence AD, Stevens T, Kreutzberg GW et al. In vivo visualization of activated glia by [11C] (R)-PK11195-PET following herpes encephalitis reveals projected neuronal damage beyond the primary focal lesion. Brain 2001; 124: 2014-27. 12. Turner MR, Cagnin A, Turkheimer FE, Miller CC, Shaw CE, Brooks DJ et al. Evidence of widespread cerebral microglial activation in amyotrophic lateral sclerosis: an [11C](R)-PK11195 positron emission tomography study. Neurobiol Dis 2004; 15: 601-9. 120

debruyne j.

13. Gerhard A, Watts J, Trender-Gerhard I, Turkheimer F, Banati RB, Bhatia K et al. In vivo imaging of microglial activation with [(11)C](R)-PK11195 PET in corticobasal degeneration. Mov Disord 2004; 19: 1221-6. 14. Gerhard A, Banati RB, Goerres GB, Cagnin A, Myers R, Gunn RN et al. [11C](R)-PK11195 PET imaging of microglial activation in multiple system atrophy. Neurology 2003; 61: 686-9. 15. Debruyne JC, Versijpt J, Van Laere KJ, De Vos F, Keppens J, Strijckmans K et al. PET visualization of microglia in multiple sclerosis patients using [C-11]PK11195. Eur J Neurol 2003; 10: 257-64. 16. Brenner T, Brocke S, Szafer F, Sobel RA, Parkinson JF, Perez DH et al. Inhibition of nitric oxide synthase for treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol 1997; 158: 2940-6. 17. Evangelou N, Esiri MM, Smith S, Palace J, Matthews PM. Quantitative pathological evidence for axonal loss in normal appearing white matter in multiple sclerosis. Ann Neurol 2000; 47: 391-5. 18. Liu C, Edwards S, Gong Q, Roberts N, Blumhardt LD. Three dimensional MRI estimates of brain and spinal cord atrophy in multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1999; 66: 323-30. 19. Filippi M, Grossman RI. MRI techniques to monitor MS evolution: the present and the future. Neurology 2002; 58: 1147-53. 20. Simon JH, Jacobs LD, Campion MK, Rudick RA, Cookfair DL, Herndon RM et al. A longitudinal study of brain atrophy in relapsing multiple sclerosis. The Multiple Sclerosis Collaborative Research Group (MSCRG). Neurology 1999; 53: 139-48. 21. Rudick RA, Fisher E, Lee JC, Simon J, Jacobs L. Use of the brain parenchymal fraction to measure whole brain atrophy in relapsing-remitting MS. Multiple Sclerosis Collaborative Research Group. Neurology 1999; 53: 1698-704. 22. Brex PA, Jenkins R, Fox NC, Crum WR, O'Riordan JI, Plant GT et al. Detection of ventricular enlargement in patients at the earliest clinical stage of MS. Neurology 2000; 54: 1689-91. 23. McDonald WI, Compston A, Edan G, Goodkin D, Hartung HP, Lublin FD et al. Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines from the International Panel on the diagnosis of multiple sclerosis. Ann Neurol 2001; 50: 121-7. 24. Camsonne R, Crouzel C, Comar D, Maziere M, Prenant C, Sastre J et al. Synthesis of n-(C-11) methyl, n-(methyl-1 propyl), (chloro-2 phenyl)-1 isoquinoleine carboxamide-3 (PK-11195) – a new ligand for peripheral benzodiazepine receptors. J Labelled Compd Rad 1984; 21: 985-91.

debruyne j.

121

25. Frackowiak RS, Lenzi GL, Jones T, Heather JD. Quantitative measurement of regional cerebral blood flow and oxygen metabolism in man using 15O and positron emission tomography: theory, procedure, and normal values. J Comput Assist Tomogr 1980; 4: 727-36. 26. Debruyne JC, Van Laere KJ, Versijpt J, De Vos F, Keppens J, Strijckmans K et al. Semiquantification of the peripheral-type benzodiazepine ligand [11C]PK11195 in normal human brain and application in multiple sclerosis patients. Acta Neurol Belg 2002; 102: 127-35. 27. Friston KJ, Frith CD, Liddle PF, Frackowiak RS. Comparing functional (PET) images: the assessment of significant change. J Cereb Blood Flow Metab 1991; 11: 690-9. 28. Mikolajczyk K, Szabatin M, Rudnicki P, Grodzki M, Burger C. A JAVA environment for medical image data analysis: initial application for brain PET quantitation. Med Inform (Lond) 1998; 23: 207-14. 29. Doble A, Malgouris C, Daniel M, Daniel N, Imbault F, Basbaum A et al. Labelling of peripheral-type benzodiazepine binding sites in human brain with [3H]PK 11195: anatomical and subcellular distribution. Brain Res Bull 1987; 18: 49-61. 30. Filippi M. Multiple sclerosis: a white matter disease with associated gray matter damage. J Neurol Sci 2001; 185: 3-4. 31. Zivadinov R et al. Normalized versus absolute brain atrophy measures in multiple sclerosis. Mult Scler 2001; 7: 117. 32. Ashburner J, Friston K. Multimodal image coregistration and partitioning--a unified framework. Neuroimage 1997; 6: 209-17. 33. Barnett MH, Prineas JW. Relapsing and remitting multiple sclerosis: pathology of the newly forming lesion. Ann Neurol 2004; 55: 458-68. 34. Filippi M, Tortorella C, Rovaris M, Bozzali M, Possa F, Sormani MP et al. Changes in the normal appearing brain tissue and cognitive impairment in multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2000; 68: 157-61. 35. Fu L, Matthews PM, De Stefano N, Worsley KJ, Narayanan S, Francis GS et al. Imaging axonal damage of normal-appearing white matter in multiple sclerosis. Brain 1998; 121: 103-13. 36. Yin X, Crawford TO, Griffin JW, Tu P, Lee VM, Li C et al. Myelin-associated glycoprotein is a myelin signal that modulates the caliber of myelinated axons. J Neurosci 1998; 18: 1953-62. 37. Li C, Tropak MB, Gerlai R, Clapoff S, Abramow-Newerly W, Trapp B et al. Myelination in the absence of myelin-associated glycoprotein. Nature 1994; 369: 747-50.

122

debruyne j.

38. Blatter DD, Bigler ED, Gale SD, Johnson SC, Anderson CV, Burnett BM et al. Quantitative volumetric analysis of brain MR: normative database spanning 5 decades of life. Am J Neuroradiol 1995; 16: 241-51. 39. Whitwell JL, Crum WR, Watt HC, Fox NC. Normalization of cerebral volumes by use of intracranial volume: implications for longitudinal quantitative MR imaging. Am J Neuroradiol 2001; 22: 1483-9. 40. Stevenson VL, Miller DH. Measures of brain and spinal cord atrophy. In Rudick RA, Goodkin DE eds. Multiple sclerosis therapeutics, London: Martin Dunitz Ltd, 1999: 107-117. 41. Bermel RA, Bakshi R, Tjoa C, Puli SR, Jacobs L. Bicaudate ratio as a magnetic resonance imaging marker of brain atrophy in multiple sclerosis. Arch Neurol 2002; 59: 275-80. 42. Miller DH, Barkhof F, Frank JA, Parker GJ, Thompson AJ. Measurement of atrophy in multiple sclerosis: pathological basis, methodological aspects and clinical relevance. Brain 2002; 125: 1676-95. 43. Ashburner J, Friston Neuroimage 2000; 11: 805-21.

KJ.

Voxel-based

morphometry--the

methods.

44. Chard DT, Griffin CM, Parker GJ, Kapoor R, Thompson AJ, Miller DH. Brain atrophy in clinically early relapsing-remitting multiple sclerosis. Brain 2002; 125: 327-37. 45. Zivadinov R, Sepcic J, Nasuelli D, De Masi R, Bragadin LM, Tommasi MA et al. A longitudinal study of brain atrophy and cognitive disturbances in the early phase of relapsing-remitting multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2001; 70: 773-80. 46. Arnold DL, Matthews PM. MRI in the diagnosis and management of multiple sclerosis. Neurology 2002; 58: S23-S31. 47. Bakshi R, Benedict RH, Bermel RA, Jacobs L. Regional brain atrophy is associated with physical disability in multiple sclerosis: semiquantitative magnetic resonance imaging and relationship to clinical findings. J Neuroimaging 2001; 11: 129-36. 48. Berg D, Maurer M, Warmuth-Metz M, Rieckmann P, Becker G. The correlation between ventricular diameter measured by transcranial sonography and clinical disability and cognitive dysfunction in patients with multiple sclerosis. Arch Neurol 2000; 57: 1289-92. 49. Fisher E, Rudick RA, Cutter G, Baier M, Miller D, Weinstock-Guttman B et al. Relationship between brain atrophy and disability: an 8-year follow-up study of multiple sclerosis patients. Mult Scler 2000; 6: 373-7. 50. Kalkers NF, Bergers E, Castelijns JA, van Walderveen MA, Bot JC, Ader HJ et al. Optimizing the association between disability and biological markers in MS. Neurology 2001; 57: 1253-8. debruyne j.

123

51. Luks TL, Goodkin DE, Nelson SJ, Majumdar S, Bacchetti P, Portnoy D et al. A longitudinal study of ventricular volume in early relapsing-remitting multiple sclerosis. Mult Scler 2000; 6: 332-7. 52. Paolillo A, Pozzilli C, Gasperini C, Giugni E, Mainero C, Giuliani S et al. Brain atrophy in relapsing-remitting multiple sclerosis: relationship with 'black holes', disease duration and clinical disability. J Neurol Sci 2000; 174: 85-91. 53. Pelletier J, Suchet L, Witjas T, Habib M, Guttmann CR, Salamon G et al. A longitudinal study of callosal atrophy and interhemispheric dysfunction in relapsingremitting multiple sclerosis. Arch Neurol 2001; 58: 105-11. 54. Rovaris M, Comi G, Rocca MA, Wolinsky JS, Filippi M. Short-term brain volume change in relapsing-remitting multiple sclerosis: effect of glatiramer acetate and implications. Brain 2001; 124: 1803-12. 55. Wilson M, Morgan PS, Lin X, Turner BP, Blumhardt LD. Quantitative diffusion weighted magnetic resonance imaging, cerebral atrophy, and disability in multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 2001; 70: 318-22. 56. Ge Y, Grossman RI, Udupa JK, Babb JS, Nyul LG, Kolson DL. Brain atrophy in relapsing-remitting multiple sclerosis: fractional volumetric analysis of gray matter and white matter. Radiology 2001; 220: 606-10. 57. Schlumpf M, Parmar R, Lichtensteiger W. Prenatal diazepam induced persisting downregulation of peripheral (omega 3) benzodiazepine receptors on rat splenic macrophages. Life Sci 1993; 52: 927-34. 58. Johnson MD, Wang JK, Morgan JI, Spector S. Downregulation of [3H]Ro5-4864 binding sites after exposure to peripheral-type benzodiazepines in vitro. J Pharmacol Exp Ther 1986; 238: 855-9. 59. Trapp BD, Peterson J, Ransohoff RM, Rudick R, Mork S, Bo L. Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis. N Engl J Med 1998; 338: 278-85. 60. Saindane AM, Ge Y, Udupa JK, Babb JS, Mannon LJ, Grossman RI. The effect of gadolinium-enhancing lesions on whole brain atrophy in relapsing-remitting MS. Neurology 2000; 55: 61-5. 61. Narayanan S, Fu L, Pioro E, De Stefano N, Collins DL, Francis GS et al. Imaging of axonal damage in multiple sclerosis: spatial distribution of magnetic resonance imaging lesions. Ann Neurol 1997; 41: 385-91. 62. Davie CA, Barker GJ, Thompson AJ, Tofts PS, McDonald WI, Miller DH. 1H magnetic resonance spectroscopy of chronic cerebral white matter lesions and normal appearing white matter in multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1997; 63: 736-42.

124

debruyne j.

IV. DISCUSSIE In dit hoofdstuk zullen wij discussiëren over de 2 delen van mijn titel die ik in de voorgaande artikelen uitgewerkt heb. Zoals in de “structuur van het proefschrift” beschreven werd vormen zij 2 hypothesen die ik in mijn doelstellingen heb uiteengezet namelijk: cytokinen in bloed en inflammatie bij MS en microglia en inflammatie in MS. Daarna wordt in een 3de deel van de discussie de actuele toestand in de wereldliteratuur rondom deze twee thema’s toegelicht.

1 Cytokinen in bloed en inflammatie bij MS In onze longitudinale studie gingen wij na of in vitro cytokine inductie was toegenomen voor en tijdens de relapsen. Wij bestudeerden IFN-γ en TNF-α, 2 pro-inflammatoire cytokinen. IFN-γ, wordt hoofdzakelijk geproduceerd door lymfocyten van de Th1 subset. Daar IL-2 eveneens afkomstig is van de Th1 subset werd eveneens de IL-2 productie gemeten. TNF-α is een monokine en wordt in de eerste plaats geproduceerd door mononucleaire cellen uit het perifere bloed doch eveneens door de geactiveerde Tlymfocyten. Om uit te maken of geactiveerde monocyten verantwoordelijk zijn voor de TNF-α productie werd de plasma-neopterine spiegel gemeten, neopterine is namelijk een specifieke merker van de IFN-γ gemedieerde monocyten/macrofagen activatie. Die longitudinale bepaling van inflammatoire cytokinen had als bedoeling om een opstoot te voorspellen met als consequente stap om de eigenlijke relaps met bijbehorende weefselschade te voorkomen door via een adequate behandeling te kunnen anticiperen nog voor de klinische uitval manifest wordt en er onherstelbare schade aan de weefsels wordt aangebracht. Andere longitudinale studies werden eerder gepubliceerd en suggereerden dat er een verhoogde in vitro productie van TNF-α en INF-γ aanwezig is rond het tijdstip van een opstoot. Rieckmann toonde reeds eerder de voorspellende waarde aan van het TNFmRNA voor de klinische relapsen. Hij toonde daarenboven bij een beperkt aantal stalen het verband aan tussen TNFmRNA expressie en TNF-α eiwit productie. Nergens toonde hij de voorspellende waarde aan van de TNF-α productie, wat precies het doel was van onze studie [Rieckmann et al. 1995]. Dezelfde auteur wees op een verhoogde concentratie van circulerende adhesiemoleculen van het type ICAM-1 als indicatoren van een relaps [Rieckmann et al. 1994]. In onze studie kwamen bij 12 patiënten 29 relapsen voor: 9 relapsen bij 6 relapsingprogressieve MS patiënten en 20 relapsen bij 6 relapsing-remitting MS patiënten. 7 Relapsen deden zich voor op de dag van de consultatie en de overige 22 relapsen tussen dag 1 en 27 voorafgaand aan het tijdstip van de bloedafname. De witte bloedcellen waren significant gestegen bij de actieve MS patiënten vergeleken met normale personen. Dit verschil was te wijten aan de toename van de neutrofiele polymorfonucleaire cellen. Deze circulerende neutrofielen waren vooral toegenomen in de actieve relapsing-remitting en relapsing-progressieve MS patiënten en zijn waarschijnlijk het gevolg van het chronisch inflammatoir verloop van de aandoening zoals eveneens gezien wordt bij andere chronisch inflammatoire ziekten zoals rheumatoïde arthritis en colitis ulcerosa. Een studie van Ziaber en medewerkers wees op de immunoregulerende eigenschappen van polymorfonucleaire neutrofielen in het verloop van MS. Deze cellen zouden zich in een pregeactiveerde toestand bevinden tijdens relapsen en in het verloop van chronisch progressieve MS met een verhoogde binding van TNF-α en een verhoogde expressie van een aantal adhesiemoleculen [Ziaber et al. 2000]. Er was een trend debruyne j.

125

waarneembaar van een stijgend aantal monocyten bij MS patiënten. Voor de totale lymfocyten en de circulerende T-lymfocyten kon geen verschil worden aangetoond tussen patiënten en gezonde vrijwilligers. De concentraties bleven stabiel zowel tijdens de klinische aanvallen als de remissieperioden en bleken niet gecorreleerd met de gestegen cytokine productie bij relapsen. De in vitro TNF-α productie was bij sommige patiënten gestegen tot boven 2000 pg/ml tijdens de 4 weken voorafgaand aan relapsen vergeleken met het tijdstip 3 maanden voor en na een relaps, dus op afstand van een klinische opstoot. Buiten de periode van de relaps bleven de cytokinespiegels stabiel in de verdere follow-up bij de MS patiënten en de vrijwilligers. De interindividuele variatiecoëfficiënt bij normale personen en MS patiënten was <20%. TNF-α concentraties bleven steeds onder de grens van 1500 pg/ml bij niet actieve MS patiënten en vrijwilligers. De stijging van TNF-α, kort voor een klinische relaps, correleert met de stijging van de absolute aantallen monocyten en de serum neopterinespiegels. Dit doet ons vermoeden dat monocyten een belangrijke rol spelen in de TNF-α productie. Daar hun aantal niet significant gestegen is tijdens de relapsen veronderstellen we dat deze cellen zich bij toegenomen immunologische activiteit in een geactiveerde toestand bevinden in de weken voorafgaand aan de relaps. De toegenomen INF-γ en IL-2 productie bij in vitro inductie tijdens exacerbaties wijst op een T cel activatie in de patiënten. INF-γ en IL-2 worden geproduceerd door de Th1 subset van de CD4+helper T cellen wat illustreert dat MS een hoofdzakelijk Th1 gedomineerde aandoening is. Er was een duidelijke correlatie tussen de verhoogde serum neopterine spiegels in het bloed, de in vitro TNF-α en INF-γ productie en de absolute PBMC telling. Dit suggereert dat INF-γ de monocyten stimuleert waardoor de stijging van TNF-α kan verklaard worden. Het serieel bepalen van in vitro TNF-α productie kan nuttig zijn om opstoten te voorspellen in MS. Deze test is in de routine praktijk evenwel niet toepasbaar gebleken om praktische redenen en wegens de beperkte discriminerende waarde. Waarden boven de 2000 pg/ml werden slechts in 4 van de 29 relapsen genoteerd (15%). Anderzijds wil dit zeggen dat boven de 2000 pg/ml geen vals positieve waarden aanwezig zijn. Tijdens het actieve stadium van de ziekte wordt het immunologisch systeem geprikkeld vanuit het perifeer bloed. Bij een inflammatoir signaal in het CZS migreren leukocyten van het beenmerg via het bloed naar de perifere weefsels. Monocyten en lymfocyten ondergaan een transendotheliale penetratie doorheen de BBB in het centraal zenuwstelsel door middel van communicatie tussen de adhesiemoleculen. De aanwezige cytokinen en chemokinen en de cel-celinteracties van geactiveerde mononucleaire cellen met het hersenparenchym veroorzaken onder meer een onevenwicht tussen proteolytische enzymen en hun inhibitoren. Daardoor wordt de myeline enzymatisch aangetast. De gangbare veronderstelling zegt dat oorspronkelijke perifere monocyten zich omvormen tot geactiveerde microglia. Zij doen dienst als antigeen-presenterende cellen (APC) die autoreactieve T-cellen activeren door het aanbieden van epitoop die gedragen wordt door MHCII. De antigeen-geactiveerde T-cellen produceren cytokinen (bijvoorbeeld interferon-γ = macrofaagactiverende factor en IL-2= T-cel groeifactor) en ook chemokinen ter bevordering van het inflammatoir proces. Chemokinen en MMPs spelen een bijlangrijke rol in de migratie van leukocyten doorheen de bloed-hersen barriere (BBB) [Sellebjerg and Sorensen 2003]. Chemokinen en cellen met hun receptoren worden in een verhoogde hoeveelheden waargenomen in het bloed, CZS en CSV van MS-patiënten (vergeleken met neurologische controles zoals hoofdpijn, trauma) en zouden kunnen dienen als merker van ziekteactiviteit. 126

debruyne j.

De mononucleaire cellen worden voornamelijk aangetrokken door monocyt chemotactische proteïnen (MCPs), een subfamilie van de CC-chemokinen (chemokinen met 2 opeenvolgende cysteïne lokalisaties in hun aminozuur sekwentie). Deze chemokinen stimuleren de inflammatoire cascade door steeds meer cellen te rekruteren in de inflammatiehaard; er grijpt een chemotaxis plaats van leukocyten naar het epicentrum van de inflammatoire zone door een chemokineconcentratie gradiënt. De CC-chemokinen vervullen niet alleen de rol van chemotaxis, maar kunnen eveneens, na binding met hun receptor (CCR) leukocyten (monocyten en lymfocyten) activeren om enzymen te secreteren zoals MMPs (MMP-9; gelatinase B), cytokinen, chemokinen [Opdenakker et al. 2003]. Het immunologisch antwoord wordt daarenboven gemoduleerd door de anti-inflammatoire eigenschappen van TGF-β en IL-10 op de monocyten, waarbij MMP-9 als merker van inflammatie gebruikt werd. Deze bevindingen vallen samen met andere resultaten waarbij interferon-gamma (= macrofaag/monocyte activerende factor) de functionele tegenhanger is van IL-10. Combinaties van cytokinen in inflammatoire gebieden geven signalen naar monocyten (bijvoorbeeld monocyt-specifieke chemokinen uit talrijke weefselcellen en interferon-gamma van geactiveerde lymfocyten) voor het al dan niet vrijstellen van deze MMPs. Tumor necrosis factor(TNF)-α en transforming growth factor (TGF)-β oefenen een gecombineerd effect uit op de MMP-9 synthese door de monocyten. TNF-alfa en interleukine-1beta stimuleren de productie van MMP-9, terwijl TGF-β de TNF-α geïnduceerde MMP-9 secretie door de monocyten onderdrukt. Deze onderdrukking heeft een dosis gebonden effect, ze gebeurt op pre-translationeel niveau daar TNF-α geïnduceerde MMP-9 mRNA onderdrukt wordt door TGF-β [Vaday et al. 2001]. De suppressie van TNF-α geïnduceerde MMP-9 secretie door TGF-β correleert met een daling van de prostaglandine E2 (PGE2) secretie. De blokkage van TNF-α gestimuleerde MMP-9 productie kan tegengegaan worden door toevoeging van PGE2 of cAMP. Met andere woorden TGF-β is een potente suppressor van TNF-α geïnduceerde MMP-9 synthesis door monocyten via PGE2-en cAMP-afhankelijke mechanismen. Ook IL-10 kan de productie van MMPs door monocyten beïnvloeden. De productie van MMPs door monocyten gebeurt onder meer via een PGE2 –cAMP afhankelijk mechanisme. Na pre-incubatie van monocyten met IL-10 voor in vitro stimulatie met ConA, is IL-10 in staat prostaglandine H synthase-2 (PGHS-2), de induceerbare vorm van prostaglandine synthase, te inhiberen. De inhibitie van PGE2 productie door IL-10 resulteert in de suppressie van MMP-9 (gelatinase B). Bovendien, door exogeen toedienen van PGE2 of dibutyryl cAMP kan de productie van MMPs in IL-10 behandelde monocyten hersteld worden [Mertz et al. 1994]. De vrijstelling van verschillende cytokinen voor het regelen van de talrijke activiteiten van leukocyten, waaronder celdeling, productie van chemokinen, cytotoxische producten en secretie van matrix metalloproteïnasen (MMPs) resulteert uiteindelijk in myeline, axonale en oligodendrogliale aantasting en soms in een klinische aanval. We zien een activatie van de Th1 subset cellen aan de hand van een verhoogde in vitro productie van proinflammatoire cytokinen zoals INF-γ. INF-γ stimuleert de monocyten met hogere in vitro TNF-α productie en een stijging van de neopterine spiegel in vivo. TNF-α proteïne concentratie stijgt 4 weken voor een relaps. Een aanval vroegtijdig voorspellen en snel behandelen om aldus de hersenschade minimaal te houden blijkt evenwel in de praktijk niet toepasbaar wegens de geringe relevantie van de resultaten.

debruyne j.

127

2 Microglia en inflammatie in MS Onze studie had tot doel het in vivo meten van de ziekteactiviteit van geactiveerde microglia cellen door middel van [11C]PK11195 PET tijdens het natuurlijk verloop van het inflammatoir proces bij MS. Teneinde pathologische ligandopname te kunnen opsporen dienden we vooreerst referentiewaarden om de tracer te bepalen in de witte en de grijze stof bij normale proefpersonen. Daarvoor hebben we een semi-kwantitatieve methode aangewend. Deze analyse heeft evenwel een aantal belangrijke beperkingen. Zoals bij elke semi-kwantitatieve benadering is de keuze van het normalisatiegebied belangrijk voor de gevoeligheid van het meten van significante veranderingen in opnames. Bij MS is er geen referentieregio. De regio waarop genormaliseerd wordt bij gezonde vrijwilligers is histologisch niet identiek met de regio van de patiënt. Bij de MS patiënt kan namelijk een hogere inflammatiegraad worden verwacht zowel in de witte als de grijze stof. De verhouding tussen specifieke en aspecifieke binding van de ligand zal eveneens niet dezelfde zijn bij normale personen als bij MS patiënten. Globale normalisatie zal dus een gestegen [11C]PK11195 activiteit voor een deel maskeren. Dezelfde normalisatie problemen werden beschreven bij niet absolute kwantificatie metingen bij metabolisme evaluatie in PET en perfusie studies in SPECT [Van Laere et al. 2001a]. Deze semi-kwantitatieve analyse kan evenwel worden toegepast in acute en chronische neuro-inflammaties wanneer er een voldoende hoog signaal van microgliale activiteit kan worden aangetoond boven de metingen van het normale achtergrondgeruis. Zeven proefpersonen ondergingen een MR en PET-scan op dezelfde dag en bij 5 van hen werd een tweede PET-scan binnen de week uitgevoerd voor het bepalen van intrasubject reproduceerbaarheid. Bij 3 vrijwilligers werd een dynamische PET-scan van 60 minuten [11C]PK11195 opname uitgevoerd. Er werd een tijds - activiteitscurve van genormaliseerde PK opname waarden in de 3 hersengebieden (witte stof, corticale grijze stof en subcorticale grijze stof) bepaald. Deze curve vertoont een pseudo - equilibrium rond de 40ste minuut na injectie waarin de ratio specifieke versus aspecifieke binding een plateaufase bereikt. De opnamewaarden tussen de 40ste en de 60ste minuut worden gesommeerd en gemeten. De genormaliseerde activiteit in de witte stof en de grijze stof op de statische scans van de 7 vrijwilligers toont een gemiddelde waarde van 1.010 +/- 0.035 in de witte stof en 1.041 +/0.006 in de grijze stof. Dat betekent geen significant verschil tussen de beide compartimenten. De variabiliteit van de genormaliseerde activiteit in de witte en grijze stof bij de 7 vrijwilligers bedroeg gemiddeld 12.5%. De reproduceerbaarheid van de meting binnen 1 persoon toont een variatiecoëfficiënt van 14.8% voor de witte stof en 14% voor de grijze stof. Er is geen verschil tussen de neo-corticale en subcorticale grijze stof activiteit. De zwakke reproduceerbaarheid is het gevolg van een belangrijke technische beperking in de [11C]PK11195 analyse. Het komt door het eerder zwakke signaal van de tracer ten opzichte van de metingen van het achtergrondsgeruis. In dit opzicht biedt 3D-PET en [11C]PK11195 een grotere gevoeligheid en betere beeldkwaliteit om een toename van de geactiveerde microglia en bijgevolg meer subtiele pathologie aan te tonen [Myers et al. 1998]. Absolute kwantificatie meting van [11C]PK11195 is een meer algemeen aanvaarde analysemethode doch niet gevalideerd in diffuse hersenpathologie. In de Londen - groep van het Hammersmith hospitaal worden de ligand metingen uitgevoerd volgens het 128

debruyne j.

simplified reference tissue model met clusteranalyse [Lammertsma and Hume 1996] Het voordeel van deze methode is dat een meer gedetailleerde kwantificatie van de ligand bekomen wordt wegens de continue analyse gedurende de volledige post-injectie periode. De clusteranalyse werd toegepast in twee gevallen van Rasmussen’s en Herpes encefalitis [Cagnin et al. 2001], in een geval van cerebrale vasculitis in refractaire epilepsie [Goerres et al. 2001] en recentelijk in 10 gevallen met amyotrofe laterale sclerosis [Turner et al. 2004]. In deze gevallen is er immers voldoende referentie regio aanwezig voor kinetische modellering. Bij ernstige vormen van MS evenwel, kan de clusteranalyse moeilijk worden toegepast wegens de onvoldoende aanwezigheid van normaal referentie weefsel dat kan dienen als normale input voor receptor kinetiek [Banati et al. 2000]. De toepasbaarheid van de semi-kwantitatieve methode werd getest door het vergelijken van de opname van [11C]PK11195 bij 3 MS patiënten met chronische en actieve witte stofletsels op de MRI. Bij 2 MS patiënten met actieve witte stof inflammatie werd een significant pathologische opname van [11C]PK11195 aangetoond van respectievelijk 1.36 en 1.14. Bij de patiënt met een chronisch letsel bedroeg de genormaliseerde [11C]PK11195 opname 1.02 en was de waarde niet significant gestegen. Deze semi-kwantitatieve methode voor de meting van [11C]PK11195 werd toegepast in een studie van 22 patiënten met MS. In verschillende MS subgroepen met chronische en actieve witte stofletsels op de MR werd de [11C]PK11195 ligand opname gemeten om zo meer inzicht te verwerven in het immunopathologisch proces van het ziekteverloop bij patiënten met verschillende klinische manifestaties en invaliditeit. Dertien patiënten vertoonden een relapsing remitting vorm, 7 patiënten een secundair progressieve vorm en 2 patiënten een primair progressief verloop van de ziekte. Zes patiënten hadden een klinische aanval rond de periode van de PET-scan opname en 10 patiënten vertoonden gadolinium-capterende letsels op de MR waarvan bij 5 patiënten eveneens een klinische aanval voorkwam. Eén patiënt werd 2 maal gescand binnen een interval van 4 maanden, de eerste scan tijdens een klinische aanval met gadolinium letsels en in een tweede tijd in een fase van remissie. De ziekteduur in de ganse groep verliep over een periode van 3 maand tot 32.7 jaar met een gemiddelde van 9.3 ± 8.3 jaar. De gemiddelde invaliditeit op de EDSS bedroeg 4.0 (volledig ambulant met de mogelijkheid om 500 meter zelfstandig te stappen) met een minimum van 2.0 en een maximum van 7.0. Bij de patiënten werden VOI’s aangebracht in de witte stof, de normaal ogende witte stof (NAWM) en de grijze stof. De relatieve [11C]PK11195 opname in de VOI’s werden genormaliseerd met de cortex als referentie. Zoals bij de normale personen was de opname waarde van [11C]PK11195 in de NAWM en de grijze stof bij de patiënten niet significant verschillend. De opnamewaarde was wat hoger dan bij de normale personen, doch statistisch niet significant verschillend. De T2 letsels toonden een lagere opname vergeleken met de witte stof in de controles. In de gadolinium letsels evenwel was er een duidelijke hogere opname van [11C]PK11195. Deze verhoogde focale opname ter hoogte van T1 gadolinium capterende letsels op de MR, werd eveneens door Vowinckel aangetoond [Vowinckel et al. 1997]. Dit stemt overeen met de histologische samenstelling van deze letsels. Ze worden namelijk gevormd door inflammatoire cellen zoals macrofagen en T-cellen. De opname van de tracer in de T2 gewogen letsels is globaal laag. T2 gewogen beelden op de MR zijn namelijk histologisch heterogeen. Zij zijn verantwoordelijk voor de gekende klinisch-radiologische paradox [De Groot et al. 2001]. Deze klinisch-radiologische paradox wordt veroorzaakt door de aspecificiteit van de T2 letsels op de conventionele MR en door een onvoldoende inschatting van de klinische betekenis van de normaal ogende witte stof (NAWM) in de debruyne j.

129

hersenen en het ruggenmerg. De MR heeft weliswaar een grote diagnostische waarde, is een belangrijk onderzoek in het monitoren van klinische trials en van het natuurlijk verloop van MS. Nochtans is er een zwakke correlatie tussen de MR parameters en de invaliditeit, gemeten door EDSS. De opname van [11C]PK11195 in de T2 gewogen beelden in onze studie was laag en wellicht te wijten aan een downregulatie van de PBR bij nietimmunologisch geprikkelde microglia. Deze afwezigheid van triggering wordt veroorzaakt door het verdwijnen van steeds meer myelinevezels die in oudere letsels worden vervangen door axonaal weefsel. Wanneer zich dan een transiënte reactivatie van het auto-immuun proces voordoet zoals tijdens een relaps of bij het zien van gadolinium-capterende letsels op MR, zien we een verhoogde expressie van de PBR. In onze studie zien we inderdaad globaal een hogere opname in de T2 letsels in een actief stadium, gekenmerkt door een klinische aanval en/of een gadolinium-aankleurend letsel op de MR. Bij de patiënt waar 2x een scanning werd uitgevoerd zien wij een hoge [11C]PK11195 opname in het T2 letsel tijdens het actief stadium en een duidelijke daling 4 maanden na de aanval. De [11C]PK11195 opname was des te hoger wanneer het actief stadium werd gekenmerkt door een gadoliniumletsel mèt klinische relaps, dan wel wanneer enkel een gadoliniumletsel voorkwam. De verhoogde activiteit in een actief stadium is evenwel een globaal fenomeen zoals duidelijk kon worden geïllustreerd bij een andere patiënt die een significante toename van [11C]PK11195 vertoonde in een chronisch letsel in de contralaterale hemisfeer van het primaire gadolinium-capterend letsel. Deze observatie van geactiveerde microgliale activiteit op afstand van de inflammatiehaard werd reeds eerder door Banati bij in vitro en in vivo studies aangetoond [Banati et al. 2000]. Het natuurlijk proces bij MS waarbij klinische en MR relapsen afgewisseld worden door perioden van relatieve rust is een zogenaamd "waxing en waning" fenomeen gekenmerkt door wisselende PBR expressie van de microglia in de T2 gewogen letsels met afnemende waarden naargelang de voortschrijdende ziekteduur en de leeftijd van de T2 letsels. In onze studie konden wij eveneens aantonen dat bij de 2 patiënten met de primair progressieve vorm van MS, een substantiel hogere opname van [11C]PK11195 gevonden werd in de thalamus en de NAWM. Deze bevindingen waren kenmerkend voor de progressieve vorm en werden niet teruggevonden bij de relapsing remitting MS patiënten. Microglia vormen een verspreide populatie van cellen in alle hersengebieden, iets meer nadrukkelijk aanwezig in de grijze stof en voornamelijk in de sensibele, limbische en subcorticale grijze structuren. Een verhoogde thalamische [11C]PK11195 opname bij primair progressieve MS patiënten werd reeds beschreven door Banati, als een geprojecteerd neuroinflammatoir antwoord door de aantasting van de lange sensibele banen zoals men bijvoorbeeld ziet bij een myelopathisch syndroom in MS. Naar analogie werd een verhoogde opname aangetoond in het corpus geniculatum lateralis bij een neuritis optica en ter hoogte van de hersenstam bij een internucleaire ophtalmoplegie, door een aantasting van de fasciculus longitudinalis medialis [Banati et al. 2000]. Er was eveneens een trend van hogere opname van [11C]PK11195 in de NAWM vergeleken met de witte stof bij controles. Er was evenwel geen significante correlatie in de NAWM tussen een verhoogde [11C]PK11195 opname en het voorkomen van een relaps tijdens een actief stadium. De resultaten van een autoradiografische studie van Banati in EAE en in humaan postmortem materiaal bevestigen de aanwezigheid van regio’s van verhoogde concentratie van niet-fagocytaire geramificeerde maar geactiveerde microglia, ze bevinden zich in het verloop van neurogene tractie in de NAWM [Banati et al. 1997] Tenslotte werd er een positieve relatie gevonden tussen verhoogde traceropname en de ziekteduur in de NAWM en in de grijze stof bij de subgroep van zwaar geïnvalideerde patiënten met een EDSS boven de 4.0. De verhoogde opname van [11C]PK11195 in de NAWM tijdens de ziekteprogressie refereert naar de hypothese dat het demyeliniserend proces bij MS 130

debruyne j.

geïnitieërd wordt door microglia vanaf het begin van de ziekte. Dit proces is onafhankelijk van de gebeurtenissen rondom de BBB zoals men ziet bij klinische en MR opflakkeringen. Het pathofysiologisch mechanisme van de focale inflammatie is waarschijnlijk verschillend van dit van de progressieve demyelinisatie, onder meer door de prominente rol van de autoimmune T-cel. De NAWM microglia zijn bijgevolg belangrijke actoren bij de progressie van het ziekteproces met continue macroscopisch onzichtbare demyelinisaties onafhankelijk van de relapsen. Dit komt overeen met de stelling van Confavreux dat relapsen de progressie van irreversibele invaliditeit niet significant beïnvloeden [Confavreux.et al. 2000]. We kunnen dus besluiten dat de [11C]PK11195 PET een nuttig pathofysiologisch onderzoek is voor het in vivo evalueren van het immunopathologisch proces van MS en dat de microgliacellen bij dit proces een belangrijke rol spelen. Bij contrastcapterende MR letsels is de [11C]PK11195 opname significant verhoogd, doch bij de meer chronische T2 gewogen MR letsels is de microgliale activiteit integendeel verminderd door het gradueel verdwijnen van myelinevezels. Ze worden vervangen door axonale afbraakproducten die kenmerkend zijn voor het chronisch degeneratief stadium van de ziekte. Er is een tijdelijke reactivatie van de microglia in deze chronische letsels tijdens een klinische en/of MR relaps. Het betreft evenwel een globaal fenomeen gekenmerkt door een opregulatie van perifere benzodiazepine receptoren (PBR) in oude letsels op afstand van de actieve focus. Het immuunproces is bijgevolg een wisselend dynamisch gebeuren van activatie en inactivatie van microglia tijdens het natuurlijk verloop van de ziekte. De NAWM microglia spelen een rol in het ziekteproces door hun immunologisch getriggerd vermogen van continue demyelinisatie, onafhankelijk van episoden van actieve inflammatie en andere BBB fenomenen. Microglia vervullen een belangrijke rol in het proces van de neuroinflammatie. Daar microgliale activatie toeneemt in de NAWM tijdens het progressief verloop van MS, werd nagegaan of er een correlatie bestaat tussen de gestage voortschrijdende neuroinflammatie en hersenatrofie en klinische parameters zoals ziekteduur en invaliditeit. Voor het meten van hersenatrofie gebruikten wij de segmentatie en volumetriemeting op T1 gewogen beelden, genormaliseerd op de standaard-T1-template (Montreal Neurological Institute). De bekomen beelden werden gesegmenteerd in grijze-, witte stof en hersenventrikelmappen zonder letselextractie. Een hersenatrofie-index werd gedefinieerd als het relatieve volume van de ventrikels gedeeld door het volume van de witte en grijze stof. Als resultaat werd atrofie weerhouden in alle segmenten van de hersenen bij MS patiënten vergeleken met normale vrijwilligers. Deze waarden waren niet significant in de grijze en witte stof compartimenten doch wel in het ventrikelcompartiment. Er werd eveneens een correlatie gevonden tussen de atrofie-index, de ziekteduur en de invaliditeit gemeten met de EDSS. Eerdere studies met verschillende atrofiemetingen konden deze correlatie niet éénduidig aantonen. Bij de meeste was deze correlatie aanwezig. Een segmentaire analyse studie door Ge et al. van de Universiteit van Pennsylvania kon geen verband leggen tussen de volumemetingen van de grijze en witte stof fracties en de invaliditeit bij relapsingremitting MS-patiënten [Ge et al. 2001]. Als we de atrofie vergelijken met de [11C]PK11195 opname in de T2 gewogen letsels en in de NAWM zien wij dat bij toenemende atrofie er een significante afname van de [11C]PK11195 opname in T2 letsels wordt waargenomen. Tevens werd gevonden dat de geactiveerde microglia concentratie in de NAWM statistisch significant gecorreleerd is met de atrofie-index. Er is een zwakke doch significante correlatie tussen de gestage stijging van de [11C]PK11195 opname in de debruyne j.

131

NAWM tijdens de ziekteprogressie en de afname van het hersenparenchym. Een probleem is dat onze studie geen longitudinale follow-up is maar eerder een cross-sectionele studie van patiënten met een verschillende ziekteduur. Daar zij een heterogene groep vertegenwoordigen kunnen wij enkel formele conclusies van de ziekteprogressie maken door extrapolatie. Er kon geen correlatie aangetoond worden tussen de opname in de gadolinium capterende letsels en hersenatrofie. Dit komt overeen met de longitudinale studie van 2 jaar van Saindane van de Universiteit in Pennsylvania waar eveneens geen relatie kon aangetoond worden tussen gadolinium letsels en ontwikkeling van hersenatrofie [Saindane et al. 2000]. Daaruit zou kunnen besloten worden dat de BBB doorbraak eerder als een epifenomeen in het proces van hersenatrofie dient beschouwd te worden, enkel aanleiding gevend tot lokale inflammatie en reversibel oedeem met een graad van focale axonale schade. Studies met magnetisatie transfert en magnetische resonantie spectroscopie toonden aan dat de hersenatrofie in MS eerder het resultaat was van een globaal proces. De rol van geactiveerde microglia in een algemeen demyeliniserend proces speelt zich voornamelijk af in de NAWM met een lange termijnsrelatie tussen neuroinflammatie en hersenatrofie. De mechanismen zijn waarschijnlijk anders dan deze verantwoordelijk voor focale letsels en liggen aan de basis van het geleidelijk progressief verloop van de demyeliniserende aandoening. Onze studie toont een discrete relatie tussen de NAWM inflammatie, met als parameter de microgliale activatie, en hersenatrofie. Demyelinisatie, geïnduceerd door autoimmuun lijden in de NAWM, vormt een belangrijke factor bij progressieve neurologische uitval. Reeds eerder werd in een studie door Yin en medewerkers van het Lerner Research Institute in Cleveland bij MAG deficiënte muizen, een relatie aangetoond tussen demyelinisatie en atrofie. Demyelinisatie leidt tot axonale degeneratie door de afwezigheid van neurotrofe factoren die in het MAG aanwezig zijn en die belangrijk zijn voor het beschermen van de periaxonale ruimte [Yin et al. 1998]. Neuroinflammatie leidend tot atrofie is waarschijnlijk gemedieerd door een continu proces van onzichtbare demyelinisatie mede veroorzaakt door geactiveerde microglia. Uit deze studie kunnen wij besluiten dat microglia potentiële immune effector celllen zijn in het centrale zenuwstelsel met een intrinsieke capaciteit om immunologisch geïnduceerde inflammaties te controleren. [11C]PK11195 PET is een gevoelige techniek om microgliale antwoorden in gebieden van actieve pathologie te detecteren. [11C]PK11195 PET is eveneens een merker van progressie van pathologische hersenactiviteit. Een andere belangrijke observatie is dat gestegen [11C]PK11195 PET signalen kunnen worden waargenomen verwijderd van het letsel, in gebieden die structureel normaal lijken. Dit wijst op de aanwezigheid van geactiveerde microglia meestal gelegen langs axonale projectiegebieden. Bij een secondair progressieve MS patiënt met myelopathie worden microstructurele wijzigingen waargenomen in de thalamus. Voor hoeverre is microgliale activatie enkel een merker van ziekteprogressie, maar eveneens verantwoordelijk voor neuronale schade. Hersenfunctie in gezonde en pathologische condities lijkt een wisselwerking te zijn tussen gliale en neuronale activiteit. In ideale omstandigheden met moderne logistieke uitrusting is [11C]PK11195 PET een gevoelig onderzoek voor monitoring van microgliale activiteit. Zelfs indien een 3D scan, moderne software en cyclotron, MR scan en een goede teamwerking aanwezig zijn blijft de procedure ingewikkeld en omslachtig. De organisatie, zoals de timing van de verschillende onderzoeken, het op het juiste moment bijeenbrengen van patiënten en onderzoeksteam vormen een grote uitdaging, voornamelijk bij studies met grotere groepen. 132

debruyne j.

Indien aan deze condities kan voldaan worden, zijn een aantal projecten mogelijk. Terwijl tot op heden vooral casuïstiek werd gepubliceerd is er nood aan grote longitudinale studies met homogene groepen zoals relapsing-remittting, secondair en primair progressieve en monosymptomatische MS patiënten. Dergelijke studies werden tot op heden niet uitgevoerd. Zij kunnen belangrijke informatie verschaffen omtrent het fysiopathologisch gebeuren tijdens het natuurlijke verloop van deze specifieke ziektevormen. Daarnaast zijn er de klinische studies voor het meten van de therapie-respons in de verschillende homogene groepen. Bijkomend is er de vergelijking van het effect van de 4 erkende immunologische therapieën op de microgliale activiteit. Tenslotte zou dit onderzoek eveneens kunnen gebruikt worden voor het monitoren van individuele patiënten.

3 Nieuwe inzichten en toekomstperspectieven omtrent immunologische parameters in MS en beeldvorming met [11C]-(R)-PK11195 PET scan Recente inzichten in biologische markers van inflammatie in MS Een perfecte biologische merker voor ziekteactiviteit moet gemakkelijk toegankelijk, reproduceerbaar, gevoelig en ziektespecifiek zijn. Totnogtoe is er geen enkele biomerker die dergelijke eigenschappen heeft in MS. Markers in het perifeer bloed zijn zeer aantrekkelijk, maar gelimiteerd door de onduidelijke correlatie tussen het perifeer compartiment en het CZS. Daarentegen zou het CSV een optimaal medium kunnen zijn om relevante biologische markers te detecteren daar dit lichaamsvocht sterk geassocieerd is met het ziekteproces ware er niet het probleem van de moeilijke toegankelijkheid voor het herhaald collecteren van dit biologische vocht. Rekening houdend met deze limieten worden recent markers voorgesteld van de inflammatie-en de degeneratieve fase. De voornaamste markers betreffen cytokinen, adhesiemoleculen, chemokinen, matrix metalloproteasen (MMPs) en anti-myeline antilichamen. Daar MS beschouwd wordt als een T-cel-gemedieerde auto-immune aandoening, vertonen Th1 cytokinen zoals TNF-α, IL-1β, IFN-γ, IL-2, IL-6 en p40 subeenheid van IL-12een verhoogde expressie in actieve MS patiënten. Th2 cytokinen zoals IL-10, TGF-β en IL-4 zijn gedaald in fasen van ziekteactiviteit en gestegen in fasen van ziekte remissie. Adhesiemoleculen spelen een rol bij leukocyten migratie in het CZS. Verhoogde concentraties van s-ICAM-1 (soluble intercellular adhesion molecule-1, PECAM-1 (soluble platelet endothial cell adhesion molecule-1), VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule-1), ICAM-1 en E-selectine worden waargenomen in patiënten met klinische opstoten en gadolinium letsels op de MR. Niettegenstaande deze bevindingen is er geen algemene consensus over de rol van de circulerende adhesiemoleculen als markers van ziekteactiviteit [Archelos et al. 1999]. Chemokinen zijn betrokken in het rekruteren van immunologische cellen op plaatsen van inflammatie. In MS en EAE is er een verhoogde expressie van inflammatoire chemokinen en receptoren door monocyten en neurale weefselcellen in letsels in het centrale zenuwstelsel. Ze worden in verhoogde concentratie teruggevonden in het CSV van MS patiënten maar kunnen evenwel onvoldoende gereproduceerd worden als ziekte markers in het perifeer bloedcompartiment [Trebst and Ransohoff 2001].

debruyne j.

133

Matrix metalloproteasen hebben de eigenschap om extracellulaire proteïnen te degraderen waardoor zij een controlefunctie hebben bij celmigratie doorheen de BBB door de aantasting van het subendotheliaal basaal membraan. Een verhoogde expressie van verscheidene MMPs en voornamelijk MMP-9 (gelatinase B) werd aangetoond in acute MS letsels en in CSV in associatie met BBB doorbraak en in het serum bij klinisch- of MRactieve MS patiënten. Specifieke MMP activiteit zou zelfs gelieerd zijn aan verschillende subtypes van de ziekte zoals MMP-2 bij chronisch progressieve MS en MMP-9 in actieve MS patiënten [Galboiz et al. 2001]. Meer recent werd gesuggereerd dat de aanwezigheid van auto-antilichamen tegen MOG (myeline oligodendrocyt glycoproteïne) en MBP (myeline basisch proteïne) in het serum van monosymptomatische patiënten een hoge voorspellingswaarde hebben voor het ontstaan van definitieve MS [Berger et al. 2003]. Dit betekent dat dit de eerste ziektespecifieke merker zou zijn met een duidelijke prognostische waarde. De prognostische rol van antilichamen werd eveneens aangetoond door de observatie dat intrathecale synthese van IgM in het begin van de ziekte correleert met een snel verloop [Villar et al. 2003]. Een verhoogd immuun respons werd waargenomen voor Herpes-6 en EBV (Epstein Barr virus) in de vroege fase van de ziekte [Villoslada et al. 2003]. Testing voor anti-Herpes-6 IgM antilichamen bij MS zou kunnen bijdragen in het voorspellen van een volgende relaps. NO zou een goede merker kunnen zijn voor inflammatie wegens zijn excitotoxische eigenschappen. Sommige rapporten vermelden dat NO oxidatieproducten gestegen zijn in de liquor van MS patiënten en zelfs gecorreleerd zijn met ziekteactiviteit [Danilov et al. 2003]. Door het feit dat axonaal verlies een vroegtijdig fenomeen is in MS, worden intrathecale axonale proteïnen zoals neurofilamenten (Nf) beschouwd als een belangrijke merker van axonaal verlies. Er werd aangetoond dat significant verhoogde concentraties van Nf aanwezig zijn bij patiënten met RR-MS [Lycke et al. 1998] en verhoogde intrathecale antilichamen tegen Nf bij patiënten met secondair progressieve en primair progressieve MS [Silber et al. 2002]. Dit zou kunnen wijzen op een correlatie met hersenatrofie bij een snel progressief verloop van de ziekte. In een recente studie in The Lancet werd een prognostische merker voor de behandeling van MS met INF-β beschreven. Het gaat om het eiwit, TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL). Het is een product van de perifere bloed monocyten dat in expressie wordt gebracht door INF-β. TRAIL is verantwoordelijk voor de inductie van apoptosis maar vertoont eveneens anti-inflammatoire eigenschappen tegenover de T-cel. Er werd aangetoond dat bij INF-β -responders een opregulatie van dit eiwit aanwezig was in tegenstelling met non-responders. Bij het verschijnen van neutraliserende antilichamen verdwijnt deze TRAIL expressie. Er zou kunnen besloten worden dat een hoge TRAIL concentratie in het serum een prognostisch gunstig teken is voor een efficiënte INF-β behandeling [Wandinger et al. 2003]. De wetenschappelijke kennis van potentiële biologische markers in MS weerspiegelt zich niet in praktische toepassing zoals bijvoorbeeld in klinische studies. Ziekte-specifieke gebeurtenissen in het perifere bloedcompartiment zijn gelimiteerd door complexe dynamische acties tussen moleculen en cellen die zich in dit medium afspelen. Nieuwe technische mogelijkheden zoals DNA-microarrays, (realtime) polymerase chain reacties 134

debruyne j.

(PCR) of meerkleuren flowcytometrie en toenemende kennis van de pathogenesis van MS bieden hoopvolle vooruitzichten voor betrouwbare en specifieke biomarkers. Recente inzichten en studies met [11C]-(R)-PK11195 PET scan. Microgliale cellen vormen een structureel en functioneel netwerk met complexe celcommunicaties onderling of met neuronen. Zij hebben een regulerende invloed op synaptische transmissie in normale en pathologische condities. Deze microglia, zijn uitdrukkelijk aanwezig als potentiële immuno-effectorcellen in vele hersenziekten. Zij reageren snel op subtiele, acute en chronische pathologische stimuli. De detectie van microgliale activatie verschaft ons diagnostische parameters van ziekten, accurate lokalisatie en informatie over de ziekteprogressie en secondaire neurodegeneratieve veranderingen verwijderd van de primaire ziektehaard. Zij zijn indicatoren van ziekte geïnduceerde hersenplasticiteit. Door middel van PET en de ligand [11C]-(R)-PK11195 selectief voor geactiveerde microglia worden systematische pogingen ondernomen om in vivo neuropathologische beeldvorming te ontwikkelen. Het gebruik van microgliale antwoorden als markers van ziekte lokalisatie, progressie, chroniciteit en herstel heeft zijn biologische basis in de hechte koppeling tussen neuronale activiteit en de functionele staat van de microglia. Afhankelijk van de hersenschade ondergaan de microglia een lokale activatie met daarenboven een distributiepatroon langsheen de neurale tracti in de hersenen. Deze retro- en anterograde microgliale activatie langsheen de meer afgelegen projectiezones van het lokale hersenletsel bewijst het migratievermogen van deze weefselcel zoals wij zien bij chronische vormen van MS en neurodegeneratieve ziekten zoals amyotrofe lateraal sclerose (ALS) [Turner et al. 2004], multi-systeem atrofie (MSA) [Gerhard et al. 2003] en Alzheimer dementie (AD) [Cagnin et al. 2001]. De iso-quinoline PK 11195 bindt zich op de perifere benzodiazepine receptoren via het membraan van de mitochondria. In vitro bindt PK11195 zich eveneens op astrocyten doch bij in vivo studies en in condities zonder BBB schade is de distributie van de ligand het dichtst bij de geactiveerde microglia dan wel bij de reactieve astrocyten [Banati 2002]. Dit werd bevestigd door microautoradiografische data en door de hogere affiniteit voor de PK11195 van de R-enantiomeer in vergelijking met de algemeen gebruikte racemaat-vorm. De perifere benzodiazepine receptoren (PBR) spelen een belangrijke biologische rol in de synthese van neurosteroïden en in de regulatie van immunologische processen in de mononucleaire fagocyten [Gavish et al. 1999]. De voornaamste toepassing evenwel is hun gebruik als [11C]-(R)-PK11195, een inflammatoire merker in actieve hersenpathologie zoals: CVA [Gerhard et al. 2000], MS [Banati et al. 2000], Herpes encephalitis [Cagnin et al. 2001], vasculitis [Goerres et al. 2001], AD [Cagnin et al. 2001], ALS [Turner et al. 2004] en MSA [Gerhard et al. 2003]. Een andere bevinding bleken de toegenomen [11C]-(R)-PK11195 PET signalen afgelegen van het primaire letsel in gebieden die structureel normaal leken. Bijvoorbeeld bij CVA patiënten zien wij in de ipsilaterale thalamus de aanwezigheid van actieve microglia in de projectie gebieden van het primaire letsel in de cortex [Pappata et al. 2000]. Recente studies in Alzheimer patiënten tonen een correlatie tussen regionale [11C]-(R)PK11195 opname stijging ter hoogte van de temporale kwab geassocieerd met hersenatrofie op de gecoregistreerde MR. Dit toont aan dat microgliale activatie niet enkel een merker van ziekteprogressie is maar tevens een effector van neuronale schade [Cagnin et al. 2001] debruyne j.

135

Tenslotte vermelden wij nog 2 onlangs verschenen [11C]-(R)-PK11195 PET studies bij MSA [Gerhard et al. 2003] en ALS [Turner et al. 2004]. In deze 2 neurodegeneratieve ziekten spelen geactiveerde microgliacellen een belangrijke rol. MSA toonde [11C]-(R)PK11195 een verhoogde opname in de dorso-laterale prefrontale cortex, putamen, pallidum, pons en substantia nigra overeenkomend met de gekende neuropathologische distributie van microgliale activatie. Een grotere longitudinale studie met seriële [11C]-(R)PK11195 zal uitwijzen of er een correlatie bestaat tussen de grootte van de microgliale activatie en de ziekteprogressie. Mogelijks zal ze meer klaarheid brengen omtrent de hypothetische neuro-inflammatoire rol van de microglia in neuro-degeneratieve ziekten en de relevantie van een behandeling met neuro-protectieve agentia. Ook bij ALS werd een wijd verspreide cerebrale microgliale activatie aangetoond door middel van [11C]-(R)-PK11195 PET studie. Bij deze progressieve neurodegeneratieve ziekte werd een microgliale activatie in de pathogenesis van celdood aangetoond [McGeer et al. 1993]. Significant verhoogde tracer bindingen werden aangetoond in de motorische cortex, pons, dorso-laterale prefrontale cortex en thalamus met een duidelijke correlatie tussen de verhoogde binding in de motore cortex en de klinische tekenen van het motor neuron lijden. Deze bevindingen tonen aan dat er bij ALS een uitgebreide cerebrale pathologie aanwezig is en is tevens een mooie illustratie van de dying-back hypothese met retrograde microgliale migratie in de motore cortex en de pons en zelfs uitbreiding naar de extra-motore gebieden zoals de prefrontale regio. Voor klinische toepassing evenwel blijft de ontwikkeling van nieuwe liganten en een verbeterde signaal kwantificatie noodzakelijk voor in vivo neuropathologische beeldvorming. Het probleem bij het gebruik van de PK11195 ligand is namelijk zijn variabel kinetisch gedrag in het serum. Er is een belangrijke binding van PK11195 aan de plasmaproteïnen. De ligand bindt zich met hoge affiniteit aan het α-acid glycoproteïne(AGP) [Lockhart et al. 2003]. AGP is een acute fase proteïne, de plasma concentraties nemen toe bij infecties en inflammatoire ziekten zoals MS. Het gevolg is dat de vrije plasmaconcentraties van PK11195 afnemen. Bij de BBB doorbraak dringt AGP en AGP-gebonden ligand in het hersenweefsel en is er eveneens een lokale synthese van AGP in de inflammatoire focus. Dit alles maakt dat metingen van ligand binding op de PBR variabel zijn door hun competitie met aspecifieke bindingen op serumproteïnen zoals acute fase proteïnen. Deze beperkingen zijn geldig zowel voor de semi-kwantitatieve methode voor ligandmetingen als voor de cluster analyse. Wat het PET onderzoek in MS betreft is de huidige procedure, zelfs met 3D scan, moderne software, cyclotron, MR en een goede teamwerking, omslachtig. Door de huidige problemen met de radioligand en onvolmaaktheden met de kwantificatie kan het onderzoek niet routinematig worden gebruikt. Qua methodologie beschikken we met de 3D PET over moderne apparatuur. Specifiekere en gemakkelijk te kwantificeren liganten zijn evenwel noodzakelijk. Indien aan deze condities kan worden voldaan, zijn een aantal projecten mogelijk. Terwijl tot op heden met [11C]-(R)-PK11195 PET vooral casuïstiek werd gepubliceerd is er nood aan grote longitudinale studies met homogene groepen zoals relapsing-remittting, secondair en primair progressieve en monosymptomatische MS patiënten. Dergelijke studies werden tot op heden niet uitgevoerd. Zij kunnen belangrijke informatie verschaffen omtrent het fysiopathologisch gebeuren tijdens het natuurlijke verloop van deze specifieke ziektevormen. Daarnaast zijn er de klinische studies voor het meten van de therapie-respons in de verschillende homogene groepen. Bijkomend is er de vergelijking van het effect van 136

debruyne j.

de 4 erkende immunologische therapieën op de microgliale activiteit. Tenslotte zou dit onderzoek eveneens kunnen gebruikt worden voor het monitoren van individuele patiënten.

debruyne j.

137

138

debruyne j.

V SAMENVATTING, SUMMARY, RESUMÉ SAMENVATTING Multiple sclerosis (MS) is een chronische ziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS) gekenmerkt door een relapsing-remitting of progressief klinisch verloop en door de pathologische trias van inflammatie, demyelinisatie en gliosis. Het is een complexe aandoening bepaald door een samenspel van genetische vatbaarheid en ongekende omgevingsfactoren. Deze interactie leidt tot een cascade van moleculaire en cellulaire reacties die cumuleren in een relapsing inflammatoir en uiteindelijk progressief neurodegeneratief proces. De weefselschade en de neurologische uitval zijn het gevolg van gecoördineerde acties. Vooreerst worden de T-lymfocyten perifeer geactiveerd door specifieke peptiden aangeboden door antigeen presenterende cellen (APC) in de contekst van MHC moleculen. Daardoor kunnen ze in het CZS auto-immuun reageren en orgaan specifieke eiwitten herkennen. Dit gebeurt na het doorbreken van de bloed-hersenbarriére, infiltratie van de inflammatoire cellen in het hersenparenchym, verdere stimulatie van myeline-reactieve T-cellen door microglia als APC, de aanwezigheid van de autoantilichamen met uiteindelijk demyelinisatie en axonaal verlies. Cytokinen, chemokinen, adhesiemoleculen, groeifactoren en andere moleculen zoals vrije radicalen, proteasen, NO, glutamaat worden massaal geproduceerd door T-lymfocyten en geactiveerde microglia en nemen actief deel in het de-en remyelinisatieproces. Neuroinflammatie speelt dus een belangrijke rol in het ziekteproces bij MS. Specifieke markers van ziekteactiviteit werden tot op heden niet ontwikkeld. De reden is dat MS een complexe aandoening is gekenmerkt door neuropathologische heterogeniciteit tussen de individuele patiënten. Het multifactorieel karakter is de oorzaak van de grote variabiliteit in het chronisch inflammatoir proces. De voortdurende de-en remyelinisatie en de daarmee gepaard gaande moleculaire processen doen vermoeden dat er geen uniforme test bestaat maar eerder een combinatie van meerdere biologische en cellulaire parameters die samen met gespecialiseerde beeldvorming de ziekteactiviteit met meer nauwkeurigheid zullen kunnen weergeven. In een eerste deel van onze studie hebben wij de evolutie van de ziekteactiviteit tijdens het natuurlijke verloop van MS nagegaan door middel van biologische markers in het bloed. Het betrof een longitudinale studie waarbij 22 MS patienten maandelijks klinisch en biologisch gevolgd werden gedurende 2 jaar. Wij onderzochten de rol van T-lymfocyten en monocyten en hun pro-inflammatoire cytokinen, INF- γ , IL-2 en TNF-α in functie van ziekteactiviteit en hun relatie met klinische relapsen. We vonden een toegenomen INF-γ en IL-2 bij de in vitro inductie tijdens exacerbaties. Daar INF-γ en IL-2 geproduceerd worden door de Th1 subset van de CD4+helper T-cellen illustreert dat MS een hoofdzakelijk T-cel gedomineerde aandoening is. Er was een trend aanwezig van een toename van monocyten bij MS patiënten. Voor de totale lymfocyten en de circulerende T-lymfocyten kon geen verschil worden aangetoond tussen patiënten en gezonde vrijwilligers. De concentraties bleven stabiel zowel tijdens de klinische aanvallen als de remissieperioden en bleken niet gecorreleerd met de gestegen cytokineproductie bij relapsen. Bij de actieve MS patiënten was de TNF-α productie toegenomen vanaf 4 weken voorafgaand aan de dag van de exacerbatie en er was een significante relatie met de in vitro INF-γ productie, de absolute concentratie van de debruyne j.

139

monocyten en de neopterine spiegels. INF-γ stimuleert de monocyten die verantwoordelijk zijn voor de TNF-α stijging. Seriële bepaling van de TNF-α voor het voorspellen van opstoten blijkt inde routine praktijk evenwel niet toepasselijk daar in onze studie de voorspellende waarde slechts 15% bedroeg, te laag voor de relevantie van de resultaten. In het tweede gedeelte van onze studie werd de ziekteactiviteit van multiple sclerose bestudeerd aan de hand van microglia, intrinsieke weefsel macrofagen die zich bij een inflammatie in een geactiveerde toestand bevinden waarbij zij immunocompetente eigenschappen vertonen en in staat zijn myelino toxische stoffen af te scheiden die leiden tot een myeline afbraak. Het gedrag van deze geactiveerde microglia.werd in vivo bestudeerd door middel van positron emissie tomografie (PET) en de specifieke radioligand [11C]PK11195 van de perifere benzodiazepinereceptoren die op de microglia gelegen zijn.Voor het meten van de normale waarden van de ligandopname werd een semi-kwantitatieve methode ontwikkeld bij normale personen en toegepast bij MS patiënten. Als resultaat vonden wij dat de relatieve ligandopname tijdens de gestabiliseerde toestand op de statische scan significant hoger was in de grijze structuren van de hersenen vergeleken met de gemiddelde opname in de volledige hersenen. Er was evenwel geen significante verschil van de genormaliseerde activiteit tussen de witte en grijze compartimenten De reproduceerbaarheid bij de vrijwilligers bedroeg 12,5%. Deze methode werd toegepast bij 2 klinisch actieve patienten met gadolinium postieve T-1 gewogen letsels op de MR. De focale ligand opname was significant toegenomen in de actieve inflammatie letsels. Deze semi-kwantitatieve methode toont aan dat de opname van [11C]PK11195 in de normale hersenen zeer laag is en bewijst eveneens de toepasbaarheid ervan op patiënten met hersenpathologie. Deze semi-kwantitatieve methode werd toegepast in een studie van 22 patienten met MS. Een cross-sectionele studie over een periode van 3 maand tot 32,7 jaar. De bedoeling was de rol van de microglia in vivo te bestuderen in acute inflammaties in de normaal ogende witte stof (NAWM) tijdens het acute stadium en het chronisch progressief verloop van de ziekte. Daarnaast was het de bedoeling om de correlatie aan te tonen tussen neuroinflammatie, gekenmerkt door microgliale activiteit, hersenatrofie en klinische parameters zoals ziekteduur en invaliditeit. Neocorticaal volumeverlies is een proces dat reeds wordt vastgesteld in het begin van de ziekte en grotendeels secundair is aan de witte stof inflammatie en demyelinisatie. Anderzijds is er een verhoogde microgliale activiteit met axonale transectie aanwezig in de NAWM en in gadoliumletsels. De opname van [11C]PK 11195 in T2 letsels was in het algemeen verminderd. De opnamewaarden namen toe in een actieve fase wanneer een klinische of een MR relaps aanwezig was. Gedurende de ziekteprogressie werd een gestage toename van [11C]PK 11195 opname in de NAWM waargenomen. Atrofie was significant groter in MS patiënten vergeleken met leeftijds gerelateerde controlepersonen. Er werd een significante correlatie gevonden tussen hersenatrofie, ziekteduur en invaliditeit gemeten met de expanded disability status scale (EDSS). De [11C]PK11195 opname in de NAWM nam evenredig toe met de afname van het hersenparenchym terwijl in de T-2 letsels de [11C]PK11195 opname daalde overeenkomstig met de toenemende hersenatrofie. Microglia als intrinsieke weefsel macrofagen kunnen zich enerzijds gedragen als APC voor de T-lymfocyten bij relapsen en anderzijds als autonome geactiveerde cellen met afscheiding van pro-inflammatoire cytokines en myelinotoxische factoren. Ze zijn in hoge concentratie aanwezig in focale inflammaties doch we zien eveneens een globale opname in de T-2 letsels tijdens een actief stadium. 140

debruyne j.

De microgliacellen zijn nadrukkelijk aanwezig in de actieve plaques samen met de Tlymfocyten waarmee zijn een netwerk vormen als APC’s is voor het vernietigen van de myeline. Het immunologische getriggerd proces manifesteert zich in een golvend verloop met periodes van toegenomen activiteit afgewisseld met periodes van relatieve rust. Dit manifesteert zich ondermeer door voortdurende op- en downregulatie van de perifere benzodiazepine receptoren op de microglia cellen als merker van immunologische activiteit. In het progressieve verloop van MS zijn de microglia-cellen eveneens in verhoogde concentratie aanwezig in de NAWM, met een stijgende concentratie in het verloop van het ziekteproces, onafhankelijk van het al dan niet aanwezig zijn van actieve letsels of klinische opstoten. Dit illustreert dat immunologisch getriggerde microgliacellen hun activiteit uitoefenen los van de gebeurtenissen rond de bloedhersen-barrière. Ze staan in voor de progressie van het ziekteproces door hun pro-inflammatoire rol in onzichtbare demyelinisatie in de NAWM. Bijgevolg wordt er een significante correlatie waargenomen tussen het neuro-inflammatoire proces en de toename van de hersenatrofie tijdens het ziekteverloop. De neuro-inflammatie vormt de werkelijke ‘burden of disease’ in de NAWM. De focale inflammatieletsels dienen eerder beschouwd te worden als een epifenomeen in het immunologisch gebeuren niet verantwoordelijk voor de hersenatrofie. Antwoorden op de hypothesen Cytokinen en inflammatie bij MS INF-γ en IL-2, 2 pro-inflammatoire cytokinen geproduceerd door de Th1 cel zijn gestegen tijdens de exacerbaties. Tijdens de exacerbaties worden monocyten geactiveerd. De TNF-α productie is toegenomen vanaf 4 weken voor een relaps. Seriële bepaling van TNF-α voor het voorspellen van opstoten is in de klinische praktijk niet toepasselijk wegens een te lage relevantie van de positieve resultaten. Microglia en inflammatie bij MS Geactiveerde microgliacellen zijn nadrukkelijk aanwezig in actieve plaques waar zij als APCs de T-lymphocyten activeren voor het beschadigen van de myeline. Er is een gestage toename van microgliale activiteit in de NAWM gedurende de ziekteprogressie onafhankelijk van de aanwezigheid van actieve letsels of klinische opstoten. De microgliale activiteit in de NAWM neemt gelijkmatig toe met de afname van het hersenparenchym.

debruyne j.

141

SUMMARY Multiple sclerosis (MS) is a chronic disease of the central nervous system(CNS) characterized by a relapsing-remitting or progressive clinical course and by the pathological triad of inflammation, demyelinization and gliosis. It appears to be a complex process mediated by a combination of genetic and environmental factors leading to a cascade of molecular and cellular reactions which result in a relapsing inflammatory and finally, in a progressive neurodegenerative disorder. Tissue damage and neurological defect are the result of coordinated actions. Firstly, T-cells become activated in the periphery by processed peptides expressed by antigen-presenting cells (APC) in the context of MHC molecules. As a consequence these activated T-cells become immune competent cells for recognition and destruction of myelin-specific proteins. This happens after they have passed through the blood-brain barrier into the brain parenchyma where they are reactivated by microglia now presenting CNS antigens. This second activation step triggers a new wave of inflammation in which numerous cytokines, chemokines, adhesion molecules, growth-factors and other molecules such as free radicals, proteases, NO, and glutamate are produced. This process is maintained by positive feedback loops acting on effector cells resulting in damage to myelin, oligodendrocytes and neurons. Neuroiflammation plays an important role in the pathophysiology of MS. Specific reliable markers of disease activity are not identified yet for reason that MS is a complex disorder, characterized by considerable differences in neuropathogical presentation and clinical variation in disease manifestation between individual patients. The concurrent de-and remyelination leading to seemingly contradictory biological and cellular processes makes it probable that in the multi-origin disease, which is MS, there are no single specific body fluid markers but rather a combination of molecular parameters with specialized imaging techniques to mirror disease activity. In the first part of our study we investigated the evolution of disease activity during the natual course of MS by means of biological markers in the peripheral blood. In this longitudinal study we clinically and biologically followed 22 MS patients monthly during a period of 2 years. We studied the role of the T-lymphocytes, monocytes and their proinflammatory cytokines, INF-γ, IL-2 en TNF-α in order to evaluate their function in disease activity and their relation with clinical relapses. We found increased in vitro induction of INF-γ and IL-2 during exacerbations. IFN-γ and IL-2 are mainly produced by the Th1 subset of CD4+ helper T-cells indicating that MS may be mediated by a in loco Th1-dominated response. There was a trend of increased numbers of monocytes in MS patients. For the total number of lymphocytes and circulating Tlymphocytes no differences could be demonstrated between patients and normals. The concentrations remained stable during clinical exacerbations as well as during episodes of remission and there was no clear relationship with the increased cytokines production during relapses. There was an increased TNF-α production in active MS patients during the period of one month preceding clinical relapses. Since there was a significant relation between in vitro INF-γ production and the absolute blood monocyte count and the serum neopterine levels, it is tempting to think that INF-γ plays a causal role in the activation of monocytes. 142

debruyne j.

Nevertheless, serial analyses of TNF-α revealed to be of no value in clinical practice since the predicting capacity nearly reached 15% which is far too low for being a clinically useful discriminating factor. In the second part of our study we assessed the disease activity of MS by means of microglia, the brain’s intrinsic macrophages. In brain inflammation they become activated with immunocompetent features able to produce myelinotoxic components leading to demyelination. Microglial activity can be measured in vivo by positron emission tomography (PET) and the specific radioligand [11C]PK11195 of the peripheral benzodiazepine receptor situated on the microglia. Normal uptake of the ligand was measured by means of a semiquantitative approach in normals and applied in MS patients. The relative ligand uptake was significantly higher in grey matter structures as compared to the whole brain whereas the uptake values were comparable in the white and grey compartments. The intersubject reproducibility was 12,5%. Finally this method was applied in two clinically active patients and showed significantly higher focal uptake in the active inflammation. It was concluded that the normal brain uptake of [11C]PK11195 tends to be very low. The feasibility for the application of the semiquantitative method in brain pathology was also shown. This semiquantitative method was performed in a cohort of 22 patients with MS, in a crosssectional study spread over a period from 3 months to 32.7 years. The aim of the study was firstly, to assess the role of the microglia in vivo in the normal appearing white matter (NAWM) during the acute state and the chronic progressive course of the disease and secondly, to demonstrate the correlation between neuroinflammation, by means of microglia activity, brain atrophy and clinical parameters such as disease duration and invalidity. Neocortical atrophy contributes significantly to neurologic impairment, and seems to be an early manifestation in MS secondary to white matter inflammation and demyelinisation. On the other hand, an increased microglial activity and axonal degeneration in the NAWM and in the gadolinium lesions has been demonstrated. The uptake of [11C]PK11195 in T2 weighted lesions was decreased but it increased in an active phase when a clinical or MR relapse was present. There was a steady rise of [11C]PK11195 uptake in the NAWM during the disease. Brain atrophy was significanthly prominent in MS patients compared to age-matched controls. A significant correlation was found between brain atrophy and both disease duration and disability as measured with the expanded disability status scale (EDSS). The [11C]PK11195 uptake in the NAWM increased with the amount of atrophy, while the T2lesional [11C]PK11195 uptake decreased according to increasing brain atrophy. Or the one side, microglia, in active disease with MR or clinical relapses, act as APC for Tlymphocytes. On the other hand, they behave like independent immuno-competent cells producing pro-inflammatory cytokines and myelinotoxic factors in stages of chronic progression. They appear in high concentration in focal inflammations but there is an overall global T2lesional upgrading in an active state. Microglia are significantly present in active plaques where they form a cytokine network as APC for the T-lymphocytes with destructive properties to myeline antigens. The immunological process is waxing and warning with periods of active inflammation followed by periods of relative stagnation. debruyne j.

143

This is pathologically demonstrated by continuous up- and downregulation of the peripheral benzodiazepine receptors on the microglia as markers of immunological activity. During disease progression there is a rising concentration of activated microglia cells in the NAWM independent from relapse or inflammatory lesions. This illustrates that immunologically triggered microglia can initiate the demyelinating process unrelated to BBB disruption and autoreactive T-cell function.They are active in the progression of the disease process causing invisible demyelination in the NAWM and brain atrophy as a consequence. Neuroinflammation in the NAWM constitutes ‘the real burden of disease’ and relapses must be considered as an epiphenomenon not significantly influencing the progression of brain parenchymal loss. Reply on the hypotheses Cytokines and inflammation in MS There is an increased INF-γ and IL-2 production during exacerbations. Pheripheral blood monocytes are activated during exacerbations. There is an increased TNF-α production in active MS patients during the period of one month preceding clinical relapses. Serial analyses of TNF-α revealed to be of no value in clinical practice since the predicting capacity is far too low for being clinical useful. Microglia and inflammation in MS Activated microglia appear in high concentration in focal inflammations where they act as APCs for T-lymphocytes for destructive properties to myeline antigens. There is a rising concentration of activated microglia cells in NAWM during disease progression independent to the presence of inflammatory lesions or from relapse. Microglial activity in NAWM increased in correlation with the decrease of the amount of brain parenchyma.

144

debruyne j.

RESUMÉ La sclérose en plaques (SEP) est une maladie chronique du système nerveux central(SNC) caractérisée par une phase de poussées-rémissions et par une phase d’évolution progressive, ainsi que par la triade pathologique composée d’inflammation, de démyélinisation et de gliose. C’est une affection complexe déterminée par l’interaction d’une prédisposition génétique et de facteurs environnementaux inconnus. Cette interaction mène à une cascade de réactions moléculaires et cellulaires qui cumulent en un processus de poussées inflammatoires évoluant finalement vers un processus progressivement neurodégénératif. En premier lieu les lymphocytes T sont activés au niveau périphérique par des peptides spécifiques portés par les cellules présentatrices d’antigènes (APC) dans le contexte des molécules MHC. C’est ainsi que ces lymphocytes peuvent réagir de façon auto-immune au niveau du SNC et y reconnaître des protéines spécifiques. Ceci nécessite le passage de la barrière hémato-encéphalique, l’accumulation de cellules inflammatoires dans le parenchyme cérébral, la stimulation de cellules T réactives à la myéline par la microglie agissant comme APC, la présence d’auto-anticorps, conduisant finalement à une démyélinisation et à une perte axonale. Cytokines, chemokines, molécules d’adhésion, facteurs de croissance et autres molécules comme les radicaux libres, protéases, NO, glutamate sont produits massivement par les lymphocytes T et la microglie activée et ont un rôle actif dans le processus de dé- et remyélinisation. Cependant, des marqueurs spécifiques de l’activité de la maladie n’ont pas encore été définiés à ce jour. La raison en est que la SEP est une affection complexe caractérisée par une hétérogénéité neuropathologique entre les patients individuellement. Le caractère multi-factoriel est la cause de la grande variabilité dans le processus inflammatoire chronique. La dé- et remyélinisation constante et les processus moléculaires associés font penser qu’il n’existera pas de test unique, mais plutôt une combinaison de plusieurs paramètres biologiques et cellulaires pouvant mesurer, avec l’ imagerie cérébrale, l’activité réelle de la maladie. Dans la première partie de notre étude, nous avons étudié l’évolution de l’activité de la maladie durant la progression naturelle de la SEP à l’aide de marqueurs biologiques sanguins. Il s’agissait d’une étude longitudinale dans laquelle 22 patients souffrant de SEP étaient suivis au niveau biologique et clinique pendant une période de 2 ans. Nous avons étudié le rôle des lymphocytes T et des monocytes et leurs cytokines proinflammatoires, INF-γ, IL-2 et TNF-α en fonction de l’activité de la maladie et leur relation avec les poussées. Nous avons découvert une augmentation de l’induction in vitro d’INF-γ et d’IL-2 pendant les poussées. L’INF-γ et IL-2 sont produits par la sous-population Th1 des CD4+ T helper. Ceci illustre bien que la SEP est une affection dominée essentiellement par l’activation des cellules T. Nous avons observé une tendance à l’augmentation du nombre de monocytes chez les patients souffrant de SEP. Pour les lymphocytes totaux et les lymphocytes T circulants, on n’a pas pu démontrer de différence entre les patients et les volontaires sains. Leurs nombres sont restés stables tant pendant les poussées cliniques que pendant les périodes de rémission et ne semblaient pas corrélés à l’augmentation de la production de cytokines lors de poussées. Chez les patients souffrant de SEP active on notait une augmentation de la debruyne j.

145

production de TNF-α à partir de 4 semaines précédant le jour de l’exacerbation et il y avait une relation significative avec la production d’ INF-γ in vitro, la concentration absolue des monocytes et les taux de neoptérine. L’INF-γ stimule les monocytes qui sont responsables de l’augmentation de TNF-α. La détermination sérique de TNF-α pour la détection des poussées ne semble pas une méthode de routine applicable, vu que dans notre étude la valeur prédictive était de 15%, donc trop faible pour que ces résultats soient significatifs. Dans la deuxième partie de notre étude nous avons tenté de mesurer l’activité de la maladie en étudiant la microglie. Cell-ci représente les tissulaires intrinsèques qui sont dans un état activé lors d’une inflammation et qui présentent alors des caractéristiques immunocompétentes leur permettant de sécréter des substances myélinotoxiques. Le comportement de la microglie activée a été étudié à l’aide d’une tomographie par émission de positron (PET) avec le radioligand spécifique [11C]PK11195 des récepteurs périphériques de benzodiazépine situés sur la microglie. Pour mesurer les valeurs normales de captation du ligand nous avons développé une méthode semi-quantitative chez des personnes normales et appliqué celle-ci à des patients souffrant de SEP. Nous avons observé que la captation relative de ligand en situation stabilisée sur le scanner statique était plus importante dans la substance grise du cerveau comparé à la captation moyenne du cerveau en général. Il n’y avait cependant pas de différence significative de l’activité normalisée entre le cortex et la substance blanche. La reproductibilité des mesures chez les volontaires était de 12,5%. Cette méthode a été utilisée chez 2 patients cliniquement actifs avec des lésions pondérées T-1 positives au gadolinium à la résonance magnetique nucléaire (RMN). La captation focale du ligand était significativement augmentée dans les lésions inflammatoires actives. Cette méthode semi-quantitative montre que la captation de [11C]PK11195 dans le cerveau normal est très faible et démontre également sa possibilité d’application chez les patients souffrant d’une pathologie cérébrale. Elle a donc été utilisée dans une étude cross-sectionnelle de 22 patients souffrant de SEP sur une période de 3 mois à 32,7 ans. L’intention était d’étudier le rôle de la microglie in vivo dans la substance blanche d’apparence normale (NAWM) pendant une phase aiguë et pendant l’évolution progressive de la maladie. En outre nous avons recherché une possible corrélation entre l’inflammation neurologique, caractérisée par l’activation de la microglie et l’atrophie cérébrale et la durée de la maladie et l’invalidité qu’elle provoque. La perte de volume néocortical est un processus qui est déja observé au début de la maladie et est en partie secondaire à l’inflammation de la substance blanche et la démyélinisation. D’autre part on remarque une augmentation de l’activité microgliale avec présence de transection axonale dans la substance blanche et dans les lésions caractérisées par une rupture de la barrière hemato-encephalique et la prise de gadolinium. La captation de [11C]PK11195 dans les lésions T2 était généralement diminuée. Les valeurs de captation augmentaient dans la phase active quand une poussée clinique était présente à la RMN. Durant la progression de la maladie nous avons remarqué une augmentation évidente de la captation de [11C]PK11195 dans la substance blanche. L’atrophie était significativement plus importante chez les patients souffrant de SEP par rapport aux personnes de contrôle du même âge. Nous avons mis en évidence une 146

debruyne j.

corrélation significative entre l’atrophie cérébrale, la durée de la maladie et l’invalidité mesurée avec l’Expanded Disability Status Scale (EDSS). La captation de [11C]PK11195 dans la substance blanche apparement normale augmentait proportionnellement à la diminution du parenchyme cérébral, alors que dans les lésions T-2 la captation de [11C]PK11195 diminuait en rapport avec l’atrophie cérébrale. La microglie en tant que macrophages tissulaires intrinsèques peut se comporter d’une part comme APC pour les lymphocytes T en cas de poussées et d’autre part comme des cellules autonomes activées avec sécrétion de cytokines pro-inflammatoires et de facteurs myélinotoxiques. Les cellules microgliales sont présentes en forte concentration dans les inflammations focales et nous voyons également une absorption de notre marqueur dans les lésions T-2 pendant la phase active. Elles sont clairement présentes dans les plaques actives, de même que les lymphocytes T avec lesquels elles forment un réseau comme cellules présentatrices d’antigènes Le processus immunologique se manifeste par une évolution ondulante avec des périodes d’activité augmentée alternant avec des périodes d’accalmie. Ceci se manifeste entre autre par la régulation augmentée ou diminuée des récepteurs de benzodiazépine périphériques sur la microglie comme marqueur d’activité immunologique. Dans l’évolution progressive de la SEP on retrouve les cellules de la microglie en concentration élevée dans la substance apparement normale, indépendamment de la présence de lésions actives ou de poussées cliniques. Ceci illustre que les cellules microgliales immunologiquement stimulées, exercent leur activité indépendamment des processus liés à la ruptue de la barrière hématoencéphalique. Elles sont responsables de la progression du processus de la maladie par leur rôle pro-inflammatoire et induisent une démyélinisation macroscopiquement invisible de la substance blanche. Par conséquent on observe une corrélation significative entre le processus neuroinflammatoire et l’augmentation de l’atrophie cérébrale pendant l’évolution de la maladie. L’inflammation neurologique forme la réelle "burden of disease" dans la substance blanche apparemment normale. Les lésions inflammatoires focales doivent être plutôt considérées comme un épiphénomène dans le processus immunologique, et elles ne sont pas responsables de l’atrophie cérébrale. Réponses aux hypothèses Cytokines et inflammation dans SEP INF-α et IL-2, deux cytokines pro-inflammatoires produits par le Th1 cellule, sont augmentées pendant les poussées. On remarque une activation des monocytes pendant les poussées. La production de TNF-α est augmentée à partir de 4 semaines précédant le jour de l’exacerbation. La détermination sérique de TNF-α pour la détection des poussées ne semble pas une méthode de routine applicable, vu que la valeur prédictive est trop faible pour la signification des résultats. Microglie et inflammation dans SEP Une augmentation de l’activité microgliale est clairement présente dans les plaques actives de même que les lymphocytes T avec lesquels elles forment un réseau comme cellules présentatrices d’antigènes debruyne j.

147

Dans l’évolution progressive de la SEP on retrouve les cellules de la microglie en concentration élevée dans la substance blanche apparemment normale, indépendamment de la présence de lésions actives ou de poussées cliniques. L’activité de la microglie dans la substance blanche apparemment normale augmentait proportionnellement à la diminution du parenchyme cérébral.

148

debruyne j.

VI. REFERENTIES The IFNB Multiple Sclerosis Study Group.Interferon beta-1b is effective in relapsingremitting multiple sclerosis:I. Clinical results of a multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Neurology 1993;. 43: 655-661. European Study Group on Interferon beta-1b in Secondary Progressive MS: placebocontrolled multicentre randomised trial of interferon b-1b in treatment of secondary progressive multiple sclerosis. Lancet 352, 1491-7. 1998. 3D'Asscher PA van den Elsen, EJ Pol en MA Viergever. "Medical image matching A review with classification". IEE Engineering in Medecine and Biology, vol12, no1, pp 2638, March 1993). 2004. Ahmed Z, Doward AI, Pryce G et al. A role for caspase-1 and -3 in the pathology of experimental allergic encephalomyelitis : inflammation versus degeneration. Am J Pathol 2002a; 161: 1577-1586. Amato MP, Ponziani G. A prospective study on the prognosis of multiple sclerosis. Neurol Sci 2000; 21: S831-S838. Amor S, O'Neill JK, Morris MM et al. Encephalitogenic epitopes of myelin basic protein, proteolipid protein, myelin oligodendrocyte glycoprotein for experimental allergic encephalomyelitis induction in Biozzi ABH (H-2Ag7) mice share an amino acid motif. J Immunol. 1996; 156: 3000-3008. Andersson PB, Waubant E, Gee L, Goodkin DE. Multiple sclerosis that is progressive from the time of onset: clinical characteristics and progression of disability. Arch Neurol. 1999; 56: 1138-1142. Anholt RR, Pedersen PL, De Souza EB, Snyder SH. The peripheral-type benzodiazepine receptor. Localization to the mitochondrial outer membrane. J Biol.Chem. 1986; 261: 576583. Anthony DC, Hughes P, Perry VH. [The evidence for primary axonal loss in multiple sclerosis]. Rev Neurol 2000; 30: 1203-1208. Archelos JJ, Hartung HP. The role of adhesion molecules in multiple sclerosis: biology, pathogenesis and therapeutic implications. Mol.Med.Today 1997; 3: 310-321. Archelos JJ, Previtali SC, Hartung HP. The role of integrins in immune-mediated diseases of the nervous system. Trends Neurosci. 1999; 22: 30-38. Arnold DL. Magnetic resonance spectroscopy: imaging axonal damage in MS. J Neuroimmunol. 1999; 98: 2-6.

debruyne j.

149

Arnold DL, Wolinsky JS, Matthews PM, Falini A. The use of magnetic resonance spectroscopy in the evaluation of the natural history of multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1998; 64 Suppl 1: S94-101. Ashburner J, Friston K. Multimodal image coregistration and partitioning--a unified framework. Neuroimage. 1997; 6: 209-217. Awad M, Gavish M. Peripheral-type benzodiazepine receptors in human cerebral cortex, kidney, and colon. Life Sci 1991; 49: 1155-1161. Babinski J. Etude anatomique et clinique sur la sclérose en plaques. Paris: Masson, 1885. Baker RW, Thompson RH, Zilkha KJ. Fatty-acid composition of brain lecithins in multiple sclerosis. Lancet 1963; 1: 26-27. Bakshi R, Ariyaratana S, Benedict RH, Jacobs L. Fluid-attenuated inversion recovery magnetic resonance imaging detects cortical and juxtacortical multiple sclerosis lesions. Arch Neurol 2001; 58: 742-748. Balashov KE, Smith DR, Khoury SJ, Hafler DA, Weiner HL. Increased interleukin 12 production in progressive multiple sclerosis: induction by activated CD4+ T cells via CD40 ligand. Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 1997; 94: 599-603. Banati RB. Visualising microglial activation in vivo. Glia 2002; 40: 206-217. Banati RB, Gehrmann J, Schubert P, Kreutzberg GW. Cytotoxicity of microglia. Glia 1993; 7: 111-118. Banati RB, Goerres GW, Myers R et al. [11C](R)-PK11195 positron emission tomography imaging of activated microglia in vivo in Rasmussen's encephalitis. Neurology 1999; 53: 2199-2203. Banati RB, Myers R, Kreutzberg GW. PK ('peripheral benzodiazepine') - binding sites in the CNS indicate early and discrete brain lesions: microautoradiographic detection of [3H]PK11195 binding to activated microglia. J Neurocytol 1997; 26: 77-82. Banati RB, Newcombe J, Gunn RN et al. The peripheral benzodiazepine binding site in the brain in multiple sclerosis: quantitative in vivo imaging of microglia as a measure of disease activity. Brain 2000; 123: 2321-2337. Banik NL, Matzelle DC, Gantt-Wilford G, Osborne A, Hogan EL. Increased calpain content and progressive degradation of neurofilament protein in spinal cord injury. Brain Res. 1997; 752: 301-306. Barkhof F. MRI in multiple sclerosis: correlation with expanded disability status scale (EDSS). Mult.Scler. 1999; 5: 283-286. Barkhof F, Filippi M, Miller DH et al. Comparison of MRI criteria at first presentation to predict conversion to clinically definite multiple sclerosis. Brain 1997; 120: 2059-2069. 150

debruyne j.

Barkhof F, van Walderveen M. Characterization of tissue damage in multiple sclerosis by nuclear magnetic resonance. Philos.Trans.R.Soc.Lond B Biol.Sci. 1999; 354: 1675-1686. Barnes D, Hughes RA, Morris RW et al. Randomised trial of oral and intravenous methylprednisolone in acute relapses of multiple sclerosis. Lancet 1997; 349: 902-906. Barron KD. The microglial cell. A historical review. J Neurol Sci 1995; 134 Suppl: 57-68. Bashir K, Whitaker JN. Clinical and laboratory features of primary progressive and secondary progressive MS. Neurology 1999; 53: 765-771. Becker KG, Simon RM, Bailey-Wilson JE et al. Clustering of non-major histocompatibility complex susceptibility candidate loci in human autoimmune diseases. Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 1998; 95: 9979-9984. Beeson PB. Age and sex associations of 40 autoimmune diseases. Am J Med. 1994; 96: 457-462. Ben Nun A, Wekerle H, Cohen IR. Vaccination against autoimmune encephalomyelitis with T-lymphocyte line cells reactive against myelin basic protein. Nature 1981; 292: 6061. Benavides J, Cornu P, Dennis T et al. Imaging of human brain lesions with an w3 site radioligand. Ann Neurol 1988; 24: 708-712. Benavides J, Fage D, Carter C, Scatton B. Peripheral type benzodiazepine binding sites are a sensitive indirect index of neuronal damage. Brain Res. 1987; 421: 167-172. Benavides J, Quarteronet D, Imbault F et al. Labelling of "peripheral-type" benzodiazepine binding sites in the rat brain by using [3H]PK 11195, an isoquinoline carboxamide derivative: kinetic studies and autoradiographic localization. J Neurochem 1983; 41: 17441750. Benavides J, Savaki HE, Malgouris C et al. Autoradiographic localization of peripheral benzodiazepine binding sites in the cat brain with [3H]PK 11195. Brain Res Bull 1984; 13: 69-77. Benveniste EN. Role of macrophages/microglia in multiple sclerosis and experimental allergic encephalomyelitis. J Mol.Med 1997; 75: 165-173. Berg D, Maurer M, Warmuth-Metz M, Rieckmann P, Becker G. The correlation between ventricular diameter measured by transcranial sonography and clinical disability and cognitive dysfunction in patients with multiple sclerosis. Arch.Neurol. 2000; 57: 12891292. Berger T, Rubner P, Schautzer F et al. Antimyelin antibodies as a predictor of clinically definite multiple sclerosis after a first demyelinating event. N.Engl.J Med. 2003; 349: 139145. debruyne j.

151

Black KL, Ikezaki K, Santori E, Becker DP, Vinters HV. Specific high-affinity binding of peripheral benzodiazepine receptor ligands to brain tumors in rat and man. Cancer 1990; 65: 93-97. Black KL, Ikezaki K, Toga AW. Imaging of brain tumors using peripheral benzodiazepine receptor ligands. J Neurosurg. 1989; 71: 113-118. Blatter DD, Bigler ED, Gale SD et al. Quantitative volumetric analysis of brain MR: normative database spanning 5 decades of life. AJNR Am.J.Neuroradiol. 1995; 16: 241251. Blinkenberg M, Rune K, Jensen CV et al. Cortical cerebral metabolism correlates with MRI lesion load and cognitive dysfunction in MS. Neurology 2000; 54: 558-564. Blumhardt, L. D. Interferon beta-1a in relapsing-remitting multiple sclerosis: a metaanalysis. Neurology 52A, 498. 1999. Boxel-Dezaire AH, Hoff SC, van Oosten BW et al. Decreased interleukin-10 and increased interleukin-12p40 mRNA are associated with disease activity and characterize different disease stages in multiple sclerosis. Ann Neurol 1999; 45: 695-703. Boxel-Dezaire AH, Smits M, Trigt-Hoff SC et al. Cytokine and IL-12 receptor mRNA discriminate between different clinical subtypes in multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 2001; 120: 152-160. Bramwell B. On the relative frequency of disseminated sclerosis in this country (Scotland and the North of England) and in America. Rev Neurol Psychiatry (Edinb) 1, 12-17. 1903. Brenner T, Brocke S, Szafer F et al. Inhibition of nitric oxide synthase for treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. J.Immunol. 1997; 158: 2940-2946. Brex PA, Ciccarelli O, O'Riordan JI, Sailer M, Thompson AJ, Miller DH. A longitudinal study of abnormalities on MRI and disability from multiple sclerosis. N.Engl.J.Med. 2002; 346: 158-164. Brex PA, Miszkiel KA, O'Riordan JI et al. Assessing the risk of early multiple sclerosis in patients with clinically isolated syndromes: the role of a follow up MRI. J Neurol Neurosurg.Psychiatry 2001; 70: 390-393. Broman T. Investigations of disturbances of the cerebral vascular permeability, with special respect to pathogenetic problems in multiple sclerosis. Acta Psychiatr.Neurol.Scand.Suppl 1951; No. 74: 53-54. Bruno R, Sabater L, Sospedra M et al. Multiple sclerosis candidate autoantigens except myelin oligodendrocyte glycoprotein are transcribed in human thymus. Eur.J Immunol. 2002; 32: 2737-2747. Bunge MB, Bunge RP, Ris H. Ultrastructural study of remyelination in an experimental lesion in adult cat spinal cord. J.Biophys.Biochem.Cytol. 1961; 10: 67-94. 152

debruyne j.

Burt RK. BMT for severe autoimmune diseases: an idea whose time has come. Oncology (Huntingt) 1997; 11: 1001-1014. Burt RK, Burns WH, Miller SD. Bone marrow transplantation for multiple sclerosis: returning to Pandora's box. Immunol.Today 1997; 18: 559-561. Butterfield RJ, Sudweeks JD, Blankenhorn EP et al. New genetic loci that control susceptibility and symptoms of experimental allergic encephalomyelitis in inbred mice. J Immunol. 1998; 161: 1860-1867. Buzzard EF. The treatment of disseminated sclerosis: A suggestion. Lancet 1, 98. 1911. Cagnin A, Brooks DJ, Kennedy AM et al. In-vivo measurement of activated microglia in dementia. Lancet 2001; 358: 461-467. Cagnin A, Myers R, Gunn RN. Imaging activated microglia in the ageing human brain. J Cereb Blood Flow Metab 1999; 19: S820. Cagnin A, Myers R, Gunn RN et al. In vivo visualization of activated glia by [11C] (R)PK11195-PET following herpes encephalitis reveals projected neuronal damage beyond the primary focal lesion. Brain 2001; 124: 2014-2027. Calabresi PA, Fields NS, Maloni HW et al. Phase 1 trial of transforming growth factor beta 2 in chronic progressive MS. Neurology 1998; 51: 289-292. Calopa M, Bas J, Mestre M, Arbizu T, Peres J, Buendia E. T cell subsets in multiple sclerosis: a serial study. Acta Neurol Scand. 1995; 92: 361-368. Campadelli-Fiume G, Mirandola P, Menotti L. Human herpesvirus 6: An emerging pathogen. Emerg.Infect.Dis. 1999; 5: 353-366. Camsonne R, Crouzel C, Comar D et al. Synthesis of n-(C-11) methyl, n-(methyl-1 propyl), (chloro-2 phenyl)-1 isoquinoleine carboxamide-3 (PK-11195) – a new ligand for peripheral benzodiazepine receptors. J Labelled Compd Rad 1984; 21: 985-991. Carswell R. Pathological Anatomy: Illustations of the Elementary Forms of Disease. London: Longmans, 1838. Cepok S, Jacobsen M, Schock S et al. Patterns of cerebrospinal fluid pathology correlate with disease progression in multiple sclerosis. Brain 2001; 124: 2169-2176. Chang A, Tourtellotte WW, Rudick R, Trapp BD. Premyelinating oligodendrocytes in chronic lesions of multiple sclerosis. N.Engl.J Med. 2002; 346: 165-173. Chapman J, Vinokurov S, Achiron A et al. APOE genotype is a major predictor of longterm progression of disability in MS. Neurology 2001; 56: 312-316. Charcot J-M. Histologie de la sclérose en plaques. Gaz Hôpitaux Paris 1868; 141: 554-558. debruyne j.

153

Chard DT, Griffin CM, Parker GJ, Kapoor R, Thompson AJ, Miller DH. Brain atrophy in clinically early relapsing-remitting multiple sclerosis. Brain 2002; 125: 327-337. Chofflon M, Juillard C, Juillard P, Gauthier G, Grau GE. Tumor necrosis factor alpha production as a possible predictor of relapse in patients with multiple sclerosis. Eur.Cytokine Netw. 1992; 3: 523-531. Ciccarelli O, Werring DJ, Wheeler-Kingshott CA et al. Investigation of MS normalappearing brain using diffusion tensor MRI with clinical correlations. Neurology 2001; 56: 926-933. Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem.J 1997; 326 ( Pt 1): 1-16. Comi G. Why treat early multiple sclerosis. Curr Opin Neurol 13, 235-240. 2000. Comi G. Effect of early interferon treatment on conversion to definite multiple sclerosis: a randomised study. Filippi, M Barkhof F. Lancet 357, 1576-1582. 2001. Comi G, Filippi M. The effect of glatiramer acetate (Copaxone) on disease activity as measured by cerebral MRI in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS): a multicentre, randomized, double-blind, placebo-controlled study extended by open-label treatment. for the Copaxone MRI Study Group. Neurology, 52 (suppl.2) , A289. 1999. Comi G, Filippi M, Barkhof F et al. Effect of early interferon treatment on conversion to definite multiple sclerosis: a randomised study. Lancet 2001; 357: 1576-1582. Compston A. Future options for therapies to limit damage and enhance recovery. Semin.Neurol 1998a; 18: 405-414. Compston, A. neurobiology of multiple sclerosis. McAlpine's Multiple Sclerosis, 283-322. 1998b. Compston A. The genetic epidemiology of multiple sclerosis. Philos.Trans.R.Soc.Lond B Biol.Sci 1999; 354: 1623-1634. Confavreux C, Hutchinson M, Hours MM, Cortinovis-Tourniaire P, Moreau T. Rate of pregnancy-related relapse in multiple sclerosis. Pregnancy in Multiple Sclerosis Group. N.Engl.J Med. 1998; 339: 285-291. Confavreux C, Vukusic S, Moreau T, Adeleine P. Relapses and progression of disability in multiple sclerosis. N.Engl.J Med. 2000; 343: 1430-1438. Cook SD, Rohowsky-Kochan C, Bansil S, Dowling PC. Evidence for multiple sclerosis as an infectious disease. Acta Neurol Scand.Suppl 1995; 161: 34-42. Costa DC, Pilowsky LS, Ell PJ. Nuclear medicine in neurology and psychiatry. Lancet 1999; 354: 1107-1111.

154

debruyne j.

Cross AH, Trotter JL, Lyons J. B cells and antibodies in CNS demyelinating disease. J Neuroimmunol. 2001; 112: 1-14. Cruveilhier J. Anatomie pathologique du corps humain: descriptions avec figures lithographiées et coloriées; des diverses alterations morbides dont le corps humain est susceptible. Paris: Ballière, 1842. Cuzner ML. Molecular biology of microglia. (In: Russell WC, editor.), 97-120. 1997. Chichester (UK): Wiley. Dalton CM, Brex PA, Miszkiel KA et al. Application of the new McDonald criteria to patients with clinically isolated syndromes suggestive of multiple sclerosis. Ann.Neurol 2002; 52: 47-53. Dangond F, Windhagen A, Groves CJ, Hafler DA. Constitutive expression of costimulatory molecules by human microglia and its relevance to CNS autoimmunity. J Neuroimmunol. 1997; 76: 132-138. Danilov AI, Andersson M, Bavand N, Wiklund NP, Olsson T, Brundin L. Nitric oxide metabolite determinations reveal continuous inflammation in multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 2003; 136: 112-118. Davie CA, Barker GJ, Thompson AJ, Tofts PS, McDonald WI, Miller DH. 1H magnetic resonance spectroscopy of chronic cerebral white matter lesions and normal appearing white matter in multiple sclerosis. J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry 1997; 63: 736-742. Dawson GD. A summation technique for the detection of small evoked potentials. Electroencephalogr.Clin.Neurophysiol.Suppl 1954; 6: 65-84. Dawson JW. The histology of disseminated sclerosis. Proc R Soc Edinb 1916; 17: 229-416. De Groot CJ, Bergers E, Kamphorst W et al. Post-mortem MRI-guided sampling of multiple sclerosis brain lesions: increased yield of active demyelinating and (p)reactive lesions. Brain 2001; 124: 1635-1645. De Keyser J, Wilczak N, Leta R, Streetland C. Astrocytes in multiple sclerosis lack beta-2 adrenergic receptors. Neurology 1999; 53: 1628-1633. De Keyser J, Wilczak N, Walter JH, Zurbriggen A. Disappearance of beta2-adrenergic receptors on astrocytes in canine distemper encephalitis: possible implications for the pathogenesis of multiple sclerosis. Neuroreport 2001; 12: 191-194. De Stefano N, Matthews PM, Filippi M et al. Evidence of early cortical atrophy in MS: relevance to white matter changes and disability. Neurology 2003; 60: 1157-1162. Denny-Brown D. Multiple sclerosis; the clinical problem. Am.J.Med. 1952; 12: 501-509. Denny-Brown D, Brenner C. Lesion in peripheral nerve resulting from compression by spring clip. Arch Neurol Psychiatry 1944; 52: 1-19. debruyne j.

155

Dinter H, Onuffer J, Faulds D, Perez HD. Phosphodiesterase type IV inhibitors in the treatment of multiple sclerosis. J.Mol.Med. 1997; 75: 95-102. Diorio D, Welner SA, Butterworth RF, Meaney MJ, Suranyi-Cadotte BE. Peripheral benzodiazepine binding sites in Alzheimer's disease frontal and temporal cortex. Neurobiol.Aging 1991; 12: 255-258. Doble A, Malgouris C, Daniel M et al. Labelling of peripheral-type benzodiazepine binding sites in human brain with [3H]PK 11195: anatomical and subcellular distribution. Brain Res Bull 1987; 18: 49-61. Dousset V, Grossman RI, Ramer KN et al. Experimental allergic encephalomyelitis and multiple sclerosis: lesion characterization with magnetization transfer imaging. Radiology 1992; 182: 483-491. Dubois A, Benavides J, Peny B et al. Imaging of primary and remote ischaemic and excitotoxic brain lesions. An autoradiographic study of peripheral type benzodiazepine binding sites in the rat and cat. Brain Res 1988; 445: 77-90. Dyment DA, Cader MZ, Willer CJ, Risch N, Sadovnick AD, Ebers GC. A multigenerational family with multiple sclerosis. Brain 2002; 125: 1474-1482. Ebers, G. C. The geography of MS reflects genetic susceptibility. Bulman D. Neurology 36(suppl 147), 132-147. 1986. Ebers GC, Sadovnick AD, Dyment DA, Yee IM, Willer CJ, Risch N. Parent-of-origin effect in multiple sclerosis: observations in half-siblings. Lancet 2004; 363: 1773-1774. Eldadah BA, Faden AI. Caspase pathways, neuronal apoptosis, and CNS injury. J Neurotrauma 2000; 17: 811-829. Evangelou N, Esiri MM, Smith S, Palace J, Matthews PM. Quantitative pathological evidence for axonal loss in normal appearing white matter in multiple sclerosis. Ann.Neurol 2000; 47: 391-395. Fassas A, Anagnostopoulos A, Kazis A et al. Peripheral blood stem cell transplantation in the treatment of progressive multiple sclerosis: first results of a pilot study. Bone Marrow Transplant. 1997; 20: 631-638. Fassbender K, Ragoschke A, Rossol S et al. Increased release of interleukin-12p40 in MS: association with intracerebral inflammation. Neurology 1998; 51: 753-758. Fazekas F, Deisenhammer F, Strasser-Fuchs S, Nahler G, Mamoli B. Treatment effects of monthly intravenous immunoglobulin on patients with relapsing-remitting multiple sclerosis: further analyses of the Austrian Immunoglobulin in MS study. Mult.Scler. 1997; 3: 137-141. Ferguson B, Ma. Axonal damage in acute multiple sclerosis lesions. Brain 120, 393-399. 1997. 156

debruyne j.

Filippi M, Paty DW. Correlations between changes in disability and T2-weighted brain MRI activity in multiple sclerosis: a follow up study. Neurology 45, 255-260. 1995. Filippi M, Paty DW, Kappos L et al. Correlations between changes in disability and T2weighted brain MRI activity in multiple sclerosis: a follow-up study. Neurology 1995; 45: 255-260. Filippi M, Rocca MA, Martino G, Horsfield MA, Comi G. Magnetization transfer changes in the normal appearing white matter precede the appearance of enhancing lesions in patients with multiple sclerosis. Ann Neurol 1998; 43: 809-814. Firth D. The case of Augustus d'Este. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1949. Fisher E, Rudick RA, Cutter G et al. Relationship between brain atrophy and disability: an 8-year follow-up study of multiple sclerosis patients. Mult.Scler. 2000; 6: 373-377. Flugel A, Berkowicz T, Ritter T et al. Migratory activity and functional changes of green fluorescent effector cells before and during experimental autoimmune encephalomyelitis. Immunity. 2001; 14: 547-560. Fogdell-Hahn A, Ligers A, Gronning M, Hillert J, Olerup O. Multiple sclerosis: a modifying influence of HLA class I genes in an HLA class II associated autoimmune disease. Tissue Antigens 2000; 55: 140-148. Frackowiak RS, Lenzi GL, Jones T, Heather JD. Quantitative measurement of regional cerebral blood flow and oxygen metabolism in man using 15O and positron emission tomography: theory, procedure, and normal values. J Comput.Assist.Tomogr. 1980; 4: 727736. Friston KJ, Frith CD, Liddle PF, Frackowiak RS. Comparing functional (PET) images: the assessment of significant change. J Cereb Blood Flow Metab 1991; 11: 690-699. Fromann, C. Untersuchungen uber die normale und pathologische Anatomie des Ruckenmarks, zweiter Theil. 128. 1864. Jena:Fromann. Galboiz Y, Shapiro S, Lahat N, Rawashdeh H, Miller A. Matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors as markers of disease subtype and response to interferon-beta therapy in relapsing and secondary-progressive multiple sclerosis patients. Ann Neurol 2001; 50: 443-451. GAMES and the Transatlantic Multiple Sclerosis Genetics Cooperative. A meta-analysis of whole genome linkage screens in multiple sclerosis. J.Neuroimmunol.2003 143:39-46 2003. Gareau PJ, Gati JS, Menon RS et al. Reduced visual evoked responses in multiple sclerosis patients with optic neuritis: comparison of functional magnetic resonance imaging and visual evoked potentials. Mult.Scler. 1999; 5: 161-164.

debruyne j.

157

Gavish M, Bachman I, Shoukrun R et al. Enigma of the peripheral benzodiazepine receptor. Pharmacol.Rev 1999; 51: 629-650. Ge Y, Grossman RI, Udupa JK, Babb JS, Nyul LG, Kolson DL. Brain atrophy in relapsingremitting multiple sclerosis: fractional volumetric analysis of gray matter and white matter. Radiology 2001; 220: 606-610. Gebicke-Haerter PJ, Van Calker D, Norenberg W, Illes P. Molecular mechanisms of microglial activation. A. Implications for regeneration and neurodegenerative diseases. Neurochem.Int. 1996; 29: 1-12. Gehlert DR, Stephenson DT, Schober DA, Rash K, Clemens JA. Increased expression of peripheral benzodiazepine receptors in the facial nucleus following motor neuron axotomy. Neurochem Int 1997; 31: 705-713. Gerhard A, Banati RB, Goerres GB et al. [11C](R)-PK11195 PET imaging of microglial activation in multiple system atrophy. Neurology 2003; 61: 686-689. Gerhard A, Neumaier B, Elitok E et al. In vivo imaging of activated microglia using [11C]PK11195 and positron emission tomography in patients after ischemic stroke. Neuroreport 2000; 11: 2957-2960. Gimsa U, Peter SV, Lehmann K, Bechmann I, Nitsch R. Axonal damage induced by invading T cells in organotypic central nervous system tissue in vitro: involvement of microglial cells. Brain Pathol 2000; 10: 365-377. Giovannoni G, Lai M, Kidd D et al. Daily urinary neopterin excretion as an immunological marker of disease activity in multiple sclerosis. Brain 1997; 120 ( Pt 1): 1-13. Goerres GW, Revesz T, Duncan J, Banati RB. Imaging cerebral vasculitis in refractory epilepsy using [(11)C](R)-PK11195 positron emission tomography. AJR Am J Roentgenol. 2001; 176: 1016-1018. Goris A, Sawcer S, Vandenbroeck K et al. New candidate loci for multiple sclerosis susceptibility revealed by a whole genome association screen in a Belgian population. J Neuroimmunol. 2003; 143: 65-69. Greenfield JG, Carmichael EA. The Cerebro-Spinal Fluid in Clinical Diagnosis. (London:MacMillan), 272. 1925. Gronseth GS, Ashman EJ. Practice parameter: the usefulness of evoked potentials in identifying clinically silent lesions in patients with suspected multiple sclerosis (an evidence-based review): Report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology. Neurology 2000; 54: 1720-1725. Gunn RN, Lammertsma AA, Hume SP, Cunningham VJ. Parametric imaging of ligandreceptor binding in PET using a simplified reference region model. Neuroimage 1997; 6: 279-287.

158

debruyne j.

Guzman M, Sanchez C, Galve-Roperh I. Control of the cell survival/death decision by cannabinoids. J Mol.Med. 2001; 78: 613-625. Gveric D, Hanemaaijer R, Newcombe J, van Lent NA, Sier CF, Cuzner ML. Plasminogen activators in multiple sclerosis lesions: implications for the inflammatory response and axonal damage. Brain 2001; 124: 1978-1988. Hailer NP, Heppner FL, Haas D, Nitsch R. Astrocytic factors deactivate antigen presenting cells that invade the central nervous system. Brain Pathol 1998; 8: 459-474. Hartung HP, Gonsette R, Konig N et al. Mitoxantrone in progressive multiple sclerosis: a placebo-controlled, double-blind, randomised, multicentre trial. Lancet 2002; 360: 20182025. Hayes GM, Woodroofe MN, Cuzner ML. Microglia are the major cell type expressing MHC class II in human white matter. J Neurol.Sci. 1987; 80: 25-37. Hellings N, Baree M, Verhoeven C et al. T-cell reactivity to multiple myelin antigens in multiple sclerosis patients and healthy controls. J Neurosci.Res. 2001; 63: 290-302. Hensiek AE, Sawcer SJ, Feakes R et al. HLA-DR 15 is associated with female sex and younger age at diagnosis in multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg.Psychiatry 2002; 72: 184-187. Hickey WF, Vass K, Lassmann H. Bone marrow-derived elements in the central nervous system: an immunohistochemical and ultrastructural survey of rat chimeras. J Neuropathol.Exp.Neurol 1992; 51: 246-256. Hummel V, Kallmann BA, Wagner S et al. Production of MMPs in human cerebral endothelial cells and their role in shedding adhesion molecules. J Neuropathol.Exp.Neurol 2001; 60: 320-327. Huseby ES, Liggitt D, Brabb T, Schnabel B, Ohlen C, Goverman J. A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells in a model for multiple sclerosis. J Exp.Med. 2001; 194: 669-676. Husted CA, Goodin DS Hugg JW Maudsley AA Tsuruda JS de Bie SH et al. Biochemical aletrations in multiple sclerosis lesions and normal-appearing white matter detected by in vivo 31P and1H spectroscopic imaging. Ann Neurol 36, 157-165. 1994. Huxley AF, Stämpfli R. Evidence for saltatory conduction in perpheral myelinated nerve fibres. J Physiol 1949; 108: 315-339. Iglesias A, Bauer J, Litzenburger T, Schubart A, Linington C. T- and B-cell responses to myelin oligodendrocyte glycoprotein in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Glia 2001; 36: 220-234. Isaac C, Li DK, Genton M et al. Multiple sclerosis: a serial study using MRI in relapsing patients. Neurology 1988; 38: 1511-1515. debruyne j.

159

Jacobs LD, Beck RW, Simon JH et al. Intramuscular interferon beta-1a therapy initiated during a first demyelinating event in multiple sclerosis. CHAMPS Study Group. N.Engl.J Med. 2000; 343: 898-904. Jacobs LD, Cookfair DL, Rudick RA et al. A phase III trial of intramuscular recombinant interferon beta as treatment for exacerbating-remitting multiple sclerosis: design and conduct of study and baseline characteristics of patients. Multiple Sclerosis Collaborative Research Group (MSCRG). Mult.Scler. 1995; 1: 118-135. Jeffery D, Alshami E. Allogenic bone marrow transplantation in multiple sclerosis. Neurology 50, A:147. 1998. Johnson, K. P. Copolymer 1 reduces relapse rate and improves disability in relapsingremitting multiple sclerosis. Results of a phase III multicenter, double-blind, placebocontrolled trial. Neurology 45, 1268-1276. 1995. Johnson MD, Wang JK, Morgan JI, Spector S. Downregulation of [3H]Ro5-4864 binding sites after exposure to peripheral-type benzodiazepines in vitro. J Pharmacol Exp Ther 1986; 238: 855-859. Jonsson C, Pagani M, Johansson L, Thurfjell L, Jacobsson H, Larsson SA. Reproducibility and repeatability of 99Tcm-HMPAO rCBF SPET in normal subjects at rest using brain atlas matching. Nucl Med Commun 2000; 21: 9-18. Junck L, Olson JM, Ciliax BJ et al. PET imaging of human gliomas with ligands for the peripheral benzodiazepine binding site. Ann Neurol 1989; 26: 752-758. Jurewicz A, Biddison WE, Antel JP. MHC class I-restricted lysis of human oligodendrocytes by myelin basic protein peptide-specific CD8 T lymphocytes. J Immunol. 1998; 160: 3056-3059. Kalkers NF, Bergers E, Castelijns JA et al. Optimizing the association between disability and biological markers in MS. Neurology 2001; 57: 1253-1258. Kalman B, Lublin FD. Cytokine therapy. In: Zhang j, Hafler D Hohfeld R Miller A editors. Immunotherapy in neuroimmunologic diseases. 2004. UK: Martin Dunitz Ltd;1998. pp. 261-278. Karaszewski JW, Reder AT, Anlar B, Arnason GW. Increased high affinity beta-adrenergic receptor densities and cyclic AMP responses of CD8 cells in multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 1993; 43: 1-7. Karp CL, Boxel-Dezaire AH, Byrnes AA, Nagelkerken L. Interferon-beta in multiple sclerosis: altering the balance of interleukin-12 and interleukin-10? Curr.Opin.Neurol 2001; 14: 361-368. Kesselring J. The pathogenesis of multiple sclerosis. Schweiz Med Wochenschr 1990; 120: 1083-1090.

160

debruyne j.

Kimberlin DW, Whitley RJ. Human herpesvirus-6: neurologic implications of a newlydescribed viral pathogen. J Neurovirol. 1998; 4: 474-485. Kish SJ, Sperk G, Hornykiewicz O. Alterations in benzodiazepine and GABA receptor binding in rat brain following systemic injection of kainic acid. Neuropharmacology 1983; 22: 1303-1309. Kreutzberg GW. Microglia: a sensor for pathological events in the CNS. Trends Neurosci. 1996; 19: 312-318. Kumlien E, Hilton-Brown P, Spannare B, Gillberg PG. In vitro quantitative autoradiography of [3H]-L-deprenyl and [3H]-PK 11195 binding sites in human epileptic hippocampus. Epilepsia 1992; 33: 610-617. Kurtzke JF. Epidemiologic contributions to multiple sclerosis: an overview. Neurology 1980; 30: 61-79. Kurtzke JF. Rating neurologic impairment in multiple sclerosis: an expanded disability status scale (EDSS). Neurology 1983; 33: 1444-1452. Kurtzke JF, Hyllested K. Multiple sclerosis in the Faroe Islands: I. Clinical and epidemiological features. Ann.Neurol 1979; 5: 6-21. Laird HE, Gerrish KE, Duerson KC, Putnam CW, Russell DH. Peripheral benzodiazepine binding sites in Nb 2 node lymphoma cells: effects on prolactin-stimulated proliferation and ornithine decarboxylase activity. Eur.J Pharmacol. 1989; 171: 25-35. Lammertsma AA, Brooks DJ, Frackowiak RS et al. Measurement of glucose utilisation with [18F]2-fluoro-2-deoxy-D-glucose: a comparison of different analytical methods. J Cereb.Blood Flow Metab 1987; 7: 161-172. Lammertsma AA, Hume SP. Simplified reference tissue model for PET receptor studies. Neuroimage. 1996; 4: 153-158. Larhammar D, Schenning L, Gustafsson K et al. Complete amino acid sequence of an HLA-DR antigen-like beta chain as predicted from the nucleotide sequence: similarities with immunoglobulins and HLA-A, -B, and -C antigens. Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 1982; 79: 3687-3691. Lassmann H. Comparative Neuropathology of Chronic Experimental Encephalomyelitis and Multiple Sclerosis. Berlin: Springer, 1983.

Allergic

Lassmann H, Bruck W, Lucchinetti C. Heterogeneity of multiple sclerosis pathogenesis: implications for diagnosis and therapy. Trends Mol.Med. 2001; 7: 115-121. Lawson LJ, Perry VH, Dri P, Gordon S. Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain. Neuroscience 1990; 39: 151-170.

debruyne j.

161

Lee MA, Palace J, Stabler G, Ford J, Gearing A, Miller K. Serum gelatinase B, TIMP-1 and TIMP-2 levels in multiple sclerosis. A longitudinal clinical and MRI study. Brain 1999; 122 ( Pt 2): 191-197. Lehmann PV, Forsthuber T, Miller A, Sercarz EE. Spreading of T-cell autoimmunity to cryptic determinants of an autoantigen. Nature 1992; 358: 155-157. Leppert D, Ford J, Stabler G et al. Matrix metalloproteinase-9 (gelatinase B) is selectively elevated in CSF during relapses and stable phases of multiple sclerosis. Brain 1998; 121 ( Pt 12): 2327-2334. Leppert D, Waubant E, Burk MR, Oksenberg JR, Hauser SL. Interferon beta-1b inhibits gelatinase secretion and in vitro migration of human T cells: a possible mechanism for treatment efficacy in multiple sclerosis. Ann Neurol 1996; 40: 846-852. Li C, Tropak MB, Gerlai R et al. Myelination in the absence of myelin-associated glycoprotein. Nature 1994; 369: 747-750. Li H, Cuzner ML, Newcombe J. Microglia-derived macrophages in early multiple sclerosis plaques. Neuropathol.Appl.Neurobiol. 1996; 22: 207-215. Lichtinghagen R, Seifert T, Kracke A, Marckmann S, Wurster U, Heidenreich F. Expression of matrix metalloproteinase-9 and its inhibitors in mononuclear blood cells of patients with multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 1999; 99: 19-26. Liedtke W, Cannella B, Mazzaccaro RJ et al. Effective treatment of models of multiple sclerosis by matrix metalloproteinase inhibitors. Ann Neurol 1998; 44: 35-46. Lindberg RL, De Groot CJ, Montagne L et al. The expression profile of matrix metalloproteinases (MMPs) and their inhibitors (TIMPs) in lesions and normal appearing white matter of multiple sclerosis. Brain 2001; 124: 1743-1753. Linker R. CNTF-deficiency deteriorates clinical course and histopathology in a murine model of experimental autoimmune encephalomyelitis: a neurotrophic factor as outcome determinator of neuroinflammation. Gaupp S, Holtmann B et al. Neurology 56(suppl 3):A67. 2004. Lisak RP. Intravenous immunoglobulins in multiple sclerosis. Neurology 1998; 51: S25S29. Liu C, Edwards S, Gong Q, Roberts N, Blumhardt LD. Three dimensional MRI estimates of brain and spinal cord atrophy in multiple sclerosis. J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry 1999; 66: 323-330. Lockhart A, Davis B, Matthews JC et al. The peripheral benzodiazepine receptor ligand PK11195 binds with high affinity to the acute phase reactant alpha1-acid glycoprotein: implications for the use of the ligand as a CNS inflammatory marker. Nucl.Med.Biol. 2003; 30: 199-206.

162

debruyne j.

Loevner LA, Grossman RI, Cohen JA, Lexa FJ, Kessler D, Kolson DL. Microscopic disease in normal-appearing white matter on conventional MR images in patients with multiple sclerosis: assessment with magnetization-transfer measurements. Radiology 1995; 196: 511-515. Louis JC, Magal E, Takayama S, Varon S. CNTF protection of oligodendrocytes against natural and tumor necrosis factor-induced death. Science 1993; 259: 689-692. Lu P, Wang YL, Linsley PS. Regulation of self-tolerance by CD80/CD86 interactions. Curr.Opin.Immunol. 1997; 9: 858-862. Lublin FD, Reingold SC. Defining the clinical course of multiple sclerosis: results of an international survey. National Multiple Sclerosis Society (USA) Advisory Committee on Clinical Trials of New Agents in Multiple Sclerosis. Neurology 1996; 46: 907-911. Lucchinetti, C Bruck W Parisi J et al. Heterogeneity of multiple sclerosis lesions: implications for the pathogenesis of demyelination. Ann Neurol 47, 707-717. 2000. Lucchinetti CF, Bruck W, Rodriguez M, Lassmann H. Distinct patterns of multiple sclerosis pathology indicates heterogeneity on pathogenesis. Brain Pathol 1996; 6: 259-274. Lycke JN, Karlsson JE, Andersen O, Rosengren LE. Neurofilament protein in cerebrospinal fluid: a potential marker of activity in multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1998; 64: 402-404. Maeda A, Sobel RA. Matrix metalloproteinases in the normal human central nervous system, microglial nodules, and multiple sclerosis lesions. J Neuropathol.Exp.Neurol 1996; 55: 300-309. Makhlouf K, Weiner HL, Khoury SJ. Increased percentage of IL-12+ monocytes in the blood correlates with the presence of active MRI lesions in MS. J Neuroimmunol. 2001; 119: 145-149. Marangos PJ, Patel J, Boulenger JP, Clark-Rosenberg R. Characterization of peripheraltype benzodiazepine binding sites in brain using [3H]Ro 5-4864. Mol.Pharmacol. 1982; 22: 26-32. Marburg O. Die sogenannte "akute Multiple Sclerose"(Encephalomyelitis periaxialis scleroticans). Jahrb Psychiatr Neurol(Leipzig) 1906; 27: 213-312. Marie P. Lectures on the Diseases of the Spinal Cord. Trans.Lubbock M.London (New Sydenham Society), 134-136. 1895. Marrosu MG, Murru R, Murru MR et al. Dissection of the HLA association with multiple sclerosis in the founder isolated population of Sardinia. Hum.Mol.Genet. 2001; 10: 29072916. Massova I, Kotra LP, Fridman R, Mobashery S. Matrix metalloproteinases: structures, evolution, and diversification. FASEB J 1998; 12: 1075-1095. debruyne j.

163

McDonald WI. Rachelle Fishman-Matthew Moore Lecture. The pathological and clinical dynamics of multiple sclerosis. J Neuropathol.Exp.Neurol 1994; 53: 338-343. McDonald WI, Compston A, Edan G et al. Recommended diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines from the International Panel on the diagnosis of multiple sclerosis. Ann.Neurol. 2001; 50: 121-127. McGeer PL, Kawamata T, Walker DG, Akiyama H, Tooyama I, McGeer EG. Microglia in degenerative neurological disease. Glia 1993; 7: 84-92. McLeod JG, Hammond SR, Hallpike JF. Epidemiology of multiple sclerosis in Australia. With NSW and SA survey results. Med.J Aust. 1994; 160: 117-122. Medana IM, Gallimore A, Oxenius A, Martinic MM, Wekerle H, Neumann H. MHC class I-restricted killing of neurons by virus-specific CD8+ T lymphocytes is effected through the Fas/FasL, but not the perforin pathway. Eur.J Immunol. 2000; 30: 3623-3633. Mertz PM, DeWitt DL, Stetler-Stevenson WG, Wahl LM. Interleukin 10 suppression of monocyte prostaglandin H synthase-2. Mechanism of inhibition of prostaglandin-dependent matrix metalloproteinase production. J Biol.Chem. 1994; 269: 21322-21329. Messmer K, Reynolds GP. Increased peripheral benzodiazepine binding sites in the brain of patients with Huntington's disease. Neurosci Lett 1998; 241: 53-56. Mestre M, Carriot T, Belin C et al. Electrophysiological and pharmacological characterization of peripheral benzodiazepine receptors in a guinea pig heart preparation. Life Sci 1984; 35: 953-962. Mikolajczyk K, Szabatin M, Rudnicki P, Grodzki M, Burger C. A JAVA environment for medical image data analysis: initial application for brain PET quantitation. Med Inform.(Lond) 1998; 23: 207-214. Miller DH, Khan OA, Sheremata WA et al. A controlled trial of natalizumab for relapsing multiple sclerosis. N.Engl.J Med. 2003; 348: 15-23. Miller SD, McRae BL, Vanderlugt CL et al. Evolution of the T-cell repertoire during the course of experimental immune-mediated demyelinating diseases. Immunol.Rev. 1995; 144: 225-244. Moreau T, Thorpe J, Miller D et al. Preliminary evidence from magnetic resonance imaging for reduction in disease activity after lymphocyte depletion in multiple sclerosis. Lancet 1994; 344: 298-301. Murray IP, Ell PJ. Nuclear Medecine in Clinical Diagnosis and Treatment. Churchill Livingstone Inc.

1998.

Myers R, Banati RB, Paulesu E, Thorpe J, Miller DH, Jones T. Use of two-and three dimensional PET and [11C](R)-PK11195 to image focal and regional brain pathology. In:

164

debruyne j.

Carson RE, Daube-Witherspoon ME, Herscovitch P, editors. Quantitative Functional Brain Imaging with Positron Emission Tomography. New York: Academic Press, 1998: 195-200. Myers, R., Gunn, R. N., Cunningham, V. J., Banati, R. B., and Jones, T. Cluster analysis and the reference tissue model in the analysis of clinical [11C]PK11195 PET. J Cereb Blood Flow Metab 19(S1), S789. 1999. Myers R, Manjil LG, Cullen BM, Price GW, Frackowiak RS, Cremer JE. Macrophage and astrocyte populations in relation to [3H]PK 11195 binding in rat cerebral cortex following a local ischaemic lesion. J Cereb Blood Flow Metab 1991; 11: 314-322. Myhr KM, Riise T, Vedeler C et al. Disability and prognosis in multiple sclerosis: demographic and clinical variables important for the ability to walk and awarding of disability pension. Mult.Scler. 2001; 7: 59-65. Narayanan S, Fu L, Pioro E et al. Imaging of axonal damage in multiple sclerosis: spatial distribution of magnetic resonance imaging lesions. Ann.Neurol. 1997; 41: 385-391. Nesbit GM, Forbes GS, Scheithauer BW, Okazaki H, Rodriguez M. Multiple sclerosis: histopathologic and MR and/or CT correlation in 37 cases at biopsy and three cases at autopsy. Radiology 1991; 180: 467-474. Nicoletti F, Patti F, Cocuzza C et al. Elevated serum levels of interleukin-12 in chronic progressive multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 1996; 70: 87-90. Nijeholt GJ, van Walderveen MA, Castelijns JA et al. Brain and spinal cord abnormalities in multiple sclerosis. Correlation between MRI parameters, clinical subtypes and symptoms. Brain 1998; 121: 687-697. Noseworthy JH, Lucchinetti C, Rodriguez M, Weinshenker BG. Multiple sclerosis. N.Engl.J Med. 2000a; 343: 938-952. Noseworthy JH, O'Brien PC, Weinshenker BG et al. IV immunoglobulin does not reverse established weakness in MS. Neurology 2000b; 55: 1135-1143. O'Riordan JI, Thompson AJ, Kingsley DP et al. The prognostic value of brain MRI in clinically isolated syndromes of the CNS. A 10-year follow-up. Brain 1998; 121 ( Pt 3): 495-503. Ochi H, Osoegawa M, Wu XM et al. Increased IL-13 but not IL-5 production by CD4positive T cells and CD8-positive T cells in multiple sclerosis during relapse phase. J Neurol Sci 2002; 201: 45-51. Oger J, Vorobeychik G Al-Fahim A et al. Neutralizing antibodies in betaseron-treated MS patients and in vitro immune function before treatment. Neurology 48, A80. 1997. Opdenakker G, Nelissen I, Van Damme J. Functional roles and therapeutic targeting of gelatinase B and chemokines in multiple sclerosis. Lancet Neurol 2003; 2: 747-756. debruyne j.

165

Owens T, Wekerle H, Antel J. Genetic models for CNS inflammation. Nat.Med. 2001; 7: 161-166. Panitch, H. S. Bever C. T. J. Katz E. and Johnson K. P. Upper respiratory infections trigger attacks of multiple sclerosis in patients treated with with interferon-ß. J.Neuroimmunol. 35(suppl. 1), 125. 1991. Pappata S, Levasseur M, Gunn RN et al. Thalamic microglial activation in ischemic stroke detected in vivo by PET and [11C]PK1195. Neurology 2000; 55: 1052-1054. Paty DW, Li DK. Interferon beta-1b is effective in relapsing-remitting multiple sclerosis. II. MRI analysis results of a multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial. UBC MS/MRI Study Group and the IFNB Multiple Sclerosis Study Group. Neurology 1993; 43: 662-667. Paulesu E, Perani D, Fazio F et al. Functional basis of memory impairment in multiple sclerosis: a[18F]FDG PET study. Neuroimage. 1996; 4: 87-96. Phillips JT. Regression analysis of multiple sclerosis population data predicts multigenic interaction and minor combined effects of HLA and T-cell receptor genes (abstr). Neurology 43(suppl 2), 205. 1993. Piert M, Koeppe RA, Giordani B, Berent S, Kuhl DE. Diminished glucose transport and phosphorylation in Alzheimer's disease determined by dynamic FDG-PET. J Nucl.Med. 1996; 37: 201-208. Pirmohamed M, Winstanley P. Hepatitis B vaccine and neurotoxicity. Postgrad.Med.J 1997; 73: 462-463. Pitt D, Werner P, Raine CS. Glutamate excitotoxicity in a model of multiple sclerosis. Nat.Med. 2000; 6: 67-70. Porcelli SA, Modlin RL. The CD1 system: antigen-presenting molecules for T cell recognition of lipids and glycolipids. Annu.Rev Immunol. 1999; 17: 297-329. Poser CM, Paty DW, Scheinberg L et al. New diagnostic criteria for multiple sclerosis: guidelines for research protocols. Ann Neurol 1983; 13: 227-231. Putman TJ. Evidence of vascular occlusion in multiple sclerosis and "encephalomyelitis.". Arch Neurol Psychiatry 37, 1298-1321. 1937. Quincke H. Die Lumbar punktion des Hydrocephalus. Klin Wochenschr 20, 929-933. 1891. Raff MC. Glial cell diversification in the rat optic nerve. Science 1989; 243: 1450-1455. Raine CS. Multiple sclerosis: immune system molecule expression in the central nervous system. J Neuropathol.Exp.Neurol 1994a; 53: 328-337.

166

debruyne j.

Raine CS. The Dale E. McFarlin Memorial Lecture: the immunology of the multiple sclerosis lesion. Ann.Neurol. 1994b; 36 Suppl: S61-S72. Ramsay SC, Weiller C, Myers R et al. Monitoring by PET of macrophage accumulation in brain after ischaemic stroke. Lancet 1992; 339: 1054-1055. Rao VL, Butterworth RF. Characterization of binding sites for the omega3 receptor ligands [3H]PK11195 and [3H]RO5-4864 in human brain. Eur.J Pharmacol. 1997; 340: 89-99. Reddy H, Narayanan S, Arnoutelis R et al. Evidence for adaptive functional changes in the cerebral cortex with axonal injury from multiple sclerosis. Brain 2000; 123 ( Pt 11): 23142320. Reder AT, Genc K, Byskosh PV, Porrini AM. Monocyte activation in multiple sclerosis. Mult.Scler. 1998; 4: 162-168. Redwine JM, Buchmeier MJ, Evans CF. In vivo expression of major histocompatibility complex molecules on oligodendrocytes and neurons during viral infection. Am J Pathol 2001; 159: 1219-1224. Riahi F, Zijdenbos A, Narayanan S et al. Improved correlation between scores on the expanded disability status scale and cerebral lesion load in relapsing-remitting multiple sclerosis. Results of the application of new imaging methods. Brain 1998; 121 ( Pt 7): 1305-1312. Rice GP, Paszner B, Oger J, Lesaux J, Paty D, Ebers G. The evolution of neutralizing antibodies in multiple sclerosis patients treated with interferon beta-1b. Neurology 1999; 52: 1277-1279. Rieckmann P, Albrecht M, Kitze B et al. Tumor necrosis factor-alpha messenger RNA expression in patients with relapsing-remitting multiple sclerosis is associated with disease activity. Ann Neurol 1995; 37: 82-88. Rieckmann P, Altenhofen B, Riegel A, Baudewig J, Felgenhauer K. Soluble adhesion molecules (sVCAM-1 and sICAM-1) in cerebrospinal fluid and serum correlate with MRI activity in multiple sclerosis. Ann Neurol 1997; 41: 326-333. Rieckmann P, Martin S, Weichselbraun I et al. Serial analysis of circulating adhesion molecules and TNF receptor in serum from patients with multiple sclerosis: cICAM-1 is an indicator for relapse. Neurology 1994; 44: 2367-2372. Rindfleisch E. Histologisches Detail zu der grauen Degeneration von Gehirn und Ruckenmark.(Zugleich ein Beitrag zu der Lehre von der Entstehung und Verwandlung der Zelle.). Arch Pathol Anat Physiol Klin 26, 474-483. 1863. Risch N. Linkage strategies for genetically complex traits. I. Multilocus models. Am J Hum.Genet. 1990; 46: 222-228.

debruyne j.

167

Rodriguez M, Lennon VA. Immunoglobulins promote remyelination in the central nervous system. Ann Neurol 1990; 27: 12-17. Rodriguez M, Lennon VA, Benveniste EN, Merrill JE. Remyelination by oligodendrocytes stimulated by antiserum to spinal cord. J Neuropathol.Exp.Neurol 1987; 46: 84-95. Rodriguez M, Scheithauer B. Ultrastructure of multiple sclerosis. Ultrastruct.Pathol 1994; 18: 3-13. Roelcke U, Kappos L, Lechner-Scott J et al. Reduced glucose metabolism in the frontal cortex and basal ganglia of multiple sclerosis patients with fatigue: a 18Ffluorodeoxyglucose positron emission tomography study. Neurology 1997; 48: 1566-1571. Rooney WD, Goodkin DE, Schuff N, Meyerhoff DJ, Norman D, Weiner MW. 1H MRSI of normal appearing white matter in multiple sclerosis. Mult.Scler. 1997; 3: 231-237. Rubio JP, Bahlo M, Butzkueven H et al. Genetic dissection of the human leukocyte antigen region by use of haplotypes of Tasmanians with multiple sclerosis. Am J Hum.Genet. 2002; 70: 1125-1137. Rudick, R. Use of the Multiple Sclerosis Functional Composite to predict disability in relapsing MS. Cutter G, Baier M et al. Neurology 56, 1324-1330. 2001. Rudick RA, Fisher E, Lee JC, Simon J, Jacobs L. Use of the brain parenchymal fraction to measure whole brain atrophy in relapsing-remitting MS. Multiple Sclerosis Collaborative Research Group. Neurology 1999; 53: 1698-1704. Ruff MR, Pert CB, Weber RJ, Wahl LM, Wahl SM, Paul SM. Benzodiazepine receptormediated chemotaxis of human monocytes. Science 1985; 229: 1281-1283. Sadovnick AD, Baird PA. The familial nature of multiple sclerosis: age-corrected empiric recurrence risks for children and siblings of patients. Neurology 1988; 38: 990-991. Sadovnick AD, Ebers GC. Epidemiology of multiple sclerosis: a critical overview. Can.J Neurol Sci 1993; 20: 17-29. Sadovnick AD, Ebers GC, Dyment DA, Risch NJ. Evidence for genetic basis of multiple sclerosis. The Canadian Collaborative Study Group. Lancet 1996; 347: 1728-1730. Saindane AM, Ge Y, Udupa JK, Babb JS, Mannon LJ, Grossman RI. The effect of gadolinium-enhancing lesions on whole brain atrophy in relapsing-remitting MS. Neurology 2000; 55: 61-65. Sarchielli P, Orlacchio A, Vicinanza F et al. Cytokine secretion and nitric oxide production by mononuclear cells of patients with multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 1997; 80: 76-86. Schlumpf M, Parmar R, Lichtensteiger W. Prenatal diazepam induced persisting downregulation of peripheral (omega 3) benzodiazepine receptors on rat splenic macrophages. Life Sci. 1993; 52: 927-934. 168

debruyne j.

Schoemaker H, Morelli M, Deshmukh P, Yamamura HI. [3H]Ro5-4864 benzodiazepine binding in the kainate lesioned striatum and Huntington's diseased basal ganglia. Brain Res. 1982; 248: 396-401. Schonrock LM, Kuhlmann T, Adler S, Bitsch A, Bruck W. Identification of glial cell proliferation in early multiple sclerosis lesions. Neuropathol.Appl.Neurobiol. 1998; 24: 320-330. Schumacher GA. Problems of multiple sclerosis. N.Y.State J.Med. 1966; 66: 1743-1752. Schumacher GA. Critique of experimental trials of therapy in multiple sclerosis. Neurology 1974; 24: 1010-1014. Schwartz GG. Multiple sclerosis and prostate cancer: what do their similar geographies suggest? Neuroepidemiology 1992; 11: 244-254. Scolding N. New cells from old. Lancet 2001; 357: 329-330. Sellebjerg F, Sorensen TL. Chemokines and matrix metalloproteinase-9 in leukocyte recruitment to the central nervous system. Brain Res.Bull. 2003; 61: 347-355. Sette G, Baron JC, Young AR et al. In vivo mapping of brain benzodiazepine receptor changes by positron emission tomography after focal ischemia in the anesthetized baboon. Stroke 1993; 24: 2046-2057. Silber E, Semra YK, Gregson NA, Sharief MK. Patients with progressive multiple sclerosis have elevated antibodies to neurofilament subunit. Neurology 2002; 58: 1372-1381. Simon JH, Jacobs LD, Campion MK et al. A longitudinal study of brain atrophy in relapsing multiple sclerosis. The Multiple Sclerosis Collaborative Research Group (MSCRG). Neurology 1999; 53: 139-148. Smith KJ, Kapoor R, Hall SM, Davies M. Electrically active axons degenerate when exposed to nitric oxide. Ann Neurol 2001; 49: 470-476. Sorensen JC, Dalmau I, Zimmer J, Finsen B. Microglial reactions to retrograde degeneration of tracer-identified thalamic neurons after frontal sensorimotor cortex lesions in adult rats. Exp Brain Res 1996; 112: 203-212. Sriram S, Rodriguez M. Indictment of the microglia as the villain in multiple sclerosis. Neurology 1997; 48: 464-470. Starosta-Rubinstein S, Ciliax BJ, Penney JB, McKeever P, Young AB. Imaging of a glioma using peripheral benzodiazepine receptor ligands. Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 1987; 84: 891895. Stefano GB, Liu Y, Goligorsky MS. Cannabinoid receptors are coupled to nitric oxide release in invertebrate immunocytes, microglia, and human monocytes. J Biol.Chem. 1996; 271: 19238-19242. debruyne j.

169

Steinman L. Some misconceptions about understanding autoimmunity through experiments with knockouts. J Exp.Med. 1997; 185: 2039-2041. Streit WJ, Kreutzberg GW. Response of endogenous glial cells to motor neuron degeneration induced by toxic ricin. J Comp Neurol 1988; 268: 248-263. Sun D, Whitaker JN, Huang Z et al. Myelin antigen-specific CD8+ T cells are encephalitogenic and produce severe disease in C57BL/6 mice. J Immunol. 2001; 166: 7579-7587. Sun X, Tanaka M, Kondo S, Okamoto K, Hirai S. Clinical significance of reduced cerebral metabolism in multiple sclerosis: a combined PET and MRI study. Ann Nucl.Med. 1998; 12: 89-94. Sutin J, Shao Y. Resting and reactive astrocytes express adrenergic receptors in the adult rat brain. Brain Res.Bull. 1992; 29: 277-284. Thoua NM, van Noort JM, Baker D et al. Encephalitogenic and immunogenic potential of the stress protein alphaB-crystallin in Biozzi ABH (H-2A(g7)) mice. J Neuroimmunol. 2000; 104: 47-57. Tintoré M, Rovira A Martinez M et al. Isolated demyelinating syndrmes: comparison of different MR imaging criteria to predict conversion to clincally definite multiple sclerosis. Am J Neuroradiol 21, 702-706. 2000. Tortorella C, Viti B, Bozzali M et al. A magnetization transfer histogram study of normalappearing brain tissue in MS. Neurology 2000; 54: 186-193. Tosti ME, Traversa G, Bianco E, Mele A. Multiple sclerosis and vaccination against hepatitis B: analysis of risk benefit profile. Ital.J Gastroenterol.Hepatol. 1999; 31: 388-391. Trapp BD, Peterson J, Ransohoff RM, Rudick R, Mork S, Bo L. Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis. N.Engl.J Med 1998; 338: 278-285. Trebst C, Ransohoff RM. Investigating chemokines and chemokine receptors in patients with multiple sclerosis: opportunities and challenges. Arch Neurol 2001; 58: 1975-1980. Tremlett HL, Luscombe DK, Wiles CM. Use of corticosteroids in multiple sclerosis by consultant neurologists in the United Kingdom. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1998; 65: 362-365. Trojano M, Avolio C, Liuzzi GM et al. Changes of serum sICAM-1 and MMP-9 induced by rIFNbeta-1b treatment in relapsing-remitting MS. Neurology 1999; 53: 1402-1408. Truyen L, van Waesberghe JH, van Walderveen MA et al. Accumulation of hypointense lesions ("black holes") on T1 spin-echo MRI correlates with disease progression in multiple sclerosis. Neurology 1996; 47: 1469-1476.

170

debruyne j.

Tuohy VK, Sobel RA, Lees MB. Myelin proteolipid protein-induced experimental allergic encephalomyelitis. Variations of disease expression in different strains of mice. J Immunol. 1988; 140: 1868-1873. Turner MR, Cagnin A, Turkheimer FE et al. Evidence of widespread cerebral microglial activation in amyotrophic lateral sclerosis: an [11C](R)-PK11195 positron emission tomography study. Neurobiol.Dis. 2004; 15: 601-609. Vaday GG, Schor H, Rahat MA, Lahat N, Lider O. Transforming growth factor-beta suppresses tumor necrosis factor alpha-induced matrix metalloproteinase-9 expression in monocytes. J Leukoc.Biol. 2001; 69: 613-621. Valentiner W. Ueber die Sclerose des Gehirns and Ruckenmarks. Dtsch Klin 1856; 8: 147151. van Buchem MA, Grossman RI, Armstrong C et al. Correlation of volumetric magnetization transfer imaging with clinical data in MS. Neurology 1998; 50: 1609-1617. van Buchem MA, McGowan JC, Kolson DL, Polansky M, Grossman RI. Quantitative volumetric magnetization transfer analysis in multiple sclerosis: estimation of macroscopic and microscopic disease burden. Magn Reson.Med. 1996; 36: 632-636. Van Laere K, Versijpt J, Audenaert K et al. 99mTc-ECD brain perfusion SPET: variability, asymmetry and effects of age and gender in healthy adults. Eur.J Nucl.Med. 2001; 28: 873887. van Oosten BW, Barkhof F, Truyen L et al. Increased MRI activity and immune activation in two multiple sclerosis patients treated with the monoclonal anti-tumor necrosis factor antibody cA2. Neurology 1996; 47: 1531-1534. van Oosten BW, Lai M, Hodgkinson S et al. Treatment of multiple sclerosis with the monoclonal anti-CD4 antibody cM-T412: results of a randomized, double-blind, placebocontrolled, MR-monitored phase II trial. Neurology 1997; 49: 351-357. Villar LM, Masjuan J, Gonzalez-Porque P et al. Intrathecal IgM synthesis predicts the onset of new relapses and a worse disease course in MS. Neurology 2002; 59: 555-559. Villar LM, Masjuan J, Gonzalez-Porque P et al. Intrathecal IgM synthesis is a prognostic factor in multiple sclerosis. Ann Neurol 2003; 53: 222-226. Villoslada P, Juste C, Tintore M et al. The immune response against herpesvirus is more prominent in the early stages of MS. Neurology 2003; 60: 1944-1948. Vowinckel E, Reutens D, Becher B et al. PK11195 binding to the peripheral benzodiazepine receptor as a marker of microglia activation in multiple sclerosis and experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci.Res. 1997; 50: 345-353.

debruyne j.

171

Wandinger KP, Lunemann JD, Wengert O et al. TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) as a potential response marker for interferon-beta treatment in multiple sclerosis. Lancet 2003; 361: 2036-2043. Waubant E, Gee L, Bacchetti P et al. Relationship between serum levels of IL-10, MRI activity and interferon beta-1a therapy in patients with relapsing remitting MS. J Neuroimmunol. 2001; 112: 139-145. Wekerle H, Kojima K, Lannes-Vieira J, Lassmann H, Linington C. Animal models. Ann.Neurol 1994; 36 Suppl: S47-S53. Whitaker JN, Wolinsky JS, Narayana PA et al. Relationship of urinary myelin basic protein-like material with cranial magnetic resonance imaging in advanced multiple sclerosis. Arch Neurol 2001; 58: 49-54. Whitwell JL, Crum WR, Watt HC, Fox NC. Normalization of cerebral volumes by use of intracranial volume: implications for longitudinal quantitative MR imaging. AJNR Am.J Neuroradiol. 2001; 22: 1483-1489. Wilson MA. (Textbook of Nuclear Medicine). 1998. Raven Press. Windhagen A, Newcombe J, Dangond F et al. Expression of costimulatory molecules B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), and interleukin 12 cytokine in multiple sclerosis lesions. J Exp.Med. 1995; 182: 1985-1996. Wingerchuk DM, Weinshenker BG. Multiple sclerosis: epidemiology, genetics, classification, natural history, and clinical outcome measures. Neuroimaging Clin.N.Am 2000; 10: 611-624. Wolff SD, Balaban RS. Magnetization transfer contrast (MTC) and tissue water proton relaxation in vivo. Magn Reson.Med. 1989; 10: 135-144. Woods MJ, Williams DC. Multiple forms and locations for the peripheral-type benzodiazepine receptor. Biochem Pharmacol 1996; 52: 1805-1814. Yin X, Crawford TO, Griffin JW et al. Myelin-associated glycoprotein is a myelin signal that modulates the caliber of myelinated axons. J.Neurosci. 1998; 18: 1953-1962. Young IR, Hall AS, Pallis CA, Legg NJ, Bydder GM, Steiner RE. Nuclear magnetic resonance imaging of the brain in multiple sclerosis. Lancet 1981; 2: 1063-1066. Yousry TA, Berry I, Filippi M. Functional magnetic resonance imaging in multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1998; 64 Suppl 1: S85-S87. Zaffaroni M, Stampino LG, Ghezzi A, Baldini SM, Zibetti A. In vitro cytokine, sCD23 and IgG secretion in multiple sclerosis. J Neuroimmunol. in experimental allergic encephalomyelitis. Annu.Rev Immunol. 1990; 8: 579-621.

172

debruyne j.

Zavala F, Lenfant M. Peripheral benzodiazepines enhance the respiratory burst of macrophage-like P388D1 cells stimulated by arachidonic acid. Int.J Immunopharmacol. 1987; 9: 269-274. Ziaber J, Pasnik J, Baj Z, Pokoca L, Chmielewski H, Tchorzewski H. Tumor necrosis factor-alpha binding by peripheral blood lymphocytes and polymorphonuclear neutrophils in patients with multiple sclerosis. J Investig.Allergol.Clin.Immunol. 2000; 10: 98-101. Zipp F, Kerschensteiner M, Dornmair K et al. Diversity of the anti-T-cell receptor immune response and its implications for T-cell vaccination therapy of multiple sclerosis. Brain 1998; 121 ( Pt 8): 1395-1407. Zivadinov R, De Masi R, Nasuelli D et al. MRI techniques and cognitive impairment in the early phase of relapsing-remitting multiple sclerosis. Neuroradiology 2001; 43: 272-278. Zivadinov R, Sepcic J, Nasuelli D et al. A longitudinal study of brain atrophy and cognitive disturbances in the early phase of relapsing1995; 61: 1-5. Zamvil SS, Steinman L. The T lymphocyte -remitting multiple sclerosis. J Neurol Neurosurg.Psychiatry 2001b; 70: 773-780.

debruyne j.

173

174

debruyne j.

VII BIJLAGE

debruyne j.

175

176

debruyne j.

1 Multiple Sclerose

debruyne j.

Tijdschr. voor Geneeskunde, 50, nr. 16, 1994

177

178

debruyne j.

debruyne j.

179

180

debruyne j.

debruyne j.

181

182

debruyne j.

2 Risks of Multiple Sclerosis in relatives of patients in Flanders, Belgium Journal of Neurology, Neurosurgery, and Psychiatry 1997;62: 329-333

debruyne j.

183

184

debruyne j.

debruyne j.

185

186

debruyne j.

debruyne j.

187

3 De immunologie van Multiple Sclerose nr. 23, 1999

188

Tijdschr. voor Geneeskunde, 55,

debruyne j.

debruyne j.

189

190

debruyne j.

debruyne j.

191

192

debruyne j.

debruyne j.

193

4 Interferon-beta therapie bij Multiple Sclerose Geneeskunde, 55, nr. 23, 1999

194

Tijdschr. voor

debruyne j.

debruyne j.

195

196

debruyne j.

debruyne j.

197

198

debruyne j.

debruyne j.

199

VIII LIJST MET AFKORTINGEN AD

alzheimer dementie

MRS

AGP ALS APC

α-acid glycoproteïne amyotrofe laterale sclerose antigeen presenterende cellen bloed-hersen barrière cluster of differentiation cerebrospinal fluid cerebrospinaal vocht centraal zenuwstelsel experimenteel autoimmune encephalomyelitis epstein barr virus endotheel cellen

MSA MSFC MT

magnetische resonantie spectroscopie multisysteem atrofie ms functional composite scale magnetic transfer Imaging

MTR NAB NAGM NAWM NKTc NO

magnetic transfer ratio neutraliserende antilichamen normal appearing grey matter normal appearing white matter natural killer T-cellen nitraat oxide

NWM OSP

PET PGE2

normal white matter oligodendrocyt-specifiek proteïne perifere benzodiazepine receptoren positron emissie tomografie prostaglandine E2

PHA PLP

phytohemaglutinine proteolipid proteïne

PPMS

primair progressieve multiple sclerosis region of interest relapsing remitting multiple sclerosis statistical parametric mapping secondair progressieve multiple sclerosis T-cel receptor

BBB CD CSF CSV CZS EAE EBV EC EDSS EP FMR FDG GAMES g-CSP HLA ICAM IL INF IVIg MBP MHC MMPs MNI MOBP MOG MRNA

200

expanded disability status scale geëvokeerde potentialen functionele magnetische resonantie fluorodeoxyglucose genetic analysis of MS in Europeans granulocyt-colony stimulerende factor human leucocyt antigen intracellulaire adhesie molecule interleukine interferon intraveneuze immunoglobuline myeline basisch proteïne major histocompatibiliteit antigeen matrix metalloproteïnasen montreal neurological institute myeline oligodendrocyt basisch proteïne myeline oligodendrocyt glycoproteïne boodschapper RNA

PBR

ROI RRMS SPM99 SPMS TcR

TNF-α VCAM

transforming growth factor-beta tissue inhibitor metalloproteïnase tumor necrosis factor-alfa vasculaire adhesie molecule

VLA-4

very late antigen-4

VOI

voxel of Interest

TGF-β TIMP

debruyne j.