III. METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli-Agustus 2009 (sampling sampai dengan embedding), Februari 2010 (sectioning), dan bulan Juli 2010 (pewarnaan), bertempat di SEAFAST CENTRE IPB dan Laboratorium Histologi Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
3.2 Alat dan Bahan Penelitian Alat yang digunakan terdiri atas seperangkat alat bedah (gunting, pinset, alas bedah), pisau silet, gelas piala, Erlenmeyer, botol sampel, kapas, kertas tissue, benang, aluminium foil, tissue basket, exhause fan, pipet tetes, pipet mohr, mikropipet, gelas ukur, cup untuk embedding, gelas objek, cover glass, inkubator, waterbath, mikrotom putar (rotatory microtom), tabung Eppendorf, kotak preparat, pensil, dan kamera. Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah tikus putih Albino Norway Rats (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley umur 5-6 minggu sebanyak 90 ekor berjenis kelamin jantan dengan berat badan berkisar antara 140240 g, bakteri asam laktat (BAL) indigenus isolat lokal yaitu Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus fermentum, kultur bakteri enteropathogenic E. coli (EPEC), ransum tikus percobaan, (kasein, minyak jagung, mineral mix, carboximethylcellulose, dan maizena), eter, NaCl fisiologis 0.9%, larutan fiksatif Bouin (asam pikrat jenuh, formalin, dan asam asetat glasial dengan perbandingan 15:5:1), alkohol 70%, 80%, 90%, 95%, dan 100%, xylol, parafin, akuades, pewarna hematoksilin, entelan, neophren in toluene 2%, phosphate buffered saline (PBS), metanol, H2O2, serum normal, antibodi primer/monoklonal Cu,ZnSOD (SIGMA S2147), antibodi sekunder Dako envision peroksidase system (K1491), larutan kromogen diamino benzidine (DAB), air bebas ion (MilliQ), kertas film, dan label.
19
Alur penelitian yang dilakukan dapat dilihat pada skema dibawah ini. Pengujian probiotik sebagai antioksidatif secara in vivo dengan membentuk kelompok tikus percobaan sebagai berikut: A. Kontrol negatif (ransum standar) B. BAL 1 (Lactobacillus plantarum) C. BAL 1 (Lactobacillus fermentum) D. BAL 2 (Lactobacillus plantarum) + EPEC E. BAL 2 (Lactobacillus fermentum) + EPEC F. Kontrol positif (EPEC)
Kelompok B,C,D,E: cekok BAL
Hari
H0
H8
H15
H22
T2
T3
Kelompok D,E,F : cekok EPEC
Terminasi
T1
Analisis kandungan enzim antioksidan intraseluler (SOD) pada hati
Diketahui satu BAL probiotik terbaik dalam meningkatkan kandungan enzim antioksidan SOD pada hati tikus
Gambar 5 Diagram alur penelitian.
3.3 Tahapan Perlakuan 3.3.1 Hewan Percobaan Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 90 ekor tikus putih Albino Norway Rats (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley yang berumur 5-6 minggu dengan berat badan berkisar 140-240 g dan berjenis kelamin jantan hasil perkembangbiakkan dari Badan POM RI.
20
3.3.2 Kandang dan Perlengkapan Kandang hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kandang yang berukuran 17.5 x 23.75 x 17.5 cm dan berjumlah sesuai dengan jumlah tikus yang digunakan. Kandang tersebut terbuat dari stainless steel. Kandang tikus berlokasi pada tempat atau ruangan yang bebas dari suara ribut dan terjaga dari asap industri dan polutan lainnya. Ruangan tempat kandang tikus berada mudah dibersihkan dan disanitasi dengan suhu optimum ruangan untuk tikus adalah 22-24 °C, kelembapan udara 50-60%, dan ventilasi yang cukup, namun tidak ada jendela yang terbuka.
3.3.3 Ransum Komposisi ransum basal disusun berdasarkan standar AOAC (Association of Official Agricultural Chemists) yaitu mengandung karbohidrat, protein, lemak, mineral, vitamin, dan air. Semua kelompok tikus percobaan diberi ransum standar.
Tabel 1 Komposisi ransum standar tikus Komponen
Sumber
Jumlah
Protein
Protein kasein
10%
Lemak
Minyak jagung
8%
Mineral
Campuran mineral
5%
Vitamin
Campuran vitamin
1%
Serat
Carboxymethylcellulose
1%
Air
Air
5%
Pati Maizena (pati jagung) Sumber : Muchtadi et al. (1992)
% sisanya
Perhitungan =% 8−
×
%
×
5−
.
×
%
1% 1−
×
5−
%
×
%
100 – (lainnya)
3.3.4 Perlakuan terhadap Hewan Percobaan Sebanyak 90 ekor tikus percobaan dibagi dalam 6 kelompok perlakuan. Setiap kelompok perlakuan terdiri dari 15 ekor tikus yang akan diterminasi pada 3 waktu yang berbeda (hari ke-8, 15, dan 22) masing-masing 5 ekor tikus. Masingmasing kelompok diberi perlakuan seperti pada Tabel 2 dan waktu terminasi dapat dilihat pada Gambar 5.
21
Tabel 2 Kelompok tikus percobaan sesuai perlakuan yang diberikan Kelompok Tikus A
Perlakuan Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok akuades mulai hari ke-1 sampai hari ke- 21 (kontrol negatif)
B
Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok BAL 1 (L. plantarum) mulai hari ke-1 sampai hari ke-21
C
Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok BAL 2 (L. fermentum) mulai hari ke-1 sampai hari ke-21
D
Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok BAL 1 (L. plantarum) mulai hari ke-1 sampai hari ke-21 serta dicekok EPEC pada hari-8 sampai hari ke-14
E
Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok BAL 2 (L. fermentum) mulai hari ke-1 sampai hari ke-21 serta dicekok EPEC pada hari-8 sampai hari ke-14
F
Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok akuades mulai hari ke-1 sampai hari ke- 21 serta cekok EPEC pada hari ke-8 sampai hari ke-14 (kontrol positif)
Jumlah BAL yang diberikan sesuai petunjuk Zoumpopolou et al. (2008). Dua buah kultur dari bakteri asam laktat terpilih (L. plantarum dan L. fermentum) berumur satu hari pada media de Man Rogosa Sharpe Broth (MRS Broth) dengan populasi 108 cfu/ml/hari diberikan sesuai dengan perlakuan kepada tikus percobaan. Sedangkan populasi EPEC penyebab diare yang diberikan adalah sebesar 106 cfu/ml/hari, yang didasarkan bahwa dosis infeksi E. coli enteropatogenik adalah minimal 105 cfu/ml menurut Oyetayo (2004). Setelah perlakuan tertentu selesai diaplikasikan pada tikus percobaan, dilakukan terminasi (pengakhiran perlakuan) dengan selang waktu 7 hari. Pembunuhan tikus dilakukan dengan cara dislokatio cervicalis.
3.3.5 Pembuatan Preparat Histologi Jaringan Hati Tikus Pembuatan preparat histologi meliputi proses pengambilan jaringan (sampling),
fiksasi,
dehidrasi,
penjernihan
(clearing),
infiltrasi
parafin,
embedding, pemotongan (sectioning), dan pewarnaan (staining) (Kiernan 1990). Pada proses terminasi, organ hati tikus diambil kemudian dicuci dengan NaCl fisiologis 0.9%. Selanjutnya organ dimasukkan ke dalam larutan fiksatif Bouin
22
yang telah disiapkan kurang lebih satu jam sebelum terminasi. Setelah terfiksasi, organ direndam dalam alkohol 70% (stopping point). Selanjutnya sampel organ hati dipotong kecil-kecil seperti dadu dan dimasukkan ke dalam tissue basket serta diberi label dengan kertas film. Sampel jaringan yang telah berada dalam tissue basket didehidrasi dengan alkohol bertingkat mulai dari alkohol 70%, 80%, 90%, dan 95% masing-masing selama 24 jam. Selanjutnya dilakukan dehidrasi dalam alkohol absolut (100%) I, II, III masing-masing selama 1 jam. Setelah itu, dilakukan penjernihan (clearing) dalam xylol I, II, dan III masing-masing selama 1 jam dan dilanjutkan dengan infiltrasi parafin cair I, II, III pada suhu 60 °C selama masing-masing 1 jam. Tahap selanjutnya adalah embedding, yaitu penanaman jaringan dalam blok parafin (cetakan) sehingga memudahkan pada saat pemotongan/penyayatan dengan mikrotom. Blok parafin tersebut kemudian dipotong dengan mikrotom setebal 4 µm. Proses ini disebut sectioning. Sebelum blok parafin dipasang pada holder mikrotom, sebaiknya setiap sudut blok diiris sedikit sebagai pembatas antar potongan sehingga mudah dipisahkan setelah disayat. Hasil potongan direndam dalam akuades suhu ruang. Setelah ditentukan hasil sayatan terbaik, sayatan tersebut dimasukkan ke dalam akuades yang dipanaskan dengan suhu 37 °C dalam waterbath. Selanjutnya sayatan jaringan dilekatkan pada gelas objek dan diberi label (untuk pewarnaan imunohistokimia, jaringan dilekatkan pada gelas objek dengan agen perekat neophren in toluene). Setelah itu, sediaan diinkubasi dalam inkubator selama lebih kurang 24 jam. Proses berikutnya adalah pewarnaan (staining). Pewarnaan diawali dengan deparafinisasi dengan cara merendam gelas preparat dalam xylol III, II, I secara berurutan selama masing-masing 5 menit. Selanjutnya rehidrasi dilakukan dengan merendam preparat dalam alkohol bertingkat mulai dari alkohol absolut III, II, I, 95%, 90%, 80%, 70% selama masing-masing 5 menit, kemudan dilanjutkan dengan perendaman preparat dalam air kran selama 5 menit dan dalam akuades selama 3 menit. Pewarnaan Imunohistokimia Superoksida Dismutase (Cu,Zn-SOD) Pewarnaan ini dilakukan untuk mengamati kandungan enzim Cu,Zn-SOD pada jaringan hati tikus percobaan. Dalam pewarnaan imunohistokimia terdapat
23
tahapan awal yang harus dilakukan, yaitu preparasi gelas objek dan pelapisan (coating) gelas objek dengan neofren in tholuene 2%. Setelah prosedur deparafinisasi dan rehidrasi dilakukan, tahap selanjutnya adalah penghilangan peroksidase endogen menggunakan substrat metanol (30 ml) yang dicampur dengan H2O2 (0.3 ml) atau 3% H2O2 dalam metanol (disiapkan sesaat sebelum gelas objek dimasukkan) dengan cara mencelupkan gelas preparat dan dibiarkan dalam keadaan gelap selama 15 menit. Kemudian dilakukan pencucian dengan akuades dan phosphate buffer saline (PBS) masing-masing 2 kali selama 10 menit. Selanjutnya permukaan sediaan di sekitar
jaringan dikeringkan
menggunakan kertas tissue dengan tetap menjaga jaringan untuk tidak kering, kemudian preparat disusun sejajar secara mendatar dalam kotak lembab untuk selanjutnya ditetesi 50-60 µl normal serum untuk masing-masing preparat. Kotak kemudian ditutup rapat dan diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37 °C selama 60 menit. Tujuan penetesan normal serum adalah untuk menutupi bagian antigen yang tidak spesifik pada jaringan agar tidak mengacaukan reaksi. Selanjutnya dilakukan pencucian preparat dengan PBS sebanyak 3 kali selama masing-masing 5 menit. Tahap selanjutnya adalah penetesan antibodi primer (monoclonal antibody) Cu,Zn-SOD (SIGMA S2147) sebanyak 50-60 µl pada masing-masing preparat, lalu diinkubasi pada suhu 4 °C selama dua malam. Setelah diinkubasi, gelas preparat dicuci kembali dengan PBS sebanyak tiga kali masing-masing 10 menit, kemudian ditetesi antibodi sekunder DEPS sebanyak 50-60 µl per preparat pada suasana gelap dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 60 menit. Sediaan dicuci dengan PBS masing-masing 3 kali selama 5 menit kemudian ditetesi larutan kromogen DAB pada kondisi gelap dan di tutup selama 30 menit pada suhu ruang. Selanjutnya preparat dicuci dengan air bebas ion (milliQ) dan kemudian dilakukan pengecekan dengan mikroskop cahaya. Adanya warna coklat menunjukkan hasil positif.
Proses
selanjutnya
adalah
counterstain
menggunakan
pewarna
hematoksilin untuk mewarnai sel yang tidak menghasilkan Cu,Zn-SOD dan dilanjutkan dengan dehidrasi pada alkohol bertingkat 70%, 80%, 90%, 95%, absolut I, dan absolut II masing-masing beberapa detik serta absolut III selama 1 menit, dilanjutkan clearing dengan xylol I dan II selama beberapa detik serta xylol
24
III selama 1 menit. Proses diakhiri dengan mounting (penutupan sediaan dengan cover glass) menggunakan entelan. Preparat yang telah selesai diwarnai diamati dengan mikroskop cahaya pada lensa objektif 20x pada tiap preparat. Pemotretan juga dilakukan dengan pembesaran lensa objektif 20x pada preparat jaringan hati tersebut sebanyak enam lapang pandang secara acak pada setiap preparat.
3.3.6 Analisis Kandungan SOD Hati Tikus Analisis kandungan enzim superoksida dismutase (SOD) dilakukan dengan metode imunohistokimia. Pewarnaan imunohistokimia terhadap Cu,Zn-SOD dilakukan untuk mendeteksi sel-sel penghasil Cu,Zn-SOD
yang dapat
menunjukkan jumlah sel penghasil serta kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD. Pengamatan dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran lensa obyektif 20x. Pengamatan Cu,Zn-SOD secara kualitatif dilakukan pada sitoplasma dan inti sel hati dengan melihat intensitas warna coklat dan distribusinya pada seluruh bagian setiap preparat yang diamati. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop cahaya pada perbesaran objektif 10x. Semakin tua dan semakin merata warna coklatnya berarti mengandung semakin banyak Cu,Zn-SOD. Penilaian dilakukan dengan memberikan tanda (+). Semakin banyak tanda (+) berarti kandungan enzim Cu,Zn-SOD semakin banyak dan merata di seluruh bagian jaringan hati. Pengamatan secara kuantitatif dilakukan pada inti sel hati berdasarkan berbagai tingkatan kandungan warna coklat yang terbentuk tiap lapang pandang pada perbesaran objektif 20x. Keberadaan enzim Cu,Zn-SOD ditunjukkan oleh tanda (+), semakin banyak tanda (+) berarti semakin tinggi kandungan enzim tersebut. Ada empat tingkatan hasil reaksi, yaitu positif kuat (+++, inti sel hati berwarna coklat tua), positif sedang (++, inti sel hati berwarna coklat sedang), positif lemah (+, inti sel hati berwarna coklat muda campur biru), dan reaksi negatif (-, inti sel hati berwarna biru). Perhitungan dilakukan pada enam lapang pandang yang berbeda yang dipilih secara acak pada setiap preparat jaringan. Hasil pengamatan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati secara
25
kuantitatif ini dianalisis dengan ANOVA dan apabila terdapat perbedaan yang nyata akan dilakukan uji Lanjutan Duncan (Wresdiyati et al. 2010).
