III. METODE PENELITIAN A. BAHAN DAN ALAT Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah kecap manis komersial Indonesia dengan berbagai macam merek. Jumlah kecap manis yang diuji sebanyak tujuh belas. Ketujuh belas kecap ini terdiri atas tiga kecap lokal dan empat belas kecap nasional. Pereaksi yang digunakan diantaranya: larutan AgNO3 0.1 M, larutan K2CrO4 5%, MgO, H2SO4, HgO, K2SO4, larutan 60% NaOH-5% Na2S2O3, larutan H2BO3, indikator metilen redmetilen blue, larutan HCl 0.02 N, indikator fenoftalin, air destilata, CaCO3, Pb asetat jenuh, NaOksalat, pereaksi Anthrone 0,1% dalam H2SO4, larutan glukosa standar 0.2 mg/ml, dan buffer pH 7.2. Alat yang digunakan untuk analisis fisikokimia kecap manis adalah kromameter, viskometer Brookfield, refraktometer, neraca analitik, penjepit cawan, desikator, oven vakum, cawan alumunium, cawan porselen, alat destruksi, tanur listrik, erlenmeyer, pipet tetes, gelas piala, buret, labu Kjeldahl, labu takar, pipet volumetrik, alat distilasi, termometer, spektrofotometer, kertas saring, corong, hot plate, water bath, tabung reaksi, dan pH-meter.
B. METODE PENELITIAN Kecap manis yang terdiri atas tujuh belas merek diuji satu per satu untuk analisis sifat fisik dan kimia. Setiap analisis dilakukan dengan dua kali ulangan dan setiap ulangan dilakukan secara duplo. Analisis sifat fisik meliputi: total padatan terlarut, kekentalan, warna, dan water activity (aw). Sementara itu, analisis sifat kimia meliputi: kadar air, kadar garam, pH, total gula, dan total Nitrogen. Diagram alir analisis sifat fisikokimia kecap dapat dilihat pada Gambar 2. Kecap Manis Komersial
Analisis Fisik -
Total Padatan Terlarut Viskositas Warna Water activity (aw)
Analisis Kimia -
Kadar Air Kadar Garam pH Total Gula Total Nitrogen
Gambar 2. Diagram alir analisis sifat fisikokimia kecap manis
1. Analisis Fisik a. Penetapan Warna dengan Metode Chromameter CR-300 1) Persiapan Alat Alat Chromameter disiapkan (Gambar 3) dan steker dimasukkan. Kalibrasi alat dilakukan dengan menekan tombol ‘CALIBRATE’. Standar kalibrasi yang digunakan Y = 68.3 ; x = 0.420 ; dan y = 0.438. Measuring head diletakkan pada alat kalibrasi yang berwarna putih. Tombol pada measuring head ditekan. Alat akan melakukan tiga kali pengukuran.
Gambar 3. Chromameter CR-300 Minolta
2) Pengukuran Sampel Measuring head diletakkan pada sampel yang akan diukur, dan tombol pada measuring head ditekan. Pengukuran dilakukan terhadap tiga titik permukaan sampel. Hasil pengukuran dicatat dengan sistem skala L*, a*, b*. Nilai L menyatakan parameter kecerahan (0 = hitam, 100 = putih). Warna kromatik campuran warna merah-hijau ditunjukkan oleh nilai a, (a+) = 0 – 80 untuk warna merah dan (a-) = 0 – (-80) untuk warna hijau). Sementara itu, untuk warna kromatik campuran biru-kuning ditunjukkan oleh nilai b (b+) = 0 – 70 untuk warna kuning dan (b-) = 0 - (-70) untuk warna biru.
b. Penetapan Kekentalan dengan Menggunakan LV Brookfield Viscometer 1) Pengukuran Sampel Nomor (jenis) spindle dan kecepatan putar pada alat viskometer ditentukan terlebih dahulu. Bila pengukuran dilakukan pada fluida yang kekentalannya belum diketahui, dianjurkan untuk menggunakan spindle dari bernomor besar hingga kecil dan kecepatan putar dari kecepatan putar rendah ke kecepatan tinggi. Nomor spindle 4 dengan kecepatan putar 30 rpm digunakan untuk sampel kecap yang sangat kental dan nomor spindle 3 dengan kecepatan putar 30 rpm digunakan untuk sampel kecap yang kental. Ketinggian viskometer diatur (Gambar 4) hingga tanda garis tercelup pada sampel. Pengukuran dilakukan dengan menekan tombol ON. ‘Clamp lever’ dilepas. Spindle akan berputar selama 20-30 detik untuk menghasilkan viskositas yang tepat. Setelah jarum stabil, tuas penjepit ditekan sehingga jarum penunjuk tidak berubah posisi. Alat viskometer dimatikan dengan memindah tombol ke posisi OFF. Angka yang terlihat dicatat dan jarum dikembalikkan sampai menunjuk posisi 0.
11
Gambar 4. LV Brookfield Viscosimeter
2) Perhitungan Viskositas kecap dihitung dengan rumus berikut: Viskositas (centipoise) = skala yang terbaca x faktor konversi (Tabel 6) Tabel 6. Faktor konversi penetapan viskositas Rpm Spindle 60 30 12 6 No. 1 1 2 5 10 No. 2 5 10 25 50 No. 3 20 40 100 200 No. 4 100 200 500 1000
c. Penetapan Total Padatan Terlarut dengan Menggunakan Spectronic Instrument Refractometer Alat yang digunakan untuk menentukan nilai total padatan terlarut adalah refraktometer (Gambar 5). Prinsip kerja dari refraktometer adalah dengan memanfaatkan refraksi cahaya (Anonim, 2009). Pengukuran dengan refraktometer ditetapkan dalam satuan 0brix. Brix ialah zat padat kering terlarut dalam suatu larutan (gram per 100 gram larutan) yang biasanya dihitung sebagai sukrosa. Semakin tinggi derajat brix, semakin manis suatu larutan (Risvan, 2007). Prisma refraktometer dibersihkan dengan alkohol. Dua tetes sampel ditempatkan pada prisma refraktometer dan prisma ditutup sehingga nilai total padatan terbaca dan dinyatakan dengan derajat brix.
Gambar 5. Spectronic Instrument Refractometer
12
2. Analisis Kimia a. Penetapan Kadar Air dengan Metode Oven Vakum (AOAC, 1999) Cawan kosong dan tutupnya dikeringkan dalam oven selama 15 menit, lalu didinginkan di dalam desikator (Gambar 6a). Cawan kering diambil dengan penjepit dan ditimbang. Sampel ditimbang sebanyak 1-2 gram pada cawan tersebut, lalu dikeringkan di dalam oven vakum suhu 70°C, 25 mmHg selama 2 jam (Gambar 6b) dan didinginkan lagi di dalam desikator, lalu ditimbang. Penimbangan diulangi hingga diperoleh bobot tetap (≤ 0,0005 gram). Kadar air dihitung menurut persamaan berikut: Kadar air (g/100 g bahan basah) =
W
W W
W
x 100
Keterangan: W = bobot contoh sebelum dikeringkan (gram) W1 = bobot contoh + cawan sesudah dikeringkan (gram) W2 = bobot cawan kosong kering (gram)
(a) (b) Gambar 6. Alat dalam pengukuran kadar air. (a) Desikator, (b) OvenVakum
b. Penetapan Kadar Garam dengan Metode Modifikasi Mohr (AOAC, 2000) a) Pembuatan AgNO3 0,1 M AgNO3 yang telah dikeringkan 120°C selama 1 jam ditimbang sebanyak 16,989 gram di dalam gelas piala, lalu ditambahkan air destilata sebanyak 50 ml dan diaduk dengan spatula hingga semua AgNO3 terlarut. Larutan dimasukkan ke dalam labu takar 1 liter dengan hati-hati. Gelas piala dibilas dengan air destilata tiga kali dan ditambahkan air ke dalam labu takar hingga tanda tera. Larutan diaduk dengan cara membolak-balikkan labu takar sehingga diperoleh larutan yang homogen. Larutan dipindahkan ke dalam botol pereaksi dan ditutup rapat.
b) Standarisasi AgNO3 0,1 M NaCl ditimbang sebanyak 100 mg dalam erlenmeyer, lalu ditambah dengan 25 ml akuades dan 10ml larutan K2Cr2O7 5%, dan dititrasi dengan larutan AgNO3 0,1 M.
c) Titrasi dengan AgNO3 0,1 M Abu di dalam cawan yang merupakan hasil pengabuan dicuci sebanyak 3 kali dengan 1-2 ml air destilata (total air destilata yang digunakan untuk membilas adalah 100 ml). Larutan abu dipindahkan ke dalam erlenmeyer 250 ml, kemudian ditambahkan 1 sudip MgO dan 1 ml larutan K2Cr2O7 5%, lalu dititrasi dengan larutan AgNO3 0,1 M sampai timbul warna oranye pertama.
13
Normalitas AgNO3 = Kadar Garam (%) =
c. Penetapan Total Nitrogen dengan Metode Mikro Kjeldahl (AOAC, 2005) Sampel sebanyak 0,03 gram dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl, lalu ditambah 2 gram K2SO4, 50 mg HgO, 3 ml H2SO4 dan beberapa butir batu didih. Sampel didestruksi sampai jernih (Gambar 7a). Setelah dingin, sampel ditambahkan dengan 3 ml air destilata dan didinginkan kembali. Isi labu dipindahkan ke dalam alat destilasi dan ditambah 10 ml NaOH-Na2S2O3 (Gambar 7b). Labu dibilas dengan 2 ml air destilata. Erlenmeyer diisi dengan 5 ml H3BO3 dan 2 tetes indikator campuran metil merah 0,2% dan metilen biru 0,2% (2:1), lalu diletakkan di bawah kondensor pada alat destilasi. Destilasi dilakukan sampai diperoleh destilat sebanyak 50 ml. Setelah itu, tabung kondensor dibilas dengan air destilata dan hasilnya ditampung pada erlenmeyer yang sama. Larutan tersebut dititrasi dengan HCl 0,022 N (Gambar 7c). Blanko juga disiapkan mengganti sampel awal dengan air destilata. Perhitungan total Nitrogen: Total N (%) = Keterangan:
N HC
a = b =
,
x 100%
ml HCl sampel ml HCl blanko
(a) (b) (c) Gambar 7. Tahap pengukuran total nitrogen. (a) Destruksi, (b) Destilasi, (c) Titrasi Metode Kjeldahl umumnya digunakan juga untuk menentukan kandungan protein dalam bahan pangan, karena didasarkan pada pengukuran kadar Nitrogen total yang ada di dalam sampel. Kandungan protein dapat dihitung dengan mengasumsikan rasio tertentu antara protein terhadap nitrogen untuk contoh yang dinalisis. Karena unsur nitrogen bukan hanya berasal dari protein, maka metode ini umumnya didasarkan pada asumsi bahwa kandungan nitrogen di dalam protein adalah sekitar 16%. Untuk mengubah dari kadar nitrogen ke dalam protein, digunakan angka faktor konversi sebesar 100/16 atau 6.25.
d. Penepatan Total Gula (Apriyantono et al., 1994) 1) Persiapan Sampel Sampel sebanyak 0,5 gram dimasukkan ke dalam gelas piala 300 ml, lalu ditambahkan 100 ml air destilata dan 1 gram CaCO3. Sampel dididihkan selama 30 menit, kemudian didinginkan. Sampel dipindahkan ke dalam labu takar 250 ml dan diambahkan dengan 1,5-2,5 ml larutan Pb asetat jenuh sampai larutan menjadi jernih.
14
Volume larutan sampel ditepatkan sampai tanda tera dengan air destilata, lalu dikocok dan disaring dengan kertas saring. Sebanyak 30 ml filtrat sampel diambil ke dalam gelas piala lain dan ditambahkan 1,5 gram Na-oksalat kering untuk mengendapkan Pb. Sampel disaring kembali dan diambil filtratnya sebanyak 5 ml untuk analisis total gula.
2) Penetapan Total Gula dengan Metode Anthrone a) Pembuatan Kurva Standar Larutan glukosa standar (0,2 mg/ml), masing-masing sebanyak 0,0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; dan 1,0 ml dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Setelah masing-masing ditepatkan menjadi 1,0 ml dengan air destilata, larutan segera ditambah 5 ml pereaksi Anthrone. Tabung reaksi ditutup dan ditempatkan pada penangas 100°C selama 12 menit. Setelah didinginkan, absorbansi larutan dibaca pada panjang gelombang 630 nm. Plot kurva standar dibuat, yaitu jumlah (g) glukosa standar (sumbu x) dan nilai absorbansi (sumbu y), lalu ditentukan persamaan regresi liniernya.
b) Analisis Sampel Sebanyak 5 ml sampel (dari persiapan sampel) dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan diencerkan sampai tanda tera dengan air destilata. Sampel dimasukkan sebanyak 1 ml ke dalam tabung reaksi bertutup dan ditambahkan 5 ml pereaksi Anthrone. Tabung reaksi ditutup dan ditempatkan pada penangas 100°C selama 12 menit. Setelah didinginkan dengan air mengalir, absorbansi larutan dibaca pada panjang gelombang 630 nm. Nilai absorbansi dimasukkan ke dalam kurva standar untuk mengetahui konsentrasi gula. Perhitungan: Total gula (%) = x 100% Keterangan: G = konsentrasi glukosa pada sampel yang diperoleh dari kurva standar FP = faktor pengenceran = 5000 W = berat contoh (gram)
e. Penetapan pH dengan Menggunakan pH-meter Orion 210A Alat yang digunakan untuk menghitung pH kecap adalah pH-meter Orion 210A (Gambar 8). Alat pH-meter dinyalakan selama 15 menit, kemudian dikalibrasi dengan buffer pH 7,2. Sampel sebanyak 5 ml diencerkan menjadi 50 ml dengan air destilata, kemudian diukur pH-nya.
Gambar 8. pH-meter Orion 210A
15
f. Penetapan Water Activity (aw) dengan menggunakan Shibaura aw-meter WA-360 1) Menyalakan alat aw -meter disiapkan (Gambar 9). Alat dinyalakan dan sudah dipastikan alat telah terkalibrasi. Alat dibiarkan menyala kira-kira selama 15 menit sampai alat menjadi stabil.
2) Menggunakan alat Sampel dimasukkan ke dalam cup sebanyak 1-3 gram, lalu dimasukkan ke dalam probe. Tombol ‘START’ ditekan, dan ditunggu sampai muncul tulisan ‘COMPLETED’, lalu akan muncul nilai aw dan suhu. Nilai aw dan suhunya dicatat. Sampel dikeluarkan dari probe, lalu probe dan cup dibersihkan.
Gambar 9. Shibaura aw –meter WA-360
3. Pengolahan Data a. Analysis of Variance (ANOVA) Analisis sifat fisik dan kimia selanjutnya dianalisis dengan menggunakan One Way Analysis of Variance (ANOVA). Program yang digunakan adalah SPSS 16. ANOVA adalah suatu metode untuk menguraikan keragaman total data menjadi komponenkomponen yang mengukur berbagai sumber keragaman. Secara aplikatif, ANOVA digunakan untuk menguji rata-rata lebih dari dua sampel berpengaruh secara signifikan atau tidak (Rosy dan Mulyani, 2007). ANOVA digunakan untuk mengetahui apakah ketujuh belas sampel kecap berpengaruh secara nyata pada suatu variabel pada taraf signifikansi yang ditetapkan. Taraf signifikansi (α) yang digunakan adalah 5%. Pertimbangan dalam penggunaan α tersebut agar tingkat kesalahan yang dilakukan tidak terlalu besar. Jika hasil ANOVA menunjukkan bahwa terdapat pengaruh secara nyata dari ketujuh belas sampel terhadap suatu variabel, maka dilakukan uji lanjut Duncan Test untuk mengetahui sampel mana saja yang berbeda nyata. Uji lanjut Duncan Test akan membagi sampel ke dalam beberapa kelompok (subset). Sampel yang berada pada 1 subset yang sama menunjukkan bahwa sampel-sampel tersebut tidak berbeda nyata pada taraf signifikansi 5%. Sementara itu, sampel yang berada pada subset yang berbeda menunjukkan bahwa sampel-sampel tersebut berbeda nyata pada taraf signifikansi 5%.
b. Principal Component Analysis (PCA) Principle component analysis (PCA) merupakan metode yang dapat digunakan untuk memvisualisasikan seluruh informasi yang terkandung dalam data dan deskripsi suatu produk. Data dari penelitian ini biasanya sangat kompleks untuk diinterpretasi (Meilgaard et al., 1999). PCA pertama kali diperkenalkan oleh Karl Pearson pada awal tahun 1990-an. PCA digunakan untuk menghitung kombinasi linier dan variabel
16
(komponen) yang menggambarkan keragaman data asli sebanyak mungkin, dimana matriks multidimensi data asli dapat disederhanakan tanpa harus kehilangan informasi penting sehingga memudahkan interpretasi matriks data yang kompleks. Metode ini cenderung digunakan untuk pengelompokan dan mengetahui hubungan pengelompokan antara contoh dan variabel (Setyaningsih et al, 2010). Menurut Supranto (2004), pada PCA faktor pertama menyerap sebagian besar varian dari seluruh variabel, kemudian faktor kedua menyerap sebagian besar sisa varian dari variabel setelah diperoleh faktor pertama, lalu faktor ketiga menyerap sebagian besar sisa varian dari variabel setelah faktor 1 dan faktor 2 diperoleh. Begitu seterusnya, sehingga faktor 1 menyerap sebagian besar varian dari seluruh variabel, faktor 2 menyerap sebagian varian yang kedua dan proses pencarian faktor berhenti setelah varian dari seluruh variabel asli sudah terserap. Seluruh proses ini dilakukan oleh program XLSTAT atau Minitab di komputer. Disarankan bahwa syarat minimum persentase varian yang akan menentukan banyaknya faktor atau komponen utama (PC) yang diambil jika nilai persentasenya sudah mencapai paling sedikit 60% atau 75% dari seluruh varian variabel asli. Pada PCA, nilai rata-rata dari setiap uji, yang merupakan variabel dihitung lalu dikonversi menjadi nilai baku (Z) dengan rumus sebagai berikut:
Nilai variabel dari sampel Rataan variabel Standar deviasi variabel
Nilai baku (Z) dimasukkan ke dalam program XLSTAT 2011atau Minitab 15 untuk diolah dengan metode PCA. Plot yang akan keluar berupa scree plot, loading plot, score plot, dan biplot. Pada PCA, sampel yang memiliki kemiripan yang sama digambarkan sebagai dua titik yang letaknya berdekatan. Keragaman variabel dapat dijelaskan sebagai berikut, yaitu variabel dengan keragaman kecil digambarkan sebagai vektor yang pendek, sedangkan variabel yang keragamannya besar digambarkan sebagai vektor yang panjang. Korelasi antar variabel digunakan untuk menilai bagaimana suatu variabel mempengaruhi atau dipengaruhi oleh variabel yang lain. Dua variabel yang memiliki korelasi positif tinggi akan digambarkan sebagai dua arah garis yang sama atau membentuk sudut lancip (<90°), sedangkan dua variabel yang memiliki korelasi negatif tinggi akan digambarkan dalam bentuk dua garis dengan arah berlawanan atau membentuk sudut tumpul (>90°), serta dua variabel yang tidak memiliki korelasi digambarkan oleh dua garis dengan sudut mendekati 90°. Nilai variabel pada suatu sampel digunakan untuk melihat keunggulan dari setiap sampel. Sampel yang letaknya searah dengan arah suatu variabel dapat dikatakan sampel tersebut nilainya diatas rata-rata. Sebaliknya, sampel yang terletak berlawanan dengan arah suatu variabel dapat dikatakan sampel tersebut memiliki nilai di bawah rata-rata. Sampel yang berada ditengah dapat dikatakan memiliki nilai relatif dekat dengan rata-rata.
17
