III. METODE PENELITIAN 3.1. BAHAN DAN ALAT Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari bahan baku utama, bahan penunjang, dan bahan-bahan untuk analisis. Bahan baku utama terdiri atas rimpang jahe, temulawak, kayu secang, daun kumis kucing, flavor enhancer (GMP dan IMP), jeruk x, dan jeruk y. Rimpang jahe (Zingiber officinale Roscoe.), temulawak (Curcuma xantorrhiza), kayu secang (Caesalpinia sappan Linn.), daun kumis kucing (Orthosiphon aristatus BI. Miq), diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat-obatan (BALITTRO), Cimanggu Bogor. Bitter blocker (Frutarom (musk ketone), flavor enhancer (P:P), flavor enhancer, dan Lavarian (musk base)) diperoleh dari PT Sensient Technologies Indonesia. Jeruk nipis dan jeruk purut dibeli dari Giant hypermarket yang ada di Bogor. Bahan-bahan yang digunakan untuk analisis terdiri atas radikal bebas DPPH (1-1--diphenyl-2picry1hydrazyl)), enzim α-amilase, NaH2PO4, NaCl, CaCl2 , bovine serum albumin, air suling, Na-Ktartarat, NaOH 1 M, NaOH 2 M metanol, asam 3.5- dinitrosalisilat, larutan penyangga asam asetat, akuades, asam askorbat, serta bahan-bahan lainnya yang digunakan untuk uji organoleptik . Bahan yang ditambahkan untuk membuat minuman yaitu gula pasir, hidrokoloid Carboxyl Methyl Cellulose (CMC), natrium benzoat, kalium sorbat dan air minum diperoleh dari mini market alfa mart, toko bahan kimia setya guna, dan penjual AQUA® galon yang ada di Bogor. Alat-alat yang digunakan untuk mendapatkan ekstrak jahe, temulawak, dan jeruk adalah juice extractor atau parutan kelapa. Saringan vakum dan rotary evaporator diperlukan untuk pemekatan ekstrak secang dan kumis kucing. Bahan baku dipersiapkan dengan menggunakan baskom, pisau, talenan, dan panci. Pipet tetes dan neraca analitik (KERN ABJ 220-4M, max= 220 g, min= 10 mg, e= 1 mg, d= 0.1mg) diperlukan dalam pembuatan formulasi minuman adapun botol kaca gelap digunakan sebagai wadah minuman. Autoclave dan water bath digunakan untuk sterilisasi botol dan pasteurisasi produk minuman akhir. Alat-alat yang digunakan untuk analisis adalah pH meter (eutech pH meter seri 510, rentang pH 0.00-14.00), mikropipet, spektrofotometry, hot plate, alat-alat uji organoleptik, dan alat-alat gelas lainnya.
3.2. METODE PENELITIAN Metode penelitian dilakukan dengan dua tahap. Tahap pertama adalah penelitian pendahuluan yang bertujuan untuk menentukan jenis perlakuan (kombinasi varietas jeruk dan bitter blocker/flavor enhancer yang ditambahkan ke dalam minuman) untuk menghasilkan citarasa terpilih. Pembuatan ekstrak komponen minuman dan pengukuran aktivitas antioksidan minuman formula standar pembanding (Kordial 2009) dilakukan untuk menghindari bias yang diakibatkan ingridien penyusun minuman. Tahap kedua adalah penelitian lanjutan yang bertujuan untuk menentukan perlakuan dengan citarasa terpilih berdasarkan variasi komposisi ekstrak jeruk yang berbeda & flavor enhancer, penggunaan gula atau pemanis, dan pengawet atau perlakuan non pengawet yang ditambahkan ke dalam minuman. Pembuatan model minuman sesuai rancangan percobaan hasil keluaran Design Expert 7.0 ® dengan variasi komposisi ekstrak jeruk yang berbeda dan flavor enhancer diujikan secara organoleptik dengan metode hedonik kepada 50 orang panelis tidak terlatih (usia antara 20-55 tahun, 34 orang laki-laki dan 16 orang perempuan). Tiga formula terpilih berdasarkan perlakuan ekstrak jeruk yang berbeda dan flavor enhancer selanjutnya dipilih untuk diberikan perlakuan berikutnya. Perlakuan yang diberikan pada minuman dikelompokkan menjadi dua, yaitu: minuman
41
yang menggunakan kombinasi gula, pengawet (natrium benzoat atau kalium sorbat) atau nonpengawet dan minuman yang menggunakan kombinasi pemanis (pemanis 1 atau pemanis 2), pengawet (natrium benzoat) atau non-pengawet. Perlakuan-perlakuan tersebut selanjutnya diujikan secara organoleptik dengan metode hedonik. Perlakuan-perlakuan yang diberikan tersebut dilakukan karena diketahui dapat mempengaruhi tingkat penerimaan citarasa minuman (Kordial 2009). Pemilihan formula terpilih dari masing-masing perlakuan dilakukan dengan menggunakan syarat memiliki skala hedonik ≥ 6.6 dari skala 9.0. Penyeleksian tersebut menghasilkan 6 formula minuman yang kemudian dilakukan pengukuran terhadap aktivitas antioksidan (metode DPPH), aktivitas antidiabetes (metode inhibisi α-amilase), dan nilai pH. Penentuan perlakuan terbaik dari 6 formula minuman tersebut dilakukan dengan metode perbandngan eksponensial (MPE).
3.2.1. Penelitian Pendahuluan Penelitian pendahuluan bertujuan untuk menentukan jenis perlakuan yang akan diberikan ke dalam minuman. Pembuatan ekstrak komponen minuman dan pengukuran aktivitas antioksidan minuman formula standar pembanding (Kordial 2009) dilakukan untuk menghindari bias yang diakibatkan ingridien penyusun minuman. Minuman formula standar yang dibuat dengan menggunakan ekstrak kumis kucing berbunga putih dan berbunga ungu dari Pusat Studi Biofarmaka (PSB) IPB diukur aktivitas antioksidannya untuk dibandingkan dengan aktivitas antioksidan minuman formula standar pembanding (Kordial 2009). Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan minuman formula standar yang dibuat dengan menggunakan ekstrak kumis kucing berbunga putih memiliki nilai yang lebih kecil dibandingkan dengan minuman formula standar yang dibuat dengan menggunakan ekstrak kumis kucing berbunga ungu. Oleh karena itu, pengukuran aktivitas antioksidan minuman komponen tunggal kumis kucing berbunga putih dan berbunga ungu yang berasal dari Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat (BALITRO) Sukabumi dan PSB IPB dilakukan untuk mengetahui ekstrak kumis kucing yang akan digunakan dalam penelitian ini. Perlakuan yang diberikan untuk menentukan jenis perlakuan yang akan digunakan di antaranya dengan menambah konsentrasi ekstrak jeruk y menjadi A g, B g, C g dalam 100 ml minuman, menambahkan ekstrak jeruk x sejumlah C g dalam 100 ml minuman, menambahkan ekstrak jahe menjadi P g, Q g, R g dalam 100 ml minuman, kombinasi penambahan ekstrak jeruk x dan ekstrak jeruk y (I g : J g; K g : L g; M g : N g) dalam 100 ml minuman, kombinasi ekstrak jeruk y dan bitter blocker I-IV (D g dan E g : F g) dalam 100 ml minuman, kombinasi ekstrak jeruk x dan bitter blocker I-IV (C g : J g) dalam 100 ml minuman, kombinasi ekstrak jahe merah dan ekstrak jeruk y (L g : M g) dalam 100 ml minuman, penambahan ekstrak kayu manis D g dalam 100 ml minuman, penambahan ekstrak jahe merah A g dalam 100 ml minuman. Perlakuan yang dipilih adalah perlakuan yang menghasilkan citarasa yang relatif lebih baik daripada formula minuman sebelumnya, melalui penilaian sensori secara individu.
3.2.2. Penelitian Lanjutan Penelitian lanjutan dilakukan untuk menentukan perlakuan dengan citarasa terpilih dari variasi komposisi ekstrak jeruk yang berbeda & flavor enhancer, penggunaan gula atau pemanis, dan pengawet atau non pengawet yang ditambahkan ke dalam minuman. Pembuatan model minuman sesuai rancangan percobaan hasil keluaran Design Expert 7.0 ® dengan variasi komposisi ekstrak jeruk yang berbeda & flavor enhancer diujikan secara organoleptik dengan metode hedonik. Rancangan percobaan yang dihasilkan diperoleh dengan menentukan terlebih dahulu jumlah minimum dan maksimum dari ekstrak jeruk x, ekstrak jeruk y, dan flavor enhancer yang akan digunakan
42
sebagai data masukan berdasarkan trial and error pada penelitian pendahuluan. Penelitian ini menggunakan pemanis berupa gula pasir, pemanis 1, dan pemanis 2 sebagai data perbandingan untuk aktivitas antidiabetes. Pembuatan minuman formula standar, minuman komponen tunggal (ekstrak kumis kucing), dan mengukur aktivitas antioksidannya
penentuan jenis perlakuan
Penelitian pendahuluan
Penelitian lanjutan
Trial and error
Kombinasi ekstrak jeruk x, ekstrak jeruk y, dan flavor enhancer dengan jumlah total A g/100 ml minuman
Pembuatan model minuman sesuai rancangan percobaan hasil keluaran Design Expert 7.0 ® dengan variasi komposisi ekstrak jeruk yang berbeda & flavor enhancer
Uji hedonik, parameter citarasa
Tiga formula terpilih berdasarkan perlakuan ekstrak jeruk yang berbeda & flavor enhancer dipilih untuk diberikan perlakuan berikutnya
Perlakuan menggunakan kombinasi gula, pengawet (natrium benzoat atau kalium sorbat) atau non-pengawet Perlakuan menggunakan kombinasi pemanis (pemanis 1 atau pemanis 2), pengawet (natrium benzoat) atau non-pengawet 1)
Uji hedonik, parameter citarasa
Pemilihan formula terpilih dari masing-masing perlakuan dilakukan dengan menggunakan syarat memiliki skala hedonik ≥ 6.60 dari skala 9.00
Enam formula terpilih dari masingmasing perlakuan
Penentuan perlakuan terbaik dengan metode perbandingan eksponensial 1)
Pengukuran: aktivitas antioksidan (metode DPPH) aktivitas antidiabetes (metode inhibisi α-amilase) nilai pH minuman
Pembuatan model minuman sesuai rancangan percobaan dengan kombinasi beberapa perlakuan dapat dilihat pada Lampiran 20.
Gambar 1. Diagram alir metodologi penelitian Rancangan percobaan variasi komposisi yang dihasilkan adalah sebanyak 14 formula yang merupakan kombinasi dari ekstrak jeruk x, ekstrak jeruk y, dan flavor enhancer. Flavor enhancer
43
yang digunakan pada penilitian ini ada dua jenis sehingga formula yang harus diujikan secara hedonik menjadi 28 formula. Dua puluh delapan formula tersebut kemudian diujikan secara organoleptik dengan metode hedonik. Tiga formula terpilih berdasarkan perlakuan ekstrak jeruk yang berbeda & flavor enhancer selanjutnya dipilih untuk diberikan perlakuan berikutnya. Perlakuan yang diberikan pada minuman dikelompokkan menjadi dua, yaitu: minuman yang menggunakan kombinasi gula, pengawet (natrium benzoat atau kalium sorbat) atau non-pengawet dan minuman yang menggunakan kombinasi pemanis (pemanis 1 atau pemanis 2), pengawet (natrium benzoat) atau non-pengawet. Pemilihan formula terpilih dari masing-masing perlakuan dilakukan dengan menggunakan syarat memiliki skala hedonik ≥ 6.60 dari skala 9.00. Penyeleksian tersebut menghasilkan 6 formula minuman yang kemudian dilakukan pengukuran terhadap aktivitas antioksidan (metode DPPH), aktivitas antidiabetes (metode inhibisi α-amilase), dan nilai pH. Penentuan perlakuan terbaik dari 6 formula minuman tersebut dilakukan dengan metode perbandngan eksponensial (MPE).
3.2.3. Analisis 3.2.3.1. Nilai pH (AOAC 1995) pH meter harus dikalibrasi terlebih dahulu dengan larutan buffer pH 4.0 dan pH 7.0 sebelum digunakan. Sampel sebanyak 30-50 ml diukur nilai pH-nya dengan menggunakan pH meter.
3.2.3.2. Aktivitas Antioksidan Metode DPPH (Kubo et al. 2002 dan Molyneaux 2003) Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode radikal bebas DPPH (1,1-diphenyl2-picryl-hydrazil radical-scavenging). Ekstrak kumis kucing dan 6 formula minuman terpilih dari masing-masing perlakuan digunakan sebagai sampel pengujian aktivitas antioksidan. Asam askorbat digunakan sebagai standar pembanding terhadap aktivitas antioksidan yang dimiliki oleh formula minuman. Oleh karena itu, aktivitas antioksidan minuman akan dihitung berdasarkan kesetaraannya dengan aktivitas antioksidan dalam ppm AEAC (Ascorbic acid Equivalent Antioxidant Capacity). Metode pengukuran aktivitas antioksidan secara spesifik dapat dilihat pada Gambar 2. Pencampuran 2 ml larutan buffer asetat (pH 5.5), 3.75 ml metanol, dan 200 µl larutan DPPH 3 mM dalam metanol Pemvorteksan larutan campuran Penambahan 50 µl larutan sampel atau larutan standar antioksidan Pengiinkubasian pada suhu 37°C selama 30 menit Pembacaan absorbansi sampel dengan spektrofotometer pada λ = 517 nm Gambar 2. Pengukuran aktivitas antioksidan metode DPPH (Kubo et al. 2002; Molyneaux 2004)
44
3.2.3.3. Aktivitas Antidiabetes Metode inhibisi α-amilase (Thalapaneni et al. 2008) Larutan enzim α-amilase dibuat dengan melarutkan 50 mg enzim α-amilase 54 IU/mg dari Bacillus subtilis dalam 50 ml buffer fosfat A. Buffer fosfat A diperoleh dengan melarutkan 600 mg NaH2PO4, 292.5 mg NaCl, 4.7 mg CaCl2 dan 100 mg bovine serum albumin dalam 100 ml air suling dan ditambahkan NaOH 1 M hingga pH mencapai 6.9. Larutan substrat diperoleh dengan melarutkan 1 g pati dalam 100 ml buffer fosfat B pada suhu dibawah 900C selama 15 menit. Buffer fosfat B dibuat dengan melarutkan 240 mg NaH2PO4 dan 39.2 mg NaCl dalam 100 ml air suling dan NaOH 1 M ditambahkan sedikit demi sedikit hingga pH 6.9. Reagen warna dibuat dengan mecampurkan 20 ml larutan Na-K-tartarat, 50 ml larutan DNS, dan air suling hingga diperoleh volume akhir 100 ml. Larutan Na-K-tartarat dibuat dengan melarutkan 30 g Na-K-tartarat dalam 20 ml NaOH 2 M di atas hot plate (tidak sampai mendidih). Larutan DNS diperoleh dengan melarutkan 1094.88 mg asam 3.5dinitrosalisilat dalam 50 ml air suling pada suhu 45-500C. Sampel pada analisis ini berupa : (1) minuman formula sebelumnya (Kordial 2009), (2) enam formula minuman terpilih dari masingmasing perlakuan. Kedua sampel dianalisis dalam satu perlakuan jumlah sampel yang ditambahkan yaitu 1 kali jumlah ekstrak dalam 100 ml minuman fungsional berbasis kumis kucing. Campuran reaksi diperoleh dengan melarutkan 250 µl larutan sampel dan 250 µl larutan enzim. Campuran reaksi diinkubasi pada suhu 250C selama 10 menit, setelah itu larutan pati ditambahkan sebanyak 250 µl dan diinkubasi kembali pada suhu 250C selama 10 menit. Reagen warna selanjutnya ditambahkan sebanyak 500 µl dan diinkubasi kembali selama 5 menit pada air mendidih. Air suling sebanyak 5000 µl selanjutnya ditambahkan dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Tabel 4. Jumlah larutan pada analisis inhibisi α-amilase Larutan
Blanko
Kontrol (+)
Kontrol (-)
Sampel
Sampel
-
-
250 µl
250 µl
Buffer B
500 µl
250 µl
250 µl
-
Enzim
-
250 µl
-
250 µl
Pati
250 µl
250 µl
250 µl
250 µl
Reagen warna
500 µl
500 µl
500 µl
500 µl
Air suling
5000 µl
5000 µl
5000 µl
5000 µl
Perhitungan persentase inhibisi dapat dihitung dengan persamaan (3.1). % inhibisi = {(A1-A2) / A1} x 100 % (3.1) Keterangan: A1 = Absorbansi kontrol (+) – Absorbansi blanko A2 = Absorbansi sampel – Absorbansi kontrol (-)
3.2.3.4. Uji Hedonik Uji hedonik dilakukan dengan menggunakan 50 orang panelis tidak terlatih (mahasiswa Ilmu dan Teknologi Pangan,dll.). Hal tersebut dikarenakan panelis yang digunakan pada uji konsumen (uji afeksi) adalah ≥ 50 panelis tidak terlatih dengan memperhatikan beberapa aspek demografi, di antaranya usia dan jenis kelamin (Carpenter et al. 2000 dan Stone & Sidel 2004). Jumlah panelis awal yang digunakan dalam penelitian adalah 60 orang, namun panelis yang dapat mengikuti pengujian
45
sampel secara keseluruhan dan tidak memberikan data pencilan berjumlah 50 orang. Data pencilan tidak dapat dipakai dalam analisis data (Soemartini 2007). Panelis diminta mengungkapkan tanggapan pribadinya mengenai kesukaan atau ketidaksukaan pada uji ini. Skala hedonik yang digunakan pada penelitian ini adalah skala 1-9. Skala 1 menyatakan sangat tidak suka sekali, skala 2 menyatakan sangat tidak suka, skala 3 menyatakan tidak suka, skala 4 menyatakan agak tidak suka, skala 5 menyatakan netral , skala 6 menyatakan agak suka, dan skala 7 menyatakan suka, skala 8 menyatakan sangat suka, skala 9 menyatakan sangat suka sekali. Parameter yang dinilai pada uji hedonik adalah citarasa dari minuman secara overall. Sampel minuman fungsional disajikan secara bersamaan di dalam booth tertutup. Air mineral disediakan untuk menetralkan indera pengecap panelis agar tidak terjadi bias saat penilaian. Data hasil uji hedonik yang diperoleh diolah secara statistik dengan analisis ragam (Analysis of Variance/ANOVA) pada tingkat kepercayaan 95 % (α=0.05). Uji lanjut Duncan dilakukan jika dari hasil analisis ragam (Analysis of Variance/ANOVA) diperoleh nilai yang menunjukkan adanya perbedaan yang nyata di antara sampel minuman fungsional yang disajikan. Uji Duncan dilakukan untuk mengetahui sampel minuman fungsional yang berbeda nyata pada taraf α=0.05.
46
