III. METODE PENELITIAN 3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Kawasan Agropolitan Desa Sindang Jaya, Kecamatan Pacet, Kabupaten Cianjur Jawa Barat. Analisis mikroba dan penyemaian benih di Laboratorium Bioproses IV dan Greenhouse, Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Cibinong. Analisis residu profenofos dilakukan di Laboratorium Residu Pestisida Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian (BALITBIOGEN). Penelitian dilaksanakan pada bulan Oktober 2005 -Maret 2006.
3.2 Alat dan Bahan Penelitian 3.2.1 Alat Penelitian ini menggunak an alat-alat sebagai berikut: cawan petri, labu Erlenmeyer, tabung reaksi, gelas piala, gelas ukur, autopipet, labu ukur, botol Schott, corong, jarum ose, lampu spritus, kertas saring, neraca analitik, pH meter, autoklaf, sentrifuse, mikropipet Eppendorf 100 dan 1000µl, kertas milipore 0.45µm, termometer, bak pengomposan, pH meter dan Kromatografi gas (GC) dan Spektrofotometer.
3.2.2 Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanah tercemar pestisida yang diperoleh
dari Kawasan Agropolitan Des a Sindang Jaya,
Kecamatan Pacet, Kabupaten Cianjur Jawa Barat Bahan-bahan pengomposan dalam hal ini kotoran sapi dan daun wortel diperoleh dari tempat asal tanah yang terkontaminasi pestisida. Bahan lain yang digunakan adalah media selektif MSPY (Mineral Salt Peptone Yeast), alkohol teknis 70% (v/v), metanol, larutan garam steril, arang aktif, spirtus, larutan NaOH 5% Na2SO4 anhidrat, larutan asam asetat 25%, etil asetat, serium(II)sulfat, asetonitril dan air destilata, standar pestisida, FDA, buffer posfat pH 3-6, CH3CN.
22
3.3 Desain Penelitian Penelitian diawali dengan survei lahan pertanian yang tercemar pestisida di kecamatan Darmaga, Ciawi, Cisarua dan Kecamatan Pacet. Lahan pertanian yang mengindikasikan residu pestisida tinggi dianalisis sampel tanahnya. Hasil analisis residu yang melewati ambang batas ditetapkan sebagai lokasi pengomposan. Tahap penelitian selanjutnya menganalisis C/N dan kadar air bahan-bahan yang digunakan untuk pengomposan yaitu; tanah, serbuk gergaji kotoran sapi dan daun wortel. Berdasarkan data tersebut diperoleh komposisi masing-masing bahan dalam campuran untuk C/N 30, 35 dan 40 menggunakan Software Moisture and Carbon/Nitrogen Ratio Calculation Spread Sheet (Richard 2005 ). Selanjutnya dilakukan pengomposan tanah tercemar profenofos dengan tanah, serbuk gergaji kotoran sapi dan daun wortel. Tahap ini bertujuan untuk mengetahui laju degradasi profenofos selama pengomposan. Tanah yang sudah diremediasi dengan cara pengomposan diuji pengaruhnya terhadap pertumbuhan tanaman. Pada penelitian ini menggunakan tanaman bayam Jepang, karena mudah di dapat dan cepat panen. Tahap ini dilakukan di 2 tempat yaitu: penyemaian benih di green house dan penanaman di lapangan. Selanjutnya menghitung jumlah populasi bakteri dengan TPC (Total Plate Count), mengisolasi bakteri yang mampu mendegradasi profenofos selama pengomposan, menguji aktivitas bakteri dengan FDA (Fluorescent Diacetate Assay) dan menguji kemampuan degradasi profenofos oleh bakteri yang telah diisolasi tersebut dengan media adaptasi. Bagan alir tahapan penelitian disajikan pada Gambar 5. 1. Analisis residu profenofos pada tanah yang diduga tercemar profenofos. Analisis C/N dan kadar air tanah, kotoran sapi dan daun wortel. 2. Selama pengomposan 35 hari dilakukan pengukuran suhu harian dan sampling tanah setiap minggu untuk analisis residu profenofos, pH dan analisis mikroba. Menurut Indriani (2004), akhir proses pengomposan ditandai dengan suhu kompos stabil yang berarti kondisi semua bahan organik juga sudah stabil.
23
Analisis residu pestisida
Survei penggunaan pestisida
Penentuan lokasi pengomposan
Kotoran sapi dan daun wortel
Tanah tercemar pestisida Analisis residu pestisida, C/N dan kadar air
Analisis C/N dan kadar air Pencampuran tanah tercemar dengan biowaste pada
Sampling perminggu untuk analisis: residu profenofos, C/N, pH, TPC dan aktivitas mikroba Minggu ke-5: Analisis kualitas kompos meliputi C/N, KTK, unsur hara, kadar air, kadar abu, pH dan populasi mikroba
Inkubasi
Kompos/Tanah bebas profenofos
Penanaman di rumah kaca
Uji Toksisitas
Penanaman di lapang
Pertumbuhan dan biomass Isolasi Bakteri Uji aktivitas dan uji kemampuan degradasi profenofos
Gambar 5 Diagram Tahapan Penelitian
3. Analisis kompos dilakukan pada akhir penelitian meliputi C/N, kadar air, kadar abu, KTK, unsur hara, pH, residu profenofos dan populasi mikroba.
24
4. Menguji toksisitas tanah yang sudah dikomposkan dengan menyemai benih bayam Jepang di green house Bioteknologi LIPI Cibinong tanpa pemupukan selama 14 hari dan menanam bayam Jepang di lapangan selama 40 hari (panen). Biomass tanaman ditimbang berdasarkan akar, batang dan daun. Sedangkan hasil panen di lapangan dibandingkan dengan hasil panen petani di lahan sumber tanah yang digunakan untuk penelitian. Parameter yang diamati selama penelitian secara detail di sajikan pada Tabel 4
Tabel 4 Sampling dan parameter yang diamati Sampling
Parameter
Metode/Alat
Harian
Suhu
Termometer
Minggu ke-0 1, 2, 3, 4
pH C/N Kadar air Residu profenofos Populasi mikroba Aktivitas mikroba
pH meter Gravimetri & Kjeldal AOAC, 1984 GC TPC FDA
Minggu ke-5
pH C/N Kadar air Residu profenofos Populasi mikroba Aktivitas mikroba Kualitas kompos: Kadar Abu Total N P2O5 K2O
pH meter Gravimetri & Kjeldal Gravimetri GC TPC FDA Gravimetri Kjeldal
Bak pengomposan (Gambar 6) memiliki dimensi 1 x 1 x 1 meter terbuat dari kayu yang dipasang dengan jarak 1-2 cm tiap lembarnya guna aliran oksigen selama pengomposan. Pada bak yang sama dilakukan penanaman bayam Jepang untuk uji pertumbuhan tanaman pada tanah sudah dibioremediasi.
25
Gambar 6. Bak Proses Pengomposan
3.4 Pengolahan Data 3.4.1 Rancangan Percobaan Penelitian ini dilakukan dengan Rancangan Acak Lengkap satu faktor yaitu komposisi campuran pengomposan (tanah, serbuk gergaji, daun wortel dan kotoran sapi) dengan 3 taraf yaitu C/N 30, C/N 35, C/N 40 dua kali ulangan. Respon utama yang diamati adalah parameter laju degradasi pestisida. Sebagai kontrol digunakan tanah tercemar pestisida tanpa perlakuan untuk mengetahui laju degradasi pestisida secara alami di lahan tercemar tersebut. Model Statistik untuk rancangan ini adalah (Matjik dan Sumertajaya, 2002): Yij = µ + t i + eij dimana;
i
= 1,2,...,t dan j = 1,2,...,r
Yij
=Pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j
µ
=Rataan umum
ti
=Pengaruh perlakuan ke-i
eij
=Pengaruh acak pada perlakuan ke-i ulangan ke-j
Hipotesis yang diuji adalah sebagai berikut: H0 : t 1 = t 2 = t 3 = 0 (Perlakuan tidak berpengaruh terhadap respon yang diamati/semua perlakuan memberikan respon yang sama) H1 : paling sedikit ada satu i dimana t i ? 0 26
Analisa yang dilakukan meliputi kadar residu pestisida, C/N, KTK, unsur hara, pH, kadar air, kadar abu dan populasi mikroba dalam kompos.
3.4.2 Penurunan Profenofos Selama Pengomposan Pengomposan dilakukan dengan mencampurkan tanah yang tercemar profenofos dengan serbuk gergaji, kotoran sapi dan daun wortel. Komposisi masing-masing bahan berdasarkan C/N yaitu 30, 35 dan 40 masing-masing 2 ulangan. Selama pengomposan (35 hari) dilakukan 6 kali sampling campuran untuk analisis residu profenofos dan analisis mikroba. Sampling tersebut dilakukan pada 5 titik dan dikompositkan. Pengukuran suhu dilakukan setiap hari dan jika suhu meningkat ditandai dengan campuran menjadi panas atau kelembaban berkurang dilakukan pembalikan sambil disiram. Pada akhir proses pengomposan ditandai dengan suhu menurun dan stabil mendekati suhu ruang, dilakukan analisis kualitas kompos meliputi: C/N, kadar air, kadar abu, KTK, unsur hara, pH, residu profenofos dan populasi mikroba. Selanjutnya dilakukan analisa kualitas kompos mengacu kepada standar mutu kompos menurut Indrasti dan Wilmot (2001), Japan Bark Compost Association (Harada et al. 1993), SNI 19-7030-2004 Kompos (2004) dan Depatemen Pertanian (2004) seperti Tabel 5. Tabel 5 Standar Mutu Kompos Paremeter Mutu Satuan Total N % Rasio C/N P 2O5 % K2O % pH KTK Meq/100g Kadar air % Keterangan:
A 2.5-3.5 20-25 >0.021 >0.021 7-8 100 35-45
B 0.2 <35 >0.5 >0.3 5.5-7.5 >70 55-65
C 0.4 10-25 0.1 0.2 6.8-7.5 = 50
D
7-8 = 80 = 35
A: Indrasti dan Wilmot (2001) B: Japan Bark Compost Association (Harada et.al., 1993) C: SNI Kompos (19-7030-2004) D: Depatemen Pertanian (2004)
Kualitas kompos sangat ditentukan oleh beberapa kriteria yaitu; kematangan kompos, kandungan unsur hara kompos, kandungan bahan berbahaya dan kandungan mikroba patogen dalam tanah. Gaur (1980) menyatakan bahwa kompos yang baik berstruktur remeh dan tidak menggumpal, berwarna coklat
27
kehitaman, bau humus dan reaksi agak masam sampai netral. Nisbah C/N berkisar 5-20 dan kompos yang stabil mengandung N dalam bentuk senyawa nitrat dan tidak ada N dalam bentuk amonia (Murbandono, 2005).
3.4.3 Analisis Residu Profenofos Analsis residu profenofos menggunakan Gas Chromatography (GC) dilakukan dengan metode shaker. Spesifikasi GC yang digunakan adalah adalah: tipe GC Shimadzu Model GC-4CM, kolom OV 17, Dimensi kolom panjang 2m dan diameter 3 mm, detektor
63
Ni ECD, phase gerak N2, sensitivitas 102, laju alir
30 ml/menit, kecepatan kertas 5mm/menit, attunation 4, suhu kolom 210oC, suhu detektor dan injektor 250 oC. Metode kerja analisis residu profenofos secara rinci dapat dilihat pada Lampiran 12.
3.4.4 Analisis Mikroba Analisis mikroba meliputi: jumlah populasi bakteri, isolasi jenis bakteri, analisis aktivitas bakteri dan uji kemampuan bakteri mendegradasi profenofos. Analisis jumlah populasi bakteri dilakukan dengan metode TPC pada media agar PCA/Plate Count Agar. Mikroba yang terdapat di dalam campuran pengo mposan masih merupakan koloni beberapa jenis bakteri sehingga perlu dilakukan isolasi untuk mendapatkan isolat/biakan murni (koloni tunggal). Isolasi bakteri dapat dilakukan dengan 2 cara yaitu: metode cawan tuang/taburan (Pour Plate Method) dan metode cawan gores
(Streak Plate Method ) seperti yang dilakukan pada
penelitian ini. Metode awan tuang dilakukan dengan cara menginokulasi medium agar yang sedang mencair pada temperatur 50oC dengan suspensi bahan yang mengandung bakteri dan menuangkannya ke dalam cawan petri, setelah diinkubasi akan terlihat koloni-koloni yang tersebar di pemukaan agar. Mikroba dapat mendegradasi pestisida apabila mikroba tersebut telah beradaptasi dengan lingkungan yang mengandung pestisida. Pada proses adaptasi tersebut terjadi sintesis enzim yang dibutuhkan untuk mendegradasi senyawasenyawa rekalsitran (Gumbira dan Fauzi, 1996).
28
Sebelum melakukan pengujian kemampuan bakteri dalam mendegradasi profenofos, bakteri diadaptasikan dahulu pada media padat NA adaptasi yang mengadung profenofos. Bakteri yang mampu tumbuh diuji kemapuannya mendegradasi profenofos dengan uji pembentukan zona jernih pada media MSPY (Mineral Salt Pepton Yeast) yang mengandung profenofos. Bakteri tersebut diinkolasi selama 4 hari. Pembuatan media padat NA adaptasi sama dengan media padat NA yang mengadung nistayn. Perbedaanya pada media padat NA adaptasi tidak ditambahkan nistatyn tetapi ditambahkan profenofos dengan konsentrasi yang berbeda. Analisis Aktivitas Mikroba dilakukan dengan metode Fluorescent Diacetate Assay (FDA) seperti yang dilakukan Eggen (1999). FDA digunakan untuk membandingkan aktivitas mikroba hydrolitik dalam satu eksoterm yang sama. Analisis FDA dilakukan dengan cara menginkubasi sampel dalam larutan buffer yang bertindak sebagai penerima elektron yang menurunkan warna fluoroscent. Intensitas warna ditentukan dengan spektrofotometer. Metode kerja analisis mikroba secara rinci dapat dilihat pada Lampiran 13.
29
