III. METODE PENELITIAN 3.1 Tempat dan Waktu Laboratorium yang digunakan adalah Lab. Bakteriologi dan Lab. Terpadu FKH-IPB serta Lab. Bioteknologi Hewan dan Biomedis Pusat Riset Bioteknologi-IPB. Tempat pengambilan sampel penelitian di Rumah Sakit Marinir Cilandak Jakarta. Penelitian ini telah berlangsung dari April 2002 hingga Desember 2005. 3.2 Bahan dan Alat Penelitian Bahan penelitian terdiri dari sampel swab vagina dan swab rektum dari ibu hamil yang mengalami komplikasi obstetri. Bahan penunjang lain adalah media perbenihan bakteri berupa media agar darah domba 5% (Merck, Darmstadt, Jerman), Todd-Hewitt Broth (THB) (Gibco, Karlsruhe, Jerman), soft-agar (10 ml Brain Heart Infusion dari Gibco ditambah 0,15% agar) dan Tryptic Soy Agar. Bahan kimiawi yang digunakan antara lain adalah Agarose (Serva, Heiderberg, Jerman), Polyetylen-glycol (PEG) 6000 (Serva), Phosphat buffer saline (PBS), asam hialuronat (Sigma), Bovine Serum Albumin (BSA) (Serva), amonium sulfat (NH4)2SO4, sephadex (Sigma), bufer Tris-HCl 0,1M; SDS 10%, Acrylamide/bis, Amonium persulfat 10%, TEMED, Comassie blue R 250 (Serva, Jerman), molekul marker untuk protein, antimouse IgG Peroxidase Conjugate (Sigma), mouse IgG (Sigma) dan reagen-reagen untuk ELISA. Hewan yang digunakan adalah kelinci lokal, mencit (strain DDY) yang diperoleh dari PT. Biofarma. Bakteri referens SGB (International Referens Strain) yang digunakan untuk membuat antiserum monospesifik: Strain 090 (tipe Ia), R36B (tipe Ib), 18RS21 (tipe II), COH-1 (tipe III), 3139 (tipe IV), SS1169 (tipe V), NT6 (tipe VI), 7271 (tipe VII), JM9-130013 (tipe VIII). Staphylococcus aureus K-39 digunakan untuk uji CAMP. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini selain alat-alat yang biasa digunakan di Laboratorium Mikrobiologi, digunakan juga kolom kromatografi berdiameter 1 cm dengan tinggi 40 cm dan fraction collector, alat elektroforesis, perangkat ELISA, spuit disposible ukuran 1 ml dan jarum suntik nomor 27 serta kandang hewan percobaan.
3.3 Metode Penelitian 3.3.1 Isolasi dan Identifikasi Bakteri Bakteri diisolasi dari swab vagina dan swab rektum ibu hamil yang mengalami komplikasi obstetri dengan menumbuhkannya pada plate agar darah domba 5%. Identifikasi dilakukan dengan uji CAMP dan uji imunodifusi melalui Agar Gel Presipitation Test (AGPT) (Hayati et al. 2004). 3.3.1.1 Uji Christie, Atkins and Munch Petersen (CAMP) Bakteri yang morfologinya koloninya mirip dengan morfologi koloni SGB yang diperoleh dari hasil isolasi primer dipilih untuk isolasi sekunder. Preidentifikasi terhadap kandidat SGB tersebut dilakukan dengan uji CAMP. Untuk melakukan uji CAMP dibutuhkan agar darah domba 5% (Merck, Darmstadt, jerman). Staphylococcus aureus strain K-39 digoreskan secara vertikal, kemudian tegak lurus dengan goresan ini dibuat goresan dari semua isolat kandidat SGB berjarak kira-kira 3 – 5 mm. Biakan diinkubasi dalam inkubator selama 18 – 24 jam pada suhu 37oC. Bakteri menunjukkan reaksi positif bila adanya hemolisis sempurna berbentuk kepala panah (arrowhead) atau bentuk setengah bulan di daerah zona hemolitik S. aureus. Bakteri-bakteri yang menunjukkan reaksi positif pada uji ini selanjutnya ditentukan serogrupnya dengan mengunakan uji imunodifusi. 3.3.1.2 Penentuan Serogrup a. Ekstraksi Antigen Autoklaf Preparasi antigen dilakukan secara ekstraksi autoklaf. Bakteri ditumbuhkan dalam 50 ml Todd Hewitt Broth (THB) (Gibco, Karlsruhe, Jerman) pada suhu 37oC selama 18 – 24 jam lalu disentrifus 3000 rpm selama 10 menit, pelet yang diperoleh dicuci sebanyak 2 kali dengan 5 cc NaCl 0,14 M. Pelet yang terakhir dilarutkan dengan 0,35 ml NaCl 0,14 M dan dihomogenkan. Suspensi ini kemudian ditetesi dengan indikator phenol red dan dinetralkan dengan menggunakan NaOH 1 N dengan pH netral sehingga suspensi berwarna merah jambu/merah. Suspensi selanjutnya diautoklaf selama 15 menit pada suhu 120oC kemudian disentrifus selama 10 menit dengan kecepatan 3000 rpm dan supernatan
yang dihasilkan digunakan sebagai antigen. Sebelum digunakan antigen tersebut disimpan pada suhu –200C. b. Produksi Antibodi Monospesifik-grup terhadap SGB Bakteri referens dibiakkan dalam 50 ml Todd-Hewitt Broth (THB) selama 18-24 jam pada suhu 370C. Sedimen bakteri yang diperoleh setelah disentrifus 3000 rpm selama 10 menit, disuspensikan ke dalam PBS 5 ml kemudian diagitasi. Hal ini dilakukan 3 kali dan untuk sedimen yang terakhir ditambahkan 5 ml PBS/NaCl fisiologis lalu diagitasi. Untuk melakukan inaktivasi, suspensi ini ditangas dalam waterbath selama 1-2 jam pada suhu 600C. Suspensi ini siap digunakan sebagai vaksin. Minggu pertama hari ke-1, kelinci disuntik secara intravena (vena auricularis) dengan 1 ml vaksin. Pada minggu kedua dan ketiga hari ke-1, 2 dan 3 kelinci diberikan boster masing-masing sebanyak 1 ml. Pada minggu ketiga hari ke-7 dilakukan pengambilan darah dari arteri aurikularis sebanyak 2 ml, masukkan dalam inkubator selama 2 jam kemudian simpan dalam frizer selama satu malam. Cairan bening yang terbentuk dimasukkan dalam tabung baru, lalu kespesifikan antibodi diuji dengan mereaksikan antiserum dengan antigen ekstraksi autoklaf melalui AGPT. Jika belum memberikan reaksi positif maka vaksinasi dilanjutkan pada minggu keempat. Pada hari ke-7 serum diuji kembali, jika hasil uji ini memberikan reaksi positif maka darah kelinci dapat dipanen seluruhnya. c. Uji serogrup melalui Agar Gel Presipitation Test (AGPT) Untuk membuat media agar, ke dalam sebuah erlenmeyer dicampur 0,4 gram agarose (Serva, Heiderberg, Jerman) dan 1,2 gram polyetylen-glycol (PEG 6000, Serva), kemudian dilarutkan dalam 20 ml akuades dan 20 ml phosphat buffer salin (PBS) 0,5 M, pH 7,2. Suspensi ini ditangas pada air mendidih sehingga campuran ini larut secara sempurna. Dengan menggunakan pipet ukur 10 ml agar cair yang sudah suam-suam kuku dituangkan pada 6 buah gelas objek dan ditunggu sampai mengeras. Pada agar ini dibuat sumur-sumur untuk antigen dan anti-sera homolognya dengan menggunakan Gel Puncter. Ke dalam sumur di bagian tengah diisikan anti-sera sedangkan antigen-antigen yang diuji dimasukkan
pada sumur-sumur yang mengelilinginya. Rak yang berisi gelas objek ini kemudian ditaruh pada tempat yang telah diberi alas kertas saring basah untuk menjaga kelembabannya. Reaksi ini dibaca setelah 18 – 48 jam dengan melihat garis presipitasi pada daerah antigen dan anti-sera yang homolog. 3.3.2 Karakterisasi Fenotipe Antigen Kapsul polisakarida Ekspresi fenotipe bakteri diuji dengan melihat pola pertumbuhannya pada media cair dan soft-agar serta melihat sifat hidrofobisitasnya dengan salt agregation test (SAT) (Wibawan dan Laemmler 1991). 3.3.2.1 Pertumbuhan pada Media Cair dan Soft-Agar Untuk melihat pola pertumbuhan bakteri pada media cair, isolat SGB ditumbuhkan dalam medium THB, diinkubasi selama 18 – 24 jam pada suhu 37oC, dan diamati sifat pertumbuhannya tanpa mengocok biakan tersebut. Pola pertumbuhan bakteri dinyatakan keruh apabila supernatan tampak keruh serta jernih bila supernatan tampak jernih dan ada sedimen sel bakteri di bawah tabung dan atau adhesif/menempel pada dinding tabung. Untuk melihat sifat pertumbuhan bakteri pada agar lunak, satu Ose SGB yang telah ditumbuhkan pada THB, diencerkan dalam 10 ml NaCl fisiologis steril. Satu Ose suspensi ini diinokulasikan pada medium soft-agar (10 ml Brain Heart Infusion, Gibco, 0,15% agar) yang telah dihangatkan hingga suam-suam kuku, diagitasi dengan vortex selama 30 detik, diinkubasi 18 – 24 jam pada suhu 37oC. Pertumbuhan koloni dibedakan atas dua tipe yaitu difus dan kompak. 3.3.2.2 Uji Hidrofobisitas dengan SAT. Bakteri ditumbuhkan dalam 10 ml THB selama semalam pada suhu 37oC kemudian disentrifus 3000 rpm selama 10 menit. Pelet yang diperoleh dilarutkan dalam 2 mM PBS pH 6.8 dan kekeruhannya disetarakan dengan BaSO4 transmisi 10% pada panjang gelombang 620 nm sehingga suspensi ini mengandung 109 sel per ml. Amonium sulfat dibuat dalam beberapa konsentrasi yaitu 1.2, 1.6, 2, 2.4, 2.8 dan 3 M. Sebanyak 25 µl suspensi bakteri dicampurkan dengan larutan (NH4)2SO4 sama banyak di atas gelas objek. Reaksi positip ditandai dengan adanya agregasi sel bakteri yang jelas (Wibawan dan Laemmler 1991).
3.3.3 Penentuan Serotipe Antigen Kapsul Polisakarida Penentuan serotipe dilakukan dengan mereaksikan antigen yang dipreparasi secara ekstraksi HCl dengan antisera monospesifik-tipe melalui uji AGPT (Wibawan & Laemmler 1991). a. Antigen Ekstraksi HCl Untuk preparasi antigen ekstraksi HCl, bakteri dibiakkan dalam 50 ml THB selama 18 - 24 jam dalam inkubator pada suhu 370C, disentrifus 3000 rpm selama 10 menit, sedimen ditambah dengan 0,35 ml HCl 0.2 N, dihomogenkan secara sempurna. Suspensi kemudian ditangas dalam penangas air selama 2 jam dengan suhu 520C. Setelah dingin ditetesi indikator dan dinetralkan dengan NaOH 0,1 N kemudian disentrifus 5 menit dengan kecepatan 3000 rpm, sedimen yang diperoleh dibuang dan supernatan diambil sebagai antigen. b. Pembuatan Antisera Monospesifik-tipe Prosedur pembuatan antisera monospesifik-tipe sama dengan pembuatan antisera monospesifik-grup, tetapi untuk ini digunakan 9 bakteri referens international strain 090, R36B, 18RS21, COH-1, 3139, SS1169, NT6, 7271, JM9130013 masing-masing tipe Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII dan VIII. c. Uji serotipe melalui Agar Gel Presipitation Test (AGPT) Untuk membuat media agar sama dengan uji serogrup. Ke dalam sumur di bagian tengah diisikan anti-sera spesifik-tipe sedangkan antigen-antigen ekstraksi HCl yang akan diuji dimasukkan pada sumur-sumur yang mengelilinginya. Rak yang berisi gelas objek ini kemudian ditaruh pada tempat yang telah diberi alas kertas saring basah untuk menjaga kelembabannya. Reaksi ini dibaca setelah 18 – 48 jam dengan melihat garis presipitasi pada daerah antigen dan anti-sera yang homolog. 3.3.4 Penentuan Hialuronidase 3.3.4.1 Uji Plate Agar- Hyaluronidase Uji Plate Agar- Hyaluronidase dilakukan dengan metode Christ (1989). Untuk membuat media agar, dicampurkan 100 ml BHI dan 1 g Noble-agar (Difco,
Detroit) lalu disterilkan dalam autoklaf. Kemudian ditambahkan 50 mg asam hialuronat (Sodium-salt from human umbilical cord, Sigma, Stockholm) dalam 25 ml air dan 1,25 g bovines serum albumin (BSA, Serva) yang dipreparasi secara steril lalu dimasukkan dalam plate. Bakteri SGB diinkubasikan dalam media ini selama 24 jam pada suhu 370C, Kemudian dialirkan 5 ml asam cuka 2 mol/l. Streptokokus yang positip hialuronidase akan memperlihatkan zona bening disekelilingnya. 3.3.4.2 Isolasi Hialuronidase dalam Supernatan Bakteri SGB ditumbuhkan dalam 50 ml THB yang diencerkan 2 kali, diinkubasi pada suhu 37oC selama 5 jam (nilai absorbansi 0,8 pada λ 650 nm), kemudian suspensi ini diinokulasikan kembali dalam 500 ml THB (mengandung 0,2% asam hialuronat) pada suhu 37oC selama 18 jam. Untuk mengamati fase pertumbuhan bakteri, dilakukan pengamatan dengan λ 650 nm) selama masa inkubasi. Suspensi melihat nilai optical density (λ bakteri ini kemudian disentrifugasi 4000 rpm selama 30 menit pada suhu 40C. Supernatan yang diperoleh digunakan untuk pengujian kadar protein sesuai
dengan
metode
Bradford
(1976)
dan
pengujian
aktivitas
hialuronidasenya pada substrat asam hialuronat metode Bergmeyer (1987). 3.3.4.3 Pengendapan dengan Amonium Sulfat Untuk memperoleh konsentrasi amonium sulfat yang optimum yang dapat mengendapkan protein dengan konsentrasi maksimum maka sebanyak 10 ml supernatan yang mengandung protein enzim ditambahkan dengan berbagai konsentrasi amonium sulfat berdasarkan kejenuhan (40%, 45%, 55%, 65%, 75% dan 85%). Penambahan amonium sulfat dilakukan sedikit demi sedikit dengan magnetic stirer pada suhu dingin. Setelah semua amonium sulfat larut, didiamkan semalam pada suhu 4oC. Endapan yang terbentuk dari hasil sentrigasi 10.000 rpm selama 30 menit pada suhu 4oC, diresuspensi dalam bufer phosfat pH 6,4. Selanjutnya dilakukan pengujian kadar protein dan aktivitas hialuronidase. Konsentrasi amonium sulfat yang menghasilkan konsentrasi protein dan aktivitas hialuronidase tertinggi digunakan sebagai patokan untuk pengendapan selanjutnya.
3.3.4.4 Dialisis Dialisis dilakukan untuk menghilangkan garam yang tersisa pada proses pengendapan dengan amonium sulfat. Kantong dialisis (Sigma) dengan lebar 25 mm dan diameter 16 mm dipotong sepanjang 10 cm dan dicuci dengan air mengalir selama 3-4 jam. Kantong ini selanjutnya dipanaskan selama 30 menit dalam 1 mM EDTA, selanjutnya dilakukan pencucian dengan air bebas ion. Sebanyak 10 ml sampel enzim dimasukkan kedalam kantung dialisis dan diikat dengan benang pada kedua ujungnya. Kantung dimasukkan dalam bufer phosfat pH 6,4 dengan volume 100 kali sampel, diagitasi secara perlahan selama 1 jam pada suhu dingin. 3.3.4.5 Kromatografi Filtrasi Gel Pemurnian
dengan
teknik
kromatografi
filtrasi
gel
dilakukan
berdasarkan pada perbedaan kemampuan dari berbagai molekul protein enzim memasuki pori-pori yang terdapat pada fase diam. Sebanyak 1,7 gram Sephadex G-100 direndam dalam air bebas ion steril dan diaduk secara perlahan selama 30 menit, kemudian didiamkan semalam pada suhu 4oC. Air bebas ion dibuang dan diganti dengan bufer phosfat pH 6,4 sambil diaduk perlahan selama 30 menit kemudian didiamkan selama semalam pada suhu 4oC. Gel dicuci sebanyak tiga kali dengan bufer phosfat pH 6,4 dan didiamkan selama satu jam. Secara perlahan gel dituang ke dalam kolom kromatografi yang berdiameter 1 cm yang telah terisi bufer phosfat hingga mencapai tinggi 40 cm, diusahakan tidak ada gelembung yang terperangkap dalam kolom. Kolom diekuilibrasi dengan mengalirkan bufer phosfat pH 6,4 sebanyak 200 ml selama semalam pada suhu 4oC. Sebanyak 2 ml hialuronidase yang telah melalui proses dialisis dimasukkan dengan pipet ke dalam kolom tepat diatas permukaan gel. Larutan enzim dibiarkan mengalir perlahan sehingga seluruh enzim berada sedikit dibawah permukaan gel. Kolom diisi dengan larutan pengelusi yaitu bufer phosfat pH 6,4 lalu dilakukan fraksinasi dengan volume tiap fraksi adalah 2 ml. Selanjutnya dilakukan pengujian kadar protein dan aktivitas hialuronidase pada setiap fraksinya.
3.3.4.6 Pengukuran Konsentrasi Protein Metode Bradford Konsentrasi protein diukur dengan menggunakan standar protein Bovine Serum
Albumin (BSA) dengan konsentrasi 0,1 hingga 1 mg/ml.
Masing-masing 100 µl konsentrasi BSA ditempatkan pada tabung reaksi dan ditambahkan 5 ml pereaksi Bradford lalu diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37oC, kemudian diukur absorbansinya pada λ 595 nm sehingga didapat kurva standar yang merupakan persamaan garis regresi ( y = ax + b, dengan nilai r mendekati satu ) antara nilai absorbansi sebagai ordinat dan konsentrasi protein BSA sebagai absis. Dengan metoda yang sama untuk sampel hialuronidase, yaitu sebanyak 100 µl hialuronidase ditambah 5 ml pereaksi Bradford diinkubasi 37oC selama 5 menit lalu dilihat nilai absorbansinya pada λ 595 nm. Kadar protein hialuronidase didapat dengan memasukkan nilai absorbansi tersebut ke dalam persamaan garis yang telah dibuat. 3.3.4.7 Pengukuran Aktivitas Hialuronidase (Bergmeyer, 1987) Aktivitas hialuronidase diukur berdasarkan perbandingan absorbansi pada panjang gelombang 232 nm dengan asam hialuronat sebagai substrat. Prosedur uji aktivitas hialuronidase adalah: Larutan
Sampel
Standar
Konsentrasi
Buffer phospat
1ml
1,5 ml
37 mmol/liter
Asam hialuronat
0,5 ml
0,5 ml
27,8 mg/liter
Larutan NaCL
0,5 ml
1 ml
45,8 mmol/liter
o
Inkubasi pada suhu 70 C, selama 10 menit Hialuronidase
0,1 ml
0,1 ml
3 U/liter
Inkubasi pada suhu 37 oC, selama 6 jam Perkhlorit acid
0,5 ml
0,5 ml
Sentrifugasi 5000 g, selama 20 menit, selanjutnya dilihat absorbansinya pada λ 232 nm. Absorbansi sampel (A1) dan absorbansi standar (A2) Aktivitas (U/ml) = A1 / A2 x 0,003 U/ml
3.3.4.8 Penentuan Berat Molekul dengan SDS-PAGE (Sodium Dodecyl SulphatePolyacrilamide Gel Electroforesis) Hialuronidase dalam supernatan, hasil pengendapan amonium sulfat, hasil dialisis dan hasil pemurnian dari fraksi yang paling kuat aktivitasnya terhadap asam hialuronat ditentukan berat molekulnya dengan SDS-PAGE metode Laemmli. Gel terdiri dari 12,5% gel pemisah (separating gels) dan 4% gel pengumpul (stacking gels) yang tebalnya 0,75 mm, panjang 5 cm dan lebar 9 cm. Bahan-bahan yang digunakan adalah: No
Bahan
Gel Pemisah 12,5 %
Gel Pengumpul 4 %
1
Lar.stock acrilamid
6,25 ml
0,83 ml
2
Akuades
4,4 ml
3,4 ml
3
Bufer gel pemisah (8,8)
4,1 ml
-
4
Bufer gel pengumpul
-
0,45 ml
(6,8) 5
SDS 10%
0,15 ml
0,05 ml
6
APS 10%
100 µl
50 µl
7
Temed
25 µl
15 µl
15,025 ml
4,795 ml
Jumlah
Dua lempeng kaca yang merupakan cetakan gel dari alat elektroforesis (Pharmacia, Biotech) dihimpitkan dan diantaranya diletakkan spacer (pemisah) pada bagian tepi cetakan. Gel pemisah dimasukkan (kurang lebih 4 ml atau 1 cm dibawah sisir) ke dalam kaca yang telah dipasang sebelumnya. Setelah gel pemisah membeku, gel pengumpul dimasukkan dengan bantuan sisir (comb) untuk membuat sumur-sumur tempat memasukkan contoh protein terlarut yang akan dipisahkan. Setelah gel pengumpul membeku, sisir diangkat. Sampel sebanyak 15 µl ditambahkan buffer sampel 10 µl lalu dididihkan selama satu menit sebelum diinjeksikan kedalam sumur. Marker yang digunakan adalah High Molecular Weight. Elektroforesis dijalankan dengan arus 20 mA dan voltage 50 volt. Elektroforesis dihentikan bila pewarna sampel mencapai batas 0,3 – 0,5 cm di bagian bawah gel. Setelah elektroforesis selesai, gel dilepas dan diwarnai dengan larutan biru komasi (Comassie blue R 250, Serva Germany). Pewarnaan dilakukan
selama dua jam, setelah itu gel dipucatkan dengan larutan pencuci (destainning) selama semalam sambil digoyang-goyang sampai timbul pita-pita protein. Setelah pita protein timbul, gel difiksasi dengan larutan fiksasi. Pengukuran berat molekul hialuronidase didasarkan pada kurva standar yang diperoleh dari persamaan garis antara berat molekul protein standar dengan nilai mobilitas relatif (Rf). 3.3.5 Uji Patogenisitas Uji patogenisitas dilakukan dengan pendekatan model septikemia earlyonset pada mencit neonatus yang dilakukan oleh Rodewald et al. (1992). a. Preparasi Inokulum Setiap strain bakteri diinokulasi dalam 50 ml Todd-Hewitt broth pada suhu 370C selama semalam, kemudian disentrifus 3000 rpm selama 10 menit dan dicuci 2 kali dengan PBS. Pelet terakhir diresuspensi dalam PBS dan dikalibrasi hingga setara dengan Mc. Farlan 0.5. Suspensi ini kemudian diencerkan secara bertingkat hingga sebanyak 5 kali hingga setara dengan 104 bakteri/ml. b. Penyuntikan bakteri SGB Mencit neonatus strain DDY (dari P.T. Biofarma) usia 0-48 jam diinfeksikan dengan SGB secara intraperitoneal. Pengamatan terhadap kematian akibat infeksi early-onset dilakukan hingga 48 jam kemudian. Pengamatan terhadap infeksi lateonset dilakukan 48 jam hingga 2 minggu kemudian. Mencit dibagi menjadi 10 kelompok sesuai dengan strain bakteri yang berjumlah 10 strain. Satu kelompok mencit terdiri dari 5 ekor neonatus dan diberikan injeksi suspensi bakteri sebanyak 0,1 ml suspensi bakteri yang mengandung 104 bakteri/ml. Kelompok kontrol diberikan injeksi PBS 0,1 ml (Rodewald et al. 1992; Mancuso et al. 1994). c. Kultur Darah Untuk membuktikan adanya septikemia, setiap strain bakteri diinfeksikan secara intraperitoneal pada mencit neonatus dengan dosis sama seperti di atas. Empat – 8 jam pascainfeksi darah mencit neonatus diambil dengan cara punksi percutaneous cardiac dengan jarum berukuran 27. Darah yang diperoleh dimasukkan dalam larutan tryptic soy agar yang masih hangat-hangat kuku (460C)
dalam plate steril lalu dicampur sambil memutar-mutar plate. Koloni yang representatif dikonfirmasi dengan uji CAMP. 3.3.6 Uji Sensitivitas Antibiotika Uji sensitivitas terhadap antibiotika dilakukan dengan metode difusi cakram Kirby Bauer menggunakan kertas cakram yang mengandung bacitracin (10 IU), erytromycin (15 µg), gentamicin (10 µg), penicillin (10 IU), Ampicillin (10 µg), chloramphenicol (30 µg), vancomycin (30 µg) dan tetracycline (30 µg) (BectonDickinson, Heidelberg, Germany). Bakteri dari medium agar darah domba diambil dengan ose dan dimasukkan dalam larutan NaCl fisiologis kemudian disetarakan dengan larutan barium sulfat (BaSO4) 0.5 Mc. Farlan atau dengan menggunakan spektrofotometri bernilai 0.08-0.10 pada A625. Kapas lidi dimasukkan ke dalam suspensi bakteri tersebut dan diputar 2 kali pada dinding tabung kemudian diulas pada permukaan agar Muller Hinton (mengandung darah domba 5%) hingga merata lalu diamkan 3-5 menit. Cakram antibiotika diletakkan secara aseptik di atas ulasan bakteri dengan jarak antar cakram kira-kira 24 mm (tidak lebih dari 5 cakram pada plate yang berukuran 100 mm) Cakram sedikit ditekan supaya menempel pada media dan tidak mudah bergerak. Media diinkubasi dengan selama 16-18 jam pada suhu 37oC. Kepekaan bakteri terhadap antibiotika dievaluasi dengan mengukur diameter hambatan pertumbuhan (satuan mm) dengan sliding caliper Hasil yang diperoleh diinterpretasi peka, intermediate atau resisten sesuai rekomendasi NCCLS. 3.3.7 Uji Imunogenisitas a. Preparasi Vaksin Tiap-tiap isolat SGB diinokulasi dalam 50 ml THB pada suhu 370C selama semalam lalu disentrifus 10 menit, 3000 rpm. Pelet yang diperoleh dicuci 2 kali dengan PBS. Pelet yang terakhir diresuspensikan dalam PBS dan konsentrasi bakteri dikalibrasi dengan larutan barium sulfat (BaSO4) yang telah ditentukan dengan spektrofotometrik pada panjang gelombang 620 nm, transmisi 10% sehingga jumlah bakteri setara dengan 109 bakteri/ml. Suspensi bakteri ini diinaktifkan dengan pemanasan 520C selama 1 jam.
b. Vaksinasi Vaksinasi mencit betina bunting dengan vaksin bakteri SGB yang dilemahkan dengan pemanasan dilakukan secara intraperitoneal dengan dosis vaksin adalah 0,5 ml. c. Preparasi Serum Darah diambil pada hari ke-1, ke-3 dan ke-5 pascavaksinasi melalui sayatan kecil di ekor lalu dimasukkan dalam tabung ependorf steril dan disentrifus 5000 rpm selama 10 menit. Serum yang terbentuk dipindahkan dalam tabung yang baru dan disimpan pada suhu −200C. Pengukuran titer antibodi IgG dilakukan dengan metode ELISA. d. ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Uji ELISA dilakukan dengan modifikasi metode yang telah dilakukan oleh Paoletti dan Kasper (2002). Mikrotiter pelat dilapisi dengan vaksin SGB yang telah dilemahkan masing-masing 100 µl per sumur dalam bufer karbonatbikarbonat. Pelat diinkubasi semalam pada suhu 40C. Pelat dicuci 4 kali dengan larutan pencuci (0.05% PBS-Tween 20). Kemudian ditambahkan larutan penghambat (5% susu skim dalam 0,1% PBS-Tween 20) sebanyak 300 µl per sumur, inkubasi selama 2 jam pada suhu 370C. Pelat dicuci 4 kali dengan larutan pencuci. Sampel serum diencerkan 1:100, sedangkan standar mouse IgG diencerkan secara bertingkat sebanyak 6 kali yaitu 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600 dan 1:3200 kemudian dimasukkan masing-masing sebanyak 100 µl per sumur lalu diinkubasi selama 1 jam pada suhu 370C. Pelat dicuci kembali dengan larutan pencuci. Kemudian ke dalam masing-masing sumur dimasukkan 100 µl anti-mouse IgG peroxidase conjugate dengan pengenceran 1:1000, inkubasi kembali selama 1 jam pada suhu 370C. Pelat dicuci 4 kali dengan larutan pencuci. Substrat TMB dalam bufer phosphate citrate dimasukkan 100 µl ke dalam masing-masing sumur. Pelat diinkubasi dalam tempat gelap pada suhu ruang selama 20 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 25 µl H2SO4 2M, kemudian pelat dibaca pada 450 nm dengan menggunakan ELISA reader.
e. Pengukuran Konsentrasi Imunoglobulin G Konsentrasi IgG diukur dengan menggunakan standar IgG mouse (Sigma) dengan konsentrasi awal 1 mg/ml. Kurva standar didapat dari persamaan garis regresi (y = ax + b, dengan nilai r mendekati satu) antara nilai absorbansi yang diperoleh sebagai ordinat dan konsentrasi IgG standar sebagai absis. Konsentrasi IgG sampel didapat dengan memasukkan nilai absorbansinya ke dalam persamaan garis yang didapat. 3.3.8 Analisis Data Karakterisasi faktor-faktor virulensi, uji sensitivitas antibiotika dan uji patogenisitas dianalisis secara diskriptif, sedangkan uji imunogenisitas dianalisis secara statistik dengan menggunakan uji anova yang dilanjutkan dengan uji Duncan (Gomez & Gomez 1995).
