II. METODELOGI PENELITIAN
2.1. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian diadakan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. Pengambilan sampel dilakukan di perkebunan sayuran Desa Candi Kuning Kecamatan Baturiti Kabupaten Tabanan. Penelitian dilakukan selama 3 bulan mulai dari bulan November 2011 sampai Januari 2012.
2.2. Penelitian Pendahuluan (Pra-Penelitian) Penelitian pendahuluan dilakukan untuk mengetahui metode pengenceran yang sesuai dalam menghitung populasi bakteri pelarut fosfat, sehingga diketahui seri pengenceran yang tepat agar bakteri pelarut fosfat yang tumbuh pada media dapat dihitung dengan baik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada pengenceran 10-1, 10-2, dan 10-3 pertumbuhan bakteri pelarut fosfat pada media pikovskaya sangat padat dan sulit untuk dihitung. Sedangkan pada pengenceran 10-4, 10-5 dan 10-6, pertumbuhan bakteri pelarut fosfat dapat dihitung karena pertumbuhan koloni pada media sudah terpisah. Hasil penelitian pendahuluan dapat dilihat pada Lampiran 7.
6
2.3. Metode Penelitian Alur Penelitian disajikan dalam bentuk bagan seperti di bawah ini Pengambilan Sampel
Menghitung Total Bakteri dan Isolasi
Analisis Tanah (tekstur tanah, kandungan bahan organik tanah, kandungan fosfat
Pemurnian dan Karakterisasi Bakteri
tanah, kelembaban tanah dan pH tanah)
Identifikasi Bakteri Gambar 1. Skema Alur Penelitian
2.3.1. Teknik Pengambilan Sampel Sampel tanah diambil dari perkebunan sayuran di Desa Candi Kuning, Kecamatan Baturiti, Kabupaten Tabanan yang ditanami jenis sayuran yang berbeda yaitu wortel, kentang, kubis, brokoli dan bawang prei. Lahan perkebunan memiliki ketinggian dan suhu yang sama (diasumsikan kondisi perkebunannya homogen). Pengambilan sampel tanah dilakukan dengan metode composite yaitu pada 1 lahan perkebunan jenis wortel ditentukan 5 titik (2 titik di pojok atas kiri kanan, 2 titik di pojok bawah kiri kanan dan 1 titik di tengah) setelah itu sampel tanah tersebut dicampur (composite) jadi satu, hasil composite tersebut masing -masing dibagi 3 sehingga diperoleh 3 sampel dalam 1 lahan perkebunan. Metode tersebut dilakukan pada kelima tanaman sehingga diperoleh total sampel 15 sampel tanah. Pengambilan sampel tanah dilakukan dengan menggunakan bantuan paralon dan sekop pada kedalaman ± 25 cm di daerah dekat perakaran tanaman (Ginting dkk., 2006; Wulandari, 2001).
7
2.3.2. Menghitung Total Bakteri Pelarut Fosfat Total bakteri yang terdapat pada sampel tanah dihitung dengan menggunakan metode pengenceran Platting Method (Pelczar dan Chan, 2006). Sampel tanah ditimbang sebanyak 10 gram kemudian dimasukkan ke dalam 90 mL air steril, sehingga diperoleh pengenceran 10 kali (10-1) kemudian di vortex sampai homogen, selanjutnya dibuat seri pengenceran dari pengenceran 10 kali tersebut diambil 1 mL secara aseptik dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi 9 mL air steril untuk memperoleh pengenceran 100 kali (10-2). Tabung reaksi tersebut kemudian di vortex sampai homogen, kemudian dari pengenceran 100 kali diambil lagi 1 mL secara aseptik dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi air steril sebanyak 9 mL untuk memperoleh pengenceran 1000 kali (10-3). Pengerjaan diulangi sampai memperoleh seri pengenceran 1.000.000 kali (10-6). Selanjutnya dilakukan penanaman seri pengenceran tersebut dengan menggunakan metode cawan tuang atau pour plate (Pelczar dan Chan, 2006). Metode ini dilakukan dengan cara dipipet 1 mL dari pengenceran 10-4, 10-5 dan 106
lalu dituangkan dalam 3 cawan petri steril kemudian dituangkan media
pikovskaya. Setelah itu digoyangkan ke kiri dan ke kanan, setelah homogen lalu cawan petri tersebut diinkubasi pada suhu 280C selama 72 jam (3 hari). Lalu diamati koloni bakteri yang tumbuh dan dihitung jumlahnya. Koloni bakteri yang tumbuh pada media pikovskaya akan tampak putih dan memiliki zone bening di sekeliling koloni tersebut. Rumus yang digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pelarut fosfat yaitu, Jumlah total bakteri = Jumlah koloni per cawan
1 Faktor Pengenceran
Dengan satuan CFU/g tanah (Colony Forming Units) (Dwidjoseputro, 2006; Gobel, 2008).
8
2.3.3. Pemurnian dan Karakterisasi Bakteri Koloni bakteri yang tumbuh dari media pikovskaya dipilih yang memiliki bentuk, ukuran, tekstur dan warna berbeda, kemudian koloni tersebut diambil dengan ose lalu di goreskan pada cawan petri yang sudah diisi media pikovskaya dengan metode streak for single colony agar didapatkan biakan murni (Ramona dkk., 2007) setelah itu, di inkubasi pada suhu 280C selama 24 jam. Setelah diperoleh koloni dalam satu sel, maka koloni tersebut di streak kembali pada media agar miring dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 280C sehingga diperoleh isolat bakteri pelarut fosfat yang selanjutnya dilakukan identifikasi.
2.3.4. Teknik Identifikasi Bakteri Identifikasi bakteri dapat disajikan dalam bagan di bawah ini Pengamatan Makroskopis
Pengamatan Mikroskopis
Uji Biokimia
Uji Mac Conkey Agar
Uji Hemolisa Darah
Uji Penggunaan Sitrat
Uji Katalase
Uji Oksidase
Uji TSI (Tripel Sugar Iron)
Gambar 2. Skema Identifikasi Bakteri
9
Uji Gula-gula
Uji SIM (Sulfida Indol Motility)
2.3.4.1. Pengamatan Makroskopis Koloni bakteri yang tumbuh pada media pikovskaya setelah diinkubasi selama 48 jam, kemudian dipilih koloni yang memiliki zone bening disekelilingnya, selanjutnya koloni diamati bentuk, ukuran, tekstur dan warnanya dengan mengunakan buku Isolasi dan Identifikasi Bakteri Klinik (Soemarno, 1987).
2.3.4.2. Pengamatan Mikroskopis Pengamatan mikroskopis dilakukan dengan pewarnaan Gram bakteri. Isolat bakteri diambil sebanyak 1 ose, kemudian dibuat apusan pada kaca objek yang kering dan bersih, kemudian difiksasi di atas nyala api Bunsen yang sebelumnya sudah diwarnai dengan larutan metilen blue selama 1 sampai 1,5 menit. Setelah itu apusan yang terwarnai metilen blue tersebut dicuci dengan air suling, kemudian ditetesi larutan garam iodin dan dibiarkan selama 1 menit. Selanjutnya dicuci dengan larutan alkohol 95% sampai warna terhapus kurang lebih selama 30 detik, kemudian dicuci kembali dengan air suling dan diwarnai pewarna safranin selama 5 sampai 15 menit. Setelah itu dicuci lagi dengan air suling, kemudian dikeringkan di atas nyala api Bunsen, selanjutnya diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 100 x 100 µm (Hadioetomo, 1985).
2.3.4.3. Uji Biokimia 2.3.4.3.1. Uji Mac Conkey Agar Uji ini dilakukan untuk untuk mengidentifikasi bakteri Gram negatif, yang dilakukan dengan cara, koloni bakteri diinokulasi pada cawan petri yang telah diisi media Mac Conkey Agar, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C, lalu diamati pertumbuhannya. Uji dikatakan positif jika bakteri tumbuh pada media ini (Tirnata, tanpa tahun).
10
2.3.4.3.2. Uji Hemolisa Darah Uji ini dilakukan untuk untuk mengidentifikasi bakteri Gram positif dan mampu menghemolisis darah, yang dilakukan dengan cara, koloni bakteri di streak pada cawan petri yang berisi media Blood Agar, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C, lalu diamati. Jika area tersebut jernih, berarti terjadi hemolisis sel darah secara lengkap. Jika area berwarna hijau, berarti terjadi hemolisis sebagian pada sel darah. Sedangkan jika area tersebut tidak menunjukkan perubahan warna, berarti tidak terjadi hemolisis pada sel-sel darah (Hadioetomo, 1985).
2.3.4.3.3. Uji TSI (Triple Sugar Iron) Uji ini dilakukan untuk melihat kemampuan bakteri dalam memfermentasikan glukosa, laktosa dan sukrosa, yang dilakukan dengan cara, isolat bakteri diinokulasikan pada media TSI Agar (Triple Sugar Iron Agar) miring dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Bakteri tumbuh ditandai dengan terbentuknya warna merah atau kuning pada lereng dan dasar koloni, serta ada atau tidaknya gas di bagian bawah tabung yang dapat dilihat dengan terangkatnya agar. Warna merah yang terbentuk menunjukkan bakteri tidak memfermentasi laktosa dan sukrosa sedangkan warna kuning menunjukkan bakteri memfermentasi glukosa (Rahmadhany dan Amiruddin, 2008).
2.3.4.3.4. Uji SIM (Sulfida Indol Motility) Uji ini dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya hidrogen sulfit (H2S), formasi indol dan motilitas bakteri, yang dilakukan dengan cara, isolat bakteri diinokulasikan pada media SIM dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C.
11
Hasil positif adanya H2S ditandai oleh terbentuknya warna hitam yang menunjukkan bahwa bakteri menghasilkan H2S. Hasil positif untuk formasi indol ditandai oleh formasi warna merah yang menunjukkan produksi indol dari tryptofan setelah ditetesi dengan reagen indol (Monoclonal Blood Grouping Reagent) dalam waktu beberapa detik. Hasil positif pergerakan (Motility) ditandai dengan adanya penyebaran yang berwarna putih seperti pada akar disekitar inokulasi yang menunjukkan bakteri memiliki flagel (Hadioetomo, 1985).
2.3.4.3.5. Uji Penggunaan Sitrat Uji ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menguraikan sitrat, yang dilakukan dengan cara, isolat bakteri diinokulasi pada Simons Citrate miring dan diinokulasi selama 24 jam pada suhu 370C. Hasil positif bakteri dapat menguraikan sitrat, ditunjukan dengan adanya pertumbuhan bakteri pada permukaan agar miring dan ditandai dengan berubahnya warna media dari hijau menjadi biru (Hadioetomo, 1985).
2.3.4.3.6. Uji Gula-Gula Uji ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam memfermentasi gula-gula, yang dilakukan dengan cara, isolat bakteri diinokulasi pada media gula-gula seperti glukosa, laktosa, maltosa, sukrosa, dan manitol yang selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 370C. Hasil positif ditunjukkan dengan perubahan media dari biru menjadi kuning yang menandakan bakteri mampu memfermentasi laktosa, sukrosa, maltosa dan manitol. Sedangkan akan terbentuk gas pada tabung Durham yang menandakan bakteri mampu memfermentasi glukosa (Hadioetomo, 1985).
12
2.3.4.3.7. Uji Katalase Uji ini dilakukan untuk mengetahui bakteri mampu memecah H2O2 menjadi O2 yang dilakukan dengan cara, koloni bakteri diambil dan dibuat apusan pada gelas objek kemudian ditetesi 2 tetes larutan H2O2 3%. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya gelembung gas oksigen yang
menunjukkan
bahwa
bakteri
yang
teridentifikasi
tersebut
menghasilkan enzim katalase (Hadioetomo, 1985).
2.3.4.3.8. Uji Oksidase Uji ini dilakukan untuk mengetahui bakteri tersebut menghasilkan enzim oksidase, yang dilakukan dengan cara koloni bakteri di streak pada kertas saring yang sebelumnya telah dibasahi dengan menggunakan reagen oksida (Larutan 1% ditetramethyl paramhenylen diamine dihydrocide dalam aquadest). Hasil positif ditunjukkan dengan adanya perubahan warna menjadi merah muda, lalu merah tua, merah gelap dan akhirnya hitam (Hadioetomo, 1985).
Hasil dari uji biokimia di atas akan disesuaikan dengan menggunakan kunci determinasi dari buku Bergeys’s Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 1994) sehingga diketahui jenis bakteri pelarut fosfat sampai pada tingkat genus.
2.3.5. Analisis Tanah Sampel tanah perkebunan sayuran yang dianalisis di Laboratorium Tanah Universitas Udayana. Parameter yang dianalisis adalah tekstur tanah, kandungan bahan organik tanah, kandungan unsur hara fosfat tanah, kelembaban tanah dan pH tanah.
13
2.4. Analisis Data Data yang diperoleh dalam penelitian dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif. Secara kualitatif yaitu dengan mendeskripsikan hasil isolasi dan identifikasi bakteri pelarut fosfat yang ditemukan pada sampel tanah yang diambil di perkebunan sayuran. Sedangkan secara kuantitatif dengan menghitung populasi bakteri pelarut fosfat yang ditemukan pada sampel tanah di tanah perkebunan sayuran. Data kuantitatif disajikan dalam bentuk tabel dengan menghitung standar deviasi (SD) untuk mengetahui tingkat keakuratan data yang diperoleh.
14
