II. METODELOGI PENELITIAN
2.1. Metode Pengumpulan Data 2.1.1. Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Udayana. Pengambilan sampel dilaksanakan di Denpasar. Penelitian dilakukan dari bulan November 2012 sampai Pebruari 2013.
2.1.2. Persiapan Penelitian 2.1.2.1 Pembuatan Media Pikovskaya Pembuatan media Pikovskaya sebanyak 1000 ml dilakukan dengan menimbang 5 gram Ca3(PO4)2, 0,2 gram NaCl, 0,2 gram KCl, 0,1 gram MgSO4.7H2SO4, 2,5 mg MnSO4.7H2O, 2,5 mg FeSO4.H2O, 0,5 gram (NH4)2SO4, 10 gram Glukosa, 0,5 gram yeast ekstrak, 15 gram agar, kemudian ditambahkan aquades hingga volumenya mencapai 1000 ml. Setelah itu semua bahan dicampurkan dalam elemeyer dan dipanaskan di atas penangas air sambil diaduk-aduk hingga mendidih, setelah agak dingin media tersebut ditutup dengan menggunakan kapas dan aluminium foil. Kemudian disterilisasi dengan Autoclave pada temperatur 1210C dengan tekanan 15 lbs selama 15 menit. Selanjutnya disimpan dalam lemari es (Rao, 1994; Widyastuti, 2012).
2.1.3. Pelaksanaan Penelitian 2.1.3.1. Teknik Pengambilan Sampel Pupuk Organik Pengambilan sampel pupuk organik dilakukan dengan cara pembelian sampel secara acak di beberapa tempat di daerah Denpasar yaitu di Jalan Tanjung Bungkak, Jalan Raya Niti Mandala Renon, dan di Jalan Nangka Utara. Sampel pupuk organik yang digunakan dalam penelitian ini yaitu sebanyak 6 sampel pupuk organik dengan merek yang berbeda-beda yaitu Pupuk Kompos Organik Agung, Pupuk Organik Media Euphorbia + Adenium, Pupuk Organik
5
Kompos (Limbah sapi), Pupuk Organik Kompos Cap Melon, Pupuk Full Organik (Higher For Grow) dan Pupuk Botani (Pubotan) Tanah Subur.
2.1.3.2. Isolasi dan Karakterisasi Mikroba Pelarut Fosfat dari Berbagai Merek Pupuk Organik Teknik isolasi mikroba pelarut fosfat dari pupuk organik dilakukan dengan menggunakan metode pengenceran Platting Method (Pelczar dan Chan, 2006) yaitu dengan mengambil sampel pupuk organik dan ditimbang sebanyak 10 gram. Setelah ditimbang, sampel tersebut dimasukkan ke dalam botol yang telah berisi air steril (aquades yang telah disterilisasi) sebanyak 90 ml sehingga akan di dapatkan pangkat pengenceran 10 -1. Sampel dikocok hingga homogen dan diambil secara aseptik sebanyak 1 ml dengan menggunakan pipet ukur kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi air steril sebanyak 9 ml dan dikocok hingga homogen menggunakan vortex, sampel tersebut memiliki faktor pengenceran (10-2). Kemudian dari pengenceran (10-2) tersebut diambil secara aseptik sebanyak 1 ml dan dilarutkan pada 9 ml air steril dalam tabung reaksi, dikocok hingga homogen dengan menggunakan vortex, sampel ini memiliki faktor pengenceran (10-3). Pengerjaan ini diulang sampai diperoleh pengenceran (10 -6). Metode pengenceran Platting Method ini dilakukan pada masing-masing sampel pupuk organik dengan merk yang berbeda – beda dan dilakukan dengan teknik pengenceran yang sama. Sampel pupuk organik yang telah dilakukan seri pengenceran tersebut kemudian dilakukan penanaman. Dimana sampel dengan faktor pengenceran (10-4), (10-5) dan (10-6) masing-masing diambil sebanyak 1 ml untuk dimasukkan ke dalam tiga buah cawan petri dengan menggunakan metode Pour Plate (Hadioetomo, 1990). Pada metode ini, masing-masing faktor pengenceran (10-4, 10-5, 10-6) diambil secara aseptik sebanyak 1 ml kemudian dituangkan ke dalam cawan petri steril yang kosong, lalu dituangkan media pikovskaya. Cawan petri yang sudah berisi sampel dan media pikovskaya tersebut lalu digoyangkan kekanan dan kekiri agar homogen. Penanaman ini diulangi pada sampel-sampel pupuk organik yang berbeda merek tersebut dengan teknik penanaman yang
6
sama. Setelah campuran dingin dan membeku kemudian cawan petri tersebut diinkubasi pada suhu 280C selama 24-72 jam ( Kawuri dkk., 2007). Mikroba pelarut fosfat yang telah diinkubasi selama 24-72 jam akan tumbuh pada media pikovskaya. Hal ini dikarenakan media pikovskaya tersebut merupakan media yang bersifat selektif bagi mikroba pelarut fosfat. Koloni mikroba pelarut fosfat ditentukan dengan cara mengamati zona bening yang terdapat disekitar koloni yang tumbuh tersebut.
2.1.3.3. Teknik Karakterisasi Bakteri Pelarut Posfat Pengamatan secara makroskopis koloni bakteri pelarut fosfat yang tumbuh pada media pikovskaya dilakukan dengan cara mengamati zona bening yang terdapat disekitar koloni. Kemudian dilakukan pencatatan ciri-ciri koloni tersebut yang meliputi bentuk koloni, warna, dan ukuran koloni, kemudian dilakukan karakterisasi dengan menggunakan buku Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Koloni bakteri pada media pikovskaya yang memiliki bentuk, warna, dan ukuran yang berbeda-beda tersebut kemudian dilakukan sterak (penggoresan pada media) untuk mendapatkan koloni murni dengan cara mengambil koloni menggunakan jarum ose yang kemudian digoreskan pada media pikovskaya dan diinkubasi selama 24 jam. Koloni murni yang tumbuh pada media tersebut kemudian dilakukan isolasi kembali pada media pikovskaya miring. Menurut Madjid (2010) ciri dari terisolasinya bakteri pelarut fosfat pada media Pikovskaya yaitu terdapat koloni bakteri berbentuk bulat, berwarna putih keruh dan membentuk zona bening disekitar koloninya. Pengamatan secara mikroskopis bakteri pelarut fosfat dapat dilakukan melakukan pewarnaan Gram bakteri. Dimana kaca objek yang bebas lemak ditetesi 1 tetes air steril di kedua bagian samping kanan dan kiri kaca objek tersebut. Jarum ose yang sudah dipijarkan pada api bunsen, digunakan untuk mengambil biakan murni bakteri pelarut fosfat pada media pikovskaya miring. Biakan yang diambil tersebut lalu dibuat apusan pada kaca objek yang sudah berisi air steril dengan cara digesek-gesek agar biakan tercampur air dengan merata. Setelah itu, difiksasi di atas nyala api dengan jarak kurang lebih 30 cm
7
sampai mengering. Kemudian diteteskan kristal violet dan didiamkan selama 2 menit, dibilas dengan air steril. Lalu ditetesi dengan lugol dan dibiarkan selama 1 menit, kemudian dibilas dengan alkohol 96%, dan dibilas dengan air suling. Setelah itu diwarnai kembali dengan safranin dan dibiarkan selama 10 menit. Kemudian dibilas dengan air steril dan difikasasi di atas nyala api sampai kering. Selanjutnya dilakukan pengamatan di bawah mikroskop (Hadioetomo, 1990., Ramona dkk, 2007). Pengamatan secara biokimia bakteri pelarut fosfat dilakukan dengan beberapa uji biokimia yaitu : a.Uji Mac Conkey Agar Uji ini dilakukan dengan cara mengambil biakan bakteri dengan menggunakan jarum ose dan kemudian diinokulasikan pada cawan petri yang berisi Mac Conkey Agar, kemudian diinkubasi pada suhu 37˚ C selama 24 jam. Uji dikatakan positif jika bakteri tumbuh. Uji ini dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri Gram negative (Hadioetomo, 1990).
b. Uji Hemolisa Darah Uji yang dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri Gram positif yang mampu menghemolisis darah ini dilakukan dengan cara koloni bakteri di streak pada cawan petri yang berisi Blood Agar, kemudian diinkubasi pda suhu 37˚ C selama 24 jam. Apabila area streak tersebut jernih menunjukkan terjadinya hemolisis sel darah secara lengkap, namun apabila area streak tersebut hijau artinya hemolisis sebagian pada sel-sel darah, dan apabila area streak tersebut tidak menunjukkan perubahan warna artinya tidak terjadi hemolisis pada sel-sel darah (Hadioetomo, 1990).
c. Uji Katalase Uji katalase bakteri dilakukan dengan mengambil koloni bakteri bakteri dari media pikovskaya miring dengan menggunakan ose secara aseptis. Koloni bakteri tersebut kemudian digoreskan pada kaca objek dan ditetesi dengan H2O2 3% sebanyak 1-2 tetes. Katalase positif ditandai dengan
8
munculnya gelembung gas pada kaca objek, sedangkan katalase negatif ditandai dengan tidak adanya gelembung pada kaca objek (Kurniawan, 2010). Uji ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam mengubah hidrogen peroksida menjadi oksigen dan air (Hadioetomo, 1990).
d. Uji Oksidase Uji oksidase bakteri dilakukan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menghasilkan enzim oksidase. Uji ini dilakukan dengan cara mengambil koloni bakteri dengan menggunakan jarum ose secara aseptik yang kemudian digesekkan pada kertas saring yang telah di tetesi oleh reagen oksida sebanyak 1-2 tetes. Hasil positif dari uji oksidase ini ditandai dengan perubahan warna yang terjadi pada kertas saring. Dimana kertas saring akan berubah warna dari merah, merah tua hingga gelap (Hadioetomo, 1990).
e. Uji SIM (Sulfida Indol Motility) Uji ini dilakukan dengan cara mengambil koloni bakteri menggunakan jarum ose, kemudian ditusukkan pada media SIM dan diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. Hasil positif sulfida (H2S) ditandai dengan media SIM yang berubah warna menjadi hitam. Sedangkan hasil postif motility ditandai dengan terjadnya pergerakan pada media. Motilitas bakteri ditandai dengan terbentuknya serat-serat putih seperti akar pada media. Setelah inkubasi 24 jam, media tersebut kemudian ditetesi dengan larutan indol. Reaksi bakteri terhadap indol dapat tejadi dalam beberapa detik, dengan reaksi positif indol ditandai dengan terbentuknya lingkaran seperti cincin berwarna merah pada media. Uji SIM ini bertujuan untuk mengetahui dihasilkan atau tidaknya sulfida, motility, dan indol (Hadioetomo, 1990).
f. Uji TSIA (Triple Sugar Iron Agar) Uji ini dilakukan dengan menggunakan media TSIA miring. Koloni bakteri diambil dengan menggunakan jarum ose kemudian ditusukkan pada dasar media, lalu di streak pada lereng media. Dalam uji ini akan diamati
9
perubahan warna yang terjadi pada dasar dan lereng media, berwarna merah atau kuning. Sedangkan hasil positif gas ditandai dengan terangkatnya media, yang menunjukkan bahwa bakteri tersebut dapat menghasilkan gas. Uji TSIA ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam memfermentasi glukosa, laktosa dan sukrosa. Apabila pada dasar atau lereng koloni terbentuk warna merah menunjukkan bahwa bakteri tersebut tidak memfermentasi laktosa dan sukrosa. Sedangkan apabila terbentuk warna kuning menunjukkan bahwa bakteri tersebut memfermentasi glukosa (Hadioetomo, 1990). g. Uji Simmon’s citrate Uji simmon’s citrate ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menggunakan sitrat sebagai sumber karbon, yang dilakukan dengan mengambil koloni bakteri dengan menggunakan jarum ose kemudian di streak pada media simmon’s citrate miring. Hasil positif ditandai dengan media yang berubah warna menjadi hijau (Hadioetomo, 1990).
h. Uji Gula-Gula Uji gula-gula ini meliputi uji glukosa, laktosa, manitol, maltose dan sukrosa. Koloni bakteri diambil menggunakan jarum ose, kemudian ditanam pada media cair yang telah berisi glukosa, laktosa, manitol, maltose dan sukrosa. Hasil positif ditandai dengan terjadinya perubahan warna pada media dari hitam menjadi kuning. Uji ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam memfermentasi glukosa, laktosa, manitol, maltose, dan sukrosa (Hadioetomo, 1990).
2.1.3.4. Teknik Karakterisasi Cendawan Pelarut Posfat Koloni cendawan pada media pikovskaya yang memiliki bentuk, warna, dan ukuran yang berbeda-beda tersebut kemudian dilakukan reisolasi untuk mendapatkan koloni murni dengan cara mengambil hifa atau spora cendawan pada sampel yang telah terisolasi dengan menggunakan jarum ose dan dibiakan pada cawan petri steril yang telah diisi media pikovskaya. Pada pembuatan
10
biakan murni dilakukan di dekat api bunsen untuk meminimalisir kontaminasi yang mungkin terjadi (Proborini, 2002). Pengamatan karakterisasi secara makroskopis koloni cendawan pelarut fosfat yang tumbuh pada media pikovskaya dilakukan dengan cara mengamati bentuk morfologi dari cendawan tersebut. Kemudian dilakukan pencatatan ciriciri cendawan tersebut yang meliputi warna permukaan koloni cendawan, warna sebalik koloni cendawan, ada atau tidaknya garis radial atau konsentris. Menurut Madjid (2010) ciri dari terisolasinya cendawan pelarut fosfat pada media Pikovskaya yaitu terdapat koloni cendawan yang membentuk zona bening disekitar koloninya. Pengamatan secara mikroskopis cendawan pelarut fosfat dilakukan dengan cara mengambil hifa atau spora cendawan dengan menggunakan jarum ose, kemudian diletakkan pada gelas benda yang telah diberi laktophenol atau laktophenol blue dan tutup dengan gelas penutup, kemudian diamati dengan menggunakan mikroskop. Selanjutnya hasil yang diperoleh dibandingkan dengan buku kunci identifikasi cendawan. Literatur yang digunakan untuk mengidentifikasi cendawan pengenalan kapang tropic umum. Gandjar, dkk., 1999.; Fungi and Food Spoilage. Pitt and Hocking. 1997.
2.1.3.5. Total Mikroba Pelarut Fosfat pada Berbagai Merek Pupuk Organik Total mikroba pelarut fosfat yang terdapat pada pupuk organik berbagi merek tersebut dapat dilakukan dengan mengamati dan menghitung koloni yang tumbuh pada cawan petri tersebut. Total mikroba pelarut fosfat yang tumbuh pada media pikovskaya dihitung dengan menggunakan rumus : 𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑚𝑖𝑘𝑜𝑏𝑎 = 𝑗𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑘𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖 𝑝𝑒𝑟 𝑐𝑎𝑤𝑎𝑛 × Satuannya
CFU/gram
pupuk
organik
1 𝐹𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑃𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛
(Colony
Forming
Unit)
(Hadioetomo, 1990).
11
2.2. Variabel Pengamatan Variabel penelitian meliputi: 1.
Keberadaan mikroba pelarut fosfat pada pupuk organik.
2.
Total mikroba pelarut fosfat pada pupuk organik.
3.
Karakterisasi mikroba pelarut fosfat, meliputi : pengamatan makroskopis, mikroskopis, dan pengamatan dengan uji biokimia.
2.3 Metode Pengolahan Data Data yang diperoleh dari penelitian ini diolah secara kuantitatif dan kualitatif. Secara kualitatif yaitu dengan mendeskripsikan karakteristik mikroba pelarut fosfat yang terdapat pada masing-masing pupuk organik. Sedangkan pengolahan data secara kuantitatif yaitu dengan menghitung populasi mikroba pelarut fosfat yang terdapat pada masing-masing pupuk organik. Data kemudian dibuat dalam bentuk tabel.
12
