IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN β-LAKTOGLOBULIN DENGAN METODE PCR-SSCP PADA DOMBA DI UP3 JONGGOL
SKRIPSI DIAN NURHAYATI
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI PRODUKSI TERNAK FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008
i
RINGKASAN DIAN NURHAYATI. D14104086. 2008. Identifikasi Keragaman Gen βLaktoglobulin dengan Metode PCR-SSCP pada Domba di UP3 Jonggol. Skripsi. Program Studi Teknologi Produksi Ternak, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Pembimbing Utama : Dr. Ir. Cece Sumantri, M.Agr.Sc. Pembimbing Anggota : Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si. Produksi susu merupakan sifat kuantitatif yang dipengaruhi oleh banyak faktor, yang dikelompokkan dalam faktor genetik, lingkungan dan interaksi antara faktor genetik dan lingkungan. Induk dengan produksi susu yang tinggi diharapkan dapat memenuhi kebutuhan nutrisi bagi anaknya pada masa pra sapih. Kondisi anak domba yang baik pada masa pra-sapih, diperkirakan pada saat sapih dan fase produksi akan memiliki penampilan yang baik pula. Seiring dengan kemajuan teknologi dibidang biologi molekuler saat ini, dengan ditemukannya gen-gen penciri yang mempengaruhi sifat kuantitatif yang bersifat ekonomis maka seleksi dapat dilakukakan dalam jangka waktu yang lebih singkat. β-laktoglobulin merupakan kelompok protein susu utama dari whey. Selain itu, β-laktoglobulin merupakan salah satu major protein susu yang terdapat pada susu ruminansia dan telah banyak dilaporkan dapat menjadi penciri genetik untuk produksi susu. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen βlaktoglobulin ekson tujuh pada induk domba di UP3 Jonggol dengan metode PCRSSCP. Pendeteksian keragaman gen β-laktoglobulin dengan metode PCR-SSCP menghasilkan lima tipe (tipe A 42,28%, B 12,50%, C 21,87%, D 7,81% dan E 15,62%). Keragaman tipe gen β-laktoglobulin yang terdapat pada domba induk di UP3 Jonggol dalam penelitian ini belum ditemukan terpaut dengan sifat produksi dan kualitas susu, yaitu persentase protein dan lemak susu. Hal ini dapat disebabkan gen yang mengontol sifat produksi susu bersifat poligen ataupun domba di UP3 Jonggol belum diseleksi untuk domba yang memiliki produksi susu tinggi. Kata-kata kunci: gen β-laktoglobulin, PCR-SSCP.
ii
ABSTRACT Identification of β-Laktoglobulin Gene by PCR-SSCP Methods within Sheep at UP3 Jonggol Nurhayati, D., C. Sumantri and A. Farajallah The effort that can be done to increase the productivity of local sheep are selection and crossing. Technological advancement of moleculer genetic is able to select gen by identifying the DNA polymorphism. The aim of this research was to identify the various of β-Lactoglobulin gene of the local sheep and its association with milk yield and percentage of protein and milk fat. The 83 blood sample from ewes at UP3 Jonggol was used to determined polymorphism by using PCR-SSCP methods. βLactoglobulin is the major whey protein in the milk of ruminants. The βlactoglobulin amplified product was 420 bp. There are five types of sheep at Study and Training Husbandary Unit in Jonggol based on SSCP methods that are A, B, C, D, and E type (A type 42,28%, B 12,50%, C 21,87%, D 7,81% and E 15,62%). Results from the analysis showed not significant association of the types using PCRSSCP method with milk yield and percentage of protein and milk fat. It might be caused by selection in Indonesian local sheep is based on meat production. Keywords: Polymorphism, β-Lactoglobulin gene, PCR-SSCP.
iii
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN β-LAKTOGLOBULIN DENGAN METODE PCR-SSCP PADA DOMBA DI UP3 JONGGOL
DIAN NURHAYATI D14104086
Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI PRODUKSI TERNAK FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008
iv
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN β-LAKTOGLOBULIN DENGAN METODE PCR-SSCP PADA DOMBA DI UP3 JONGGOL
Oleh DIAN NURHAYATI D14104086
Skripsi ini telah disetujui dan disidangkan di hadapan Komisi Ujian Lisan pada tanggal 29 April 2008
Pembimbing Utama
Pembimbing Anggota
Dr. Ir. Cece Sumantri, MAgr. Sc. NIP. 131 624 187
Dr. Ir. Achmad Farajallah, MSi. NIP. 131 878 947
Dekan Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Luki Abdullah, M.Sc.Agr NIP. 131 955 531
v
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 22 Mei 1986 di Jakarta. Penulis adalah anak ketiga dari empat bersaudara dari pasangan Drs. Alwi Amin dan Maeza. Pendidikan dasar diselesaikan pada tahun 1998 di SDS Perguruan Rakyat III, Jakarta. Pendidikan lanjutan menengah pertama diselesaikan pada tahun 2001 di SLTP Negeri 7 Jakarta, dan pendidikan lanjutan menengah atas diselesaikan pada tahun 2004 di SMA Negeri 31 Jakarta. Penulis diterima sebagai mahasiswa pada departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB) pada tahun 2004. Selama mengikuti pendidikan, penulis aktif di Himpunan Mahasiswa Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan (Himaproter) English Club (E-club), Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
vi
KATA PENGANTAR Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, atas rahmat dan karunia yang telah diberikan-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan studi, penelitian, dan penulisan skripsi ini. Skripsi ini berjudul Identifikasi Keragaman Gen β-Laktoglobulin dengan Metode PCR-SSCP pada Domba di UP3 Jonggol. Ternak domba merupakan salah satu ternak yang populer dipelihara oleh masyarakat Indonesia, namun pertumbuhan domba lokal masih rendah. Hal tersebut dapat dilihat dari pertambahan bobot badan yang masih rendah. Beberapa faktor yang berpengaruh terhadap pertumbuhan adalah genetik dan lingkungan. Salah satu upaya yang dapat dilakukan untuk meningkatkan mutu genetik ternak adalah dengan metode seleksi dan persilangan. Seleksi induk pada domba lokal dilakukan untuk mendapatkan induk dengan produksi susu yang tinggi agar mampu mencukupi kebutuhan nutrisi anaknya. Tujuan dari penelitian ini adalah mengidentifikasi keragaman gen βLaktoglobulin ekson tujuh dan hubungannya dengan produksi susu dan persentasi protein dan lemak susu pada induk domba di UP3 Jonggol. Hasil yang diperoleh dari penelitian ini perlu dikaji lebih jauh lagi untuk dapat ditindak lanjuti, guna mendapatkan induk domba dengan produksi susu yang mampu mencukupi kebutuhan nutrisi anaknya dan peningkatan produktivitas ternak domba. Penulis berharap, semoga skripsi ini dapat memberikan sumbangan yang berarti bagi kemajuan dunia peternakan di Indonesia. Amin.
Bogor, Mei 2008
Penulis
vii
DAFTAR ISI RINGKASAN .........................................................................................
Halaman i
ABSTRACT ............................................................................................
ii
LEMBAR PERNYATAAN ....................................................................
iii
LEMBAR PENGESAHAN ....................................................................
iv
RIWAYAT HIDUP ................................................................................
v
KATA PENGANTAR ............................................................................
vi
DAFTAR ISI ...........................................................................................
vii
DAFTAR TABEL ...................................................................................
ix
DAFTAR GAMBAR ..............................................................................
x
DAFTAR LAMPIRAN ...........................................................................
xi
PENDAHULUAN ..................................................................................
1
Latar Belakang ............................................................................ Tujuan .........................................................................................
1 2
TINJAUAN PUSTAKA .........................................................................
3
Domba ......................................................................................... Domba Ekor Tipis ........................................................... Domba Ekor Gemuk ....................................................... Domba Garut ................................................................... Protein Susu .................................................................................. β-Laktoglobulin ..................................................................... ...... Metode Polymerase Chain Reaction-Single-Strand Conformation Polymorphism .............................................................................
3 4 4 4 5 6 8
METODE ..... ..........................................................................................
9
Lokasi dan Waktu ....................................................................... Materi .......................................................................................... Sampel Darah dan Isolasi DNA ...................................... Primer................................................................................ Polymerase Chain Reaction (PCR) ................................ Polymerase Chain Reaction-Single-Starnd Conformation Polymorphism ................................................................. Elektroforesis .................................................................. Pewarnaan Perak ............................................................. Prosedur ...................................................................................... Data Sekunder .................................................................. Pengambilan Sampel Darah ............................................ Ekstraksi DNA ................................................................ Amplifikasi Gen β-Laktoglobulin ..................................
9 9 9 9 9 9 10 10 10 10 10 10 11
viii
Elektroforesis Produk PCR ............................................. Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP) ...... Elektroforesis SSCP ........................................................ Pewarnaan Perak .........................................................................
11 11 Halaman 12 12
Analisis Data ................................................................................
12
HASIL DAN PEMBAHASAN ..............................................................
14
Amplifikasi Gen κ-Kasein .......................................................... Pendeteksian Keragaman Gen β-Laktoglobulin ......................... Polymerase Chain Reaction-Single-StrandConformation Polymorphism (PCR-SSCP) ........................................... Keragaman Menggunakan Metode PCR-SSCP .......................... Pengaruh Keragaman Gen β-Laktoglobulin dengan PCR-SSCP terhadap Produksi Susu, Persentase Protein dan Lemak Susu ....
14 16
KESIMPULAN DAN SARAN ..............................................................
22
Kesimpulan ................................................................................. Saran ...........................................................................................
22 22
UCAPAN TERIMAKASIH ...................................................................
23
DAFTAR PUSTAKA .............................................................................
24
LAMPIRAN
27
..........................................................................................
16 17 20
ix
DAFTAR TABEL Nomor
Halaman
1. Komposisi Protein Susu ..................................................................
6
2. Persentase Komposisi Susu Domba Dibandingkan dengan Tiga Ruminansia lainnya ........................................................................
6
3. Frekuensi Tipe β-Laktoglobulin......................................................
20
4. Pengaruh Tipe β-Laktoglobulin terhadap Produksi Susu
22
5. Pengaruh Tipe β-Laktoglobulin terhadap Persentasi Protein ......... dan Lemak Susu ............................................................................
22
x
DAFTAR GAMBAR Nomor
Halaman
1. Hasil Amlifikasi Gen β-Laktoglobulin Menggunakan Metode PCR pada Gel Poliakrilamida 6% .........................................................
14
2. Tempat Penempelan Pasangan Primer pada Sekuen Gen Ekson Empat (X12187) ..................................................................
15
3. Hasil Pendeteksian Keragaman Gen β-Laktoglobulin Menggunakan Metode PCR-SSCP pada Gel Poliakrilamida 9%. Tipe A (16 dan 44), Tipe B (17), Tipe C (18), Tipe D (19) dan E (43) .....
19
4. Diagram Elektroforesis Masing-Masing Tipe Gen β-Laktoglobulin
19
xi
DAFTAR LAMPIRAN Nomor
Halaman
1. Informasi Gen β-Laktoglobulin Ekson Tujuh pada Domba ...........
29
2. Metode Isolasi DNA Menggunakan Genomic DNA Mini Kit Geneiad ...........................................................................................
33
3. Hasil Analisis Ragam Pengaruh Tipe β-Laktoglobulin dengan Pengelompokkan Umur terhadap Produksi Susu ...........................
34
4. Hasil Analisis Ragam Pengaruh Tipe β-Laktoglobulin terhadap Persentase Protein Susu .................................................................
34
5. Hasil Analisis Ragam Pengaruh Tipe β-Laktoglobuli terhadap Persentase Lemak Susu ..................................................................
34
xii
PENDAHULUAN Latar Belakang Domba merupakan salah satu ternak lokal Indonesia. Populasi ternak domba pada tahun 2006 mencapai 8.543.000 ekor (Direktorat Jendral Peternakan, 2006). Berdasarkan data Deptan RI tahun 2005, kebutuhan protein yang disuplai dari ternak ayam (56%), sapi (23%), babi (13%), sedangkan dari ternak domba dan kambing hanya sekitar 5% (Ramadas, 2007). Manajemen pemeliharaan yang masih secara tradisional
dikalangan
peternakan
rakyat
berpengaruh
terhadap
rendahnya
produktivitas domba lokal. Hal tersebut dapat menjadi suatu penjelasan terhadap pertambahan bobot badan domba lokal yang masih tergolong rendah, yaitu rata-rata 100 g/hari (Hasnudi, 2004). Domba memiliki beberapa keunggulan dibanding ternak yang lain, yaitu telah mampu beradaptasi dengan iklim di Indonesia, memiliki resistensi terhadap cacing dan sifat reproduksi yang tinggi, serta siklus birahi yang tidak tergantung pada musim kawin (Natasasmita et al., 1986). Namun ada beberapa kendala dari ternak domba lokal, diantaranya pertambahan bobot badan yang rendah dan produksi susu induk yang rendah. Produksi susu induk yang rendah tidak mencukupi untuk kebutuhan pertumbuhan anak sehingga menyebabkan pertumbuhan anak yang rendah. Produksi susu induk sangat penting dalam menentukan daya hidup dan pertumbuhan anak pra-sapih. Kondisi anak domba yang baik pada masa pra-sapih, diperkirakan pada saat sapih dan fase produksi akan memiliki penampilan yang baik pula. Selain perbaikan pada faktor lingkungan seperti perbaikan kualitas, dapat juga dilakukan perbaikan faktor genetik yang merupakan potensi atau kemampuan yang dimiliki ternak itu sendiri. Induk dengan produksi susu yang tinggi diharapkan dapat memenuhi kebutuhan nutrisi bagi anaknya pada masa tersebut. Salah satu upaya yang dapat dilakukan untuk meningkatkan mutu genetik ternak adalah dengan metode seleksi dan persilangan. Seleksi induk pada domba lokal dilakukan untuk mendapatkan induk dengan produksi susu yang tinggi agar mampu mencukupi kebutuhan nutrisi anaknya. Aktifitas seleksi akan sangat efektif apabila berada pada kondisi yang sangat beragam. Kemajuan dalam bidang teknologi molekuler memungkinkan upaya seleksi dapat dilakukan pada tingkat DNA, yaitu
dengan cara mencari keragaman DNA gen-gen yang mengendalikan sifat yang berpengaruh terhadap produksi susu induk. Kandungan protein utama pada susu adalah Casein dan whey. Salah satu gen yang diduga memiliki pengaruh besar terhadap persentase protein dan produksi susu adalah gen β-Laktoglobulin. Gen-gen protein susu termasuk gen β-Laktoglobulin merupakan kandidat gen yang dapat digunakan untuk analisis pautan dengan produksi susu. Keragaman alelik dari gen-gen kandidat tersebut menarik karena kemungkinan berpengaruh langsung atau tidak langsung pada produksi susu. Tujuan Tujuan yang ingin dicapai dengan melakukan penelitian ini adalah mengidentifikasi keragaman gen β-Laktoglobulin pada domba di UP3 Jonggol dengan menggunakan metode PCR-SSCP.
2
TINJAUAN PUSTAKA Domba Domba termasuk dalam subfamili Caprinae, family Bovidae, genus Ovis dan spesies Ovis aries (Ensminger, 2002). Ternak domba merupakan ternak ruminansia kecil yang banyak dipelihara oleh masyarakat Indonesia terutama didaerah pedesaan dan umumnya berupa domba-domba lokal. Domba lokal merupakan domba asli Indonesia yang mempunyai daya adaptasi yang baik pada iklim tropis dan dapat beranak sepanjang tahun. Domba yang dikenal sekarang merupakan hasil domestikasi dari 3 jenis domba liar yaitu, domba Argali (Ovis ammon) dan domba Urial (Ovis vignei) yang berasal dari Asia Tengah, dan domba Mouflon (Ovis musimon) yang berasal dari Asia Minor dan Eropa (Ensminger, 2002). Ternak domba domestikasi banyak dipelihara sebagai penghasil daging, susu dan wool. Ternak domba lokal Indonesia memiliki beberapa keunggulan diantaranya yaitu prolifik, mudah dipelihara, siklus birahinya tidak dipengaruhi oleh musim dan tahan terhadap berbagai penyakit. Diwyanto (1982) mengelompokkan ternak domba di Indonesia berdasarkan lebar pangkal ekor, yaitu domba ekor gemuk (>9 cm), domba ekor sedang (5-8 cm) dan domba ekor tipis (<4 cm). Metode
pengklasifikasian
pada
ternak
domba
dapat
dikelompokan
bedasarkan: (1) tipe ekor yaitu domba ekor gemuk, domba ekor tipis panjang dan pendek, (2) bulu penutup yaitu wool, bulu, dan fur, dan (3) fungsi utamanya yaitu daging, wool, fur, dan susu (Devendra dan McLeroy, 1982). Domba Ekor Tipis Domba Ekor Tipis merupakan domba asli Indonesia. Penyebaran domba ekor tipis menurut Hardjosubroto (1994) sekitar 80% populasinya terdapat di Jawa Barat dan Jawa Tengah. Gatenby (1991) menyatakan bahwa jumlah tertinggi domba ekor tipis di Asia Tenggara adalah terpusat di Jawa Barat. Domba ini mampu hidup didaerah yang gersang. Menurut Einstiana (1999), bobot domba ekor tipis jantan yang telah dewasa antara 30-40 kg, sedangkan bobot betina dewasa 15-20 kg dan pola warna belangnya bervariasi mulai dari bercak, belang dan polos. Ekornya tidak menunjukkan adanya deposit lemak, betina tidak bertanduk, sedangkan jantan memiliki tanduk dengan
3
bentuk melingkar. Domba ini memiliki keunggulan dalam adaptasi pada kondisi iklim tropis dan dapat kawin sepanjang tahun. Domba Ekor Gemuk Domba jenis ini terdapat di Jawa Timur dan Madura, serta pulau-pulau di Nusa Tenggara. Di Sulawesi Selatan dikenal dengan nama domba Donggala. Domba ekor gemuk merupakan salah satu domba Indonesia yang telah beradaptasi dengan baik pada kondisi lingkungan dan sistem pengelolaan, baik secara intensif maupun ekstensif. Domba ekor gemuk memiliki ciri-ciri khusus yaitu berbulu kasar, baik jantan maupun betina biasanya bertanduk, warna putih dan telinga sedang (Devendra dan Mc Leroy, 1982). Ekor yang gemuk merupakan tempat penyimpanan cadangan makanan dalam bentuk lemak yang dapat dimanfaatkan jika terjadi kekurangan pakan. Pada saat banyak pakan, ekor domba ini penuh dengan lemak sehingga terlihat membesar. Namun, bila pakan kurang, ekor mengecil karena cadangan energinya dibongkar untuk mensuplai energi yang dibutuhkan tubuh. Panjang ekor normal 15-18 cm tulang vertebrae, berbentuk hurup S atau sigmoid. Domba ekor gemuk jantan unggul memiliki bobot badan yang dapat mencapai 50-70 kg, betina 25-40 kg dan rataan bobot potong 24 kg. Domba ini bersifat prolifik dengan selang beranak hanya 8-9 bulan, umur pertama kali beranak antara 11-17 bulan dan dapat menghasilkan 2,34 anak sapihan pertahun (Devendra dan Mc Leroy, 1982) Domba Priangan Domba jenis ini tersebar didaerah Priangan, yaitu Bandung, Garut, Sumedang, Ciamis dan Tasikmalaya. Domba ini penyebarannya paling banyak didaerah Garut sehingga disebut domba garut (Gatenby,1991). Domba ini merupakan hasil persilangan antara domba Merino dan domba Cape dengan domba lokal. Apabila dibandingkan dengan domba ekor tipis, domba ini termasuk domba tipe besar. Domba Priangan dikategorikan dalam dua tipe, yaitu tipe tangkas dan tipe pedaging. Domba jantan memiliki tanduk yang cukup besar, melengkung kearah belakang dan ujungnya mengarah kedepan sehingga berbentuk seperti spiral, sedangkan domba betina tidak bertanduk. Menurut Einstiana (2006), pola warna bulu
4
domba Garut di Margawati terdiri dari empat pola warna bulu, yaitu putih, hitam, cokelat dan kombinasi (dua warna dan tiga warna). Bobot badan domba Priangan betina sekitar 35-40 kg, sedangkan bobot domba jantan mencapai 50-60 kg. Domba Priangan termasuk domba yang prolifik, interval beranak yang pendek dan jumlah anak yang dihasilkan pertahun rata-rata 1,7 ekor (Devendra dan Mc Leroy, 1982) . Protein Susu Protein susu pada umumnya dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu kasein dan whey. Kasein merupakan komponen protein yang terbesar dalam susu dan sisanya berupa whey. Proporsi kasein dalam total susu sekitar 80%, dan whey sekitar 20% (Yahyaoui et al., 2003). Kasein terdiri atas beberapa fraksi seperti α-kasein, β-kasein, dan κ-kasein. Kasein merupakan salah satu komponen organik yang berlimpah dalam susu bersama dengan lemak dan laktosa. Whey protein merupakan protein butiran (globular). Kadar whey dalam susu mencapai 20%. β-laktoglobulin, α-laktalbumin, Immunoglobulin (Ig), Laktoferrin dan Bovine Serum Albumin (BSA) adalah contoh dari whey protein (Kontopidis, 2000). Produksi susu merupakan salah satu sifat kuantitatif yang dipengaruhi oleh banyak gen dan mempunyai daya waris rendah (Tiesnamurti, 2002). Sebagai sifat kuantitatif, maka jumlah gen yang mengatur produksi susu menyebar dibanyak kromosom dan secara bersama-sama atau sendiri-sendiri akan mempengaruhi produksi susu sehingga pengenalannya secara individu relatif sulit dilakukan dan sangat tergantung akan ketersediaan mutu pakan yang diberikan dan lingkungan yang kondusif untuk pemeliharaan. Protein susu bervariasi secara kuantitatif dan kualitatif pada masing-masing individu dalam satu spesies. Secara kuantitatif dapat dilihat dari komposisi elemenelemen penyusun protein susu yaitu proporsi dari kasein dan protein whey dapat dilihat komposisinya secara umum menurut Harper dan Hall (1981) disajikan dalam Tabel 1. Secara kualitatif variasi protein ini ditunjukkan oleh polimorfisme genetik pada spesies yang sama.
5
Tabel 1. Komposisi Protein Susu Jenis Protein
Jenis Fraksi
Jumlah dari Protein Susu
Berat Molekul
(%) Kasein
Kasein
85
-
αs1-kasein
Kasein
53-70
121.000
αs2-kasein
Kasein
80
23.000
κ-kasein
Kasein
17
19.000
β-kasein
Kasein
23-35
24.000
β-laktogolulin
Laktoglobulin
7-12
36.000
α-laktalbumin
Laktalbumin
2-5
15.000
Serum albumin
Laktalbumin
0,7-1,3
69.000
Imunoglobulin
Laktalbumin
1,5-3,5
150.000
IgG1
Laktalbumin
0,8-1,7
150.000
IgG2
Laktalbumin
0,6-1,4
180.000
Sumber: Harper dan Hall (1981)
Pada domba kadar protein dalam susu lebih banyak jika dibanding dengan susu sapi. Protein yang terdapat pada susu kambing butirannya juga lebih halus dan lebih cepat larut dibandingkan susu sapi. Persentase rataan komposisi susu domba dibandingkan dengan komposisi susu tiga spesies ruminansia lainnya disajikan dalam tabel 2. Tabel 2. Persentase Komposisi Susu Domba Dibandingkan dengan Tiga Ruminansia lainnya Domba Kambing Sapi Kerbau Air (%)
82,5
87,0
87,5
80,7
Total solid (%)
17,5
13,0
12,5
19,2
Lemak (%)
6,5
3,5
3,5
8,8
Casein (%)
4,5
2,8
2,6
3,8
Lactose (%)
4,8
4,8
4,7
4,4
Mineral (%)
0,92
0,80
0,72
0,80
Energy (kcal/l)
1050
650
700
1100
Sumber : Pulina, 2004
6
β-Laktoglobulin β-laktoglobulin merupakan salah satu komponen utama protein susu selain αs1-kasein, β-kasein, κ-kasein, dan α-laktalbumin pada susu sapi. β-laktoglobulin adalah komponen utama whey dalam protein susu. β-laktoglobulin dapat ditemukan dalam komponen susu beberapa mammalia, tetapi tidak terdapat pada manusia, rodensia dan lagomorph (Hambling et al, 1992). β-Laktoglobulin termasuk kelompok protein lipocalin yang dapat mengikat molekul-molekul yang bersifat hidrofobik dan berperan penting dalam metabolisme lemak (Kontopidis, 2000). β-Laktoglobulin dalam susu dapat meningkatkan persentase protein susu. β-Laktoglobulin merupakan salah satu major protein susu yang terdapat pada susu ruminansia (Kumar et al., 2006). Pada domba gen β-Laktoglobulin terdiri atas tiga variant yaitu A, B (Kolde dan Braunitzer, 1983) (Schlee dan Rottman, 1993) dan variant C (Erhardt, 1989). Pada ternak sapi dilaporkan terdapat dua variant untuk gen β-Laktoglobulin yaitu A dan B (Yahyaoui, 2003). Menurut Yahyaoui (2003) variasi genetik A dan B berbeda pada asam amino yang terdapat pada posisi 20. Variant A terdapat asam amino histidin dan Variant B terdapat thrionin. Variant C hampir serupa dengan variant A dimana terdapat satu perubahan asam amino dari arginin menjadi glutamin pada posisi 148 (Erhardt, 1989). β-laktoglobulin adalah protein globular dengan berat molekular 36,4 kDa dan terdiri atas 162 asam amino (Kontopidis, 2004). Gen β-Laktoglobulin pada domba yang berasal dari Iran dan Russia yang dideteksi dengan menggunakan metode PCR-RLFP dengan menggunakan enzim restriksi RsaI menghasilkan dua alel (A dan B) dengan frekuensi masing-masing 0,65 dan 0,35 dan terdapat tiga genotipe, yaitu AA, AB dan BB. Kumar et al., (2006) melaporkan bahwa pada ternak kambing di India terdapat dua alel untuk gen β-laktoglobulin yaitu alel A dan B dan tiga variasi genotipe (AA, AB dan BB). Ternak kambing yang memiliki genotipe AA memiliki produksi susu yang lebih tinggi (81,82 l) dibandingkan dengan ternak yang memiliki genotipe AB (68,97 l) pada 90 hari laktasi. Pada domba dan sapi, genotipe gen βLaktoglobulin memiliki pengaruh yang nyata terhadap produksi susu dan lemak susu.
7
Metode PCR-SSCP (Polymerase Chain ReactionSingle Strand Conformation Polymorphism) Teknik PCR mampu mengatasi masalah penelitian suatu genom, yaitu keterbatasan jumlah sampel yang akan dianalisis. PCR adalah suatu metode in vitro untuk mensintesis sekuens DNA spesifik secara enzimatis dengan menggunakan dua oligonukleotida sebagai primer yang berhibridisasi secara berlawanan pada sisi daerah target utas DNA yang diinginkan (Muladno, 2002). DNA juga dapat diperbanyak oleh reaksi berantai polimerase dari sehelai rambut, setetes darah, semen. Bahan awal untuk PCR adalah DNA yang mengandung sekuens yang akan diamplifikasi. Jumlah DNA yang diperlukan untuk proses PCR sangat kecil, biasanya lebih kecil dari 1 mikrogram. Selain itu juga diperlukan dua oligonukleotida primer untuk inisiasi target DNA , enzim DNA polymerase, dan campuran keempat deoksinukleotida trifosfat (dNTPs)sebagai prekusor. Konsentrasi Mg2+ pada buffer PCR yang cukup juga diperlukan Proses PCR terdiri dari 3 tahapan, yaitu (1) Denaturasi, yaitu struktur DNA utas ganda mengudar menjadi utas tunggal, (2) Anneling, yaitu penempelan primer pada sekuens DNA komplementer yang akan diperbanyak, (3) Ekstensi, yaitu pemanjangan primer oleh DNA polymerase (Muladno, 2002). Single
Strand
Conformation
Polymorphism
(SSCP)
adalah
metode
elektroforesis yang popular untuk mengidentifikasi mutasi sekuens karena mudah, murah, dan memiliki sensitifitas tinggi walau hanya satu nukleotida saja (Nataraj, 1999). SSCP dapat mendeteksi keragaman dan mutasi titik pada berbagai posisi pada fragment DNA, meskipun mutasi yang terjadi hanya pada satu basa.(Orita et al, 1998). Sensitifitasan dari analisis SSCP merupakan hal yang cukup sulit dalam teknik karena sangat peka dalam kondisi elektroforesis. Sensitifitas dipengaruhi beberapa faktor termasuk didalamnya tipe subtitusi basa, panjang fragment, kandungan G dan C dalam fragment dan lokasi variasi sekuens.
8
METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilakukan selama empat bulan, dimulai dari bulan September 2007 sampai dengan Desember 2007. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak Fakultas Peternakan, dan Laboratorium Zoologi Fakultas Matematika dan Imu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Materi Sampel Darah Sampel darah domba yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel darah segar berjumlah 83 sampel yang didapat dari Unit Pendidikan dan Penelitian Peternakan (UP3) Jonggol. Domba yang terdapat di UP3 Jonggol merupakan domba ekor tipis yang telah dilakukan persilangan dengan beberapa domba luar. Primer Primer adalah molekul oligonukleotida yang berukuran pendek (sekitar 18-24 basa) yang akan menempel pada DNA cetakan ditempat yang spesifik. Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen β-Laktoglobulin ekson tujuh pada domba, yaitu forward 5′ CGG GAG CCT TGG CCC TCT GG 3′ dan reverse 5′ CCT TTG TCG AGT TTG GGT GT 3′ (Kumar et al., 2006). Formamide Dye Komponen formamide dye terdiri dari 80% larutan formamida, 0,5 µl EDTA 10mM, 1 mg/ml bromthymol blue, dan 1 mg/ml xylene cyanol. Gel poliakrilamida 6% Bahan – bahan yang digunakan untuk membuat 1 lembar gel poliakrilamid 6% adalah air destilata steril 4 ml, larutan 30% akrilamida (akrilamida : bis = 29 :1) 4 ml, 5 x TBE (Tris-Borat EDTA) 4 ml, tetramethylendiamine 15 µl dan 1% ammonium persulfat 160 µl. Alat yang digunakan adalah plat kaca cetakan gel. Gel poliakrilamida 9% Bahan – bahan yang digunakan untuk membuat 1 lembar gel poliakrilamid 9% adalah air destilata steril 13 ml, larutan 60% akrilamida (akrilamida : bis = 59 :1) 3 ml, 5 x TBE 4 ml, tetramethylendiamine 25 µl dan 1% ammonium persulfat 180 µl.
9
Pewarnaan Perak Bahan-bahan yang digunakan dalam pewarnaan perak adalah CTAB (cetyltrimetil ammonium bromide), NH4OH, AgNO3, 10 N NaOH, Na2CO3, formaldehida, dan 1 % asam asetat. Alat yang digunakan adalah nampan dan horizontal shaker. Ekstraksi DNA Bahan-bahan yang digunakan dalam ekstraksi DNA adalah TE (Tris EDTA), STE (Sodium Tris-EDTA), NaCL, SDS, CIAA (chloroform iso amil alkohol), Etanol. Prosedur Data Sekunder Data sekunder yang diperoleh berasal dari domba yang telah diketahui bobot badan dan produksi susu induk di Unit Pendidikan dan Penelitian Peternakan (UP3) Jonggol. Analisis kualitas susu dilakukan di Laboratorium IPT Perah (Lampiran 1) Pengambilan Sampel Darah Sampel darah diambil dari domba induk melalui vena jugularis menggunakan tabung vaccutainer yang mengandung antikoagulan. Sampel tersebut kemudian disimpan dalam termos es dan suhunya dipertahankan sekitar 4 oC maksimal selama 7 hari. Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA dilakukan dari sampel darah segar menggunakan Genomic DNA mini kit (Geneaid) yang telah dimodifikasi (Lampiran 2). Ekstraksi DNA juga dilakukan secara konvensional mengikuti metode Sambrook et al., 1989. Sampel darah total yang telah disimpan dalam 95% etanol disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama lima menit. Endapan sel-sel darah yang diperoleh dicuci dengan menggunakan buffer TE sebanyak dua kali, diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung baru dan ditambahkan 1 x STE, 20µl 10 mg/ml protK dan 40µl 10% SDS. Campuran ini dikocok pelan-pelan selama 2 jam pada suhu 550C. Molekul DNA dimurnikan dengan metode fenol-chloroform, yaitu dengan menambahkan 40 µl 5M NaCl, 400 µl larutan fenol dan CIAA (chloroform iso amil alkohol), kemudian dikocok pelan pada suhu ruang dengan kecepatan 500 rpm
10
selama 2 jam. Molekul DNA yang larut dalam fase air dipisahkan dari fase fenol dengan alat sentrifugasi pada kecepatan 7000 rpm selama lima menit. Molekul DNA dipindahkan ke dalam tabung baru dengan volume terukur dan ditambahkan 5M NaCl sebanyak 0,1 x volume DNA dan absolute alkohol sebanyak 2x volume DNA. Endapan yang dihasilkan kemudian dicuci dengan menambahkan 70% etanol sebanyak 400 µl kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1200 rpm selama lima menit, kemudian disuspensikan dalam 80 µl 80% buffer TE (Tris-EDTA). Amplifikasi Gen β-Laktoglobulin Amplifikasi gen β-Laktoglobulin secara in vitro menggunakan teknik PCR. Pereaksi PCR terdiri dari sampel DNA 2 µl, primer forward 25 nM, primer reverse 25 nM, enzim Taq polymerase (Promega) 0,5 unit, 5x buffer green 5 µl, 10 mM dNTP, 2,5 mM MgCl2 , dan air steril dengan volume akhir 25 µl. Campuran tersebut kemudian diinkubasikan dalam mesin thermocycler (TaKaRa PCR thermalcycler MP4) dengan kodisi sebagai berikut: Tahap pradenaturasi pada suhu 94 oC selama 5 menit, tahap kedua yang terdiri dari 30 siklus yang masing-masing siklus terdiri dari denaturasi pada suhu 94 oC selama 1 menit, anneling 62 oC selama 1 menit, elongasi 72 oC selama 2 menit, dan elongasi akhir 72 oC selama 5 menit. Pendeteksian Keragaman Gen β-Laktoglobulin dengan Metode PCR-SSCP (Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism) Produk PCR yang telah dihasilkan kemudian dilakukan elektroforesis dengan menggunakan 2 µl amplikon pada gel poliakrilamida 6% dengan tegangan 180 volt selama 65 menit yang kemudian dilanjutkan dengan Silver Staining. Produk PCR yang memperlihatkan pita DNA yang berbentuk tunggal di atas gel kemudian dimurnikan dengan teknik pengendapan alkohol. Amplikon sebanyak
23 µl
ditambah alkohol absolut 2 x volume dan 5M NaCl 1/10 x volume. Campuran tersebut kemudian diinkubasi selama 12 jam (over night) dalam freezer. Setelah 12 jam, kristal DNA gen β-Laktoglobulin diendapkan dengan cara disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm selama 10 menit. Bagian endapan dari larutan dimurnikan dengan cara membuang bagian supernatannya dan dilanjutkan dengan pengeringan menggunakan pompa vakum selama 30 menit. Sampel yang telah dimurnikan ditambah dengan larutan formamide dye (80% larutan formamida + 10mM EDTA + 1mg/ml bromthymol blue + 1 mg/ml
11
xylene cyanol), kemudian campuran ini diinkubasi dalam water bath pada suhu 94 °C selama 10 menit dengan tujuan membuat fragment DNA untai ganda menjadi untai tunggal. Setelah 10 menit, campuran tersebut segera didinginkan dalam ice bath selama minimal 2 menit. Alat elektroforesis dijalankan pada tegangan 150 volt selama 17 jam di dalam refrigerator. Penggunaan refrigerator dimaksudkan agar suhu gel tetap konstan pada saat proses elektroforesis dilakukan. Pewarnaan Perak Pewarnaan perak dilakukan dengan metode Tegelstrom (1992) yang secara singkat dapat dijelaskan sebagai berikut: Gel direndam dalam larutan CTAB 0,1% selama 10 menit dan sambil digoyang dengan menggunakan alat horizontal shaker kemudian gel dibilas dengan menggunakan air destilata selama 2 x 2 menit. Pencucian selanjutnya adalah dengan menggunakan larutan NH4OH 3% selama 8 menit, kemudian larutan perak nitrat selama 15 menit. Setelah itu, larutan dibuang dan gel dibilas dengan menggunakan air destilata 2 x 2 menit. Pemunculan pita pada gel dapat diamati dengan merendam gel dalam larutan Na2CO3. Setelah muncul pita, larutan dibuang kemudian gel direndam dalam larutan asam asetat glacial 1% untuk menghentikan reduksi perak. Penentuan Tipe Gen β-Laktoglobulin Keragaman gen β-Laktoglobulin dapat dideteksi dengan membandingkan banyaknya pita yang muncul dalam gel 9% poliakrilamida nondenaturasi. Penentuan tipe gen β-Laktoglobulin dalam penelitian ini adalah berdasarkan perbedaan banyaknya pita yang muncul disebabkan karena perbedaan konformasi fragment DNA untai tunggal. Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan berupa rancangan acak lengkap (Mattjik dan Sumertajaya, 2002) untuk mengetahui pengaruh keragaman tipe βLaktoglobulin (A, B, C, D dan E) terhadap produksi susu harian dan persentase protein dan lemak susu. Data produksi susu harian dan persentase protein dan lemak susu induk didapatkan dari hasil pencatatan UP3 Jonggol. Jika respon yang diperoleh menunjukkan hasil yang berbeda (α = 0,05) maka dilakukan pengujian lebih lanjut menggunakan metode uji jarak Duncan. Model matematis dari rancangan tersebut adalah sebagai berikut:
12
Yij = µ + Ti + €ij Keterangan : Yij
= nilai pengamatan
µ
= nilai rataan umum
Tj
= pengaruh tipe ke-j
€ij
= pengaruh galat yang menyebar normal
Frekuensi tipe dihitung menggunakan rumus untuk menghitung frekuensi (Mattjik dan Sumertajaya, 2002) dengan model matematis sebagai berikut: Yi = ni / N Keterangan : Yi
= frekuensi tipe ke-i
ni
= jumlah individu dengan tipe i
N
= jumlah individu sampel
13
HASIL DAN PEMBAHASAN Amplifikasi Gen β-Laktoglobulin Gen β-laktoglobulin pada ternak domba di UP3 Jonggol berhasil diamplifikasi dengan menggunakan pasangan primer berdasarkan Kumar et al., (2006) dengan menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction). Perkiraan panjang fragmen yang berhasil diamplifikasi dapat diketahui dengan cara mencocokkan pasangan primer pada sekuen gen β-laktoglobulin ekson tujuh yang diperoleh dari GenBank X12817 (Lampiran 3). Hasil amplifikasi gen β-laktoglobulin pada domba yang berhasil diamplifikasi diperlihatkan pada Gambar 1.
M
1
2
3
4
5
6
7
400 bp
420 bp
100 bp
Gambar 1. Hasil Amplifikasi β-Laktoglobulin Menggunakan Metode PCR pada Gel Poliakrilamida 9%. (M: marker 100 bp DNA Ladder) Penelitian ini menggunakan primer yang disusun berdasarkan literatur Kumar et al., (2006). Primer yang digunakan oleh Kumar et al., (2006) adalah untuk mengamplifikasi gen β-laktoglobulin pada 9 bangsa ternak kambing (Jamunapari, Jakhrana, Rajasthan, Barbari, Black Bengal, Beetal, Sirohi, Marwari, Gaddi, Surti, Osmanabadi, dan Chegu) di India. Meskipun terdapat perbedaan jenis ternak yang digunakan sebagai primer, hal ini tidak menjadi masalah karena primer tersebut dapat berkomplement pada sekuens ternak domba yang digunakan.
14
Menurut Kumar et al., (2006) panjang gen β-laktoglobulin hasil amplifikasi dengan pasangan primer yang diperoleh dari gen bank nomor akses X12817 adalah 426 bp (pasang basa). Pada penelitian ini panjang gen β-laktoglobulin yang berhasil diamplifikasi memiliki panjang 420 bp. Perbedaan panjang gen β-laktoglobulin ini disebabkan pasangan primer yang disusun oleh Kumar et al., adalah untuk bangsa ternak kambing di India. Terdapat perbedaan sekuens gen β-laktoglobulin pada ternak kambing dan domba meskipun memiliki tingkat homologi yang tinggi (95%). Pada ternak sapi sekuens asam amino β-laktoglobulin juga menunjukkan tingkat homologi yang tinggi, yaitu lebih dari 95% dan hanya terdapat enam posisi pada gen β-laktoglobulin sapi yang menyebabkan perbedaan dengan gen βlaktoglobulin pada domba dan kambing (Yahyaoui, 2003). Jika terdapat perbedaan sekuens antara gen β-laktoglobulin antara ternak kambing dan domba akan mengakibatkan
perbedaan
terhadap
produk
hasil
amplifikasi.
Gambar
menunjukkan posisi pasangan primer AF 25 dan 26 pada sekuens
2
gen β-
laktoglobulin ternak domba.
5161 taaggggagg ctagcggtcc ttctcccgag gaggggctgt cctggaacca 5211 ccagccatgg agaggctggc aagggtctgg caggtgcccc aggaatcaca Primer forward 5261 ggggggcccc atgtccattt cagggcccgg gagccttgga ctcctctggg 5311 gacagacgac gtcaccaccg cccccccccc atcaggggga ctagaaggga 5361 ccaggactgc agtcaccctt cctgggaccc aggcccctcc aggcccctcc 5411 tggggctcct gctctgggca gcttctcctt caccaataaa ggcataaacc 5461 tgtgctctcc cttctgagtc tttgctggac gacgggcagg gggtggagaa 5511 gtggtgggga gggagtctgg ctcagaggat gacagcgggg ctgggatcca 5561 gggcgtctgc atcacagtct tgtgacaact gggggcccac acacatcact 5611 gcggctcttt gaaactttca ggaaccaggg agggactcgg cagagacatc Primer Reverse 5661 tgccagttca cttggagtgt tcagtcaaca cccaaactcg acaaaggaca 5711 gaaagtggaa aatggctgtc tcttagtcta ataaatattg atatgaaact 5761 caagttgctc atggatcaat atgcctttat gatccagcca gccactactg
Gambar 2. Posisi pasangan primer AF 25 dan 26 pada sekuens Gen βLaktoglobulin ekson 7 pada ternak domba (Sumber www.ncbi.nlm.nih.gov, nomor akses X12817)
15
Suhu anneling (penempelan primer) yang digunakan dalam penelitian ini adalah 620C. Suhu anneling adalah kisaran suhu yang membuat primer menempel (komplementer) ke DNA cetakan. Kumar et al., (2006) dan Agung (2007) telah melakukan amplifikasi gen β-laktoglobulin dengan suhu anneling 650C . Meskipun terdapat perbedaan suhu anneling yang digunakan untuk amplifikasi gen β-laktoglobulin pada penelitian ini dengan penelitian yang sebelumnya, hal ini tidak menjadi masalah karena gen β-Laktoglobulin ekson tujuh yang menjadi target pada penelitian ini tetap berhasil teramplifikasi. Suhu annealing menjadi sangat penting dalam proses amplifikasi, hal itu dikarenakan proses perpanjangan DNA baru dimulai dari primer (Muladno, 2002). Persentase keberhasilan amplifikasi gen β-laktoglobulin sekitar 77% atau sebanyak 64 sampel yang berhasil diamplifikasi dari total 83 sampel. Kurang berhasilnya amplifikasi DNA dapat dikarenakan penempelan primer tidak secara tepat sehingga perbanyakan secara in vitro tidak terjadi dan kurang optimalnya metode ekstraksi yang digunakan sehingga masih tingginya materi pengotor. Tingkat keberhasilan amplifikasi DNA ditentukan oleh konsentrasi sampel DNA, taq Polymerase, dinukleotida, ion Mg, buffer dan primer (Yuwono, 2006). Selain itu residu heparin dan hemoglobin dapat dijadikan sebagai salah satu faktor yang mampu menghambat proses penggandaan (Lestari, 2001). Heparin yang berlebih hingga 0,4 g/ml dapat menurunkan aktifitas enzim taq polymerase hingga 60%. Faktor-faktor yang dapat mempengaruhi keberhasilan dengan metode PCRSSCP adalah panjang fragment DNA, suhu, konsentarsi akrilamida, perbandingan akrilamida dan bis akrilamida dan pemurnian sampel DNA. Panjang Fragmen Gen β-Laktoglobulin hasil amplifikasi dalam penelitian ini memiliki panjang fragment 420 pb. Menurut Hayashi (1991) sensitivitas dari metode PCR-SSCP adalah 99% untuk fragment DNA yang memiliki panjang 100-300 pb dan 89% untuk fragment yang memiliki panjang 300-450 pb. Panjang fragmen hasil amplifikasi dalam penelitian ini adalah 420 pb, sehingga keakuratan pendekatan PCR-SSCP penelitian ini dapat diperkirakan sekitar 89%.
16
Suhu Suhu elektroforesis yang digunakan pada penelitian ini dilakukan dalam refrigerator dengan kisaran suhu 40C. Suhu yang konstan sangat berpengaruh terhadap ketegasan dan ketajaman pita yang dihasilkan (Bastos et al., 2001). Apabila elektroforesis dilakukan dalam suhu ruang diperlukan penambahan gliserol untuk menjaga kestabilan suhu. Elektroforesis pada penelitian ini dilakukan dalam refrigerator dengan suhu 40C yang relatif konstan, sehingga tidak diperlukan tambahan gliserol. Konsentrasi Akrilamida Konsentrasi akrilamid gel berpengaruh terhadap pendeteksian keragaman dalam SSCP. Konsentrasi akrilamida yang semakin rendah menghasilkan gel yang lebih lembut dan lebih sensitif dalam mendeteksi keragaman (Hayashi, 1991). Barroso et al. (1999) menggunakan konsentrai akrilamida 17% untuk gel dengan kondisi terbaik. Agung (2007) menggunakan konsentrai akrilamida 12%, sedangkan Ceriotti et al. (2004) menggunakan konsentrai akrlimida 9,25%. Konsentrasi akrilamida yang digunakan dalam penelitian ini adalah 9% (59:1). Perbedaan konsentrasi yang digunakan dalam penelitian ini dan penelitian lainnya tidak menjadi masalah karena keragaman gen β-laktoglobulin tetap berhasil teramplifikasi. Perbandingan Akrilamida dan Bis Akrilamida Perbandingan akrilamida dan bis akrilamida yang digunakan akan berpengaruh terhadap lebar matriks yang akan dilewati oleh utas tunggal DNA. Barroso et al. (1999) menggunakan perbandingan 100:1 untuk menghasilkan kondisi gel terbaik. Ceriotti et al. (2004) menggunakan perbandingan 29:1, sedangkan Agung (2007) menggunakan perbadingan 59:1. Perbandingan akrilamida dan bis akrilamida yang digunakan dalam penelitian ini adalah 59:1. Perbedaan perbandingan tersebut tidak berpengaruh terhadap pendeteksian, selama bentuk ikatan utas tunggal DNA masih dapat bermigrasi dalam matrik gel tersebut. Pemurnian Sample DNA Pemurnian Sampel DNA hasil amplifikasi juga berperan penting dalam keberhasilan metode PCR-SSCP. Pada saat pemurnian DNA hasil amplifikasi, semua
17
materi selain DNA target akan terbuang saat supernatan hasil pemisahan dengan sentifugasi dibuang. Apabila sampel DNA tidak dimurnikan (masih ada sisa pereaksi PCR) maka akan mengakibatkan kemungkinan adanya pita-pita tambahan yang bukan DNA target dan akan mengurangi tingkat ketelitian dalam melakukan identifikasi tipe dan penentuan genotipe. Pendeteksian Keragaman Gen β-Laktoglobulin dengan Metode PCR-SSCP Pendeteksian keragaman gen β-Laktoglobulin menggunakan metode PCRSSCP (Single Strand Conformation Polymorphism). PCR-SSCP merupakan metode yang sangat handal dalam mendeteksi keragaman DNA yang disebabkan adanya perubahan pada fragment DNA dan mendeteksi level mutasi yang rendah (Yahyaoui, 2003). PCR-SSCP memiliki asumsi bahwa perubahan yang terjadi pada nukleotida akan mempengaruhi bentuk (konformasi) dari fragment DNA untai tunggal (Bastos et al., 2001) dan laju mingrasi pada saat elektroforesis. Laju migrasi fragment DNA untai tunggal dalam gel 9% poliakrilamid nondenaturasi berbanding terbalik dengan diameter (ukuran) fragment DNA dan kandungan ion dalam gel (Muladno., 2002). Tahapan-tahapan dalam metode PCR-SSCP terdiri dari beberapa tahap. Tahap pertama yaitu amplifikasi DNA target dengan menggunakan mesin thermocycler, tahap berikutnya adalah pemurnian sampel DNA dan penambahan larutan formamida dye, tahap ketiga yaitu denaturasi DNA produk PCR pada suhu 940C kemudian tahapan elektroforesis dalam gel 9% poliakrilamid nondenaturasi pada kondisi suhu yang konstan. Apabila elektroforesis dilakukan pada suhu ruang, maka perlu ditambahkan buffer aditif seperti gliserol kedalam gel untuk menjaga gel selalu dalam keadaan suhu yang konstant. Pada penelitian ini elektroforesis dilakukan didalam refrigerator bersuhu 40C sehingga tanpa penambahan gliserol, suhu akan berada pada kondisi konstant. Suhu yang konstant berpengaruh terhadap ketegasan dan ketajaman pita yang dihasilkan. Keragaman Gen β-Laktoglobulin dengan Metode SSCP Pada penelitian ini ditemukan bahwa gen β-Laktoglobulin ekson tujuh pada domba di UP3 Jonggol adalah bersifat polimorfik (beragam). Hasil tersebut berbeda dengan hasil penelitian Agung (2007) yang melaporkan bahwa tidak ada keragaman (monomorfik) gen β-laktoglobulin pada domba lokal dengan menggunakan metode PCR-RFLP. Kucinskiene (2005) dengan metode PCR-RFLP menemukan adanya dua
18
alel untuk gen β-Laktoglobulin pada domba Lithuanian Native Coarsewooled (domba tipe pedaging-wool) yaitu alel A dan B. Penelitian tersebut menghasilkan tiga genotipe yaitu AA, AB dan BB. Genotipe BB memiliki hubungan dengan produksi susu yang tinggi. Sedangkan genotipe AB dan BB memiliki hubungan dengan kadar protein dan casein yang tinggi. Pendeteksian
keragaman
gen
β-laktoglobulin
dengan
menggunakan
pendekatan SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) menghasilkan lima tipe yang terdiri atas tipe A, B, C, D, dan E. Gambar 3 merupakan gambar hasil pendeteksian keragaman gen β-laktoglobulin dengan metode PCR-SSCP. Gambar 4 merupakan diagram elektroforesi untuk masing-masing tipe gen β-laktoglobulin.
8
17
18
19
24
A
B
C
D
E
Gambar 3. Hasil Pendeteksian Keragaman Gen β-Laktoglobulin Menggunakan Metode PCR-SSCP pada Gel Poliakrilamida 9%. Tipe A 8, Tipe B 17, Tipe C 18, Tipe D 19 dan Tipe E 24.
A
B
C
D
E
Gambar 4. Diagram Elektroforesis Tipe Gen β-Laktoglobulin Penentuan tipe dilakukan dengan melihat pola migrasi pita tunggal DNA pada lembar gel poliakrilamida 9%. Persentase keberhasilan pendeteksian keragaman
19
dengan PCR-SSCP dalam penelitian ini adalah 77%.Persentase tipe A, B, C, D dan E adalah 27,71%, 9,64%, 16,87%, 12,05% dan 10,84%. Frekuensi masing-masing tipe dapat diketahui dengan cara membagi jumlah sampel yang memiliki tipe tertentu dengan jumlah sampel total. Frekuensi Tipe gen β-laktoglobulin disajikan dalam Tabel 3. Tabel 3. Frekuensi Tipe Gen β-laktoglobulin Tipe SSCP
Frekunsi (%)
Jumlah Sampel (n)
A
42,28%
27
B
12,50%
8
C
21,87%
14
D
7,81%
5
E
15,62%
10
Jumlah
100 %
64
Dari tabel 3 terlihat bahwa Tipe A memiliki frekuensi tipe gen βlaktoglobulin yang tertinggi dan tipe D merupakan tipe dengan frekunsi yang terendah. Tipe A memiliki empat pita dan tipe D memiliki 3 pita. Pada penelitian sebelumnya Agung (2007) mengamplifikasi gen βLaktogobulin dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) dan mendapatkan hasil yang monomorfik (seragam). Hal ini dapat dikarenakan dengan menggunakan metode PCR RFLP yang menggunakan enzim restriction SacII tidak mengenali situs potong fragmen DNA tersebut. Tidak adanya keragaman pada gen ini juga dapat disebabkan domba yang digunakan pada penelitian tersebut berasal dari delapan daerah asal yaitu Ciomas, Jonggol, Margawati, Indramayu, Donggala, Madura, Sumbawa dan Rote yang belum diseleksi untuk domba yang memiliki produksi susu yang tinggi dan secara umum domba yang ada di Indonesia seleksi domba adalah untuk domba tipe pedaging. Seleksi yang dilakukan terhadap ternak domba di Indonesia belum mengarah pada ternak domba yang memiliki produksi dan kualitas susu yang tinggi. Pendeteksian keragaman gen β-Laktoglobulin dengan metode PCR-SSCP dibedakan berdasarkan banyaknya pita yang muncul dan laju migrasi fragment DNA. Tipe gen yang ditemukan dalam penelitian ini memiliki jumlah dua hingga empat
20
pita. Hasil ini sesuai dengan penelitian Bastos et al (2001) yang menyatakan bahwa pita maksimum suatu sampel DNA dengan metode SSCP adalah empat pita. Hasil yang diperoleh dari penelitian ini masih berupa tipe gen β-laktoglobulin sehingga tidak dapat dilakukan identifikasi alel, penentuan genotyping individu dan perhitungan nilai heterozigositas. Untuk mengetahui berapa banyak alel yang ada pada lokus β-laktoglobulin ternak domba perlu dilakukan sekuensing terhadap tipetipe yang telah ditemukan. Perbedaan hasil pendeteksian keragaman sangat bergantung kepada perubahan bentuk dari ikatan utas tunggal DNA. Bentuk dari utas tunggal DNA dalam gel dipengaruhi oleh faktor panjang fragmen dan lingkungan terhadap gel, diantaranya adalah suhu, konsentrai ion dan konsentrasi larutan dalam gel (Hayashi, 1991). Pengaruh Keragaman Gen β-Laktoglobulin dengan PCR-SSCP terhadap Produksi Susu Harian dan Komposisi Susu Keragaman gen β-laktoglobulin pada ternak ruminansia telah banyak didapatkan dari berbagai penelitian. Bovenhuis(1992) dan Ng-Kwai-Hang et al. (1984) telah menemukan keragaman gen β-laktoglobulin pada ternak sapi perah yang dihubungkan dengan persentase protein dan lemak susu. Mroczkwski (2004) pun telah mendapatkan keragaman gen β-laktoglobulin pada domba merino yang dihubungkan terhadap produksi susu, persentase protein dan lemak susu. Genotip AA cenderung menghasilkan persentase protein dan lemak susu yang lebih tinggi dari genotip AB dan BB pada produksi susu dan berpengaruh terhadap persentasi protein dan lemak susu.
21
Tabel 4. Pengaruh Tipe β-Laktoglobulin terhadap Produksi Susu, Persentase Protein dan Lemak Susu Produksi Susu (gram)
Tipe
x ±sb
kk
n
A
474,5 ± 135,3
28,58
23
B
441,5 ± 129,8
29,39
8
C
483,8 ± 129,5
26,76
14
D
446,6 ± 70,5
15,78
10
E
493,3 ± 127,2
25,78
9
Keterangan: χ = rataan, sb = simpangan baku, kk = koefisien keragaman, n = jumlah sampel. Tabel 5. Pengaruh Gen β-Laktoglobulin terhadap Kualitas Susu (Persentase Protein dan Lemak) Tipe
Protein (%)
Lemak (%)
x ±sb
kk
n
x ±sb
kk
n
A
5,31 ± 0,625
11,77
4
3,07 ± 1,38
44,95
4
B
5,35
-
1
3,56
-
1
C
5,39 ± 0,506
9,38
7
3,91 ± 1,02
26,08
7
D
6,09
-
1
3,27
-
1
E
5,74 ± 1,12
19,51
2
4,74 ± 0,19
4,00
2
Keterangan: χ = rataan, sb = simpangan baku, kk = koefisien keragaman, n = jumlah sampel. Produksi susu harian untuk umur 1, 2, 3, dan 4 tahun adalah 368,30, 429,24, 519,96, 462,98 gram/ekor/hari, dengan simpangan baku sebesar 25,21, 137,24, 130,89, dan 116,31 gram untuk tiap umur secara berturut-turut. Produksi susu dalam penelitian ini secara nyata (p<0,05) dipengaruhi oleh umur induk (Lampiran 4). Keragaman tipe gen β-Laktoglobulin ekson tujuh yang didapatkan pada domba induk di UP3 Jonggol dalam penelitian ini tidak berpengaruh terhadap produksi susu harian, dan persentase protein dan lemak susu (Lampiran 5&6). Pengaruh yang berbeda antara penelitian ini dan penelitian yang dilakukan Mroczkwski (2004), Bovenhuis (1992) dan Ng-Kwai-Hang et al. (1984) dapat disebabkan oleh berbagai faktor. Perbedaan sekuens gen β-Laktoglobulin yang digunakan dalam penelitian ini dengan pengaruh keragaman tipe protein β-
22
Laktoglobulin yang dilakukan Mroczkwski (2004), Bovenhuis (1992) dan Ng-KwaiHang et al. (1984) dapat disebabkan oleh perbedaan susunan asam amino yang dihasilkan dari gen β-Laktoglobulin. Ng-Kwai-Hang et al. (1990) mengatakan bahwa perbedaan jumlah populasi, bangsa sapi, dan lingkungan juga dapat menjadi faktor penyebabnya. Sifat produksi susu termasuk sifat kuantitatif yang dikendalikan oleh banyak gen, bersifat aditif serta dipengaruhi oleh lingkungan. Nudda et al. (2003) menyatakan bahwa kandungan protein dalam susu dipengaruhi oleh faktor genetik dan juga faktor lingkungan. Pada umumnya ternak domba yang ada di Indonesia termasuk kedalam tipe pedaging. Domba yang berasal dari UP3 Jonggol mungkin belum diseleksi untuk domba yang memiliki produksi susu yang tinggi sehingga keragaman tipe gen βLaktoglobulin tidak ditemukan berpengaruh terhadap produksi susu harian, persentase protein dan lemak susu.
23
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Berdasarkan penelitian ini dapat disimpulkan bahwa dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism (PCR-SSCP) gen β-Laktoglobulin pada domba di UP3 Jonggol bersifat polymorfik (beragam). Terdapat lima tipe gen β-Laktoglobulin ekson tujuh, yaitu tipe A 27,71%, Tipe B 9,64%, Tipe C 16,87%, Tipe D 12,05% dan Tipe E 10,84%. Tipe A memiliki persentase yang tertinggi dibanding dengan tipe lainnya. Hasil analisis menunjukkan bahwa variant tipe gen β-Laktoglobulin yang berhasil dideteksi dengan PCR-SSCP belum terpaut terhadap sifat produksi susu harian, dan kualitas susu yaitu, persentase protein dan lemak susu pada domba di UP3 Jonggol. Hal ini disebabkan produksi susu merupakan salah satu sifat kuantitatif yang dipengaruhi oleh banyak gen dan lingkungan. Saran Disarankan untuk melakukan melakukan verifikasi terhadap lima tipe gen βLaktoglobulin yang ditemukan dalam penelitian ini dengan cara sekuensing agar diketahui dimana terjadinya perubahan-perubahan pada fragment DNA yang menyebabkan keragaman dan diketahui jumlah alel untuk gen β-Laktoglobulin. Diperlukan pula perbaikan managemen untuk meningkatkan performa dan produkstivitas domba Di UP3 Jonggol dan perbaikan dalam segi rekording serta penambahan jumlah sampel yang akan digunakan.
24
UCAPAN TERIMA KASIH Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, atas limpahan rahmat dan karunia yang telah diberikan-Nya sehinggan penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi ini. Kepada Ibunda dan Ayahanda tercinta, yang telah memberikan kasih sayang, perhatian dan pengorbanan yang tak pernah terbalaskan. Kepada Paman dan Keluarga atas segala perhatian yang telah diberikan, tanpa mereka penulis tak akan bermakna. Kepada Kakak dan adik yang selalu memberikan semangat dan motivasi bagi penulis. . Kepada Dr. Ir. Cece Sumantri, M.Agr.Sc sebagai pembimbing utama Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si sebagai pembimbing anggota atas segala bimbingan, perhatian, motivasi, semangat dan arahan bagi penulis dalam penelitian dan skripsi ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada dosen penguji Dr. Ir. Rarah Ratih A.M., DEA dan Dr. Ir. Dwierra Evvyernie A. MS., MSc atas semua saran dan kritik yang sangat bermanfaat bagi penulis. Kepada Ahmad Yani, STp, MSi sebagai pembimbing akademik atas segala masukan dan nasehatnya. Kepada Dr. Ir. Kartiarso M.Sc atas segala kebaikannya dan perhatiaannya selama ini. Kepada Dr. Ir. Bambang Suryobroto selaku kepala Lab Zoologi dan dosen-dosen Zoologi atas izin yang telah diberikan penulis untuk melakukan penelitian. Kepada seluruh dosen dan staf Fakultas Peternakan, penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya. Kepada teman-teman penelitian seperjuangan Dani dan Eryk. Terima kasih banyak untuk segala pertolongan dan bantuannya selama ini. Pak Adi, mas Niko, mas Sipri, Mas Wildan. Teman-teman Bio’41 (Erna, Kusnandar dan Mita). Bapak Eko, Pak Chairul, Bu Ria dan Mbak Bibah penulis mengucapkan terima kasih atas kebersamaannya. Kepada seluruh teman-teman TPT 41 terima kasih banyak untuk semua tawa, canda, suka, duka dan kebersamaannya selama ini. Serta kepada seluruh teman-teman yang yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini, penulis mengucapakan banyak terima kasih.
Bogor, Mei 2008
Penulis
25
DAFTAR PUSTAKA Agung, P. P. 2007. Identifiksi keragaman gen κ-Kasein dan β-Laktoglobulin pada domba lokal Indonesia. Skripsi. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Barroso, A., S. Dunner dan A. Cannon. 1999. Technicalnotes: use for PCR singlestrand conformation polymorphism analysis for detection of bovine β-casein variants A1, A2, A3 and B. J. Anim. Sci. 77; 2629-2632. Bastos, E., A. Cravador, J. Azevedo dan H. Pinto. 2001. Single strand conformation polymorphism (SSCP) detection in six gene Portuguese indigenous sheep breed “Chura da Terra Quente”. Biotechnol. Agron. Soc. Environ 5 (1); 7-15. Blakely, J. dan D.H. Bade. 1992. Ilmu Peternakan. Edisi Keempat. Gajah Mada University Press. Yogyakarta. Bovenhuis, H., A.M. Johan, V. Arendonk dan S. Korver. 1992. Assosiation between milk protein polymorphism and milk production traits. J. Dairy Sci. 75: 25492559. Ceriotti, G., S. Chessa, P. Bolla, E. Budeli, L. Bianchi, E. Duranti dan A. Caroli. 2004. Single nucleotida polymorphism in the ovine casein genes detected by polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism. J. Dairy Sci. 87; 2606-2613. Devendra, C., dan G. B. McLeroy. 1982. Goat and Sheep Production in the Tropics. Intermediate Tropical Agriculture Series. Longman, London dan New York. Direktorat Jendral Peternakan. 2006. Statistik Peternakan. Departemen Pertanian. Jakarta. Diwyanto, K.H. Martojo dan Siswandi. 1982. Pengamatan ukuran permukaan tubuh domba di kabupaten Garut serta hubungannya dengan bobot badan. Prosiding. Pertemuan Ilmiah Penelitian Ruminansia Kecil. Hal: 143-146. Einstiana, A. 2006 Studi keragaman fenotipik dan pendugaan jarak genetik antar domba Lokal di Indonesia. Skripsi, Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor, Bogor. Ensminger, M. E. 2002. Sheep and Goat. Sixth Edition. Interstate Publisher, Inc.Danville, Illionis. Erhardt, G. 1989. Evidence for a third allele at β-Laktoglobulin locus of sheep and milk and its occurrence in different breeds. Anim. Genet. 20:197-204 Gatenby, R.M. 1991. The Tropical Agriculturalist Sheep. 1st Edition. Mc Millan Education Ltd., London and Basingtone. Hambling, S. G., A. S., McAlpine., L. Sawyer. 1992. β-Lactoglobulin, Dalam: Advanced Dairy Chemestry. Vol. 1 proteins, ed. P. F. Fox. London. Elsevier Applied Science: 141-190. Hardjosubroto, W. 1994. Aplikasi Pemuliaan Ternak di Lapangan. PT Gramedia. Widiasarana, Jakarta.
26
Harper, W. J. dan E. W. Hall. 1981. Dairy Technology and Engineering. AVI Publ. Co. Inc., Westport Harris, S., S. Ali, S. Anderson, A. L. Archibald dan A. J. Clark. 1988. Complete nucleotide sequence of the genomic ovine beta-lactoglobulin gene. http://www.ncbi.nlm.nih.gov// [10 Juni 2007] Hasnudi. 2004. Kajian tumbuh kembang karkas dan komponennya serta penampilan domba Sungai Putih dan Lokal Sumatera yang menggunakan pakan limbah kelapa sawit. Disertasi. Sekolah Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Hayashi, K. 1991. PCR-SSCP: a simple and sensitive method for detection of mutation in genomic DNA. PCR Methods Appl. 1, p 34-38. Hidayat. 2004. Penggunaan DNA mikrosatelit IDVGA-30 dan CSSMD18 sebagai penanda sifat cepat tumbuh pada domba garut. Skripsi. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Highsmith, W.E. 1999. Use of DNA toolbox for the characterizatio of mutation scanning methods. II: evolution of single strand conformation polymorphism analysis. Electrophoresis 20:1195-1203. Kolde, H. J., dan G., Braunitzer. 1983. The primary structure of ovine βlaktoglobulin. Milckwissen schaft 38: 70-72. Kontopidis, G. C. Hold dan L. Sawyer. 2004. Invited Review: β-laktoglobulin: binding properties, structure, and function. J. Dairy Sci. 87: 785-796. Kumar, A., P. K. Rout dan R. Roy. 2006. Polymorphism of β-Laktoglobulin gene in Indian goats and its effect on milk yield. J. Appl. Genet 47(1) pp. Kurcinskiene, J., G.Vagonis., J. Maliviciute., dan I. Tapio. 2005. Genetic polymorphism of β-Laktoglobulin in Lithuanian Blackface and Lithuanian Native Croarswooled sheep. Vet Zootech. 29: 90-92. Lestari, I. D. 2001. Analisis keragaman genetik kura-kura air tawar (Cuora ambionensis) berdasarkan haplotipe mtDNA. Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor, Bogor. Lunden, A., M. Nilsson dan L. Janson. 1996. Marked effect of β-laktoglobulin polymorphism on the ratio of casein to total protein in milk. J. Dairy Sci. 80: 2996-3005. Mason, I. L. 1980. Prolific Tropical Sheep. FAO dan UNEP. http://www.fao.org. [18 Februari 2008]. Mattjik, A. A., dan M. Sumertajaya. 2002. Perancangan Percobaan dengan Aplikasi SAS dan Minitab, Jilid 1. IPB PRESS, Bogor. Mohammadi, A., M. R. Nassiry., G. Elyasi dan J. Shodja. 2006. Genetic polymorphism of β-Laktoglobulin in certain Iranian and Russian sheep breeds. J. of Biotechnology. Vol 4. No 4, 265-268. Mroczkowski, S., K. Korman, G. Erhardt, D. Piwczynski dan B. Borys. 2004. Sheep milk protein polymorphism and its effect on milk performance of Polish Merino, Arch. Tierz., Dummerstorf 47, Special Issue, 114-121.
27
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Pustaka Wirausaha Muda dan USESE Foundation. Bogor. Nataraj, A.J., I.O. Glander, N. Kusukawa dan W.E. Highsmith. 1999. Single strand conformation polymorphism and heteroduplex analysis for gel-based mutation detection. Electrophoresis 20: 1177-1185.. Noor, R. R. 2004. Genetika Ternak. Penebar Swadaya. Jakarta. Natasasmita, A., N. Sugana, M. Duldjaman, dan Amsar. 1986. Penentuan parameter seleksi dan pengarahan metoda pembibitan domba di kalangan petani. Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor, Bogor. Nei, M. 1987. Molecular Evolutionary Genetics. Colombia University press, NewYork. Ng-Kwai-Hang, K.F., J.F. Hayes, J.E. Moxley, dan H.G. Monardes. 1984. Assosiation of genetics variant of casein and milk serum protein with milk, fat, and protein production by dairy cattle. J. Dairy Sci. 67:835-840 Ng-Kwai-Hang, K. F., H. G. Monardes, dan J. F. Hayes. 1990. Association between genetic polymorphism of milk proteins and production traits during three lactations. J. Dairy Sci. 73:3414-3420. Nudda, A. M. Feligini, G. Battacone, N. Pietro, P. Maciotta dan G. Pulina. 2003. Effects of lactation stage, parity, β-Laktoglobulin genotype on milk SSC on whey protein compotition in Sarda dairy ewes. Italian J. Anim. Sci. Vol 2; 29-39. Orita, M. H. Iwahana, H. Kanazawa, K. Hayashi dan T. Sekiya. 1989. Detection of polymorphism of human DNA by gel elektroforesis as single-strand conformation polymorphism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Pulina, G., R. Bencini. 2004. Dairy Sheep Nutrition. CABI Publishing, England. Ramadas, A. 2007. Domba Garut, peluang usaha membidik pasar lokal dan dunia. http://www.trubus-online.com. [20 Januari 2008] Sambrook, J., E. F. Fritsch dan T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Schlee, P., J. Krause.,O. Rottman. 1993. Genotyping of ovine β-Lg A and B using the PCR. Arch Tierz. 36: 519-523. Steel, R. G. D. dan J. H. Torrie. 1991. Prinsip dan Prosedur Statistika. Cetakan kedua. PT. Gramedia Pustakan Utama, Jakarta. Tegelstrom, H. 1992. Mitochondrial DNA in natural population. An improved routine for screening of genetic variation based on sensitive silver staining. Electrophoresis 7: 226-229. Tiesnamurti, B. 2002. Kajian genetik terhadap induk domba Priangan peridi ditinjau dari aspek kuantitatif dan molekuler. Disertasi. Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Bogor.
28
Yahyaoui, M. H. 2003. Genetic polymorphism in goat. Tesis. Fakultad de Veterinaria. Universida Autonoma de Barselona, Spanyol. http://www.tesisenxarxa.net [20 Februari 2007] Yuwono, T. 206. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Andi OFFSET, Yogyakarta.
29
LAMPIRAN
30
Lampiran 1. Hasil Analisis Kualitas Susu; Protein, Lemak dan Laktosa Identitas
Protein
Lemak
Laktosa
91
6,045
5,6
-
92
5,850
3,3
-
93
4,485
3,1
-
95
5,655
2,6
-
96
6,533
4,6
-
97
4,680
4,1
-
98
5,460
2,2
0.0493
99
5,168
2,3
0.1120
100
4,680
3,8
-
101
5,070
3,0
3.9247
102
5,070
3,6
4.2249
103
5,655
3,6
2.7195
104
4,485
5,1
1.3486
106
5,265
2,2
4.5072
107
5,070
3,0
4.1667
108
5,460
3,0
3.4453
110
5,655
3,5
3.0197
111
4,973
3,9
4.9283
112
5,655
2,4
4.0860
31
Lampiran 2. Modifikasi Metode Isolasi DNA Menggunakan Genomic DNA Mini Kit Geneaid Sampel darah ↓ Sentrifugasi 3500 rpm, 10 menit Sel darah putih dipindahkan ke tabung 1,5 ml ↓ + Etoh absolut sampai 1 ml Masukkan ke freezer, 2 jam ↓ Senturfigasi 7000 rpm, 10 menit Supernatan dibuang + TE sampai 500 µl ↓ Senturfigasi 7000 rpm, 10 menit Supernatan dibuang + 1 x STE sampai 350 µl + 5 mg/ml proteinase K 10 µl ↓
Inkubasi 56°C, 1 jam
+ 10 % SDS 40 µl + Bufer GB 250 µl ↓
Inkubasi 70°C, 10 menit
+ Ethanol 250 µl ↓ Pindahkan ke GD Column ↓ Sentrifugasi 10000 rpm, 3 menit Cairan ditabung penampung dibuang + Bufer W1 400 µl ↓ Sentrifugasi 10000 rpm, 1 menit Cairan ditabung penampung dibuang + Bufer pencuci 600 µl ↓ Sentrifugasi 10000 rpm, 1 menit Cairan ditabung penampung dibuang Pindahkan GD Column ke tabung 1,5 ml ↓ + Bufer pengelusi 100 µl ↓ Sentrifugasi 10000 rpm, 1 menit Didapatkan cairan berisi DNA dalam tabung 1,5 ml
32
Lampiran 3. Informasi Gen Laktoglobulin pada Domba locus X12817 7379 bp DNA linear MAM 14-NOV-2006 DEFINITION Ovis aries beta-lactoglobulin gene. ACCESSION X12817 VERSION X12817.1 GI:1313 KEYWORDS beta-lactoglobulin. SOURCE Ovis aries (sheep) ORGANISM Ovis aries Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Ruminantia; Pecora; Bovidae; Caprinae; Ovis. REFERENCE 1 (bases 1 to 7379) AUTHORS Harris,S., Ali,S., Anderson,S., Archibald,A.L. and Clark,A.J. TITLE Complete nucleotide sequence of the genomic ovine beta-lactoglobulin gene JOURNAL Nucleic Acids Res. 16 (21), 10379-10380 (1988) PUBMED 3194215 REFERENCE 2 (bases 1 to 7379) AUTHORS Watson,C.J., Gordon,K.E., Robertson,M. and Clark,A.J. TITLE Interaction of DNA-binding proteins with a milk protein gene promoter in vitro: identification of a mammary gland-specific factor JOURNAL Nucleic Acids Res. 19 (23), 6603-6610 (1991) PUBMED 1754397 REFERENCE 3 (bases 1 to 7379) AUTHORS Harris,S. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (09-SEP-1988) Harris S., Institute of Animal Physiology and Genetics Research, AFRC, Kings Buildings, West Mains Road, Edinburgh EH9 3JQ, Scotland FEATURES Location/Qualifiers source 1..7379 /organism="Ovis aries" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:9940" /clone="SS1" /tissue_type="spleen" /clone_lib="EMBL3" CAAT_signal 698..703 TATA_signal 768..772 precursor_RNA 802..5463 /note="primary transcript" exon 802..937 /number=1 CDS join(842..937,1602..1741,2586..2659,3772..3882,4551. 4869..4885) /codon_start=1 /product="beta-lactoglobulin" /protein_id="CAA31305.1" /db_xref="GI:1314" /db_xref="GOA:P67976" /db_xref="InterPro:IPR000566" /db_xref="InterPro:IPR002345" /db_xref="InterPro:IPR002447" /db_xref="InterPro:IPR011038" /db_xref="InterPro:IPR012674" /db_xref="UniProtKB/Swiss-Prot:P67976" /translation="MKCLLLALGLALACGVQAIIVTQTMKGLDIQKVAGTWHSLAMAA SDISLLDAQSAPLRVYVEELKPTPEGNLEILLQKWENGECAQKKIIAEKTKIPAVFKI DALNENKVLVLDTDYKKYLLFCMENSAEPEQSLACQCLVRTPEVDNEALEKFDKALKA LPMHIRLAFNPTQLEGQCHV" sig_peptide 842..895 mat_peptide join(896..937,1602..1741,2586..2659,3772..3882,455 4869..4882) /product="beta-lactoglobulin" intron 938..1601 /number=1
33
exon intron exon intron exon intron exon intron exon intron exon polyA_signal polyA_site ORIGIN 1 gtgctcagca 61 gctgtagcct 121 aggtgggagg 181 tgctcagccg 241 ctcttgtcat 301 cctcgatacc 361 cagcctgcag 421 ttggaggagc 481 ggctctgacc 541 agcctggacc 601 cgtctaggcc 661 cctcgtagag 721 gtggctgggg 781 gcctgcctgt 841 catgaagtgc 901 cgtcacccag 961 gagttgcagg 1021 gttcccatca 1081 gttcactgtc 1141 ttctcctgcg 1201 tgatttcctc 1261 cacacgacct 1321 ggggttagtg 1381 acctccagcc 1441 tccctctttg 1501 gagtatctca 1561 cccttcccac 1621 ccttggctat 1681 tgtacgtgga 1741 ggtgggcgtc 1801 gtggggtgca 1861 acccggcgct 1921 atttgatgct 1981 ggaaggggag 2041 aggtattctg 2101 attttcatca 2161 cgaagcagtg 2221 cgggctcaag 2281 agagagctgg 2341 gggtgcctgt 2401 ggcccatcca 2461 ccagctggct 2521 tggccctcag 2581 ttcagggaga
1602..1741 /number=2 1742..2585 /number=2 2586..2659 /number=3 2660..3771 /number=3 3772..3882 /number=4 3883..4550 /number=4 4551..4655 /number=5 4656..4868 /number=5 4869..4910 /number=6 4911..5283 /number=6 5284..5463 /number=7 5445..5450 5463 acacacccag gagcggtgtg ttgggccctg tgcccccgcc tgccattgcc gaccaggtcc agggtgggtg tggtgcccaa tgtccttgtc cagagtccag cagaggggga gaagccaccc gcccagcccg ctcagccctc ctcctgcttg accatgaaag gcgggcaggg gtcagctagg ttgcattctg gccgctctct ttcctgtgag ttgtcatctc ggacacagtt atgtctcccc ggttcagtgt gggctgccca ccccagagtg ggcggccagc ggagctgaag tctccccaac ggagggacca ccacccaagg tcagaacatc ataaaatcct aattccctgt tttctagtct tggggatagg cagttcccgc atgggtgtgg ggtcaaggct cccggtcccc cctatgccca ttcatcctga acggcgagtg
caccagcatt gagggaagtg tgggcctgcc gcaggggtca atttttgcta tccctcggag actgcagaga ggcagaggcc taagaggctg acacccacct cttcctgctt cggggcctga ggctggctgg cactccctgc ccctgggcct gcctggacat gagctgggcc gccacctgac gaggctggaa ggggagcaga gccaccaggc tttaaaggcc cagcccctaa aagatccaaa gagtctgggg ggccggggtg caactcaagg gacatctccc cccacccccg atggaacccc gggccccagg ctgcccaccc atcaaacaaa ctgaagtgga tagtctgagg gaacacctca cccgtgtgaa taccagccct gggcagagat ctccctgacc tgtggcctga tgccaccccc tgaaaatggt tgctcagaag
cccgctgctc tcctgggaga catcccacgt ggtcactttc ccctaactgg ctcgacctga tcccttcacc accctccagg accccggaag gtgcccccgc ggccttggat ggatgagcca cctgcatgcg agagctcaga ggccctcgcc ccagaaggtt tcagagagcc aaatccccgc gcccaagatc cggccgtctt ctgctggaaa atgtctccag aagagtctct tgttgctaca agagcattcc ggacagagag tccctctcca tgctggatgc agggcaacct cactccccag gctggggaag agggcttttt tgaacataaa aatgcatagc attacaagtg gtatctaaaa ggctgctggg gtccacctca ggggacctga ttttctctct ggtgacagtg ctccagccct ccatgccaat aagattattg
ctgaggtctg tttaaaatgt gcctgcatta ccgtcctggg gcagcaggtg accccatgtc caaggccacg acacacctgt tgttcctggc ttctggggtc ggaagaaggc agtgggattc cctcctgtat agcacgaccc tgtggcgtcc cgagggttgg aagagaggct tggggcagct caggtgttgg ctccagtcct cacgcctgcc agtcatgtgt ctgcccctca tgtggggggg ccagggtgca cccactgtgg ggtggcgggg ccagagtgcc ggagatcctg ggctgtggac agggctcaga ttttttttaa acattcattt aaagatacat tatttgagca tgaacaagaa aggcagcaga gacgggggtc accccagggc ggcttcatct agtgcgccga cctgggccag ggctcagaaa cagaaaaaac
caggcagctc gagaggcggg gccccagtgc gttattatga cttgcagagc acccttgccc gtcacatggt ccccagtgct actggcagcc taccaggaac ctcctattgt cgggaaccgc aaggccccaa cagctgcagc aggccatcat ccgggtgggt gtgacgttgg tcaaccaggc cagggctggc ctgcgcgccc tgcgcagctt tgaagttctg aattttcccc ctcatctggg gagttggggg ggctgggggc acttggcact cccctgagag ctgcagaaat cccccggggg gtttactggt acttttatta ttgtttactt acaatgaggc acagagagac gtcctggaaa cctgggtctt agggtgcagg tgccttttgg gacttctcct ggctagttgg cttctgcccc gcagctgtct caagatccct
34
2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541 3601 3661 3721 3781 3841 3901 3961 4021 4081 4141 4201 4261 4321 4381 4441 4501 4561 4621 4681 4741 4801 4861 4921 4981 5041 5101 5161 5221 5281 5341 5401 5461 5521 5581 5641 5701 5761 5821 5881 5941 6001 6061 6121 6181 6241 6301 6361 6421 6481 6541 6601 6661 6721
gcggtgttca cggggactgt ggtgatgaag ccttggggcg cgagctctct acctgtgccc acgaccccag ctcattcact catcagggct ctcactctga gcgccatcca caggcagccg ggcttgcccc tccagcccca gggggcctca ggatccagag aagaggaagc cgggtggtga cccctccccc agaacaaagt acagtgctga tgcccaggga atccccagga accgggagcc ccgggagacg tcactgaatc caggtacaaa tgtgccgtag cggcgagtgg ccagaggtgg ggaagggagg ctgcagacca ggaggtggac catccggctt ccagggcagg aggcctccca tgccaggcct ccccacaggg tgccctgccc cccacatcag cgactgcaga acactgacct taaggggagg agaggctggc cagggcccgg atcaggggga aggcccctcc tgtgctctcc gggagtctgg tgtgacaact agggactcgg acaaaggaca caagttgctc tcatgtaccc ggcaagaggt gagatcagtc ccacctgatg caggaggaga catgggtttg agcggtttat ggtatacagc ctcatatttt atggaccgta agtgggtagc cctgtattgg atgtcccact cggcctgcag tcccgggcca attatcttta
agatcgatgg ggacaggttc acactgcctt gtggccatgg ttgctggggg tcccaggggt cccgctccac tgttcgtcct gcccttccgc ctggaggccc gctgcactgg gggctgccca gacaatgacc cccgagatcg gactgagtgg ttgacagtga accatttcag ccccggggga cccgttggaa ccttgtgctg gcccgagcaa gaccagctgc ggaggagggg agtctgctgt ggtgggctgc taacagcctt gccatctttc cagtcccact aggctcctgg ggggcaggct ggaactaggc ccctggggag aacgaggccc gccttcaacc agccacccgg ggaggaaggg ctcttcccga cagtgccacg cacgtcctgg gccctggggt gctggctggc cctccagctc ctagcggtcc aagggtctgg gagccttgga ctagaaggga tggggctcct cttctgagtc ctcagaggat gggggcccac cagagacatc gaaagtggaa atggatcaat aaacgcactg cacagtgaga ctggtgttca tgaagagctg aggggacgac ggtggactcc ggggtcacaa aaagtgggga tatgcatacc gccttccagg catttcctcc caggtggatt taattaccaa agggtggtgg cgtgacccac aaaaaaactg
tgagtccggg agggggctgg gacacctgct gcaggtcccg gcgggcggtg aaccgagagc agctccttca aaatccgaga cgggcagcct tgcactgact gtttgggtgc ctggcctcgg ccatcctcag ggggaagccc tgagtgttcc gggcttcctg gggtggggga gccccgctgg ctcacttttc gacaccgact agcctggcct gtggtccttg tggggggtcc gggcctgtgg agaactgtga tgttaccggg aactatcaca gggcattttc ctgtgtcagc ttccccctgt caagggggaa cagggactga tggagaaatt cgacccagct ccccgggacg gtggggtgca ggtgtccagt tctaggtgag gcacacacat cccccctgtg cgcgtgccac cttccagcag ttctcccgag caggtgcccc ctcctctggg ccaggactgc gctctgggca tttgctggac gacagcgggg acacatcact tgccagttca aatggctgtc atgcctttat atctgtctgg actgtctgca ttggaggact actcatttga agaggatgag aggagttggt agactgagtg ttttttagat tgaatgctca tttcttctgt tccaggggat ctttaccact agctgctcca gggtagactg agtcctgcag aggtctattt
tccctggggg cgtcgggccc tcacttgcct gctggcgggc ctctgggccc cgttgcccac tctcctggag tgataaagct gggccacatc gacgccaggg tggtcctgcc tcagggtgag gacgcacccc tatttcttga caagtccagg ggccccatgc tgccagaggc tcgtggaggg tcccgtcttg acaaaaagta gccagtgcct ctgcaacagg ctgagtcccg gtggctgggg ctggtgtgac gagtttcaat tcctgaaaac agggcccctg cggcccaggg gacctgcaga gggcaggtgc cccccgtccc cgacaaagcc ggagggtgag acctcctccc gcaccccgtg cccatcctga cccctgccgg ggggtagggg agaatggctg tcttgtgggt agctaaggct gaggggctgt aggaatcaca gacagacgac agtcaccctt gcttctcctt gacgggcagg ctgggatcca gcggctcttt cttggagtgt tcttagtcta gatccagcca ctaatgatga cacacagcag gatgttgaag aaagaccctg atggttggat gatggacagg actgaactga aataagaata gtcactcagt ccacagaatt cctcccgacc gtgccaccag agaaaaagcc tgacctggga acagccgggt tgtgacttcg
acacccacca tgggatgcta cccctgccac taacccacca tcaggctgag tccaggggcc acaaactctg tcgagggggg tgcccttggc tgcccagccc cccaagctgc ccccagctgc ccttcccttg caactccagt aggtggtgga gcctggcagt gctccccacc tgctgggggc accgcgtcca cctgctcttc gggtgggtgc gggtgggggg ccaggagaga acgggggcca cgtcgcgatg tatttcccaa aaatggcagg tgccaggggg ggaggaaggg cccactgcac tctggagggc tgccccatag ctcaaggccc cacccaggcc atggtgaccc ggggccccct cccccccatg tgcctctggg gtcttggtgg gaagctgggg gacctgtgtc aagtgagcca cctggaacca ggggggcccc gtcaccaccg cctgggaccc caccaataaa gggtggagaa gggcgtctgc gaaactttca tcagtcaaca ataaatattg gccactactg gagattccca agtccaccag ctgaaactcc atgctgggaa ggcatcacca gaggcctggc gctgaactga tacacataac cgtatctgac ctccaaggca cagggattga ggaagcccgt cctgtgccct acaccctccc agctctgctc ctgccgtaac
cccccgcccc agggactggt ctgcccgggg gggtgacacc ctcaggaggt caggtgcccc tccgccctcg gttggggttc cccctcagga agggtctctg ccggacacca ccccgctcag ctgggcagtg ccctggggga gggtcctggc ggcagcaggg ccgtcttcgc tgactagcaa gccttgaatg tgcatggaaa caaccctggc tgggagcttg gtggtcgcat gacacacagg gggccggtgg aataagaact tgacattttc gcgcgggcat acccggacag tgccctggga aagggcagac tcaggacccc tgcccatgca ccgcccttcc ccagctcccc ccccaccccc actctccctc gtaagctgcc ggcctgggac tccctcctgg ctggcctcac gaatggtacc ccagccatgg atgtccattt cccccccccc aggcccctcc ggcataaacc gtggtgggga atcacagtct ggaaccaggg cccaaactcg atatgaaact tcgtatcaac gtagagagct tcatcctaag aatgctttgg agattgaggg acacaatgga gtgctacgga atggaaatga atagtgtata tctgtgacct agaatactgg accggcatct gttactctct ctgagcttcc gcttcaggac ttcaaggctc ttctgaacat
35
6781 6841 6901 6961 7021 7081 7141 7201 7261 7321
ccagtgcgat cctatgagtc tcgtcctgat actgaggttc ttttctcttt tgtccccagg tggaattaat caaccatcct tatatatata tgcgcaggct
ggacaggacc accagacact caaagagcaa accagagctg aatctggatt acagccactc cggtccaaac gctttgacca tttttttttt tctctctagt
tcctccccag cgggggtggc gaccaatgac agctgtcctt taaggcctac ggtggcatcc tggacaaaaa ccctgcatct tttcattttt ttctctctag
gcctcagggg cccgccttca ttcttaggag ttgaacctaa ttgcccctca gaggccactt ccttggtggg ttttttcttt tggctgtgct tcttctctta
cttcagggag gggtgctcac caagcagaca agacacacag agagggaaga agtattatct aagtttcatc tatgtgtatg ggctgttcgt tcacagagca
ccagccttca agtcttccca cccacaggac ctctcgaagg cagtcctgca gaccgcaccc ccagaggcct catgtatata tgcagttcgg gtctctaga
//
36
Lampiran 4. Hasil Analisis Ragam Pengaruh Tipe β-Laktoglobulin dengan terhadap Produksi Susu Sumber JK KT DF F hitung F tabel P keragaman terkoreksi terkoreksi Tipe β-
4
19339
19339
Error
60
907929
907929
Total
64
927268
Laktoglobulin
0,31
0,871
S = 125.116 R-Sq = 2.09% R-Sq(adj) = 0.00%
Lampiran 5. Hasil Analisis Ragam Pengaruh Tipe β-Laktoglobulin terhadap Persentase Protein Susu Sumber JK KT DF F hitung F tabel P keragaman terkoreksi terkoreksi Tipe β-
4
0,6867
0,172
Error
10
3,9719
0,397
Total
14
4,6586
Laktoglobulin
0,43
0,784
S = 0.630230 R-Sq = 14.74% R-Sq(adj) = 0.00%
Lampiran 6. Hasil Analisis Ragam Pengaruh Tipe β-Laktoglobulin terhadap Persentase Lemak Susu Sumber JK KT DF F hitung F tabel P keragaman terkoreksi terkoreksi Tipe β-
4
2,066
0,517
Error
10
12,001
1,200
Total
14
14,068
Laktoglobulin
0,43
0,784
S = 1.09551 R-Sq = 14.69% R-Sq(adj) = 0.00%
37
