IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN CALPASTATIN DOMBA LOKAL (Ovis aries) DENGAN METODE PCR-RFLP DAN HUBUNGANNYA DENGAN BOBOT BADAN
SKRIPSI ROHMAT DIYONO
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI PRODUKSI TERNAK FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN CALPASTATIN DOMBA LOKAL (Ovis aries) DENGAN METODE PCR-RFLP DAN HUBUNGANNYA DENGAN BOBOT BADAN
ROHMAT DIYONO D14103024
Skripsi ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor
PROGRAM STUDI TEKNOLOGI PRODUKSI TERNAK FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN CALPASTATIN DOMBA LOKAL (Ovis aries) DENGAN METODE PCR-RFLP DAN HUBUNGANNYA DENGAN BOBOT BADAN
Oleh ROHMAT DIYONO D14103013
Skripsi ini telah disetujui dan disidangkan di hadapan Komisi Ujian Lisan pada tanggal 16 Mei 2007
Pembimbing Utama
Pembimbing Anggota
Dr. Ir. Cece Sumantri, MAgr.Sc. NIP. 131 624 187
Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si NIP. 131 878 947
Dekan Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Ronny R. Noor, MRur.Sc. NIP. 131 624 188
RINGKASAN ROHMAT DIYONO. 2007. Identifikasi Keragaman Gen Calpastatin Domba Lokal (Ovis aries) Dengan Metode PCR RFLP dan Hubungannya dengan Bobot Badan. Skripsi. Program Studi Teknologi Produksi Ternak. Fakultas Peternakan. Institut Pertanian Bogor. Pembimbing Utama : Dr. Ir. Cece Sumantri, M.Agr.Sc Pembimbing Anggota : Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si Domba lokal di Indonesia mempunyai produktivitas yang rendah, terutama sifat pertumbuhan dan kualitas daging. Peningkatan produktivitas domba tersebut dapat dilakukan melalui upaya seleksi berdasarkan pada penciri DNA yang disebut dengan Marker Assisted Selection (MAS). Calpastatin merupakan gen yang berfungsi untuk menghambat proses degradasi protein sel otot. Gen calpastatin diduga terkait dengan sifat pertumbuhan otot dan keempukan daging pada mamalia. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen calpastatin pada domba lokal (Ovis aries) dan menganalisis hubungan antara genotipe gen calpastatin dengan bobot badan. Sampel darah domba yang digunakan berjumlah 288 sampel yang terdiri dari Domba Ekor Tipis (DET) Jonggol (36), domba Garut Ciomas (29), domba Garut Margawati (29), Domba Ekor Gemuk (DEG) Indramayu (43), DEG Madura (43), 46 DEG Donggala (46), DEG Sumbawa (26), dan DEG Rote (36). Amplifikasi gen calpastatin dilakukan dengan Teknik PCR, sedangkan untuk menentukan genotipenya dilakukan dengan teknik Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) dengan enzim restriksi MspI. Analisis hubungan antara genotipe gen calpastatin dengan bobot badan domba dilakukan dengan metode General Linear Model SAS 6.12. Gen calpastatin yang bisa terpotong sempurna menjadi 336 dan 286 pb disebut dengan genotipe MM dan yang tidak terpotong disebut dengan genotipe NN, sedangkan yang tidak terpotong sempurna disebut genotipe MN. Gen calpastatin domba lokal bersifat polimorfik pada semua populasi domba lokal, kecuali domba Rote. Tipe gen calpastatin pada domba Rote semuanya adalah NN atau monomorfik. Frekuensi alel M tertinggi ditemukan pada populasi domba Garut Ciomas (29%) dan terendah pada populasi Domba Ekor Gemuk di Sumbawa dan Madura masingmasing 4%. Frekuensi alel M untuk domba Margawati, Jonggol, Indramayu, dan Donggala secara berturut-turut yaitu 24, 16, 13 dan 12%. Keragaman genetik yang ditunjukkan dengan nilai heterosigositas, juga bervariasi antara subpopulasi dan berkisar antara 8% pada populasi domba Sumbawa dan Madura, sampai 43% pada populasi domba Garut Ciomas. Nilai heterosigositas domba Margawati, Jonggol, Indramayu, dan Donggala secara berturut-turut yaitu 37, 28, 23 dan 21%. Genotipe gen calpastatin berhubungan dengan bobot badan domba jantan (P=0,017) tetapi tidak berhubungan dengan bobot badan domba betina (P=0,847). Rataan bobot badan domba jantan dengan genotipe MN lebih tinggi dibandingkan dengan genotipe NN. Kata-kata kunci ; domba lokal, calpastatin, keragaman genetik, RFLP, bobot badan
ABSTRACT Detection of Ovine Calpastatin Gene Polymorphisms within Indonesian Local Sheep Population Using PCR-RFLP and Its Effect on Body Weight Diyono, R., C. Sumantri, and A. Farajallah Genetic improvement of Indonesian Local Sheep can be gained through selection for traits having economic interest, i.e., meat and growth traits. Calpastatin (CAST) play an essential role in inhibiting muscle protein degradation and responsible for muscle hypertrophy. DNA polymorphisms within the calpastatin gene may lead to the phenotypic differences of sheep growth traits. A 622 bp of Indonesian local sheep calpastatin gene successfully amplified using Polymerase Chain Reaction (PCR) technique. An MspI restriction enzyme cut the PCR product into two different length fragments that are 336 bp and 286 bp and revealed two alleles system, M and N and two genotypes MN and NN. All of Indonesian local sheep population are polymorphic in calpastatin gene, except, Rote Fat Tailed Sheep Population. The highest M allele frequency was found in Garut Ciomas Thin Tailed Sheep population (29%) and the lowest one was found in Sumbawa and Madura Fat Tailed Sheep Population (4%). The allele M frequencies of Margawati, Jonggol, Indramayu, and Donggala Sheep population are 24, 16, 13 and 12%, respectively. The observed heterosigosity was different among population. The highest heterosigosity was found in the Ciomas Sheep (43%) and the lowest one was found in Sumbawa and Madura Sheep population (8%). The observed heterosigosities of Margawati, Jonggol, Indramayu, and Donggala were 37, 28, 23 and 21%, respectively. This research showed that there is an association beetwen calpastatin genotipe and body weight of male sheep (P=0,017) but not for female sheep (P=0,847). Male sheeps with MN genotype have higher body weight compared to NN genotipe. Keywords : sheep, calpastatin , genetic polymorphims, RFLP, body weight
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 11 Juli 1985 di Temanggung Jawa Tengah. Penulis adalah anak keempat dari empat bersaudara dari pasangan Bapak Brahim dan Ibu Wagini (Almh). Pendidikan dasar diselesaikan pada tahun 1997 di SDN Prangkokan, pendidikan lanjutan menengah pertama diselesaikan pada tahun 2000 di SLTP Negeri 2 Candiroto, dan pendidikan lanjutan menengah atas diselesaikan pada tahun 2003 di SMU Negeri 1 Parakan, Temanggung. Penulis diterima sebagai mahasiswa IPB pada Program Studi Teknologi Produksi Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada tahun 2003. Selama mengikuti pendidikan, penulis aktif di Badan Eksekutif Mahasiswa (BEM) Fakultas Peternakan IPB periode 2004-2005. Selain aktif dalam keorganisasian intra kampus, penulis juga aktif di organisasi mahasiswa daerah yaitu Paguyuban Mahasiswa Temanggung Makukuhan (PMTM) dan terpilih sebagai ketua umum periode 2004-2005. Dalam bidang akademik, penulis pernah menjadi asisten dosen mata kuliah Matematika I dan Kalkulus I pada program Tingkat Persiapan Bersama (TPB) tahun ajaran 2004/2005.
KATA PENGANTAR Puji dan syukur penulis senantiasa panjatkan kepada Alloh Swt., karena atas segala rahmat dan karunia-Nya, penulisan skripsi ini dapat terselesaikan. Skripsi ini berjudul Identifikasi Keragaman Gen Calpastatin Domba Lokal (Ovis aries) dengan Metode PCR-RFLP. Domba lokal di Indonesia masih mempunyai produktivitas yang rendah khususnya sifat pertumbuhan dan kualitas daging. Beberapa upaya telah dilakukan untuk meningkatkan produktivitas domba diantaranya perbaikan pakan dan manajemen pemeliharaan, seleksi, persilangan, dan kombinasi antara seleksi dan persilangan. Akhir-akhir ini, seleksi dapat dilakukan dengan menggunakan penciri DNA, yaitu dengan memanfaatkan hubungan antara keragaman DNA dengan sifat kuantitatif. Selanjutnya seleksi hanya dilakukan terhadap ternak-ternak yang mempunyai tipe DNA (alel) tertentu yang terkait dengan sifat produksi unggul. Salah satu tujuan penulisan skripsi ini untuk memberikan informasi tentang keragaman gen calpastatin pada domba lokal, yaitu gen yang terkait dengan sifat pertumbuhan dan kualitas daging. Informasi keragaman gen calpastatin tersebut, selanjutnya diharapkan menjadi dasar seleksi berdasarkan penciri DNA (marker assisted selection) untuk meningkatkan sifat pertumbuhan dan kualitas daging domba lokal. Penulis berharap semoga skripsi ini dapat memberikan sumbangan terhadap pembangunan peternakan di Indonesia. Amiin.
Bogor, Mei 2007 Penulis
DAFTAR ISI RINGKASAN…………………………………………………………...
Halaman i
ABSTRACT……………………………………………………………..
ii
LEMBAR PERNYATAAN……………………………………………..
iii
LEMBAR PENGESAHAN……………………………………………..
iv
RIWAYAT HIDUP………………………………...……………………
v
KATA PENGANTAR…………………………………………………..
vi
DAFTAR ISI………………………………………………………….....
vii
DAFTAR TABEL…………………………………………………….....
ix
DAFTAR GAMBAR……………………………………………………
x
DAFTAR LAMPIRAN……………………………………………….....
xi
PENDAHULUAN………………………………………………………
1
Latar Belakang………………………………………………….. Tujuan…………………………………………………………...
1 1
TINJAUAN PUSTAKA………………………………………………...
2
Domba Lokal di Indonesia……………………………………… Domba Ekor Tipis Jawa………………………………… Domba Priangan (Domba Garut)……………………….. Domba Ekor Gemuk…………………………………… Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR RFLP)............................................. Keragaman Gen Calpastatin ....................................................... Hubungan Antara Sistem Calpain-Calpastatin dengan Sifat Pertumbuhan ……………………………………………………
2 2 3 3 4 4 5
METODE ……………...………………………………..........................
7
Lokasi dan Waktu………………………………………………. Materi…………………………………………………………… Sampel Darah…………………………………………… Primer……………………………………....................... Prosedur …………………...…………………………………… Ekstraksi DNA dari Sampel Darah dalam Etanol 95%... Amplifikasi Gen Calpastatin (CAST)dengan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) .................................. Identifikasi Genotipe Gen Calpastatin dengan Metode Restriction Fragment Lenght Polymorphisms (RFLP)..... Elektroforesis dan Pewarnaan Perak ............................... Pendeteksian Keragaman Gen calpastatin........................ Analisis Data.................................................................................
7 7 7 7 7 7 8 8 8 9 9
HASIL DAN PEMBAHASAN……………………………………….....
11
Amplifikasi Gen Calpastatin........................................................ Pendeteksian Keragaman Gen Calpastatin dengan RFLP ........... Keragaman Genetik Gen Calpastatin Domba Lokal ................... Keragaman Genetik Domba Ekor Tipis (DET)................ Keragaman Genetik Domba Ekor Gemuk (DEG)............ Hubungan antara Genotipe Gen Calpastatin dengan Bobot Badan Domba ....................................................................
11 12 14 15 16
KESIMPULAN DAN SARAN……………………………………….....
19
Kesimpulan……………………………………………………... Saran…………………………………………………………......
19 19
UCAPAN TERIMAKASIH…………………………………………......
20
DAFTAR PUSTAKA…………………………………………………...
21
LAMPIRAN…………………………………………………………......
24
16
DAFTAR TABEL Nomor 1. 2.
Halaman
Nilai Frekuensi Genotipe, Frekuensi Alel, Standar Eror Frekuensi Alel (SE), dan Nilai Heterosigositas (ĥ) Lokus CASTMspI Domba Lokal Indonesia........................................................ Rataan Bobot Badan Domba ( X ) dan Simpangan Baku Rataan (SE) antara Genotipe MN dan NN..........................................
DAFTAR GAMBAR
14 17
Nomor
Halaman
1
Estimasi Struktur Gen Calpastatin Domba..................................
11
2
Sekuen Nukleotida Gen Calpastatin Lokus CAST-MspI .............
11
3
Perbedaan Sekuen Nukleotida Gen Calpastatin pada Lokus CAST-MspI.........................................................................
12
4
Pola Pita Gen Calpastatin Domba dalam Gel Poliakrilamid 6%.....................................................................................
13
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor 1 2
Halaman
Analisis Ragam Respon Genotipe Gen Calpastatin terhadap Bobot Badan Domba Jantan dan Hasil Uji Lanjutan (Uji Duncan)…………………………………………………………. Analisis Ragam Respon Genotipe Gen Calpastatin terhadap Bobot Badan Domba Betina……………………………………..
PENDAHULUAN
24 24
Latar Belakang Populasi domba lokal di Indonesia tergolong masih rendah, yaitu sekitar 8.307.000 ekor, sedangkan produksi daging domba hanya 66.500 ton (3,15%) dari total produksi daging dalam negeri (DJBPP, 2005). Domba-domba lokal Indonesia diberi nama sesuai dengan daerah dan karakteristiknya, seperti domba Donggala, domba Garut, domba Kisar, Domba Ekor Gemuk, Domba Ekor Tipis Jawa dan Domba Ekor Tipis Sumatera. Domba lokal mempunyai beberapa keunggulan, antara lain mampu beradaptasi dengan baik pada lingkungan tropis, tidak mengenal musim kawin, bersifat prolifik, dan kebal terhadap beberapa macam penyakit dan parasit. Namun demikian, domba lokal mempunyai produktifitas yang rendah. Peningkatan produktifitas domba lokal dapat dilakukan dengan cara seleksi. Seleksi pada domba lokal dilakukan terhadap sifat-sifat yang mempunyai nilai ekonomis tertentu. Salah satu sifat yang mempunyai nilai ekonomis tinggi adalah sifat pertumbuhan. Kemajuan dalam bidang biologi molekuler memungkinkan upaya seleksi dapat dilakukan pada tingkat DNA, yaitu dengan cara mencari keragaman gen yang mengontrol sifat ekonomis. Pemetaan lokus terkait dengan sifat kuantitatif (QTL) dan pencarian tipe DNA (alel) yang terkait dengan sifat unggul merupakan dasar penerapan program MAS (Marker Assisted Selection). Metode seleksi ini dapat digunakan untuk mendeteksi sifat unggul dari seekor ternak dalam waktu yang relatif lebih cepat. Calpastatin merupakan sebuah gen yang berfungsi untuk menghambat degradasi protein sel-sel otot. Peningkatan aktivitas calpastatin menyebabkan terjadinya pertambahan massa otot (hyperthropy) dan penurunan keempukan daging. Keragaman gen calpastatin diduga terkait dengan sifat pertumbuhan domba lokal. Identifikasi keragaman gen calpastatin dapat dilakukan dengan metode Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP). Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen calpastatin domba lokal (Ovis aries) lokus CAST-MspI dan menganalisis hubungan antara genotipe gen calpastatin dan bobot badan domba.
TINJAUAN PUSTAKA
Domba Lokal di Indonesia Domba merupakan hewan ruminansia yang berkuku belah dan termasuk dalam subfamili Caprinae dari famili Bovidae. Semua domba termasuk dalam genus Ovis dan yang terdomestifikasi adalah Ovis aries (Blakely dan Bade, 1991). Dombadomba terdomestifikasi yang ada sekarang memiliki komposisi genetik dari domba Argali (Ovis ammon) yang berkembang di Asia Tengah, domba Urial (Ovis vignei) di Asia, domba Moufflon (Ovis musimon) di Asia Kecil dan Eropa (Devendra dan McLeroy, 1982). Menurut Diwyanto (1982), domba lokal Indonesia dapat digolongkan menjadi tiga kelompok, yaitu Domba Ekor Tipis (DET), Domba Ekor Sedang (DES) dan Domba Ekor Gemuk (DEG). Domba Ekor Tipis mempunyai lebar pangkal ekor kurang dari 4 cm, Domba Ekor Sedang 4 - 8 cm, dan Domba Ekor Gemuk lebih dari 8 cm. Domba Ekor Tipis banyak dijumpai pada daerah-daerah yang relatif basah seperti di Jawa Barat, sedangkan Domba Ekor Gemuk terutama tersebar pada daerahdaerah kering seperti di Jawa Timur dan Nusa Tenggara (Sutana, 1993 ; Doho, 1994). Domba Ekor Tipis Jawa Domba Ekor Tipis Jawa memiliki ekor tipis dan pendek. Sekitar 80 – 85% jenis domba ini terdapat di daerah Jawa Tengah dan Jawa Barat dan sisanya merupakan Domba Priangan. Jenis domba ini berukuran kecil. Bobot badan betina dewasa bervariasi dari 25- 35 kg dengan tinggi badan rata-rata 57 cm. Bobot badan domba jantan dewasa berkisar antara 40 – 60 kg dengan tinggi badan rata-rata 60 cm. Pada umumnya domba ini mempunyai bobot potong 19 kg (Devendra dan McLeroy, 1982). Domba Ekor Tipis Jawa memiliki warna dominan putih dan terdapat belang hitam di sekeliling mata, hidung, dan kadang-kadang diseluruh tubuhnya. Bagian ekornya tidak menunjukkan adanya deposisi lemak. Domba jantan memiliki tanduk yang melengkung, sedangkan domba betina biasanya tidak bertanduk. Domba Ekor Tipis Jawa mempunyai telinga ukuran sedang dan wool yang kasar (Mason, 1980).
Domba Priangan (Domba Garut)
Domba Priangan merupakan domba ekor tipis yang tersebar di daerah Jawa Barat, terutama di daerah Garut sehingga disebut domba Garut (Gatenby, 1991). Domba Priangan mulai dikembangkan pada tahun 1864 melalui persilangan tiga bangsa domba, yaitu Domba Ekor Tipis Jawa, domba Merino dan domba Cape yang diduga berasal dari Afrika Selatan. Domba Priangan mempunyai ukuran tubuh yang lebih besar dibandingkan dengan Domba Ekor Tipis Jawa. Jenis domba ini mempunyai bentuk muka yang cembung dan sering ditemukan domba dengan telinga rumpung (tidak mempunyai daun telinga). Warna wool bermacam-macam yaitu hitam, abu-abu, putih dan belang-belang hitam. Pada bagian pangkal ekornya terdapat sedikit timbunan lemak. Domba betina tidak bertanduk, sedangkan domba jantan memiliki tanduk yang melengkung. Bobot badan Domba Priangan betina sebesar 35 – 40 kg, sedangkan bobot domba jantan mencapai 50 – 60 kg. Domba Priangan termasuk domba yang prolifik, interval beranak yang pendek, dan jumlah anak yang dihasilkan pertahun rata-rata sebesar 1,7. Domba Priangan banyak digunakan untuk meningkatkan komposisi genetik (upgrading) domba lokal yang terdapat pada daerah tersebut (Devendra dan McLeroy ,1982). Domba Ekor Gemuk. Domba Ekor Gemuk merupakan domba khas daerah Jawa Timur. Populasi Domba pada awalnya banyak dijumpai di Pulau Madura kemudian menyebar ke daerah Jawa Timur lainnya (Edey, 1983). Domba Ekor Gemuk dapat ditemukan di pulau-pulau wilayah timur Indonesia, seperti Lombok, Sumbawa, Kisar dan Rote. Domba jenis ini juga terdapat di bagian selatan Pulau Sulawesi, yaitu di daerah Donggala. Domba Ekor Gemuk yang terdapat di Donggala kemudian disebut dengan domba Donggala. Ciri-ciri kusus domba ekor gemuk adalah berbulu kasar, tidak bertanduk, warna putih dan telinga sedang (Mason, 1980). Domba jantan kadangkadang bertanduk tetapi ukurannya kecil (Edey, 1983). Panjang ekor normal 15-18 tulang vertebrae, berbentuk huruf S dan menyimpan lemak dalam jumlah besar. Bobot badan domba ekor gemuk jantan unggul dapat mencapai 43 kg, betina 40 kg dan rataan bobot potong 24 kg. Domba betina sangat prolifik dengan selang beranak hanya 8 – 9 bulan, umur pertama kali beranak antara 11-17 bulan, dan dapat menghasilkan 2,34 anak sapihan pertahun (Devendra dan McLeroy, 1982). Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment
Length Polymorphism (PCR – RFLP) Metode Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu metode yang dapat digunakan untuk memperbanyak segmen DNA secara in vitro (Ausubel, 1995). Segmen DNA tersebut kemudian dapat diketahui runutan nukleotidanya, salah satunya yaitu dengan menggunakan enzim restriksi. Enzim restriksi dapat memotong DNA secara spesifik dan terbatas pada situs yang dikenalinya (Lewin, 1994). Perbedaan pola pemotongan DNA dari jenis gen yang sama antar beberapa ternak disebut Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). Pada prinsipnya, RFLP merupakan semua mutasi yang menghilangkan atau menciptakan sekuen rekognisi baru bagi enzim restriksi. Penyisipan (insersi), penghilangan (delesi), maupun subtitusi nukleotida yang terjadi pada daerah rekognisi suatu enzim restriksi menyebabkan tidak lagi dikenalinya situs pemotongan enzim restriksi dan terjadinya perbedaan pola pemotongan DNA (Lewin, 1994). Metode RFLP telah diterapkan untuk mendeteksi Quantitative Traits Loci (QTL) pada ternak. Pendeteksian RFLP telah dikembangkan dan digunakan untuk studi linkage pada ternak seperti sapi, ayam dan babi. Pendeteksian RFLP dilakukan pada sekuen DNA yang telah diketahui fungsinya, misalnya gen (penyandi protein), dan juga pada sekuen DNA yang belum jelas fungsinya (Montgomery dan Kinghorn, 1997). Keragaman Gen Calpastatin Gen calpastatin terletak pada kromosom domba nomer 5 (Hediger et al., 1991) sedangkan pada ternak sapi (Bos taurus) terletak pada kromosom nomer 7 (Bishop et al., 1993; Kappes et al., 1997). Gen calpastatin dengan simbol CAST terletak diantara dua penciri apit mikrosatelit MCM527 dan BMS1247 pada posisi lokus 5q15 – q21 antara 96,057-96,136 Mb. Hasil analisis Quantitative Traits Loci (QTL) menunjukkan bahwa gen calpastatin berasosiasi kuat dengan sifat pertumbuhan pada domba silang balik antara DET dengan domba Merino (Margawati, 2005). Palmer et al. (1998) melaporkan bahwa terdapat keragaman gen calpastatin domba Dorset pada bagian ekson 1C, intron 1 dan ekson 1D (no.akses GenBank AF016006 dan AF016007). Hasil pemotongan produk PCR dengan enzim restriksi MspI dan NcoI menghasilkan dua alel, yaitu alel M dan N. Enzim restriksi MspI menghasilkan produk 336 dan 286 bp sedangkan NcoI menghasilkan potongan
produk 374 dan 248 bp. Beberapa penelitian serupa juga telah dilakukan pada ternak sapi. Lonergan et al. (1995) menemukan keragaman DNA gen bovine calpastatin pada lokus BamHI dan EcoRI. Chung et al. (1999) menemukan keragaman gen calpastatin dengan metode PCR-SSCP. Primer yang didesain dari domain I cDNA bovine calpastatin (nomor akses GenBank : L14450), berhasil mengamplifikasi lokus CAST1 sepanjang 500 pb dan menghasilkan dua alel, yaitu alel A dan B. Keragaman gen calpastatin tersebut terkait erat dengan sifat pertumbuhan sapi Angus jantan. Sapi Angus dengan genotipe BB mempunyai bobot badan lebih tinggi dari pada sapi dengan genotipe AB dan AA. Hubungan Antara Sistem Calpain-Calpastatin dengan Sifat Pertumbuhan Pertumbuhan adalah peningkatan ukuran tubuh dan perubahan komposisi tubuh seiring dengan semakin bertambahnya umur anak domba. Sifat pertumbuhan pada anak domba dipengaruhi oleh banyak faktor. Beberapa diantaranya yang adalah tingkat pemberian pakan, genotip, jenis kelamin, kesehatan dan manajemen pemeliharaan (Gatenby, 1991). Pada tingkat sel pertumbuhan hewan ternak dapat didefinisikan sebagai hyperplasia yaitu pertambahan jumlah sel melalui proses mitosis, dan hypertropi yaitu bertambahnya ukuran atau volume sel-sel otot (Hossner, 2005). Menurut Chung et al. (1999), kejadian hypertropi ini erat kaitanya dengan sistem calpain-calpastatin yang terdapat dalam jaringan tubuh. Calpain merupakan sebuah enzim proteolytic terkait dengan ion kalsium (Ca2+), yang ada dalam dua bentuk, yaitu μ-calpain dan m-calpain. μ-calpain merupakan calpain yang memerlukan ion Ca2+ dalam konsentrasi rendah, sedangkan m-calpain merupakan calpain yang memerlukan ion Ca2+ dalam konsentrasi tinggi. Calpain berfungsi untuk mendegradasi protein sel-sel otot (myofibril) di dalam jaringan otot (Goll et al., 1992). Selanjutnya dinyatakan oleh Killefer dan Koohmaraie (1993) bahwa aktivitas calpain dalam jaringan otot postmortem dapat menyebabkan struktur protein sel otot menjadi lemah. Hal ini berakibat pada kualitas daging yang menjadi lebih empuk. Selain μ-calpain dan m-calpain, dalam sistem calpain juga terdapat calpastatin. Calpastatin ini merupakan inhibitor spesifik terhadap fungsi μ-calpain dan m-calpain. Morgan et al. (1993) melaporkan bahwa
ketika aktivitas degradasi protein pada jaringan otot hewan hidup menurun, maka aktivitas calpastatin meningkat. Aktivitas calpastatin yang tinggi dapat ditemukan pada domba yang mempunyai fenotipe callipyge. Kejadian hipertropi ini disebabkan oleh kandungan DNA otot yang tinggi sehingga dapat meningkatkan kapasitas sintesis protein otot. Kejadian hipertropi terjadi setelah hewan dilahirkan sehingga tidak menyebabkan kesulitan beranak (dystocia). Selain itu hipertropi pada domba callipyge juga disebabkan oleh menurunnya degradasi protein otot sebagai akibat dari meningkatnya aktivitas calpastatin (Koohmaraie et al., 1995).
METODE Lokasi dan Waktu Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Zoologi, Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilakukan selama 6 bulan, yaitu dari bulan Juli - Desember 2006. Materi Sampel Darah Sampel darah yang digunakan adalah sampel darah dalam Etanol 95% koleksi Dr.Ir.Cece Sumantri, MAgr.Sc., Departemen IPTP Fakultas Peternakan IPB. Sampel darah domba yang digunakan berjumlah 288 yang berasal dari Ciomas (29), Jonggol (36), Indramayu (43), UPTD BPPTD Margawati (29) , Madura (43), Donggala (46), Sumbawa (26) dan Rote (36). Domba Ciomas merupakan domba Garut tipe tangkas, sedangkan domba Margawati merupakan domba tipe pedaging. Domba Garut dan Jonggol merupakan Domba Ekor Tipis (DET). Domba Indramayu (domba asal Jawa Timur), Madura, Donggala, Rote dan Sumbawa merupakan bangsa Domba Ekor Gemuk (DEG). Domba yang diambil sampel darahnya mempunyai catatan bobot badan (kg) dan ada tiga kelompok umur yang berbeda, yaitu umur kurang dari 1 tahun, 1-2 tahun dan 3-4 tahun. Primer Primer adalah molekul pendek utas tunggal DNA yang akan menempel pada DNA cetakan pada tempat yang spesifik. Sekuen primer yang digunakan dalam penelitian ini berdasarkan pada Palmer et al. (1998), yaitu primer foward (AF33) 5’ TGGGGCCCAATGACGCCATCGATG 3’ (ekson 1C) dan primer reverse (AF34) 5’ GGTGGAGCAGCACTTCTGATCACC 3’ (ekson 1D). Prosedur Ekstraksi DNA dari Sampel Darah dalam Etanol 95% Sampel darah total yang disimpan dalam etanol 95% disentrifugasi 3500 rpm selama 5 menit. Endapan sel-sel darah yang diperoleh dicuci dengan bufer TE sebanyak dua kali. Sekitar 100 µl sel-sel darah yang telah bebas dari etanol disuspensikan dengan 1 x STE sampai volume mencapai 350 µl. Sel-sel darah
kemudian dilisis dengan 20 µl proteinase K (10 mg/ml) dan 40 µl 10% SDS. Campuran ini dikocok pelan-pelan selama 2 jam pada suhu 55 °C. Pemurnian DNA dilakukan degan metode fenol-kloroform, yaitu dengan menambahkan 1/10 volume 5 M NaCl, 1 x volume larutan fenol dan 1 x volume kloroform : iso amil alkohol (24:1), kemudian dikocok pelan pada suhu ruang selama 2 jam. Fase DNA dipisahkan dari fase fenol dengan sentrifugasi pada kecepatan 7000 rpm selama 5 menit. Molekul DNA diendapkan dengan menambahkan 1/10 x volume 5 M NaCl dan 2 x volume etanol absolut. Endapan DNA yang dihasilkan dicuci dengan 70% etanol kemudian diendapkan lagi pada kecepatan 7000 rpm selama lima menit. Sisa etanol dibuang dan diuapkan dengan menggunakan pompa vakum. DNA kemudian dilarutkan dengan 80 µl 80% bufer TE. Amplifikasi Gen Calpastatin (CAST)dengan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) Volume pereaksi amplifikasi DNA adalah 25 µl yang terdiri dari 10-100 ng DNA, pasangan primer masing-masing 25 pmol, 0.87 unit enzim Taq polymerase dan buffernya (New England BioLabs), 2 mM dNTP, dan 2,5 mM MgCl2. Inkubasi dilakukan pada mesin thermocycler (TaKaRa PCR Thermal Cycler MP4). Kondisi PCR yang digunakan terdiri dari denaturasi awal pada suhu 94 oC selama 4 menit, 30 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 94 oC selama 10 detik, penempelan primer pada suhu 48 oC selama 1 menit, dan tahap pemanjangan pada suhu 72 oC selama 2 menit. Pemanjangan akhir molekul DNA dilakukan pada suhu 72 oC selama 7 menit. Identifikasi Genotipe Gen Calpastatin dengan Metode Restriction Fragment Lenght Polymorphisms (RFLP) Produk PCR kemudian dipotong dengan enzim restriksi MspI (New England BioLabs) yang mengenali situs C|CGG. Kondisi pemotongan mengikuti petunjuk produsen, yaitu 2 µl produk PCR dicampur dengan 1-2 Unit MspI dalam 1 x bufer (New England BioLabs), dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama semalam. Elektroforesis dan Pewarnaan Perak Visualisasi fragmen DNA produk PCR yang telah dipotong dilakukan dengan teknik elektroforesis gel poliakrlamida 6 % yang diikuti dengan pewarnaan perak (Tegelstrom, 1992). Gel dibuat dengan cara mencampurkan 12 ml air destilata; 4 ml
5 x TBE ; 4 ml akrilamida 30 % ; 15 µl TEMED, dan 160 µl APS 10 %. Sebanyak 2 µl produk inkubasi dicampur dengan Loading dye + 6µl (Bromthymol blue 0,01%, Xylene Cyanol 0,01% dan gliserol 50%). Elektroforesis dilakukan pada tegangan konstan 220 mVolt selama 30 menit atau setelah pewarna bromthymol blue mencapai bagian bawah gel. Setelah elektroforesis selesai, gel diambil untuk dilakukan pewarnaan perak. Tapan pewarnaan perak yaitu gel dimasukkan ke dalam larutan CTAB 0,2 gram /200 ml air destilata selama delapan menit sambil digoyang. Kemudian dicuci dengan air destilata selama 2 x 2 menit. Air tersebut di buang dan ditambahkan larutan NH4OH (2,4 ml NH4OH/200 ml air destilata) selama 6 menit sambil digoyang-goyang. Kemudian dilanjutkan dengan larutan perak nitrat (AgNO3) selama 10 menit sambil digoyang-goyang. Kemudian gel dicuci kembali dengan air destilata 2 x 2 menit. Untuk memunculkan pita, gel direndam dalam larutan yang terdiri atas Na2CO3 dan formadehid 378%. Setelah pita muncul larutan asam asetat dituangkan untuk menghentikan aktifitas oksidasi perak oleh formadehid. Pendeteksian Keragaman Gen Calpastatin Setiap pita DNA yang muncul dibandingkan ke marker untuk mengetahui panjangnya. Setiap pita DNA dari setiap sampel diperbandingkan untuk menentukan genotipe pita DNA. Satu posisi migrasi yang sama dianggap sebagai satu tipe atau alel. Analisis Data Keragaman genotipe tiap-tiap individu dapat ditentukan dari pita-pita DNA gen yang ditemukan. Masing-masing sampel dibandingkan berdasarkan ukuran (marker) yang sama dan dihitung frekuansi alelnya. Frekuensi alel dihitung berdasarkan rumus Nei (1987) :
Xi = (2nij + ∑nij)/(2n) Keterangan : Xi = frekuensi alel ke-i nij = jumlah individu yang bergenotipe ii nii = jumlah individu yang bergenotipe ij n = jumlah sampel
Derajat heterozigositas (ĥ) dihitung berdasarkan frekuensi alel pada tiap lokus DNA dengan rumus Nei (1987) :
ĥ = 2n (1 - ∑Xi2)/(2n – 1) Keterangan : Xi = frekuensi alel ĥ
= nilai heterozigositas lokus Analisis hubungan antara genotipe gen calpastatin dengan bobot badan
dilakukan dengan metode General Linear Model (GLM) dengan program SAS 6.12, dengan model sebagai berikut :
Yijkl
= μ + Gi + Uj + Dk + G*Uij + G*Dik + Eijk
Keterangan : Y ijk = respon bobot badan μ
= nilai tengah umum
Gi = pengaruh genotipe ke-i Uj = pengaruh umur ke-j Dk = pengaruh kelompok daerah ke-k G*Uij = pengaruh interaksi antara genotipe dan umur G*Dik = pengaruh interaksi antara genotipe dan daerah asal Eijk = pengaruh galat perlakuan pada pengamatan ke-ijk
HASIL DAN PEMBAHASAN Amplifikasi Gen Calpastatin Metode Polymerase Chain reaction (PCR) digunakan untuk mengamplifikasi gen calpastatin lokus CAST-MspI pada domba lokal. Struktur gen calpastatin domba lokal yang telah teramplifikasi dapat dilihat pada Gambar 1. Primer yang digunakan berhasil mengamplifikasi ruas gen calpastatin sebesar 622 pb (Gambar 2). Suhu penempelan primer dalam penelitian ini adalah 48°C. Kondisi ini berbeda dengan suhu penempelan primer yang disarankan oleh Palmer et al. (1998) yaitu 62°C.
GenBank : OAU66320 UTR
GenBank : OAU66320
Ex. 1C
intron 1
Ex. 1D
UTR
3’
5’ 1
243
951 / 1
61
534
611/ 1089
2 416
2604
GenBank : AF016006
Gambar 1. Struktur gen calpastatin domba tctacctaca tagaggaact gggtaaaaga gaagtcacac ttcctccaaa atatagggaa cttttgaata aagaagaagg gatcgcaggg cctcctccag AF 33
actcctcgaa gacttcacct ggtattgttt tttaagacaa tcattgctgt ctagttgcga ggggctctgg cacaggctca cttccctggc cttaaccact ctggttctta ttcttttgta cagtcagctg
acccctgggg gcagttcccc ttaatgcact caactttttt gttcgggctt tgtgcagcct gtgcacaggc gtggtcgtgg cagggagcga ggccaccagg ccgtctggtt tttcattttt gggtgatcag
cccaatgacg tacagctgat cagggaaact ttaaacttta tctctagttg tctgcaggtg ttcagttgtt ctcacaggct acccgtgtcc gaagccccaa aatacatttc cagaaatcta aagtgctgct
ccatcgatgc gcaaagaaaa tgttagaaac tttttgactt gggcaagcga gcttctcttg gtgacttgag tactccacgg cctgcgttgc gatgccaagg cttcatctgc cagaagaggc ccacccaaag
cttgtcatca ctgagaaaga tacctcccac cgctgggtct gggctattct ttgcagagcc agctctagag catgtgggat aaggcggcct ctttttactt cagtcaaacc tttaaaagct agaaaagaag
AF 34
aaaagtggaa gaggatacca tgactgagca agccctggag gccctgtctg cctccctggg cacccggaag ccaaggccag agctcgaccc cagctccatt
Gambar 2. Sekuen nukleotida gen calpastatin lokus CAST-MspI, AF33 dan AF34 masing-masing merupakan primer foward dan primer reverse ( Sumber : www. ncbi.nlm.nih.gov)
Persentase keberhasilan primer dalam mengamplifikasi gen calpastatin lokus CAST-MspI dalam penelitian ini hanya sekitar 70%. Sebanyak 201 sampel berhasil teramplifikasi dari total 288 sampel. Menurut Palumbi (1996) keberhasilan dalam
mengamplifikasi DNA tergantung pada interaksi komponen campuran PCR. Al-Soud dan Radstrom (2001) menyatakan bahwa keberhasilan amplifikasi juga dipengaruhi oleh adanya haemoglobin yang dapat menghambat kerja enzim taq polymerase. Dalam hal ini, diduga bahwa koleksi darah utuh dalam etanol yang sebelumnya tanpa dilakukan pemisahan sel-sel darah memungkinkan kontaminasi haemoglobin dalam sampel DNA (Prasetyo, 2005). Pendeteksian Keragaman Gen Calpastatin dengan RFLP Metode Restriction Fragment Length Polymorphisms (RFLP) digunakan untuk mengidentifikasi keragaman gen calpastatin domba lokal. Enzim restriksi yang digunakan yaitu MspI yang mengenali situs pemotongan empat basa C│CGG, yang terletak di daerah intron 1 antara ekson 1C dan 1D. Keragaman gen calpastatin domba disebabkan oleh adanya mutasi titik yang terjadi pada posisi basa ke-261 nomor akses GenBank AF016006. Terjadinya subtitusi basa (transisi) G – A (Gambar 3) menyebabkan situs pemotongan untuk enzim restriksi MspI berubah. Produk PCR gen calpastatin sepanjang 622 pb berhasil dipotong dan menghasilkan dua alel, yaitu alel M dan N. Alel M (AF016006) : -------------TTGCAGAGCC│GGGGCTCTGG-------Alel N (AF016007) : -------------TTGCAGAGCC│AGGGCTCTGG-------Gambar 3. Perbedaan sekuen nukleotida gen calpastatin pada lokus CAST-MspI yang disebabkan karena subtitusi basa G – A . Alel M mempunyai nukleotida G pada posisi basa ke-261, sedangkan alel N mempunyai nukleotida A (Nomor akses GenBank : AF016006 dan AF016007) Sumber : www. ncbi.nlm.nih.gov
Pada lokus CAST-MspI, ternak domba dikatakan mempunyai genotipe MM apabila terdapat dua fragmen (pita) DNA dengan panjang 336 dan 286 pb. Genotipe MN ditunjukkan dengan tiga fragment DNA yaitu 622, 336 dan 286 pb. Genotipe NN ditunjukkan dengan terdapatnya satu fragmen DNA yaitu 622 pb (Gambar 4). Ternak domba dengan genotipe homosigot (MM atau NN) berarti bahwa kedua tetua masing-masing menyumbangkan gen (alel) yang sama. Domba dengan genotipe heterosigot (MN) merupakan kombinasi gen yang berbeda dari kedua tetuanya. Dalam penelitian ini, dari total sampel 201 domba yang berasal dari delapan daerah tidak ditemukan ternak domba dengan genotipe MM.
Pada penelitian lain dilaporkan adanya keragaman gen calpastatin lokus yang sama yang diidentifikasi dengan metode Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphisms (PCR-SSCP) (Palmer et al., 1999b). Identifikasi dengan metode PCR-SSCP pada gen calpastatin menghasilkan tiga jenis alel yaitu alel A, B, dan C. Berdasarkan referensi nomor akses GenBank AF016006, alel M pada penelitian ini sama dengan alel A. Nomor akses GenBank AF016007 menunjukkan bahwa alel N sama dengan B. Alel C yang ditunjukkan dengan nomor akses GenBank AF016008 tidak dapat teridentifikasi dengan metode PCR-RFLP pada penelitian ini.
622
336 286
Gambar 4. Pola pita gen calpastatin domba dalam gel poliakrilamid 6%. MN dan NN = Genotipe. Genotipe MN ditunjukkan dengan adanya tiga pita dengan ukuran 622, 336, dan 286 pb. Genotipe NN ditunjukkan dengan satu pita 622 pb. Huruf A = marker.
Identifikasi keragaman gen calpastatin juga telah dilakukan dengan metode PCR-SSCP. Palmer et al. (1999b) melaporkan adanya tiga jenis alel yaitu alel A, B dan C dengan tiga genotipe yaitu AA, AB dan AC. Frekuensi alel A, B dan C masing-masing 77, 16 dan 6% sedangkan frekuensi genotipe AA, AB dan AC masing-masing 55, 32 dan 13%. Palmer et al. (1999a) melaporkan adanya tiga genotipe pada Sapi Angus yaitu AA, AB dan BB untuk lokus CAST1 dan CAST5. Sedangkan untuk lokus CAST10 terdapat genotipe AA, BB, CC, AB, AC dan BC. Kurly et al. (2003) telah melaporkan adanya keragaman gen calpastatin pada ternak babi Stambeek (dengan metode PCR-RFLP) dengan menggunakan enzim restriksi HinfI, MspI dan RsaI.
Keragaman Genetik Gen Calpastatin Domba Lokal Nei dan Kumar (2000) menyatakan bahwa keragaman genetik terjadi apabila terdapat dua alel atau lebih dalam suatu populasi (biasanya lebih dari 1%). Menurut Nei (1987), keragaman genetik dapat diukur secara akurat dengan Nilai heterosigositas (ĥ). Heterosigositas disebut juga sebagai keragaman genetik. Nilai Heterosigositas dipengaruhi oleh jumlah sampel, jumlah alel dan frekuensi alel. Frekuensi genotipe, frekuensi alel dan nilai heterosigositas gen calpastatin domba lokal dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1. Nilai Frekuensi Genotipe, Frekuensi Alel dan Nilai Heterosigositas (ĥ) Lokus CAST-MspI Domba Lokal Indonesia Daerah
Jumlah sampel (n)
Ciomas (DET)
12
Jonggol (DET)
22
Margawati (DET)
29
Indramayu (DEG)
36
Donggala (DEG)
41
Madura (DEG)
28
Sumbawa (DEG)
13
Rote (DEG)
20
Genotipe
frekuensi genotipe
MM MN NN MM MN NN MM MN NN MM MN NN MM MN NN MM MN NN MM MN NN MM MN NN
7 (0,58) 5 (0,42) 7 (0,32) 15 (0,68) 14 (0,48) 15 (0,52) 9 (0,25) 27 (0,75) 10 (0,24) 31 (0,76) 2 (0,07) 26 (0,93) 1 (0,08) 12(0,92) 20 (1,00)
Frekuensi Alel
Heterosigositas (ĥ)
M = 0,29 N = 0,71
0,43
M = 0,16 N = 0,84
0,28
M = 0,24 N = 0,76
0,37
M = 0,13 N = 0, 87
0,23
M = 0,12 N= 0,88
0,21
M = 0,04 N = 0,96
0,08
M = 0,04 N = 0,96
0,08
M = 0,00 N = 1,00
0,00
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa gen calpastatin lokus CAST-MspI bersifat polimorfik (beragam) yaitu pada populasi domba Ciomas, Jonggol, Margawati, Indramayu, Madura, Donggala dan Sumbawa. Gen CAST-MspI pada populasi domba Rote bersifat monomorfik (seragam). Polimorfisme pada gen
calpastatin juga telah dilaporkan pada berbagai ternak meliputi domba Dorset Down, domba Hoggets, Dorset Down x Coopworth sheep, domba Kurdi, domba Corridale, domba Karakul, serta pada sapi Angus dan babi (Chung et al.,1999; Palmer et al., 1999a; Nassiry, 2005; Shahroudi et al., 2006). Frekuensi alel adalah frekuensi relatif dari suatu alel dalam populasi atau jumlah suatu alel terhadap jumlah total alel yang terdapat dalam suatu populasi (Nei dan Kumar, 2000). Populasi domba lokal di Indonesia mempunyai frekuensi alel N yang lebih tinggi dibandingkan alel M pada semua subpopulasi. Hasil penelitian ini berlawanan dengan beberapa penelitian sebelumnya yang dilakukan terhadap populasi domba di luar negeri. Palmer et al.(1999b) melaporkan bahwa genotipe calpastatin pada domba Corridale yaitu MM, MN dan NN, dengan frekuensi alel untuk alel M dan N masing-masing 79 dan 21%. Hasil yang sama juga diperoleh Shahroudi et al.(2006) yang melakukan penelitian serupa pada domba Karakul di Iran. Nassiry (2005) menemukan frekuensi alel sebesar 88% untuk alel M dan 12% untuk alel N dan frekuensi genotipe MM, MN dan NN masing-masing 76, 24 dan 0%, serta nilai heterosigositas 36% pada populasi domba Kurdi Iran. Keragaman Genetik Domba Ekor Tipis (DET) Gen calpastatin pada populasi DET bersifat polimorfik pada semua daerah. Frekuensi genotipe MN dan NN untuk domba Ciomas yaitu 58 dan 42%, dengan nilai heterosigositas 43%. Frekuensi Genotipe MN dan NN domba Margawati yaitu 48 dan 52%, dengan nilai heterosigositas 37%. Frekuensi genotipe MN dan NN untuk domba Jonggol yaitu masing-masing 32 dan 68% dengan frekuensi alel M 16% dan nilai heterosigositas 28%. Frekuensi alel M terbesar terdapat pada populasi domba Ciomas dan domba Margawati masing-masing sebesar 29 dan 24%. Populasi domba dari kedua daerah ini merupakan domba Garut. Domba Ciomas dan Margawati mempunyai nilai heterosigositas yang berbeda, hal ini kemungkinan disebabkan karena perbedaan sejarah seleksi yang dilakukan terhadap kedua jenis domba tersebut. Domba Margawati merupakan domba Garut tipe pedaging, sedangkan domba Ciomas merupakan domba Garut tipe tangkas. Secara umum nilai heterosigositas DET lebih tinggi dibandingkan dengan nilai heterosigositas DEG. Secara umum, populasi domba di bagian barat wilayah Indonesia mempunyai frekuensi alel M yang lebih tinggi dibandingkan dengan populasi domba di bagian
timur. Frekuensi genotipe domba Ciomas dan Margawati mempunyai frekuensi genotipe MN yang tinggi masing-masing 58 dan 48% dibandingkan dengan dombadomba dari daerah lain. Elyasi et al. (2005) melaporkan hasil yang hampir sama yaitu frekuensi genotipe MN yang tinggi pada domba Arkhamerino (47,62%) dan domba persilangan Ghezel x Arkhamerino (46,67%). Hal ini kemungkinan disebabkan terdapatnya darah domba Merino baik pada domba Ciomas, domba Garut Margawati, domba Arkhamerino, dan domba Persilangan Ghezel x Arkhamerino. Keragaman Genetik Domba Ekor Gemuk (DEG) Pada umumnya populasi DEG mempunyai frekuensi alel M yang rendah. Frekuensi alel M untuk populasi bangsa domba ekor gemuk (DEG) bervariasi antar subpopulasi. Bangsa DEG yang terletak dibagian timur wilayah Indonesia cenderung mempunyai frekuensi alel M yang lebih kecil. Frekuensi genotipe MN dan NN untuk domba Indramayu, Donggala, Madura dan Sumbawa secara berurutan yaitu ; 25 dan 75% ; 24 dan 76% ; 7 dan 93%, serta 8 dan 92%. Frekuensi alel M pada domba Madura dan Sumbawa mempunyai nilai yang sama kecilnya yaitu 4%. Frekuensi alel M pada domba Indramayu dan Donggala masing-masing sebesar 13 dan 12%. Lebih tingginya frekuensi alel M pada domba Indramayu kemungkinan disebabkan telah adanya usaha seleksi untuk sifat pertumbuhan. Domba Donggala kemungkinan telah mengalami persilangan dengan domba lokal sehingga frekuensi alel M relatif lebih tinggi dibandingkan dengan domba ekor gemuk lainnya yaitu domba Madura dan Sumbawa. Berbeda dengan bangsa DEG lainnya, gen calpastatin domba Rote bersifat monomorfik. Nilai Heterosigositas tertinggi pada bangsa DEG ditemukan pada populasi domba Indramayu yaitu 23% dan terendah pada populasi domba Rote yaitu 0%. Nilai heterosigositas untuk populasi domba Donggala yaitu 21%, sedangkan untuk populasi domba Sumbawa dan Madura mempunyai nilai heterosigositas yang sama yaitu 8%. Hubungan Antara keragaman Gen Calpastatin dengan Bobot Badan Domba Data genotipe yang digunakan untuk analisis hubungan antara genotipe dengan bobot badan hanya 99 yang terdiri dari 45 data genotipe domba jantan dan 54 data genotipe domba betina. Data genotipe tersebut berasal dari Ciomas, Jonggol, Margawati dan Indramayu. Data genotipe domba Donggala tidak digunakan untuk
analisis hubungan antara genotipe dengan bobot badan karena faktor lingkungan pemeliharaan yang masih beragam. Data genotipe domba dari daerah Madura, Sumbawa dan Rote tidak memungkinkan untuk dilakukan analisis hubungan dengan bobot badan. Hal ini disebabkan karena tingkat polimorfisme genotipe gen calpastatin dari ketiga daerah tersebut sangat rendah. Hasil analisis ragam (Lampiran 1 dan 2) menunjukkan bahwa genotipe gen calpastatin berpengaruh nyata terhadap bobot badan domba jantan (P=0,017) tetapi tidak berpengaruh nyata terhadap bobot badan domba betina (P=0,847). Hasil Uji lanjut menunjukkan bahwa rataan bobot badan domba jantan dengan genotipe MN lebih besar dibandingkan dengan genotipe NN (Tabel 2). Berdasarkan hasil analisis tersebut, alel M kemungkinan terkait dengan sifat bobot badan yang lebih unggul. Rendahnya frekuensi alel M dan tidak terdapatnya genotipe MM kemungkinan sebagai akibat dari seleksi negatif terhadap sifat bobot badan unggul yang terjadi pada populasi domba lokal di Indonesia. Tabel 2. Rataan Bobot Badan Domba ( X ) dan Simpangan Baku Rataan (SE) antara Genotipe MN dan NN Genotipe Jumlah sampel X + SE (ekor) (kg) MN 15 43,4 + 4,0a NN
30
35,1 + 2,9b
Keterangan : Superskrip (a,b) yang berbeda menyatakan berbeda nyata (P<0,05)
Penelitian lain menunjukkan bahwa genotipe gen calpastatin terkait dengan sifat pertumbuhan. Nassiry et al. (2005) melaporkan adanya hubungan antara genotipe gen calpastatin domba Kurdi Iran (metode PCR-SSCP) dengan sifat pertumbuhan. Genotipe AB terkait dengan pertambahan bobot badan domba harian prasapih dan pertambahan bobot badan harian dari umur 9 bulan sampai umur 1 tahun (AB>AA>AC). Hasil yang sama juga dilaporkan oleh Tahmoorespour (2005) yang melaporkan bahwa genotipe AB>AA>AC terkait dengan pertambahan bobot badan harian prasapih pada domba Baluchi. Berbeda dengan Palmer et al.(1999b) yang melaporkan bahwa domba dengan genotipe AC memiliki keunggulan dalam sifat produksi dibandingkan dengan genotipe AA. Domba dengan genotipe AC memiliki bobot badan hidup lebih besar 12-17%, memiliki bobot karkas yang lebih besar 15-18%, tetapi lebih rendah tingkat keempukan dagingnya 4-12%. Pada daerah
amplifikasi lain, Chung et al. (2001) menyatakan bahwa sapi dengan genotipe BB mempunyai bobot badan yang lebih tinggi dibandingkan dengan genotipe AB dan AA. Penelitian ini merupakan yang pertama dilakukan untuk mengetahui keragaman gen calpastatin pada populasi domba lokal di Indonesia. Informasi yang tersedia masih sangat sedikit untuk dapat dijadikan sebagai perbandingan. Hasil penelitian ini memberikan informasi bahwa gen calpastatin bersifat polimorfik dan dapat digunakan untuk studi keragaman populasi domba lokal di Indonesia. Selain itu, informasi keragaman ini dapat digunakan dalam penelitian berikutnya untuk menganalisis hubungan antara genotipe gen calpastatin dengan sifat pertumbuhan dan keempukan daging domba lokal. Hasil analisis ragam dalam penelitian ini menunjukkan bahwa terdapat hubungan antara genotipe gen calpastatin dengan bobot badan. Seleksi terhadap bobot badan dapat dilakukan terhadap ternak yang mempunyai alel M. Namun demikian, perlu dilakukan penelitian lain dengan materi ternak yang lebih banyak dan lebih seragam baik dari faktor lingkungan maupun umur, untuk mengetahui hubungan antara gen calpastatin dengan parameter sifat pertumbuhan lainnya serta dengan kualitas daging.
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Gen calpastatin lokus CAST-MspI pada populasi domba lokal di Indonesia bersifat polimorfik (beragam), kecuali pada populasi domba Rote. Identifikasi keragaman
gen
calpastatin
dengan
teknik
Restriction
Fragment
Lenght
Polymorphisms (RFLP) menghasilkan dua alel yaitu M dan N, serta dua genotipe yaitu MN dan NN. Frekuensi alel M tertinggi ditemukan pada populasi Domba Garut Ciomas (29%) dan terendah pada populasi Domba Ekor Gemuk di Sumbawa dan Madura masing-masing 4%. Frekuensi alel M untuk domba Margawati, Jonggol, Indramayu, dan Donggala secara berturut-turut yaitu 24, 16, 13 dan 12%. Nilai heterosigositas bervariasi antara subpopulasi dan berkisar antara 8% pada populasi domba Sumbawa dan Madura, sampai 43% pada populasi domba Garut Ciomas. Nilai heterosigositas domba Margawati, Jonggol, Indramayu, dan Donggala secara berturut-turut yaitu 37, 28, 23 dan 21%. Genotipe gen calpastatin dalam penelitian ini berhubungan dengan bobot badan domba jantan (P=0,017) tetapi tidak berhubungan dengan bobot badan domba betina (P=0,847). Domba jantan dengan genotipe MN mempunyai rataan bobot badan lebih tinggi dibandingkan dengan genotipe NN. Saran Seleksi domba terhadap bobot badan unggul dapat dilakukan terhadap domba yang mempunyai alel M pada gen calpastatin. Namun demikian, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk melakukan analisis hubungan antara gen calpastatin dengan parameter sifat pertumbuhan lainnya serta dengan kualitas keempukan daging, dengan menggunakan domba dalam jumlah yang lebih banyak dan lebih seragam dalam hal faktor lingkungan dan umur. Penelitian lanjutan tersebut sebaiknya menggunakan populasi domba dengan keragaman gen calpastatin yang tinggi yaitu domba Garut, domba Jonggol, domba Indramayu, dan domba Donggala.
UCAPAN TERIMA KASIH Alhamdulillahirabbilal’alamin, puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulisan skripsi ini dapat terselesaikan. Rasa hormat dan bangga, serta ucapan terimakasih yang sebenarnya tidak cukup hanya dengan kata-kata, penulis sampaikan kepada Bapak dan Ibu (Almh) yang telah berjuang untuk menyekolahkan anak-anaknya hingga pendidikan tinggi, dan atas segala do’a, nasehat, bimbingan, motifasi, serta dukungan baik moril maupun materil. Penulis mengucapkan rasa terimakasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Ir. Cece Sumantri, MAgr.Sc. dan Dr. Ir. Achmad Farajallah, MSi selaku pembimbing utama dan anggota, atas segala bimbingan, perhatian, saran, dan arahan, serta atas materi penelitian yang telah diberikan. Rasa terimakasih penulis sampaikan kepada Dr. Ir. Supraptini Mansjoer dan Dr. Ir. Asep Sudarman, MRur.Sc. selaku dosen penguji yang telah memberikan saran dan masukan dalam penulisan skripsi ini. Rasa terimakasih juga penulis sampaikan kepada Ir. Rukmiasih, Msi selaku pembimbing akademik atas segala perhatian dan bimbingannya selama penulis menjalani studi di IPB. Ucapan terimakasih tak lupa penulis sampaikan kepada Dr. Ir. Bambang Suryobroto sebagai Kepala Bagian Zoologi atas izin dan kesempatannya melakukan penelitian di Bagian Zoologi FMIPA, IPB. Rasa terimaksih penulis sampaikan kepada Pak Adi dan rekan-rekan di Lab. Zoologi : Ogi, Astri, Wildan, Lusi, Nico, Ruth, Mbak Ani, Mbak Anifa, Mbak Zul, dan Indra atas kebersamaanya, serta kepada seluruh kelurga besar zoologi atas suasana kekeluargaannya. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Mas Rizal yang telah memberikan arahan dan bimbingan selama penulis tinggal di Graha Ar-Rahman. Terakhir, kepada teman-teman TPT 40 yang tidak dapat disebutkan satu persatu penulis ucapkan terimakasih atas semangat persahabatannya.
Bogor, Mei 2007 Penulis
DAFTAR PUSTAKA Al-Soud, W.A dan P. Radstrom. 2001. Purification and characterization of PCR inhibitory components in bloods cells. J. Clin. Microbiol. : 485-493 Ausubel. 1995. Short Protocol in Molecular Biology. 3rd edition. New York Bishop, M.D., M. Koohmaraie, J.Killefer, and S. Kappes.1993. Restriction fragment length polymorphisms of the bovine calpastatin gene. J. Anim. Sci. 71:2277. Blakely, J. dan D.H. Bade. 1991. Ilmu Peternakan Edisi ke-4. Terjemahan. Gadjah Mada University Press, Yogyakarta. Chung, H.Y., M.E Davis, H.C. Hines, D.M. Wulf. 1999. Effect of the calpain proteolysis and calpain genotype on meat tenderness of Angus bulls. J. Anim. Sci. 77: 31-38 Delgado, E.F., G.H. Geesink, J.A. Marchello, D.E. Goll, and M. Koohmaraie. 2001. The calpain system in three muscle of normal and callipyge sheep. J. Anim. Sci. 79:398-412 Devendra, C dan G.B. McLeroy. 1982. Goat and Sheep Production in The Tropics. Longman Group Limited, London. DJBPP. 2005. Buku Statistik Peternakan. Departemen Pertanian RI. Doho, S.R. 1994. Parameter fenotipik beberapa sifat kualitatif dan kuantitatif pada Domba Ekor Gemuk. Thesis. Fakultas Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor Diwyanto, K. 1982. pengamatan fenotip domba priangan serta hubungan antara beberapa ukuran tubuh dengan bobot badan. Tesis. Fakultas Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor Edey, T.N. 1983. Tropical Sheep and Goat Production. Australian Universities. International Development Program (AUIDP), Canberra, Australia. Elyasi-zaringhabaee, G., J. Shodja, M.R. Nassiry, O. Pirahary, and A. Javanmard. 2005. Determination of ovine calpastatin gene polymorphisms using PCRRFLP. In: Sharoudi, F.E., M.R.Nassiry, R.Valizadh, A.H.Moussavi, M.T. Pour, and H. Ghiasi (Editor). Genetic polymorphisms at MTNR1A, CAST, and CAPN loci in Iranian Karakul Sheep. Iranian J. Biotechnol. 4:117-122 Falconer, D.S., and T.F.C Mackay. 1996. Introduction to Quantitative Genetics. 4th edition Longman Group Ltd. Essex, England. Gatenby, R.M. 1991. Sheep. Macmilalan Education Ltd. London Goll, D.E., V.F. Thompson, R.G. Taylor, and J. A. Christiansen. 1992. Role of the calpain system in muscle growth. Biochimie. 74:225-237. Hediger, R., H. A. Ansari, and G. F. Stranzinger. 1991. Chromosome banding and gene localizations support extensive conservation of chromosome structure between cattle and sheep. Cytogenet. Cell Genet. 57:127.
Hossner, K.L. 2005. Hormonal Regulation of http://www.cabi-publishing.org [8 Juni 2006]
Farm
Animal
Growth.
Kappes, S.M., J.W. Keele, R.T. Stone, T.S.Sonstegard, T.P.L. Smith, R.A. Mcgraw, N.L.Lopezcorrales, and C.W.Beattie. 1997. A second-generation linkage map of the bovine genome. Genome Res. 7:235. Killefer, J., and M. Koohmaraie. 1994. Bovine skeletal muscle calpastatin : clonning, squence analysis, and stady-state mRNA expression. J. Anim. Sci. 72 : 606 Koohmaraie, M., S.D. Shackelford, T.L. Wheeler, S.M. Lonergan, and M.E. Doumit. 1995. A muscle hypertrophy condition in lamb (callipyge): characterization of effects on muscle growth and meat quality traits. J. Anim. Sci. 73:3596–3607. Kurly, J., W. Kapelanski, M. Pierzchala, S. Grajewska, and M. Bocian. 2003. Preliminary observation on the effects of calpastatin gene (CAST) polymorphisms in carcass traits in pigs. Anim.Sci.Paper and report. 2:87-95 Lewin,B. 1994. Genes V. Oxford University Press. New York Lonergan, S.M., C.W. Ernst, M.D. Bishop, C.R. Calkins, and M. Koohmaraie. 1995. Relationship of restriction fragment length polymorphisms at the bovine calpaststin locus to calpastatin activity and meat tenderness. J. Anim. Sci. 73:3608-3612 Margawati, E.T. 2005. Pemetaan quantitative traits loci (QTL) sifat pertumbuhan pada populasi domba silang balik ekor tipis dan merino. Disertasi. Fakultas Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor Mason, I.L. 1980. Prolific Tropical Sheep. Food and Agriculture Organization of The United nation, Roma Montgomery G.W and Kinghorn. 1997. Recent developments in gene mapping and progress towards marker-assisted selection in sheep. Aust. J. Agric. Res. 48:729-741. Morgan, J.B., T.L.Wheeler, M. Koohmaraie, J. W. Savell, and J. D. Crouse. 1993. Meat tenderness and the calpain proteolytic system in the longissimus muscle of young bulls and steers. J. Anim. Sci. 71:1471. Nassiry, M.R., A. Javadmanesh, M. Nosraty, A. Mohammadi, and A. Javanmard. 2005. Genetics polymorphisms of ovine calpastatin locus in Iranian Kurdi Sheep by PCR-RFLP. Proc. of 3rd Moscow International Congress, Biotechnology. State of art and prospects of development. P:291 Nei, M. 1987. Molecular Evolutionery Genetics. Columbia University Press, new York. Nei, M and S. Kumar. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. Oxford University Press, Inc., New York Palmer,B.R., N. Roberts, J.G.H. Hickford, and R. Bickerstaffe. 1998. Rapid Communication : PCR- RFLP for MspI and NcoI in the ovine calpastatin gene. American Society of Animal Science
Palmer, B.,R. Morton, and J.D. Robert. 1999a. marker assited selection for meat quality and the ovine calpastatin gene. In: Sharoudi, F.E., M.R.Nassiry, R.Valizadh, A.H.Moussavi, M.T. Pour, and H. Ghiasi (Editor). Genetic polymorphisms at MTNR1A, CAST and CAPN loci in Iranian Karakul Sheep. Iranian J. Biotechnol. 4:117-122 Palmer, B.R., N. Robert, and M.P. Kent. 1999b. A candidate gene approach to animal quality traits. In: Sharoudi, F.E., M.R.Nassiry, R.Valizadh, A.H.Moussavi, M.T. Pour, and H. Ghiasi (Editor). Genetic polymorphisms at MTNR1A, CAST and CAPN loci in Iranian Karakul Sheep. Iranian J. Biotechnol. 4:117-122 Palumbi, S.R. 1996. Nucleic acids II: The polymerase chain reaction. In: D.M. Hillis, C. Moritz dan B.K.Mable (Editor). Molecular Systematics. 2nd Edition. Sinauer Associates. Inc., Massachusetts USA Prasetyo, A. 2005. Metode ekstraksi DNA dan identifikasi gen kappa kasein (k-Kasein) pada sapi Friesian Holstein (FH) di peternakan rakyat. Skripsi. Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Bogor Roberts, N., B. Palmer, J.G.H. Hickford, and R. Bickerstaffe. 1996. PCR-SSCP in the ovine calpastatin gene. Anim. Genet. 27:211-222. Sambrok, J., F. Fritsch and T. Miniatis. 1989. Molecular Clooning Laboratory manual. 3rd Edition. Cold Spring Harbor laboratory press, New York Sharoudi, F.E., M.R. Nassiry, R. Valizadh, A.H. Moussavi, M.T. Pour, and H. Ghiasi. 2006. Genetic polymorphisms at MTNR1A, CAST and CAPN loci in Iranian Karakul Sheep. Iranian J. Biotechnol. 4:117-122 Smith T. 2003. Genetic Selection for Tenderness. In: Margawati, E.T (Editor). 2005. Pemetaan quantitative traits loci (QTL) sifat pertumbuhan pada populasi domba silang balik ekor tipis dan merino. Disertasi. Fakultas Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Bogor Sutana, I.K. 1993. Domba Ekor Gemuk di Indonesia: Potensi dan Permasalahannya. Prosiding sarasehan usaha ternak domba dan kambing menyongsong Era PJPT II. 13-14 Desember 1992. Diterbitkan oleh Ikatan Sarjana Peternakan Indonesia (ISPI) Cabang Bogor dan Himpunan Pengusaha Domba dan Kambing Indonesia (HKDI) Cabang Bogor, Bogor. Tahmoorespour, M. 2005. Genetic polymorphism in calpain and calpastatin genes and association with growth traits in Baluchi sheep. In: Sharoudi, F.E., M.R.Nassiry, R.Valizadh, A.H.Moussavi, M.T. Pour, and H. Ghiasi (Editor). Genetic polymorphisms at MTNR1A, CAST and CAPN loci in Iranian Karakul Sheep. Iranian Journal. Biotechnol. 4:117-122 Tegelstrom, H. 1992. Mitochondrial DNA in natural population : An improved routine for screening of genetic variation based on sensitive silver stainning. Electrophoresis. 7:226-229
LAMPIRAN Lampiran 1. Analisis Ragam Respon Genotipe Gen Calpastatin terhadap Bobot Badan Domba Jantan dan Hasil Uji Lanjutan Source
DF
Model Error Total
11 33 44
Sum of Squares 9638.97417793 1749.49826652 11388.47244444
R-Square 0.846380
C.V. 19.24758
Mean Square
F Value
Pr > F
16.53
0.0001
876.27037981 53.01509899
Root MSE 7.28114682
BB Mean 37.82888889
Source
DF
Type III SS
Mean Square
GENOTIPE UMUR ASAL GENOTIPE*UMUR GENOTIPE*ASAL
1 2 3 2 3
337.41173869 4164.24960633 2357.58230317 94.76473578 62.91516723
337.41173869 2082.12480317 785.86076772 47.38236789 20.97172241
F Value
Pr > F
6.36 39.27 14.82 0.89 0.40
0.0166 0.0001 0.0001 0.4188 0.7570
Hasil Uji Duncan : Duncan Grouping
Mean
N
A
43.380
15
MN
B
35.053
30
NN
Keterangan
:
GENOTIPE
Duncan grouping dengan berbeda nyata (P<0,05)
huruf
berbeda
menunjukkan
Lampiran 2. Analisis Ragam Respon Genotipe Gen Calpastatin terhadap Bobot Badan Domba Betina Source
DF
Sum of Squares
Model Error Total
11 41 52
1607.34781413 491.80463870 2099.15245283
Mean Square 146.12252856 11.99523509
F Value
Pr > F
12.18
0.0001
R-Square 0.765713
C.V. 13.44966
Source
DF
GENOTIPE UMUR ASAL GENOTIPE*UMUR GENOTIPE*ASAL
1 2 3 2 3
Root MSE 3.46341379
Type III SS 0.45140803 558.53717608 445.76017475 5.10590251 83.56657193
Mean Square 0.45140803 279.26858804 148.58672492 2.55295125 27.85552398
BB Mean 25.75094340
F Value
Pr > F
0.04 23.28 12.39 0.21 2.32
0.8471 0.0001 0.0001 0.8092 0.0892
