IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN GROWTH HORMONE (GH|EcoRV) PADA AYAM KAMPUNG DI INDONESIA MENGGUNAKAN METODE PCR-RFLP
CANDRA KRISDIANTO
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Keragaman Gen Growth Hormone (GH|EcoRV) pada Ayam Kampung di Indonesia Menggunakan Metode PCR-RFLP adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, September 2016 Candra Krisdianto NIM D14120041
1
ABSTRAK CANDRA KRISDIANTO. Identifikasi Keragaman Gen Growth Hormone (GH|EcoRV) pada Ayam Kampung di Indonesia Menggunakan Metode PCR-RFLP. Dibimbing oleh RINI HERLINA MULYONO dan CECE SUMANTRI. Growth hormone (GH) dikenal sebagai salah satu hormon pengontrol pertumbuhan makhluk hidup termasuk produksi telur, pertumbuhan otot, dan pertumbuhan tulang. Tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi keragaman gen GH yang terdapat pada ayam kampung dengan metode Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP). Keragaman gen GH dianalisa dari 106 ekor ayam kampung yang terdiri dari 49 ekor ayam kampung Ciawi dan 57 ekor ayam kampung Sukabumi, sebagai data pembanding digunakan juga 20 ayam Cobb, 10 Isa Brown, dan 10 ayam kampung x Isa Brown. Gen diamplifikasi dengan suhu annealing 60 oC selama 20 detik dengan panjang sekuen 339 pb yang terletak pada intron 3. Hasil amplifikasi dipotong menggunakan enzim EcoRV dengan suhu 37 oC. Data yang diambil adalah frekuensi genotipe, frekuensi alel, heterozigositas, dan keseimbangan HardyWeinberg. Hasil penelitian menunjukkan alel G lebih besar dari alel A. Berdasarkan hasil dapat disimpulkan bahwa ayam kampung, Cobb, dan Isa Brown bersifat polimorfik sedangkan ayam kampung x Isa Brown bersifat monomorfik. Kata kunci: ayam kampung, gen GH, keragaman, PCR-RFLP
ABSTRACT CANDRA KRISDIANTO. Identification of Polymorphism of Growth Hormone Gene (GH|EcoRV) in Indonesia Native Chicken Using PCR-RFLP Method. Supervised by RINI HERLINA MULYONO and CECE SUMANTRI. Growth hormone (GH) is known as one of the hormones that controlling growth of the living being including egg production, muscle, and bone growth. The objective of this research was to identify polymorphism of GH gene in native chicken using Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) method. Polymorphisms of GH gene were studied from blood samples of 106 kampung chickens consisting 49 chickens from Ciawi and 59 chickens from Sukabumi, for comparative data used samples of 20 Cobb, 10 Isa Brown, and 10 kampung x Isa Brown. Gene was amplified with annealing temperature of 60 oC for 20 seconds resulting 339 pb sequences which located at intron 3. The result of amplification was digested in 37 oC by EcoRV enzyme. The collected data was genotype and allele frequencies, heterozygosity, and HardyWeinberg equilibrium. The result showed that allele G was higher than allele A. Based on the result it can be concluded that kampung, Cobb, and Isa Brown are polymorphic and kampung x Isa Brown are monomophic. Key words: GH gene, native chickens, PCR-RFLP, polymorphism
2
3
IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN GROWTH HORMONE (GH|EcoRV) PADA AYAM KAMPUNG DI INDONESIA MENGGUNAKAN METODE PCR-RFLP
CANDRA KRISDIANTO
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
4
6
7
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Desember 2015 ini ialah ayam lokal, dengan judul Identifikasi Kegaraman Gen Growth Hormone (GH|EcoRV) pada Ayam Kampung di Indonesia Menggunakan Metode PCRRFLP. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Ir Rini H Mulyono, MSi dan Bapak Prof Dr Ir Cece Sumantri, MSc selaku pembimbing; Ibu Dr Ir Sri Darwati, MSi dan Bapak Sigid Prabowo, SPt MSi sebagai dosen penguji sidang; Bapak Dr Asep Gunawan, SPt MSc sebagai dosen pembahas seminar; dan Ibu Zakiah Wulandari, STP MSi sebagai dosen pembimbing akademik. Penghargaan juga penulis sampaikan kepada Shelvi, SSi; Isyana Khoerunissa, SPt; Ahmad Furqon, SPt; dari Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, yang telah membantu selama penelitian berlangsung. Ungkapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada ibunda Rahayu Wijayati, kakak Putra Rahardianto, adik Ragelia Sekar Merah Saraswati atas doa dan kasih sayangnya. Terima kasih juga penulis sampaikan khususnya kepada Tari Oktavia yang selalu mendampingi dan menyemangati; Ade, Ady, Anna, Asri, Audrian, Herdian, Melati, Nurma selaku teman penelitian yang selalu bersama; teman terbaik Kiki Rizqi Januar, Shania Zaradina, Randi Novriadi, Fajar Heirizwan beserta teman-teman Torero IPTP 49 lainnya; Grup Himager, Himadota; Afrizal, Dimas, Arif, Rolando, Naufal dan teman-teman SMA atas segala dukungannya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2016 Candra Krisdianto
8
9
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR PENDAHULUAN Latar Belakang Tujuan Penelitian Ruang Lingkup Penelitian METODE Waktu dan Lokasi Penelitian Alat Bahan Prosedur Analisis Data HASIL DAN PEMBAHASAN Amplifikasi Gen Growth Hormone (GH|EcoRV) Frekuensi Genotipe dan Frekuensi Alel Gen GH|EcoRV Keseimbangan Hardy-Weinberg pada Gen GH|EcoRV Heterozigositas SIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN RIWAYAT HIDUP
vi vi 1 1 1 1 2 2 2 2 3 4 6 6 8 8 9 10 10 12 15
10
DAFTAR TABEL 1 2 3 4
Primer gen GH Genotipe dan panjang produk hasil PCR-RFLP Frekuensi genotipe dan frekuensi alel pada populasi ayam lokal Keseimbangan Hardy-Weinberg gen GH|EcoRV berdasarkan uji chi-square (X2) 5 pendugaan nilai heterozigositas gen GH|EcoRV
2 7 8 9 9
DAFTAR GAMBAR 1 Posisi penempelan primer (garis bawah) pada sekuen GH berdasarkan GenBank dengan kode akses AY461843.1 2 Hasil amplifikasi gen GH|EcoRV pada 16 sampel ayam kampung dengan menggunakan teknik PCR pada gel agarose 1.5% 3 Posisi fragmen gen GH|EcoRV dan titik potong enzim berdasarkan GenBank (nomor akses: AY461843) 4 Visualisasi hasil genotyping gen GH|EcoRV ayam kampung pada gel agarose 2% dengan genotipe AA, GG, dan AG
4 6 7 7
PENDAHULUAN Latar Belakang Ayam merupakan unggas yang digemari masyarakat Indonesia sebagai sumber protein hewani. Konsumsi daging unggas di Indonesia saat ini menempati urutan pertama (65%) diikuti oleh sapi (20%), kambing dan domba (6%), dan daging lainnya (9%) (Aman 2011). Daging ayam tersebut sekitar 77.6% berasal dari ayam ras pedaging dan 16.6% dari ayam kampung (DPKH 2013). Ayam kampung memiliki kelebihan pada daya adaptasi tinggi karena mampu menyesuaikan diri dengan berbagai situasi, kondisi lingkungan dan perubahan iklim serta cuaca setempat. Ayam kampung mempunyai kelemahan dalam hal produktivitas. Faktor penyebab produktivitas rendah adalah lingkungan yang tidak mendukung seperti sistem pemeliharaan dan nutrisi pakan yang kurang. Ayam kampung memiliki potensi untuk ditingkatkan mutu genetiknya melalui seleksi secara kuantitatif dan kualitatif. Penyeleksian dapat dilakukan dengan cara konvensional dan molekuler. Seleksi konvensional dilakukan dengan cara memilih ayam yang mempunyai fenotip produksi tinggi, kemudian dilakukan seleksi molekuler dengan memilih gen ayam yang mempunyai produksi tinggi. Penyeleksian gen-gen yang berkorelasi dengan sifat produksi pada ayam kampung masih dapat dilakukan karena sifat produksi yang masih beragam. Perkembangan ilmu bioteknologi digunakan untuk mencari dan menyeleksi gen tersebut pada ayam lokal. Gen GH atau Growth Hormone dianggap sebagai gen yang paling menentukan performa ayam karena berfungsi dalam pertumbuhan dan metabolisme pada ayam (Vasilatos-Younken et al. 2000). Nie et al. (2005) menyatakan bahwa mutasi pada gen GH juga memberikan pengaruh terhadap pertumbuhan ayam, sifat karkas, produksi telur dan deposisi lemak. Keragaman genetik diperlukan untuk mempertahan kelestarian pada suatu populasi ayam kampung sebagai sumber daya genetik ternak unggal lokal Indonesia. Teknik yang sering dilakukan untuk mengidentifikasi keragaman genetik yaitu metode Polymorphism Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP). Penelitian mengenai keragaman genetik gen GH pada ayam kampung masih jarang dilakukan, sehingga peningkatan mutu kualitas ayam kampung dapat depercepat dengan penyeleksian terhadap gen tersebut. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen Growth Hormone (GH) pada ayam kampung melalui metode Polymerase Chain ReactionRestriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP). Ruang Lingkup Penelitian Penelitian ini mengidentifikasi gen growth hormone intron 3 yang terletak di kromosom 1 pada ayam kampung. Identifikasi keragaman menggunakan enzim restriksi EcoRV dengan metode PCR-RFLP
2
METODE Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian berlangsung dari bulan Desember 2015 sampai Maret 2016. Alat Tahap pengambilan darah menggunakan alat-alat yang terdiri atas tabung ependorf 1.5 mL, spoit, 1 set cool box, dan spidol permanen. Tahap ekstraksi DNA digunakan alat-alat yang terdiri atas centrifuge, tabung eppendorf 1.5 mL beserta rak tabung, 1 unit mikropipet beserta tip, vortex, inkubator, rotating mixer, dan freezer. Analisis PCR-RFLP menggunakan alat-alat yang terdiri atas mesin PCR thermocycler, tabung eppendorf beserta rak tabung, incubator, refrigerator, stirrer, microwave, tray pencetak, 1 unit mikropipet beserta tip, vortex, microsentrifuge (spin down), dan UV transilluminator. Bahan Sampel darah yang digunakan sebagai sumber DNA sebanyak 49 ayam kampung asal Ciawi dan 57 ayam kampung asal Sukabumi, sebagai pembanding digunakan juga 20 ekor ayam Cobb, 10 ekor Isa Brown, dan 10 ekor ayam kampung x Isa Brown. Sampel darah ayam kampung, Isa Brown, dan kampung x Isa Brown merupakan koleksi dari laboratorium genetika dan molekuler ternak, sedangkan sampel darah ayam Cobb diambil langsung dari laboratorium lapang fakultas peternakan Bahan-bahan yang digunakan pada tahapan pengambilan sampel darah terdiri atas alkohol 70%, EDTA dan kapas. Tahap ekstraksi DNA digunakan bahan-bahan yang terdiri atas 1×STE (sodium tris-EDTA), larutan EtOH 96%, air destilasi, NaCl 0.2%, SDS (sodium dodecylsulphate) 10%, proteinase-K (5 mg mL-1), phenol solution, CIAA (chloroform isoamylalcohol), NaCl 5M, dan TE (tris EDTA) 80%. Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen GH di kromosom 1 basa ke-2248 dirancang berdasarkan Primer Designing Tool NCBI sekuen acuan di GenBank (Nomor akses: AY461843). Primer yang dirancang mempunyai urutan sekuen yang ditampilkan pada Tabel 1. Tabel 1 Primer gen GH Gen Target Sekuens Primer Intron F: 5’- ATGTCTCCACAGGAACGCAC -3’ GH 3 R: 5’- GCTCTGTAAGCTGAGCACCAC -3’ Keterangan: F= Forward, R= reverse
Panjang sekuen 339 pb
3
Bahan-bahan yang digunakan pada teknik PCR yaitu sampel DNA, DW (destilation water), Green Master Mix dan pasangan primer forward dan reverse. Primer yang digunakan pada gen GH (F: 5’- ATGTCTCCACAGGAACGCAC-3’; R: 5’-GCTCTGTAAGCTGAGCACCAC-3’). Teknik RFLP menggunakan bahanbahan yang meliputi produk PCR (amplikon), enzim restriksi EcoRV dengan situs potong GA|TATC, buffer R, dan DW. Bahan-bahan yang digunakan dalam elektroforesis terdiri atas amplikon, agarose gel 1.5% dan 2%, 0.5×TBE (tris boratEDTA), etidium bromida (EtBr) 10%, dan marker 100 pb. Prosedur Pengambilan Sampel Darah Sampel darah ayam Cobb diperoleh dengan mengambil darah menggunakan spoit di vena axillaris bagian sayap. Darah diambil pada bagian kulit yang dioles alkohol terlebih dahulu. Darah yang diambil sebanyak 1 mL kemudian dimasukkan ke dalam tabung 1.5 mL dan dicampur dengan serbuk EDTA agar tidak menggumpal. Sampel darah disimpan dalam refrigerator (suhu 4 oC) sebelum diproses lebih lanjut. Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA dilakukan berdasarkan Sambrook et al. (1989) yang dimodifikasi. Darah ayam diambil sebanyak 20 μL dan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL, lalu ditambahkan 1 000 μL NaCl 0.2%, kemudian sampel dihomogenkan menggunakan vortex dan didiamkan selama 5 menit. Sampel selanjutnya disentrifius pada kecepatan 8 000 rpm selama 5 menit dan supernatan yang terbentuk dibuang. Endapan ditambahkan 40 μL SDS 10%, 10 μL proteinaseK (5 mg mL-1) dan 1×STE sampai 400 μL, kemudian diinkubasi pada suhu 55 °C selama 2 jam sambil digoyang secara perlahan dengan menggunakan tilter. Degradasi bahan organik dilakukan dengan menambahkan 400 μL phenol solution, 400 μL CIAA, dan 40 μL NaCl 5M, kemudian digoyang selama 1 jam pada suhu ruang. Molekul DNA dipisahkan dari fenol dengan cara disentrifius pada kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit sehingga terbentuk fase DNA (bening). Fase DNA dipindahkan ke tabung baru untuk ditambahkan 800 μL EtOH absolute 70% dan 40 μL NaCl 5M, kemudian freezing (over night). Molekul DNA disentrifius pada kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit untuk memisahkan EtOH absolute. Supernatan yang mengendap dibuang. Endapan didiamkan hingga kering untuk disuspensikan dalam 100 μL TE 80%. Sampel DNA disimpan dalam freezer sampai akan digunakan. Amplifikasi DNA DNA diamplifikasi dengan teknik PCR. Sampel DNA hasil ekstraksi sebanyak 0.3 μL dimasukkan ke dalam tabung PCR, lalu ditambahkan 14 μL larutan premix. Premix tersusun atas 0.2 μL primer, 6.3 μL DW, 7.5 μL Green Master Mix. Campuran ini diinkubasi dalam thermocycler untuk proses amplifikasi. Proses amplifikasi diawali dengan tahap denaturasi pada suhu 95 oC selama 5 menit. Tahap kedua terdiri dari 30 siklus, masing-masing siklus terdiri dari proses denaturasi pada suhu 95 oC selama 10 detik, annealing primer pada suhu 60 oC
4 selama 20 detik dan ekstensi DNA pada suhu 72 oC selama 30 detik. Tahapan terakhir adalah pemanjangan primer pada suhu 72 oC selama 5 menit. Rekonstruksi struktur perancangan primer gen GH pada Gallus gallus disajikan pada Gambar 1. Forward 2041 2101 2161 2221 2281 2341
gacctgagtg tacaccaaca gggaaggatg ttttatggaa cttttcacac aataaagtcc
catttgggat aaaactccca acgcccagca cagagggtct cctgcatgca taaaaaaaca
gtctccacag ggctgcgttt gaagtcagta ccacgtggta gaaagacacg ggctcgagtc
gaacgcacct tgttactcag agttgtctcc tcagtcccga ggttgggcag tgagtggtgg
atattccgga aaaccatccc cctgggtaaa gaaggagaaa taaatcatat tgctcagctt
ggaccagagg agctcccacg cacagcactg tgccttctta tcccacccta acagagctgc
reverse
Gambar 1 Posisi penempelan primer (garis bawah) pada sekuen GH berdasarkan GenBank dengan kode akses AY461843.1 Elektroforesis Hasil amplifikasi DNA divisualisasi melalui elektroforesis. Amplikon dipisahkan menggunakan elektroforesis agarose gel 1.5%. Gel terbuat dari 0.45 g agarose gel dan 30 mL 0.5×TBE yang dipanaskan dalam microwave pada suhu medium-high selama 3 menit. Homogenisasi dilakukan dengan stirrer, lalu ditambahkan 2.5 μL EtBr 10%. Gel dicetak pada tray pencetak dan dibiarkan hingga mengeras. Amplikon sebanyak 5 μL dipisahkan (running) melalui elektroforesis pada tegangan 100 V selama 35-45 menit yaitu sampai fragmen DNA selesai bermigrasi di dalam gel. Pita-pita (bands) akan tampak dengan bantuan sinar UV sehingga genotyping dilakukan berdasarkan panjang fragmen DNA yang terlihat. Genotyping Genotyping dilakukan dengan teknik RFLP. Sebanyak 4 μL amplikon ditambahkan 0.9 μL DW, 0.7 μL buffer, dan 0.4 μL enzim restriksi. Enzim EcoRV pada pemotongan gen Growth Hormone intron 3 diinkubasi pada suhu 37 °C selama 4 jam. Sebanyak 5 μL DNA hasil pemotongan kemudian dilakukan elektroforesis kembali pada tegangan 100 V selama 35-45 menit pada agarose gel 2%. Sampel DNA hasil elektroforesis kemudian diangkat dan diamati di bawah sinar UV. Fragmen DNA yang muncul dari hasil elektroforesis dibandingkan dengan marker untuk diketahui panjang fragmennya. Posisi DNA yang terbentuk diidentifikasi sebagai alel untuk penentuan genotipe setiap sampel. Analisis Data Frekuensi Alel dan Genotipe Frekuensi alel dihitung menggunakan rumus menurut Nei dan Kumar (2000) sebagai berikut: xi =
(2nii + ∑i≠j nij ) 2N
5 Frekuensi genotipe dihitung dengan rumus sebagai berikut (Nei dan Kumar 2000): xii =
nii N
Keterangan: xi = frekuensi alel ke-i; xii = frekuensi genotipe ke-i; nii = jumlah individu bergenotipe ii; nij = jumlah individu bergenotipe ij; dan N = jumlah total sampel.
Keseimbangan Hardy-Weinberg Keseimbangan Hardy-Weinberg diuji dengan rumus chi-kuadrat (χ2) menurut Nei dan Kumar (2000) yaitu dengan rumus berikut: (O − E)2 χ =∑ E 2
Keterangan: χ2 = chi-kuadrat; O = nilai pengamatan; dan E = nilai harapan. X2 tabel (α;db), jika X2 hitung > X2 tabel = nyata, X2 hitung < X2 tabel = tidak nyata db = 3.84
Derajat Heterozigositas Keragaman genetik dilakukan melalui perhitungan nilai heterozigositas pengamatan (H0) menurut Weir (1996): H0 = ∑ i≠j
N1ij N
Keterangan: H0 = heterozigositas pengamatan; N1ij = jumlah individu heterozigot pada lokus ke-1; dan N = jumlah individu yang dianalisis.
Heterozigositas harapan dihitung menggunakan rumus berdasarkan Nei dan Kumar (2000) yaitu: q
He = 1 − ∑ xi2 i=1
Keterangan: He = heterozigositas harapan; xi = frekuensi harapan; dan q = jumlah alel.
6
HASIL DAN PEMBAHASAN Amplifikasi Gen Growth Hormone (GH|EcoRV) Fragmen gen hormon pertumbuhan (GH|EcoRV) diamplifikasi menggunakan teknik PCR dengan target titik SNP menurut Nie et al. (2005) yaitu pada posisi basa ke-2248 bp yang terletak di intron 3. Amplifikasi gen GH|EcoRV menggunakan mesin Thermal Cycler pada kondisi suhu annealing 60 oC selama 20 detik. Pasangan primer didesain menggunakan Primer Designing Tool (Primer3), berdasarkan informasi urutan DNA gen GH (nomor akses: AY461843). Hasil PCR dari 5 kelompok ayam yang berbeda menunjukkan bahwa gen GH dapat teramplifikasi dengan baik pada semua sampel ayam dengan ukuran pita 339 pb. Menurut Feng et al. (1997) gen GH berfungsi sebagai pengatur penyebaran nutrisi untuk menstimulasi pertumbuhan otot dan menurunkan deposisi lemak. Hasil PCR dari 16 sampel penelitian menunjukkan gen GH teramplifikasi dengan baik seperti yang disajikan pada Gambar 2.
500 pb 339 pb
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16
Gambar 2 Hasil amplifikasi gen GH|EcoRV pada 16 sampel ayam kampung dengan menggunakan teknik PCR pada gel agarose 1.5% Identifikasi keragaman gen GH pada penelitian ini dilakukan dengan metode PCR-RFLP. Teknik PCR-RFLP adalah salah satu metode yang efisien, sederhana dan akurat, teknik ini sudah umum digunakan untuk mendeteksi polimorfisme, evolusi, dan analisis forensik (Ota et al. 1991). Pemotongan fragmen gen GH intron 3 dilakukan menggunakan enzim restriksi EcoRV dengan buffer R. Suhu inkubasi enzim 37 oC selama 4 jam. Enzim ini akan bekerja jika fragmen mempunyai basa dengan urutan GA|TATC yang ternyata enzim tersebut dapat memotong pada urutan basa ke-2248 pada amplikon, hal tersebut bersesuaian dengan Nie et al. (2005) yang melaporkan Single Nucleotide Polymorphisms (SNP) ditemukan antara Guanin (G) dan Adenin (A) pada basa ke-2248 gen GH. Basa G telah bermutasi menjadi basa A sehingga pemotongan amplikon dimarka alel A, sedangkan alel G tidak terpotong (Gambar 3). SNP adalah salah satu bentuk variasi materi genetik pada makhluk hidup. Variasi basa ke-2248 pada gen GH telah dikorelasikan dengan pertambahan bobot badan pada populasi ayam di China, ayam yang mempunyai basa A pada urutan basa ke-2248 mempunyai bobot badan lebih besar. Visualisasi titik potong enzim GH|EcoRV basa ke-2248 disajikan pada Gambar 3.
7
Keterangan
: Alel G mempunyai basa G pada posisi basa ke-2248 Alel A mempunyai basa A pada posisi basa ke-2248
Gambar 3 Posisi fragmen gen GH|EcoRV dan titik potong enzim berdasarkan GenBank (nomor akses: AY461843) Enzim restriksi EcoRV memotong produk PCR 339 pb gen GH Alel A dengan panjang fragmen 148 pb dan 191 pb yang ditunjukkan pada Tabel 2. Tabel 2 Genotipe dan panjang produk hasil PCR-RFLP Lokus Genotipe Panjang Produk (pb) GG 339 GH|EcoRV AA 148, 191 GA 148, 191, 339 Pemotongan terjadi karena enzim restriksi mengenal situs potong GA|TATC. Produk PCR berdasarkan GenBank nomor akses AY461843.1 menunjukkan bahwa pada titik ke-2248 mutasi telah terjadi. Visualisasi setelah pemotongan menggunakan enzim disajikan pada Gambar 4. Kelompok ayam terdeteksi mempunyai 3 genotipe yaitu GG, AG, dan AA. Genotipe GG ditemukan pada 115 ayam, AG pada 27 ayam, AA pada 4 ayam dari keseluruhan sampel darah ayam yang diamati. Berdasarkan hasil penelitian, terdapat mutasi pada basa ke-2248. Nie et al. (2005) menyatakan mutasi pada intron 3 gen GH lebih tinggi daripada gen lain pada ayam leghorn, white recessive rock, dan taihe silkies. Hasil genotyping divisualisasikan pada gel agarose 2% (Gambar 4).
500 pb
339 pb 191 pb 148 pb
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16
Gambar 4 Visualisasi hasil genotyping gen GH|EcoRV ayam kampung pada gel agarose 2% dengan genotipe AA, GG, dan AG
8
Frekuensi Genotipe dan Frekuensi Alel Gen GH|EcoRV Frekuensi genotipe dan alel hasil analisis gen GH yang dilakukan pada sampel darah ayam disajikan pada Tabel 3. Tabel 3 Frekuensi genotipe dan frekuensi alel pada populasi ayam lokal Frekuensi Genotipe Frekuensi Alel Populasi N AA GG AG A G Kampung Ciawi 49 0.06 0.65 0.29 0.20 0.80 Kampung Sukabumi 57 0.00 0.84 0.16 0.08 0.92 Cobb 20 0.05 0.80 0.15 0.12 0.88 Isa Brown 10 0.00 0.90 0.10 0.05 0.95 Kampung x Isa Brown 10 0.00 1.00 0.00 0.00 1.00 Proses PCR-RFLP menghasilkan genotipe 146 sampel ayam yang terdiri atas AA, GG, dan AG masing-masing sebanyak 4, 115, dan 27 ekor ayam. Data menunjukkan bahwa alel G lebih tinggi daripada alel A. Penelitian yang dilakukan Nie et al. (2005) pada populasi ayam di China juga menunjukkan bahwa frekuensi alel G lebih besar dibandingkan alel A dengan nilai sebesar 0.87 untuk alel G dan 0.13 untuk alel A. Mutasi gen GH pada intron 3 berpengaruh langsung pada bobot badan ayam yang dilakukan pada populasi ayam di China, Alel A (Genotipe AA) memiliki pertumbuhan otot lebih besar dibandingkan dengan alel G (Genotipe GG) (Nie et al. 2005). Alel yang terdapat pada ayam kampung adalah polimorfik (beragam) hal yang sama ditunjukkan juga pada ayam Cobb dan ayam Isa Brown. Ayam kampung x Isa Brown mempunyai frekuensi alel yang monomorfik (seragam). Hal tersebut bersesuaian dengan Penelitian Nei et al. (2005) yang menyatakan bahwa tipe Isa Brown adalah tipe ringan, sehingga alel yang ditunjukkan pada kampung x Isa Brown bersifat monomorfik untuk bobot badan rendah dengan genotipe G. Hal yang sama ditemui antar populasi Cobb dan Isa Brown, ayam Isa Brown berbadan ringan sehingga frekuensi alel G lebih tinggi dibandingkan ayam Cobb. Sebaliknya pada ayam kampung, frekuensi Alel A lebih tinggi daripada ayam Cobb yang menggambarkan bahwa ayam kampung relatif berukuran besar sebagai tipe dwiguna, ayam kampung dapat diarahkan ke tipe pedaging dengan memunculkan alel A. Ayam kampung x Isa Brown tidak memiliki alel A karena telah dilakukan seleksi dengan tidak mengawinkan indukan yang mempunyai alel A. Perbedaan persentase alel A pada ayam kampung Ciawi dan Sukabumi dapat dikarenakan oleh sistem pemeliharaan yang berbeda, ayam kampung Ciawi dipelihara secara intensif untuk memperoleh bobot badan tinggi, sedangkan ayam kampung Sukabumi dipelihara secara ekstensif dan tidak difokuskan kearah pedaging. Alel dapat dikatakan polimorfik jika memiliki frekuensi sama atau kurang dari 99% (Allendorf dan Luikart 2006). Keseimbangan Hardy-Weinberg pada Gen GH|EcoRV Analisis keseimbangan Hardy-Weinberg gen GH|EcoRV menggunakan nilai chi-kuadrat (X2). Populasi ayam kampung Ciawi, kampung Sukabumi, Cobb, Isa
9 Brown berada pada keseimbangan Hardy-Weinberg (X2 hitung < X2 tabel), sedangkan ayam kampung x Isa Brown menyimpang dari keseimbangan HardyWeinberg karena hanya memiliki 1 genotipe yang diperlihatkan oleh Tabel 3. Allendorf dan Luikart (2006) mengatakan bahwa Keseimbangan Hardy-Weinberg dapat dilihat dengan melihat hasil dari X2 hitung dan membandingkannya dengan nilai X2 tabel. Derajat bebas diperoleh dari kemungkinan genotipe yang muncul (3) dikurangi dengan jumlah alel yang muncul (2), sehingga nilai X2 tabel dengan derajat bebas (db) 3 - 2 = 1 adalah 3.84. Tabel 4 Keseimbangan Hardy-Weinberg gen GH|EcoRV berdasarkan uji chisquare (X2) Sampel N X2 Hitung X2 Tabel (0.05) Kampung Ciawi 49 0.71 3.84 Kampung Sukabumi 57 0.42 3.84 Cobb 20 2.13 3.84 Isa Brown 10 0.03 3.84 Kampung x Isa Brown 10 3.84 Suatu populasi dikatakan dalam keseimbangan Hardy-Weinberg yaitu jika frekuensi genotipe dan frekuensi alel selalu konstan dari generasi ke generasi. Keseimbangan Hardy-Weinberg digunakan untuk membandingkan frekuensi gen, Weigend dan Romanov (2001) menyebutkan faktor yang mempengaruhi keseimbangan populasi adalah mutasi dan rekombinasi, genetic drift, seleksi, dan migrasi. Heterozigositas Nilai heterozigositas pengamatan (Ho) dan heterozigositas harapan (He) digunakan untuk mengetahui keragaman genetik suatu populasi. Heterozigositas harapan (He) merupakan penduga keragaman genetik populasi hewan ternak (Noor 2010). Nilai heterozigositas dari keempat populasi ayam disajikan pada Tabel 3. Tabel 5 pendugaan nilai heterozigositas gen GH|EcoRV Populasi N Ho He Kampung Ciawi 49 0.29 0.32 Kampung Sukabumi 57 0.16 0.15 Broiler 20 0.15 0.22 Petelur 10 0.10 0.10 Kampung Petelur 10 Nilai heterozigositas pengamatan (Ho) pada 5 populasi ayam lokal berkisar antara 0.1-0.22, sedangkan nilai heterozigositas harapan (He) berkisar 0.1-0.25. Nilai heterozigositas berbeda dikarenakan jumlah populasi dan frekuensi alel yang digunakan pada setiap populasi terdapat perbedaan. Nilai heterozigositas dipengaruhi oleh jumlah sampel, jumlah dan frekuensi alel serta marka genetik yang digunakan (Allendorf dan Luikart 2006). Nilai heterozigositas tertinggi ditunjukkan oleh ayam kampung, namun nilai heterozigositas rata-rata populasi ayam lokal yang diteliti termasuk rendah dikarenakan ayam merupakan hasil
10 seleksi ke arah petelur. Heterozigositas pada ternak sangat menguntungkan, hal ini sesuai dengan penelitian Briles et al. (1957) yaitu ayam yang mempunyai gen golongan darah B heterozigot mempunyai sifat produksi telur, daya hidup, dan daya tetas yang baik. Nei (1987) menyatakan bahwa nilai heterozigositas berkisar antara 0-1, apabila nilai heterozigositas mendekati 0 maka diantara populasi yang diukur memiliki hubungan genetik yang sangat dekat dan apabila nilai heterozigositas mendekati 1 maka diantara populasi yang diukur memiliki hubungan genetik yang sangat jauh.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Populasi ayam kampung, Cobb, dan Isa Brown bersifat polimorfik, sedangkan ayam kampung x Isa Brown bersifat monomorfik. Keragaman tertinggi ditunjukkan oleh ayam kampung, nilai heterozigositas ayam lokal termasuk dalam kategori rendah. Saran Perlu dilakukan sekuensing pada setiap tipe genotipe untuk meneliti lebih lanjut tentang keragaman gen GH pada ayam lokal. Perlu dilakukan asosiasi antara keragaman gen GH dengan pertumbuhan bobot badan dan produksi telur. Keragaman genetik perlu ditingkatkan melalui kebijakan manajemen perkawinan seperti penyediaan pejantan dari luar populasi dan melakukan seleksi melalui uji performa serta pergiliran pejantan untuk menghindari silang dalam.
DAFTAR PUSTAKA Allendorf FW, Luikart G. 2006. Conservation and the Genetics of Populations. Oxford (UK): Blackwell Publishing Aman Y. 2011. Ayam Kampung Unggul. Jakarta (ID): Penebar Swadaya. Bingxue Y, Xuemei D, Jing F, Xiaoxiang H, Changxin W, Ning L. 2003. Single nucleotide polymorphism analysis in chicken growth hormone gene and its associations with growth and carcass traits. Chinese Sci Bull. 48(15):15611564.doi: 10.1360/02wc0379 Briles WE, Allen CP, Millen TW. 1957. The B blood group system of chickens. I. Heterozygosity in closed populations. Genetics 42(5): 631-648. [DPKH] Direktorat Jenderal Peternakan dan Kesehatan Hewan. 2013. Statistik Peternakan dan Kesehatan Hewan. Jakarta (ID): Kementerian Pertanian RI. Falconer DS, Mackay TFC. 1996. Introduction to Quantitative Genetic. Ed ke-4. New York (US): Longman Inc. Feng XP, Kuhnlein U, Aggrey SE, Gavora JS, Zadworny D. 1997. Trait association of genetic markers in the growth hormone and the growth hormone receptor gene
11 in a white leghorn strain. Poult Sci. 76(12): 1770-1775. doi: 10.1093/ps/76.12.1770 Nei M. 1987. Molecular Evolutionary Genetics. New York (US): Columbia Univ Pr. Nei M, Kumar S. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York (US): Oxford Univ Pr. Nie Q, Sun B, Zhang D, Luo C, Ishag NA, Lei M, Yang G, Zhang X. 2005. High diversity of the chicken growth hormone gene and effects on growth and carcass traits. J Hered. 96(6):698-703. doi: 10.1093/jhered/esi114 Noor RR. 2000. Genetika Ternak. Jakarta (ID): Penebar Swadaya Sambrook J, Fritsch EF, Medrano JF. 1989. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Ed ke-2. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory Pr. Ota M, Seki T, Nomura N, Sugimura K, Mizuki N, Fukushima H, Tsuji K, Inoko H. 1991. Modified PCR-RFLP Method for HLA-DPB1 and -DQA1 genotyping. Tissue Antigens. 38: 60-71. doi: 10.1111/j.1399-0039.1991.tb01882.x Vasilatos-Younken R, Zhou Y, Wang X. Altered chicken thyroid hormone metabolism with chronic GH enhancement in vivo: consequences for skeletal muscle growth. J Endocrinol. 166(3):609-620. doi: 10.1677/joe.0.1660609 Weigend S, Romanov MN. 2001. Current strategies for the assessment and evaluation of genetic diversity in chicken resources. World’s Poult Sci J. 57(3): 275-288. doi: http://dx.doi.org/10.1079/WPS20010020 Weir BS. 1996. Genetic Data Analysis II: Method for Discrete Population Genetic Data. Ed ke-2. Sunderland (GB): Sinauer
12
LAMPIRAN Lampiran 1 Sekuen lengkap gen GH Gallus gallus (GenBank: AY461843) LOCUS DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM
REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL
FEATURES source
mRNA exon CDS
exon variation exon variation
AY461843 4101 bp DNA linear VRT 03-DEC-2003 Gallus gallus growth hormone gene, complete cds. AY461843 AY461843.1 GI:38564744 . Gallus gallus (chicken) Gallus gallus Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Archelosauria; Archosauria; Dinosauria; Saurischia; Theropoda; Coelurosauria; Aves; Neognathae; Galloanserae; Galliformes; Phasianidae; Phasianinae; Gallus. 1 (bases 1 to 4101) Sun,B., Nie,Q., Lei,M. and Zhang,X. Single nucleotide polymorphisms of chicken whole growth hormone gene and their relation to growth traits Unpublished 2 (bases 1 to 4101) Sun,B., Nie,Q., Lei,M. and Zhang,X. Direct Submission Submitted (10-NOV-2003) Animal Science, South China Agricultural University, Tianhe, Guangzhou, Guangdong 510642, P R China Location/Qualifiers 1..4101 /organism="Gallus gallus" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:9031" join(489..553,1468..1628,2071..2187,2489..2650,3719..4013) /product="growth hormone" 489..553 /number=1 join(544..553,1468..1628,2071..2187,2489..2650,3719..3919) /codon_start=1 /product="growth hormone" /protein_id="AAR23809.1" /db_xref="GI:38564745" /translation="MAPGSWFSPLLIAVVTLGLPQEAAATFPAMPLSNLFANAVLRAQ HLHLLAAETYKEFERTYIPEDQRYTNKNSQAAFCYSETIPAPTGKDDAQQKSDMELLR FSLVLIQSWLTPVQYLSKVFTNNLVFGTSDRVFEKLKDLEEGIQALMRELEDRSPRGP QLLRPTYDKFDIHLRNEDALLKNYGLLSCFKKDLHKVETYLKVMKCRRFGESNCTI" 1468..1628 /number=2 1494 /replace="a" 2071..2187 /number=3 2075
13 exon exon
/replace="a" 2489..2650 /number=4 3719..4013 /number=5
ORIGIN 1 ctgcagtgga 61 acccactgaa 121 gcagccctgt 181 tgcgtgagaa 241 ataaaacctc 301 tccccaggca 361 gcaccatggc 421 cacgagcacc 481 tatcatcacc 541 ggaatggctc 601 tgctttgggt 661 cggctctgaa 721 gtgcaacttc 781 ggaatgagct 841 atacgtgttg 901 atgtctaatc 961 tcaacccctt 1021 accctactga 1081 taaccttcag 1141 gcaggtaatg 1201 gtgcaaatag 1261 ctcacgcgcc 1321 gagcacgtta 1381 gagggctgca 1441 acccctctcc 1501 tcacgctggg 1561 tgtttgccaa 1621 aagagttcgt 1681 gcttcccacc 1741 ggaggagaaa 1801 cagctctctg 1861 ctcaaccctt 1921 ctgctttccc 1981 gcaaagagca 2041 gacctgagtg 2101 tacaccaaca 2161 gggaaggatg 2221 ttttatggaa 2281 cttttcacac 2341 aataaagtcc 2401 ctctgggctg 2461 cagctctgaa 2521 catccagtcc 2581 ttttggcacc 2641 cctgatgagg 2701 acatttggat
tccaagcaag tgggaaacca taaccgtggg attcccccac tggttgcaat aacatcctcc gaacacatct cccatccatt tggatgaaag caggtacttt gatgggatac ctaaaatgtg aaaccatgag gcagaatacg ccagggatat agactcatag gcacttgtcc gattaacttt gcttgacagt cagccacttc gctcagctga aaagagtgta ggggaaaata ctcacaggtg tctccgctct actgccgcag cgctgtgctg aagtgttggc ctgcataaat gggtcttaat cctcctcctg cagtgagagc acctgccagt acctgccggg catttgggat aaaactccca acgcccagca cagagggtct cctgcatgca taaaaaaaca cttcagggag atccctttgt tggctcaccc tcagacagag gtaggtctgc taacacagca
cactgcctgt tcccacctgc gcagaaaaac gtaagcacag aaacagcaga ccaacctttc gcatttatgc ttaaacagac gaggaaacgt gctttatctc gatggtgggg gcaacttaca ctgactcagg aagaacaagg taaaactcag aatggcccgg aagtcctgca tgtaagcgga gacctccaga tcaccccagt gctgttccca ccgtgctctg aagggacgga gacacaaccc gctgtaggct gaagctgctg agggctcagc catctcctca tcctgcaagc aggggaggag caaggagtca aatctctaag cctgcacagg aaagagtgag gtctccacag ggctgcgttt gaagtcagta ccacgtggta gaaagacacg ggctcgagtc agcagggcat catttcagga ccgtgcaata tgtttgagaa atactgatgg cccagaccac
gaagctcgtg tctaagccag caggcaggaa aacagatttg atatgaagaa catctccgta aaggagggga ccccagctat tcaagcaaca agttctaatg tgtgctgtgg gatcagtgac taaccctgag caaaccagag ttccaaggct gttgaaaagc ggctccaggg cactcatgtg tcctacaggt gaaggcagac gtcctcaccc ctcaggaagg cccacatgga tgagccccag cgtggttttc ccaccttccc acctccacct ttagcttgat agagactttt aggtgatgac cctcctcctg accagtaggt gatgcacatc gaaagagtcc gaacgcacct tgttactcag agttgtctcc tcagtcccga ggttgggcag tgagtggtgg gcagcagcac catggagctg cctaagcaag actaaaggac aagcctgcgc gagcagctgg
acaacatcca aagtcccctg aatcaggtgg ggatgggtct aaagttcagc taaatgacta tatggagagg ataaggggtg cctgagcaac ggtgttccaa tgggctgaca aaaggatctc cctaaccttg ttgtaatggt ttaaaacgga acttcaaaga cattcctcca agctggatgt gtgtcccaga agtgccatgg actgctctcc tgaaacctac gcaacatgtg gtgccaccaa tcctctcctc tgccatgccc cctggctgcc gcctccagga cagctatcgg cgaccagcct tccatgtgtt gttgtgccaa atgtcccacg gtgctcttct atattccgga aaaccatccc cctgggtaaa gaaggagaaa taaatcatat tgctcagctt tgcagaacac cttcggtttt gtgttcacga ctggaagaag tctgctattt agagtgttct
tcctgctcta cactgccctg attttctacc ttcaatggtg actaatttta caatgaggta tggcagtgat tctcacctgt tctcccggca tgctgctgca cacgcagagc cttccctaca acagggggca gattgctatc gatcaggatg tcacctaatt ctgaagttaa cgagggttaa gagccacagc cagcagcacg accctgttgg caaaaaacat ggcttgtgtg aggacgggta atcgctgtgg ctctccaacc gagacatata ccgtgccacg tgcctcctga gtcctcccca ctgtgctcac cacgtgggct tttccttctt cttatcacac ggaccagagg agctcccacg cacagcactg tgccttctta tcccacccta acagagctgc ctcacctgca cactggttct acaacttggt ggatccaagc ctcttacctg tcagaaaggt
14 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541 3601 3661 3721 3781 3841 3901 3961 4021 4081 //
cactcttaat gtcccaggga ttggggttgg tttgctttgt gcatcaccac ttatagaccc cattttcgat gccctgggca ggctctgaga gtcccttcca aacccaacca acgccgtgat actgtccact ccactgctgc ctcacagctc aagacagcat gctggaggac catccacctg gaaggatctg gagcaactgc cccccccttc cctgctgtct ggggagggag
gcattggcac cgtggagatg gctttgggat tattttgaat agctagagac taaataacta cagaaaagtt gtttgagctg tcccttccaa acccaacggt tgccatcatt tccatgacac gatacgagcg ttacttaccc cacgacggcc cactttgcca cgcagcccgc cgcaacgagg cacaaggtgg accatctgag ctccccgtca gctggctggg gaggggggcc
agctgcccag tggcactgag cttggaggtc gacgttgctt ccacatctat gaaaagccag gtggtgcccc gtggggggca cacaaccgtg gccacgattc ccatggttcc ttcagctgca caggtgctga caaactcttc agggctgggt gcagcccctc ggggcccgca acgccctgct agacctacct gccctgtgcc ccaaaaacac gatatagggc c
ggaggtgggg ggacgtggtt tttccaacct attgtcagaa gccacatgag gcctgggagc atccctggag cccagcccat ctgtgattcc catggttctg atgatctcag gctccatgtg caaccgatac cgagccacgc cagagctctg gctcagccgc gctcctcaga gaagaactac gaaggtgatg tgcgccatgg gaggaataaa gggttcgggg
gggtcaccgt atgggcacgg taataactct tcctttcttg tctggacagt aaacaaaccc gtcccaaggc ggcagggggt acagccctgc tgatccttaa aggccccttc cagcaccact gcagaccatc ggggtgagca tccactagaa agccctctcg cccacctacg ggcctgctgt aagtgccggc ctgacggccc ccccacagcg cgggctcagg
ccctggaggc cgggagtggg atgatgaagt gatgtgttca tgtttatgtc tccgtcctga catggatgga gagacggggg aatccttgag ggtcccttcc ccacccaacc tccagatctt tccatccctt gtgggtgcag aactggagca tcccacagga acaagttcga cctgcttcaa gcttcggaga tgtccccccc ctgagctctg gccgggcaaa
15
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Kota Batu pada tanggal 7 September 1994. Penulis merupakan anak kedua dari 3 bersaudara, Putra Rahardianto dan Ragelia Sekar Merah Saraswati, dari pasangan Rianto dan Rahayu Wijayati. Pendidikan sekolah dasar penulis selesai pada tahun 2006 di SDN 2 Ngaglik Kota Batu. Penulis menyelesaikan pendidikan sekolah menengah pertama di SMPN 1 Batu pada tahun 2009. Penulis menyelesaikan pendidikan sekolah menengah atas di SMAN 1 Batu pada tahun 2012. Penulis diterima sebagai mahasiswa Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan melalui jalur SNMPTN Undangan pada tahun 2012. Selama menjalani pendidikan di perguruan tinggi, penulis pernah berperan aktif dalam acara International Scholarship and Education Expo (ISEE) sebagai anggota divisi Workshop and TOEFL pada tahun 2014, serta terlibat dalam IPB Goes To Field (IGTF) pada bulan Agustus 2014 di Kecamatan Ampelgading, Kabupaten Malang. Penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Genetika Ternak pada tahun 2016. Selain itu, penulis juga merupakan anggota dari Animal Breeding and Genetics Science (ABG Sci) pada laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak.
