IDENTIFIKASI KERAGAMAN GEN INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR-I RECEPTOR (IGF-IR|AluI) PADA AYAM LOKAL DENGAN METODE PCR-RFLP
HERDIAN SAPUTRA
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Keragaman Gen Insulin-Like Growth Factor-I Receptor (IGF-IR|AluI) pada Ayam Lokal dengan Metode PCR-RFLP adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, September 2016 Herdian Saputra NIM D14120022
ABSTRAK HERDIAN SAPUTRA. Identifikasi Keragaman Gen Insulin-Like Growth FactorI Receptor (IGF-IR|AluI) pada Ayam Lokal dengan Metode PCR-RFLP. Dibimbing oleh ASEP GUNAWAN dan CECE SUMANTRI. Gen Insulin-Like Growth Factor-I Receptor (IGF-IR) adalah gen yang berperan penting dalam pertumbuhan, sifat karkas, dan kualitas daging terutama pada ayam. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen IGFIR dengan menggunakan enzim retriksi AluI melalui metode PCR-RFLP pada beberapa ayam lokal indonesia. Sampel yang digunakan pada penelitian ini sebanyak 198 ekor ayam lokal indonesia, yang terdiri atas 69 ekor ayam kampung ciawi, 56 ekor ayam kampung sukabumi, 25 ekor ayam merawang, 23 ekor ayam pelung, dan 25 ekor ayam sentul. Panjang produk hasil PCR adalah 351 bp. Hasil genotyping menghasilkan 2 genotipe, yaitu AG (351 pb, 92 pb, dan 259 pb), dan GG (92 pb dan 259 pb). Frekuensi genotip AG (0.556) memiliki nilai yang paling tinggi dibandingkan dengan genotip GG (0.444). Sehingga frekuensi alel G (0.72) lebih tinggi dibandingkan frekuensi alel A (0.28). Populasi ayam kampung sukabumi dan ayam kampung ciawi berada pada keadaan keseimbangan HardyWeinberg. Nilai heterozigositas pengamatannya lebih tinggi dari pada nilai heterozigositas harapan (Ho>He). Disimpulkan bahwa gen IGF-IR pada ayam lokal Indonesia bersifat polimorfik. Kata kunci : ayam lokal Indonesia, Gen IGF-IR, PCR-RFLP, polimorfik
ABSTRACT HERDIAN SAPUTRA. Identification of Insulin-Like Growth Factor-I Receptor (IGF-IR|AluI) Gene in Indonesian Local Chickens Using by PCR-RFLP Method. Supervised by ASEP GUNAWAN and CECE SUMANTRI. Insulin-Like Growth Factor-I Receptor (IGF-IR) is a gene that plays an important role in the growth, carcass trait, and meat quality, especially in chickens. This study aims to identify IGF-IR gene polymorphism using a restriction enzyme AluI by PCR-RFLP method in some Indonesian local chickens. The sample used in this study were 198 Indonesian local chickens, consisting of 69 ciawi chickens, 56 sukabumi chickens, 25 merawang chickens, 25 sentul chickens, and 23 pelung chickens. The length of PCR product was 351 bp. The result of genotyping showed 2 genotypes, namely AG (351 bp, 92 bp and 259 bp) and GG (92 bp and 259 bp). Genotype AG (0.556) had the highest value than genotype GG (0.444). The frequency of allele G (0.72) was higher than the frequency of alleles A (0.28). Population of sukabumi chickens and ciawi chickens were in Hardy-Weinberg equilibrium. Values of heterozigosity observation were higher than the values of heterozigosity expectation (Ho>He). It could be concluded that the IGF-IR gene in the Indonesian local chicken was polymorphic. Key words: IGF-IR gene, Indonesian local chickens, PCR-RFLP, polymorphism.
IDENTIFIKASI KERGAMAN GEN INSULIN LIKE-GROWTH FACTOR-I RECEPTOR (IGF-IR|AluI) PADA AYAM LOKAL DENGAN METODE PCR-RFLP
HERDIAN SAPUTRA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Peternakan pada Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
DEPARTEMEN ILMU PRODUKSI DAN TEKNOLOGI PETERNAKAN FAKULTAS PETERNAKAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
Judul Skripsi : Identifikasi Keragaman Gen Insulin-Like Growth Factor-I Receptor (IGF-IR|AluI) pada Ayam Lokal dengan Metode PCR-RFLP Nama : Herdian Saputra NIM : D14120022
Disetujui oleh
Dr agr Asep Gunawan, SPt MSc Pembimbing I
Prof Dr Ir Cece Sumantri, MSc Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Irma Isnafia Arief, SPt MSi Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis ucapkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Salawat serta salam semoga senantiasa tercurahkan kepada Rasulullah SAW. Skripsi dengan judul identifikasi Keragaman gen insulin-like growth factor-I receptor (IGF-IR) pada ayam lokal dengan metode PCR-RFLP sebagai syarat memperoleh gelar sarjana peternakan telah berhasil diselesaikan. Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr agr Asep Gunawan, SPt MSc dan Bapak Prof Dr Ir Cece Sumantri, MSc sebagai komisi pembimbing, atas segala ilmu, saran, motivasi, dan semangat yang diberikan selama proses bimbingan. Terima kasih juga kepada Bapak Dr Jakaria, SPt MSi sebagai dosen pembimbing akademik atas semua saran dan masukan selama ini. Terima kasih kepada Ibu Dr Ir Sri Darwati, MSi sebagai dosen pembahas pada seminar hasil penelitian penulis, atas segala saran dan masukannya. Terima kasih juga kepada Ibu Dr Ir Lucia Cyrilla ENSD, MSi dan Ibu Ir Anita S. Tjakradidjaja, MRurSc sebagai dosen penguji sidang skripsi atas semua saran dan masukan untuk perbaikan karya ilmiah ini. Ungkapan terima kasih disampaikan kepada Ayahanda (Alm Herkules) dan Ibunda (Tini) serta adik (Rizki Nugraha) yang tidak hentinya memberikan doa, kasih sayang, motivasi, dan dukungan moral dan material yang tidak terhingga. Terimakasih kepada Ummi Hani Trisandi yang selama ini menemani penulis dalam proses pembuatan karya ilmiah ini, dan selalu memberikan motivasi dan semangat agar karya tulis ini cepat diselesaikan. Terimakasih kepada Ade Surya Kusuma, Briliannanda Novandri, dan Ady Mulyana yang telah menjadi sahabat penulis. Terima kasih kepada keluarga besar ABG Sci yang telah memberikan ilmu dan membimbing penulis pada saat melakukan penelitian. Serta terimakasih kepada keluarga besar IPTP 49, atas kebersamaan yang telah terjalin selama penulis menuntut ilmu di Fakultas Peternakan IPB. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2016 Herdian Saputra
DAFTAR ISI DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR PENDAHULUAN Latar Belakang Tujuan Penelitian Ruang Lingkup Penelitian METODE Lokasi dan Waktu Bahan Alat Prosedur Analisis Data HASIL DAN PEMBAHASAN Amplifikasi Gen IGF-IR Keragaman Gen IGF-IR Frekuensi Alel dan Genotipe Gen IGF-IR Keseimbangan Hardy-Weinberg pada Gen IGF-IR Pendugaan Nilai Heterozigositas Gen IGF-IR|AluI SIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN RIWAYAT HIDUP
viii ix ix 1 1 1 2 2 2 2 3 3 5 6 6 7 8 9 10 12 12 14 19
DAFTAR TABEL 1 2 3 4 5 6
Jumlah sampel ayam yang digunakan Primer gen IGF-IR Genotipe dan panjang produk hasil PCR-RFLP Frekuensi alel dan genotipe gen IGF-IR pada ayam lokal Keseimbangan Hardy-Weinberg gen IGF-IR|AluI berdasarkan uji X2 Nilai heterozigositas pengamatan (Ho) dan heterozigositas harapan (He) gen IGF-IR|AluI.
2 3 5 9 10 11
DAFTAR GAMBAR 1 Posisi penempelan primer (cetak tebal) pada sekuen gen IGF-IR . 2 Hasil amplifikasi gen IGF-IR pada gel agarosa 1.5%. 3 Visualisasi hasil fragmen gen IGF-IR|AluI pada gel agarosa 2%. Genotipe AG (351 pb, 259 pb, dan 92 pb), dan Genotipe GG (92 pb, dan 259 pb).
4 7
8
DAFTAR LAMPIRAN 1 Sekuen Lengkap Gen IGF-IR (Nomor Akses Gen Bank: NC_006097) 2 Pembuatan primer melalui primer designing tools (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) 3 Blast primer melalui MEGA 6.06 4 Penentuan enzim restriksi melalui NEBcutter V2. (http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)
14 15 17 17
PENDAHULUAN Latar Belakang Ayam lokal merupakan plasma nutfah Indonesia yang keberadaan dan populasinya perlu ditingkatkan. Persentase populasi unggas Indonesia pada tahun 2015 sebesar 97.01% dari total populasi ternak nasional dan 14,36% dari populasi tersebut adalah populasi ayam lokal. Produksi telur dan daging ayam lokal masing-masing 10.87% dan 10.27% dari produksi nasional (Ditjennak Keswan 2015). Penyebaran ayam lokal merata di seluruh pelosok Indonesia dan telah menyatu dengan kehidupan masyarakat Indonesia. Hal ini disebabkan karena kemampuan ayam lokal Indonesia yang memiliki daya tahan terhadap lingkungan yang kurang nyaman, dan memiliki daya tahan terhadap penyakit yang cukup tinggi (Mardiningsih et al. 2004), namun ayam lokal memiliki kekurangan yaitu laju pertumbuhan yang lambat (Nataamijaya 2010). Diantara jenis ayam lokal, ada beberapa jenis yang cukup dikenal oleh masyarakat antara lain ayam kampung, ayam pelung, ayam merawang dan ayam sentul. Upaya yang dapat dilakukan untuk meningkatkan mutu genetik produksi ayam lokal dapat dilakukan melalui seleksi. Seleksi dapat dilakukan secara konvensional dan molekuler. Seleksi secara molekuler dilakukan dengan mengidentifikasi gen pengontrol pertumbuhan salah satunya adalah gen insulinlike growth factor-I receptor (IGF-IR). Gen insulin-like growth factor-I receptor (IGF-IR) berperan penting dalam pertumbuhan, karkas, dan kualitas daging, terutama pada ayam (Lei et al. 2008). Penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Jin et al. (2014) melaporkan bahwa gen IGF-IR berasosiasi dengan bobot badan umur 49 hari, 70 hari, dan efisiensi konversi pakan pada ayam broiler. Yang et al. (2012) melaporkan bahwa adanya mutasi synonymous pada gen IGF-IR basa Guanin (G) menjadi basa Arginin (A) yang berasosiasi dengan bobot badan ayam. Lei et al. (2008) menunjukan bahwa gen IGF-IR berhubungan secara signifikan terhadap bobot badan umur 28, 35, 56 hari, dan karakteristik karkas pada ayam Xinghua. Salah satu teknik yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi keragaman genetik yaitu metode Polymorphism Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP). Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik amplifikasi potongan deoxyribonucleic acid (DNA) secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi dua buah primer oligonukleotida. Proses amplifikasi dilakukan menggunakan enzim Taq polymerase terhadap primer yang menempel pada DNA spesifik (Muladno 2010). Penelitian ini dilakukan untuk melihat keragaman gen insulin like growth factor I receptor (IGF-IR) yang dapat dilakukan sebagai langkah awal untuk perbaikan sifat pertumbuhan pada ayam lokal Indonesia. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi keragaman gen insulin-like growth factor-I receptor (IGF-IR) pada ayam lokal dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCRRFLP).
2 Ruang Lingkup Penelitian Identifikasi keragaman gen insulin-like growth factor-I receptor (IGF-IR) ekson 2 yang terletak pada kromosom 10 pada ayam lokal dengan metode PCRRFLP menggunakan enzim restriksi AluI.
METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, Bagian Pemuliaan dan Genetika, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor. Penelitian berlangsung dari bulan Januari 2016 sampai April 2016. Bahan Sumber DNA berasal dari ayam kampung sukabumi, ciawi dan koleksi DNA dari Laboratorium Pemuliaan dan Genetika Ternak IPB. Jumlah total sampel darah sebagai sumber DNA berjumlah 198 sampel. Detail sampel ayam yang digunakan pada penelitian disajikan pada Tabel 1.
No 1 2 3 4 5 Total
Tabel 1 Jumlah sampel ayam yang digunakan Jenis ayam Asal Ayam kampung 26 minggu Sukabumi Ayam kampung 12 minggu Ciawi Ayam merawang Koleksi Lab Ayam pelung Koleksi Lab Ayam sentul Koleksi Lab
Jumlah (n) 56 69 25 23 25 198
Bahan-bahan yang digunakan dalam pengambilan sampel darah yaitu alkohol 70%, EDTA, dan kapas. Tahap ekstraksi DNA, bahan-bahan yang digunakan antara lain DW (destilation water), larutan EtOH absolute 70%, SDS (sodium dodecylsulphate) 10%, NaCl 0.2%, 1xSTE (sodium tris-EDTA), 10% proteinase-K (5 mg/ml), CIAA (chloroform isoamylalcohol), phenol solution, TE (tris EDTA) 80%, dan NaCl 5M. Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen IGF-IR dirancang berdasarkan Yang et al. (2012) yang telah dimodifikasi menggunakan aplikasi MEGA 6 dengan sekuen disajikan pada Tabel 2.
3 Tabel 2 Primer gen IGF-IR Gen
Posisi Target
IGF-IR
Exon 2
Sekuens Primer F: 5’- AAC GCC TGG AGA ACT GTA CG -3’ R: 5’- CCG CAT CTA GGA TGA GAG AC -3’
Panjang sekuen target (bp) 351
Keterangan: F= Forward, R= reverse
Bahan-bahan yang digunakan pada teknik PCR yaitu sampel DNA, fermentas mix (DW (destiltion water), MgCl2, dNTPs, taq polymerase, buffer, dan pasangan primer forward dan reverse. Bahan-bahan yang digunakan pada teknik RFLP antara lain produk PCR (amplikon), enzim restriksi Alu1 dengan situs potong AG|CT, Buffer B, dan DW (destilton water). Bahan-bahan yang digunakan dalam elektroforesis terdiri dari amplikon, agarose gel 1.5 dan 2.5%, 0.5×TBE (tris borat-EDTA), etidium bromida (EtBr) 10%, dan marker 100bp. Alat Alat yang digunakan pada saat pengambilan sampel darah ayam yaitu, spoit, pipa kapiler haematokrit, tabung ependorf 1.5 mL, spidol, dan 1 set cool box. Alat-alat yang digunakan pada tahap ekstraksi DNA yaitu microsentrifuge berpendingin, tabung eppendorf 1.5 mL beserta rak tabung, freezer, inkubator, tilter, 1 unit mikropipet beserta tip dan vortex. Alat-alat yang digunakan pada analisis PCR-RFLP terdiri atas mesin PCR thermocycler, tabung eppendorf beserta rak tabung, 1 unit mikropipet beserta tip, vortex, microsentrifuge (spin down), incubator, refrigerator, stirer, microwave, tray pencetak, dan UV transilluminator. Prosedur Pengambilan Sampel Darah Sampel darah yang diekstraksi diperoleh dengan cara mengambil darah menggunakan spoit atau pipa kapiler hematokrit pada vena axillaris bagian sayap. Sebelum dilakukan pengambilan darah, bagian kulit ayam diolesi dengan kapas yang telah diberi alkohol terlebih dahulu. Darah yang diambil sebanyak 1 mL dimasukkan ke dalam tabung 1.5 mL kemudian ditambahkan serbuk EDTA agar sampel darah tidak menggumpal. Sampel darah disimpan di dalam refrigerator dengan suhu 4 0C, agar sampel tidak rusak sebelum dilakukan proses selanjutnya. Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA yang dilakukan berdasarkan Sambrook et al. (1989) yang dimodifikasi. Sampel darah ayam diambil sebanyak 20 μL dimasukkan ke dalam tabung eppendorf 1.5 mL, lalu ditambahkan 1000 μL NaCl 0.2%, kemudian divortex dan didiamkan selama 5 menit agar homogen. Sampel selanjutnya disentrifius pada kecepatan 8000 rpm selama 5 menit dan supernatan dibuang. Endapan yang tersisa ditambahkan 40 μL SDS 10%, 10 μL proteinase-K (5 mg/mL) dan 1×STE sampai 400 μL, kemudian diinkubasi pada suhu 55 °C selama
4 2 jam sambil digoyang secara perlahan menggunakan tilter. Bahan organik didegredasi dengan menambahkan 400 μL phenol solution, 400 μL CIAA, dan 40 μL NaCl 5M, kemudian digoyang menggunakan tilter selama 1 jam pada suhu ruang. Molekul DNA dipisahkan dari fenol dengan cara disentrifius pada kecepatan 12000 rpm selama 5 menit sehingga terbentuk fase DNA (bening). Fase DNA dipindahkan ke tabung baru sebanyak 400 μL lalu ditambahkan EtOH abssolute 70% sebanyak 800 μL dan NaCl 5M sebanyak 40 μL, kemudian freezing (overnight). Molekul DNA disentrifius pada kecepatan 12 000 rpm selama 5 menit untuk memisahkan EtOH absolute. Supernatan yang mengendap dibuang. Endapan didiamkan hingga kering untuk disuspensikan dalam 100 μL TE 80%. Sampel DNA disimpan dalam freezer. Amplifikasi DNA DNA diamplifikasi dengan teknik PCR. Total volume DNA yang diamplifikasi sebanyak 15 μL yang terdiri atas sampel DNA dan larutan premix masing-masing 1 μL dan 14 μL. Sampel DNA hasil ekstraksi sebanyak 0.5-1 μL dimasukkan ke dalam tabung PCR, lalu ditambahkan 14 μL larutan premix. Premix tersusun atas DW (destiltion water) sebanyak 10.85 μL, MgCl2 sebanyak 1 μL, dNTPs sebanyak 0.3 μL, taq polymerase sebanyak 0.05 μL, buffer sebanyak 1.5 μL, dan pasangan primer forward dan reverse sebanyak 0.3 μL. Campuran ini diinkubasi dalam thermocycler untuk proses amplifikasi. Proses amplifikasi diawali tahap denaturasi pada suhu 95 oC selama lima menit. Tahap kedua terdiri dari 35 siklus, masing-masing siklus terdiri dari proses denaturasi pada suhu 95 oC selama 10 detik, annealing primer pada suhu 60 oC selama 20 detik dan ekstensi DNA pada suhu 72 oC selama 30 detik. Tahapan terakhir adalah pemanjangan primer pada suhu 72 oC selama sepuluh menit. Forward 26241 26301 26361 26421 26481 26541
CTGAAACGCC AAAGCAGAGG CTGCTGTTCC ATTCGCGGGA AAGGAGATCG AACTCTGACC
TGGAGAACTG ATTACCGCAA GTGTGGCGGG GGAACCTCTT GGCTTCACAA TGTGTTACCT
TACGGTCGTT GAGGGTTTCC TTCAGATCCT GCTCATCTCT CTTCCGCTTC CCGAAGCTGA CCGTCATAAC TGACTACTTG CTTGGAAAGC CTCAGCGATC TCTTCCCCAA CCTCACGGTC CTACAACTAT GCCTTGGTGA TCTTCGAAAT GACAAATCTG CTTGAGGAAC ATAACCCGCG GGGCCATACG GATTGAGAAG CTCCACAGTG GACTGGTCTC TCATCCTAGA TGCGG
Reverse
Alel G: 5’-----cccgaAG|CTgaccg----3’ Alel A: 5’-----cccgaAACTgaccg----3’ Keterangan:
Alel G mempunyai basa G pada posisi basa ke 26336 Alel A mempunyai basa A pada posisi basa ke 26336
Gambar 1 Posisi penempelan primer (cetak tebal) pada sekuen gen IGF-IR berdasarkan Ensemble (nomor akses : ENSGALG00000007039) Elektroforesis Hasil amplifikasi DNA dapat diketahui melalui elektroforesis. Amplikon akan dipisahkan dengan elektroforesis agarose gel 1.5%. Gel dibuat dari 0.45 g agarose gel dan 30 mL 0.5×TBE yang dipanaskan dalam microwave pada suhu medium-high selama 3 menit. Campuran dihomogenisasi dengan stirer, lalu ditambahkan 2.5 μL EtBr 10%. Gel dicetak pada tray pencetak dan dibiarkan hingga mengeras. Sebanyak 5 μL amplikon ditambahkan dengan pewarna loading dye 1 μL dimasukkan ke dalam sumur-sumur gel. Sumur pertama diisi oleh DNA
5 marker yang berukuran 100 pb. Elektroforesis dilakukan pada tegangan 100 V selama 35-45 menit yaitu sampai fragmen DNA selesai bermigrasi di dalam gel. Pita-pita (bands) akan tampak dengan bantuan sinar UV sehingga genotyping dilakukan berdasarkan panjang fragmen DNA yang terlihat. Genotyping Genotyping dapat dilakukan dengan teknik Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP). Sebanyak 5 μL amplikon ditambahkan DW (destilation water) sebanyak 0.9 μL, buffer sebanyak 0.7 μL, dan enzim restriksi sebanyak 0.4 μL. Enzim AluI pada pemotongan gen IGF-IR pada ekson 2 diinkubasi pada suhu 37 °C overnight. Sebanyak 5 μL DNA hasil pemotongan kemudian dielektroforesis kembali pada tegangan 100 V selama 35-45 menit pada agarose gel 2.5%. Sampel DNA hasil elektroforesis kemudian diangkat dan diamati di bawah sinar UV. Fragmen DNA yang muncul dari hasil elektroforesis dibandingkan dengan marker untuk diketahui panjang fragmennya. Posisi migrasi DNA yang terbentuk diidentifikasi sebagai alel untuk penentuan genotipe setiap sampel disajikan pada Tabel 3 . Tabel 3 Genotipe dan panjang produk hasil PCR-RFLP Lokus Genotipe Panjang Produk (bp) GG 92, dan 259 IGF-IR|AluI AA 351 AG 351, 259, dan 92 Analisis Data Frekuensi Alel dan Genotipe Frekuensi genotipe dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut (Nei dan Kumar 2000): nii Xii = N Keterangan: xii = frekuensi genotipe ke-i nii = jumlah individu bergenotipe ii N = jumlah total sampel
Frekuensi alel dapat dihitung berdasarkan Nei dan Kumar (2000) dengan rumus sebagai berikut: 2nii +Σnij Xi = 2N Keterangan: xi = frekuensi alel ke-i nii = jumlah individu bergenotipe ii nij = jumlah individu bergenotipe ij N = jumlah total sampel
6 Derajat Heterozigositas Keragaman genetik dapat diketahui melalui perhitungan frekuensi heterozigositas pengamatan (H0) dengan menggunakan rumus menurut Weir (1996): H0 = i≠j
nij N
Keterangan: H0 = heterozigositas pengamatan N1ij = jumlah individu heterozigot pada lokus ke-1 N = jumlah individu yang dianalisis
Heterozigositas harapan dihitung menggunakan rumus berdasarkan Nei dan Kumar (2000) yaitu: q
x2i
He =1i=1
Keterangan: He = heterozigositas harapan xi = frekuensi harapan q = jumlah alel
Keseimbangan Hardy-Weinberg Keseimbangan Hardy-Weinberg diuji dengan nilai chi-kuadrat (χ2) berdasarkan Hartl dan Clark (1997) yaitu dengan rumus berikut: X2 =
O−E ² E
Keterangan: χ2 = chi-kuadrat O = jumlah genotipe pengamatan E = jumlah genotipe harapan
HASIL DAN PEMBAHASAN Amplifikasi Gen IGF-IR Amplifikasi gen IGF-IR yang dilakukan pada sampel ayam kampung ciawi, ayam kampung sukabumi, ayam merawang, ayam pelung, dan ayam sentul sebanyak 198 ekor berhasil dilakukan dan keberhasilannya mencapai 100%. Gen IGF-IR yang telah diamplifikasi dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) menghasilkan panjang produk sepanjang 351 pb. Visualisasi fragmen gen IGF-IR hasil amplifikasi pada gel agarosa 1.5% disajikan pada Gambar 2.
7
Keterangan : M = Marker 1-3 = sampel ayam sukabumi 4-6 = sampel ayam ciawi
7 8 9
= sampel ayam merawang = sampel ayam pelung = sampel ayam sentul
Gambar 2 Hasil amplifikasi gen IGF-IR pada gel agarosa 1.5%. Amplifikasi gen IGF-IR pada sampel ayam lokal dilakukan pada suhu annealing sebesar 60 oC, hal ini berbeda dengan penelitian yang dilakukan oleh Yang et al. (2012) yang menggunakan suhu annealing sebesar 58 oC, dan menghasilkan fragmen gen IGF-IR sepanjang 155 pb. Perbedaan penggunaan suhu annealing tersebut disebabkan karena panjang fragmen gen IGF-IR yang diinginkan berbeda yaitu 351 pb, sehingga primer yang digunakan juga berbeda. Menurut Viljoen et al. (2005) suhu annealing merupakan suhu optimum terjadinya penempelan primer yang digunakan pada titik pemotongan DNA selama proses amplifikasi berlangsung dan berkisar antara 55-72 oC. Keberhasilan proses PCR ditentukan oleh beberapa faktor, antara lain kualitas DNA hasil ekstraksi, komposisi bahan penyusun mix PCR, suhu annealing yang digunakan, dan kondisi mesin thermocycler. Beberapa hal yang harus diperhatikan agar memperoleh hasil PCR yang optimal yaitu suhu annealing, konsentrasi MgCl2+, konsentrasi primer, dan konsentrasi DNA target (Viljoen et al. 2005).
Keragaman Gen IGF-IR Hasil yang didapatkan pada penelitian ini, yaitu terdapat dua jenis genotipe yang dihasilkan dari proses pemotongan DNA oleh enzim retriksi AluI. Enzim retriksi AluI hanya mengenali situs pemotongan AG|CT. Enzim AluI akan mulai bekerja pada DNA ayam lokal dan memotong situs yang dikenalnya, tetapi jika terjadi mutasi, enzim AluI tidak memotong sekuen gen tersebut. Genotipe GG memiliki dua fragmen pita dengan panjang 92 pb dan 259 pb, dan genotipe AG memiliki tiga fragmen pita dengan panjang masing-masing 351 pb, 92 pb, dan 259 pb. Visualisasi genotipe gen IGF-IR disajikan pada Gambar 3.
8
Keterangan : M = Marker 1-3 = sampel ayam sukabumi 4-6 = sampel ayam ciawi
7 8 9
= sampel ayam merawang = sampel ayam pelung = sampel ayam sentul
Gambar 3 Visualisasi hasil fragmen gen IGF-IR|AluI pada gel agarosa 2%. Genotipe AG (351 pb, 259 pb, dan 92 pb), dan Genotipe GG (92 pb, dan 259 pb). Yang et al. (2012) melaporkan, bahwa gen IGF-IR pada ayam jinghai kuning terjadi mutasi synonymous basa G (guanine) menjadi basa A (adenine) pada posisi 26336 pb yang berasosiasi dengan bobot badan umur 8 dan 12 minggu. Hasil dari pemotongan fragmen gen IGF-IR pada ayam jinghai kuning dengan menggunakan enzim retriksi AluI menghasilkan 3 jenis genotipe, yaitu genotipe GG memiliki 2 fragmen pita dengan panjang produk 90 pb dan 65 pb, genotipe AG memiliki tiga fragmen pita dengan panjang produk 90 pb, 65 pb dan 155 pb, dan genotipe AA memiliki satu fragmen pita dengan panjang produk 155 pb. Perbedaan hasil genotipe yang didapatkan terjadi karena perbedaan sampel ayam yang digunakan.
Frekuensi Alel dan Genotipe Gen IGF-IR Frekuensi genotipe pada ayam kampung ciawi yang tertinggi yaitu genotipe GG (0.623) dan terendah yaitu genotipe AG (0.377). Frekuensi genotipe yang tertinggi pada ayam kampung sukabumi yaitu genotipe GG (0.750) dan terendah yaitu genotipe AG (0.250). Frekuensi genotipe pada ayam merawang yang tertinggi yaitu genotipe AG (0.960) dan yang terendah yaitu GG (0.040). Frekuensi genotipe yang tertinggi pada ayam sentul yaitu genotipe AG (0.920) dan yeng terendah yaitu GG (0.080). Sedangkan pada ayam pelung hanya terdapat satu jenis genotipe yaitu genotipe AG (1.00). Frekuensi alel G (0.72) hasil penelitian lebih mendominasi daripada frekuensi alel A (0.28). Nilai frekuensi alel dan genotipe pada ayam yang diteliti disajikan pada Tabel 4.
9 Tabel 4 Frekuensi alel dan genotipe gen IGF-IR pada ayam lokal Sampel Ayam kampung ciawi Ayam kampung sukabumi Ayam merawang Ayam sentul Ayam pelung
Jumlah (N) 69 56 25 25 23
Frekuensi Genotipe Alel GG AG A G 0.623 0.377 0.19 0.81 0.750 0.250 0.13 0.88 0.040 0.960 0.48 0.52 0.080 0.920 0.46 0.54 0.000 1.000 0.50 0.50
Keterangan: N= Jumlah sampel, n= Jumlah per genotipe
Frekuensi genotipe menunjukkan jumlah suatu genotipe yang muncul dalam suatu populasi. Frekuensi suatu genotipe tertentu, dapat ditentukan dengan cara membandingkan jumlah individu yang memiliki genotipe tertentu dibandingkan dengan jumlah individu yang diamati. Hasil frekuensi genotipe yang didapatkan berbeda dengan yang dilaporkan oleh Yang et al. (2012). Frekuensi genotipe pada ayam jinghai kuning mulai dari yang tertinggi sampai yang terendah, yaitu genotipe GG (0.555), genotipe AG (0.400), dan genotipe AA (0.045). Perbedaan frekuensi genotipe yang didapatkan karena jenis ayam yang digunakan sebagai sampel berbeda, sehingga jumlah genotipe yang dihasilkan juga berbeda. Hal yang sama juga telah dilaporkan oleh Tamzil et al. (2013) bahwa adanya perbedaan tingkat keragaman genotipe antara ayam kampung dan ayam arab yang diteliti dengan ayam hubbard. Hasil analisis frekuensi alel gen IGF-IR pada ayam lokal menunjukan bahwa gen IGF-IR bersifat polimorfik. Menurut Hartl dan Clark (1997), jika frekuensi alel mencapai nilai 1, maka populasi bersifat monomorfik. Suatu alel dikatakan polimorfik jika memiliki frekuensi alel sama atau kurang dari 0.99. Frekuensi alel yang didapatkan sama dengan yang dilaporkan oleh Yang et al. (2012) yaitu alel G (0.755) lebih mendominasi dari pada alel A (0.245), hal ini terjadi karena pada sampel ayam lokal hanya didapatkan genotipe GG dan AG, dan tidak didapatkan genotipe AA sehingga menyebabkan rasio alel G lebih mendominasi dari pada alel A.
Keseimbangan Hardy-Weinberg pada Gen IGF-IR Hasil perhitungan nilai chi-kuadrat pada sampel ayam lokal yang diteliti menunjukkan bahwa hanya nilai X2 hitung ayam kampung sukabumi dan ayam kampung ciawi yang berada dalam keseimbangan Hardy-Weinberg (χ2 hitung < χ2 0.05). Sedangkan nilai X2 hitung ayam merawang, ayam sentul, dan ayam pelung tidak berada dalam keseimbangan Hardy-Weinberg (χ2 hitung > χ2 0.05). Hasil uji chi-kuadrat gen IGF-IR disajikan pada Tabel 5.
10 Tabel 5 Keseimbangan Hardy-Weinberg gen IGF-IR|AluI berdasarkan uji X2 Sampel Jumlah sampel X2 hitung Ayam kampung ciawi 69 3.718 Ayam kampung sukabumi 56 0.157 Ayam merawang 25 21.302* Ayam sentul 25 18.141* Ayam pelung 23 23.000* Keterangan: X2 0.05 = 3.84 dan X2 0.01 = 6.64 * = nyata (P < 0.05)
Penelitian sebelumnya yang dilaporkan oleh Yang et al. (2012), bahwa pada populasi ayam jinghai kuning berada dalam keseimbangan Hardy-Weinberg. Pada penelitian, populasi ayam kampung sukabumi dan ayam kampung ciawi berada dalam keseimbangan Hardy-Weinberg. Hal ini dimungkinkan karena ayam kampung sukabumi yang diambil untuk dijadikan sampel berasal dari peternak rakyat Jampang Tengah yang dipelihara dengan cara diumbar di halaman rumah dan belum adanya proses seleksi yang terjadi. Begitu juga dengan populasi ayam kampung ciawi yang dimungkinkan belum terjadi seleksi. Menurut Allendorf dan Luikart (2006) bahwa frekuensi alel dan genotipe akan konstan dari generasi ke generasi karena adanya perkawinan acak, tidak ada mutasi, tidak ada migrasi, tidak ada seleksi alam dan populasi berukuran besar. Populasi ayam merawang, ayam sentul, dan ayam pelung tidak berada dalam keseimbangan Hardy-Weinberg. Hal ini bisa terjadi karena pada populasi tersebut telah dilakukan seleksi. Ditunjukkan dengan adanya ciri-ciri khusus pada fenotipe ayam tersebut yang cenderung sudah seragam. Noor (2008) menyatakan bahwa ketidakseimbangan Hardy-Weinberg disebabkan oleh terjadinya seleksi intensif, mutasi, migrasi atau genetic drift dan perkawinan tidak acak pada suatu populasi.
Pendugaan Nilai Heterozigositas Gen IGF-IR|AluI Nilai heterozigositas pengamatan dan nilai heterozigositas harapan merupakan salah satu cara untuk menduga nilai koefisien biak dalam (inbreeding) pada suatu kelompok ternak sehingga dapat dijadikan gambaran keragaman genetik suatu populasi (Hartl dan Carlk 1997). Nilai heterozigositas pada ayam lokal yang diamati memiliki nilai heterozigositas harapan (He) yang lebih rendah daripada nilai heterozigositas pengamatan (Ho). Pendugaan nilai heterozigositas pengamatan (Ho) dan heterozigositas harapan (He) disajikan pada Tabel 6.
11 Tabel 6 Nilai heterozigositas pengamatan (Ho) dan heterozigositas harapan (He) gen IGF-IR|AluI. Sampel Jumlah sampel Nilai He Nilai Ho Ayam kampung ciawi 69 0.306 0.377 Ayam kampung sukabumi 56 0.219 0.250 Ayam merawang 25 0.499 0.960 Ayam sentul 25 0.497 0.920 Ayam pelung 23 0.500 1.000 Menurut Nei (1987) bahwa, nilai heterozigositas berkisar antara 0 sampai 1. Nilai heterozigositas sama dengan 0 maka diinterpretasikan populasi yang diukur memiliki hubungan genetik yang sangat dekat, sedangkan apabila nilai heterozigositas sama dengan 1 diasumsikan populasi yang diukur tidak terdapat hubungan genetik atau pertalian genetik yang cukup jauh. Ayam kampung ciawi dan ayam kampung sukabumi memiliki nilai heterozigositas pengamatan (Ho) mendekati 0. Hal ini dimungkinkan bahwa populasi ayam tersebut hanya berasal dari Sukabumi dan Ciawi, dan belum adanya proses introduksi ayam dari luar daerah tersebut. Menurut Legates dan Warwik (1990), bahwa persilangan dengan kerabat dekat dapat meningkatkan homozigositas dan dapat menurunkan heterozigositas. Sedangkan pada ayam merawang, ayam pelung, dan ayam sentul memiliki nilai heterozigositas mendekati 1. Hal ini dimungkinkan karena telah ada proses introduksi ayam lain dari luar populasi yang dimaksudkan untuk mendapatkan kombinasi sifat tertentu. Nilai heterosigositas yang tinggi dapat menguntungkan karena makin jauh hubungan kekerabatannya maka kemungkinan terjadinya inbreeding makin kecil dan kemungkinan alel resesif yang dapat membawa cacat rendah. Tingginya nilai heherosigositas diharapkan dapat membentuk bangsa baru yang memiliki produktifitas yang lebih tinggi dari pada kedua tetuanya (Hardjosubroto 1994). Populasi ayam kampung ciawi dan ayam kampung sukabumi memiliki variasi gen yang rendah bekisar antara 0.250–0.377 sedangkan pada ayam merawang, sentul, dan pelung memiliki variasi gen yang tinggi berkisar antara 0,920-1,000. Menurut Javanmard et al. (2005) bahwa nilai heterosigositas di bawah 0.500 (50%) mengindikasikan rendahnya variasi suatu gen dalam populasi. Rendahnya variasi genetik bisa terjadi karena ayam kampung ciawi dan ayam kampung sukabumi melakukan perkawinan dengan sesama ayam dalam populasi tersebut, dan belum adanya tambahan ayam dari luar populasi yang masuk ke dalam populasi. Sebaliknya pada ayam merawang, ayam sentul, dan ayam pelung yang memiliki variasi genetik tinggi karena telah terjadi persilangan dengan populasi ayam dari luar populasi ayam tersebut. Adanya keragaman gen IGF-IR pada ayam kampung sukabumi, ayam kampung ciawi, ayam merawang, ayam sentul, dan ayam pelung memiliki potensi untuk dijadikan kandidat awal seleksi untuk sifat pertumbuhan terutama untuk skala industri. Namun perlu dilakukan validasi keragaman jumlah sampel yang lebih banyak dan hubungan terhadap sifat pertumbuhan.
12
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Identifikasi terhadap gen IGF-IR|AluI yang dilakukan pada ayam lokal bersifat polimorfik. Pada seluruh sampel ayam diperoleh hanya 2 genotipe GG dan AG. Populasi ayam sukabumi dan ayam ciawi belum mengalami seleksi sehingga berada pada keseimbangan Hardy-Weinberg sementara pada populasi ayam merawang, ayam sentul, dan ayam pelung sudah mengalami proses seleksi sehingga tidak berada pada keseimbangan Hardy-Weinberg. Saran Penelitian lanjutan berupa asosiasi gen IGF-IR terhadap pertumbuhan, sifat karkas, dan kualitas daging dapat dilakukan pada ayam lokal, agar dapat dilakukan seleksi terhadap ayam lokal.
DAFTAR PUSTAKA Allendorf FW, Luikart G. 2006. Conservation and the Genetics of Populations. Oxford (UK): Blackwell Publishing [Ditjennak Keswan] Direktorat Jenderal Peternakan dan Kesehatan Hewan. 2015. Statistik Peternakan dan Kesehatan Hewan 2015. Jakarta (ID): Direktorat Jenderal Peternakan dan Kesehatan Hewan Kementerian Pertanian RI. Hardjosubroto, W. 1994. Aplikasi Pemuliabiakan Ternak di Lapangan. Jakarta (ID): Gramedia Widiasarana Indonesia. Hartl DL, Clark AG. 1997. Priciples of Population Genetics. Ed ke-3. Sunderland (US): Sinauer Associate Inc. Javanmard A, Asadazadeh N, Banabazi MH, Tavakolian J. 2005. The allele and genotype frequencies of bovine pituitary specific transcription factor and leptin genes in Iranian cattle and buffalo populations using PCR-RFLP. J Iranian Biotechnol. 3: 104-108. Jin S, Chen S, Li H, Lu Y, Xu G, Yang N. 2014. Associations of polymorphisms in GHRL, GHSR, and IGF1r genes with feed efficiency in chickens. Molecular Bio Rep. 41(6):3973-3979. Legates, J. E and Warwick. 1990. Breeding and Improvement of Farm Animals. Ed ke-8. New York (US): McGraw-Hill Publising Company. Lei M, Peng X, Zhou M, Luo C, Nie Q, Zhang M. 2008. Polymorphisms of the IGF1R gene and their genetic effects on chicken early growth and carcass traits. BMC Genetic 9:70 Mardiningsih D, TM Rahayuning, W Roesali, DJ Sriyanto. 2004. Tingkat produktivitas dan faktor-faktor yang mempengaruhi tenaga kerja wanita pada peternakan ayam lokal intensif di Kecamatan Ampal Gading, Kabupaten Pemalang Jawa Tengah. Bogor (ID): Pusat Penelitian dan Pengembangan Peternakan. Prosiding Seminar Nasional Teknologi Peternakan dan Veteriner 2004. Buku II, hlm. 548−554.
13 Muladno. 2010. Teknologi Rekayasa Genetika. Ed ke-2. Bogor (ID): IPB Press. Nataamijaya AG. 2000. The native chicken of Indonesia. Bulletin Plasma Nutfah. 6 (1): 1-6. Nei M, Kumar S. 2000. Molecular Evolution and Phylogenetics. New York (US): Oxford Univ Pr. Nei M. 1987. Molecular Evolutionary Genetics. New York (US): Columbia University Press. pp 175-208 Noor RR. 2008. Genetika Ternak. Jakarta (ID): Penebar Swadaya. Sambrook J, Fritsch EF, Medrano JF. 1989. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. Ed ke-2. New York (US): Cold Spring Harbor Laboratory Pr. Tamzil HM, Noor RR, Hardjosworo PS, Manalu W, Sumantri C. 2013. Keragaman Gen heat shock protein 70 pada ayam kampung, ayam arab, dan ayam ras. J Vet. Vol 14 (3): 317-326. Viljoen GJ, Nel LH, Crowther JR. 2005. Molecular Diagnosis PCR Handbook. Netherlands (NL): Springer. Weir BS. 1996. Genetic Data Analysis II: Method for Discrete Population Genetic Data. Ed ke-2. Sunderland (GB): Sinauer. Yang F, Jin C, Dai G, Xie K, Yu Y, Wang J. 2012. Polymorphisms in exon 2 of IGF-IR gene and theirs association with production traits in jinghai yellow chicken. J Anim & Vet Advances. 11 (19): 3499-3505
14
LAMPIRAN 1
Sekuen Lengkap Gen IGF-IR (Nomor Akses Gen Bank: NC_006097)
LOCUS NC_006097 20435342 bp DNA linear CON 04-JAN-2016 DEFINITION Gallus gallus isolate RJF #256 breed Red Jungle fowl, inbred line UCD001 chromosome 10, Gallus_gallus-5.0, whole genome shotgun sequence. ACCESSION NC_006097 GPC_000002136 VERSION NC_006097.4 GI:966749122 DBLINK BioProject: PRJNA10808 BioSample: SAMN02981218 Assembly: GCF_000002315.4 KEYWORDS WGS; RefSeq. SOURCE Gallus gallus (chicken) ORGANISM Gallus gallus Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Archelosauria; Archosauria; Dinosauria; Saurischia; Theropoda; Coelurosauria; Aves; Neognathae; Galloanserae; Galliformes; Phasianidae; Phasianinae; Gallus. REFERENCE 1 (bases 1 to 20435342) CONSRTM International Chicken Genome Sequencing Consortium TITLE Sequence and comparative analysis of the chicken genome provide unique perspectives on vertebrate evolution JOURNAL Nature 432 (7018), 695-716 (2004) PUBMED 15592404 REMARK Erratum:[Nature. 2005 Feb 17;433(7027):777] COMMENT REFSEQ INFORMATION: The reference sequence is identical to CM000102.4. On Jan 4, 2016 this sequence version replaced gi:358485502. Assembly name: Gallus_gallus-5.0 The genomic sequence for this RefSeq record is from the whole-genome assembly released by the International Chicken Genome Consortium on 2015/12/16. The original whole-genome shotgun project has the accession AADN00000000.4. ##Genome-Assembly-Data-START## Assembly Provider :: International Chicken Genome Consortium Assembly Method :: MHAP/PBcR v. 8.2beta Assembly Name :: Gallus_gallus-5.0 Genome Coverage :: 70x Sequencing Technology :: Sanger; 454; Illumina; PacBio ##Genome-Assembly-Data-END##
15 ##Genome-Annotation-Data-START## Annotation Provider :: NCBI Annotation Status :: Full annotation Annotation Version :: Gallus gallus Annotation Release 103 Annotation Pipeline :: NCBI eukaryotic genome annotation pipeline Annotation Software Version :: 6.5 Annotation Method :: Best-placed RefSeq; Gnomon Features Annotated :: Gene; mRNA; CDS; ncRNA ##Genome-Annotation-Data-END## FEATURES Location/Qualifiers source 1..20435342 /organism="Gallus gallus" /mol_type="genomic DNA" /isolate="RJF #256" /db_xref="taxon:9031" /chromosome="10" /sex="female" /breed="Red Jungle fowl, inbred line UCD001" CONTIG join(gap(500000),NT_455918.1:1..132397,gap(unk100), NT_455919.1:1..46334,gap(unk100), complement(NW_003763853.2:1..6812165),gap(unk100), NT_455920.1:1..240307,gap(unk100),complement(NT_455921.1:1..53180) , gap(unk100),complement(NT_455922.1:1..877567),gap(unk100), complement(NT_455923.1:1..1667439),gap(unk100), NT_455924.1:1..4147156,gap(unk100), complement(NT_455925.1:1..5957997)) //
2
Pembuatan primer melalui primer designing (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)
tools
16
17 3
Blast primer melalui MEGA 6.06
4
Penentuan enzim restriksi (http://nc2.neb.com/NEBcutter2/)
melalui
NEBcutter V2.
18
19
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Muara Enim, Sumatera Selatan pada tanggal 6 Februari 1995 dan merupakan anak pertama dari dua bersaudara dari pasangan (Alm) Herkules dan Tini. Riwayat pendidikan penulis dimulai dari taman kanakkanak pada tahun 1999. Tahun 2000 sampai dengan tahun 2006, penulis menempuh pendidikan dasar di SDN 36 Lahat. Penulis melanjutkan pendidikan di SMP Negeri 1 Lawang Kidul selama tiga tahun, dan lulus pada tahun 2009. Selama tiga tahun berikutnya penulis melanjutkan pendidikan di SMA Negeri 1 Muara Enim dan lulus pada tahun 2012. Penulis mendaftar kuliah di Institut Pertanian Bogor melalui jalur undangan dan masuk di Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor.
