IDENTIFIKASI GLYCOGEN STORAGE DISEASE TIPE V PADA SAP1 FRIESIAN-HOLSTEIN DI JAWA - EALI
JAZIROTUL FITRIYATI
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHIJAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
IDENTIFIKASI GLYCOGEN STORAGE DISEASE TIPE V PADA SAP1 FRIESIAN-HOLSTEIN DI JAWA - BALI
JAZIROTUL FITRIYATI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperolel~gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
2009
ABSTRAK JAZIROTUL FITRIYATI. Identifikasi Glycogen Storage Disease Tipe V pada Sapi FriesianHolstein di Jawa - Bali. Dibimbing oleh ACHMAD FARAJALLAI-I dan R.R. DYAH PERWITASARI Glycogen storage disease (GSD) tipe V pada merupakan kelainan genetik autosomal resesif yang ditandai defisiensi enzim glikogen fosforilase. Glikogen fosforilase b e h n g s i untuk memecah glikogen menjadi glukosa yang dibutuhkan dalam pembentukan ATP. Pada sapi, defisiensi glikogen fosforilase disebabkau oleh substitusi basa C menjadi T pada kodon ke-489 gen PYGM (muscle glycogen pliosphoiylase). Snbtitusi ini mengubah penyandian asam amino dari Arginin (cgg) menjadi Triptofan (tgg). Sapi karier GSD tipe V dapat menyebarkan ale1 niutan ke dalam suatn populasi melalni inseminasi bnatan (IB). Sapi FH merupakan sapi perah yang paling banyak ditemakkan di Indonesia dan dikembangbiakkan melalui IB. Perlu dilakukan identifikasi GSD tipe V dengan teknik polynierase chain reactioii-restrictiori pagmerzt leiigth poly~norpliisnz (PCR-RFLP) untuk mencegah penggunaan individu karier GSD tipe V sebagai bibit unggul sapi FH. Sampel darah sebagai sumber DNA diambil dari 7 pusat penlbibitan pemerintab dan 10 petemakan rakyat di Jawa-Bali dengan total 826 sampel. Semua sampel berhasil diamplifikasi dan individu lieterozigot tidak ditemukan. Hasil ini dapat menjaniin bahwit spenna atau induk betina yang didatangkan dari Jawa-Bali bebas dari kelainan genetik GSD tipe V.
JAZIROTUL FITRIYATI. Identification of Glycogen Storage Disease Type V in FriesianI-Iolstein Cattle from Java-Bali. Supervised by ACHMAD FARAJALLAI-I dan R.R. DYAH PERWITASARI. Glycogen storage disease type V is known as autosomal rececive genetic defect, which is indicated by the glycogen phosphorylase deficiency in muscle. Glycogen phosphorylase deficiency in cattle caused by the substitution of C by T base in the 489th codon of PYGM (irluscle glycogen phosphorylase) gene; causing amino acid transformation from Arginin into Ttyptophan. Glycogen phosphorylase is responsible for the breakdown of glycogen into glucose that are needed to ATP syntesis. Glycogen storage disease type V carrier sires can cause the spreading of mutant allele through the population, which is usually done by artificial insemination (AI). Friesian-Holstein cattle is known as dairy cattle which is used A1 for breeding programme. Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) used to identify GSD type V. Blood samples as DNA source, were collected from seven government breeding centre dan ten local dairy farm through Java and Bali; with tbe total sample was 826. All samples were successfully amplified, however the heterozygote was not found. This result assured that male sperms or female cattles from Java and Bali breeding centre are free from GSD type V.
Judul : Identifikasi Glycogen Storage Disease Tipe V pada Sapi FriesianHolstein di Jawa - Bali Nama : Jazirotul Fitriyati NIM : G34051270
Menyetujui:
(Dr. Ir. Achnad Farajallah, M.Si) NIP. 19650427 199002 1 002
\
(Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari, M.Sc) NIP. 19860403 199003 2 001
Mengetahui:
4
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Psngetahual Alam Institut Pertalian Bogor
qasim, DEA 10328 198601 1 002 Tanggal lulus:
PRAKATA Alhamdulillali, puji syukur atas limpahan rahmat, karunia, dan Iiidayali-Nya yang diberikan oleli Allah SWT kepada penulis sehingga karya ilmiah yatig berjudul Ideutifikasi Mutasi Gen PYGM Penyebab Glycogeli Storage Disease Tipe V pada Sapi Friesian-Holstein (FM) di Jawa Bali Penulis ~iiengucapka~l teri~i~a kasili kepada Bapak Dr. Ir. Achniad Farajallal~,M.Si dan Ibu Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari, M.Sc selaku petnbimbing, yang telah nieniberikaii bantuati, pengarahan, bitlibingall kepada pennlis, dan telah menyediakan balxa11-bahaii kimia a~xalisis ~nolekulerrnelalui Program Kerjasama Keniitraan Penelitian Pertanian dengan Perguruan Tinggi (KKP3T) tahun 2008 dengan judul "Identifikasi beberapa defisiensi genetik pada sapi perah". Terinia kasih kepada Dr. Ir. Cece Sumantri, M.Agr.Sc yang telali niemberikaln sanipel darali sapi FA. Di sa~npingitu, penulis juga niengucapkan terima kasih kepada Wildan NM, Klioirul M, Nurkhabibah, E ~ y kA, Paskali PA, Ria A atas 1atiIiat1-latiha~i~~ya, Sylvia NP, Ikka E, Nur ACD, Gilang I-I, Indra, Diaz S, Kantlii AW dan Ruth MW yang selalu nienenlani d a ~memberi i seniangat. Ucapan terinia kasili juga kepada Erna I, I<usnatidar, Lydia UI-I, Restu M d a ~ seniua i keluarga besar zoologi, Biologi. Tidak lupa p e u ~ ~ lucapkan is kepada Sri MU, Amanda W, Kartika F, Teti M, Dorkas E, An~tiiarylisAP dati teman-tetnan Har~i~otiy 2. Terilna kasili juga kepada teman-teman Biologi angkatan 42 atas doanya. Terinia kasili kepada Ayah, Ibu, ICakak, Adik-adik dali selutuh keluarga yang selalu n~eniberidukungan, kasih sayang, doa, dan dorongan scmangat yang tiada lienti uiituk menjadikan perrulis lebili baik. Semoga k a ~ y ailniiah ini bernianfaat.
Bogor, Mei 2009
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 5 Januari 1988 di Kendal Jawa Tengah, putra dari Bapak Jazuri dan Ibu Sri Nuriyati. Penulis nienipaka~~ anak peltalna dari einpat bersaudara. Tal~uu1999 peuulis l~tlusdari MI Al-Khoiriyali I Semarang, tahun 2002 lulus dari Mts NU 20 I
DAFTAR IS1
DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR LAMPIRAN PENDAHULUAN
. 1
Tujuat~
BAHAN DAN METODE ......................................... . . . ............................................................. 1
Waktu dan Teiupat ..................... . . . ......... . . .................................................... 1 Metode ....................
. . . . ........................................................................
2
HASIL
3
PEMBAI-IASA
4
SIMPULAN DAN SARA
5
5 DAFTAR PUSTAKA
6 7
DAFTAR TABEL 1.
Hala~i~aii Teliipat peligainbilan satlipel darah sapi FH yalig diuji GSD tipe V... .......................... 2
2.
Hasil peneiituan genotipe dan frekueiisi ale1 GSD tipe V pada sampel sapi FH .............
4
DAPTAR GAMBAR
1.
Halaliia~i Ruiiutali nukleotida gen PYGM Bos to~a.usNo. Acc. GetlBalik NC- 007330 posisi 5914-6166 yailg diapit ole11 priliier AF72 dan AF73 ............................................ 3
2.
Visualisasi hasil a~l~pliiikasi gel1 PYGM dengan pewarnaan silver pada PAGE 6% ...........
3
3.
Visualisasi liasil petiiotoiigan alnplikon gel1 PYGM ~iienggunakaiie~lziliii-estriksi StyI.. ..
4
4.
Visualisasi liasil peliiotoligan Stj,I pada ainplikon d-loop lilitokolidria orangutan ..............
4
DAFTAR LAMPIIUN
1.
Alur peiiibelituka~lATP dari glikogen rnelijadi asaiii laktat
I-Iala~naii 8
~
PENDAHULUAN Kelainan ge~ietikadalah penyakit yang disebabkan oleh perubahan material genetik yang nienyebabkan pembahan fenotipe. Perubahaii material genetik ini biasa disebut dengall mutasi. Mutasi pada gen dapat dibedakaii metijadi dua, yaitu mutasi benilahla dan tiiutasi tak bennalcna. Mutasi berinakna ~ncnyebabkanperubahan struktur protein. Sebaliknya, tnutasi dan pe~iya~idian tak bei-tnaki~atidak mcnyebabkan pembahan struktur dan penyandian protein. Pada iiidividu diploid, terdapat sepasang kromosoln honiolog. Adaiiya kromoso~ilhomolog nie~nungkinkangen pada suahi kro~nosotii tiiengalami ~nutasinamun pasangail Ilotuolognya nornial atau disebnt dengall heterozigot. Jika ekspresi dari gel1 yang mengalatiii tnutasi ilii ~nengikutipola domiriai~-resesil Mendel, niaka individu noniial adalah individu-individu yang tidak ~uempu~iyai ale1 illutan (I-Iomozigot dotninan) maupuli individu heterozigot. Sedangkan individu yaiig iiienibawa ale1 mutan pada kedua kroniosoiii Iioi~iolognyadisebut honiozigot resesif. lndividu hoiiiozigot resesif kebanyakan letal. Individu heterozigot akan nienjadi pe~nbawa (karier) ale1 lnutan dalain suahi populasi (Healy 1996). Dalatn dunia pete~nakan, inse~ninasi buatan (IB) merupakati salah satu cara untuk lileiilpercepat penyebaran gen-gen penibawa sifat unggul. Pencegahan penggunaan individu karier sebagai bibit unggul dalani IB hams dihindari karena akan menyebarkan ale1 kelainan genetik ke dalam populasi (Mukhopadhyaya 2006). Penyebaran ale1 kelainan geiietik dapat dikendalikan melalui inanajenien pemuliaan berbasis inforniasi genetik. Itiformasi genetik bisa dipemleh dengan melakukan identifikasi molekuler. Kelebilian dari teknik molekuler ini antara lain dapat dilakukan langsung pada individu tanpa perlu menunggu gen terekspresi, bersifat non-invasive, dan proses yang relatif lebih cepat. Sapi Friesian-Holstein (FH) mempakan sapi perah yang banyak diternakkan di Indonesia. Beberapa identifikasi kelainan genetik pada sapi FH telali dilakukan ~nelalui teknik inolekuler (Tsujino et a/. 1996; Bilstrom et al. 1998; Johnstone et al. 2004;Citek el a/. 2006). Dari beberapa kelainan genetik pada sapi, identifikasi molekuler bovine leukocyte adllesion deficiency (BLAD) dan complex vertebral ma2founa-
tion (CVM) pada sapi FtI telah dilakukan di Indonesia (Muttaqin 2007; Ikhtiarini 2008). Kelaitiaii genetik lain yang terdapat pada sapi dan beluni pernah diide~itifikasi di Indonesia adalah glycogen stor.rrge disease (GSD) tipe V (citek ef nl. 2006). Glycogerl sforuge ~d.sense(GSD) tipe V (sindrom McArdle) merupakan suatu kelaiiian genetik yang bersifi~t autosornal resesif. Itidividu GSD tipe V nie~~gala~ni defisietisi cuzim glikogen fosforilase pada otot. Delisiensi iili disebabkan oleh adaiiya iilutasi pada gen PYGAf (r~~r~scle gljicogen phosphor:ylase) petiyandi glikogen fosforilase. Glikogen fosforilase berfungsi untuk mernecali glikogen menjadi glukosa (Lampirati 1). Dalani keadaa~idefosforilasi eiizim i~iinieiijadi inaktif (fosforilase b) sedaiigkail dalanl keadaan fosforilasi enziril i~iinie~ijadi aktif (fosForilase a). Penderita GSD tipe V ~iietiiilikifosforilase a yang inaktif sehingga glikogeii otot tidak dapat dipecali menjadi glukosa yatig dipcrluknli dalaiil si~itesis ATP. Gejala GSD tipe V pada nianusia ditandai dengan otot cepat me-ngalami kratn dan cepat lelah karena otot kekurangan energi uiltuk berkontraksi (DiMauro el (11. 2002). Glj~cogeri storage disease tipe V pertama [tali diteinukail pada mailusia pada tahun 1951 oleh Brian McArdle (Haller 2000). Pada tahun 1995, GSD tipe V diteniukan juga pada sapi Chamlais di Ainerika Serikat (Angelo ct a/. 1995). Glycoger~sforage rliseo.se tipe V pada sapi terjadi kareiia adanya substitusi basa C nie~ijadi T padn kodon ke-489 yang menyebabkan peiubahan asam aiilino dari arginin (egg) ~ilenjaditriptofan (tgg) (Tsujino et a/. 1996).
Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk niengidentifikasi ada~iya mutasi titik pada gen PYGM penyebab glycoger~storage disease tipe V pada sapi Friesian-Holstein (FH) di Jawa-Bali.
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Februari 2009 sainpai dengan Mei 2009 di bagian Fungsi Ilayati clan Perilaku Hewan Departenien Biologi, FMIPA IPB.
Ballall Baban yatlg digimakan berupa sampel darah sapi perah FH yang berasal dari litna lokasi pusat pen~hibitan pemerintah dan sepuluh lokasi peternakan sapi perah rakyat (Tabel 1). Tabel 1 Tetnpat penga~nbilansampel darah sapi FH yang diuji GSD tipe V Asal sampel Pusat Pembibitan Pen~erintnh: BBlB Singosari BIB Lernbang BPTU Baturraden BET Cipclang BPPT-SP Cikole ~
~
~
Junilah sampel
Tahun koleksi
32 30 97 57 SS
200a2 2008' 2002' 2005' 2005'
Jcnis kclaillin
~~~~~~~~~~~~~
8 8 c? 9 9
Pctc~.nnknnRnLyat: FAPET lPB PR. Ngantang PR. Boyolali I
-
I. Kolcksi Dr. Is. Ccce Sutnnnlti, M.Agr.Sc 2. Koleksi Dr. Ir. Dynh Petnvilasati, M.Sc. 3. Koleksi yang dilakukan dalou~pcnclitian ini Metode Sampel yang diatnbil sebagai snmber DNA adalah darah sapi. Pengambilan darah dilakukan dari vena kogsigealis di pangkal ekor bagian bawah (dekat anus) tnenggunakan tabung vakum (vacctrtainer) dengan jarum venoject. Darah yang diperoleh kenludian diawetkan dalam alkohol 95% satnpai dikerjakan lehih lanjut. Ekstraksi dan isolasi DNA (genom total) dari darah sapi meng-gunakan DNA Extrnction Kit for Fresh Blood (GeneAicl Canada ) yang dimodifikasi. Modifikasi dilakukan dengan cara membuang etanol dari darah dan pelisisan sel menggunakan proteinase-K. Alkohol pada sanlpel darah dibuang dengan cara menambalkan 1000 p1 akuades ke dalam 200 p1 sampel darah dalam tabung 1,5 ml. Selanjutnya sel darah dalam tabung tersebut disentrifugasi 5000 g selama 10 menit lalu supematan yang berisi akohol dan akuades dibuang. Proses ini
petnbuangan alkol~olini dilakukan dua kali agar sel-sel darah benar-benar bersih dari alkohol. Beberapa satnpel juga diekstraksi secara tnanual tnenggunakan metode Sa~nbrooket a/. (1989) yang telah dimodifikasi ole11 Farajallah et crl. (1998). Teknik ekstraksi DNA secara tnauual dilaki~katllerltadap sel-sel darah yang sudah bersih dari alkohol. Sel-sel darah disusnensikan dalaln buffer l x STE (salt 5M trisHCL 2M EDTA 0 2 M pr-I 8.0) salllpai volu~ne400 p1. Sel-sel darah kemudian dilisis menggunakan proteinase K 0,2 mg/ml datl sodium dodesil sulfat (SDS) 1%, lce,nudian diinkubasi pada si~hu55'C selatna 2 jam sa~ubildilcocok pelan. Molekul DNA dipisalkan dari haban organik laitmya dengan inetode fettol. Sel-sel darah yang sudah dilisis ditambaltka~lNaC:I 5M 40 p1-, fenol 400 p1 dan CIAA (klorofor~n:isoamilalkoI~ol = 24:l) 400 p1 l;~ludikocok pelan. Molekulmolekul DNA kemudian diendal~kandengan metlambahkan alkohol absolut sebatlyak dua kali volume darl NaCl 5M sebanyak 40 krl lalu diinkubasi dalam freezer tninitl~aldua jam. Molekul-molekul DNA yang mengendap dicuci menggunakan alkohol 70% sebanyak 40 p1 selanjutnya alkohol diuapkatl dalatn wadah vakum. Molelal-molekul DNA di-suspensikan d;~lamTE (Tris-I-ICI EDTA) SO?' 60pl da11 disimpan dala~n fieeier sampai dikerjakan lehih latljut. Anlplifikasi gen PYCiM dilakukan secara in idlro dengall teknik polj,n~ercrse chaiii reactioil (PCR). Pritner yang digunakan yaitu forlurlr-d primer AF72 5'CCAGGA- AGACCCTCATTCCA-3' dan reverse pt-imer AF73 5'-AGGGAAACACACACACAG-3'(Soethout et (11. 2002). Campuran untuk inengainplifikasi gen PYGM terdiri atas 10-100 ng sampel DNA, masingtnasing primer 1 pM, dNT'Ps 0,01 tnM, MgCI' 1pM, dait Tuq pulyinerrrse 1 unit beserta bufernya (NEB biolctbs, New Eilglni~dUSA). Campuran uutuk reaksi PCR dilakukan dalam volume total 25 pL menggunakan tabung 0,2 ml thirt wcrll. Reaksi PCR menggunakan tlzmm~dcycler- TaKaRa dilakukan dalam kondisi predenaturasi pada suhu 94'C selanla 5 tnenit. Dilailjutkan dengan 30 siklus denah~rasi94'C selatua 1 menit, penempelan pada suhu 58°C-6I0C selama 1 menit, pemanjangan 64'C selama 1 menit. Pemanjangan akbir dilakukan pada suhu 72°C selalna 1 tnenit. Target DNA hasil amplifikasi berukuran 252 bp (Tsujino et al. 2002).
Deteksi mutasi gen PYGM dapat dilakukan melaui teknik RLFP (restrictioit fragment length polymorphism) menggunakan enzim restriksi StyI (clc[dt][dtlgg). Berdasarkan Tsujino et a1. (1996), mutasi gen PYGM penyebab GSD tipe V terjadi pada kodon 489 karena substitusi basa C menjadi T. Substitusi ini menyebabkan pembahan asam amino dari arginin (egg) menjadi triptofan (tgg). Hasil amplifikasi sampel yang mengalami mutasi akan terpotong oleh enzim restriksi StyI karena terbentuk situs pemotongan StyI (Gambar 1) sedangkan sampel yang normal (homozigot dominan) tidak akan terpotong (Tsujino et al.2002). Enzim StyI yang tidak bekerja dapat memberikan hasil negatif untuk amplikon yang mengalami mutasi. Oleh karena itu, perlu dilakukan pengujian aktivitas enzim StyI untuk menjamin bahwa amplikon yang tidak terpotong benar-benar disebabkan tidak terjadi mutasi. Pengujian aktivitas enzim restriksi SryI dilakukan dengan memotong amplikon d-loop mitokondria orangutan (no. sampel 34 dan 35) milik Dr. Ir. R.R. Dyah Penvitasari M, Sc. Amplikon d-loop mitokondria orangutan ini bemkuran 538 bp dengan situs pemotongan Sty1 di dalamnya. Sty1 yang memiliki aktivitas baik akan memotong amplikon d-loop menjadi dua pita sepanjang 151 bp dan 387 bp. VisuaIisasi produk PCR dan hasil pemotongan dengan enzim Sty1 (cc[a/t][dtlgg) dilakukan menggunakan metode polyacrilmnide gel electrophoresis PAGE) 6% yang dijalankan pada tegangan 200 V selama 40 menit yang dilanjutkan dengan pewamaan sensitif perak menumt Tegelstrom (1986). Pada sampel normal (genotipe GG) hanya akan ditemukan pita sepanjang 252 bp. Pada sampel heterozigot karier (genotipe Gg) akan ditemukan tiga pita dengan panjang 252 bp, 133 bp dan 119 bp. Sedangkan sarnpel GSD tipe V (genotipe gg) akan ditemukan dua pita sepanjang 133 bp dan 119 bp. Frekuensi ale1 dihitung berdasarkan jumlah individu bergenotipe homozigot (GG dan gg) dan heterozigot karier (Gg) dengan menggunakan mmus berdasarkan Nei (1987):
Ketermgan: xi
= Gckuensi ole1 A:
ny
=jumlnh individu bcrgenotipc AiA, = jumlah individu bergmotipc AiAj =jumlnh total individu.
q n
5914 5944 5974 6004
gggagaagaccctcattccacaggggtgat
tgatgatcttctgaccctatcctgtagctt caaggacttctacgagctggagcctcataa
gttccagaataagaccaatgggatcacccc EC
6034 t ~ g g c g c t g g t t g g t g a t g t g t a a c c c t g i 6064 6095 6124 6154
?%?XI
gctggcagagatcattgctgaggtgagaag
tcgtggatggccagtagcggtcagcacaqt
cactgcaaggcgcagccaggtgcagctgtg tgtgtgtttccct
Ketermgan: Deretm nukleotidn dengnn lrunlf miring tehl menujukknn situs penempelan primer. EIunlf ymg digarishwahi menunjukknn situs pemotongei~Styl.
Gan~bar1. Runutan nukleotida gen PYGM Ros taurzts No. Acc GenBank NC-OO7330 posisi.5914-6166 yang diapit oleh primer AF72 dan AF73
Gen PYGM berllasil diamplifikasi dengan teknik PCR pada semua sampel. Cetakan DNA hasil ekstraksi kit dan manual keduanya menghasilkan amplikon berukuran sekitar 252 bp (Gambar 2). Identifikasi GSD tipe V pada sapi I'W di Jawa-Bali menunjukkan bahwa 100% amplikon tidak terpotong oleh Sty1 karena tetap berukuran 252 bp (Gambat 3). Semua sampel bergenotipe GG (homozigot dominan) (Tabel 2). Penlotongan amplikon D-loop mitokondria orangutan n~enggunakanenzim Sty1 menunjukkan amplikon sepanjang 538 bp terpotong menjadi dua bagian sepanjang 151 bp dan 387 bp (Gambar 4).
Ketemngnn: K = menggunakan cetakan DN.4 hail ekstraksi kit, M = menggumkan cetabn 13NA hosil clrshnksi manunl. 123, j22 dan setemsnyn = nomor satnpel, (-) = kontrol negatif, P = pennnda 100 bp
Gambar 2. Visualisasi hasil amplifikasi gen PYGM dengm pewarnaan silver pada PAGE 6%
Kolcmngan: Jl, j2 don seterusnyo = nornor sampol, P = pennndn 100 bp
Kcteran&an: P = pmnndn 100 bp, 34 don 35 = llonlor snmpcl
Gambar 3.Visualisasi hasil pemotongan amplikon gen PYGM menggunakan enzim restriksi Sty1
Gambar 4. Visualisasi hasil pemotongan Sty1 pada amplikon D-loop mitokondria orangutan.
Tabel 2 Hasil penentuan genotipe dan frekuensi ale1 GSD tipe V pada sampel sapi FH Asal sampel Pusat Pembibitan Pemerintah: BBIB Singosari BIB Lembang BPTU Baturraden BET Cipelang BPPT-SP Cikole
ni
n
32 30
32
97 57 88
97 57 88
Jenis Sapi Kelamin Heterozigot
30
d d
0 0 0 0
? ? ?
0
Peternakan Rakyat: FAPET IPB 17 17 ? PR Ngantang 47 47 ? PR. Boyolali 49 49 0 KPSBU Cilumber 98 98 ? KPSBU Pasar Kemis 95 95 ? PR. Pdk. Rangon 32 32 0 PR Lembang 34 34 ? KPS Bangli Boli 51 51 ? KPS Kunak Bogor 44 44 ?&$ KPBS Pen~dengan 55 55 ? ni: jumlah sampel, n: jumlah sampel teramplifikasi
PEMBAHASAN Gen PYGM bisa diamplifikasi dengan teknik PCR pada semua sampel yang meng~unakankit (Ger~eAidCanada)maupun manual menghasilkan amplikon herukuran 252 bp (Gambar 1). Dengan demikian, teknik ekstraksi DNA dengan kit dan manual berdasarkan Sambrook et al. (1989) menunjukkan hasil yang sama. Tingkat keberhasilan amplifikasi sangat dipengaruhi oleh kualitas DNA yang digunakan sebagai cetakan (Viljoen et 01. 2005). Kualitas DNA yang baik ditunjukkan oleh pita DNA yang tidak terfragmentasi dan tidak terkontaminasi oleh inhibitor polimerase. Beberapa kelebihan ekstraksi DNA mengynakan kit -
0
0 0 0
0 0 0 0 0 0
Sapi Homozigot dominan 32 30 97 57 88
Freknensi G 6 1
1 1 1
1
0 0 0 0 0
17 47
1
0
1
0
49 98 95
44
1 1 1 1 1 1 1
0 0 0 0 0 0 0
55
1
0
32 34
51
yaitu waktu kerja yang lebih singkat Hasil pemotongan menunjukkan bahwa semua amplikon tidak terpotong atau tetap berukuran 252 bp (Gambar 2). Amplikon yang tidak terpotong menunjukkan bahwa tidak terjadi subtitusi basa C menjadi T pada kodon 489 gen PYGM. Dengan demikian, 100% sampel yang diidentifikasi memiliki genotipe homozigot dominan (GG) sehingga frekuensi ale1 G sebesar 1 dan ale1 g sebesar 0 (Tabel 2). Citek e l al. (2006) juga melakukan pengujian GSD tipe V pada 111 induk sapi FII di Republik Ceko menunjukkan semua individu homozigot dominan. Ada kcmungkinan GSD tipe V merupakan kelainan genetik yang spesifik pada sapi Charolais. Hal ini didukung oleh penelitian sebelumnya yang menemukan
individu lieterozigot GSD tipe V Iianya pada sapi Cliarolais (Angelo el a/. 1995; Bilstroni eta/. 1998; Joluistone el a/. 2004). Pengujian aktivitas enzitn restriksi Sty1 perlu dilakukan untuk nienjatnin bahwa aniplikon gen PYGM yang tidak terpotong disebabkati oleh tidak adatuiya situs petnotonga~iStj,I. Pengujian aktivitas enzitii rcstriksi Sly1 dilakukan dengall petnotongan atiiplikon d-loop niitokondria orangutan niilik Dr. IT. R.R. Dyah Penvitasari M,Sc. Aniplikon d-loop orangutan 538 bp terpotong oleh Sty1 tlienjadi dua pita (387 bp dan 151 bn) (Gambar 3). Enzi~nrestriksi Sty1 tiiemiliki aktivitas yang baik. Teknik niolekuler lain yang dilakukan oleh O'Rourke el 01. (2006) tidak niembutuhkon pengujian aktivitas enzim StyI secara terpisah. Primer reverse yang digunakan disisipkan situs pelnotongan Stj11. U~utanpri~iier,for~vor.d 5-CCAGGAAGACCCTCATTCCA-3 dan primer reiwse 5-A,4TGKrCTCTGCCAGCCA&GG-3 dengan target anipliknli berukurao 166 bp. Ifunlf tebal pada prinler rever:ve disisipkati untuk nien~bentuksitus peniotoiigan S[yI baik pada aniplikon nornial atau niutan. A~nplikon nornial yalig dipotong dengan S I J ~aka11 menghasilkan pita yang lebih pendek dari amplikon awal sepanjang 147 bp. I-la1 itii terjadi karena 19 basa terakhir pada ijung 3OH j u g ikut terpotolig oleh Stjd sebagai akibat dari penyisipan situs pemotongan. Amplilcon inutan aka11 melnbeiituk dua situs penlotongan StyI dari liasil tnutasi pada kodon 489 dan penyisipan pada primer. Ole11 karcna itu, pemotongan an~plikonmutan ini akaii nienghasilkan dua pita sepanjang 120 bp dan 27 bp. Alel niutan penyebab GSD tipe V tidak ditelnukan pada semua sapi jantan FH dari balai pembibitan pelnerintah (BIB Lembang dan BBIB Singosari). Pemerintah iiiengatur sistem pemuliaan dalam peraturan nienteri pertanian nomer 55lPertnentanlOT. 1 4011012006 yang mengharuskan seluruh IB peternakan sapi FH yang ada di Indonesia n~enggnnakan sumber spernia dari BIB Lembang dan BBIB Singosari (www.di ~
.,
\
snak.jabarprov.go.id/data/arsiplGBPPSapi-P erah.pdf [02-03-09]). Hal ini nienjamin bahwa dalam beberapa tahun ke depan sapi FH di Indonesia akan bebas kelainan genetik GSD tipe V. Speniia asal BBIB Singosari yang digunakan oleh petemakan sapi perah di Kunak Bogor dan Bangli Bali menghasilkan ketnrunan yang bebas GSD tipe V.
Demikian juga sapi betina di KPBS (koperasi petertiakan batidinig selatan) Pengalengaii l~asilIB metiggunakan spertna asal BIB Le~nbang bebas GSD tipe V. Inforniasi bebas GSD tipe V pada sapi ja~itan dan betilia di Jawa-Bali lebih tiielnpertegas bahwa peluang kejadian GSD tipe V di Indonesia sangat kecil. Manajenieli petiiuliaan rnendatatig dapat difokuskan pada deleksi bebas GSD tipe V hanya pada pejantan yang diinipor saja. Langkah tersebut dirasa paling eiisien untuk niencegah adanya kelainan genetik GSD tipe V di Indonesia. I-Ial ini didasarkan pada perkawinan jantan nortnal dan betilia karier tidak berpeluang menghasilkan keturunan holnozigot resesif. Oleh karena itu, deteksi diiii GSD tipo V pada sapi betilia yang aka11 diimpor Lidz~k pcrlu dilakukan biaya karena ],ena~iibahan untuk ~ne~igurangi jenis sertifikasi. Deteksi dini GSD tipe V pada pejantan ilnpor dapat dilalcukan secara niat~diri oleh balai-balai penibibitan sapi perah di Indonesia dengan niengikuti protokol pada penelitian ini.
SINIPULAN DAN SARAN Sinipulan Gen PYGIVI berliasil diatiiplifikasi detigati teknik PCR pada seniua salnpel yang tnaupun diekstraksi secara manual menggunakan kit. Deteksi mutasi dilakukan dengan lnetiggunakan teknik PCR-RFLP nienggunakan enzini restriksi Sty I. Seniua sampel yang diuji tidak ~nengalaniiniutasi. Seniua sanipel metniliki genotipe Iiomozigot doniinali (GG) atau nornial seliingga frekuensi ale1 G sebesar 1 dan ale1 g sebesar 0. Alel lnutan pada gen PYGM penyebab GSD tipe V tidak diteniukan pada sapi FI-I di Jawa-Bali. Saran Balai-balai penibibitan sapi FH di Indonesia diharapkan dapat melakukan identifkasi GSD tipe V rnenggunakan protokol pada penelitien ini. Identifikasi kelainan genetik GSD tipe V juga perlu dilakukan pada sapi jenis lain di Indonesia ' untuk menjatiiin bahwa penyakit tersebut tidak terdapat pada sapi selain FH.
DAFTAR PUSTAICA Angelo S et (11. 1995. Myophospholylase deficiency associated with rhabdomyolysis and exercise intolerance in 6 related Charolais cattle. M~rscleNeiw 18(7):736-40. Bilstron~JA et 01. 1998. Genetic test for ~i~yopliosphorylasedeficiency in Charolais cattle. Ar?i J Vet Res 59(3):267-70. Citek J, Rehout V, Hajkova J, Pavkova. 2006. Monitoring of the genetic health of cattle in the Czech Reoublic. Vet Med 5116): . . 333-339. DiMauro S, Andreu AL, Bruno C, Hadjigeorgiou GM. 2002. Myopliospliorylase deficiency (glycogenosis type V; McArdle's disease). Ct~rrMol Med. 2(2):18996. Farajallah A, Su~yobrotoB, Takenaka 0. 1998. Nucleotide Sequence of Whole Mitocl~ondrial DNA of a Soft-shelled Turtle, Dogania, and PCR RFLP Analyses of Cvtoclwonie b Gene. Proceedine- of The Tokyo International Forutn on Conservation and Sustainable Use of Tropical Bioresource. New Energy and Industrial Technology Developnlent Organization (NEDO) and Japan Bioindustry Association (JBA). Haller, R. G. (2000). Treat~nentof McArdle's disease. Archives of Neurvlogy 57:923-924. Healy PJ. 1996. Testing Tor undesireble traits in cattle: An Australian perspective. JAniin Sci 74:917-922. Ikhtiarini E. 2008. Identifikasi Defisiensi genetik Corilplex Vertebral Malformation pada sapi Friesian-Holstein [skripsi]. Bogor: FMIPA Institut Pertanian Bogor Johnstone AC et al. 2004. Myophosphorylase deficiency (glycogen storage disease Type V) in a herd of Charolais cattle in New Zealand: confirmation by PCR-RFLP testing. N Z Vet J 52(6):404-8. Mukhopadhyaya PN, Jha M, Muraleedharan P, Ralhod RN. 2006. Simulation of normal, canier and affected controls for large-scale genotyping of cattle for factor XI deficiency. Genet Mol Res 5 (2):323-332.
Muttaqin WN. 2007. Frekuensi Ale1 CD-18 Pada Sapi FH di Peternaka11Rakyat dan BPTU Bt~turraden [skripsi]. Bogor: FMIPA, lnstitut Pertanian Bogor. Nei M. 1987. iMolecrrlcrr Evohrtioirary Genetic.?. New York : Columbia University Press. O'Iiourke BA, Dennis JA, Healy PI. 2006. Internal restriclion sites: quality assurance aids in genotyping. J Vei Dirrgri hn-e.st 18:195-197. Sanlbrook J, Fritsch EF, Maniatis T.1989. Molectrlrrr clorliilg: A Laborrrtoiy iMrrn~ra1.Ed ke-8. New York: Cold Spring Harbor Lahorato~yPress. Soethout EC et rrl. 2002. A direct Sty1 polynierase chain reaction-restriction fragment length polymorpl~ism (PCR-RFLP) test for the mnyophospborylase niutation in cattle. J Vet k c t 49(6):289-290. Tegelstrorn H. 1986. Mitocl~onclrialDNA in natural populations: An improved routine for the screening of genetic variation based on sensitive silver staining. Elec~ophoresis 7:226-
.
779 --,
Tsujino S et 01. 2002. Cloning of bovine niuscle glycogen pllospliotylase cDNA and identification of a niutation in cattle with myophospholylase deficiency, an aninla1 nlodel for McArdle's disease. Eli> Sci 6:19-26. Tsujino S, Shanske S, DiMauro S. 1996. Molecular genetic heterogeneity of ~~~yophospl~oryl;~se deficiency (McArdle's disease). .l iWerliciiie 329: 241-245. Viljoen GJ et 01. 2005. ilfolec~rlurDic~g~zostic PCR fIaridbook. Netherlands: Springer. Walker KR. 2001. Chal-acterisation of the ovine model of nlcardle's disease: development of therapeutic strategies [tesis]. Perth: Department of Veterinary Biology and Biomedical Sciences, Murdoch University.
LAMPIRAN
Lan~piran1 Alur pernbeiltulcail ATP dari glikogeil inelljadi asaim laktat. Angka rolnawi menul~jukkantipe GSD
('Walker2001)
