Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství
Identifikace silic u vybraných druhů léčivých, aromatických a kořeninových rostlin Bakalářská práce
Vedoucí práce: Ing. Blanka Kocourková, CSc.
Vypracoval: Pavel Vrtílek, DiS.
Brno 2011
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Identifikace silic u vybraných druhů léčivých, aromatických a kořeninových rostlin vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. Bakalářská práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.
dne…………………………………………...……. podpis zpracovatele …………………………...…..
PODĚKOVÁNÍ Paní Ing. Blance Kocourkové, CSc. a Ing. Jitce Fojtkové, Ph.D. za cenné rady, odborné materiály, za spolupráci při samotném měření a pomoci při zpracování této bakalářské práce. Dále bych chtěl poděkovat své rodině za psychickou podporu při psaní.
ANOTACE Silice jsou produkty sekundárního metabolismu rostlin, různého chemického složení. Uplatňují se, jak v potravinářství, tak ve farmacii. Obsah silice v droze představuje kvalitativní jakostní požadavek pro jejich další užití. V práci jsou popsány techniky izolace (extrakce v Soxhletově extraktoru, organickými rozpouštědly, SFE, ASE, MAE, SPME, SDME, LPME, enfleuráž, destilace s vodní parou, lisování) a stanovení složení obsahu silic ze siličných rostlin (GC, HPLC, TLC). Z nichž jedinou oficiálně uznávanou v ISO normě a v Českém lékopisu je destilace s vodní parou. Experimentálně byl sledován obsah karvonu a limonenu v kmínové silici na odrůdách kmínu kořenného REKORD, PROCHAN, KEPRON. Vzorky kmínu se separovaly pomocí destilace s vodní parou a superkritické fluidní extrakce s následnou identifikací plynovou chromatografií
s plamenově ionizačním
detektorem.
Obě metody vykazovaly
srovnatelné výsledky. Klíčová slova: extrakce, destilace s vodní parou, plynová chromatografie, kmín
ANNOTATION Essential oils are products of secondary metabolism of plants, products of different chemical composition. They are used both in food and in pharmaceutical industry. The essential oil content in the drug represents a qualitative requirement for further use. The paper describes the techniques of isolation (extraction in Soxhlet extractor, organic solvents, SFE, ASE, MAE, SPME, SDME, LPME, enfleurage, steam distillation, pressing) and determination of the composition of essential oil content of proper plants (GC, HPLC, TLC), of which only steam distillation is officially recognized in the ISO standard and the Czech Pharmacopoeia. Practically, the content of the carvone and limonene in caraway essential oil in caraway varieties RECORD, PROCHAN, KEPRON was monitored. Samples with caraway were subjected to separation by the steam distillation and supercritical fluid extraction and subsequent identification by gas chromatography with flame ionization detector. Both methods showed comparable results. Key words: extraction, steam distillation, gas chromatography, caraway
OBSAH 1
ÚVOD................................................................................................................... 9
2
CÍL PRÁCE ...................................................................................................... 10
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED ................................................................................. 11 3.1
VLASTNOSTI SILIC ............................................................................................ 11
3.2
CHEMICKÉ SLOŽENÍ SILIC ................................................................................. 12
3.3
VÝSKYT SILIC .................................................................................................. 12
3.4
POUŽITÍ SILIČNÝCH DROG A SILIC .................................................................... 13
3.5
ROZDĚLENÍ SILIC ............................................................................................. 14
3.5.1
Silice tvořené převážně deriváty fenylpropanu........................................... 14
3.5.2
Silice tvořené převážně acyklickými monoterpeny ..................................... 15
3.5.3
Silice tvořené převážně monocyklickými monoterpeny .............................. 16
3.5.4
Silice tvořené převážně bicyklickými monoterpeny .................................... 17
3.5.5
Silice tvořené převážně seskviterpeny......................................................... 17
3.5.5.1
Azulenogenní seskviterpeny ............................................................... 18
3.5.5.2
Jiné seskviterpeny ............................................................................... 19
3.6
OBVYKLÉ METODY SEPARACE TERPENŮ A SILIC............................................... 19
3.6.1
Destilace s vodní parou .............................................................................. 19
3.6.2
Lisování....................................................................................................... 20
3.6.3
Extrakce ...................................................................................................... 20
3.6.4
Extrakce tuky neboli enfleuráž.................................................................... 21
3.6.5
Extrakce organickými rozpouštědly............................................................ 21
3.6.6
Extrakce v Soxhletově extraktoru ............................................................... 21
3.6.7
Nadkritická fluidní extrakce (SFE) ............................................................. 22
3.6.8
Extrakce rozpouštědlem za zvýšeného tlaku a teploty (PSE)...................... 27
3.6.9
Mikrovlnná rozpouštědlová extrakce (MAE, MWAE) ................................ 28
3.6.10
Mikroextrakce na tuhé fázi (SPME)........................................................ 29
3.6.11
Mikroextrakce kapalnou fází (LPME) spojená s hydrodifúzí ................. 31
3.6.12
Mikroextrakce jednou kapkou (SDME) .................................................. 31
3.7
OBVYKLÉ METODY STANOVENÍ SLOŽENÍ OBSAHU SILIC ................................... 32
3.7.1
Chromatografické metody........................................................................... 32
3.7.2
Plynová chromatografie (GC) .................................................................... 33
3.7.3
Chromatografie na tenké vrstvě (TLC)....................................................... 34
3.7.4
Vysoceúčinná kapalinová chromatografie (HPLC).................................... 34
4
METODIKA...................................................................................................... 36 4.1
DESTILACE S VODNÍ PAROU.............................................................................. 36
4.2
SUPERKRITICKÁ FLUIDNÍ EXTRAKCE (SFE)...................................................... 37
4.3
IDENTIFIKACE – GC/FID ................................................................................. 37
5
VÝSLEDKY A DISKUSE................................................................................ 38
6
ZÁVĚR .............................................................................................................. 39
7
SEZNAM POUŽITÉ A CITOVANÉ LITERATURY .................................. 40
8
SEZNAM OBRÁZKŮ ...................................................................................... 45
9
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK ............................................................. 46
10
PŘÍLOHY...................................................................................................... 47
1
ÚVOD
V dnešní uspěchané době je každý z nás ovlivňován různými civilizačními faktory. Ať se jedná o zhoršené životní prostředí, stres nebo civilizační choroby. Proto se hledají účinné prostředky, které by zlepšily, zmírnily a zharmonizovaly naše fyzické a psychické zdraví. Obracíme se proto k samotné matičce přírodě, z níž čerpáme přírodní produkty. K těm patří i léčivé rostliny a jejich produkty látkové přeměny, jako jsou silice. Vonné produkty přírodního charakteru odjakživa sloužily k podpoře dobrého zdravotního stavu, včetně psychického. Užívaly se vonné látky, jak živočišné, tak z rostlinné říše pro stimulaci dobrých pocitů, nálady a optimismu. Věda, jež je součástí alopatické medicíny, zabývající se využíváním vonných a těkajících látek, jejichž součástí jsou přírodní a syntetické rostlinné silice, se nazývá aromaterapie. V alopatické medicíně bez novodobého atributu aromaterapie slouží silice jako doplněk, pomocná látka či účinná složka vybraných léčiv nebo jsou součástí naší každodenní kuchyně jako koření (JURIČ, 2003). Každou silici lze charakterizovat dle barvy, vůně a koncentrace obsahových látek. Jde o složité organické sloučeniny, které se izolují destilací s vodní parou, lisováním, extrakcí
s
následnou
separací
pomocí
plynové,
kapalinové
a
tenkovrstvé
chromatografie. V rostlinách působí kromě silic na lidský organismus pozitivně i další složky, z nichž můžeme jmenovat např. alkaloidy, hořčiny, saponiny, třísloviny, vitamíny, minerály. Jak už bylo řečeno, získávají se z rostlinných materiálů nejčastěji destilací s vodní parou, která je oficiální metodou uvedenou v Českém lékopisu. Tato metoda však není moc šetrná, je zdlouhavá a vyžaduje větší množství vzorku, i organického rozpouštědla, což má nepříznivý vliv na cenu a čas. Čím dál tím více se začínají prosazovat extrakční metody a specifické mikroextrakční techniky, které pracují s menší navážkou vzorku a spotřebou rozpouštědla než klasické extrakce. Navíc umožňují rychlejší separaci silice. Následně je provedeno analytické stanovení obsahu, kde se nejvíce využívá plynová chromatografie s plamenově ionizačním a hmotnostním detektorem, avšak lze využít i další možné alternativy.
9
2
CÍL PRÁCE
Cílem bakalářské práce je prostudování dostupné literatury, která se týká metod izolace a stanovení složení silic známých siličnatých druhů léčivých rostlin. V laboratoři ústavu stanovit obsah silic ze vzorků druhů, které probíhají pod garancí vedoucí práce (kmín kořenný, koriandr setý, heřmánek lékařský, perila křovitá) pomocí destilace s vodní parou podle platného Českého lékopisu nebo ISO normy. U kmínu použít i superkritickou fluidní extrakci a ve spolupráci s Ústavem chemie a biochemie identifikovat složení kmínové silice.
10
3
LITERÁRNÍ PŘEHLED
Éterické oleje, těkavé oleje či olea aetherea nazýváme rostlinné silice, tedy vonné složky, které jsou obsaženy v různých částech tzv. siličnatých rostlin (kořenech, listech, plodech, květech atd.). Jde o produkty sekundárního metabolismu rostlin (HAY, 1993). Silice lze izolovat z rostlinného materiálu různými metodami. Nejrozšířenější je parní destilace neboli destilace s vodní parou. Známe i oleje z citrusových plodů, které se získávají lisováním za studena (LZS) nebo odstřeďováním. Rostlinný materiál se rozmělní a mechanicky lisuje. Tím se získá malé množství oleje v nejvyšší kvalitě (HÁDEK, 2006). Působením světla se často rozkládají, proto se uchovávají v dobře uzavřených lahvičkách z tmavého skla, aby byla zajištěna jejich ochrana před denním světlem a UV zářením. Zároveň se jedná o těkavé látky, které se skladují v uzavřených nádobách za nízkých teplot. Z chemického hlediska jde o velmi složité směsi, skládající se z jednotlivých biosubstancí – terpenů, nejrůznějších alkoholů, esterů, fenolů, aldehydů, ketonů a mnoha dalších složek. Tyto látky komplexně vytvářejí éterický olej a ovlivňují svým biochemickým složením organizmus člověka (TOMKO, 1999).
3.1 Vlastnosti silic Z technologického hlediska a na základě jejich fyzikálních vlastností je lze definovat jako lipofilní těkavé látky organického původu, charakteristického zápachu a vůně (mátová silice), světlolomné (index lomu), opticky aktivní, hustoty obvykle nižší než voda (MELICHAROVÁ & POTRUSILOVÁ, 1993). Ve vodě jsou nerozpustné a s vodou nemísitelné. Dobře rozpustné jsou v organických rozpouštědlech (líh, chloroform, hexan, aceton). Charakteristickým znakem je také rozpustnost v lihu určité koncentrace, kdy Český lékopis uvádí pro každou silici poměr a koncentraci lihu, při němž se musí čiře rozpustit (ČESKÝ LÉKOPIS, 2009). Většina éterických olejů je téměř bezbarvá. Některé oleje se však vyskytují v různých barevných odstínech. K modrým například patří heřmánek nebo řebříček, k rudým
pomeranč,
k rezavým
jasmín
(HÁDEK,
2006).
Heřmánková
silice
je po destilaci s vodní parou modrá, ale po extrakci např. superkritickou fluidní extrakcí je žlutá.
11
Čistotu silice znehodnocují polymerační a oxidační produkty při špatném uchovávání, přítomné stopy vody, olejů, těžkých kovů a cizích silic. Beze zbytku by měly vytěkat. Tmavnutí a pryskyřičnatění silic je způsobeno světlem, vzdušnou vlhkostí, teplem nebo oxidací vzdušným kyslíkem, kdy se mění barva a jejich vůně. Syntetizují se ve speciálních sekrečních buňkách (siličných kanálcích, trichomy) v různých orgánech rostlin (na povrchu květů, uvnitř plodů, semen, na listech, v nati) (HAY, 1993).
3.2 Chemické složení silic Terpeny, obvykle extrahované z rostlinných materiálů, jsou výrazně vonící těkavé látky (TOMKO,1999; VACEK,1995). Základem struktury terpenů je uhlovodík izopren. V přírodě se samostatně nevyskytuje, běžně však nacházíme jeho polymery, terpenické uhlovodíky a jejich kyslíkaté deriváty. Terpeny rozdělujeme podle počtu uhlíkových atomů na monoterpeny (C10), seskviterpeny (C15), diterpeny (C20), triterpeny (C30), tetraterpeny (C40) a polyterpeny (PAVEL, 1989). Některé ze složek silice jsou zastoupeny ve více rostlinách, např. (+)-limonen byl nalezen v pomerančové, citrónové a kmínové silici. (-)-limonen je obsažen v silici ze smrkového a jedlového jehličí. α-pinen je zase nejdůležitějším uhlovodíkem terpentýnové silice a spolu s β-pinenem tvoří základ terpentýnového oleje. Citronelol je obsažen v růžové a geraniové silici. Hlavní složkou růžového oleje je geraniol. Mentol je dominantní terpenoid máty peprné (ŠKÁRKA et al., 1987). Pro své antiseptické vlastnosti se přidává do zubní pasty. Řada seskviterpenů má zase funkci bioregulátorů, feromonů a kancerostatik (VACEK, 1995). Existují silice, u nichž převládá jediná vonná složka, např. hřebíčková, která je až z 90 % složena z eugenolu. Ve většině případů jde však o směs různých látek, které se podílí na vůni. Jejich struktura je po chemické stránce velice pestrá. Jsou tvořeny uhlovodíky, alkoholy, aldehydy, ketony, estery, oxidy a fenoly.
3.3 Výskyt silic Silice se v přírodě vyskytují v mnoha čeledích zejména v Pinaceae, Lauraceae, Myrtaceae, Geraniaceae, Rutaceae, Apiaceae, Lamiaceae, Asteraceae, Iridaceae, Zingiberaceae (MINAŘÍK et al., 1979). Vyskytují se v různých částech rostlin: v květech, plodech, listech, nati, kůře, oplodí i kořenech. Ukládají se v žláznatých chlupech, papilách, žláznatých buňkách, nádržkách, kanálcích a mezibuněčných 12
prostorách, odkud se při rozrušení rostlinných orgánů uvolňují. Silice se vyskytují v rostlinných materiálech jak čerstvých, tak sušených. Sbírá se květ, plod, list, stonek, nať, kořen, kůra nebo celá rostlina. Jednotlivé části rostliny se sbírají v době, kdy obsah účinných látek je co nejvyšší. Plody se sbírají obvykle na podzim a byliny na jaře. Na obsah účinných složek má vliv lokalita, vláha, roční období, délka dne, odrůda, hnojení, ochrana a celá řada dalších faktorů (SEDLÁKOVÁ, 2003).
3.4 Použití siličných drog a silic Jejich použití je velice široké. Uplatňují se jednak v potravinářství, v kosmetickém průmyslu, ve farmacii a nalezneme je v každé domácnosti. Při vnitřním podání silice dráždí i chuťové a čichové receptory sliznic zažívacího traktu, čímž zvyšují tvorbu zažívacích šťáv a zlepšují trávení. Potravinářský průmysl využívá siličné rostliny jako koření, v nápojích a jako ochucovadla pokrmů. Citrusové silice (látky myrcen, limonen), silice z černého čaje (bergamot) a řada dalších slouží k přípravě
nápojů
nealkoholických,
tak
alkoholických
(UHLÍŘOVÁ,
2008).
K ochucování pokrmů se využívají často i silice česnekové a hořčičné, obsahující alifatické sirné sloučeniny (izothiokyanáty u hořčice, dialyldisulfidy u česneku) (MINAŘÍK et al., 1979). Siličné drogy se používají v potravinářské technologii i při výrobě aromat (VOLDŘICH, 2009). Farmacie využívá silice pro přípravu léčiv a doplňků stravy. Ze silice izolovaný mentol, kafr, terpentýnová silice, jalovcová silice, levandule, rozmarýn mají dráždivý i prokrvující účinek na pokožku, tak derivační účinek, kdy bolest rozptylují či odvádějí. Protizánětlivě působí heřmánek, řebříček a šalvěj. Pro podporu a regulaci trávení nebo jako léčivo odstraňující plynatost můžeme použít např. silice majoránky, fenyklu, kmínu, koriandru, hřebíčku, skořice, muškátu, máty peprné, tak i oplodí citrusů, hlavně z pomerančovníku hořkého. Rozdělení do terapeutických skupin: - dráždidla kůže (obsahují více karvakrolu, cineolu, citronelalu, pinenu a limonenu, vyvolávají zčervenání a pocit tepla, Oleum terebithinae, Oleum galtheriae, Oleum rosmarini, Kafr, Tymol, součástí mastí a liniment proti revmatickým a neuralgickým bolestem); - antiflogistika (Oleum chamomilae a jeho obsahové látky, např. β-farnesen, chamazulen);
13
- expectorancia (k inhalaci se používá Oleum pini pulmilionis, Oleum eucalypti, Oleum menthae piperitae, perorálně: Herba a extrakt thymi, Fructus a oleum foeniculi, Fructus a oleum anisi, taky mají antiseptické působení); - stomachika aromatika, karminativa (Menthae folium, Origani herba, Carvi fructus, Anisi fructus, Foeniculi a Coriandri fructus, Curcumae radix); - diuretika (Juniperi fructus a oleum, Levistici radix, Petroselini fructus, pozor na toxické dávky, které způsobují anurii); - emenagoga a abortiva (apiol, Myristicae semen, Caryophylli flos, Crocus, Lauri folium, Cinnamomi cortex, toxické dávky, ale způsobují záněty v pánevních orgánech a GIT – jsou životu nebezpečné); - antiseptika, desinficiencia, antiparasitika (drogy obsahující karvakrol, cineol, thymol, eugenol); - anthelminthika (Chenopodii oleum, askaridol, santhonin, thymol); - insekticida (rod Chysanthemum); - repelenty (Cassiae oleum, kafr, Therebinthinae oleum, Cinnamomi oleum, Menthae oleum, Citronellae oleum) (TOMKO, 1999).
3.5 Rozdělení silic 3.5.1 Silice tvořené převážně deriváty fenylpropanu Nejvýznamnější sloučeniny tohoto typu jsou skořicový aldehyd, hlavní složka silice skořicové, eugenol silice hřebíčkové, anetol, anýzový aldehyd a fenikulin silice anýzové a fenyklové, asaron silice puškvorcové a apiol silice petrželové. Eugenol a anetol mají výrazné antiseptické účinky. Anetol může být výchozí látkou k syntéze některých důležitých léčiv nebo estrogenně účinného dietylstilbestrolu. Skořicová silice je slabě žlutá tekutina skořicové vůně. Získává se z usušené kůry stromu skořicovníku ceylonského (Cinnamomum ceylanicum), která obsahuje až 2 % silice tvořené až 75 % skořicového aldehydu, až 8 % eugenolu a terpenických látek. Kůra musí obsahovat nejméně 65 % skořicového aldehydu. Používá se jako stomachikum a dochucovadlo. Hřebíčková silice se získává z usušených květních poupat stromu hřebíčkovce kořenného (Jambosa caryophyllus). Droga obsahuje až 20 % silice, z níž až 95 % ji tvoří eugenol, dále karyofylen a aceteugenol. Silice se užívá jako antiseptikum dutiny ústní ve formě ústních vod a droga jako koření.
14
Anýzová silice je bezbarvá nebo nažloutlá světlolomná tekutina nebo krystalická hmota nasládlé chuti. Získává se destilací usušeného zralého plodu dvounažky bedrníku anýzu neboli anýzu obecného (Pimpinella anisum). Obsahuje až 5 % silice, z nichž až 90 % je zastoupen anetol. Droga musí obsahovat nejméně 1,5 % silice. Silice i droga se užívá jako karminativum, stomachikum a expektorans se spasmolytickým účinkem. Fenyklová silice je bezbarvá nebo nažloutlá, nasládle aromatické, později hořké chuti. Získává se z usušených zralých plodů nažek jednoleté a vytrvalé byliny fenyklu obecného (Foeniculum vulgare). Až 6 % silice obsahují plody, z nichž až 60 % je zastoupen anetol. Dále ji tvoří fenikulin, karyofylen, fenchon, α-pinen. Fenykl se užívá jako karminativum, laktagogum, expektorans, v likérnictví a v potravinářství jako koření. Droga musí obsahovat nejméně 3 % silice. Z usušeného kořene dvouleté byliny petržele kadeřavé (Petroselinum crispum) se získává až 0,3 % silice, která je tvořena až z 80 % apiolem, dále myristicinem a flavonovým glykosidem apiinem. Musí obsahovat alespoň 0,1 % silice. Droga se užívá jako diuretikum, protože dráždí ledviny a dělohu, ale nejčastěji se spotřebovává jako zelenina do polévek a salátů. Usušený oddenek puškvorce obecného (Acorus calamus) obsahuje až 4 % silice tvořené převážně asaronem, některé variety obsahují i terpeny (geranylacetát, geraniol). Oddenek obsahuje i hořčiny a třísloviny, které mají pozitivní účinek na zažívání. 3.5.2 Silice tvořené převážně acyklickými monoterpeny Z těchto látek se v silicích nejčastěji vyskytují bezkyslíkaté myrcen, ocimen, alkoholy linalool, geraniol, citronelol a nerol, aldehydy citral a citronelal. Látky tohoto typu jsou hlavními složkami silice geraniové, citronelové, levandulové, koriandrové, meduňkové a kosatcové. Mají příjemnou vůni, a proto se používají nejčastěji jako korigencia vůně. Geraniol má i výrazný anthelmintický účinek. Linalool a geraniol jsou výchozími látkami pro přípravu citralu, vhodného pro výrobu vitaminu A. Citronelal slouží k syntéze mentolu. Citronelol je dobré antioxidans a antiseptikum v zubním lékařství. Citronelová silice se získává destilací trav z rodu Cymbopogon. Je bezbarvá nebo nažloutlá s charakteristickým citrónovým zápachem a aromatickou chutí. Silice je součástí derivačních, karminativních a stomachických přípravků. Z různých druhů pelargónií se získává bezbarvá, nazelenalá nebo nažloutlá tekutina příjemné růžové vůně, neboli geraniová silice.
15
Z levandulových květů levandule lékařské (Levandula officinalis), která obsahuje až 3 % silice, se izoluje levandulová silice. Má dobré derivační účinky, zvláště antirevmatické. Z usušených zralých plodů koriandru setého (Coriandrum sativum) se získává koriandrová silice, která obsahuje až 70 % linaloolu, geraniol, p-cymen, felandren. Má dobrý karminativní účinek a používá se jako koření. 3.5.3 Silice tvořené převážně monocyklickými monoterpeny Patří sem např. bezkyslíkaté p-mentan, limonen citrusových silic, α-terpinen, p-cymen, alkoholy a fenoly mentol silice mátové, a-terpineol, karvakrol a tymol silice tymiánové, ketony menton, karvon silice kmínové, diosfenol listů buko, oxidy a peroxidy mentofuran, cineol eukalyptové silice, askaridol silice merlíkové. Některé z nich mají dobré anthelmintické účinky (cineol, mentol, askaridol, p-cymen, tymol, karvakrol). Mentol dráždí kůži a sliznici, zejména nervová zakončení vnímající chlad, a vyvolává proto chladivý pocit. Je dobrým antiseptikem žlučníku, neboť je žlučí vylučován. Dobré antiseptické účinky má i cineol, tymol a karvakrol. Antiseptikum ledvin a močových cest je diosfenol vylučovaný močí. Destilací čerstvě kvetoucí natě máty peprné (Mentha piperita) se získává silice obsahující přes 50 % mentolu, jeho estery s kyselinou octovou a valerovou, menton, felandren, pinen, cineol, jasmon a další. Rozeznává se mentol levotočivý a syntetický (tzv. racemický). Za obyčejné teploty sublimuje. Listy blahovičníku (eukalyptu) kulatoplodého obsahují až 3 % eukalyptové silice, která je tvořena až z 85 % cineolem. Čistý cineol se ze silice získává obvykle vymrzáváním. Kmínová silice (Oleum carvi) se získává destilací s vodní parou ze zralých dvounažek kmínu kořenného (Carum carvi). Kmín obsahuje 3−7 % silice jejíž hlavní složkou je D-karvon (60 %) a D-limonen (40 %), malé množství dihydrokarvonu, karveolu. V průběhu zrání se zvyšuje obsah karvonu na úkor limonenu podle schématu: O
HO O-P
karvon
limonen geranylfosfát
O
HO
karveol dihydrokarveol
16
dihydrokarvon
Užívá se jako karminativum se spasmolytickými vlastnostmi, laktagogum, koření. Silice v plodě kmínu kořenného obsahuje: karvon 45−79 %, limonem až 35 %, vláknina 13−19 %, tuk 13−21 %, N-látky 25−36 %, popeloviny 5−7 %, bez dusíkatých extraktivních 5−18 %, vosk 1,5 %, voda 9−13 %. Od roku 1996 existuje v České Republice sdružení Český kmín, které se zabývá pěstováním a šlechtěním odrůd. Římský kmín pro svoji hořkou chuť a silné aroma se stal populární složkou koření kari. V minulosti se také používal k léčení koliky a nadýmání. Dnes je jeho použití omezeno na veterinární praxi (KŘESŤANOVÁ et al., 1997). 3.5.4 Silice tvořené převážně bicyklickými monoterpeny Bicyklické siličné monoterpeny jsou odvozeny od tří základních typů: pinanového, kamfanového a tujanového. K tujanovému typu patří bezkyslíkatý sabinen, alkohol tujol a keton tujon, obsažený v silicích některých rostlin čeledi Asteraceae (pelyněk, vratič) nebo Lamiaceae (yzop, šalvěj), ale i některých jehličnanů. Tujon má anthelmintické účinky. Je však značně toxický a může vyvolat psychické poruchy, avšak u šalvějové natě (silici) nebyla toxicita prokázána. Typ pinanový tvoří bezkyslíkatý α a β-pinen vyskytující se např. v terpentýnové silici získané z terpentýnového balzámu destilací. Autooxidací se v ní vytvářejí snadno dráždivé peroxidy pinenů. Do kamfanového typu patří např. alkohol borneol a jeho estery (bornylacetát, bornylpropionát, bornylkapronát) v kosodřevinové silici a keton kafr získaný ze dřeva kafrovníku nebo připravený synteticky. Rozdílná teplota tání rozlišuje přírodní kafr od kafru syntetického. Typický zápach kozlíkové silici dává bornylester kyseliny valerové, ale i pyridinové alkaloidy, které spolupůsobí jako látky vábící kočky. Sedativní účinek je podmíněn především přítomností triesterů polyhydroxycyklopentapyrenů, zvaných valepotriáty, např. valtratum. 3.5.5 Silice tvořené převážně seskviterpeny Siličné seskviterpeny jsou látky různé struktury, monocyklické (zingiberen, kurkumen, bisabolol, turmeron, humulen), acyklické (farnesol) i bicyklické (chamazulen, karyofylen).
17
3.5.5.1 Azulenogenní seskviterpeny Azuleny jsou látky s výrazným protizánětlivým účinkem. K terapeuticky využívaným drogám patří květ heřmánku pravého a římského, nať a květ řebříčku obecného, nať pelyňku pravého, oddenky a kořeny omanu pravého. Azuleny jsou v rostlinách přítomné jako proazuleny (azulenogeny). Destilací s vodní parou přecházejí v modře zbarvené azuleny; v guajakové pryskyřici obsažený guajol přechází v guajazulen, proazulen heřmánku a řebříčku matricin přechází destilací přímo v chamazulen. Není však vyloučeno, že tento děj se zvolna uskutečňuje i při obyčejné teplotě. Proazulen pelyňku artabsin přechází přes chamazulenogen v chamazulen teprve v kyselém prostředí. I další proazuleny pelyňku absintin a anabsintin přecházejí přes chamazulenogen v chamazulen. Proazuleny jsou účinné hořčiny, zvláště proazuleny pelyňku. V nati benedyktové je obsažena hořčina azulenového typu knicin. Na rozdíl od pelyňku se benedikt řadí mezi hořčiny, protože obsahuje jen zanedbatelné množství silice. V potravinářství se pelyněk využívá k výrobě absinthu. Heřmánkový modrý éterický olej z Chamomilla recutita Vůně: příjemná, silně bylinná Hlavní složky: seskviterpeny chamazulen, bisabolol, bisaboloxid, izobutylangelát, matricin Aromaterapeutické účinky: má protizánětlivé, antialergické, antiseptické a uklidňující účinky. Podporuje hojení kůže, tlumí bolest, stimuluje zažívání (podporuje trávení a chuť k jídlu, uvolňuje při nadýmání), působí proti depresím a utišuje pokožku. Je součástí masážních a koupelových přípravků (HÁDEK, 2006). Heřmánkový žlutý éterický olej z Ormenis multicaulis Vůně: příjemná, teplá, bylinná Hlavní složky: pinen, camphen, limonen, germacren, bisabolen, santalinaalkohol, bornylacetát Aromaterapeutické účinky: antimikrobiální, uklidňující, antialergické. V kosmetice je vhodný na pleť citlivou, podrážděnou, zánětlivou až aknózní. Najde uplatnění při neurodermatitidě, ekzémech včetně atopického, jako ,,neurotonikum (HÁDEK, 2006). Obecně heřmánkový květ obsahuje až 1 % modré silice, z níž 20 % tvoří modrý chamazulen. Obsah silice má být nejméně 0,4 % a chamazulenu nejméně 0,03 %. V nadestilované silici lze chamazulen stanovit kolorimetricky. 18
3.5.5.2 Jiné seskviterpeny Do této kategorie můžeme zařadit drogy jako usušenou samičí šištici chmelu otáčivého, z níž obsah silice je zhruba 0,5 %, tvořený až z 20 % pryskyřičnými látkami a až 5 % tříslovinami. Dále kurkumový kořen, obsahující až 5 % silice tvořené až 60 % seskviterpenických ketonů turmeronů, zinziberenem. V potravinářství slouží k výrobě kari koření a k obarvování těstovin. Zázvorový kořen obsahuje až 30 % silice. Zázvor dráždí nervová zakončení vnímající teplo, a proto vyvolává pocit pálení. Používá se při dyspepsii, jako stomachikum a karminativum, dnes převážně v potravinářství např. k výrobě zázvorového piva (TOMKO,1999; MINAŘÍK et al., 1979).
3.6 Obvyklé metody separace terpenů a silic K separaci těkavých složek z rostlinného materiálu lze využít destilaci s vodní parou podle ČSN 58 0110 (SEDLÁKOVÁ et al., 1998, 2001) a ČSN 6571 (ČSN 58 0110; ČSN 6571), rychlou parní destilaci (rapid steam distillation) (MUZIKA et al.,1990), extrakci hexanem (BOUWMEESTER, DAVIES & TOXOPEUS, 1995), zrychlenou extrakci rozpouštědlem (ASE) a extrakci v mikrovlnné peci (SCHAEFER & HANOVER, 1986). Z plynného prostředí lze těkavé složky izolovat také mikroextrakcí na pevném sorbentu (SPME) s následnou tepelnou desorpcí s přímým dávkováním na kapilární GC kolonu (KOVAR & BOCK, 1983; ADAM et al., 2005, 2009) a dalšími metodami (ADAM et al., 2008). 3.6.1 Destilace s vodní parou Destilace je fyzikální proces dělení látek na základě jejich rozdílnosti bodů varu. Látka o nižším bodu varu se přenáší do plynného skupenství a chladičem se převede zpět do skupenství kapalného. Většinou se tímto způsobem čistí látky, které jsou ve vodě málo rozpustné a při bodu varu vody mají znatelný tlak nasycených par. Páry obou nemísitelných složek tvoří při destilaci azeotrop, který má nižší bod varu než níže vroucí látka. Tím lze za teploty nižší než 100 °C předestilovat látky o bodu varu podstatně vyšším a vyhnout se jejich zahřívání na vysokou teplotu, při níž by se mohly rozkládat. Destilaci s vodní parou lze provést třemi způsoby: 1) Destilace, při níž se materiál vaří s vodou. 2) Destilace parou bez odděleného zdroje páry. 3) Destilace s odděleným zdrojem páry (VOLDŘICH, 2009). 19
3.6.2 Lisování Využívá se výhradně k získávání silic z kůry citrusových plodů. Vnější vrstva slupky tzv. flavedo je před lisováním plodu ostrouhána, spláchnuta proudem vody a po scezení je lisována. Silice se oddělí odstředěním na odstředivce (VOLDŘICH, 2009). 3.6.3 Extrakce Extrakce je separační metoda, při které přechází látka či látky z jedné fáze do druhé na základě rozpustnosti v jednotlivých fázích. Jde o přechod složky mezi dvěma vzájemně nemísitelnými fázemi (MERGL & KOZÁČKOVÁ, 2000). Extrakční soustavy se dělí podle skupenství: a) z pevné fáze do kapaliny, kdy se z tuhého materiálu rozpouští ve vhodném rozpouštědle požadovaná složka, zatímco ostatní složky ne. Využívá se především Soxhletova extrakce. b) z kapaliny do kapaliny; tato metoda je založená na rozdělovací rovnováze v soustavě dvou nemísitelných kapalin. Dosažení rovnovážného stavu je umožněno dokonalým vzájemným stykem obou fází na co největší ploše. Rychlost ustanovení rovnováh lze zvýšit protřepáním a opětovným usazením. Po ustanovení rovnováhy je koncentrace látky v obou fázích vyjádřena distribuční konstantou: KD = corg/caq, kde corg a caq jsou rovnovážné látkové koncentrace složky v organickém rozpouštědle a ve vodě. Konstanta charakterizuje látku v systému voda – organické rozpouštědlo při určité teplotě a tlaku. Čím je hodnota vyšší, tím je větší podíl složky v organickém rozpouštědle a naopak. c) z kapaliny do pevné fáze – extrakce pevnou fází (SPE) (KARLÍČEK et al., 2001). Extrakce vonných a chuťových látek probíhá za nižších teplot než destilace. Kromě velmi těkavých látek přecházejí při tradičních postupech extrakce do extraktu i další extrahovatelné látky. Extrahované silice mají hnědou nebo zelenou barvu, po naředění se jejich vlastnosti více blíží vůni a chuti původních surovin než u destilovaných silic. Tradiční metody extrakce jsou nákladnější než destilační, proto se tato technika používá pro získávání hodnotnějších silic, zejména z květů rostlin (UHLÍŘOVÁ, 2008; LEHOTAJ, 2009). Podstatným rozdílem je také mnohem menší navážka vzorku než je tomu u destilace s vodní parou. Toho se využívá hlavně v případě, že úroda dané odrůdy není velká.
20
3.6.4 Extrakce tuky neboli enfleuráž Extrakce tuky patří ke tradičním postupům získávání extraktů vonných látek zejména z květů rostlin (např. Rosae oleum, jasmínová silice). Provádí se za studena, zpravidla bezpachým vepřovým sádlem nebo za tepla macerací horkým tukem. Při prvním způsobu se minerální tuk nanáší v tenké vrstvě na obě strany skleněných desek nebo plátna uchycených ve dřevěných rámech. Na vrstvy tuku se položí nebo nasypou květy určené k extrakci a rámy se naskládají na sebe. Tuk postupně pohlcuje těkavé látky z květů. Tvrdí se, že květy ještě několik hodin po utržení žijí a produkují silici, proto je výtěžek takovéto extrakce vyšší než u jiných způsobů extrakce. Tuku nasycenému silicí se říká pomáda, uvádí se číslo - počet násad květů. Po opakování určitého počtu násad je tuk silicí nasycen a další těkavé látky se v tuku nerozpouští. Pomáda je poté extrahována ethanolem, alkoholický výluh se vymrazí a je odfiltrován tuk. Ethanol je oddestilován a výsledkem je tzv. silice absolutní neboli absol. K extrakci za normální teploty může být použit i rostlinný olej (olivový), květy se macerují v oleji, jsou odfiltrovány a po opakování několika násad je postup stejný jako v případě tuku. Pro zrychlení procesu se používá také extrakce olejem za vyšších teplot, např. 500 °C. Enfleuráž se uplatňuje ve voňavkářství při výrobě parfémů, kdy je požadavek na kvalitní čistou silici (VOLDŘICH, 2009). 3.6.5 Extrakce organickými rozpouštědly Extrakce organickými rozpouštědly (petroletherem, benzenem, hexanem) je častější než enfleuráž. Opět se provádí v extraktorech. Po odpaření rozpouštědla výsledná silice obsahuje také vosky a další v alkoholu nerozpustné složky. Říká se jí konkrétní silice neboli konkrét, která se dále zpracovává na absolutní silici rozpuštěním v ethanolu za tepla filtrací a odpařením (MINAŘÍK et al., 1979). Kromě silic jsou získávány i další složky k výrobě aromat, jako jsou přírodní pryskyřice (fixátory), které zpomalují odpařování silice (VOLDŘICH, 2009). 3.6.6 Extrakce v Soxhletově extraktoru Jde o kontinuální extrakci látky, prováděnou na Soxhletově přístroji, který se skládá ze tří částí: destilační baňky, extraktoru a zpětného vodního chladiče. Mletý nebo drcený vzorek drogy se vloží do extrakční papírové patrony. Ta se vloží do extraktoru a překryje kouskem vaty. Destilační baňka s extrakčním činidlem se umístí do vodní lázně a zahřeje se k varu. Páry rozpouštědla stoupají boční trubičkou 21
do chladiče, kde dochází ke kondenzaci par a zkondenzovaný extrakční solvent kape na patronu se vzorkem a promývá ji. V místě, kde je umístěna patrona, se postupně shromažďuje zkondenzované extrakční činidlo. Až se prostor naplní, odteče přepadovou trubičkou směs extrakčního činidla a vyextrahované látky zpět do destilační baňky. Po skončení extrakce se vyextrahovaná látka zakoncentruje za vyšší teploty pomocí rotační vakuové odparky (DOUBRAVA, KOŠTÍŘ & POSPÍŠIL,1984). Samotná extrakce trvá několik hodin, je pod bodem varu rozpouštědla a je při ní zapotřebí většího množství extrakčního rozpouštědla. Jako extrakční činidlo při extrakci silic se používá acetaldehyd. Podmínkou je, aby rostlinná droga byla dobře namletá na drobnější částice a byla suchá, z důvodu dobrého prostupu extrakčního činidla vzorkem. Kromě klasické Soxhletovy extrakce lze provést i její modifikaci, kdy je vzorek ponořen do solventu v prostoru mezi extrakční nádobou a chladičem. Vzorek je extrahován při teplotě varu rozpouštědla (UHLÍŘOVÁ, 2008). 3.6.7 Nadkritická fluidní extrakce (SFE) Moderní technologie získávání vonných a chuťových látek využívají extrakci kapalinami v superkritickém stavu (nejčastěji se používá CO2, ale také N2O, propan, methanol, amoniak nebo toluen). V případě CO2 probíhá extrakce zkapalněným plynem za podmínek nad kritickou teplotu a kritický tlak (pro CO2 31 °C, 7,38 MPa). Nadkritický CO2 je nepolární rozpouštědlo a používá se k extrakcím nepolárních látek. U oxidu dusného je kritická teplota 36,5 °C a kritický tlak 7,28 MPa. Prakticky se však pracuje s tlaky 8 až 40 MPa a teplotami 60 až 150 °C (KLOUDA, 1996). Obecným problémem oxidu uhličitého a oxidu dusného je jejich nízká polarita. Se stoupající polaritou analytů, totiž klesá jejich rozpustnost. Tento problém se obchází přídavkem
malého
množství
polární
organické
látky
zvané
modifikátor
(cca 10 objemových %) do extrakční cely (dodávání modifikátoru in situ) nebo do proudu nadkritického CO2 (dodávání modifikátoru on-line). Mezi běžně používané modifikátory patří např. methanol, ethanol, kyselina mravenčí nebo octová, acetonitril, toluen, hexan, sirouhlík nebo voda (SEDLÁKOVÁ, 1997). Volba optimálního modifikátoru a jeho množství závisí na mnoha faktorech, které ovlivňují samotnou extrakci - na tlaku a teplotě, matrici, typu extrahované látky a použité nadkritické tekutině. Použití modifikátorů při extrakci látek může vést k překvapivému
zvýšení
účinnosti:
např. 22
přídavek
3,5
mol
%
methanolu
k nadkritickému CO2 zvýší rozpustnost kyseliny 2-aminobenzoové o 620 % (DOBBS et al., 1987). Vhodné spektrum analytů bývá charakterizováno takto: nepolární lipofilní látky, např. uhlovodíky, ethery, estery, ketony, polyaromatické uhlovodíky (PAH) a polychlorované bifenyly (PCB) do molekulové hmotnosti 300 − 400 g/mol lze snadno extrahovat v tlakovém rozsahu do 30 MPa. Polární funkční skupiny (-OH, -COOH) extrakci znesnadňují nebo znemožňují. Uspokojivě lze extrahovat deriváty benzenu s maximálně třemi hydroxylovými skupinami. Neextrahovatelné jsou v rozsahu do 40 MPa polární látky, např. cukry, glykosidy, aminokyseliny a polární proteiny: lecitin, celulóza, polyterpeny a syntetické polymery. Nepolární oligomery jsou rozpustné pouze nepatrně (VENTURA, 1995). Volbou podmínek, případně přídavkem dalších látek, lze upravovat vlastnosti (polaritu) rozpouštědla a ovlivnit složení extraktu. Díky snadnému odpaření rozpouštědla nehrozí rezidua jako v případě klasické extrakce organickými látkami. Technologie je výhodná i při nanášení vonných a chuťových látek na různé nosiče. Na trhu jsou k dispozici přípravky nepolárních látek zakotvených na polysacharidických nosičích, které jsou lehce dispergovatelné ve vodě a lze je snadno a standardně dávkovat (silice, extrakty koření, včetně v tucích nerozpustných barviv, např. extrakt papriky). Nadkritickým stavem rozumíme takový stav hmoty, kdy její tlak a teplota jsou vyšší než odpovídající kritické hodnoty (pk, Tk). V tomto stavu nelze rozlišit kapalinu od plynu, používá se tedy termínu tekutina. Nadkritická oblast je názorně vyznačena na fázovém diagramu v p-T souřadnicích (Obrázek 1) (SEDLÁKOVÁ, 2003). Křivka Tr - K vyznačuje stav rovnováhy plynné a kapalné fáze. Kapalná fáze přechází vlivem teplotní expanze do oblasti nižších hustot, plynná fáze přechází do oblasti vyšších hustot vlivem rostoucího tlaku. Kritický bod K se nachází na konci výparné křivky (jež označuje rovnováhu plynné a kapalné fáze), je charakterizován kritickým tlakem pk a kritickou teplotou Tk a kapalina v tomto bodě kontinuálně přechází v nadkritickou tekutinu. Kromě své vysoké rozpouštěcí schopnosti mají nadkritické tekutiny (Supercritical Fluids, SF) několik vlastností, které je činí užitečnými pro rychlou a kvantitativní extrakci organických látek z reálných vzorků. Mají tzv. dualistickou povahu - některé jejich vlastnosti se blíží vlastnostem plynů (viskozita, difusivita), jiné vlastnostem
23
kapalin (solvatační schopnosti). Hustota nadkritické tekutiny je vyšší než hustota plynu, bývá srovnatelná s hustotami kapalin (PLANETA, 1993). Díky nízké viskozitě a vysoké difusivitě v sobě tedy SF spojují solvatační sílu kapalin s výhodnými podmínkami pro přestup hmoty v průběhu extrakce, což je činí zajímavými extrakčními médii. Nižší viskozita, vyšší difúzní koeficient a nulové povrchové napětí dělají z nadkritické tekutiny velmi silné extrakční činidlo, neboť umožňují vyšší rychlost transportních dějů než kapaliny (CHURÁČEK, 1992). Extrakce nadkritickou tekutinou je díky těmto vlastnostem rychlejší a účinnější než klasická kapalinová extrakce v důsledku rychlejší a dokonalejší penetrace extrakčního média do pevné matrice (CAMEL, TAMBUTE & CAUDE, 1993). Rozpustnost látky v nadkritické tekutině závisí na tlaku a hustotě tekutiny. Ta závisí na teplotě; rozpustnost je tedy funkcí tlaku a teploty. Nejdůležitějším parametrem je tlak. S rostoucím tlakem vzrůstá hustota nadkritické tekutiny a tím i její solvatační schopnost, ale s rostoucí teplotou hustota nadkritické tekutiny i její solvatační schopnost klesá. Volbu nadkritické tekutiny ovlivňují především tři faktory: rozpustnost analytu, difúze a matrice. Extrahovaná látka musí být v daném solventu dostatečně rozpustná (za příslušných extrakčních podmínek: teploty, tlaku, eventuelně s přídavkem modifikátoru). Stanovovaná látka musí být z matrice dostatečně rychle transportována. Časový průběh difúze závisí na množství vzorku a na typu matrice. Extrakci analytu z matrice negativně ovlivňuje adsorpce molekul na povrchu pevné matrice, záchyt analytu ve složitých organických molekulách matrice (aktivní centra) a průchod molekul analytu stěnami buněk biologické matrice. Nadkritické tekutiny mají téměř nulové povrchové napětí a do vzorku pronikají snadněji než jiná kapalná rozpouštědla. Difusivita závisí na teplotě a tlaku nadkritické tekutiny. S rostoucí difusivitou roste extrakční rychlost. Viskozita závisí na teplotě a tlaku. S rostoucí teplotou viskozita klesá. Účinnost SFE ovlivňuje tlak, teplota a doba extrakce, průtoková rychlost tekutiny a velikost namletého tuhého vzorku. Dochází k tzv. ,,přenosu hmoty“ analytu ze vzorku do nadkritické tekutiny. Analyt se jímá v extrakční nádobě, do níž je veden restriktorem. Při průchodu nadkritické tekutiny obohacené o analyty restriktorem dochází k poklesu tlaku, extrakční médium se zplyní a samo vytěká do ovzduší. Separace analytu od nadkritické tekutiny se tedy nemusí provádět.
24
Záchyt analytu se u nadkritické fluidní extrakce provádí v zásadě dvěma způsoby: proud plynného CO2 na konci restriktoru je veden do kapaliny v záchytné nádobce nebo do záchytné kolonky se sloupcem sorbentu. Záchytné zařízení musí obsahovat dostatečné množství solventu či sorbentu potřebné za daných podmínek (teplota, průtok CO2, výška záchytného sloupce) pro kvantitativní přestup hmoty z expandované nadkritické fáze (v průběhu posunu restriktorem dochází k poklesu tlaku směsi nadkritická tekutina/analyt), na konci z restriktoru proudí plynný CO2 do záchytného média bez možnosti úniku části analytů ze záchytného zařízení. Zároveň nesmí docházet ani k degradaci analytu. Záchytný systém by měl produkovat extrakty přímo použitelné pro analýzu, tedy např. roztoky v rozpouštědlech vhodných pro nadkritickou kapalinovou chromatografii (SFC) nebo plynovou chromatografii (GC), aby se předešlo ztrátě těkavých analytů při odpařování záchytného solventu a jejich ulpívání na skle odpařovací baňky při opětném rozpouštění před nástřikem na kolonu. Dále by nemělo být nutné analyt předčišťovat a zakoncentrovávat. V neposlední řadě je při použití delších extrakčních časů nezbytné zabránit odpařování zachycených analytů ze systému a tzv. stripovacímu efektu (molekuly analytu zachycené v kapalině jsou strhávány proudem plynného CO2 a spolu s ním unášeny ze systému). Vyskytla se celá řada způsobů, jak výše uvedeným nevýhodám zamezit nebo je alespoň omezit. I v případě velmi těkavých analytů (např. benzen, toluen, xylen) může být záchyt proveden kvantitativně do běžné záchytné nádobky se 4 ml rozpouštědla, aniž by docházelo k odpařování analytu nebo k jeho stripování proudem plynného CO2 (při průtoku 260 ml (g)/min na konci restriktoru) při teplotě –20 °C až –30 °C s výtěžkem 94–100 % při záchytu do chloroformu a 92–100 % pro záchyt do méně vhodných rozpouštědel (ether, acetonitril). U čerstvě kontaminovaných vzorků je tato metoda velmi efektivní, u přírodních vzorků však může nízká teplota záchytného rozpouštědla vést k ucpávání restriktoru, zvláště za předpokladu, že vzorek obsahuje stopy vody. V experimentálním uspořádání je vzorek umístěn v extrakční cele do níž se shora přivádí extrakční médium. Existuje buď statický nebo dynamický režim extrakce. U statického provedení se po určitou dobu nadkritický solvent sytí analytem: výhodou je nižší spotřeba solventu, vymývá se méně balastních látek a působení in-situ modifikátoru je delší. V dynamickém režimu se cela promývá proudem nadkritické tekutiny: rovnováha se posunuje ve směru extrakce, což je účinnější, ale nevýhodou 25
je vyšší spotřeba a vyšší koncentrace balastních látek, vymytí in – situ modifikátoru a riziko stripování analytu ze záchytného solventu na sorbent nebo do kapaliny (KLEJDUS, 2010). Mezi nevýhody patří: - malá navážka vzorku – u nedostatečně homogenních vzorků zvyšuje RSD - bez použití modifikátorů jsou tyto metody vhodné pouze pro nepolární látky - při záchytu na sorbent kondenzující modifikátor vymývá analyty ze sorbentu - při záchytu do kapaliny může docházet ke stripování analytu ze záchytného solventu - ucpání restriktoru vznikem klastrů analytu při snížení rozpustnosti CO2 Mezi výhody patří: - nízká viskozita a vysoká difuzivita nadkritické tekutiny - solvatační schopnosti se mění s tlakem a teplotou, za vhodných podmínek je dosažena vysoká selektivita extrakce - použití modifikátoru umožňuje extrahovat polárnější látky, dále ovlivňuje i selektivitu - malá spotřeba vzorku, malý objem extraktu ve vhodném rozpouštědle: často bez nutnosti přečištění a zkoncentrování - doba extrakce: 10 − 60 min. Extrakce silic nadkritickou tekutinou je velmi rozšířena, ale jen málo původních prací se zabývá separací terapeuticky účinných látek z léčivých rostlin. Ahmad (AHMAD et al., 1994) se zabýval extrakcí rhizomů zázvoru (Zingiber. zerumbet) ve snaze izolovat látky s cytotoxickými účinky, Sanagi (SANAGI et al., 1993) extrahoval drcené sušené rhizomy Curcuma longa. Ze sedmikrásky (Tanacetum parthenium) byl izolován seskviterpen lakton parthenolid, užívaný při léčbě migrény a artritidy (SMITH & BURFORD, 1992). Heaton (HEATON et al., 1993) využil SFE k izolaci protirakovinných taxanů ze sušeného tisového jehličí. Protinádorové pyrrolizidinové alkaloidy byly vyextrahovány ze semen Crotalaria spectabilis (SCHAEFFER, ZALKOW & TEJA,1989) a ze dvou druhů Senecio (SEIF EL DIN et al.,1983). Hartonem (HARTONEM et al., 1992) využil off-line SFE/SFC ke stanovení obsahu matricinu v květech heřmánku. Mnohem běžnější je extrakce a separace esenciálních olejů (silic) nebo jednotlivých účinných
látek
z
koření.
Kocourková
a
Sedláková-Fojtová
ve
spolupráci
s Ing. Šmirousem (Agritec Šumperk) vyvinuli, validovali a popsali řadu metod pro extrakci a stanovení silic ze vzorků kmínu, koriandru, anýzu, fenyklu, heřmánku a dalších koření a léčivých rostlin (ŠMIROUS et al., 2004; FOJTOVÁ J. et al., 2005). 26
Analýza těkavých složek rostlinného původu je velmi rozšířená (SEDLÁKOVÁ, LOJKOVÁ & KUBÁŇ, 2003). Často se provádějí např. studie obsahů terpenů jehličnatých stromů v závislosti na environmentálních podmínkách, vzhledem k jejich chemotypu a sledování odlišností založených na zeměpisném původu (GLOWACKI, 1994; SCHAEFER & HANOVER, 1986). Také byly prováděny studie vlivu znečištěného ovzduší v městských lokalitách na skladbu monoterpenů (SUPUKA et al., 1997, 1998) a byla zkoumána jejich role v atmosférických poruchách (SCHÜRMANN & ZEIGLER, 1993). 3.6.8 Extrakce rozpouštědlem za zvýšeného tlaku a teploty (PSE) PSE i Soxhletova extrakce se řadí do skupiny extrakcí kapalinou. Bývá také nazývána jako zrychlená extrakce rozpouštědlem (ASE), kapalinová extrakce za zvýšeného tlaku (PFE), tlaková kapalinová extrakce (PLE), tlaková extrakce horkým rozpouštědlem (PHSE), extrakce rozpouštědlem za vysokého tlaku (HPSE) a subkritická extrakce rozpouštědlem (SSE). Využívá se k extrakci vzorku z pevných matric, na získávání látek nerozpustných či částečně rozpustných ve vodě (některé těkavé organické sloučeniny solí, jílů, sedimentů) (GRULICHOVÁ, 2008). Jde o extrakci polotuhé a tuhé matrice kapalným (velmi účinná pro suché matrice) rozpouštědlem při zvýšeném tlaku (10 až 15 MPa) a zvýšené teplotě (50 až 200 °C) za čas 5 až 20 minut. Vzorek se staticky umístí do sloupcové cely, zrychlí se extrakční kinetika pomocí zvýšené teploty organického rozpouštědla, díky zvýšenému tlaku, aby se rozpouštědlo udrželo v kapalném stavu, aby nepřešlo do plynného skupenství. Pokud by rozpouštědlo přešlo do plynného stavu, klesla by extrakční kinetika na nulu. Tento stav je nežádoucí. Zvýšená extrakční teplota ovlivňuje rozpustnost vody v rozpouštědle, sníží se viskozita extrahovadla a extrahovadlo lépe proniká do matrice, protože se sníží povrchové napětí roztoku a analyt se rozpouští rychleji. Zvýšený tlak ulehčí extrakci analytu z matrice tím, že se extrahovadlo natlačí do pórů matrice (TEKEL & MIKUŠ, 2005). Výhoda metody spočívá ve vynikající solvatační schopnosti organických solventů. Vysoká teplota urychluje přestup hmoty analytu z matrice do rozpouštědla a dochází ke kontinuálnímu vyhřívání analytu. Nevýhodou je, že za vysokých teplot se lépe extrahují balastní látky (nižší selektivita přečištění), nestabilní je řada analytů a čím lepší promytí, tím více vzniká extraktu, který se musí následně zakoncentrovat. (KLEJDUS, 2010). 27
Použita byla na izolaci některých pesticidů, polyaromatických uhlovodíků, polyaromatických bifenylů z půd, jílů, sedimentů a kalů. Dále na stanovení aditiv ve výbušninách a polymerních materiálů, tuků v potravině, ropných látek v půdě a také na účinné složky v léčivě (TEKEL & MIKUŠ, 2005). Schellenberg a Richterová z Německa srovnávali metody separace silic pomocí hydrodestilace, extrakci rozpouštědlem, ASE, SPME a SFE na vzorcích kmínu, majoránky, tymiánu a šalvěje. Rozdíly byly v navážce vzorku, době extrakce a v dalších parametrech. Bylo prokázáno, že všechny použité metody vykazovaly vhodné výsledky pro další analýzu pomocí plynové chromatografie s hmotnostní detekcí (GC/MS) (RICHTER & SCHELLENBERG, 2007). 3.6.9 Mikrovlnná rozpouštědlová extrakce (MAE, MWAE) Využívá generované mikrovlny na ohřev rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel, která jsou ve styku s tuhou matricí. Vzorek s extrakčním činidlem se zahřívá v extrakční nádobě mikrovlnným zářením o frekvenci 300 MHz až 300 GHz a vlnovou délkou až 1 m. Mikrovlnné záření je pohlcováno materiály, které obsahují polární molekuly (např. voda). Tyto molekuly mají v dané látce neuspořádanou orientaci. Mikrovlnnou extrakci ovlivňuje použití vhodného extrakčního činidla a jeho množství, dále teplota a čas extrakce. Jako extrakční činidla se používají kapaliny, které jsou schopny absorbovat mikrovlnné záření (TEKEL & MIKUŠ, 2005). Interakce mikrovlnného záření se vzorkem v mikrovlnném zařízení se může uskutečňovat dvěma způsoby. První způsob je takový, že se mikrovlnné záření rozptyluje v celém vnitřním prostoru mikrovlnného zařízení rovnoměrně. Rovnoměrně je ozařován i vzorek. Druhý způsob využívá usměrněného mikrovlnného záření. Vzorek v mikrovlnném zařízení je vložen např. do teflonové nádobky a mikrovlnné záření je usměrněné na vyhraněnou zónu vzorku, která se zajistí pomocí výseče. Mikrovlnná zařízení využívající rozptýleného záření, jsou nazývána systémy s uzavřenými nádobami, kdy extrakční rozpouštědlo má vysokou dielektrickou konstantu a silně absorbuje mikrovlny. Mikrovlnná zařízení využívající usměrněného záření neboli systémy s otevřenými nádobami s kapalinou, s nízkou dielektrickou konstantou neabsorbují mikrovlny (UHLÍŘOVÁ, 2008). MAE může probíhat tak, že se extrahovaný rostlinný materiál ponoří do rozpouštědla, které silně absorbuje mikrovlnné záření nebo se extrahuje v takovém rozpouštědle, které toto záření propouští. Často se využívá extrakce směsí rozpouštědel, 28
která absorbují a neabsorbují mikrovlnné záření. Spojením mikrovlnné (MAE) a zrychlené (ASE) rozpouštědlové extrakce vzniká zrychlená mikrovlnná extrakce (MASE). MAE i MASE jsou vhodné pro termolabilní analyty, na izolaci reziduí fenylmočovinových herbicidů, pesticidů z půdy nebo polychlorovaných bifenylů ze sedimentů (TEKEL & MIKUŠ, 2005). Smain a kol. studovali kinetiku extrakce terpenů (limonen a karvon) z kmínu. Obě látky byly extrahovány pomocí MAE a identifikovány pomocí GC s hmotnostní detekcí. Efekt mikrovln při 5 a 10 kV na siličné kanálky kmínu ukázal strukturní změny po extrakci pomocí elektronového mikroskopu (SMAIN et al., 2005). 3.6.10 Mikroextrakce na tuhé fázi (SPME) Mikroextrakce na tuhé fázi neboli na vlákně je rychlá bezrozpouštědlová technika ke konvenčním metodám extrakce analytu z kapalné fáze. SPME je založena na zadržování analytu na malém množství sorbentu. SPME používá křemenné vlákno, které pokrývá film polydimethylsiloxanu (PDMS), polyakrylátu (PA) nebo kopolymeru dimethylsiloxanu a divinylbenzenu, které je uloženo v duté ocelové jehle. Je založena na dvou procesech. První je adsorpce analytu na povrch SPME vlákna technikou purge & trap nebo headspace. Druhá fáze zahrnuje následnou desorpci analytu z povrchu vlákna na kolonu GC nebo HPLC chromatografu. Od sebe se vlákna liší různou polaritou, porozitou, tloušťkou vrstvy sorbentu a opakovaně je lze používat (TEKEL & MIKUŠ, 2005). Odběr vzorku probíhá tak, že ocelová jehla propíchne septum v zátce zkumavky. Vysune se sorpční vlákno, které se ponoří do kapalného vzorku (netěkavé analyty) nebo se drží v plynném prostoru nad vzorkem, tzv. headspace analýza (těkavé analyty). Vlákno se ponoří při sorpci analytu do roztoku a provede se statická nebo dynamická sorpce analytu na povrch vlákna. Po uplynutí expozičního intervalu se vlákno zasune zpět do ocelové jehly a vytáhne ze vzorku. Jehla se přenese do plynového chromatografu, kde se dávkuje analyt z vlákna. Desorbci analytu je možno uskutečnit termicky v injektoru plynového chromatografu (SPME/GC) nebo může být desorbovaný mobilní fází (vhodným rozpouštědlem) na kolonu kapalinového chromatografu (SPME/HPLC). Dynamická headspace analýza se provádí kontinuální extrakcí analytu ze vzorku pomocí proudu inertního plynu N2 nebo He. Inertní plyn prochází vzorkem, kde dochází k sorpci analytu do plynu. Až se plyn obohatí, vede
29
se do sorpční trubičky, kde se oddělí analyt od plynu. Samotný plyn se buď vede zpátky na začátek extrakce nebo se vypustí do atmosféry (UHLÍŘOVÁ, 2008). Účinnost extrakce lze ovlivnit změnou pH vzorku a jeho vysolováním pomocí NaCl o různých hmotnostních koncentracích (25−30 % m/m). Pro účinnější separaci analytu a zkrácení doby extrakce se musí vzorek míchat konstantní rychlostí po celou dobu prováděné extrakce. Dále lze zvýšit účinnost extrakce ultrazvukem, kdy se vzorek zahřeje a odpařuje do prostoru nad kapalinou (SÝS, 2009). Pro extrakci nepolárních analytů se používá vlákno s nepolárním polymerním povrchem a pro polární analyty polární polymer. Pro těkavější analyty (silice) je vhodné použít silnější vrstvu polymeru na vlákně, která má větší sorpční schopnost. Čím má porézní polymerní vrstva větší póry než je průměr molekuly, tím dochází k maximálnímu zachycení analytu na povrchu vlákna. U menších pórů dochází k nenavázání menších molekul než jsou póry, tím se omezuje přístup analytu k vláknu a nedochází k dokonalému záchytu analytu na polymerní vrstvu. Množství analytu adsorbovaného na vlákno závisí na tloušťce a porozitě polymerní vrstvy na povrchu vlákna, na typu vlákna, na míchání vzorku, na pH, době vzorkování, zahřívání nebo přidání solí do roztoku vzorku, distribuční konstantě pro analyt, která obecně roste se zvyšováním molekulové hmotnosti a bodu varu analytu. Pokud se provádí
opakovaná
analýza,
musí
se dodržet
všechny stejné podmínky,
jak při prvním měření. Technika SPME je rychlá, jednoduchá, levná, bez použití rozpouštědla a k analýze je potřeba minimální množství vzorku. Mezi nevýhodu patří nízká sorpční kapacita vlákna. Ve spojení SPME/GC se využívá ke stanovení alkoholů, rozpouštědel nebo lokálních
anestetik
v
krvi,
při
stanovení
kokainu
v
moči,
aromatických
a chlorhalogenovaných uhlovodíků, esterů kyseliny ftalové nebo reziduí ve vodě. SPME/HPLC je vhodná pro stanovení termolabilních analytů jako jsou silice, dále na polyaromatické
uhlovodíky,
karbamáty,
fenylmočoviny
ve
vodě.
Kromě
v toxikologii, kriminalistice a farmacii má veliké uplatnění v posouzení originality značkových nápojů (vína, destiláty) a celé řady potravin jako jsou sýry, rostlinné konzumní oleje (olivový, sojový, slunečnicový). Ve farmacii na kvalitní kosmetické přípravky (parfémy), vzácné vonné oleje, esenciální oleje a bylinné silice (TEKEL & MIKUŠ, 2005; ČÍŽKOVÁ et al., 2008; MLEJOVÁ, 2008, 2010).
30
3.6.11 Mikroextrakce kapalnou fází (LPME) spojená s hydrodifúzí Při hydrodifúzi je přes rostlinný materiál shora dolů, pod malým tlakem a v pulzech propouštěna vodní pára. LPME je založena na převedení extrahované látky z jedné kapaliny do druhé navzájem nemísitelných při použití malého množství rozpouštědla. Účinnost metody ovlivňuje množství vhodného extrakčního činidla při mikroextrakci materiálu. Pro nepolární látky se používá dichlormethan, n-pentan a n-hexan a pro polární látky butylether nebo nepolární látky s přídavkem NaCl (HERAVI & SERESHTI, 2007). Mikroextrakce
kapalina–kapalina
se
provádí
v
mikroextrakční
nádobce
se separátorem fází. Takto provedená mikroextrakce se používá pouze pro větší objemy. Mikroextrakční nádobka se naplní kapalným vzorkem a malým množstvím vhodného rozpouštědla. Po dokonalém protřepání se analyt převede z vodné fáze do rozpouštědla. Vrstva organické fáze je příliš tenká na to, abychom těžší vodnou fázi odpustili. Na hrdlo mikroextrakční nádobky se nasadí separátor fází a postranní trubicí se do separátoru přivádí vodná fáze, která vytlačí organickou vrstvu do tenké kapiláry. Injekční stříkačkou se odebere organická vrstva z kapiláry a poté se může separovat v plynovém chromatografu (GC) (UHLÍŘOVÁ, 2008). Malé objemy vzorku se extrahují v rozdílné menší mikroextrakční nádobce. Pro analýzu se používá injekční mikrostříkačka, do které se nasaje vzorek a malé množství extrakčního činidla, které utvoří film na stěně mikrostříkačky. Do filmu extrakčního činidla se postupně extrahuje analyt. Po skončení extrakce se analyt separuje GC. 3.6.12 Mikroextrakce jednou kapkou (SDME) Druh metody LPME, která se provádí za použití malého množství rozpouštědla v injekční mikrostříkačce. Mikroextrakce jednou kapkou závisí na extrakční době, rychlosti míchání, použitém rozpouštědle a velikosti kapky, která může být umístěna v roztoku vzorku nebo držena v prostoru nad roztokem tzv. headspace. Lze ji provádět statickým nebo dynamickým způsobem. Dynamický způsob spočívá v propíchnutí septa injekční mikrostříkačkou. Ta se následně vloží do prostoru nad kapalinou nebo přímo do vzorku. Do stříkačky se nasaje kapka vzorku nebo plynu. Uvnitř se vzorek pár sekund nechá extrahovat a pak se vytlačí zpět do prostoru vzorku. Proces vytlačení kapky vzorku a nasátí zpět do stříkačky se několikrát opakuje v krátkých intervalech. Posléze se analyt rozpuštěný v organické fázi separuje plynovou chromatografií. Proces vzorkování při dynamickém 31
způsobu SDME se automatizuje. Nastavuje se objem nasátého vzorku v mikrolitrech a rychlost vzorkování. U statického způsobu mikroextrakce se propíchne septum injekční mikrostříkačkou a kapka extrakčního činidla se vytlačí do prostoru vzorku nebo do prostoru nad kapalinou. Analyt se extrahuje z kapalného vzorku nebo jeho par do kapky extrakčního činidla, vtáhne se zpět do injekční mikrostříkačky a opět separuje plynovou chromatografií. Hrozí však utržení kapky od jehly mikrostříkačky (UHLÍŘOVÁ, 2008).
3.7 Obvyklé metody stanovení složení obsahu silic Pro stanovení obsahu těkavých složek se používá převážně plynová chromatografie s plamenově ionizační (FID) nebo hmotnostní (MS) detekcí (RADULESCU et al., 2004). Lze však použít i vysoce účinnou kapalinovou chromatografii (HPLC) s UV (MOSSA et al., 1980; HEATON et al., 1993) nebo polarimetrickou detekcí (KOVAR & BOCK, 1983), derivační spektrofotometrii v UV oblasti (SEIF EL DIN et al., 1983) a protonovou magnetickou resonanci (GLOWACKI, 1994; MOSSA et al., 1980), které se využívají jen zřídka. Nejužívanější a nejlepší metodou pro stanovení obsahu silic je plynová chromatografie, což potvrzuje většina publikovaných prací. 3.7.1 Chromatografické metody Jsou to separační metody, které využívají k dělení složek směsi mnohonásobného opakovaného vytváření rovnovážných stavů složek mezi dvěma fázemi – mobilní (MF) a stacionární (SF) (KLOUDA, 1996). Složky vzorku, které lnou ochotněji k stacionární fázi než k mobilní fázi, se při pohybu zadržují více než jiné složky, které k stacionární fázi lnou hůře. Separace složek ze vzorku silic se provádí nejčastěji pomocí plynové chromatografie s plamenově-ionizační nebo hmotnostně-spektrometrickou detekcí. Totožnost silice lze zjistit také pomocí chromatografie na tenké vrstvě (TLC), což je typ plošné rozdělovací kapalinové chromatografie, kdy stacionární fáze je součástí hliníkové fólie (silufolu) nebo skleněné desky. Tenkovrstvá chromatografie se řídí podle uspořádání stacionární fáze a plynová chromatografie podle povahy mobilní fáze, kdy mobilní fází je plyn. Při chromatografické analýze se k identifikaci a stanovení dělených látek využívá jejich rozdílné pohyblivosti při dělení a chování při detekci. Identifikace monoterpenů je založena na srovnání retenčních časů, hmotnostních nebo IR spekter (SEDLÁKOVÁ, 2003).
32
Chromatografické metody umožňují nejenom dělení velmi složitých směsí, ale též identifikaci a kvantitativní stanovení jednotlivých látek. Používají se též k izolaci látek ve velmi čistém stavu, k analytické kontrole čistoty barviv, léčiv, rozpouštědel, k přečištění chemikálií. Mají široké uplatnění v biomedicíně (izolace bílkovin, enzymů, nukleových kyselin, identifikace stavebních složek) (DOUBRAVA, KOŠTÍŘ & POSPÍŠIL,1984). 3.7.2 Plynová chromatografie (GC) Vzorek (plyn, kapalina) se dávkuje jehlou injekční stříkačky přes septum do injektoru do proudu, tzv. nosného plynu, který jej dále unáší kolonou. Aby vzorek mohl být transportován v dávkovači do kolony, musí se ihned přeměnit na plyn (Tv < 300 °C) a odpařit se. Jako zdroj nosného plynu (MF) se používá tlaková láhev plněná dusíkem, vodíkem, heliem nebo argonem. Dusík je inertní, nejlevnější a nehořlavý. Vodík dovoluje nejrychlejší analýzu, ale nevýhodou je jeho výbušnost ve směsi s kyslíkem nebo se vzduchem. S heliem se pracuje hlavně v kombinaci plynové chromatografie s hmotnostním detektorem. Na zdroj nosného plynu navazuje čistící zařízení, které zachycuje nečistoty, nežádoucí stopy ostatních plynů a stopy reaktivního kyslíku. Reaktivní kyslík nevratně poškozuje stacionární fázi v koloně. Na čistící zařízení je napojen regulační systém, který zajišťuje stálý nebo programově se měnící průtok nosného plynu. Kolony v plynové chromatografii se používají náplňové, kapilární a mikronáplňové. Rozdíly mezi jednotlivými typy kolon jsou v délce, vnitřním průměru, materiálu, z nichž jsou vyrobeny, druhu sorbentu nebo nosiči stacionární fáze. Mikronáplňové kolony mají malý průměr a obsahují velmi malé částice náplně zhruba 10 µm i méně, účinnost separace a kapacita se snižuje. Náplňová kolona je vyplněna adsorbentem silikagelem, křemelinou nebo oxidem hlinitým (alumina). Nosičem stacionární fáze kapilární kolony je vnitřní stěna kapiláry. Vzorek silice se v systému plyn-adsorbent separuje eluční metodou na jednotlivé složky, které se detekují plamenově ionizačním detektorem (FID) nebo hmotnostní detekcí (MS). Plamenový ionizační detektor (FID) je založen na principu, kdy v detektoru hoří plamínek, přičemž při příchodu vzorku s vazbou C-H na detektor dochází v plameni k ionizaci vzorku mezi elektrodami (rozštěpení vzorku) a ionty poté vedou elektrický proud. FID můžeme označit za skoro univerzální detektor, protože detekuje téměř vše, s výjimkou formaldehydu, kyseliny mravenčí, anorganických par a plynů. To je výhodou při použití vody jako rozpouštědla. Signál detektoru (elektrický proud) se po zesílení zapisuje 33
zapisovačem jako chromatografická křivka neboli pík. Vzniklý chromatogram se vyhodnotí buď kvantitativní nebo kvalitativní analýzou píků. Z retenčního času či z retenčního objemu zjistíme při srovnání se standardem, o jakou látku jde. Retenční charakteristiky jsou otázkou kvalitativní analýzy. Na retenční data má vliv distribuční konstanta KD, která charakterizuje rozdělení složky mezi mobilní a stacionární fází. Čím je distribuční konstanta větší, tím je složka více vázána ve stacionární fázi a déle zdržována v koloně. Plocha píku a jeho výška roste s obsahem složky ve vzorku. Výšku lze změřit jednodušeji, ale je více ovlivnitelná malými změnami podmínek při průběhu stanovení. Plocha a výška píku vypovídají o kvantitě. Čím je kolona účinnější, tím lépe dokáže od sebe složky směsi oddělit. Mírou účinnosti kolony je počet teoretických pater. Čím jich kolona má víc a čím menší je výškový ekvivalent teoretického patra, tím vyšší je účinnost separace vzorku (KLOUDA, 1996). 3.7.3 Chromatografie na tenké vrstvě (TLC) Jde o planární techniku kapalinové chromatografie, které se také říká tenkovrstvá chromatografie. Stacionární fáze je součástí tenké vrstvy na vhodné podložce ze skla, hliníku nebo polyesteru. Stacionární fází u TLC je oxid hlinitý nebo silikagel. Metoda je založena na principu adsorbce. Dávkování je prováděno automatickým dávkovačem a detekce činidlem nebo pod UV lampou. Kvalitativní analýza se provádí pomocí retenčního faktoru (Rf). Jde o podíl vzdálenosti středu skvrny od startu ku vzdálenosti čela od startu (SALAŠ et al., 1987). Na povrch chromatografické fólie nebo skleněné desky s adsorbentem se nanese na start analyzovaná směs a vyvíjí se vhodnou eluční soustavou. Když rozpouštědlo dosáhne požadované výše, vyvíjení se ukončí, označí se čelo rozpouštědla a chromatogram se po vysušení vyhodnotí. Metoda slouží hlavně k určení totožnosti silice. 3.7.4 Vysoceúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) V klasické kapalinové chromatografii je mobilní fází kapalina (organické rozpouštědlo), ale na rozdíl od plynové chromatografie o separaci složek vzorku rozhoduje nejen jejich interakce se stacionární fází, ale také použitá mobilní fáze. V HPLC se v současné době používají téměř výhradně mikronáplňové kolony, které umožňují separaci a stanovení analytů v rámci několika minut. Při postupu kolonou se složky vzorku od sebe separují a v různých časech opouštějí spodní část kolony. Toto klasické provedení je základem
34
HPLC. K účinné separaci je třeba použít dostatečně malých zrníček sorbentu, která kladou prostupující kapalině dostatečný odpor. Proto se pracuje při vysokém tlaku. Ve srovnání s plynovým chromatografem může obsahovat HPLC zásobníky s více kapalinami, což umožňuje naprogramovat gradientové zařízení pro řízení změn ve složení výsledné mobilní fáze. Je-li složení mobilní fáze stálé, jedná se o izokratickou eluci. Do kolony se kapalina čerpá membránovými nebo hydraulickými čerpadly. Většinou pracují dvě čerpadla, aby na sebe navazovaly fáze sání a výtlaku. Dávkování analytu injekční stříkačkou přes pryžové septum proti vysokému tlaku je možné z hlediska těsnosti do tlaků 10 MPa. Do kolon HPLC se používá mikropartikulární náplň na bázi silikagelu nebo na bázi oxidu hlinitého (KLOUDA, 1996). Pro detekci silic se užívá hmotnostní spektrometr nebo fluorimetrický detektor, který je založen na principu fluorescence. Podstata spočívá v absorbci látek ultrafialovým zářením a následné emisi záření o vyšší vlnové délce, která se měří fotonásobičem kolmo na směr vstupujícího záření (JANČÁŘOVÁ & JANČÁŘ, 2008) Je vysoce selektivní a vhodně se kombinuje s fotometrickým detektorem, který měří při jedné vlnové délce v ultrafialové oblasti. Složitější dovolují nastavení vlnové délky pomocí monochromátoru. Kvalitativní a kvantitativní parametry jsou stejné jako u plynové chromatografie (KLOUDA, 1996).
35
4
Metodika
Ústav chemie a biochemie Mendelovy univerzity spolupracuje s Ústavem pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství a společností Agritec, research, breeding and services, Ltd. na projektu zvýšení obsahu silic v kmínu kořenném. Aby kmín mohl být prodáván jako koření, musí obsahovat nejméně 3 %. Některé vzorky Ústavu pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství obsahují více než 5 % silic. Obvykle plody kmínu obsahují mezi 1−6 % silice. Extrakce a stanovení obsahu silice kmínu kořenného byla provedena na třech v ČR registrovaných odrůdách (Kepron, Rekord, Prochan). Vzorky byly dodány vedoucí bakalářské práce v papírových sáčcích označenými jednotlivými čísly a skladovány v suchu při pokojové teplotě. Byly provedeny dvě metody extrakce, a to destilace s vodní parou a superkritická fluidní extrakce. Destilace s vodní parou byla provedena dle normy ČSN 58 0110 a optimalizace metody SFE dle Ing. Jitky Fojtkové, Ph.D.. Před samotnou extrakcí se musely připravit vzorky. Vzorky se pomlely na tříštivém mlýnku VIPO. Pro destilaci s vodní parou byla brána navážka 10 g a pro metodu superkritické fluidní extrakce (SFE) navážka 0,5 g vzorku kmínu. Každý vzorek se destiloval a extrahoval dvakrát. Poměry jednotlivých složek silice kmínu po extrakci byly zanalyzovány pomocí GC/FID za daných podmínek.
4.1 Destilace s vodní parou Tato metoda je osvědčená a obecně užívaná pro získání silice z příslušné drogy. Postupuje se podle Českého lékopisu 2009 nebo podle normy ČSN 58 0110. Používá se speciální přístroj (Obrázek 2), který před samotnou destilací musí být vyčištěn 10 % kyselinou chromsírovou a propláchnut několikrát destilovanou vodou. Příslušný vzorek drogy (kmínu) se rozemele, naváží a vloží do 1 l varné baňky, přidá se 400 ml vody a varné kamínky proti utajenému varu a destiluje se 4 hodiny po 2 ml/min, avšak záleží na druhu drogy. Během destilace byla uzavřena postranní trubice chomáčkem vaty. Po skončení destilace se nechá aparatura pár minut zchladnout, odečte se množství silice v mililitrech. Silice se zachytí do vialky a uchovává při teplotě –12 °C. Pro účely stanovení složení silice plynovým chromatografem se nepřidával xylen, protože silici pak nelze snadno oddělit od xylenu.
36
Obsah silice byl vypočten v hmotnostních procentech dle rovnice: x (%) =
1 00 ⋅ a ⋅ h n
,
kde a je objem silice v ml, h je měrná hmotnost silice (pro kmín 0,909 g.cm-3) a n navážka vzorku v g.
4.2 Superkritická fluidní extrakce (SFE) SFE byla provedena pomocí superkritického fluidního extraktoru SE-1 firmy SEKO-K, s.r.o. Brno (Obrázek 3). Vzorek kmínu byl dávkován do extrakční cely (Obrázek 4). Pro extrakci silice pomocí SFE z mletých vzorků kmínu byly zvoleny tyto podmínky extrakce: CO2 v nadkritickém stavu, tlak 40 MPa, teplota 80 °C, modifikátor chloroform (300 µl in situ) a doba extrakce 20 minut do záchytné nádobky (vialky) s n-hexanem. Následně byly silice přepipetovány do menších vialek vhodné pro identifikaci pomocí GC/FID. Všechny extrahované silice byly uchovávány před analýzou GC/FID při teplotě –12 °C.
4.3 Identifikace – GC/FID Analýza extraktů kmínu byla provedena plynovou chromatografií s plamenověionizačním detektorem pomocí uvedených přístrojů a podmínek: plynový chromatograf HP4890D (Obrázek 5), kolona HP-INNOWax (film Croslinked Polyethylene Glycol, 30 m x 0,25 mm x 0,5 µm filmu, vše Hewlett Packard) při průtoku helia 1 ml/min, nástřiku 1 µl silice kmínu naředěné hexanem při splitu 50:1, teplotě nástřiku 240 °C, teplotě detektoru 250 °C v teplotním programu: 60 °C, 5 °C/min na 150 °C a 40 °C/min. na 220 °C (celkový čas analýzy 20,07 min.). Byl identifikován a stanovován obsah karvonu a limonenu u 3 odrůd kmínu kořenného, které jsou v kmínové silici zastoupeny až z 95 %. Standarty byly použity d-Limonene a l-Carvone od firmy Fluka, Švýcarsko. Výsledky jsou zaznamenány v tabulce (Tabulka 1). Zároveň je uveden příklad chromatogramu z analýzy (Graf 1). Chromatogramy a kalibrační grafy byly vyhodnoceny pomocí stanice CSW. K integraci plochy píků byl použit integrátor od firmy Data Apex Praha. Stanice CSW provádí integraci se získanými chromatogramy, které se poté ukládají na disk i s úpravami. Po vytvoření kalibračního souboru dochází k detekci píků dle retenčních časů standardů a dále se výsledky zpracovávají pomocí programu Microsoft Excel.
37
5
Výsledky a diskuse
Sledován byl vliv tří odrůd kmínu kořenného na množství silice. Byly provedeny dvě metody extrakce: destilace s vodní parou a superkritická fluidní extrakce (SFE). Získaná kmínová silice byla poté identifikována pomocí plynové chromatografie s plamenově ionizačním detektorem. Sledován byl poměr zastoupení karvonu a limonenu v kmínové silici. Celkem bylo vyhodnoceno 20 vzorků od každé odrůdy a udělán průměr pro každou odrůdu. Z tabulky vyplývá, že nejvíce silice obsahuje odrůda Prochan (4,98 %), jak u metody destilace vodní parou (4,98 %), tak u superkritické fluidní extrakce (4,17 %). Poměry mezi složkami silice limonenu a karvonu se moc neliší. Co se týká obou metod, tak získaná silice z kmínu kořenného metodou destilace vodní parou byla bílé tukové konzistence a pomocí SFE byla zabarvena do žlutavé barvy. Z výsledků lze vyčíst, že metoda SFE je optimální pro izolaci silice z analytu a srovnatelná s metodou destilace vodní parou. Podobné výsledky byly dosaženy v disertační (SEDLÁKOVÁ, 2003) a diplomové práci (OLŠANSKÝ, 2006). Tabulka 1 Vliv odrůdy kmínu – Prochan, Kepron a Rekord Metody stanovení Odrůda
Destilace s vodní parou x (%)
RSD (%)* K (%)
SFE L (%)
x (%)
RSD (%)*
K (%)
L (%)
Prochan
4,98
1,83
64,42
35,58
4,17
1,40
67,45
32,55
Kepron
4,57
1,45
62,12
37,88
3,88
1,77
66,58
33,42
Rekord
3,89
1,02
63,97
36,03
3,36
1,81
67,17
32,83
* n = 5 (počet opakování)
Graf 1 Příklad chromatogramu z rozboru kmínové silice z odrůdy Prochan 38
6
ZÁVĚR
Některé léčivé, aromatické a kořeninové rostliny vděčí za léčivé účinky a chuť silicím, které se v nich nacházejí. Obsah silice má rozhodující význam pro jakost koření, které každodenně užíváme k přípravě nápojů a pokrmů, aby dodaly požadovanému jídlu náležitou chuť a vůni. Široké uplatnění siličných drog je i v likérnictví. Kromě potravinářského užití mají i velké uplatnění ve farmaceutickém průmyslu jako léčivé preparáty ve formě mastí, kloktadel, tablet, bonbonů a bylinných čajů. Obsah silice je důležitý a rozhodující kvalitativní požadavek na jakost koření. Legislativní požadavek na minimální obsah silice v koření, obsah nerozpustného popela a příměsí, požadovaná vlhkost a další parametry jsou uvedeny v Zákoně o potravinách a tabákových výrobcích č. 110/1997, ve vyhlášce č. 331 (VYHLÁŠKA 331, 1997). Na množství a složení silice má vliv celá řada faktorů: termín sklizně, regulátory dozrávání, zdravotní stav rostliny, oblast pěstování, odrůda, vliv fungicidů, doba sběru, doba uskladnění, vliv ošetření porostu. Dále je zapotřebí zvolit vhodnou úpravu suroviny a navážku pro izolaci silice jako je mechanická úprava ve formě mletí, řezání, drcení, přesátí, popř. fermentace a zajištění optimálních podmínek pro danou metodu (teplota, tlak, rychlost extrakce). Nejčastěji se silice v přírodním materiálu izolují destilací s vodní parou, ale osvědčená je i metoda superkritická fluidní extrakce (SFE), která je vhodná pro malé množství vzorku. Příkladem analytů, u nichž se SFE rutinně využívá, jsou polycyklické aromatické uhlovodíky, vonné silice a látky s léčivými účinky obsažené v přírodních matricích (terpeny v koření a zelených částech rostlin). Hlavním cílem této práce bylo seznámit se s metodami izolace a identifikace silic. Byly stanovovány silice u heřmánku, koriandru, majoránky, mateřídoušky a perily destilací s vodní parou. Získané výsledky jsou srovnatelné v opakovaných stanoveních, avšak metoda je pomalá a vyžaduje přístrojové vybavení, které je křehké a podléhá snadno opotřebení. Dále byla práce zaměřena na stanovení množství silice u kmínu a to srovnání metod destilace s vodní parou a superkritické fluidní extrakce. Obě metody prokázaly vysokou reprodukovatelnost výsledků, ale z hlediska úspory času a množství vzorku potřebné k analýze se jeví SFE jako lepší metoda. K identifikaci obsahu silice je nejvhodnější plynová chromatografie s plamenově ionizačním nebo hmotnostním detektorem (GC/FID; GC/MS).
39
7
SEZNAM POUŽITÉ A CITOVANÉ LITERATURY
Citace monografie (kniha, skripta, katalog, články) ADAM M., JUKLOVÁ M., BAJER T., EISNER A. & VENTURA K., 2005: Comparison of three different solid-phase microextraction fibros for analysis of essential oils in yacon (Smallanthus sonchifolius) leaves. Journal of Chromatography, 1084: 2–6 ADAM M., DOBIÁŠ P., EISNER A. & VENTURA K., 2008: Headspace single-drop microextraction of herbal essential oils. Journal Separation Science, 31: 356–363 ADAM M., DOBIÁŠ P., PAVLÍKOVÁ P. & VENTURA K., 2009: Comparison of solid-phase and single-drop microextractions for headspace analysis of herbal essential oils. Central European Journal of Chemistry, 7 (3): 303–311 AHMAD U.K., SIRAT H.M., SANAGI M.M. & SMITH R.M., 1994: J. Microbiol. Sep., 6: 27–32¨ BOUWMEESTER H.J., DAVIES J. A.R. & TOXOPEUS H., 1995: J. Agric. Food Chem., 43: 3057 CAMEL V., TAMBUTE A. & CAUDE M., 1993: J. Chromatogr., 642: 263 ČESKOSLOVENSKÁ STÁTNÍ NORMA, 1964: ČSN 58 0110 Metody zkoušení koření. Stanovení silic. ÚNM, Praha ČESKOSLOVENSKÁ STÁTNÍ NORMA, 1995: ČSN 6571 Koření, kořenící látky a byliny. Stanovení obsahu těkavých olejů (silic). Český normalizační institut ČESKÝ LÉKOPIS 2009, Grada Publishing, a.s. Praha DOBBS J.M., WONG J.M., LAHIERE R.J. & JOHNSTON K.P., 1987: Ind. Eng. Chem. Res., 26: 56 DOUBRAVA J., KOŠTÍŘ J. & POSPÍŠIL J., 1984: Základy biochemie. Státní pedagogické nakladatelství, Praha, 231 s. GLOWACKI S., 1994: Sylwan, 1: 27–42 GRULICHOVÁ H., 2008: Využití techniky PSE (extrakce rozpouštědlem za zvýšeného tlaku a teploty) v analýze potravin. Bakalářská práce, VUT v Brně, Brno, 47 s. FOJTOVÁ J., LOJKOVÁ L., KOCOURKOVÁ B., 2005: Stanovení těkavých látek v rostlinných materiálech pomocí superkritické fluidní extrakce (SFE). In Sborník - XI. odborný seminář s mezinárodní účastí, Aktuální otázky pěstování, zpracování a využití léčivých aromatických a kořeninových rostlin. 1. vyd. Brno: MZLU v Brně, ediční středisko, s. 53-58. ISBN 80-7157-914-9. 40
HAY R.K.M., 1993: Volatile Oil Crops: their biology, biochemistry and production. 1. vyd. New York: John Wiley & Sons, 14 s. ISBN 0-582-07867-9 HÁDEK K., 2006: Katalog kosmetických preparátů. 87–110 s. HARTONEM K., MANNINEN P., HILTUNEN R. & RIEKKOLA M.L., 1992: Symp. Capillary Chromatography, 14: 802 Riva del Garda, Itálie HEATON D.M., BARTLE K.D., RAYNER C.M. & CLIFFORD A.A., 1993: HRC, 16: 666–670 HERAVI J.M. & SERESHTI, 2007: Determination of essential oil components of Artemisia haussknechtii Boiss. using simultaneous hydrodistillation-static headspace liquid phase microextraction-gas chromatography mass spektrometry. Journal of Chromatography, 1160: 81–89 CHURÁČEK J., 1992: Identifikace a stanovení cizorodých toxikologicky významných organických látek v materiálech a prostředí (skripta licenčního studia II), VŠCHT Pardubice, Pardubice, 125 s. JANČÁŘOVÁ I. & JANČÁŘ L., 2008: Analytická chemie, MZLU v Brně, Brno, 195 s. ISBN 978-80-7157-647-1 KARLÍČEK R. et al., 2001: Analytická chemie pro farmaceuty. Nakladatelství Karolinum, Praha, 265–279 s. ISBN 80-246-0348-9 KLOUDA P., 1996: Moderní analytické metody. Nakladatelství Pavel Klouda, Ostrava, 10–62 s. ISBN 80-902155-0-5 KOVAR K.A. & BOCK E., 1983: Quantitative bestimmung einer mischung aus extrakten atherischer oldrogen mittels hochdruckflussigkeits-chromatographie. Journal of Chromatography, 262: 285–291 KLEDUS B., 2010: Přednášky z moderních instrumentálních metod KŘESŤANOVÁ D., DVOŘÁKOVÁ A., PERGLEROVÁ E., KANTA J. & ŠULC J., 1997: Jídlo jako jed. Reader´s Digest Výběr, Praha, 152 s. ISBN 80-902069-7-2 LEHOTAY J., 2009: Seperačné metódy v analytickej chémii, Nakladatelství STU, Bratislava, 68–69 s. ISBN 978-80-227-3036-5 MELICHAROVÁ E. & POTRUSILOVÁ D., 1993: Farmakognozie, Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví, Brno, 182–224 s. ISBN 80-7013-153-5 MERGL V. & KOZÁČKOVÁ H., 2000: Chemická laboratorní cvičení – anorganická chemie, SPŠCH v Brně, Brno, 49–51 s.
41
MINAŘÍK J. (ed.), 1979: Farmakognosie, Avicenum zdravotnické nakladatelství, Praha, 184–234 s. MLEJOVÁ M., PAVLÍKOVÁ P., DOBIÁŠ P., ADAM M. & VENTURA K., 2010: Aplikace mikroextrakce tuhou fází pro analýzu bylinných silic, VŠCHT Pardubice, Pardubice, 166–171 s. MOSSA J.S., EL-OBEID H.A. & HASSAN M.M.A., 1980: PMR Assay of Essential Oils – IV: Assay of Carvone in Caraway and Dill oil. Spectroscopy Letters, 13 (1): 49– 57 MUZIKA R.M., CAMPBEL C.L., HANOWER J.W. & SMITH A.L., 1990: Journal of Chemical Ecology, 16: 2713–2722 OLŠANSKÝ R., 2006: Stabilita a kvalita silic vybraných druhů LAKR z různých pěstitelských podmínek. Diplomová práce, MZLU v Brně, Brno, 44 s. PAVEL J., 1989: Metabolism of terpenes, Plant biochemistry I., MZLU in Brno, Brno, 135 s. PLANETA J., 1993: Superkritická fluidní extrakce, Katedra analytické chemie VŠCHT Pardubice, Pardubice, 30 s. RADULESCU
V.,
CHILIMENT
S.
&
OPREA
E.,
2004:
Capillary
gas
chromatography–mass spectrometry of volatile and semi-volatile compounds of Salvia officinalis. Journal of Chromatography A, 1027: 121–126 RICHTER J. & SCHELLENBERG I., 2007: Comparison of different extraction methods for the determination of essential oils and related compounds from aromatic plants and optimization of solid-phase microextraction/gas chromatography. Anal Bioanal Chem, 387: 2207–2217 SALAŠ J. (ed.), 1987: Analytická chemie, Avicenum zdravotnické nakladatelství, Praha, 204–228 s. SANAGI M.M., AHMAD U.K. & SMITH R.M., 1993: J. Chromatogr. Sci., 31: 20–25 SEDLÁKOVÁ J., 1997: Superkritická fluidní extrakce VIII, Diplomová práce, University of Pardubice, Pardubice, 50 s. SEDLÁKOVÁ J., 2003: Vliv vnějších faktorů na obsah silic v rostlinách. Disertační práce, MZLU V Brně, Brno, 76 s. SEDLÁKOVÁ J., LOJKOVÁ L. & KUBÁŇ V., 2003: Chem. Pap., 57: 358–362
42
SEDLÁKOVÁ J., KOCOURKOVÁ B. & KUBÁŇ V., 2001: Determinaton of Essential Oils Content and Composition in Caraway (Carum carvi L.). Czech Journal of Food Scientific, 19: 31–36 SEDLÁKOVÁ J., KUBÁŇ V., HOLUBOVÁ V. & KOCOURKOVÁ B., 1998: In collection of works 2 THETA, 120–126 SEIF EL DIN A.A., KORENY M.A. & ABDEL SALAM N.A., 1983: Application of second derivate ultraviolet spectrometry, Part II: Determination of cinnamic aldehyde and carvone in volatile oils. Analytical Letters, 16 (B12): 891–901 SCHAEFFER S.T., ZALKOW L.H. & TEJA A.S., 1989: ACS Symp. Ser., 406: 417-433 SCHAEFER P.R. & HANOVER J.W., 1986: For. Sci., 32: 725–734 SMAIN CH., HAMID A-A., AHCÉNE L., D. C. E.. 2005: Microwave-assisted extraction kinetics of terpenes from caraway seeds. Chemical Engineering and Processing, 44: 1320–1326 SMITH R.M. & BURFORD M.D., 1992: J. Chromatogr., 627: 255–261 SUPUKA J., BERTA F. & CHLADNÁ A., 1997: Trees, 11: 176–182 SUPUKA J. & BERTA F., 1998: Ekológia, 17: 102–116 SCHÜRMANN W. & ZEIGLER H., 1993: Naturwissenschaften, 80: 276–278 ŠKÁRKA B. & FERENČÍK M., 1987: Biochémia, 238–255 ŠMIROUS P., KOCOURKOVÁ B. & SEDLÁKOVÁ J.: Cultivation and breeding caraway in the Czech republic. The 8th International Congress Phytooharm 2004, Proceedings of the VIII. International Congerss Phytopharm 2004, Mikkeli, Finsko, 21. - 23. 7. 2004, 529-532. TEKEL J. & MIKUŠ P., 2005: Vybrané kapitoly z analytickej chémie – analýza látok v biologických systémoch, Univerzita Komenského v Bratislave, Bratislava, 24–57 s. ISBN 80-223-1988-0 TOMKO J., 1999: Farmakognózia, Vydavatelstvo Osveta, Martin, ISBN 80-8063-0143 UHLÍŘOVÁ Š., 2008: Izolace a stanovení silic ve vzorcích rostlinného původu. Bakalářská práce, VŠCHT Pardubice, Pardubice, zkrácená verze: 21 s. VENTURA K., 1995: Příprava vzorku ve stopové analýze organických látek, extrakce kapalinou, plynem, sorbentem, superkritická extrakce a chromatografie. Diplomová práce, VŠCHT Pardubice, Pardubice, 56 s. VACEK L., 1995: Terpenoids, Organic chemistry, MZLU Brno, Brno, 148–154 43
VOLDŘICH M., 2009: Výroba aromat a trestí. In: Co byste měli vědět o výrobě potravin? : Technologie potravin. Vyd. 1. Ostrava : Key Publishing, s. 529–532, ISBN 978-80-7418-051-4 Vyhláška 331 Ministerstva zemědělství z roku 1997, zákona č. 110/1997 Sb, o potravinách a tabákových výrobcích a o změně a doplnění některých souvisejících zákonů, pro koření, jedlou sůl, dehydratované výrobky a ochucovadla a hořčici
Citace internetu ČÍŽKOVÁ, L.; ADAM, M.; DOBIÁŠ, P.; VENTURA, K. Aplikace vybraných mikroextrakčních technik na headspace analýzu silic.[online]. 2008, [cit. 2011-01-25]. Dostupný
z
WWW:
. MLEJOVÁ, V.; ADAM, M.; DOBIÁŠ, P.; PAVLÍKOVÁ, P.; VENTURA, K. Aplikace vybraných mikroextrakčních technik při stanovení rostlinných silic.[online]. 2008, [cit. 2011-01-23]. Dostupný z WWW: . SÝS, M. Mikroextrakční metody využívání tuhé sorbenty. 2009. 46 s. Bakalářská práce. Univerzita
Pardubice.
Dostupné
z
WWW:
JURIČ, P. Aromaterapie v lékařství : Aromedica.[online] 2003,.[cit. 2010-10-28]. Dostupné z WWW: .
44
8
SEZNAM OBRÁZKŮ
Obrázek 1 Fázový diagram čisté látky (v p-T souřadnicích) (SEDLÁKOVÁ, 2003) Obrázek 2 Destilační přístroj (SEDLÁKOVÁ, 2003) Obrázek 3 Nadkritický fluidní extraktor SE-1 (SEDLÁKOVÁ, 2003) Obrázek 4 Extrakční cela SFE Obrázek 5 Plynový chromatograf HP-4890D (SEDLÁKOVÁ, 2003)
45
9
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK
ASE
- Zrychlená extrakce rozpouštědlem (Accelerated Solvent Extraction)
FID
- Plamenově-ionizační detektor (Flame Ionization Detector)
TLC
- Tenkovrstvá kapalinová chromatografie
HPLC - Vysoceúčinná kapal. chromatog. (High Performance Liquid Chromatography) GC
- Plynová chromatografie (Gass Chromatography)
K
- Kritický bod
MAE - Mikrovlnná extrakce (Microwave-Assisted Extraction) MS
- Hmotnostní spektrometrie (Mass Spectrometry)
pk
- Kritický tlak
PLE
- Extrakce rozpouštědlem za vyššího tlaku (Pressurized Liquid Extraction)
SF
- Nadkritická tekutina (Supercritical Fluid)
SFE
- Extrakce nadkritickou tekutinou (Supercritical Fluid Extraction)
SFC
-Chromatografie s nadkritickou mobilní fází
SPME - Mikroextrakce na pevné fázi (Solid Phase MicroExtraction) Tk
- Kritická teplota
PSE
- Tlaková extrakce rozpouštědlem (Pressurized Solvent Extraction)
SDME - Mikroextrakce jednou kapkou LPME - Mikroextrakce kapalnou fází
46
10 PŘÍLOHY
Obrázek 1 Fázový diagram čisté látky (v p-T souřadnicích) (SEDLÁKOVÁ, 2003)
Obrázek 2 Destilační přístroj (SEDLÁKOVÁ, 2003)
47
Obrázek 3 Nadkritický fluidní extraktor SE-1 (SEDLÁKOVÁ, 2003)
Obrázek 4 Extrakční cela SFE
48
Obrázek 5 Plynový chromatograf HP-4890D (SEDLÁKOVÁ, 2003)
49