Stanovení chmelových silic metodou SPME – GC Eva Kašparová, Martin Adam, Karel Ventura
Katedra analytické chemie, Fakulta chemicko-technologická, Univerzita Pardubice, nám. Čs. legií 565, 532 10 Pardubice, E-mail:
[email protected] Časová náročnost a vyšší spotřeba rozpouštědel jsou hlavní nevýhody tradičních extrakčních technik, a to hlavně z hlediska zdravotního, ekologického a ekonomického. Ve snaze odstranit či alespoň minimalizovat nevýhody "klasických"
extrakčních technik se
zavádějí extrakční techniky moderní. Jednou z těchto metod je i mikroextrakce tuhou fází – SPME. Tato technika je poměrně rychlá, nepotřebuje rozpouštědla či komplikované aparatury, použitelná v širokém koncentračním rozsahu a volbou vhodného typu vlákna se dosáhne reprodukovatelných výsledků i pro nízké koncentrace analytů 1. Tato práce je zaměřena na využití techniky SPME s následnou separací a analýzou na plynovém chromatografu (GC) pro stanovení charakteristických látek chmele. Chemické složení chmele je závislé na odrůdě, provenienci, ročníku a způsobu posklizňové úpravy. Pro kvalitu chmele je rozhodující obsah pivovarsky cenných složek, zejména pryskyřic, polyfenolů (tříslovin) a silic. Při charakterizaci chmele se využívají především chmelové silice (vytvářejí charakteristické chmelové aroma 2), kdy se zkoumá jejich celkový obsah a poměrové zastoupení jednotlivých sloučenin. Mezi chmelové silice patří především farnesen, humulen, myrcen a karyofylen 3, viz. obr. 1. Jedná se o látky terpenického charakteru. Ke zjištění optimálních podmínek pro toto stanovení byla vybrána odrůda chmele Premiant. Zjištěné optimální podmínky byly dále zkoušeny na Žateckém poloraném červeňáku. Obě odrůdy patří mezi nejvýznamnější odrůdy chmele v ČR, pocházejí z oblasti Žatecka a reprezentují úrodu roku 2001. Vzorky chmelových hlávek byly dodány již vysušené. Pro analýzu byly hlávky chmele pomlety, naváženy do 8 ml vzorkovacích nádobek a uzavřeny víčky se septy potaženými teflonem (Supelco, Bellefonte, USA) a uchovány v lednici pro případ možné oxidace analyzovaných látek. Analyzované vzorky byly před vlastní extrakcí temperovány po dobu 30 minut v termostatu KL 1 (Laboratorní přístroje Praha, ČR) vybaveným míchadlem. Vzorky o různých hmotnostech byly extrahovány z prostoru nad vzorkem (při rozdílných extrakčních teplotách a časech) 100 µm polydimethylsiloxanovým (PDMS) 1 cm dlouhým vláknem
4
(Supelco, Bellefonte, USA).
K uchycení vlákna byl používán SPME držák pro ruční vzorkování (Supelco, Bellefonte, USA). Hloubka vsunutí jehly do vzorkovací nádobky byla vždy 1 cm. Chmelové silice sorbované na vlákně byly po tepelné desorpci separovány a stanovovány na plynovým chromatografu UNICAM 4600 (Unicam Analytical Systems, Cambridge, UK). Chromatograf je vybaven linerem určeným pro SPME (Vývojová dílna AV ČR, Turnov, ČR) a plamenovým ionizačním detektorem. Použita byla kapilární kolona typu DB-5 (15 m x 0,53 mm) a tloušťkou filmu 5 % fenylmethylsilikonu 1,5 µm (J & W Scientific, Folsom, USA). Jako nosný plyn bylo použito helium (čistota 4,6, Linde Technoplyn a.s., Praha, ČR). Na držáku vlákna byla při desorpci nastavena maximální hloubka vsunutí jehly do SPME lineru (4,5 cm). Desorbovaný analyt byl pak veden na kolonu přímo bez použití děliče toku. GC analýza vzorků chmele probíhala při teplotě nástřiku 220 °C a teplotě detektoru 3 190 °C. Na vstupu kolony byl přetlak 80 kPa. Teplota na koloně byla řízena teplotním programem, viz. tab. 1. Vyhodnocení výsledků bylo provedeno na integrační stanici CSW (Data Apex Praha, ČR). Pro každý parametr byla vypočtena průměrná hodnota plochy píků (humulen, myrcen) ze šesti měření a směrodatná odchylka. Tabulka 1 Teplotní program na koloně Počátek [°C]
Interval
Konec [°C]
60
5 min
60
60
2 °C/min
120
120
30 °C/min
280
280
5 min
280
Podle ploch píků byly nalezeny vhodné sloučeniny pro charakterizaci chmele a optimální podmínky pro jejich stanovení. Pro kvalitní vyhodnocení bylo použito standardních roztoků: Myrcen (90 %, Sigma – Aldrich, Praha, ČR) a Humulen (98 % Sigma – Aldrich, Praha, ČR). Pro jejich analýzu bylo vždy odebráno 50 µl par nad 1 ml standardu v uzavřené 8 ml vzorkovací nádobce. K identifikaci karyofylenu a farnesenu byla použita norma ČSN 46 2520-12 o zkoušení chmele 3 a na základě porovnání retenčních časů byly tyto dvě sloučeniny identifikovány. Optimální podmínky byly vybrány s ohledem na plochy píků myrcenu a humulenu. Z testovaných teplot sorpce (30, 40, 50, 60, 70, 80 a 90 °C) byla jako optimální zvolena teplota 80 °C . Při vyšší teplotě již nebyla pozorována žádná změna ve velikosti odezvy.
Z testovaných dob sorpce (10, 15, 20, 30, 40, 50, 60 a 70 minut) byla zvolena jako optimální doba 20 min. Při delší době sorpce sice plocha humulenu vzrůstala, ale díky nižší odezvě myrcenu, která se zvyšující dobou sorpce ještě klesala, viz. obr. 2, byla zvolena již zmíněná doba extrakce. Z testovaných navážek vzorku (0,01; 0,05; 0,1; 0,3; 0,5; 0,7 a 0,9 g) byla zvolena navážka vzorku 0,5 g. Se zvyšující navážkou vzorku odezva obou silic již klesala. Zjištěné výsledky potvrdily, že metoda SPME je dostatečně citlivá a s vhodnou koncovou analytickou technikou je ji možné využívat pro stanovení charakteristických látek – chmelových silic v této rostlině a tím i k určení její odrůdy. Což je patrné porovnáním chromatogramů dvou různých odrůd chmele, na kterých byla tato metoda zkoušena, viz. obr. 3 a 4 a tab. 2.
Obr. 1 Strukturní vzorce hlavních chmelových silic.
myrcen
farnesen
karyofylen
humulen
Obr. 2 Závislost ploch píků stanovovaných látek na době sorpce myrcen
humulen
16000
plocha píku [mV.s]
14000 12000 10000 8000 6000 4000 2000 0 10
15
20
30
40
50
60
70
“ as [min]
Obr. 3 Chromatogram extraktu chmelových silic (odrůda Premiant) – měřeno za optimálních podmínek 750
plocha píku [mV.s]
3
500
1
250
4
2
0 0
5
10
15
20
25
30
retenční čas [min]
1 – myrcen, 2 – karyofylen, 3 – humulen, 4 – farnesen.
35
40
Obr. 4 Chromatogram extraktu chmelových silic (odrůda Žatecký poloraný čeveňák) – měřeno za optimálních podmínek 300 1
plocha píku [mV.s]
250 3
200 150
2
4
100 50 0 0
5
10
15
20
25
30
35
40
retenční čas [min]
1 – myrcen, 2 – karyofylen, 3 – humulen, 4 – farnesen
Poděkování Práce byla provedena díky finanční podpoře grantového projektu Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy ČR (projekt MŠM 253100002) a Grantové Agentury ČR (projekt 203/02/0023)
Literatura 1.
SPME, Sigma Aldrich s. r. o., 2002
2.
J.Čepička a kol.: Obecná potravinářská technologie, skripta VŠCHT Praha 2001
3. ČSN 46 2520-12: Zkoušení chmele 4. Kovačevič M., Kač M,: J. Chromatogr. A 918, 159 (2001)
