KSZGYSZ Kármentesítési Konferencia 2015-03-24
Hormonok, gyógyszermaradványok és más biológiailag aktív anyagok a felszín alatti vizekben Palotai Zoltán és Szigeti Tamás – Wessling Hungary Kft. 1047 Budapest, Fóti út 56.
KSZGYSZ Kármentesítési Konferencia 2015-03-24
anabolic
dexamethasone
Intracellular effects
blood life
cytoplasm
serotonone
hormonok
Prednisone
cholesterol
ligand
Generally
sterols
sildenafil
proteins
chloride
quality
synthetic GROUND WATERS aspirin
Nuclear effect
simiarity
anticoncipiens
shock
WATERS DNA-binding Clearity
Gyógyszerek életünk Felszíni és of ivóvizekanalysis globulin
Liquid chromatography
specificity
Bioaktív anyagok vizsgálata
Hormone binding
minősége
complex
interact
oxandrolon
diffuse
Non-steroidal
acetate
nongenomic
spectrometry EDS mass mineralocorticoids Endogene disruptors dopamie
glands
egyéb gyógyszermaradékok vitamin receptors MALDI TOF MS szteroidok Gas chromatography molecule glycocorticoids
health
androgenes
peszticidek maradékai Steroide receptor
A fizikai folyamatok iránya – A hőtan II. fő tétele…
entropy
A fizikai folyamatok iránya – A hőtan II. fő tétele…
A szabadba kijutott szennyezőanyag koncentrációja a szennyezés központjától kezdve folyamatosan csökken, de az attól mért tetszőlegesen nagy távolságban elvileg soha nem lesz zérus.
A környezetbe került szennyezőanyagok felezési idejüktől függően esetenként igen kis koncentrációban, de a szennyezés forrásától nagy távolságokban is kimutathatóak.
Diffúzió (Brown-féle hőmozgás)
Hajtóereje a térrészek közötti koncentráció-különbség:
Szennyezőanyagok mozgása a környezetben
Szennyezőanyagok mozgása a környezetben
Milyen anyagokkal kell számolnunk? – Néhány példa
Xenobiotikum – Az élő szervezetek számára idegen anyagok
Hulladékokból származó toxikus fémek, félfémek ionjai
Szerves vegyületek százezrei…
Szerves oldószerek maradékai
Gyógyszermaradványok
Detergensek, tenzidek
VÍZ
VÍZ
OLAJ
VÍZ
VÍZ
Kozmetikumok aktív anyagai
Mikro plasztik szennyezés
Mikro plasztik szennyezés – fizikai ártalmak és migráció
Növényvédő szerek maradványai
Térjünk vissza egy gondolat erejéig a gyógyszerekhez!
Térjünk vissza egy gondolat erejéig a gyógyszerekhez!
!
Az elmúlt 40 évben Magyarországon 1570 gyógyszerkészítményt engedélyeztek
Gyógyszermaradékok felszíni vizekből (HPLC/MS/MS/MS) 20 ppt karbamazepin 10 ppt atorvasztatin
ppt = ng/liter
5 ppt paracetamol
5 ppt ciprofloxacin
Az EU Parlament és Tanács 2000/60/EK irányelve
EU víz keretirányelv előírása: minden „egyéb” nem-kívánatos anyagot vizsgálni kell Technikai lehetőségek: ICP, GC, HPLC, MALDI-TOF Lényegében bármilyen szerves molekula vizsgálható, kimutatható, szelektíven, érzékenyen, mennyiségileg vigyázni kell (MALDI) http://www.euvki.hu/docs/VKI_en_hu_hivatalos_20040901.pdf
Az EU Parlament és Tanács 2000/60/EK irányelve
http://www.euvki.hu/docs/VKI_en_hu_hivatalos_20040901.pdf
Az EU Parlament és a Tanács 2008/105/EK irányelve AZ ELSŐBBSÉGI ANYAGOKRA ÉS BIZONYOS EGYÉB SZENNYEZŐ ANYAGOKRA VONATKOZÓ KÖRNYEZETMINŐSÉGI ELŐÍRÁSOK A-rész: KÖRNYEZETMINŐSÉGI ELŐÍRÁSOK (EQS) (1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
AA-EQS Egyébi felszíni vizek
MAC-EQS Szárazföldi felszíni vizek
MAC-EQS Egyébi felszíni vizek
Sorszám
Anyag neve
CAS-szám
AA-EQS Szárazföldi felszíni vizek
(1)
Alaklór
15972-60-8
0,3
0,3
0,7
0,7
(2)
Antracén
120-12-7
0,1
0,1
0,4
0,4
AA: MAC: EQS:
Éves átlagérték – Annual Average Maximálisan megengedhető koncentráció (µg/L) – Maximum Allowable Concentration Környezetminőségi előírások – Environmental Quality Standards http://eur-lex.europa.eu/legal-content/HU/TXT/PDF/?uri=CELEX:32008L0105&from=HU
Az EU Parlament és a Tanács 2008/105/EK irányelve AZ ELSŐBBSÉGI ANYAGOKRA ÉS BIZONYOS EGYÉB SZENNYEZŐ ANYAGOKRA VONATKOZÓ KÖRNYEZETMINŐSÉGI ELŐÍRÁSOK A-rész: KÖRNYEZETMINŐSÉGI ELŐÍRÁSOK (EQS) (1)
(2)
(3)
(4)
(5)
(6)
(7)
AA-EQS Egyébi felszíni vizek
MAC-EQS Szárazföldi felszíni vizek
MAC-EQS Egyébi felszíni vizek
Sorszám
Anyag neve
CAS-szám
AA-EQS Szárazföldi felszíni vizek
(1)
Alaklór
15972-60-8
0,3
0,3
0,7
0,7
(2)
Antracén
120-12-7
0,1
0,1
0,4
0,4
AA: MAC: EQS:
Éves átlagérték – Annual Average Maximálisan megengedhető koncentráció (µg/L) – Maximum Allowable Concentration Környezetminőségi előírások – Environmental Quality Standards http://eur-lex.europa.eu/legal-content/HU/TXT/PDF/?uri=CELEX:32008L0105&from=HU
Egyik példa: 10-Bis(fenil-ethinil)antracén
Az aromás szénhidrogének a melegvérűekben az aromás szénhidrogén receptorra hatnak (AHR) → Citochrom P450 enzimrendszer (toxikus anyagok metabolizálása)
Másik példa: Alaklór (klór-acetanilid származék) herbicid Az aromás szénhidrogének a melegvérűekben az aromás szénhidrogén receptorra hatnak (AHR) → Citochrom P450 enzimrendszer (toxikus anyagok metabolizálása)
H3C
CH3
CH3
Ibuprofen (fájdalom- és lázcsillapító)
Tervek a felszíni víz határértékre : 10 ng/L
A szabványosítás gyerekcípőben van METHOD 539: DETERMINATION OF HORMONES IN DRINKING WATER BY SOLID PHASE EXTRACTION (SPE) AND LIQUID CHROMATOGRAPHY ELECTROSPRAY IONIZATION TANDEM MASS SPECTROMETRY (LC-ESI-MS/MS)
METHOD 1694: PHARMACEUTICALS AND PERSONAL CARE PRODUCTS IN WATER,SOIL, SEDIMENT, AND BIOSOLIDS BY HPLC/MS/MS DECEMBER 2007
A felszín alá került szennyezések forrásai és elhelyezkedése
Szél Eső Település
Hulladéklerakás Iszap
Injektáló kút Tárolómedence
Ipartelep
Talaj
Mikroorganizmusok
Vízzáró réteg
Szennyezett csóva Alapkőzet
Vízadó réteg
Magyarország felszín alatti víztestei (2014.10.19.)
Porózus termál Hideg karszt Meleg termál Hegyvidék Leáramlás
Feláramlás
Mikroszennyezők eliminálása kémiai módszerekkel
Záray professzor: szupertisztító eljárás során a mikro-szennyezőket szűrné ki a vassav (H2FeO4) sóival, a ferrátokkal való oxidáció révén. A kutatás az ELTE Környezettudományi Kooperációs Kutatóközpont Irányításával folyik. Kérdés, hogy a bomlástermékek nem veszélyesebbek-e, mint az eredeti szennyezők?
A kémiai anyagok lebomlása (környezetben, szervezetben)
Etinil-ösztradiol → 6-alfa-hidroxi-etinilösztradiol
Az OH csoport révén a molekula vízoldhatósága nő, így várhatóan mozgékonysága is nőni fog a felszín alatti vizekben
OH
Policiklikus aromás szénhidrogének (PAH) OH-származékai?
Jelenleg nincsen rájuk szabályozás…
HO
OH OH
HO HO HO
OH
OH pedig tudnánk mérni…
Másik lehetőség: bontás mikroorganizmusok segítségével
Másik lehetőség: bontás mikroorganizmusok segítségével
A bontás után visszamaradó szerkezet toxikus marad, nem marad toxikus?
Sok esetben nem tudjuk
Acetil salicilsav (az Aspirin hatóanyaga)
CH3
Főként szalicilsavvá bomlik (1%-ban:antioxidáns hatású gentizinsav is keletkezik belőle, amelyet a vesék választanak ki)
Zöld patika – Green pharmacy – Egyelőre álom
A gyógyszergyárak egyelőre nem törekednek az inert
metabolitokra bomló hatóanyagok kidolgozására.
Egy érdekes rég/új herbicid: a glifozát (glyphosate, glifoszát)
Tarackbúza (Elymus repens) földalatti része
Gyomirtas – a gyomnövények által okozott kár
Gyomnövények (9%-os kárt okoznak): • • • •
Térparaziták; Vízparaziták; Tápanyag-paraziták; Esetenként allelopatikus hatásúak (pl. a mezei acat); • Kártevők rezervoirjai; • Emberre, állatra mérgezőek lehetnek;
Kárt okoznak: • Gazdaságban • Egészségben
A glifozát, mint herbicid felfedezése, szabadalmaztatása
A glyphosate – továbbiakban glifozát – John E. Franz kémikus (Monsanto) által 1971-ben és Roundup kereskedelmi néven szabadalmaztatott herbicid. Kereskedelmi forgalmazása 1974ben kezdődött. Alkalmazását tekintve a ROUNDUP® az egyik legnagyobb mennyiségben és legszélesebb körben használható gyomirtó szer a világon. John E. Franz – Monsanto 1971 a glifozát, mint herbicid felfedezője
Heszky László (2013): A glifozát-toleráns transzgénikus (GM) fajták előállítása és termesztése. Agrofórum, 2013. május p. 9095.
A glifozát szerkezete
Glifozát: N-(foszfonometil)glicin – gyenge sav Készítmények: izopropilamin trimetilszulfónium sók (glifozát-IPA, glifozát-TMS)
A glifozát bomlásterméke az AMPA
AMPA: Aminometil-foszforsav
A hatást növelő polioxi-etilén-amin (POEA)
A glifozát növények felületen való megkötődését elősegítő felületaktív anyag. Toxicitása meghaladhatja a glifozátét…
A glifozát hatásmechanizmusa
Aromás aminosavak szintézisének gátlása a kloroplasztiszban
Aromás aminosavak szintézisének gátlása
Az aromás aminosavak szintézise gátlásának következményei: • Leáll a sejtekben a fehérjeszintézis • A sikiminsav koncentrációjának toxikus növekedése • Közvetett hatás a fotoszintézis leállása a kloroplasztiszokban
A glifozát herbicid tulajdonságának hatásmechanizmusa
Aromás aminosavak szintézisének gátlása
Hisztidin
Triptofán
Fenilalanin
Aromás aminosavak bioszintézise 2/5
Enolpiroszőlősav -3-foszfát
EPSP szintáz enzim képe
Aromás aminosavak bioszintézise 4/5
Dehidrogenáz
Prefeninsav
Transzamináz
4-hidroxi-fenilpiroszőlősav
Tirozin
Aromás aminosavak bioszintézise 5/5
Dehidrogenáz
Prefeninsav
Transzamináz
4-hidroxi-fenilpiroszőlősav
Tirozin
Hatékony herbicid akár földi, akár légi kijuttatási technikával
Hatékony herbicid akár földi, akár légi kijuttatási technikával
Az intenzív technológiákban elkerülhetetlen a vegyszerezés
Baj van azonban a szelektivitással, rezisztenciával
A herbicidekre számos kultúrnövény érzékeny
Mitévők legyünk, ha van egy kabátgombunk…?
Szerezzünk a gombhoz egy kabátot…
Szerezzünk a gombhoz egy kabátot…
A Monsanto és világhírű termékei – a probléma megoldása…
Glifozát forgalmazása 40 évvel ezelőtt
GMO szója kibocsátása kb. 20 évvel ezelőtt
A világ egyik legnagyobb arányban termelt kultúrnövénye
Glycine soya 36% fehérje 30% szénhidrát 20% zsír 9% rost 1900 kJ energia
Transzformáció : mutáns EPSP szintáz gén beépítése 1/2
Transzgén Promóter
Terminátor Mutált EPSPS gén A T T G A A G C G C
Eredeti genom (kromoszóma-részlet)
Transzformáció : mutáns EPSP szintáz gén beépítése 1/2
Mutált EPSPS gén Transzgén
Terminátor
Promóter
Módosított génszakasz
Eredeti genom a beillesztett transzgén-konstrukcióval A transzformációval glifozát-toleráns egyed hozható létre
A mutáns EPSP szintáz enzim nem ismeri fel a glifozátot 1/2
N-foszfonometil-glicin
Enolpiroszőlősav-3-foszfát
A mutáns EPSP szintáz enzim nem ismeri fel a glifozátot 2/2
N-foszfonometil-glicin
Enolpiroszőlősav-3-foszfát
GMO monokultúrák kockázatai
GMO monokultúrák kockázatai – glifozát-rezistens gyomok
Glifozát-lefedettség saját számítás alapján (kb. 50g/ha)
A világ átlagos felhasználása: kb. 50 g/ha glifozát A honlap alapján számításba vehető biológiaialag hasznos termőterület: 1,8 GHa/fő Népesség: 6,7 milliárd = 6 700 000 000 ember Termőterület: 6,7 milliárd x 1,8 Gha = 12 600 000 000 ha A honlap alapján számított glifozát-lefedettség: 2010-ben: 640 000 tonna = 640 000 000 kg glifozát globálisan felhasználva → 50 g/ha
A világ GM vetésterületének alakulása 1996-tól 2013-ig (M ha) 200 180 159
160 124
120
M ha
174
145
140
132
111 100
100 80
80 60 40
40
43
50
56
89
64
27
20 0
167
2
10
1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 Évek
Forrás: GMO Compass, 2014
GMO monokultúrák kockázatai
• A monokultúra kedvez a specifikus kártevők elszaporodásának; • Nem-kívánatos génáramlás indulhat meg (gének megszökése pl. pollenek terjedésével – kultúrnövények gyom-rokonai); • A fentiek alapján „szupergyomok” kialakulása (Heszky L. és mtsai., Darvas B. és mtsai.); • Felszaporodás a környezetben; • Megjelenés az emberi vizeletben (18 EU tagállamból önkéntesek vizeletében mutatták ki: Medical Laboratory Bremen, Haferwende 12, 28357 Bremen, Germany); • Kedvezőtlen élettani hatások gyanúja: teratogenitás, enzimrendszerek károsítása;
Krónikus glifozát-expozició – Toxikus hatások kétéltűeken
• Csökkent fejméret, • Központi idegrendszer genetikai elváltozásai, • A koponyát formáló sejtek pusztulása, • Ízületek porcainak deformálódása; • Hasonlóság a humán embrióval; • Humán születési rendellenességek, • Fémionokkal kelátot képez, • Az ember elsődleges glifozát-maradék forrása az élelmiszer;
Afrikai karmosbéka (Xenopus laevis)
A glifozát megjelenése vizeletben
A vizeletminták analitikai eredményeit általában a vizeletben mindig megtalálható kreatinin mennyiségére vonatkoztatva adják meg. Oka: A vizsgált komponensek mennyisége az egyén által elfogyasztott víz mennyiségétől is függ. Ezt a bizonytalanságot csökkenti a kreatininre vonatkoztatott mérési eredmények használata
Magyarországi vizeletminták glifozát- és AMPA-tartalma
Mérési határ
Determination of Glyphosate residues in human urine samples from 18 European countries. Medical Laboratory Bemen 2013.
Analitika
A glifozát-maradék meghatározásának analitikai nehézségei
• • • • • •
Erősen poláros, Kicsiny molekula, Ennek ellenére nem illékony, Gyenge a fényelnyelése, Fluoreszcenciája nincsen, Fordított fázison gyenge a retenciója;
Ezért ismereteink szerint kevés laboratórium vállalkozik maradékainak meghatározására (EU: 32 hatósági labor).
Analitikai módszer mezőgazdasági termékek vizsgálatához
A minta-előkészítés és mérés vázlatos leírása - Élelmiszer
• • • • • • • • • •
Homogenizálás, majd 5 g minta bemérése, Extrakció hangyasavas metanollal, Centrifugálás, szűrés, Térfogat-beállítás, Bemérés a HPLC autosampler-ébe, Elválasztás Hypercarb GCB oszlopon, LC-ESP - MS/MS (TripleQuad) detektálás, Belső standerdek: 13C2 és 15N nuklidokkal jelzett glifozát standerddel, Jellemző ionátmenetek: 168/63 m/z, illetve a jelzett standerdekből 171/63 m/z; LOQ: 10 ng/g = 10 µg/kg
Electrospray ionforrás (LC-MS/MS TPQ) Fűtött kapilláris +50 V Gázfázisú ionképződés
Ködképző gáz
LC oldal
Fused silica kapilláris a fúvókával (+1,5 kV
MS oldal
Aerosol csóva
Glifozát kalibráció (2 ng/ml-100 ng/ml)
100 ng
50 ng
10 ng
Glifozát, etefon elúciós sorrendje Etefon Glifozát
Jellemző tömegátmenet: 168/63 m/z
3 C = 36
8H=8
5 O = 80
1 P = 31
1 N = 14
M0 = 169 1 proton-vesztéssel: M1 = 168
Foszforsav leszakad PO2-vé: 63
Spike-olt minta kromatogramja – 10 µg/kg glifozáttartalommal
Módszervak oldat
200 ng/ml glifozát belső sztenderd
A glifozát retenciós idejének közelében észlelhető zavaró hatású jelek kromatogramja
Spike-olt minta kromatogramja – 10 µg/kg glifozáttartalommal
10 ng/ml glifozát
200 ng/ml glifozát belső sztenderd
A glifozát 1 ng/ml-es mennyiségének és az izotópjelzett belső sztenderdnek a kromatogramja
Egy új lehetőség hormonok kimutatására: MALDI-TOF-MS
Egy új lehetőség hormonok kimutatására: MALDI-TOF-MS
Matrix Aided LASER Desorption Ioniosation – Time Of Flight – Mass Spectrometry
MALDI-TOF MS mintafogadó lemeze
MALDI-TOF MS mintafogadó lemeze
MALDI-TOF MS mintafogadó lemeze
MALDI-TOF-MS – Laser impulzus
MALDI-TOF-MS – Repülési cső
A technikával a nagymolekulájú vegyületek is jó hatásfokkal vizsgálhatók. Pl.: Hormonok, Allergének, Hosszú szénláncú szénhidrogének, Fehérje-szénhid-rát komplexek, Mikroorganizmusok fehérjéi,
A technika főként jelenlét/hiány vizsgálatára alkalmas
t1 m1
t3 m3
t2 m2
t4 m4
Összegzés
• A mérési eredmények megbízhatóságát főként a szakszerű, tervezett és fegyelmezett mintavételi tevékenység szavatolja. • Az analitikai technológia készen áll az új kihívások teljesítésére. A rutinszerű mérések igazolható LOQ jellemzői a ppb és ppt (10-9 és 10-12 g/liter, illetve g/kg) tartományokban mozognak. • Legyünk tisztában azzal, hogy a „zéró tolerancia” tudományosan nem megalapozott szakmai hiedelem!
Köszönetnyilvánítás
• • • • •
Wessling Közhasznú Nomprofit Kft Kötelesné Suszter Gabriella László József Szekers Zoltán Berente Bálint Dr.
Köszönöm megtisztelő figyelmüket!
