Hogyan épül fel a sejtmembrán? Egyszerű modellek felépítése és vizsgálata
Foszfolipid kettősréteg a sejtben
Foszfolipid kettősréteg felhasználása Liposzóma:gyógyszerek bejuttatása a szervezetbe (pl.: rák kezelése) Kettősréteg: bioszenzorokban (pl.: molekulakimutatás vérből)
Mit vizsgáltunk? • Vezikula, liposzóma • Monoréteg • Kettősréteg
Kísérleteink, méréseink 1.Liposzómakészítés (preparálás) 2.Liposzóma jellemzése: fényszórás, elektronmikroszkóp 3.Tiszta DPPC és koleszterin tartalmú liposzómák infravörös színképének felvétele különböző hőmérsékleten 4.Monoréteg készítése, izotermák és infravörös színképek felvétele
5. Kettősréteg készítése két monoréteg hordozóra való felvitelével
1. Liposzómakészítés (preparálás)
DSPC
DPPC +
+
N
N
O
O O
P
O
O
P
O
O
O
H
H
O
O O
O
O
O
O
O
disztearoil-foszfatidilkolin
dipalmitoil-foszfatidilkolin
• 10 m/m%-os vizes DPPC-oldat készítése (analitikai mérleg, automata pipetta) • Hőtorna: - Vortex: összeráz - hűtés: folyékony N2 10-szer - fűtés: fűthető mágneses keverő
• megfelelő méretű vezikulák kialakítása extrudálással (előtte 10-szeres higítás) • 10 baron 5-ször átnyomjuk 1. 200nm-es szűrőn 2. 100nm-es szűrőn
2. Liposzóma jellemzése: fényszórás, elektronmikroszkóp
Dinamikus fényszórásmérés • előtte 50-szeres higítás • Mérési elv: eltérő méretű részecskék eltérően szórják a fényt • Tapasztalat: kis részecskeátmérő, szűk méreteloszlás • Következtetés: sikeres extrudálás
100 nm-es szűrőn extrudált liposzómák méreteloszlása (fényszórásgörbe) 25
Részecskeszám (%)
20
15
10
5
0 0.1
1
10
100 Méret / nm
1000
10000
Elektronmikroszkóp • DPPC-oldat negatív festése uranilacetátban (rézrostély)
200 nm-es szűrőn extrudált
100 nm-es szűrőn extrudált
3.Tiszta DPPC és koleszterin tartalmú liposzómák infravörös színképének felvétele különböző hőmérsékleten
Tiszta DPPC rezgési spektruma
Koleszterintartalmú liposzóma rezgési spektruma
CH2 vegyérték rezgési tartomány
CH2 vegyérték rezgési tartomány CH2 antiszimmetrikus nyújtási rezgés
CH2 antiszimmetrikus nyújtási rezgés 0.25
0.20
Abszorbancia
Abszorbancia
0.05
0.00
0.15
0.10
0.05
0.00
-0.05 3050
3000
2950
2900
2850
Hullámszám (cm-1)
2800
2750
3050
3000
2950
2900
2850
Hullámszám (cm-1)
2800
2750
Koleszterin • Más szerkezet más tulajdonságok (pl.: eltérő hőmérsékleten) H3C CH3 CH3
HO
CH3 CH3
CH2 antiszimmetrikus rezgésre jellemző hullámszám
Gauche Konformáció
2853
R H
H H R
H
R H
R
H
R H
H
R
2850
2848 H
H
2851
2849
Transz Konformáció
H
2852
H
Hullámszám (cm -1)
H
Tiszta DPPC DPPC+30% koleszterin
H
R R
20 H H
25
30
35 Hõmérséklet (°C)
40
45
50
Miért jó ez? • Kozmetikumok, gyógyszerek • nincs hirtelen szerkezeti változás • negatív következmények kiküszöbölése
4. Monoréteg előállítása, izotermák és infravörös színképek felvétele
Előállítás menete • Langmuir filmmérleg • Kádba víz, rajta CHCl3-ban oldott DSPC/DPPC-t • Gátak összezárása közben Wilhelmy-lemezzel oldalnyomásmérés
+
N
+
N
DSPC
DPPC
O O
P
O
O O
O
P
O
O
H H
O O
O O
O
O
O
Oldalnyomás (mN/m)
Oldalnyomás (mN/m)
50
O
40 30 20
5
10
0
0 30
40
50
60
70
80
90
100
Molekulára jutó terület (Å2)
Kis szerkezeti különbség
110
30
40
50
60
70
80
90
100
Molekulára jutó terület (Å2)
nagy különbség az izotermák között
110
DSPC monoréteg rezgési spektruma CH2 vegyérték rezgési tartomány
Abszorbancia
0.00
CH2 antiszimmetrikus nyújtási rezgés
-0.01 2800
-1
Hullámszám (cm )
3000
R H
H H
0.00
Abszorbancia
H
R
H
R H
R H
H
Gauche Konformáció (~2852-53cm-1)
-0.01 Hullámszám (cm-1)
CH2 antiszimmetrikus rezgésre jellemző hullámszám R H
H H
H
H
H
R R
H H
2853
3000
2852
Hullámszám (cm -1)
2800
2851
2850
R
Transz Konformáció (2849-50cm-1)
2849 0
20 DSPC oldat térfogata (l)
40
5. Kettősréteg készítése két monoréteg hordozóra való felvitelével
• Foszfolipid vízfelszínre való felvitele, majd a vízbe merített szubsztrátra átvitele (itt: kvarcprizma) • Langmuir-Blodgett-módszer • 2. monoréteg elkészítése, „hordozós” monorétegre felvitele • Langmuir-Schaefer-módszer
•Langmuir-Blodgettmódszer
•Langmuir-Schaefermódszer
Köszönettel tartozunk: Lendvayné Győrik Gabriella Keszthelyi Tamás Mihály Judith Berényi Szilvia Szabó László Drotár Eszter
Készítette Dénes Márk
Szent Margit
Gimnázium, Budapest
195695denesmark@g mail.com
Kazinczy Ferenc Gimnázium, Győr
[email protected]
Maklári Judit
Bessenyei György Gimnázium, Kisvárda
[email protected]
Nagy-Pál Petra
Teleki Blanka Gimnázium, Székesfehérvár
Justin Viola
Napsugár
[email protected]
