6 konsentrasi yang digunakan. Nilai x yang diperoleh merupakan konsentrasi larutan yang menyebabkan kematian terhadap 50% larva udang. Ekstrak dinyatakan aktif apabila nilai LC50 lebih kecil dai 1000 μg/mL.
HASIL Kadar Air Daun Anggrek Merpati Hasil pengukuran kadar air simplisia daun Anggrek merpati asal Bogor dari tiga kali ulangan yaitu ulangan 1, 2 dan 3 mendapatkan hasil berturut-turut sebesar 3.42%, 3.32% dan 3.22% dan mendapatkan rata-rata sebesar 3.32% (data dan perhitungan pada Lampiran 2). Rendemen Ekstrak daun Anggrek Merpati
Rendemen (%)
Hasil pengukuran rendemen ekstrak daun anggrek merpati dengan pelarut etanol, heksan dan air (Gambar 2) mendapatkan rendemen berkisar antara 1.98% hingga 15.77%. Rendemen tertinggi terdapat pada ekstrak daun anggrek merpati dengan pelarut etanol (15.77%), sedangkan rendemen terendah terdapat pada ekstrak daun anggrek merpati dengan pelarut heksan (1.98%) (data dan perhitungan pada Lampiran 3). 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0
15.77
4 2
Etanol
Heksan
Air
Ekstrak Daun Anggrek Merpati
Gambar 2. Rendemen ekstrak daun anggrek merpati Hasil uji Fitokimia Ekstrak Daun Anggrek Merpati Hasil uji fitokimia ekstrak daun anggrek merpati dengan pelarut etanol, heksan dan air pada (Gambar 3) menunjukkan bahwa pelarut yang paling banyak melarutkan senyawa senyawa fitokimia adalah pelarut etanol yaitu senyawa flavonoid, saponin, tanin, dan steroid, sedangkan pelarut yang paling sedikit melarutkan senyawa fitokimia adalah pelarut heksan yaitu hanya senyawa steroid. Gambar hasil fitokimia dapat dilihat pada Lampiran 7.
7 Tabel2 Hasil uji fitokimia ekstrak daun anggrek merpati. Uji fitokimia Alkaloid Flavonoid Saponin Tanin Triterpenoid Steroid
Hasil Heksana +++
Etanol ++ +++ +++ +++
Air +++ +++ +++ -
keterangan : tanda (+) menunjukkan tingkat intensitas warna tanda (-) tidak terdapat senyawa Nilai IC50 Ekstrak Anggrek Merpati terhadap Aktivitas Antioksidan
IC 50 (ppm)
Hasil pengukuran IC50 antioksidan oleh ekstrak daun anggrek merpati dengan pelarut etanol, heksan dan air pada (Gambar 4) mendapatkan nilai IC50 berkisar antara 153.56±5.53 hingga 3551.34±533.95 μg/mL (data dan perhitungan pada lampiran 5). Hasil uji statistika menunjukkan tidak terdapat perbedaan yang signifikan antara pelarut etanol dan air pada taraf 95%, sedangkan pada pelarut etanol dan heksan serta air dan heksan menunjukkan perbedaan yang signifikan. Nilai IC50 tertinggi dimiliki pelarut heksan sebesar 3551.34±533.95 μg/mL, sedangkan nilai IC50 terendah dimiliki pelarut air sebesar 153.56± 5.53 μg/mL.
4.000.000 3.500.000 3.000.000 2.500.000 2.000.000 1.500.000 1.000.000 500.000 0
3 551.349
324.337 Etanol
153.565 Heksan
Air
Ekstrak Daun Anggrek Merpati
Gambar 4 Nilai IC50 aktivitas Ekstrak daun Anggrek Merpati Nilai IC50 Ekstrak Anggrek Merpati terhadap Inhibisi Enzim α-Glukosidase Hasil pengukuran presentase inhibisi enzim α-glukosidase oleh ekstrak daun anggrek merpati dapat dilihat pada Gambar 5. Hasil penelitian menunjukkan dari ketiga pelarut yang digunakan pada ekstrak daun anggrek merpati, pelarut yang memiliki aktivitas inhibisi enzim α glukosidase yang paling tinggi yaitu pada pelarut etanol. Sedangkan, yang memiliki aktivitas terendah yaitu ekstrak daun anggrek merpati dengan pelarut air. Pada kosentrasi 1000 μg/mL ekstrak daun anggrek merpati dengan pelarut etanol mampu menghambat aktivitas enzim
8 sebesar 64% sedangkan pada ekstrak daun enggrek merpati dengan pelarut air hanya menghambat sebesar 13%. Namun, jika dibandingkan dengan akarbosa sebagai kontrol positif hasil sampel ekstrak daun anggrek merpati berbeda jauh yaitu sebesar 99% pada konsentrasi 1000 μg/mL (data dan perhitungan pada Lampiran 6). 120
Inhibisi (%)
100
94
86
96
99
99
59
63
64
12
8
600
800
80 60
48 32
40 20
2
5
200
400
13
0 1000
konsentrasi (ppm)
Gambar 5 Nilai Presentase Inhibisi enzim α-glukosidase Keterangan : : Akarbosa ; : Etanol ; : air Hasil Toksisitas Ekstrak Daun Anggrek Merpati Hasil pengukuran nilai LC50 dari pelarut etanol, heksan dan air pada (Gambar 6) mendapatkan nilai LC50 dari pengujian toksisitas berkisar antara 889.64±121.42 hingga 3057.98±2657.73 μg/mL. Nilai LC50 tertinggi dimiliki pelarut heksan sebesar 3057.98±2657.73 μg/mL, sedangkan nilai LC50 terendah dimiliki pelarut air sebesar 889.64±121.42μg/mL (data dan perhitungan pada lampiran 4) 3500
3057.98±2657.73
LC50 ppm
3000 2500 2000 1500
1266.02±166.66 889.641±121.42
1000 500 0 etanol
heksan
air
Ekstrak Daun Anggrek Merpati
Gambar 6 Toksisitas Ekstrak Daun Anggrek Merpati
9
PEMBAHASAN Kadar Air Penentuan kadar air merupakan tahapan penting dalam melakukan analisis tumbuhan sebagai tanaman obat. Penentuan kadar air bertujuan untuk mengetahui proporsi atau presentase air dalam sampel yang diuji. Air merupakan salah satu senyawa yang sangat potensial bagi kelangsungan hidup semua makhluk hidup dari tingkat yang paling rendah (prokariot) hingga tingkat tinggi (eukariot) oleh sebab itu pengetahuan tentang kadar air menjadi salah satu indikator penting mengenai kualitas tanaman obat, karena kadar air yang cukup tinggi pada bahan obat akan menjadi tempat yang baik bagi pertumbuhan mikroorganisme. Informasi kadar air ini nantinya akan digunakan untuk mengetahui lama penyimpanan, cara penyimpanan, cara pengolahan dan cara pengemasan tanaman obat (Pradana 2001). Hasil pengukuran kadar air rerata yang dilakukan pada daun anggrek merpati sebesar 3.32 % menunjukkan bahwa simplisia daun anggrek merpati ini dapat disimpan dalam jangka waktu yang lama karena kadar air yang kurang dari 5% bersifat tahan terhadap pencemaran mikroorganisme (Pradana 2001). Jika dibandingkan dengan hasil kadar air yang dilaukan pada daun sengon oleh Yafet E (2013) tidak berbeda jauh yaitu sebesar 4.85%. Ekstrak Daun Anggrek Merpati Ekstraksi merupakan langkah awal yang dilakukan sebagai bagian dari persiapan sampel untuk digunakan dalam barbagai uji berikutnya. Ekstraksi daun anggrek merpati dilakukan dengan menggunakan metode maserasi, yaitu proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut melalui beberapa pengocokan pada suhu ruang (Lumbessy et al. 2013). Prinsip ekstraksi didasarkan pada perpindahan komponen zat yang terlarut ke dalam pelarut, sehingga terjadi perpindahan pada lapisan antar muka dan berdifusi terbawa pelarut. Maserasi digunakan untuk simplisia yang mengandung senyawa aktif yang mudah larut, tidak mengandung zat yang mudah menguap dalam pelarut, serta tidak mengandung benzoin, sitrat, dan lain-lain (Voigt 1994). Ekstraksi serbuk daun anggrek merpati menggunakan tiga macam pelarut yaitu air, etanol dan heksan. Ekstraksi menggunakan air dilakukan dengan pemanasan pada titik 500C, hal ini diharapkan dapat meningkatkan interaksi antara air dan komponen bioaktif pada sampel, tanpa merusak komponen bioaktif yang terdapat pada sampel, karena pemanasan yang terlalu tinggi pada sampel dapat merusak senyawa aktif yang terdapat pada sampel (Harborne 1998). Selanjutnya komponen bioaktif tersebut akan berinteraksi dengan molekul air berdasarkan kepolaran, dikarenakan air merupakan pelarut yang bersifat yang lebih polar sehingga dapat berikatan dengan senyawa yang bersifat polar seperti senyawa golongan fenolik dan polifenol. Pelarut etanol dipilih berdasarkan metode yang distandarisasi oleh BPOM (2005) yang menjelaskan bahwa untuk ekstraksi suatu bahan yang akan digunakan sebagai obat harus menggunakan etanol sebagai pelarutnya, alasannya adalah karena etanol mudah menguap, murah dan cukup aman. Selain itu etanol juga memiliki dua gugus fungsi yang berbeda tingkat kepolarannya, yaitu gugus hidroksil (OH) yang bersifat polar dan gugus
10 alkil (-R) yang bersifat non polar. Adanya kedua gugus tersebut diharapkan agar senyawa kimia dengan tingkat kepolaran berbeda dalam simplisia akan terekstrak kedalam etanol (Khopkar 2003). Sedangkan heksan dipilih untuk menjadi pembanding dari pelarut air dan etanol, hal ini karena heksan memiliki sifat non polar. Selain itu diharapkan senyawa nonpolar yang tidak terekstrak oleh air dan etanol dapat terekstrak oleh heksan. Rendemen Ekstrak Daun Anggrek Merpati Rendemen merupakan senyawa aktif yang terdapat pada sampel daun anggrek merpati yang terekstrak pada pelarut yang digunakan. Kuantitas rendemen dapat digunakan untuk mengetahui kemampuan pelarut dalam memisahkan senyawa aktif yang terdapat pada simplisia sampel daun anggrek merpati. Pemisahan ini terjadi berdasarkan interaksi analat (komponen senyawa aktif) dengan senyawa yang berasal dari pelarut. Interaksi ini akan terjadi berdasarkan polaritas masing-masing kepolaran analat dan pelarut yang hampir sama yang menimbulkan interaksi tersebut dapat terjadi (Ayoola et al. 2008). Hasil menunjukkan nilai rendemen yang paling besar diperoleh pada etanol yaitu sebesar 15.77%. Hal ini berdasarkan sifat etanol yang memiliki dua gugus fungsi yang berbeda tingkat kepolarannya, yaitu gugus hidroksil (OH) yang bersifat polar dan gugus alkil (-R) yang bersifat non polar. Adanya kedua gugus tersebut diharapkan agar senyawa kimia dengan tingkat kepolaran berbeda dalam simplisia akan terekstrak kedalam etanol (Khopkar 2003). Sehingga komponen yang terekstrak pada etanol menjadi lebih banyak. Hasil Fitokimia Ekstrak Daun Anggrek Merpati Fitokimia merupakan analisis awal yang dilakukan untuk mengidentifikasi senyawa aktif yang terdapat pada tumbuhan (Pembayun et al.. 2007). Uji fitokimia dilakukan untuk mengkaji kandungan senyawa aktif yang terdapat pada ekstrak daun anggrek merpati. Uji ini meliputi enam uji yaitu uji alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, steroid dan triterpenoid. Menurut Egwaikhide dan Gimba (2007) perbedaan jenis pelarut akan mempengaruhi perbedaan hasil dalam kekuatan sinyal yang diidentifikasi, yaitu tingkat kepekatan. Berdasarkan hasil penelitian diperoleh hasil bahwa senyawa saponin, flavonoid, tanin dan fenol ditemukan pada ekstrak daun anggrek dengan pelarut etanol dan air (Tabel 2). Hal ini dapat disebabkan oleh kepolaran dari senyawasenyawa tersebut karena adanya gugus hidroksil sehingga etanol dan air yang memiliki sifat polar dapat mengekstrak senyawa-senyawa tersebut (Javanmardi et al. 2003). Senyawa steroid ditemukan pada ekstrak daun anggrek dengan pelarut heksan dan etanol. Hal ini dapat disebabkan karena sifat dasar steroid yang bersifat non polar (Harborne 1984), sedangkan kelarutan steroid pada etanol dapat disebabkan karena etanol memiliki gugus alkil (-R) yang bersifat non polar (Khopkar 2003). Senyawa metabolit jenis alkaloid tidak menunjukkan hasil yang positif, hal ini karena konsentrasi alkaloid yang diperoleh sangat kecil sehingga secara kualitatif tidak menunjukkan hasil yang signifikan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa metabolit yang terdapat pada ekstrak etanol lebih banyak dibandingkan dengan ekstrak air dan heksan.
11 Hasil Uji Antioksidan Ekstrak Daun Anggrek Merpati Aktivitas antioksidan yang dilakukan terhadap ekstrak daun anggrek merpati dilakukan dengan metode DPPH dengan penentuan nilai IC50. Penentuan IC50 dilakukan untuk menentukan efektivitas ekstrak daun anggrek merpati terhadap radikal sebesar 50% (Molyneux 2004). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak daun anggrek merpati dengan IC50 yang baik adalah dengan pelarut air. Hasil ini menunjukkan bahwa ekstrak daun anggrek merpati yang menggunakan pelarut air dengan IC50 sebesar 153.56±5.53μg/mL mampu menangkal radikal bebas sebannyak 50%. Nilai IC50 yang semakin rendah (dibawah 200 μg/mL) menunjukkan bioaktivitas yang semakin kuat dan lebih efektif (Kusuma 2012). Berdasarkan perolehan data secara keseluruhan dapat dilihat aktivitas antioksidan yang paling tinggi terdapat pada sampel ekstrak daun anggrek merpati dengan pelarut air (IC50 terendah). Menurut Zebri et al. (2008) aktivitas antioksidan bahan alam dapat dipengaruhi oleh kadar fenol dan flavonoid yang dikandungnya, hal ini sesuai dengan data fitokimia yang menunjukkan bahwa total senyawa flavonoid tertinggi terdapat pada ekstrak daun anggrek merpati dengan pelarut air dengan melihat kepekatan warna hasil sampel uji flavonoid. Senyawa flavonoid merupakan senyawa yang memiliki gugus fenol yang lebih kompleks dengan derajat hidroksilasi yang lebih tinggi. Keberadaan gugus hidroksil pada senyawa fenol dan flavonoid tersebut yang menimbulkan antioksidan (Egwaikhide dan Gimba 2007). Hal ini dapat disebabkan karena atom oksigen pada gugus hidroksil mempunyai pasangan elektron yang bebas yang cukup untuk menghambat reaktivitas atom reatif penyusun senyawa radikal bebas (Gambar 7) (Egwaikhide dan Gimba 2007). Hasil ini membuktikan bahwa daun anggrek merpati cukup efektif digunakan sebagai antioksidan.
Gambar.7 Struktur dasar senyawa flavonoid (A), Proses peredaman radikal bebas oleh senyawa flavonoid (B).(Kumar dkk2011).
12 Hasil Uji Inhibisi Enzim α-glukosidase Enzim α-glukosidase merupakan enzim yang terdapat pada usus halus manusia. Enzim ini merupakan enzim kunci yang berperan dalam proses akhir pemecahan karbohidrat. Enzim α-glukosidase bekerja dengan cara menghidrolisis ikatan α-glikosidik pada oligosakarida dan menghasilkan glukosa. Pengujian aktivitas enzim α-glukosidase dapat diukur secara invitro dan in vivo. Pada pengujian secara in vitro dapat disimulasikan dengan menggunakan substrat pNPG. Enzim α-glukosidase akan membantu menghidrolisis substrat p-NPG menjadi p-nitrofenil dan glukosa. Intensitas warna yang dihasilkan akan semakin kuat apabila jumlah p-nitrofenil yang dihasilkan semakin banyak (Gao et al. 2007). Analisis aktivitas inhibisi Enzim α-glukosidase di lakukan dengan prinsip, sampel yang digunakan memiliki kesamaan struktural dengan substrat sehingga mampu berkompetisi untuk mendapatkan sisi aktif enzim. Akibatnya produk yang terbentuk akan berkurang sehingga intensitas warna yang dihasilkan menjadi lemah (Irawan 2011). Aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase suatu bahan alam dipengaruhi oleh kadar flavonoid (Hartika 2009 ; Lukacinova et al. 2008 dan Fawzy et al. 2008). Flavonoid ditemui dalam bentuk mono-, di-, atau triglikosida. Oleh karena itu, unit-unit gugus hidroksil dalam flavonoid tersebut terikat oleh glukosa, senyawa flavonoid dari ekstrak daun anggrek merpati ini direaksikan dengan p-NPG dan enzim α-glukosidase. Senyawa flavonoid diharapkan dapat berkompetisi dengan substrat sehingga sampel dapat menempel pada sisi aktif enzim dan tidak terbentuk produk. Produk yang akan dihitung absorbansinya adalah p-nitrofenol yang berwarna kuning (Sutedja 2003). Selain itu Bayu (2009) menyatakan bahwa senyawa steroid selain bermanfaat sebagai antiradang, antiinflamasi, antikarsinogenik juga memiliki aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase sebagai antidiabetes. Hasil uji inhibisi enzim α-glukosidase menunjukkan bahwa ekstrak daun anggrek merpati yang paling tinggi aktivitasnya dimiliki oleh pelarut etanol dengan nilai presentase penghambatan mencapai 64% pada konsentrasi 1000 μg/mL. Hasil ini sesuai dengan data fitokimia yang menunjukkan bahwa total senyawa flavonoid dari ekstrak daun anggrek merpati pada pelarut etanol cukup tinggi, meskipun total senyawa flavonoid tertinggi dimiliki ekstrak daun anggrek merpati pada pelarut air. namun adanya senyawa steroid yang terekstrak pada pelarut etanol dapat meningkatkan aktivitas inhibisi enzim α-glukoside. Hal ini sesuai dengan penelitian Munshif (2014) yang menggunakan xanthorizol (steroid) sebagai inhibitor enzim α glukosidase. Hasil uji inhibisi enzim α-glukosidase ekstrak daun anggrek merpati ini kurang efektif, karena jika dihitung nilai IC 50 ekstrak etanol mencapai 435 μg/mL, sedangkan menurut Kusuma (2012) nilai IC50 yang semakin rendah dan efektif adalah dibawah 200 μg/mL, hasil penelitian ini lebih baik dibandingkan dengan hasil penelitian yang dilakukan Irwan (2011) dengan menggunakan ekstrak daun wungu sebesar 66.11% pada konsentrasi 10000 μg/mL. Pada percobaan ini juga dilakukan pengujian aktivitas inhibisi enzim α glukosidase dengan menggunakan ekstrak daun anggrek merpati dengan pelarut heksan namun hasil pengujian menunjukan tidak terdapat aktivitas inhibisi enzim α glukosidase karena tidak memiliki senyawa flavonoid.
13 Toksisitas Ekstrak Daun Anggrek Merpati Pengujian toksisitas merupakan uji yang dilakukan untuk menduga suatu bahan aktif memiliki kemampuan sebagai anti kanker dan hama penyakit, selain itu uji toksisitas ini dapat membantu menentukan efek farmakologi dari bahan tersebut (Mc Laughin et al. Dalam Attaur-Rahman 1991). Uji toksisitas ekstrak daun anggrek merpati dilakukan menggunakan metode BSLT dengan menggunakan larva udang Artemia salina Leach. Metode BSLT ini memiliki kelebihan selain mudah dan murah hasilnya memiliki tingkat kepercayaan 95% (Colegete et al. 1993). Senyawa aktif yang memiliki daya sitoksisitas tinggi diketahui berdasarkan nilai Lethal Concentration 50% (LC50), yaitu konsentrasi zat toksik yang dapat mengakibatkan kematian organisme sampai 50%. Menurut Meyer et al. (1982), senyawa kimia dikatakan berpotensi bioaktif bila mempunyai nilai LC50<1000 μg/mL dan bersifat non toksik bila nilai LC50>1000 μg/mL. Hasil penelitian menunjukkan nilai LC50 dari seluruh ekskstrak daun anggrek merpati, ekstrak oleh air memiliki toksisitas yang paling tinggi sebesar 889.64±121.42 μg/mL, menurut Nurcholis (2008), nilai LC50 rendah (dibawah 1000 μg/mL) menunjukkan toksisitas yang tinggi. Sedangkan ekstrak oleh etanol dan heksan berturut-turut 1266.02±166.66 dan 3057.98±2657.73 μg/mL menunjukkan bahwa tingkat toksisitasnya rendah. Hal ini dapat disebabkan karena kandungan senyawa flavonoid pada ekstrak air, karena senyawa flavonoid memiliki aktivitas toksisitas (Nurcholis 2008).
SIMPULAN Hasil penelitian menunjukkan aktivitas antioksidan dan toksisitas tertinggi teramati pada ekstrak daun anggrek merpati oleh pelarut air dengan IC50 sebesar 153.56±5.53 μg/mL dan tingkat toksisitas sebesar 889.64±121.42 μg/mL sedangkan aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase yang paling tinggi dimiliki ekstrak daun anggrek merpati oleh pelarut etanol dengan presentase 64% pada konsentrasi 1000 μg/mL atau nilai IC50 sebesar 435 μg/mL
SARAN Saran dari penelitian ini perlu dilakukannya penelitian lebih lanjut terkait aktivitas inhibisi enzim α-glukosidase secara invivo dan perlu dikaji tipe penghambatan terhadap enzim α-glukosidase, serta mencari senyawa tunggal yang berperan dalam penghambatan enzim α-glukosidase pada ekstrak daun anggrek merpati.
