24 IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Susunan DNA Primer HSP 70 Pengamatan yang dilakukan untuk mengetahui seberapa besar ekspresi gen HSP 70 yang muncul pada sampel itik saat pengukuran menggunakan PCR harus didapatkan susunan DNA yang spesifik terlebih dahulu yaitu dengan mencari DNA primer, pencarian DNA primer dapat dilakukan dengan menggunakan situs National Center for Biotechnolgy Information (NCBI) dengan situs aksesnya adalah ncbi.nlm.nih.gov (Lampiran 4). Hasil yang diperoleh dari pencarian tersebut adalah DNA Primer yang dapat dilihat pada tabel 12, tabel tersebut menunjukan produk DNA primer yang dapat digunakan untuk mencari DNA target pada sampel darah itik, Proses pencarian gen HSP dilakukan dengan mencari sequence DNA HSP yang spesifik pada DNA Map (Lampiran 5) menggunakan primer - BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) di situs NCBI. DNA yang diperoleh terdiri dari 10 DNA primer (Lampiran 6) kemudian dipilih dengan mempertimbangkan desain primer yang sesuai. Tabel 1. Data DNA Primer HSP 70 Gen HSP 70 kDA
ID
Primer Set 5’ – 3’
Tm
NW_004677311.1
F : 5’-TCCAGAAGTTCGGCATTTCTCA-3’
59,96
R : 5’-GGAGAAACTCTGCAACCCGA-3’
59,97
Sumber : ncbi.nlm.nih.gov Keterangan : ID : ID gen squence HSP Tm : Temperatur
25 Pengamatan HSP dalam penelitian ini perlu dilakukan karena HSP merupakan bagian dari molekul chaperone yang akan muncul ketika itik mengalami stres panas, stres panas tersebut dapat timbul akibat kondisi kandang penelitian yang minim air juga tempertur yang panas, Kondisi suhu yang panas dapat menyebabkan melemahnya ikatan hidrogen
sehingga lipatan protein menjadi
terbuka atau terdenaturasi. Chaperone bekerja dengan cara mengikat dan memberi tenaga pada protein tersebut mengubahnya menjadi konformasi yang tepat (Moyes, 2006). DNA HSP pada itik dapat muncul akibat stres yang disebabkan oleh adanya dampak radikal bebas (Van Milgen, 2003) yang disebabkan oleh stres psikis dan suhu (Franco-Jimenez dkk., 2007), hal ini sesuai dengan pendapat Milne dkk. (2012) yang menyatakan bahwa ekspresi gen HSP akan meningkat akibat cekaman stres yang distimulasi oleh radikal bebas. 4.2 Pengaruh pemberian minyak buah Makasar terhadap ekspresi RNA
Tabel 2. Hasil pengamatan Jumlah Ekspresi Gen HSP Ulangan
Perlakuan
1 2 3 4 5 6 rata-rata
K BJA BJB BJC -----------------------------------ng/mL----------------------------3,546 3,104 2,548 2,427 3,718 2,967 2,614 2,397 3,854 3,171 2,672 2,392 3,415 3,073 2,582 2,356 4,003 2,956 2,736 2,418 3,946 3,164 2,525 2,355 3,75±0,23 3.07±0.09 2.61±0,08 2.39±0,03
Data yang diperoleh dari hasil analisis laboratorium pada Tabel 6 menunjukan nilai dimana jumlah ekspresi gen HSP paling tinggi terdapat pada perlakuan K= 0 µL tanpa pemberian MBM dengan rata – rata Ekspresi HSP sebesar
26 3,75 ng/ml, sedangkan ekspresi gen HSP paling kecil terdapat pada kelompok itik yang diberi perlakuan MBM sebanyak 200 µL. Kemudian untuk mengetahui perbedaan antar perlakuan maka dilakukan analisis stastistik dengan dilakukan uji contrast orthogonal (Lampiran 3). Pada itik tanpa pemberian MBM K=0 µL, akan menunjukan jumlah ekspresi gen HSP yang paling tinggi, mekanisme timbulnya jumlah ekspresi gen HSP terjadi ketika beban stres berlebih baik karena suhu maupun oleh psikis (kehilangan kebiasaan berendam di air) menyebabkan sistem syaraf pusat (CNS) aktif secara terus menerus dalam mengirimkan sinyal kepada target-target organ untuk melakukan homoestasis (Franco-Jimenez dkk., 2007; Tan dkk., 2010). Hormon merupakan salah satu senyawa penyinalan yang akan memberikan efek serangkaian reaksi (kaskade sinyal) kepada organ target (Tan dkk., 2010). Pemeliharaan penelitian dilakukan dengan menempatkan itik pada kondisi minim air akibatnya itik menjadi stres sehingga akan berdampak pada bagian seluler yang menimbulkan potensi bioenergetik berlebihan (Won dkk., 2012). Pada kondisi tersebut menyebabkan terjadi proses reduksi dan oksidasi molekul dan ion H meningkat tajam. Sehingga ternak mengalami stres psikis dan hipoxia (Burdick dkk., 2011), kondisi demikian diikuti dengan adanya peningkatan aktivitas enzim citokrom dan ATPase (Araujo dkk.,
1998) dan (Uppu dkk.,
peningkatan radikal bebas (OH-, O2-, H2O2) (Turrens, 2003).
2010) serta
27 Tabel 3. Signifikansi Jumlah Ekspresi Gen HSP Perlakuan BJC BJB BJA K Keterangan : BJA BJB BJC
Rata - rata 2.39 2.61 3.07 3.75
*Signifikansi a b c d
: Pemberian minyak 100 µL : Pemberian minyak 150 µL : Pemberian minyak 200 µL
*Abjad yang berbeda (a,b,c dan d) pada kolom signifikansi menunjukan perbedaan yang sangat nyata antar perlakuan (P < 0,01) Berdasarkan hasil analisis Anova polinomial orthagonal (Lampiran 1) dapat diketahui bahwa pemberian minyak buah makasar sebanyak 100 µL, 150 µL dan 200 µL dapat memberi pengaruh yang sangat nyata terhadap ekspresi gen mRNA (P < 0,01). jumlah ekspresi HSP antar perlakuan dengan pemberian dosis MBM 0 µL, 100 µL, 150 µL dan 200 µL secara berurutan adalah 3,75 ng/mL , 3,07 ng/mL , 2,61 ng/mL , 2,39 ng/mL. Faktor penyebab penurunan ekpresi mRNA HSP disebabkan karena pemberian minyak buah makasar yang mengandung asam lemak linoleat.
Linoleat pada minyak buah makasar tersebut berfungsi sebagai
antioksidan yang dapat menurunkan radikal bebas. Penelitian yang dilakukan telah menunjukan bahwa pemberian MBM dapat menurunkan tingkat radikal bebas yang menyebabkan meningkatnya ekspresi HSP pada itik, mekanisme penurunan radikal bebas dilakukan dengan cara aktivitas antioksidan merespon dan melakukan pertahanan dengan menyerang radikal bebas melalui pengikatan ion OH-. O2- dan H2O2 dengan ikatan hidroxil pada asam lemak linoleat (Long dkk., 2012).
28 Hasil uji contrast orthogonal (Lampiran 2) menunjukan adanya perbedaan antar perlakuan. Perbedaan tersebut dapat disederhanakan pada tabel 2 yang menunjukan adanya perbedaan sangat nyata antar perlakuan, nilai tertinggi yang menunjukan ekspresi gen HSP terdapat pada ternak tanpa perlakuan K = 0 µL, sedangkan nilai ekspresi gen HSP yang paling rendah terdapat pada perlakuan dengan pemberian minyak buah makasar sebanyak 200 µL. Pada pengamatan tabel menunjukan adanya penurunan jumlah ekspresi HSP ketika dosis pemberian MBM bertambah.
Jumlah Ekpresi mRNA Jumlah Ekspresi HSP
4.00 3.50 3.00 2.50 2.00 1.50 1.00 y = -0.0091x + 3.635 R² = 0.9524
0.50 0.00 0
20
40
60
80
100
120
140
160
Jumlah Pemberian BJ
Ilustrasi 3. Jumlah Ekspresi mRNA HSP Pada ilustrasi 3. Dapat diketahui bahwa pemberian MBM terhadap ekspresi gen mRNA HSP merupakan linear yang bersifat negative sehingga jumlah ekspresi mRNA gen HSP akan semakin menurun dengan setiap bertambahnya jumlah dosis MBM yang diberikan. Pada data pengamatan dapat dilihat bahwa itik yang diberi 0 nl MBM menunjukan ekspresi gen HSP yang tinggi disebabkan itik mengalami stres psikis dan fisiologik (Franco-Jimenez dkk., 2007; Tan dkk., 2010). Produktivitas itik yang dipelihara dalam kondisi tersebut dapat menurun secara drastis, hal tersebut
29 disebabkan selama heat shock sel akan melakukan peningkatan sintesis dari beberapa HSP. Sel tersebut dapat memberhentikan proses transkripsi dan translasi dari gen - gen lainnya membagi sumber daya biosintetik untuk sintesis HSP (Moyes, 2006).
