IV.
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
4.1 Tempat dan Waktu Percobaan Penelitian pendahuluan dilakukan
di laboratorium
kimia pangan dan
laboratorium uji Fakultas Teknologi Industri Pertanian Universitas Padjadjaran. Penelitian pendahuluan telah dilaksanakan pada bulan Desember 2011 – Februari 2012. Penelitian utama dilakukan pada bulan April-Juni 2012.
4.2 Bahan dan Alat Percobaan 4.2.1
Bahan Percobaan
HAK CIPTA DILINDUNGI UNDANG-UNDANG
[1] Tidak diperkenankan mengumumkan, memublikasikan, memperbanyak sebagian atau seluruh karya ini dalam bentuk apapun tanpa izin tertulis [2] Tidak diperkenankan mengutip sebagian atau seluruh karya ini tanpa menyebut dan mencantumkan sumbe [3] Pengutipan hanya diberikan bagi kepentingan akademik, penelitian, penulisan karya ilmiah dan penyusunan
Bahan baku utama dalam penelitian ini adalah sukrosa, invertase (SigmaAldrich I4504 - Grade VII, ≥300 units/mg solid), akar kawao (Milletia sericea) dan buffer pH (3-11). Akar kawao (Millettia sericea) yang akan dibuat ekstraknya diperoleh dari Desa Talagasari, Kecamatan Serang Panjang, Kabupaten Subang, Jawa Barat. Bahan kimia yang digunakan untuk analisa terdiri dari asam 3,5dinitrosalisilat, Na-K Tartrat, Na-metabisulfit, fenol, NaOH, HCl 0.1 N, glukosa, fruktosa, aquades, garam CH3COONa, CH3COOH, NH4OH, dan NH4Cl.
4.2.2
Alat Percobaan Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah peralatan gelas
(erlenmeyer, breaker glass, pipet tetes, corong, tabung reaksi); peralatan ukur (labu takar, gelas ukur, pipet volumetri, pipet mikro, termometer, spektrofotometer UV-
25
FTIP001640/037
26
VIS, stopwatch, buret, neraca, pH meter), dan peralatan pendukung (penangas air, sentrifuge, mortar, pisau, vortex).
4.3 Metode Percobaan Metode penelitian ini merupakan metode eksperimental deskriptif dengan dua ulangan yang dilanjutkan dengan analisis regresi dan korelasi untuk memprediksi variabel terikat (Y) bila variabel bebas (X) diketahui. Perlakuan yang dicobakan adalah pengaruh konsentrasi enzim (X1), konsentrasi sukrosa (X2), suhu (X3), pH (X4) dan lama pemanasan (X5) terhadap aktivitas enzim invertase yang ditambahkan inhibitor berupa ekstrak kawao fraksi larut air (A) dan fraksi larut etanol (B). Adapun
HAK CIPTA DILINDUNGI UNDANG-UNDANG
[1] Tidak diperkenankan mengumumkan, memublikasikan, memperbanyak sebagian atau seluruh karya ini dalam bentuk apapun tanpa izin tertulis [2] Tidak diperkenankan mengutip sebagian atau seluruh karya ini tanpa menyebut dan mencantumkan sumbe [3] Pengutipan hanya diberikan bagi kepentingan akademik, penelitian, penulisan karya ilmiah dan penyusunan
rincian perlakuan yang dicobakan tersebut adalah sebagai berikut : X1
= konsentrasi enzim,yang terdiri dari : 0; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45; 0,5 mg/L (b/v)
X2
= konsentrasi sukrosa, yang terdiri dari : 0; 2,5; 5; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5; 20; 22,5; 25 g/L (b/v)
X3
= suhu, yang terdiri dari 25º C, 35º C, 45º C, 55º C, 65ºC, 75º C, 85º C, 95º C
X4
= pH, yang terdiri dari nilai pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11
X5
= lama pemanasan,yang terdiri dari : 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 menit Analisis yang digunakan dipilih dari beberapa model regresi yang dianggap
dapat mewakili hasil pengamatan, yaitu model regresi yang memiliki nilai R2 (koefisien determinasi/penentu) 0,75 ≤ R 2 ≤ 1,0. Nilai R2 mengukur derajat hubungan antara variabel X dan Y apabila terdapat hubungan regresi. Perhitungan nilai R2 dilakukan dengan menggunakan rumus:
FTIP001640/038
27
R 2
Y
i
2 Y Yi Yˆi
Y
i
Y
2
2
Keeratan hubungan antara variabel X (konsentrasi ekstrak akar kawao) dan variabel Y (kriteria pengamatan) ditentukan dengan koefisien korelasi (r) yang dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
=
(∑
∑
)(∑
)
Keterangan:
HAK CIPTA DILINDUNGI UNDANG-UNDANG
[1] Tidak diperkenankan mengumumkan, memublikasikan, memperbanyak sebagian atau seluruh karya ini dalam bentuk apapun tanpa izin tertulis [2] Tidak diperkenankan mengutip sebagian atau seluruh karya ini tanpa menyebut dan mencantumkan sumbe [3] Pengutipan hanya diberikan bagi kepentingan akademik, penelitian, penulisan karya ilmiah dan penyusunan
1.
Nilai r negatif (-), berarti jika variabel X semakin besar, maka variabel Y semakin kecil.
2.
Nilai r positif (+), berarti jika variabel X semakin besar, maka variabel Y semakin besar pula. Berikut adalah persamaan matematik dari beberapa model regresi yang dapat
digunakan (Sudjana, 1996): Linier
: Ŷ i= a + bXi
Logaritmik
: Ŷ i= a + b logXi
Kuadratik
: Ŷ i = a + bXi + cXi2
Kubik
: Ŷ i = a + bXi + cXi2 + dXi3
Eksponensial
: Ŷ i = aebX
dimana : Ŷi
= nilai Y adalah konsentrasi gula pereduksi pada berbagai perubahan faktor
FTIP001640/039
28
a
= intercept
b
= angka arah atau koefisien regresi menunjukkan angka laju peningkatan atau penurunan variabel terikat yang didasarkan pada variabel bebas. Bila b (+) maka terjadi peningkatan dan bila b (-) maka terjadi penurunan.
c
= angka arah atau koefisien regresi menunjukkan laju perubahan rata-rata Ŷi jika Xi2 berubah pada keadaan variabel lain tetap. Bila c positif (+) maka untuk setiap perubahan Xi2 sebesar 1 satuan, Ŷi rata-rata bertambah sebesar c, bila c negatif (-) maka untuk setiap perubahan Xi2 sebesar 1 satuan, Ŷi rata-rata berkurang sebesar c.
d
= angka arah atau koefisien regresi menunjukkan laju perubahan rata-rata Ŷi
HAK CIPTA DILINDUNGI UNDANG-UNDANG
[1] Tidak diperkenankan mengumumkan, memublikasikan, memperbanyak sebagian atau seluruh karya ini dalam bentuk apapun tanpa izin tertulis [2] Tidak diperkenankan mengutip sebagian atau seluruh karya ini tanpa menyebut dan mencantumkan sumbe [3] Pengutipan hanya diberikan bagi kepentingan akademik, penelitian, penulisan karya ilmiah dan penyusunan
jika Xi3 berubah pada keadaan variabel lain tetap. Bila d positif (+) maka untuk setiap perubahan Xi3 sebesar 1 satuan, Ŷi rata-rata bertambah sebesar d, bila negatif (-) maka untuk setiap perubahan Xi3 sebesar 1 satuan, Ŷi rata rata berkurang sebesar d. e
= 2,71828
Xi
= data nilai perlakuan yang dicobakan pada berbagai perubahan faktor.
4.4
Pelaksanaan Percobaan
4.4.1. Percobaan Pendahuluan Percobaan pendahuluan terdiri dari 4 tahap yaitu: a. Pembuatan dan karakterisasi serbuk akar kawao. b. Pembuatan dan karakterisasi (fitokimia) ekstrak akar kawao fraksi larut air dan fraksi larut etanol.
FTIP001640/040
29
c. Penentuan konsentrasi dan unit aktivitas larutan enzim invertase sebagai larutan uji. d. Penentuan konsentrasi ekstrak akar kawao fraksi larut air dan fraksi larut etanol dalam larutan uji.
4.4.2. Percobaan Utama Percobaan utama terdiri dari pengujian pengaruh konsentrasi enzim, konsentrasi sukrosa, suhu, pH dan lama pemanasan terhadap aktivitas enzim invertase yang ditambahkan inhibitor dari ekstrak kawao fraksi larut air dan fraksi larut etanol. Konsentrasi larutan enzim invertase yang digunakan adalah 0,001 g/l.dan ekstrak akar
HAK CIPTA DILINDUNGI UNDANG-UNDANG
[1] Tidak diperkenankan mengumumkan, memublikasikan, memperbanyak sebagian atau seluruh karya ini dalam bentuk apapun tanpa izin tertulis [2] Tidak diperkenankan mengutip sebagian atau seluruh karya ini tanpa menyebut dan mencantumkan sumbe [3] Pengutipan hanya diberikan bagi kepentingan akademik, penelitian, penulisan karya ilmiah dan penyusunan
kawao yang digunakan (fraksi larut air dan fraksi larut etanol) adalah ekstrak yang diperoleh dari hasil penelitian pendahuluan dengan konsentrasi 0,02% (b/v) (lampiran 1).
FTIP001640/041
30
a.
Pengaruh Konsentrasi Enzim Invertase
Larutan kerja enzim invertase 0,001 g/l (0,0 – 1,0 ml)
Penambahan aquades hingga volume 1 ml
Penambahan larutan kawao sebanyak 0,02 ml
Penambahan larutan sukrosa 50 g/L hingga vomule 2 ml (t0)
HAK CIPTA DILINDUNGI UNDANG-UNDANG
[1] Tidak diperkenankan mengumumkan, memublikasikan, memperbanyak sebagian atau seluruh karya ini dalam bentuk apapun tanpa izin tertulis [2] Tidak diperkenankan mengutip sebagian atau seluruh karya ini tanpa menyebut dan mencantumkan sumbe [3] Pengutipan hanya diberikan bagi kepentingan akademik, penelitian, penulisan karya ilmiah dan penyusunan
Inkubasi reaksi selama 5 menit setelah penambahan sukrosa pada suhu ruang
Pengujian Gula pereduksi
Gambar 6. Diagram Proses Pengujian Pengaruh Konsentrasi Enzim (Modifikasi Metode Wang, 2011)
FTIP001640/042
31
b.
Pengaruh Konsentrasi Substrat
Larutan sukrosa konsentrasi 50 g/L (0-1 ml)
Penambahan aquades hingga volume total 1 ml
Penambahan larutan ekstrak sebanyak 0,02 ml
Penambahan larutan kerja enzim invertase 0,001 g/l hingga total volume 2 ml (t0)
HAK CIPTA DILINDUNGI UNDANG-UNDANG
[1] Tidak diperkenankan mengumumkan, memublikasikan, memperbanyak sebagian atau seluruh karya ini dalam bentuk apapun tanpa izin tertulis [2] Tidak diperkenankan mengutip sebagian atau seluruh karya ini tanpa menyebut dan mencantumkan sumbe [3] Pengutipan hanya diberikan bagi kepentingan akademik, penelitian, penulisan karya ilmiah dan penyusunan
Inkubasi reaksi selama 5 menit setelah penambahan enzim pada suhu ruang
Prosedur pengujian gula pereduksi Gambar 7. Diagram Proses Pengujian Pengaruh Konsentrasi Substrat (Modifikasi Metode Wang, 2011)
FTIP001640/043
32
c.
Pengaruh Suhu Larutan sukrosa 50 g/l (0,48) ml
Pengondisian pada berbagai suhu (0-90o C)
Penambahan 0,02 ml larutan ekstrak akar kawao
Penambahan aquades hingga volume total 1 ml
HAK CIPTA DILINDUNGI UNDANG-UNDANG
[1] Tidak diperkenankan mengumumkan, memublikasikan, memperbanyak sebagian atau seluruh karya ini dalam bentuk apapun tanpa izin tertulis [2] Tidak diperkenankan mengutip sebagian atau seluruh karya ini tanpa menyebut dan mencantumkan sumbe [3] Pengutipan hanya diberikan bagi kepentingan akademik, penelitian, penulisan karya ilmiah dan penyusunan
Penambahan 1 ml larutan kerja enzim invertase 0,001 g/l (t0)
Inkubasi reaksi selama 5 menit setelah penambahan enzim
Prosedur pengujian gula pereduksi Gambar 8. Diagram Proses Pengujian Pengaruh Suhu (Modifikasi Metode Wang, 2011)
FTIP001640/044
33
d.
Pengaruh pH Larutan enzim 0,01 g/L (dibuat dalam larutan buffer pH 3 sampai pH 11)
Pengenceran hingga 0,001 g/L menggunakan Buffer pH 7
Penambahkan 0,02 ml ekstrak akar kawao ke dalam 1 ml larutan enzim tersebut
Penambahan aquades 0,5 ml
HAK CIPTA DILINDUNGI UNDANG-UNDANG
[1] Tidak diperkenankan mengumumkan, memublikasikan, memperbanyak sebagian atau seluruh karya ini dalam bentuk apapun tanpa izin tertulis [2] Tidak diperkenankan mengutip sebagian atau seluruh karya ini tanpa menyebut dan mencantumkan sumbe [3] Pengutipan hanya diberikan bagi kepentingan akademik, penelitian, penulisan karya ilmiah dan penyusunan
Penambahan larutan sukrosa 50 g/L hingga total volume 2 ml (t0)
Inkubasi reaksi selama 5 menit setelah penambahan sukrosa pada suhu ruang
Prosedur pengujian gula pereduksi Gambar 9. Diagram Proses Pengujian Pengaruh pH (Modifikasi Metode Wang, 2011)
FTIP001640/045
34
e.
Pengaruh Lama Pemanasan
Larutan enzim 0,001 g/L (1 ml)
Penambahan 0,02 ml larutan ekstrak akar kawao dan aquades 0,48 ml
Pemanasan pada penangas suhu 95o C dengan rentan waktu (0 – 60 menit)
Penambahan larutan sukrosa 50 g/L 0,5 ml (t0)
HAK CIPTA DILINDUNGI UNDANG-UNDANG
[1] Tidak diperkenankan mengumumkan, memublikasikan, memperbanyak sebagian atau seluruh karya ini dalam bentuk apapun tanpa izin tertulis [2] Tidak diperkenankan mengutip sebagian atau seluruh karya ini tanpa menyebut dan mencantumkan sumbe [3] Pengutipan hanya diberikan bagi kepentingan akademik, penelitian, penulisan karya ilmiah dan penyusunan
Inkubasi reaksi selama 5 menit setelah penambahan sukrosa pada suhu ruang
Prosedur pengujian gula pereduksi
Gambar 10. Diagram Proses Pengujian Pengaruh Lama Pemanansan (Modifikasi Metode Wang, 2011)
4.5
Kriteria Pengamatan Kriteria pengamatan untuk keseluruhan penelitian adalah pengamatan
terhadap konsentrasi gula pereduksi dengan metode DNS (Apriantono, dkk., 1989). Konsentrasi gula pereduksi (fruktosa dan glukosa) merupakan produk dari keseluruhan hasil reaksi antara sukrosa dengan enzim invertase dengan atau tanpa penambahan inhibitor (ekstrak akar kawao fraksi larut air dan fraksi larut etanol).
FTIP001640/046
