GENOTIPING GEN ACACA DAN HUBUNGANNYA DENGAN ASAM LEMAK SUSU SAPI FRIESIAN HOLSTEIN MENGGUNAKAN TEKNOLOGI TAQMAN REAL-TIME PCR
ROSIDI AZIS
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Genotiping Gen ACACA dan Hubungannya dengan Asam Lemak Susu Sapi FH Menggunakan TaqMan real-time PCR adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, September 2015 Rosidi Azis NIM D15130251
RINGKASAN ROSIDI AZIS. Genotiping gen ACACA dan Hubungannya dengan Asam Lemak Susu Sapi Perah Friesian Holstein Menggunakan TaqMan Real-time PCR. Dibimbing oleh JAKARIA, ASEP GUNAWAN dan ANNEKE ANGGRAENI. Kandungan asam lemak susu sangat besar dipengaruhi oleh faktor genetik. Gen ACACA merupakan gen penting dalam regulasi dan metabolisme asam lemak susu pada sapi Friesian Holstein (FH). Pengaruh keragaman gen ACACA terhadap asam lemak susu pada sapi FH dalam negeri belum banyak dilakukan. Penelitian bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen ACACA pada sapi FH dan analisis hubungan kergaman gen ACACA terhadap kandungan asam lemak susu. Sampel DNA sapi FH yang digunakan berasal dari lima lokasi sebanyak 277 sampel yang terdiri atas sapi betina laktasi sebanyak 113 ekor dari Balai Penelitian Ternak (Balitnak) Ciawi, 42 ekor berasal dari BPPT-SP Cikole, 76 ekor berasal dari BBPTU Baturraden, serta sapi pejantan sebanyak 17 ekor dari BIB Lembang dan 29 ekor dari BBIB Singosari. Sampel susu sebanyak 42 dikoleksi dari BPTU Baturaden berdasarkan uji satu hari dengan menjumlahkan produksi pagi dan sore dari bulan laktasi 1-4. Sampel susu dianalisis menggunakan Gas Chromatography Mass Spectromtery (GCMS). Ampilfikasi gen ACACA menggunakan TaqMan real-time PCR (polymerase chain reaction) dengan kondisi suhu thermal cycler yaitu suhu denaturasi, annealing dan ekstensi masing-masing 95 oC selama 20 detik, 60 oC selama 1 menit dan 95 oC selama 3 detik yang diulang sebanyak 40 siklus. Penentuan genotipe gen ACACA pada setap individu dan kelompok sampel ditunjukkan dalam bentuk kurva dan klaster fluoresensi genotipe. Genotipe GG ditunjukkan dengan kurva fluoresensi FAM berwarna biru, genotipe GT ditunjukkan oleh kurva fluoresensi berwarna FAM-VIC kombinasi warna biru dan merah jambu (pink) atau hijau, sedangkan genotipe TT ditunjukkan oleh kurva fluoresensi VIC. Data genotipe dianalisis menggunakan frekuensi genotipe, frekuensi alel, derajat heterozigositas, indeks deferensiasi genetik (FST) dan tingkat keragaman alel dihitung menggunakan nilai PIC (polymorphic informative content). Analisis hubungan keragaman genotipe ACACA dengan kandungan asam lemak susu menggunakan GLM (general linier model) SAS versi 9.2. Hasil amplifikasi gen ACACA pada sapi FH diperoleh dua genotipe yaitu GG dan GT. Genotipe GG ditunjukkan oleh fluoresensi FAM berwarna biru, sedangkan genotipe GT ditunjukkan oleh kombinasi fluoresensi FAM dan VIC. Nilai frekuensi genotipe GG secara umum lebih tinggi dibandingkan genotipe GT dengan rataan masing-masing 0.885 dan 0.115. Frekuensi alel G juga menunjukkan lebih tinggi dibandingkan dengan frekuensi alel T masing-masing 0.942 dan 0.058. Nilai heterozigositas termasuk kategori rendah (Ho=0.027-0.176 dan He=0.026-0.161). Rerata nilai FST sebesar 0.100 dan nilai PIC termasuk kategori rendah (<0.25). Analisis keragaman gen ACACA terhadap asam lemak susu, secara umum tidak berbeda nyata kecuali pada asam lemak laurat (C12:0) dan dodecanoat (C12:1). Genotipe GG memiliki kandungan asam laurat lebih tinggi (5.99±0.09) dibandingkan dengan genotipe GT (5.55±0.18), sedangkan
genotipe GT memiliki kandungan asam lemak dodecanoat lebih tinggi (0.29±0.06) dibanding genotipe GG (0.14±0.06). Disimpulkan bahwa gen ACACA pada sapi FH yang diamati bersifat polimorfik. Keragaman gen ACACA berpengaruh nyata terhadap asam lemak laurat (C12:0) dan dodecanoat (C12:1). Keragaman gen ACACA berpotensi menjadi marka genetik yaitu genotipe GG untuk meningkatkan asam lemak laurat dan genotipe GT untuk meningkatkan asam lemak dodecanoat. Kata Kunci: asam lemak susu, Friesian Holstein, gen ACACA, real-time PCR
SUMMARY ROSIDI AZIS. Genotyping ACACA Gene and its Assosiasion with Milk Fatty Acid in Holstein Friesian using TaqMan Real-time PCR. Supervised by JAKARIA, ASEP GUNAWAN and ANNEKE ANGGRAENI. Milk fatty acids are largely effected by genetic factor. ACACA gene is one of importen genes in regulation and metabolism function on milk fatty acids in dairy cattle. Study on effect of the ACACA gene on milk fatty acid components in domestic Holstein Friesian (HF) cows should be done. The aims of the research were to identify the ACACA gene polymorphism and to associate varian genotypes of this gene with each milk fatty acid components in daity cattle. DNA samples of dairy cattle were extracted from five locations consisting of HF lactating cows from Balitnak (113 hds.), BBPTU Baturraden (76 hds.), BPPT-SP Cikole (42 hds.); as well as HF bulls from BIB Lembang (17 hds.) and BBIB Singosari (29 hds.). A number of 42 milk samples were collected from BBPTU Baturraden based on a single test day as the summation of morning and noon milk yields of cows for lactation periods among 1-4 and lactation months among 1-4. Milk samples were analyzed by Gas Chromatography Mass Spectromtery (GCMS). Amplification of ACACA gene used TaqMan real-time PCR (polymerase chain reaction) with thermo cycler condition of denaturation, annealing and extention for 95 oC for 20s, 60 oC for 1 min and 95 oC for 3s, respectively in 40 cycles. To determine genotype variant of the ACACA gene of individual animal was done through fluorescence curve and cluster genotype. GG genotype was shown by FAM fluoresence with blue dye, GT genotype was shown by FAM and VIC fluorescence with combination of blue and pink (green) dye, while TT genotype was shown by VIC fluorescence with pink dye. Data of genotyping were analyzed for genotype frequency, allele frequency, heterozigosity and level of polymorphic allele using PIC (polymorphic informative content) value. Association of genotype variants of the ACACA gene with each of milk fatty acids was analyzed by GLM (general linier model) procedure by SAS ver. 9.2. Genotyping the ACACA gene resulted two genoypes, namely GG and GT.The GG genotype was shown by FAM fluorescence with blue dye, while the GT genotype was shown by FAM dan VIC fluorescences with blue and pink (green) dye. Frequency of the GG genotype totally were higher (0.885) than the GT genotype (0.115). Thus frequency of G allele totally was higher than that of T allele, namely 0.942 and 0.058. The values of heterozigosity observation was lower than the expectation one (Ho=0.027-0.176 and He=0.026-0.161). The average of FSTwas 0.100 and PIC value was at a low category (<0.25). Associations of genotype polymorphism of the ACACA gene with individual milk fatty acids were generally not significant instead of laurat (C12:0) and dodecanoat (C12:1) fatty acids. The GG cows produced higher laurat than the GT ones, namely 5.99±0.09 % vs. 5.55±0.18 %, whilst the GT cows produced higher dodecanoat than the GG ones, namely 0.29±0.06 % vs. 0.14±0.06 %. It was concluded that the ACACA gene in the observed HF cattle was polymorphic with the GG and the GT genotypes. Those two GG and GT genotypesof the ACACA gene resulted higher fatty acids of laurat (C12:0)and
dodecenoat (C12:1). Those the ACACA gene may be possible to be used as gene assisted selection to increase laurat and dodecanoat fatty acids in domestic HF cows. Key Word: ACACA gene, Holstein Friesian, milk fatty acid, real-time PCR
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015 Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
GENOTIPING GEN ACACA DAN HUBUNGANNYA DENGAN ASAM LEMAK SUSU SAPI FRIESIAN HOLSTEIN MENGGUNAKAN TEKNOLOGI TAQMAN REAL-TIME PCR
ROSIDI AZIS
Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015
Penguji Luar pada Ujian Tesis: Dr Ir Dedy Duryadi Solihin, DEA
Judul Tesis
Nama NIM
: Genotiping Gen ACACA dan Hubungannya dengan Asam Lemak Susu Sapi Friesian Holstein Menggunakan Teknologi TaqMan Real-time PCR : Rosidi Azis : D15130251
Disetujui oleh Komisi Pembimbing
Dr Jakaria, SPt MSi Ketua
Dr agr Asep Gunawan, SPt MSc Anggota
Ir Anneke Anggraeni, MSi PhD Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan
Dekan Sekolah Pascasarjana IPB
Dr Ir Salundik, MSi
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian: 10 September 2015
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian ini yaitu genotiping gen ACACA dan hubungannya dengan asam lemak susu sapi Friesian Holstein Menggunakan TaqMan real-time PCR. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Jakaria SPt MSi, Dr agr Asep Gunawan, SPt MSc dan Ir Anneke Anggraeni, MSi PhD selaku pembimbing yang telah banyak memberi saran masukan dan motivasi mulai dari awal hingga akhir penulisan tesis ini. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr Ir Dedy Duryadi Solihin, DEA selaku penguji luar komisi pada ujian tesis yang telah memberikan masukan yang konstruktif untuk kesempurnaan tesis ini. Penghargaan penulis sampaikan kepada Prof Cece Sumantri, MAgrSc, Eryk Andreas, SPt MSi serta Selvy SSi dan teman-teman di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak (LGMT) yang telah memberikan masukan yang sangat berharga untuk kesempurnaan penelitian ini. Penulis mengucapkan terimakasih kepada Dr Ir Salundik, MSi selaku Ketua Program Studi Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan (IPTP) serta jajarannya (ibu Ade dan ibu Okta) di sekretariat Pasca IPTP. Teman-teman seperjuangan di Pascasarjana IPTP 2013 terima kasih atas canda dan tawa serta mohon maaf bila ada hal yang kurang berkenan. Terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi atas Beasiswa Unggulan Dalam Negeri (BU-DN) yang diberikan kepada Penulis selama menempuh pendidikan Pascasarjana IPB dan kepada program Hibah KKP3N yang telah membiayai penelitian ini. Penulis sampaikan terima kasih kepada Kepala dan Staf Balai Penelitian Ternak (Balitnak), BBPTU Baturraden, BPTP SP Cikole, BBIB Singosari dan BIB Lembang atas materi penelitian yang diberikan. Ungkapan terima kasih penulis sampaikan kepada ayahanda, ibunda, keluarga di Madura dan di Kudus tanpa menyebutkan satu persatu dan istri tercinta serta anak saya yang sholeh atas segala doa dan kasih sayangnya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, September 2015 Rosidi Azis
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
1 PENDAHULUAN Latar Belakang Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian Ruang Lingkup Penelitian
1 1 2 2 2
2 TINJAUAN PUSTAKA Susu dan asam lemak Keragaman gen ACACA Real-time PCR
3 3 5 6
3 MATERI DAN METODE Lokasi Penelitian Materi Penelitian Metode Penelitian Analisis Data
8 8 8 8 10
4 HASIL DAN PEMBAHASAN Amplifikasi Gen ACACA Frekuensi Gen ACACA Heterozigositas, FST dan PIC Asosiasi Gen ACACA dengan Asam Lemak Susu
11 11 13 14 15
5 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran
18 18 18
DAFTAR PUSTAKA
18
LAMPIRAN
22
RIWAYAT HIDUP
25
DAFTAR TABEL 1 2 3 4 5 6
Kandungan komponen susu pada beberapa bangsa sapi perah perah Karakteristik sampel penelitian sapi FH Hasil desain primer dan probe gen ACACA Frekuensi genotipe dan alel gen ACACA pada sapi FH Analisis derajar heterozigositas, FST dan PIC Pengaruh keragaman gen ACACA terhadap asam lemak susu sapi FH
4 8 9 14 15 16
DAFTAR GAMBAR 1 2 3 4 5 6 7
Ruang lingkup penelitian gen ACACA dan analisis asam lemak susu Struktur Gen ACACA pada sapi rumpun Bos taurus Sintesis asam lemak dalam sistem seluler Amplifikasi dan genotiping dalam real-time PCR Primer dan probe (forward-reverse) gen ACACA Kurva amplifikasi dan genotiping gen ACACA Kelompok genotipe gen ACACA
3 5 7 9 12 13
DAFTAR LAMPIRAN 1 Sekuen Gen ACACA No. Akeses Gene bank AJ276223
21
1 PENDAHULUAN Latar Belakang Susu merupakan salah satu sumber gizi hewani yang bermanfaat bagi manusia. Air susu menyediakan komponen penting berupa protein, lemak, laktosa, kalsium dan komponen lainnya yang bermanfaat bagi kesehatan, pertumbuhan, kecerdasan dan sistem kekebalan tubuh (Feskanich et al. 1997). Lemak susu merupakan salah satu komponen yang memiliki nilai ekonomis tinggi yang dibutuhkan untuk produk keju dan produk pangan fungsional lainnya. Kandungan asam lemak jenuh (saturated fatty acid/SFA) dalam susu termasuk tinggi yaitu sekitar 67.25 %, sedangkan kandungan asam lemak tak jenuh baik tunggal (monounsaturated fatty acid/MUFA) ataupun asam lemak tak jenuh ganda (polyunsaturated fatty acid/PUFA) rendah yaitu masing-masing sekitar 27.63 % dan 3.33 % (Ellis et al. 2006). Penelitian sebelumnya telah melaporkan bahwa mengkonsumsi makanan yang mengandung berlebihan SFA dan lemak trans dapat menyebabkan penyakit kardiovaskular, jantung koroner dan stroke (Ulbricht and Southgate 1991; Kelly et al. 1998). Sebaliknya, mengkonsumsi asam lemak tak jenuh (omega-3, omega-6 dan omega-9) berkorelasi positif terhadap kesehatan tubuh manusia, salah satunya yaitu mengurangi dan mencegah terjadinya penyakit kanker dan tumor (Kennelly 1996; Connor 2000; Huth dan Park 2012). Asam lemak susu merupakan sifat kuantitatif yang dikodekan oleh banyak gen dalam sejumlah alur biologis yang membawa sintesis asam lemak (Mao et al. 2001; Bionaz dan Loor 2008; Marchitelli et al. 2013). Salah satu gen yang berpengaruh untuk hal tersebut adalah gen acetyl-CoA carboxylase α (ACACA). Gen ACACA terletak pada kromosom 19q13-p14 yang memiliki panjang 6203 pb (panjang basa) yang terdiri dari 56 exon dan 55 intron (Shin et al. 2011). Gen tersebut memiliki peranan kunci di dalam alur metabolisme lemak susu yang mengontrol enzim acetyl-CoA carboxylase dalam regulasi sintesis asam lemak (Abu-Elheiga et al. 1995; Barber et al. 2003). Aktivitas Acetyl-CoA carboxylase di dalam sistem seluler meningkat, sehingga mengakibatkan peningkatan produksi malonyl-CoA yang digunakan sebagai substrat untuk sintesis asam palmitat dan asam lemak rantai panjang (asil-CoA>C22: 0). Malonil-CoA berfungsi sebagai inhibitor penting dalam sintesis asam lemak di dalam mitokondria untuk βoksidasi (Awan dan Saggerson 1993; Barber et al. 2003). ACACA diekspresikan dalam metabolisme asam lemak di seluruh jaringan lipogenik ternak seperti jaringan adipose, liver dan kelenjar susu selama laktasi (Barber et al. 2003; Thering et al. 2009). Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa sebanyak delapan SNP (g.2064T>A, g.2155C>T, g.2203G>T, g.2268T>C, g.2274G>A, g.2340A>G, g.2350T>C dan g.2370A>G) di daerah promotor I 5’UTR (untranlated region) berpengaruh signifikan (P<0.05) terhadap komposisi asam lemak pada daging sapi (Zhang et al. 2009). Berdasarkan informasi tersebut bahwa SNP (single nucleotide polymorphism) gen ACACA perlu diverikasi pengaruhnya terhadap komponen asam lemak sebagai salah satu upaya untuk meningkatkan kualitas asam lemak susu pada sapi FH. Pemanfaatan SNP dalam bidang seleksi molekuler saat ini banyak dilakuan karena dianggap dapat memberikan respon yang cepat dan seleksi dapat dilakukan lebih awal terhadap sifat-sifat ekonomis (Veerkamp 1998). Penerapan
2 seleksi di masa yang akan datang dapat diarahkan untuk mendorong produksi bibit sapi FH berkualitas yaitu sebagai penghasil susu dengan kandungan asam lemak yang baik. Pemanfaatan teknologi dalam bidang molekuler saat ini sudah berkembang dengan menggunakan PCR (Polymerase Chain Reaction). Real-time PCR merupakan salah satu teknologi baru dalam bidang molekuler untuk identifikasi SNP dengan cepat dalam menghasilkan data genotipe (Ranade et al. 2001). Real-time PCR menggunakan TaqMan MGB probe atau dikenal dengan nama lain yaitu TaqMan SNP genotyping assay atau 5’nuclease allelic discrimination assay yang dapat memancarkan fluoresensi spesifik pada situs target. TaqMan real-time PCR telah digunakan secara luas dalam bidang biologi molekuler termasuk pada hewan ternak (Poon et al. 2009; Navarro et al. 2015). Keunggulan real-time PCR dalam genotiping gen hanya membutuhkan sampel sedikit, melihat produk PCR secara real-time tanpa membutuhkan elektroforesis, memiliki sensitifitas yang tinggi dan hasilnya sangat akurat (Ranade et al. 2001; Mackay et al. 2002; Shen et al. 2009). Dengan demikian, seleksi melalui penerapan teknologi TaqMan real-time PCR dalam bidang molekuler dapat dimanfaatkan untuk identifikasi SNP gen ACACA dalam upaya meningkatkan kualitas asam lemak susu pada sapi FH di dalam negeri. Tujuan Penelitian 1. 2.
Tujuan penelitian ini adalah untuk melakukan: Analisis keragaman gen ACACA menggunakan teknologi TaqMan real-time PCR. Analisis hubungan keragaman genotipe gen ACACA terhadap komponen asam lemak susu pada sapi FH domestik. Manfaat Penelitian
Informasi yang diperoleh dari penelitian ini diharapkan dapat diaplikasikan sebagai dasar seleksi berbasis SNP untuk mendapatkan sapi-sapi FH yang memiliki kandungan asam lemak susu yang baik. Ruang Lingkup Penelitian Penelitian ini terbagi menjadi dua tahapan yaitu analisis keragaman genetik dan analisis asam lemak. Tahap pertama yaitu untuk mengidentifikasi variasi genetik gen ACACA pada FH yang diperoleh dari ke lima lokasi penelitian yang terdiri atas sapi FH laktasi (Balitnak, BBPTU Baturraden, BPPT-SP Cikole) dan sapi FH Pejantan aktif (BBIB Singosari dan BIB Lembang). Tahap kedua yaitu melakukan studi analisis hubungan variasi genotipe dengan komponen asam lemak susu. Asam lemak susu yang dianalisis dari BBPTU Baturraden, dimana pada lokasi tersebut sapi perah dipelihara dengan sistem pemeliharaan intensif dan manajemen pemeliharaan yang sama. Hal tersebut bertujuan untuk meminimalkan pengaruh non-genetik. Ruang lingkup penelitian kedua tahapan tersebut disajikan dalam Gambar 1.
3
Gambar 1 Ruang lingkup penelitian gen ACACA dan analisis asam lemak susu
2 TINJAUAN PUSTAKA Susu dan Asam Lemak Susu Susu merupakan sumber gizi hewani yang bermanfaat bagi manusia. Susu dihasilkan oleh kelenjar mamae sapi perah selama laktasi. Susu mengandung protein, lemak, laktosa, kalsium dan komponen lainnya yang sangat besar manfaatnya bai kesehatan, kecerdasan dan sistem imun (Feskanich et al. 1997). Kandungan komponen susu pada beberapa rumpun sapi perah Bos taurus disajikan pada Tabel 1. Sapi Ffriesian Holstein (FH) merupakan sapi perah penghasil susu yang paling tinggi dibandingkan rumpun sapi perah lainnya dengan kadar lemak paling rendah di antara sapi perah lainnya (Webb dan Johnson 1965). Produktivitas sapi perah dapat dilihat dengan cara mengukur produksi susu selama satu masa laktasi. Masa laktasi merupakan lama menghasilkan susu yaitu sekitar 10 bulan (305 hari dalam satu periode laktasi) antara masa beranak dan masa kering kandang. Total produksi susu pada setiap periode laktasi umumnya bervariasi. Produksi susu yang paling tinggi dicapai pada periode laktasi ke-satu dan ke-empat, sedangkan puncak produksi perlaktasi dicapai pada bulan ke-satu dan ke-lima (Cole et al. 2009).
4 Lemak susu dibutuhkan oleh masyarakat terutama untuk pembuatan keju dan produk olahan pangan (Henning et al. 2006). Lemak susu merupakan salah satu komponen terbesar ke-empat setelah air, protein dan laktosa yang terdapat dalam susu. Lemak susu berbentuk bola-bola kecil yang jumlahnya sangat banyak berukuran antara 1-20 mikron dengan garis tengah 3 mikron (Bukcle et al. 2009). Kandungan lemak susu ditentukan oleh komponen asam lemak. Sebagian besar (98%) asam lemak susu tersebut berupa trigliserida yang berasal dari aktivitas mikrobiologi dalam rumen (Jensen et al. 1991). Secara umum, trigliserida disusun oleh asam lemak rantai pendek, rantai panjang dan rantai sangat panjang yang disintesis oleh kelenjar susu (Gresti et al. 1993). Tabel 1 Kandungan komponen susu pada beberapa rumpun sapi perah Bos taurus Bangsa Holstein
Bobot badan (kg) 640
Produksi susu (kg)
Lemak (%)
Protein (%)
Laktosa (%)
7360
3.54
3.29
4.68
Bahan kering (%) 0.72
Total Solid (%) 12.16
Brown Swiss
640
6100
3.99
3.64
4.94
0.74
13.08
Ayrshire
520
5760
3.95
3.48
4.6
0.72
12.77
Guernsey
500
5270
4.72
3.75
4.71
0.76
14.04
Jersey
430
5060
5.13
3.98
4.83
0.77
14.42
4
3.32
4.89
0.73
12.9
Shorthorn 530 5370 Sumber: Webb dan Johnson 1965
Pengelompokan berdasarkan isomer geometrinya bahwa asam lemak menjadi asam lemak tak jenuh "cis" dan asam lemak jenuh "trans". Berdasarkan panjang rantai karbonnya asam lemak digolongkan menjadi rantai pendek (C2C6), rantai sedang (C8-C12) dan rantai panjang (C14-C24) (Jensen et al. 1991). Asam lemak jenuh (Saturated Fatty Acid/SFA) yang paling dominan dalam susu adalah miristat (C14), Palmitat (C16) dan stearat (C18). Asam lemak tak jenuh baik Monounsaturated Fatty Acid (MUFA) dan polyunsaturated Fatty Acid (PUFA) yang utama meliputi oleat (C18:1) linoleat (C18:2) dan linolenat (C18:3). Asam butirat (C4) dan kaproat (C6) berada dalam jumlah kecil sebagai trigliserida (Bukcle at al. 2009). Trigliserida disusun oleh komponen asam lemak lebih dari 400-500 jenis asam lemak yang berbeda. Trigliserida utama berupa butyroyl-palmitoylacylglycerols dimana proporsinya butyroy-lpalmitoy-loleoyl-glycerol, butyroyldipalmitoyl-glycerol, butyroyl-myristoyl-palmitoylglycerol dengan keadaan masing-masing sekitar 4.2%, 3.2% dan 3.1%. Asam lemak susu lebih komplek jika dibanding asam lemak alami lainnya, disebabkan setidaknya lebih dari 1% terdapat dua dari empat asam lemak rantai panjang utama (C14:0, C16:0, C18:0 dan C18:1) di dalam dua puluh dua trigliserida (Gresti et al. 1993). SFA adalah asam lemak yang tidak memiliki ikatan rangkap pada atom karbonnya. Dengan demikian, asam lemak tersebut tidak peka terhadap oksidasi dan pembentukan radikal bebas yang memiliki dampak terhadap peningkatan kadar kolestrol darah. Sebaliknya, MUFA dan PUFA merupakan jenis asam lemak yang mempunyai satu atau lebih ikatan rangkap pada rantai atom karbon. Oleh karena itu, asam lemak tak jenuh baik MUFA dan PUFA memiliki pengaruh positif dalam menurunkan kadar kolesterol darah (Sartika 2008).
5 Keragaman Gen ACACA Enzim Acetyl-CoA Carboxylase Alpha (ACACA) yang dikode oleh gen ACACA mengkatalisis pembentukan malonyl-Coa dari acetyl-Coa di dalam sitoplasma (Badaoui et al. 2007; Bionaz dan Loor, 2008). Struktur gen ACACA terletak pada kromosom 19 terdiri atas 56 exon dan 55 intron. Total pasang basa (pb) pada gen ACACA pada rumpun Bos taurus adalah 6203 pb (Gambar 2 dan Lampiran 1). Gen ACACA dapat dijadikan marka SNP untuk komposisi asam lemak daging pada sapi, babi dan susu kambing (Gallardo et al. 2009; Zhang et al. 2010). Hasil studi intensif oleh Bouwman et al. (2011) terhadap runutan nukleotida dari gen-gen major pengatur alur biosintesis lemak susu selama masa laktasi, diketahui total varian genotipe aditif sifat kadar dan komposisi asam lemak susu bernilai sedang sampai tinggi (h2 = 0,25-0,45). Asam lemak rantai pendek sampai sedang (C4:0 - C16:0), dan asam lemak rantai panjang (≥ C16:0), disintesis secara de novo dalam kelenjar ambing. Enzim ACACA ditemukan secara merata dalam banyak jaringan, tetapi tingkat yang paling tinggi ditemukan dalam jaringan lipogenik kelenjar susu selama laktasi (Mao et al. 2001). Kromosom 19; lokasi 19q13-p14
ACACA
6203 bp daerah koding
AJ276223
untranslated region
56 exon 55 intron
2203
Gambar 2 Struktur gen ACACA pada rumpun sapi Bos taurus (Shin et al. 2011) Sintesis asam lemak dalam sistem seluler disajikan pada gambar 3. Sintesis asam lemak susu dikendalikan oleh multi enzim, dimana aktivasi enzim tersebut berawal dari Acetyl-CoA (Park et al. 2002). Enzim acetyl-CoA merupakan enzim penentu kecepatan sintesis asam lemak. Karboksilasi acetyl-CoA menjadi malonyl-CoA sebagai reaksi awal, dimana reaksi ini melibatkan HCO3 - dan ATP (adenosine trifosfat). Malonyl-CoA terbentuk dari dua reaksi yaitu pertama, biotin terikat pada protein yang berfungsi sebagai transport yang disebut dengan karboksilbiotin. Ke-dua, memindahkan karboksilbiotin pada acetyl-CoA. Reaksi pemanjangan rantai atom C dimulai dari pembentukan asetil ACP (acyl carrier protein) dan malonil ACP kondensasi. Reaksi kondensasi ini yaitu 4 senyawa atuom C dibentuk dari 2 atom C dan 3 atom C serta CO 2 dibebaskan. Tahap berikutnya yaitu reduksi gugus keto pada C dengan ketoasil ACP reduktasi sebagai katalis. Kemudian 3 hidroksi butiril ACP diubah menjadi krotonil ACP
6
Gambar 3 Sintesis asam lemak di dalam sistem seluler dengan mengeluarkan H2O. Enzim yang bekerja pada reaksi ini yaitu 3-hidroksi asil ACP dehidratase. Reaksi terakhir dari putaran pertama sintesis asam lemak yaitu pembentukan butiril ACP dari krotonil ACP dengan katalis enoil ACP reduktase. Jadi putaran pertama elongasi atau perpanjangan atom C ini telah mengubah acetyl-CoA menjadi butiril ACP. Urutan reaksi ini berulang-ulang sampai panjang atom C mencapai 16 atom C. Pada tahap ini terjadi hidrolisis dan palmitat dibebaskan. Pemanjangan asam lemak palmitat dan mengalami desaturasi untuk menghasilkan bermacam-macam asam lemak (Kim 1997; Sul et al. 2000). Real-time PCR Polymerase chain reaction (PCR) merupakan suatu teknik untuk menggandakan jumlah molekul DNA dan monomer-monomer nukleotida pada ruas-ruas tertentu yang dilakukan secara in vitro dengan bantuan primer dan enzim polymerase (Arya et al. 2005). Primer merupakan oligonukleotida spesifik pada DNA template. Hasil dari proses PCR dapat divisualisasikan dengan elektroforesis dalam PCR komvensional. Secara umum, reaksi yang terjadi dalam mesin PCR dapat dibagi menjadi tiga tahap, yaitu tahap denaturasi (pemisahan untai ganda DNA), tahap annealing (penempelan primer), dan tahap pemanjangan primer atau dikenal fase ekstensi (Muladno 2002). Real-time PCR pada prinsipnya sama dengan prinsip PCR konvensional hanya saja real-time PCR dapat mendeteksi produk amplifikasi pada tiap siklus selama proses PCR (Bustin 2004). Aplikasi real-time PCR memanfaatkan TaqMan probe berfluoresensi, dimana TaqMan Probe didesain untuk menempel pada akumulasi produk yang mengikat sekuen target (Arya et al. 2005). Pemanfaatan TaqMan probe dalam real-time PCR sebagai sistem deteksi telah luas digunakan dalam genotiping dan kuantifikasi gen (Morita et al. 2007).
7 Molekul probe memiliki dua bagian dalam mendeteksi gen yaitu reporter dye pada ujung 5’ dan quencher pada ujung 3’ (Arya et al. 2005). Reporter dye probe berfungsi sebagai pendonor fluoropohor pada ujung 5’, sedangkan quencher dye probe berfungsi sebagai penerima fluorophor pada ujung 3’. Setelah terjadinya proses denaturasi, probe menempel (annealing) pada sekuen target yang mengakibatkan terjadinya hibridisasi. Arya et al. (2005) menyatakan bahwa ke-dua probe berhibridisasi hanya dengan sekuen target selama tahapan atau fase annealing. Hibridisasi probe wild-type hanya berhibridisasi dengan target wildtype bukan dengan mutan, sehingga dapat menghasilkan sinyal fluoresensi. Bila
Cycles
FAM fluoresence Gambar 4 Amplifikasi dan genotiping dalam real-time PCR (Bustin 2004) molekul probe tidak berhibridisasi dengan sekuen target, maka tidak akan menghasilkan sinyal fluoresensi. Cheng et al. (2004) menyatakan bahwa hibridisasi probe sesuai dengan situs mutasi yang menjadi target dan akan menghasilkan sinyal fluoresen. Oleh karena itu, sinyal fluoresen dihasilkan akibat donor molekul fluoresen padam dan molekul akseptor berpendar (Didenko 2001). Kurva fluoresensi hasil hibridisasi probe dapat dimonitor secara real-time dan data genotipe terbaca setelah proses PCR selesai. Data genotipe gen ACACA berbentuk kuva dan berbentuk cluster genotipe berdasarkan fluoresensinya, sebagaimana yang ditunjukkan pada Gambar 4 (Bustin 2004).
8
3 MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Genetika Molekuler Ternak, divisi Pemuliaan dan Genetika, Fakultas Peternakan, Institut Pertanian Bogor dan Balai Penelitian Ternak (Balitnak) Ciawi Bogor dari bulan April 2014 sampai Januari 2015. Materi Penelitian Sampel Penelitian Sampel penelitian berupa darah dan susu sapi FH. Sampel darah yang digunakan adalah 277 ekor yang berasal dari lima lokasi yang terdiri atas 113 ekor dari Balai Penelitian Ternak (Balitnak), BPPT-SP Cikole 42 ekor, BBPTU Baturraden 76 ekor dan 29 ekor, serta untuk pejantan aktif Inseminasi Buatan (IB) dari Balai Inseminasi Nasional yaitu BBIB Singosari 29 ekor dan BIB Lembang 17 ekor (Tabel 2). Sampel susu sapi perah yang digunakan berasal dari BBPTU Baturraden (42 sampel) untuk mengetahui profil asam lemak susu sapi FH. Sampel susu yang dikoleksi berdasarkan uji satu hari dengan menjumlahkan produksi pagi dan sore dari sapi laktasi 1-4 dan periode 1-4. Sampel susu menggunakan jasa analisis asam lemak di Laboratorium Terpadu di Universitas Diponegoro Semarang Jawa Tengah. Tabel 2 Sampel penelitian sapi FH No. Lokasi 1 Balitnak 2 BBPTU Baturraden 3 BPPT-SP Cikole Sub Total 4 BBIB Singosari 5 BIB Lembang Sub Total Total
Jenis Kelamin Betina Betina Betina Jantan Jantan
Jumlah 113 76 42 231 29 17 46 277
Metode Penelitian Prosedur Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA menggunakan GeneJET Whole Blood Genomic DNA Purification Mini Kit (Thermo Scientific) dengan prosedur ekstraksi sebagai berikut: Presipitasi sampel. Sampel darah yang disimpan dalam tabung vaccutaier diambil sebanyak 200 µl dan dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml. Degradasai protein dan bahan organik. Sampel yang sudah dimasukkan tabung eppendorf 1,5 ml, ditambahkan proteinase K, dikocok kuat menggunakan vortex, ditambahkan Lysis Solution sebanyak 400 µl dan di-vortex kembali. Campuran
9 reaksi digoyang pelan menggunakan nutating mixer di dalam inkubator pada suhu 56 oC selama 10 menit. Setelah proses inkubasi selesai, ditambahkan etanol absolute sebanyak 200 µl di-vortex dengan menggunakan pipet. Selanjutnya, dipindahkan ke dalam spin column (kolom saring) dan disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 8.000 rpm. Cairan yang berhasil tersaring dibuang, substrat ditambahkan 500 µl WB (wash buffer) I dan sentrifugasi kembali selama 1 menit pada kecepatan 10.000 rpm. Supernatan yang diperoleh dibuang sehingga yang tersisa adalah DNA. Purifikasi DNA. Sebanya 500 µl WB (wash buffer) II ditambahkan untuk mencuci DNA, larutan kemudian disentrifugasi selama 3 menit dengan kecepatan 14.000 rpm. Selanjutnya ditambahkan 200 µl Elution Buffer dan inkubasi selama 2 menit pada suhu ruang dan sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit. Proses selesai dan sampel DNA disimpan pada suhu -20 ˚C, kemudian siap untuk digunakan. Desain Primer dan Probe Gen ACACA Primer dan probe gen ACACA dirancang menggunakan software primer express versi 3.0.1 (perkin-Elmer, Applied Biosystems) berdasarkan sekuen gen ACACA (No. Akses Genebank : AJ276223). Hasil desain primer dan probe gen ACACA ditampilkan pada Tabel 3. Sekuen primer-forward yaitu 5'-GCC TCC CTG CCT TCA GAT AAA -3'; primer riverse yaitu 5'-GGG AAG TCC CCA GTA TCA TTT TT-3'. Sekuen probe 1 yaitu 5'-(FAM) TGA AGT GTA TAG GAC TTA GAA-3' dan probe 2 yaitu 5'-(VIC) TAT AGG ACT TAT AAA GGG C-3’. TaqMan Probe 1 disintesis dengan fluoresensi FAM™ dye TaqMan®MGB probe untuk mengenali spesifik untuk alel G (wild type) di 5’ akhir reporter berwarna biru, sedangkan probe 2 disintesis dengan fluoresensi VIC™ dye TaqMan®MGB probe untuk mengenali spesifik untuk alel T (mutan) di 3’ akhir quencher berwarna pink (merah jambu), sebagaimana tertera pada Gambar 5. Tabel 3 Hasil desain primer dan probe gen ACACA Posisi SNP (bp) 2203 G>T
Primer /probe
Sekuen
Posisi
Tm
Primer F Primer R Probe 1 Probe 2
5'-GCCTCCCTGCCTTCAGATAAA-3' 5'-GGGAAGTCCCCAGTATCATTTTT-3' 5'-TGAAGTGTATAGGACTTAGAA-3' 5'-TATAGGACTTATAAAGGGC-3
2131-2151 2215-2237 2185-2205 2192-2210
59 58 66 67
No. Akses GeneBank AJ276223
Gambar 5 Primer dan probe (forward-reverse) gen ACACA pada sapi Bos taurus
10 Amplifikasi Gen ACACA Amplifikasi gen ACACA dijalankan pada kondisi Thermal cycler real time-PCR yaitu pada suhu denaturasi 95 oC selama 20 detik, suhu annealing 60 oC selama 1 menit dan suhu ekstensi 95 oC selama 3 detik yang dijalankan selama 40 siklus. Campuran reaksi terdiri atas sample DNA sebanyak 1 µl di distribusikan ke dalam MicroAmp Optical 96-Well reaction plates. Komposisi pereaksi mix terdiri atas : 5 µl TaqMan® GTXpressTM Master Mix yang mengandung buffer, Uracil-Nglicosylase, deoxyribonucleotides, uridine, passive reference dye (ROX) dan Taq Gold DNA polymerse (Applied Biosystems, Foster City, CA USA), 0.5 ul primer dan Taqman-MGB probe (forward dan reverse) dan sisanya RT-PCR grade water 3.5 µl. Substrat DNA kemudian didistribusikan sebanyak 9 µl ke dalam Micro Amp Optical 96-Well reaction plates dengan perbandingan antara DNA dan campuran reaksi 1:9 (vol/vol), non-template DNA digunakan sebagai control dan ditutup dengan sealing foil 96-well. Larutan disentrifugasi terlebih dahulu dengan kecepan 2500 rpm selama 3 menit agar campuran reaksi berada di dasar well dan dimasukkan dalam mesin real-time PCR. Genotiping Gen ACACA Genotiping atau penentuan genotipe dari gen ACACA setiap sampel didasarkan pada tipe kurva dan clustering fluoresensi yang diterima oleh sensor pada mesin real-time PCR. Genotipe GG ditunjukkan fluoresensi FAM berwarna biru, genotipe GT ditandai dengan kombinasi fluoresen VIC dan FAM dengan fluoresensi merah jambu (pink) dan biru atau hijau dan genotipe TT dengan fluoresen VIC dengan warna pink. Hasil data diterima oleh 7500 software v2.0.6 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) dalam bentuk Microsoft excel. Analisis Data Frekuensi Gen, Heterozigositas dan PIC Frekuensi genotipe, frekuensi alel, derajat heterozigositas dan indeks deferensiasi genetik (FST) gen ACACA dihitung menggunakan software popgen32 versi 1.31. Polymorphic Informative Content (PIC) gen ACACA dihitung menurut Hartl & Clark (1997), dengan rumus sebagai berikut : 𝑛
𝑛 −1
𝑛
2𝑝𝑖 2 𝑝𝑗 2
2
PIC = 1 −
𝑝𝑖 − 𝑖=1
𝑖=1 𝑗 =𝑖+1
Keterangan : PIC 𝑝𝑖 𝑝𝑗 𝑛
: Polymorphic Informative Content : frekuensi alel ke-i : frekuensi alel ke-j : Jumlah alel perpenciri
11 Asosiasi Varian Genotipe dari Gen ACACA dengan Asam Lemak Susu Asosiasi keragaman dari dari gen ACACA dengan setiap komponen asam lemak susu dihitung menggungakan prosedur GLM (general linier model) dalam SAS ver. 9.2 dengan model sebagai berikut:
𝑌𝑖𝑗 = 𝜇 + 𝛼𝑖 + 𝜀𝑖𝑗 Keterangan : 𝑌𝑖𝑗 𝜇 𝛼𝑖 𝜀𝑖𝑗
: nilai pengamatan : nilai rataan umum : pengaruh genotipe ke-i : pengaruh galat ke-ij yang menyebar normal
4 HASIL DAN PEMBAHASAN Amplifikasi Gen ACACA Hasil amplifikasi gen ACACA dengan suhu annealing 60oC selama 1 menit pada sapi FH memperoleh dua genotipe yaitu GG dan GT (Gambar 6 dan 7). Genotipe gen ACACA pada individu sapi FH ditunjukkan dengan dua tipe kurva amplifikasi. Genotipe GG ditunjukkan dengan kurva amplifikasi berfluoresensi FAM berwarna biru dan genotipe GT ditunjukkan dengan kurva amplifikasi berfluoresensi FAM dan VIC berwarna biru dan merah jambu (pink). Gen ACACA mulai teramplifikasi pada siklus ke 22 dan 26 dan kurva fluoresensi berhasil melewati garis siklus threshold (Ct) dari base line (awal amplifikasi) menuju fase eksponesial sampai fase plateau (perpanjangan). Nilai siklus threshold kedua kurva fluoresesi VIC dan FAM masing sebesar 0.100926 dan 0.032868. Tinggi rendahnya nilai Ct berhubungan dengan kualitas DNA sampel yang digunakan. Semakin rendah nilai Ct maka kualitas DNA yang teramplifikasi semakin baik (Fraga et al. 2008). Nilai Ct ditentukan secara otomatis pada saat kurva berada pada fase eksponensial (Mackay et al. 2002). Keberhasilan kurva fluoresensi yang melewati nilai Ct dijadikan sebagai indikator keberhasilan amplifikasi gen target dan dijadikan sebagai landasan untuk menentukan genotipe individu sampel yang akurat (Wilhelm et al. 2000; Ranade et al. 2001; Mackay et al. 2002). Data klaster varian genotipe dari gen ACACA seperti tertera pada Gambar 7, terbagi menjadi tiga kelompok yang dapat dibedakan berdasarkan fluoresensinya. Genotipe GG ditunjukkan dengan kelompok fluoresensi FAM berwarna biru dan genotipe GT ditunjukkan dengan kelompok perpaduan fluoresensi VIC dan FAM berwarna hijau, sedangkan warna hitam merupakan NTC (non-template control) berfungsi sebagai kontrol. Genotipe TT tidak ditemukan dalam penelitian ini. Sebagaimana yang ditunjukkan oleh kedua data genotipe tersebut bahwa kurva fluoresensi dan klaster genotipe dengan fluoresensi VIC tidak ditemukan. Hasil penelitian ini sesuai dengan studi yang dilakukan oleh Zhang et al. (2009) yang hanya menemukan dua genotipe yaitu GG dan GT pada sapi Angus dan Beefmaster.
12 1
Plot Amplifikasi 10 1 0.1
0.01
0.001 0.0001 0.00001
0.000001 2
4
6
8 10 12 14
16 18 20 22 24 26 28
30 32 34 36
38 40
30 32 34 36
38 40
Plot Amplifikasi 10 1 0.1
0.01
0.001 0.0001 0.00001
0.000001 2
4
6
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28
Gambar 6 Kurva amplifikasi dan genotiping gen ACACA
13
Plot Diskriminasi Alel
2.1
1.6
1.1
0.6
0.1
0.3
0.5
T
0.7
0.9
1.1
Gambar 7 Klaster genotipe gen ACACA untuk 40 sampel DNA Frekuensi Gen ACACA Frekuensi genotipe gen ACACA pada Tabel 4, menunjukkan bahwa secara umum frekensi genotipe GG lebih tinggi (0.880) dibandingkan genotipe GT (0.115) pada populasi sapi FH pengamatan. Frekuensi genotipe GG yang paling tinggi pada sapi FH Balitnak (0.973), sebaliknya yang terendah pada sapi FH pejantan di BIB Lembang (0.824). Frekuensi genotipe GT yang paling tinggi pada sapi FH pejantan di BIB Lembang (0.176), sebaliknya yang terendah pada sapi FH betina di Balitnak (0.027). Frekuensi alel G gen ACACA sapi FH secara umum menunjukkan lebih dominan terhadap alel T, dengan nilai frekuensi yaitu 0.942 dan 0.058. Nilai frekuensi alel G berkisar antara 0.912-0.987, sedangan frekuensi alel T berkisar antara 0.013-0.088. Tingginya frekuensi alel G mengindikasikan bahwa sebagian besar individu sapi FH tidak mengalami mutasi pada posisi sekuen ke 2203 bp. Hal tersebut dibuktikan dengan tingginya alel G sebagai tipe alel liar (wild type) dan rendahnya alel T sebagai tipe alel mutan. Nei M. (1987) menyatakan bahwa penyebab mutasi gen dapat terjadi akibat adanya perubahan basa pada tingkat DNA (A=adenine, T=timin, G=guanine dan C=sitosin) baik dalam bentuk
14 subtitusi, delesi, insersi dan inversi pada saat replikasi dan adanya zat-zat yang bersifat mutagen. Penyebab lainnya dapat dipengaruhi oleh sumber pejantan Inseminasi Buatan (IB) yang digunakan. Sumber pejantan yang digunakan untuk IB, pada umumnya berasal dari BBIB Singosari dan BIB Lembang. Ke-dua Tabel 4 Frekuensi genotipe dan alel gen ACACA berdasarkan lokasi sapi FH Frekuensi Alel sapi Frekuensi Genotipe Lokasi (ekor) GG GT G T Balitnak BBPTU Baturraden BPPT-SP Cikole BBIB Singosari BIB Lembang Total
113 76 42 29 17 277
0.973 0.895 0.905 0.828 0.824 0.880
0.027 0.105 0.095 0.172 0.176 0.115
0.987 0.947 0.952 0.914 0.912 0.942
0.013 0.053 0.048 0.086 0.088 0.058
sumber IB tersebut tidak mewariskan genotipe TT. Hal tersebut kemungkinannya sapi pejantan untuk IB yang digunakan bergenotipe GG dikawinkan dengan sapi betina bergenotipe GT atau sebaliknya, pejantan bergenotipe GT dikawinkan dengan betina bergenotipe GG sehingga genotipe TT tidak ditemukan (Tabel 4). Meskipun demikian gen ACACA pada sapi FH bersifat beragam (polimorfik) kecuali pada sapi FH Balitnak yang memiliki frekuensi alel G dan T yaitu 0.987 dan 0.013. Hartl DL. (1987) menyatakan bahwa suatu alel bersifat polimorfik apabila salah satu frekuensi alelnya kurang dari 0.99 (>0.01). Keragaman gen ACACA telah dilaporkan pada beberapa spesies hewan yaitu pada sapi (Shin et al. 2011), kambing (Badaoui et al. 2007), tikus (Mao et al. 2001), babi (Gallardo et al. 2009) dan manusia (Abu-Elheiga et al. 1995). Heterozigositas FST dan PIC Gen ACACA Nilai heterozigositas gen ACACA sapi FH disajikan pada Tabel 5. Nilai heterozigositas pengamatan (Ho) gen ACACA pada sapi FH pengamatan memeiliki nilai antara 0.027-0.186, sedangkan nilai heterozigositas harapan (He) berada dalam kisaran antara 0.027-0.161. Secara umum nilai Ho lebih besar dari pada He di lima lokasi sapi FH. Hal tersebut mengindikasikan bahwa nilai heterozigositas gen ACACA pada sapi FH rendah. Nilai heterozigositas di bawah 0.5 (<50%) menunjukkan variasi suatu gen dalam suatu populasi bersifat renda (Hartl dan Clark 1997). Rendahnya nilai heterozigositas dapat diakibatkan karena adanya seleksi dan terjadinya perkawinan silang dalam (inbreeding) pada sapi FH. Pendugaan nilai inbreeding dapat diduga berdasarkan nilai FST (indeks derensiasi genetik). Nilai FST gen ACACA pada Tabel 5 termasuk dalam kelompok yang rendah (<0.5) dengan rataan yaitu 0.100. Wright (1987) menyatakan bahwa nilai FST kurang dari 0.5 termasuk kelompok rendah. Nilai FST yang rendah menunjukkan rendahnya tingkat inbreeding pada sapi FH di Balitnak dan BPPT-SP Cikole, sedangkan pada sapi FH BBPTU Baturraden, BBIB Singosari dan BIB Lembang memiliki nilai FST sedang (>5%). Inbreeding pada
15 suatu populasi bertujuan untuk meningkatkan derajat homozigositas dan menurunkan derajat heterozigositas (Noor RR 2010). Tabel 5 Analisis derajat heterozigositas, FST dan nilai PIC gen ACACA Heterozigositas sapi Lokasi FST (ekor) Ho He 0.013 113 0.027 0.026 Balitnak 0.053 76 0.105 0.100 BBPTU Baturraden 0.048 42 0.095 0.091 BPPT-SP Cikole 0.086 29 0.172 0.158 BBIB Singosari 0.088 17 0.186 0.161 BIB Lembang 0.100 277 0.115 0.107 Rataan FST PIC
PIC 0.026 0.095 0.087 0.145 0.148 0.058
: indeks diferensiasi genetik : polymorphic Informative Content
Bostein et al. (1980) menyatakan bahwa nilai PIC merupakan salah satu parameter yang menunjukkan tingkat informasi suatu penciri genetik pada ternak. Hasil nilai PIC gen ACACA yang diperoleh berada dalam kisaran antara 0.0260.148 (Tabel 5). Nilai PIC termasuk tinggi apabila nilainya PIC > 0.5, sedang bila nilai PIC > 0.25 dan rendah bila PIC < 0.25 (Xin-Sheng et al. 2008). Gen ACACA pada penelitian ini memiliki tingkat ke-informatifan sebesar 0.026-0.148 dalam mendeteksi keragaman populasi sapi FH. Berdasarkan parameter tersebut bahwa nilai PIC gen ACACA pada penelitian ini termasuk dalam kelompok yang rendah (PIC < 0.25). Hal ini mengindikasikan bahwa keragaman gen ACACA pada sapi FH kurang ideal untuk dijadikan sebagai marka pembantu dalam seleksi. Marka genetik yang diharapkan yaitu memilki nilai PIC yang tinggi (PIC > 0.5) untuk memberikan informasi suatu penciri genetik terhadap sifat-sifat ekonomis (Hildebrand et al. 1992). Asosiasi Gen ACACA dengan Asam Lemak Susu Hasil analisis setiap komponen asam lemak susu tertera pada Tabel 6. Asam lemak yang berhasil diidentifikasi sebanyak 24 jenis asam lemak susu yang terbagi dalam kelompok asam lemak jenuh (SFA) dan tak jenuh (unsaturated fatty acid/UFA = MUFA dan PUFA). Jenis SFA ditemukan 5 jenis rantai pendek yaitu propionat, butirat, kaproat, kaprilat dan nonanoat; 4 rantai sedang yaitu kaprat, laurat, tridekanoat dan miristat; dan 5 rantai panjang yaitu pentadecanoat, palmitat, stearat, arakidat dan behenat; untuk MUFA ditemukan 6 jenis asam lemak yaitu kaproleat, miristoleat, dodecanoat, hexadecenoat, Heptadecanoat, eicosanoat dan eurat; sedangkan untuk PUFA ditemukan 3 jenis asam lemak yaitu butanedioat, linoleat dan arakidonat. Kandungan total SFA, MUFA dan PUFA masing-masing berkisar antara 79.43-79.78%, 16.31-16.99% dan 3.12-3.57%. Pengaruh varian genotipe dari gen ACACA secara umum tidak berbeda nyata (P<0.05) terhadap komponen asam lemak susu baik SFA rantai pendek, rantai sedang dan rantai panjang maupun pada MUFA dan PUFA, kecuali pada asam lemak laurat (C12:0) dan dodecanoat (C12:1 n-3) atau lauroleat. Asam laurat termasuk jenis SFA, sedangkan dodecanoat termasuk dalam kelompok MUFA. Keragaman genotipe gen ACACA yang memiliki potensi berpengaruh terhadap
16 Tabel 6 Pengaruh keragaman gen ACACA terhadap asam lemak (%) susu sapi FH Asam Lemak Susu GG (n=36) GT (n=7) Probabilitas Ket. Asam Lemak Jenuh (SFA) a. Rantai pendek (C3-C9) Propionat (C3:0) 1.14±0.20 0.82±0.41 0.4864 ns Butirat (C4:0) 0.45±0.06 0.59±0.12 0.3131 ns Kaproat (C6:0) 1.61±0.08 1.51±0.15 0.5690 ns Kaprilat (C8:0) 2.29±0.17 2.14±0.35 0.6963 ns Nonanoat (C9:0) 0.18±0.06 0.44±0.12 0.0683 ns Sub Total 5.67 5.50 b. Rantai sedang (C10-C14) Kaprat (C10:0) 1.65±0.07 1.53±0.37 0.4713 ns Laurat (C12:0) 5.99±0.09a 5.55±0.18b 0.0459 s Tridecanoat (C13:0) 0.42±0.04 0.35±0.07 0.3806 ns Miristat (C14:0) 24.75±0.28 25.24±0.56 0.4335 ns Sub Total 32.81 32.67 c. Rantai panjang (C14-C22) Pentadecanoat (C15:0) 4.68±0.08 4.82±0.16 0.4411 ns Palmitat (C16:0) 32.87±0.29 32.78±0.59 0.9276 ns Stearat (C18:0) 1.11±0.06 1.06±0.12 0.7456 ns Arakidat (C20:0) 1.61±0.05 1.61±0.10 0.9993 ns Behenat (C22:0) 1.03±0.04 0.96±0.08 0.4996 ns Sub Total 41.30 41.26 Total SFA 79.78 79.43 Asam Lemak Tak Jenuh (UFA) a. MUFA (C14:1) – (C22:1) Kaproleat (C10:1) 0.16±0.0 0.13±0.02 0.2717 ns Miristoleat (C14:1) 3.44±0.04 3.53±0.80 0.3492 ns Hexadecenoat (C16:1) 7.54±0.27 7.83±0.55 0.6418 ns Heptadecanoat (C17:1) 1.67±0.07 1.56±0.14 0.4869 ns Eicosanoic (C20:1) 2.95±0.07 3.23±0.15 0.0910 ns Dodecanoat (C12:1 n-3) 0.14±0.06a 0.29±0.06b 0.0399 s Eurat (C22:1) 0.41±0.04 0.42±0.07 0.9591 ns Sub Total 16.31 16.99 b. PUFA (C4:2) – (C22:4) Butanedioat (C4:4) 1.13±0.09 0.77±0.17 0.0736 ns Linoleat (C18:2 n-6) 1.28±0.05 1.21±0.09 0.5290 ns Arakidonat (C20:4 n-3) 1.16±0.02 1.14±0.03 0.6268 ns Sub Total 3.57 3.12 Total UFA 19.88 20.11 Superskrip a&b yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan berbeda nyata pada taraf uji 5% (uji Duncan). s=signifikan; ns=non-signifikan
asam lemak susu yaitu pada nonanoat (C9:0) dari kelompok SFA; eicosanoat (C20:0) dari kelompok MUFA; dan butanedioat (C4:4) dari kelompok PUFA. Genotipe GG memiliki kandungan asam laurat lebih tinggi dibandingkan dengan
17 genotipe GT masing-masing 5.99±0.09 % dan 5.55±0.18 %. Demikian pula pada kelompok SFA lainnya yang secara umum genotipe GG memiliki pengaruh lebih tinggi. Hal ini berbeda dengan kelompok MUFA khususnya dodecanoat (C12:1 n3) bahwa genotipe GT memiliki kandungan lebih tinggi dibanding genotipe GG, yaitu 0.29±0.06 % dan 0.14±0.06 %. Hal yang sama terjadi pada kandungan MUFA lainnya, dimana genotipe GT cendrung memiliki pengaruh lebih baik dibandingkan genotipe GG. Asam lemak kelompok PUFA bahwa genotipe GT juga memiliki kecendrungan lebih baik dibandingkan dengan genotipe GG. Hal tersebut terjadi hanya pada asam lemak butanedioat (C4:4), sebaliknya pada asam lemak PUFA lainnya. Hasil analisis asam lemak pada penelitian ini telah sesuai dengan Zhang et al. (2009) bahwa genotipe GG memiliki pengaruh lebih kuat dibandingkan dengan genotipe GT terhadap total SFA, dan kondisi sebaliknya pada MUFA dan PUFA. Kandungan asam lemak tentunya sangat besar dipengaruhi oleh faktor lingkungan baik nutrisi dan sistem pemeliharaan ternak sapi (Butler et al. 2008). Pakan yang dikonsumsi oleh ternak disintesis menjadi asam lemak SFA, MUFA dan PUFA. Kandungan asam lemak yang dihasilkan dipengaruhi oleh aktivitas gen yang mengontrol dalam pembentukan asam lemak susu (Sutton 1989; Salman dan Djaja 2012). Ternak khususnya sapi, tidak dapat mensintesis asam lemak linoleat (C18:2) dan linolenat (C18:3 n3), dan jenis asam lemak PUFA lainnya. Asam lemak PUFA dihasilkan oleh pakan yang dikonsumsinya. Malonyl-CoA merupakan produk dari ACACA yang menjadi substrat intermediasi untuk sintesis asam lemak (FASN). Tinggi rendahnya malonyl-CoA sangat ditentukan oleh ACACA. Tingginya produk malonyl-CoA dari ACACA akan mempengaruhi tingginya produk asam lemak (SFA, MUFA dan PUFA) yang dihasilkan. (Zhang et al. 2009). Sintesis SFA oleh FASN kemudian mengalami perpanjangan atau desaturasi di dalam mikrosom jaringan adipose untuk memproduksi beberapa MUFA seperti C14:1, C16:1 dan C18:1 (St John et at. 1991 dalam Zhang et al. 2009). Kandungan SFA sapi FH pengamatan yang paling tinggi yaitu miristat (C14:0), pentadecanoat (C15:0) dan palmitat (C16:0), diikuti oleh MUFA (miristoleat) dan PUFA (linoleat) (Tabel 6). Hasil analisis ini sesuai dengan Bukcle et al. (1985) yang menyatakan bahwa jenis asam lemak susu yang paling banyak ditemukan adalah miristat (C14:0), palmitat (C16:0), stearat (C18:0), sedangkan asam lemak tak jenuh yang utama adalah oleat (C18:1), linoleat (C18:2) dan linolenat (C18:3). Total asam lemak susu (3.5-5%) disusun oleh partikelpartikel kecil seperti fosfolipid sekitar 0,5-1% dan sterol hanya 0.2-0.5%, dimana keberadaan mereka berada dalam bentuk triasilgliserida (Jensen et al. 1991). Karakteristik variasi gen ACACA terhadap kandungan asam lemak susu pada sapi FH lokal berpeluang menjadi marka genetik dalam seleksi di masa yang akan dating. Sapi FH bergenotipe GG sebagai marka genetik untuk meningkatkan kualitas SFA khususnya asam lemak laurat (C12:0), sedangkan genotipe GT sebagai marka genetik untuk meningkatkan kualitas MUFA khususnya dodecanoat (C12:1 n-3). Meskipun demikian, penelitian lebih lanjut dibutuhkan untuk mengevaluasi kemungkinan hubungan antara SNP gen ACACA dengan sifat asam lemak susu, sebagai salah satu upaya untuk meningkatkan kualitas asam lemak susu yang baik pada sapi FH domestik.
18
5 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Gen ACACA pada sapi FH pengamatan bersifat polimorfik yaitu ditemukan dua genotipe GG dan GT. Varian genotipe gen ACACA berpengaruh nyata terhadap asam lemak laurat dan dodecanoat. Dengan demikian, varian genotipe gen ACACA berpeluang untuk menjadi marka genetik untuk asam lemak susu. Genotipe GG untuk asam lemak laurat (C12:0) dan genotipe GT untuk asam lemak dodecanoat (C12:1 n-3). Saran Hasil amplifikasi gen ACACA dengan metode real-time PCR yang didapatkan masih harus diungkap lebih jauh lagi dengan sampel yang lebih banyak dan primer-probe gen ACACA pada situs yang berbeda, sehingga keragaman gen ACACA dapat menjadi bukti kuat sebagai marka genetik pada sapi perah untuk asam lemak susu.
DAFTAR PUSTAKA Abu-Elheiga L, Jayakumar A, Baldini A, Chirala SS, Wakil SJ. 1995. Human acetyl-CoA carboxylase: characterization, molecular cloning, and evidence for two isoforms. Proceed of the National Academy of Sci. 92:4011-5. Arya M, Shergill IS, Williamson M, Gommersall L, Arya N, Patel HR. 2005. Basic principles of real-time quantitative PCR. Expert Rev Mol Diagn.5(2) 1473-7159. Awan MM, Saggerson ED. 1993. Malonyl-CoA metabolism in cardiac myocytes and its relevance to the control of fatty acid oxidation. J Biochem. 295:616. Badaoui B, Serradilla J, Tomas A, Urrutia B, Ares J, Carrizosa J, Sanchez A, Jordana J, Amills M. 2007. Goat acetyl-coenzyme A carboxylase α: molecular characterization, polymorphism, and association with milk traits. J Dairy Sci.90:1039-43. Barber M, Vallance A, Kennedy H, Travers M. 2003. Induction of transcripts derived from promoter III of the acetyl-CoA carboxylase-α gene in mammary gland is associated with recruitment of SREBP-1 to a region of the proximal promoter defined by a DNase I hypersensitive site. J Biochem. 375:489-501. Bionaz M, Loor JJ. 2008. Gene networks driving bovine milk fat synthesis during the lactation cycle. BMC Genomics.9:366. Botstein D, White RL, Skolnick M, Davis RW. 1980. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am J Hum Genet.32, 314-31. Bouwman AC, Bovenhuis H, Visker MH, van Arendonk JA. 2011 Genome-wide association of milk fatty acids in Dutch dairy cattle. BMC Genet.12, 43.
19 Bukcle K, Edwards R, Fleet G, Woothon M. 2009. Ilmu Pangan. Terjemahan Hari Purnomo dan Agiono. Jakarta (ID). UI Press. Bustin SA. 2004. AZ of quantitative PCR. International University Line La Jolla, CA, (US) USA. IUL Press. Butler G, Nielsen JH, Slots T, Seal C, Eyre M D, Sanderson R, Leifert a.C. 2008. Fatty acid and fat-soluble antioxidant concentrations in milk from high and low-input conventional and organic systems: seasonal variation. J of the Sci of Food and Agr. 1431–41. Cheng J, Zhang Y, Li Q. 2004. Real-time PCR genotyping using displacing probes. Nucleic acids research. 32, 61. Cole J, Null D, VanRaden P. 2009. Best prediction of yields for long lactations. J Dairy Sci. 92, 1796-810. Connor WE. 2000. Importance of n− 3 fatty acids in health and disease. The American J of clin nutr. 71:171S-5S. Didenko VV. 2001. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): Designs and applications. Biotec. 31:1106-21. Ellis KA, Innocent G, Grove-White D, Cripps P, McLean WG, Howard CV, Mihm M. 2006. Comparing the Fatty Acid Composition of Organic and Conventional Milk. J Dairy Sci. 89:1938-50. Feskanich D, Willett WC, Stampfer MJ, Colditz G.A. 1997. Milk, dietary calcium, and bone fractures in women: a 12-year prospective study. American J of Public Health. 87, 992-7. Fraga D, Meulia T, Fenster S. 2008. Real‐Time PCR. Current Protocols Essential Laboratory Techniques. 10.3. 1-3. 40. Gallardo D, Quintanilla R, Varona L, Díaz I. Ramirez O, Pena R, Amills M. 2009. Polymorphism of the pig acetyl‐coenzyme A carboxylase α gene is associated with fatty acid composition in a Duroc commercial line. Anim Genet. 40:410-7. Gresti J, Bugaut M, Maniongui C, Bezard J. 1993. Composition of Molecular Species of Triacylglycerols in Bovine Milk Fat. J Dairy Sci.76:1850-69. Hartl DL. 1987. A primer of population genetics. Sinauer Associates, Inc. Hartl DL, Clark AG. 199. Principles of population genetics. Sinauer associates Sunderland. Henning DR, Baer RJ, Hassan AN, Dave R. 2006. Major advances in concentrated and dry milk products, cheese, and milk fat-based spreads. J Dairy Sci.89:1179-88. Hildebrand C, Torney D, Wagner R. 1992. Informativeness of polymorphic DNA markers. Los Alamos Sci.20, 100-2. Huth PJ, Park KM. 2012. Influence of dairy product and milk fat consumption on cardiovascular disease risk: a review of the evidence. Advances in Nutrition: An Intern Rev J. 3:266-85. Jensen RG,Ferris AM, Lammi-Keefe CJ. 1991. The Composition of milk fat. J Dairy Sci.74:3228-43. Kelly ML, Kolver ES, Bauman DE, Van Amburgh ME, Muller LD. 1998. Effect of intake of pasture on concentrations of conjugated linoleic acid in milk of lactating cows. J Dairy Sci.81:1630-6. Kennelly JJ. 1996. The fatty acid composition of milk fat as influenced by feeding oilseeds. Ani Feed Sci and Tech.60:137-52.
20 Kim KH. 1997. Regulation of mammalian acetyl-coenzyme A carboxylase. Ann revof nutr.17:77-99. Mackay IM, Arden KE, Nitsche A. 2002. Real-time PCR in virology. Nucleic acids research.30:1292-305. Mao J, Marcos S, Davis S, Burzlaff J, Seyfert H. 2001. Genomic distribution of three promoters of the bovine gene encoding acetyl-CoA carboxylase α and evidence that the nutritionally regulated promoter I contains a repressive element different from that in rat. J Biochem. 358:127-35. Marchitelli C, Contarini G, De Matteis G, Crisà A, Pariset L, Scatà MC, Catillo G, Napolitano F, Moioli B. 2013. Milk fatty acid variability: effect of some candidate genes involved in lipid synthesis. J of Dairy Research. 80:16573. Morita A, Nakayama T, Doba N, Hinohara S, Mizutani T, Soma M. 2007. Genotyping of triallelic SNPs using TaqMan® PCR. Molecular and Cellular Probes. 21:171-6. Muladno. 2002. Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor (ID): IPB Press Navarro E, Serrano-Heras G, Castaño M, Solera J. 2015. Real-time PCR detection chemistry. Clinica Chimica Acta. 439:231-50. Nei M. 1987. Molecular Evolutionary Genetics. (CU) Columbia university press. Noor RR. 2010. Genetika ternak. Cet. VI. Jakarta (ID). Penebar Swadaya. Park H, Kaushik VK, Constant S, Prentki M, Przybytkowski E, Ruderman NB, Saha AK. 2002. Coordinate regulation of malonyl-CoA decarboxylase, snglycerol-3-phosphate acyltransferase, and acetyl-CoA carboxylase by AMP-activated protein kinase in rat tissues in response to exercise. J of Bio Chem.277, 32571-7. Poon LL, Chan K, Smith G, Leung C, Guan Y, Yuen K, Peiris J. 2009. Molecular detection of a novel human influenza (H1N1) of pandemic potential by conventional and real-time quantitative RT-PCR assays. Clinical Chem.55:1555-8. Ranade K, Chang MS, Ting CT, Pei D, Hsiao CF, Olivier M, Pesich R, Hebert J, Chen YDI, Dzau VJ. 2001. High-throughput genotyping with single nucleotide polymorphisms. Genome Research.11:1262-8. Salman LB, Djaja W. 2012. Analysis on holstein cow milk production maintainned by large scale dairy farm on middle plain in west java. Lucrări Ştiinţifice-Universitatea de Ş tiinţ e Agricole ş i Medicină Veterinară , Seria Zootehnie.58:73-7. Sartika RAD. 2008. Pengaruh asam lemak jenuh, tidak jenuh dan asam lemak trans terhadap kesehatan. Kesmas J Kes Masy Nasional.2. Shen GQ, Abdullah KG, Wang QK. 2009. The TaqMan method for SNP genotyping. In: Single Nucleotide Polymorphisms. Springer. 293-306. Shin SC, Heo Jp, Chung ER. 2011. Effect of single nucleotide polymorphisms of acetyl-coa carboxylase α (ACACA) gene on carcass traits in Hanwoo (Korean Cattle). Asian-Australasian J of Anim Sci. 24:744-51. Sul HS, Latasa MJ, Moon Y, Kim KH. 2000. Regulation of the fatty acid synthase promoter by insulin. The J of nutrition. 130: 315S-20S. Sutton JD. 1989. Altering Milk Composition by Feeding. J Dairy Sci.72: 2801-14.
21 Thering B, Graugnard D, Piantoni P, Loor J. 2009. Adipose tissue lipogenic gene networks due to lipid feeding and milk fat depression in lactating cows. J Dairy Sci.92:4290-300. Ulbricht TLV, Southgate DAT. 1991. Coronary heart disease: seven dietary factors. The Lancet. 338, 985-92. Veerkamp R. 1998. Selection for economic efficiency of dairy cattle using information on live weight and feed intake: a review. J Dairy Sci. 81: 1109-19. Webb BH, Johnson AH. 1965. Fundamentals of dairy chemistry. Avi Publishing Co Inc. Wilhelm J, Hahn M, Pingoud A. 2000. Influence of DNA target melting behavior on real-time PCR quantification. Clinical Chem.46:1738-43. Wright S. 1978. Variability Within and Among Natural Population. Chicago (US): Uni of Chicago Press. Xin-Sheng W, Tian-Wen W, Hui-Ling Z, Guang-Long CXQ, Jin-Hua C, Xiu-Bai Z, Guo-Hong C. 2008. Correlation analysis of wool yield in wan line angora rabbits using microsatellite DNA markers. J of Biological Sci. 8: 679-82. Zhang S, Knight T, Reecy J, Wheeler T, Shackelford S, Cundiff L, Beitz D. 2009. Associations of polymorphisms in the promoter I of bovine acetyl‐CoA carboxylase‐α gene with beef fatty acid composition. Anim Genet. 41:41720.
22 Lampiran 1 Sekuen Gen ACACA No. Akeses Gene Bank AJ276223 LOCUS AJ276223 6203 bp DNA linear MAM 13-JUN-2002 DEFINITION Bos taurus gene for acetyl-CoA-carboxylase alpha, 5' region. ACCESSION AJ276223 VERSION AJ276223.1 GI:11064514 KEYWORDS acetyl-CoA-carboxylase alpha; promoter. SOURCE Bos taurus (cattle) ORGANISM Bos taurus Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi; Mammalia; Eutheria; Laurasiatheria; Cetartiodactyla; Ruminantia; Pecora; Bovidae; Bovinae; Bos. REFERENCE 1 AUTHORS Mao,J., Marcos,S., Davis,S.K., Burzlaff,J. and Seyfert,H.M. TITLE Genomic distribution of three promoters of the bovine gene encoding acetyl-CoA carboxylase alpha and evidence that the nutritionally regulated promoter I contains a repressive element different from that in rat JOURNAL Biochem. J. 358 (PT 1), 127-135 (2001) PUBMED 11485560 REFERENCE 2 (bases 1 to 6203) AUTHORS Seyfert,H.M. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (24-JUL-2000) Seyfert H.M., Molecular Biology, Research Institute for the Biology of Farm Animals, Wilhelm-Stahl-Allee 2, Dummerstorf, 18196, GERMANY FEATURES Location/Qualifiers source 1..6203 /organism="Bos taurus" /mol_type="genomic DNA" /db_xref="taxon:9913" mobile_element 467..580 /mobile_element_type="transposon:retroposon" mobile_element 1305..1840 /mobile_element_type="transposon:retroposon Art2" 5'UTR 2602..2917 /note="acetyl-CoA-carboxylase alpha" mobile_element 2984..3229 /mobile_element_type="transposon:retroposon" ORIGIN
23 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481
gatcccacat agccagggag gagcccatga agaaaagcaa agactgaagg taaaggctct tagtaggggc cgtaagagat ccctctccag ccctggggtc ttctccaacc ttagaaaagg caagagagtt gtgtggatca tctgcctctt caacagactg tatttaactt gaatcaagat tggcagaaag aagttggctt catggcaaat aaatccctgc aagttatgac tctgtctagt tgaagaaagc tgcgagtccc ggtgttcatt gaagagttga gaggacgaca gtgaactccg caaagagtcg tacatatgta ctaaacatgt ctgaagagac gcaggagagt cccaagaaca aaaatttctc gatactgggg acaggtttga cccttgtgct gaaaagatac ataggacagc aaatgccttg actctgtctt gccttctgcg acaaacctgc ttttttctct gtctgtccat cggacaagca agtcagtgaa cccactccag ccatggggtc tgcattggag gggggagcct acttagcagc cttttaagac aggccagtaa ggtaatcagt agactacaga
gtggcagaca ccacaactac tcctcaacaa caaagaccca ggtgaaaaga tcaaaaatta ttcccaggtg acaggttcaa tattcttgcc acagagaatt caggcttcag cagaggaacc ccagaaaaac caataaagtg gagaaacctg gttccaaata atatacagag tgccaggaga tgaagaggaa aaagctcaac agatggggaa agatggtgat caacctagat caaggctatg tgagtgccga ttgaactgca ggaaggactg ctcattggaa gaggatgaga ggagttggtg gacacgactg atagtagtgg agcaggagaa agtaaggcag gaggtgggaa ggcaagactt caggtattta acttccctgg atgattcctg acaactagag tggaggtgtc taggccttgg tgaaaactca tcttgttgtg gacagtttct acggctgact tatcttacga ctgtgaagta gacgttggaa gcccgtacga tactcttgcc gctaagagtc aaggaaatgg ggtgggctgc agcagcagca aattaaaatc atgctgaatc aggagctgga aaaattcaga
accaggccca tgagcccatg gagaagccat gcacatccaa atgaaaggaa ctggtgttgt gtgctagtgg tccctgagtc tagagaatcc ggacatgact caatacgtga agagatcaaa atctatttct tggagaattc tatgcaggtc ggaaaaggag tacatcctga aatatcagta ctaaaaagcc attcagaaaa acagtggaaa tgcagccatg agtgtattca gtttttccag agaattgatg aggagatcca atgctgaggc aagactctga tggctggatg atggacaggg agcgactgaa tgggaagtga agctaagtca gaacagggag atgtgaaggt aaacatgtta gtaatgaagt tggtccagtg gtcagggaac aaagcccaca atgcaagagg cagtgtctgc agtgtccacg taatcttgcc gaccttttgg ggagttgaag ctagagcctc tccttctgga gcagagaggt atatctctac tggaaaatcc ggacacgact caacccactc ggtctctggg gctattgagg agctagagag atgtggtggt gacataaaag aaattaggaa
gatgccacaa tgccgcaact agcaacagga aaataaataa gttgagtgat attttattac ttaagaaccc gggaagatcc catggacaga gaggcgactt accgtgaact ttgccaacgt gctttattga tgaaagagat aggaagcaac tatgtcaagg gaaacgctgg acctcagata tcttgatgaa cgaatatcat cagtgtcaga aaattaaaag aaagcagaga tggtcatgta cttttgaact accagtccat tgaaactcca tgctgggagg gcatcaccga aggcctggcg ccgaactgaa gggtatttat gactcaggag taagctctct ccaaagctga gcctccctgc gtataggact gttcagaatc taggattcca cgctgcaagg cagccaagtt aattggataa tgaaaacatt tttcatcacc tgtgaagttc aacacagtgt tgttctggtc ggtttttgcc ctctgaggta ctagctattg catggacgga gagcgacttc cagtgttcct ggttgcacag gctgtaccaa ctggaaccaa gaccagattg aggtcttctt agaggcagga
ctactgagcc actgaagccc agatcgcgca aattttaaaa ggttcagttt ttattgtgtt gcacacacca cttggaggag ggagcctggc agtaaactaa tccagatgtc ctgctggatc ctatgccaaa gggaatacca agttagaact ttgtatattg gctggaagaa tgcagatgac agtgaaagag ggcatctggt ctttattttt acagttactc cattactttg tgggtgtgag gtggtgttgg cctacaggag gtactttggc gattgggggc cttgatgcac tgctgtgatt ctgaggcaac ttgggataga agatggagat aggaaggctc tcactgtgaa cttcagataa tagaaagggc tgccttctaa tatgctccgg aagacgcagc ttggtgactg taaggaggga gtgtggagcc aggaccagac cctcaggctc tctgatcagg aaggcaatga tcccatacgc cagagccagc aggggagaag ggagcctggt actttcactt gcctggagaa agtcggacac agtgtaagaa catacccaca ctagtagaat tgagaaaatg caagtttgcc
tgtgttctag gaacgcccta ccacagctag attattttaa tccttgaaag tcatagataa atgcaggaga ggcatggcaa aggttacagt tggctcaaag caagctggtt atagaaaaag gactttgact gaccacctga ggacatggaa tcaccctgct gcacaagctg accagcctta gagaatgaaa cccatcactt tggggctcca cttggaagga ccaacaaagg agttggactg agaagactct accagtcctg cacctcatgc aggaggaaaa atgagtttgg catggggttg ttagtatgca caggtgaggt gctggagaag tcctggggtt atgtgagaat aggtccactt ttaaaaaaat tgcgggggac gactactaaa agagccaaaa ccaattatag ggagaatctg tctgtggcga ttaaaaagct ttaatcctgg tcttcttgtc ctttcttgaa gacctgaaga atttattttc gcagtggcac gggctgcagt atcactttca tcccagggac aactgaagcg atgctctctg aaaaattttt tcaaaggaag ggactcccac agcataagca
24 3541 3601 3661 3721 3781 3841 3901 3961 4021 4081 4141 4201 4261 4321 4381 4441 4501 4561 4621 4681 4741 4801 4861 4921 4981 5041 5101 5161 5221 5281 5341 5401 5461 5521 5581 5641 5701 5761 5821 5881 5941 6001 6061 6121 6181
aaagtaaaga gggccagtgg agtcgtgtcc gggatttccc atttggaatc ttttaaaata gttgctcctc ctcattgcgg gcacgtggga tcttaactga ttcccacctt tgtaggacat atcctaaact gaagtaaggc agtggaacat tgcactggac ctcttttttg acactctgtt gtatgccctc ggaatgctca catttggtat actgggtgac gattaaaatg catcttctcc ggtctcccct gaattagggc ccaactaata tcagtctgtt taactctcct tgctcaagag ccggagttga aactgttact ctcatccttc tacaaagctc ctgaaggttc ggctgataaa tagatgaaaa tcataggaag cttgtaaaca tgacaggtgc acaatttcct tggagaagtc agccttccta ctaccctgtt tgtaccactc
taagcatggc gaaataacat gactcttatg agtcaagaat gtggccagac ataaatattt gtgggctttc tggggcttgt tcttcctgga tggaccaccg ggttcagctt gttgttcttc attgttcttt tggtaatctg atttttgaga agtcacacat tacagctctt ttggtgttta aggcttttct ggggaaaatc ttggaaactt ttaaacaata tcagcagagt agcaaaacag cattgtgtgt ccacctaatg ttctgaggtc acagccatta ccaccacttc cctatagtgg aatccaggtg tgagaaatta attttctttc agttacttca acataaggac cagcaacatc tagacaatac agacaaagtt gagaggcctt atttaatgac cctgaatgtg accacctaaa tccctgcttc cattctttgc ttggtacaag
aggagctgga cgtattatat cgacgccatg actgtcctaa agccaccagg tctatttgtt tctagttgca gggctcagta ccaaggactg gggaagtcct tggcctgacc attggagaca aactccaggg tatttttaac aagactactg actgcttatg ctagaactta gttttgtctt tatttccccc cctgatacct gtattcgttt gaagtttatt tggtttcctc ccacatctgg ctgtgtccta acttcatttc ctgagggttg tggcacctag ttacagacat agatgggcag aactgtctta gattactata attgtagctc aatgttcaat agtttctgag actaagaaag ctcagatttt cctctttcca gctcagttgt agttattgtg tttctagtct ggtatgatga tgcttccctc cccctggctc ctt //
agccagatta cccctgtatt gactgcagcc aggtctatca agagggtgct tatttttatt gtgagcgggg gttgtggtgc aacctgcatc atgggtccat tgccagactt ctgacagcaa tgaataatta aagcaccgac caaactgacg tatttctgga catggttatc cccaactaga atagtagggt taatctaacc ttttagggct tcttcacagt ttaggcttct taaaggcttc atctcttcct agttcagttt agactttgac aaatgtgcca aagcttgtgt gttgtggcat aagacacagc tcctttgtaa attcattagg gacgtcaaaa cacaaccccc aatctattaa agtctttgta tgcttttttt ctttatattc aaacttgggt ctattctatt gggcttctag caagaacttc aggacttctt
gtgtaagtgt gtgctgttgt tgccaggctc ctgactctgc ctttgagggt tttggctgtg agctactctt atgggcttag ccctgcactg tttctattca ttctgtctag agagggaaaa ctgcttaaaa tgattctgtt ttgacaatga cttagttttg aattaaagag ttgggatatc aacagaccat ttctttaaaa gccatgatgg tctaggggcg ctttttggct atcaattgtg ataaggtccc cctctttaaa atataaattt ctctaagctc ggcaagtacc gcaccaaaca tttctgccca acagtcttgg tctctccttg gcaagacatg tggttctgca gtagtaggaa agtcgctcct ttcccaatca tgattctctc gactgctcta caaataggtt aatactcttc tgacctcagg cccaccaaac
tctgtattgg ttagttgcta ctctgtccat catttaagga ccatttactt ctgggtctca ccatgggctt ttgccctgca gcaggcagat ggcacattct tttgtgcagg ataatgataa aaaagagtct tcaggtggtc agtgccaaaa agaatttatc caagatctag ttaaagatag ctttaaggct acctggaagc agtatcacag gtaagtctaa cgtagttgac attcacagat cggtcatttg gagccaatct agatcacagt tccaccctct tatggaacag aaacaagaat ttcttggtcc tgtaccttaa gctagtactt taagggcttg gtattactaa ctaggaaagg tcatgcagct agtcaaacgt tttgttcaat tgtaaagttc ggtaaactct cctgttgacc ttgtgtattt tgtcattctc
25 Riwayat Hidup Penulis dilahirkan di Dusun Perrengan, Desa Lantek Timur Galis, Kabupaten Bangkalan Madura pada tanggal 5 September 1987, sebagai anak kedua dari empat bersaudara (Ahmad Syafi’i, Siti Maisarotus Syafila dan Sumiati Alya Jazila) dari pasangan ayahanda Nahrawi dan ibunda Sudiah. Penulis menikah dengan seorang wanita sholihah bernama Uswatun Chasanah dan dianugerahi anak Muhammad Hafidz Aufaa Rosyidi. Gelar (sarjana) pertama penulis didapatkan dari Fakultas Peternakan Universitas Brawijaya Malang, Jurusan Ilmu dan Teknologi produksi Ternak pada Tahun 2012. Pada tahun yang sama penulis diterima menjadi Supervisor di PT Charoen Pokphan Indonesia dan mengundurkan diri pada Tahun 2013. Penulis memperoleh kesempatan untuk melanjutkan studi di Pascasarjana Institut Pertanian Bogor (IPB) Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan pada tahun 2013 dan menamatkannya pada tahun 2015. Beasiswa pendidikan Pascasarjana diperoleh dari Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi (DIKTI) melalui program Beasiswa Unggulan Dalam Negeri (BU-DN), Kementrian Pertanian. Selama kuliah, penulis juga mendirikan organisasi FORSIM (Forum Studi Intelektual Muslim) bersama teman-teman Muslim Pascasarjana dengan harapan dapat membuka wacana intelektualitas Mahasiswa Pascasarjana terhadap persoalan Negeri Tercinta. Kegiatan FORSIM bekerjasama dengan Hizbut Tahrir Indonesia, dalam mengadakan Seminar Nasional antara lain Mengurai Problematika Rantai Pasok Pangan Nasional dan Indonesia Sebagai Poros Maritim Dunia: Sebuah Telaah Syariah-Ilmiah.
