GEBRUIK VAN FINCH V2.20
1
PROCEDURE
1.1
Software
Voor de organisatie van de aanvragen en de sequenerings data wordt gebruik gemaakt van Finch Geospiza). Deze software is van overal via het internet bereikbaar en bevat gebruikerscontrole zodat alle aanvragen en resultaten beschermd blijven. Alle data kunnen binnen Finch op drie verschillende niveaus georganiseerd worden: Labgroup > Project > Folder (cfr. mappen en submappen). De toegangsrechten worden geregeld op het niveau van de labgroup die enkel door GSU-administrators aangemaakt kan worden. Elke labgroup kan meerdere projecten bevatten die op hun beurt weer verschillende folders bevatten. Folders kunnen door iedereen worden bijgemaakt en laten toe om je resultaten op een logische en beheersbare manier te ordenen. Ter voorbeeld: binnen het CMGG worden labgroupen, projecten en folders gebruikt voor respectievelijk: aandoeningen, genen en screeningsreeksen. Alle sequenties moeten toegewezen worden aan een specifieke folder. Voor de analyse van sequenties kan gebruik gemaakt worden van SequenceScanner dat gratis van Applied Biosystems (link=www.appliedbiosystems.com)verkregen kan worden, daarnaast kan binnen de GSU ook gebruik gemaakt worden van de SeqScape-software die eenvoudige vergelijkingen met een referentiesequentie toelaat. Bij grote sequeneringsprojecten kan de Finch-software gebruikt worden voor het creëren van assemblies.
1.2 1.2.1
Aanvraagprocedure Eerste aanvraag
Voor de eerste aanvraag dien je contact op te nemen met de GSU om je Finch-account in orde te brengen. Hiervoor hebben we de volgende informatie nodig: • Gebruikersnaam (zoals bij UGent) • Voornaam • Achternaam • Instituut / vakgroep / dienst • Telefoonnummer • E-mail • 1 of meerdere labgroupen(Extern’dienst’ of Disease’ziektebeeld’ of Research’naampersoon’ of Research ‘ziektebeeld’) • 1 of meerdere projecten (het te analyseren gen als afkorting)+ informatie over de labgroup waar ze deel van uitmaken. Stuur deze informatie bij voorkeur via e-mail naar de GSU (
[email protected]) zodat we je account kunnen instellen en je eerste labgroup en project aan kunnen maken. Je wachtwoord wordt initieel gelijkgesteld aan je gebruikersnaam. We raden nieuwe gebruikers aan om contact op te nemen met een persoon van de GSU (tel: 09/332 46 71) om samen de eerste ingave van de te sequeneren stalen uit te voeren om tot een succesvolle ingave te komen. 1.2.2
Ingeven van een aanvraag
Requests dienen ingegeven te worden via de Finch-software die met een internet browser geopend kan worden op https://medgenpr.ugent.be/Finch/ . Gebruik je gebruikersnaam en wachtwoord om in te loggen op het systeem (zie eerste aanvraag). De link is ook terug te vinden op de website van het CMGG onder “faciliteiten”.
1.2.2.1 Verandering paswoord Indien je reeds een login hebt maar je paswoord wenst aan te passen kan je dit als volgt doen: 1. inloggen 2. ga naar Home > Admin > Users 3. klik op je username 4. klik op het potloodje rechts bovenaan (=edit) 5. verander je paswoord, bevestig en “save changes” onderaan
1.2.2.2 Aanmaak nieuwe request Vooraleer een nieuwe request aan te maken kan je best nagaan of de vereiste folder reeds aanwezig is (Home > Folders). Indien dit niet het geval is kan je er als volgt een aanmaken: 1. ga naar Home > Admin > Folders > Add Folder
2. benoem de folder (in Folder label) met een eenduidige naamgeving zoals in: FBN1g_reeks3 en COL1A1c_reeks29 3. duid in 'Project' aan waarin folder moet terecht komen. 4. druk op 'Add'
1
2 3
Een nieuwe aanvraag kan in Finch worden ingegeven door New request in het onderdeel Sequencing te selecteren. Ga verder als volgt te werk:
1. Vul Request information in a. Request label: hoeft niet gewijzigd te worden b. DNA-type: selecteer hier 'PCR' of ‘Plasmide’ afhankelijk van het te sequeneren materiaal c. Service: maak een keuze uit de volgende mogelijkheden: • just run (opgezuiverde sequenties worden uitgelezen op een sequencer) • sequencing clean-up and run (Agencourt-opzuivering van afgegeven seq-reactie + run) • unidirectional (PCR-product/plasmide wordt gesequeneerd met forward OF reverse primer) • bidirectional (PCR-product/plasmide wordt gesequeneerd met forward EN reverse primer) d. SAP order no.: Externe klanten vermelden het bestelbonnummer dat bij deze aanvraag hoort (zie document: Bestelbon opmaken) e. Priority: de prioriteit dient meestal niet gewijzigd te worden. Enkel voor zeer dringende analyses zoals prenatale testen kan de prioriteit verhoogd worden naar 'Prenatal'.
2. Klik op 'Plate request'. Ook als je je stalen in strips afgeeft mag je geen gebruik maken van 'Tube request'.
3. Selecteer individuele wells of volledige kolommen. De geselecteerde wells worden blauw gemarkeerd. Stalen volgen elkaar in KOLOMMEN op, vertrekkend van well A1. 4. Vul voor elke well template en primer in, en selecteer de folder waarin de resultaten terecht moeten komen. 5. Standaard wordt gebruik gemaakt van de 'DyeTerminator' chemistry (1 uur sequeneren). Indien echt vereist kan ook gekozen worden voor 'DyeTerminatorLong' (2 uur sequeneren). Bij Dye Terminator Long wordt de sequentie langer gelezen. 6. Druk op 'Set selected' om deze gegevens toe te passen op de geselecteerde wells. 7. Met behulp van 'View all' kan een overzicht van alle ingevulde wells opgevraagd worden 8. Indien alles naar wens is ingesteld druk je op 'Add New Request' om de aanvraag te bewaren.
Verzeker dat de posities van je sequenties zoals ingegeven in Finch overeenkomen met deze van de corresponderende PCR-producten in een 96-well plaat. Indien je een PCR product/plasmide in twee richtingen wenst te sequeneren dien je twee requests aan te maken. De staalnamen en hun posities zijn voor beide requests identiek maar elke request heeft zijn eigen set primers. De 2 requests dienen onmiddellijk na elkaar aangemaakt te worden, zodat de GSU-operator weet welke 2 bidirectionele requests bij elkaar horen. Indien je wenst gebruik te maken van de standaard primers zoals voorzien in de GSU dienen deze op een specifieke manier genoteerd te worden. Gebruik exact de naam zoals hieronder opgegeven:
Primer naam M13_F_A M13_R_A M13_F_B M13_R_B
Primer sequentie TGTAAAACGACGGCCAGT CAGGAAACAGCTATGACC CACGACGTTGTAAAACGAC GGAAACAGCTATGACCATG
Indien je daarnaast nog de naam van je fragment of je PCR-primer wenst te vermelden kan je dit doen door de standaardprimer-naam te laten volgen door '--' en een naam naar keuze, bv. M13_F_A-BRCA1exon1. Indien je naamgeving niet correct gebeurt, wordt de standaardprimer NIET als zodanig herkend in de verdere verwerking naar de robots toe. Om het downloaden van resultaten snel en efficient te laten verlopen worden folders best klein en logisch gescheiden gehouden. Naast Plate request kan er ook gekozen worden voor upload request om je request aan te maken. 1. Ga naar Home en selecteer hier: Downloads bij System
2. Save de 96 well Plate Form
3. Open de plate request via Excel 4. Vul onderstaande kolommen in: - Label = voor elke request hetzelfde: ${TEMPLATE}-${PRIMER} - Template = naam, dna-nummer,... - Primer - Folder - Chemistry = DyeTerminator (amplicons tot 500-700 bp), DyeTerminatorLong (amplicons groter dan 700 bp) of Xterminator-normal
5. Na het invullen van de request wordt deze opgeslaan 6. Ga naar New request en kies voor upload request
7. Zoek bij bladeren de juist aangemaakt requestfile en selecteer add new request
1
2
Informatie over de aflevering van de PCR-producten en het bepalen van de primerposities kan gevonden worden onder : - Ontvangst externe stalen voor DNA-sequenering in de GSU - Ontvangst interne stalen voor DNA-sequenering in de GSU (H9.3-OP3 niet beschikbaar voor externe klanten.)
