To-Tibda Fwgsfonal MR Panstiti 2000
B. MAKALAH TEKNISI LITKAYASA TEKNIK PEMBUATAN ANTIGEN TRYPANOSOMA EVANSI UNTUK ELISA DETEKSI ANTIBODI Festa Politely
Balm Penel tion Veteriner PO Box 151 151 Bogor RINGKASAN Ada beberapa cara untuk diagnosis penysiat sutra diantaranya dengan uji Enzymelinked imrnonusorbent assay (ELISA). Untuk melakukan uji ELISA diperlukan beberapa tabapan diantsraaya adalah pembustan antigen. Teknik pembuatan antigen Trypanosoma evansi untuk uji ELISA dilakukaa dengan kro afi pertukaren anion dengan memakai selulose DE52 (Diedilaminadod cellulose 52). Darah hewan yang terinfeksi T. ermui dituangkan diatas e buffered saline (PBS) pH 8,0 kolom celuloe sehwsw manmdam selulose. Larutan pl yang mengandung g1uaosa 1% (PSG) dipakai untuk membilas Trypanawm yang tidak terikat pada selulosa. Trypanosonxo yang melewati kolom don ditampung dalam tab nng kemudian disentnfus dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 memt don cairan supernatan dibuang. Pelet Trypanooma kemudan dicuci dengan PSG 3X don disentrifugasi, pencucian temkhir dilakukan dengan PBS (pH 7,4). Pelet Trypanasorna kemudian &Wutkan daigan carbonatelbicarborwte coating brffer sebanyak 4X volume pelet kemudian disomkasi selama 20 detik dengan amplitud maksimum . Setelah senhifugasi, konsentrasi protein don antigen dibaca secara spektrofotometnk pads 540 nm. Suspensi antigen tersebut kemudian dmimpan beku pads suhu -70 ° C. Untuk uji ELISA deteksi antibodi, antigen T. evansi dipakai pads konsentrasi 2,5 ug protein per mihhter. .. Kaia Kuix i: Trypaooaana evansy ELISA, Antigen, DE 52, Deteksi antA odi, PBS, PSG.
PENDAHULUAN Surra adalah penyalat parasit darah menular yang disebabkan oleh
Trypanosoma evam, surra menyerang hewan berdarah papas di daerah tropik don subtrpik . Semoa mautalia rentan terhadap infeksi T. evansi, tetapi hewan yang terinfeksi mempunym respon yang beivariasi terutama pads sapi, kerbau don kuda. Infeksi T. evansl dapat beralabat fatal pada kuda jika tidak segera diobati. Diantara beberapa penyalat yang menyerang ruminansia besar don kuda, surra yang ditemukan secara endemis hanipir di seluruh wilayah Indonesia. Penyakit ini mempunyai arti yang cukup penting bagi industri peternakan di Indonesia (ADIWINATA 8t DACHL~AN 1969, DENNING 1976). Walaupun angka kejadian infdksi don mortalitas pads sapi don key cukup rendah, wabah surra masih sering terjadi tmutama di Palau Jawa (RUKMANA,1979) . Penyakit ini ditularkan secara mekanilr dari hewan sakit ke
14
Tsew Tabor Firngsionot non Pendd 2000
hewan sehat, oleh lalat pengisap darah, terutama dan genus Tabanus. T. evansi dapat tahan hidup pada bagian mulut lalat selama 30 menit - 6jam (NIESCHULZ, 1930). Deteksi infeksi T. evansi yang umum dilakukan Ch lapangan, adalah uji parasitologik seperti pemeriksaan darah secara natif ulas darah dengan pewarnaan Giemsa serta microhematrocit centrifu' gation technique (hMCT) (WOO 1970). Caracara deteksi tersebut diatas kurang akurat untuk mendeteksi infeksi T. evansi, terutama karena infeksi T. evansi yang bersifat fluktuasi don jumlah parasit yang terlalu sedikit di dalam darah hewan yang terinfeksi (MAHMUD & GRAY, 1980). Seiring dengan kemajuan teknologi maka diagnosis penyakit dapat dilakukan secara serologis dengan teknik enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) yang mempunyai sensitwitas yang lebih tinggi dibanding dengan diagnosa pmasitologik. Untuk kepeduan pengujian dengan ELISA yang memenuhi standar diperlukan antigen yang spesifik untuk deteksi antibodi T. evansi. Teknik pembuatan antigen ELISA ini dilakukan dengan mempergunakan kolom selulose DE 52 (diethylaminathyl cellulose 52) yang dikerjakan pembuatamrya di Laboratorium Parasitologi Balm Penelitian Vetcriner meWui kerjasama dengan CTVM, Universitas Edinburgh, UK.
BAHAN DAN CARA Pembuatan antigen ELISA di laboratorium Parasitologi Balm Penelitian Veteriner Bogor, dilakukan dengan memperg~makan metode RAE & LUCKINS 1984 . Penyiapao Isolat Trypanosoma evansi Isolat yang dipakai untuk pembuatan antigen berasal dari isolat lapangan yang drdwleksi dari kerbau di Pekalongan (BAKIT 103 don BAKiT 249) don Pemalang (BAKIT 576) . Langkah pertama dari pembuatan antigen ini adalah memperbarryak jumlah parasit dengan cara menyuntikan stabilat T. evansi kepada mencit (Mus musculus albinos) secara infra peritoneal. Dalam waktu 2-3 hari, T. evansi tersebut akan berkembang biak dalam darah mencit . Ketika jumlah Trypanosoma mengpai 100 per lapangan pandang mikroskop (400X) maka dash mencit tersebut siap dipakai untuk mokulasi pada tikes albino. Pasase T. evansi ke t&us albino (Rates sp. Albinicus)ddakukan dengan penyuntikan kira-lara darah mencit secara intra peritoneal. Penyiapan kolom DE 52
Diethlaminathyl cellulose 52 ditimbang sebanyak 200 gram lalu dilakukan dengan Phospate buffered saline (PBS) yang mengandung glukosa 1 % (PSG) . Larutan PSG ini dipakai untuk melamtkan don mencuci DE 52, biasanya diperlukan selatar 3 1 PSG untuk mencuci DE 52. Larutan DE 52 dalam PSG dicuci merata don diaduk dengan menggunakan magnetic stirrer selama 5 merit, kemudian dibiarkan sampai DE 52 mengendap. Cairan PSG tersebut kemudian dibuang don diganti dengan
15
Temu Teknis Fungmonal non Penelid 2000
cairan PSG yang baru . Waktu yang diperlukan untuk mencuci dan melarutkan DE 52 kurang lebih 30 menit dan perlakuan ini diulang 2 - 3 kali sampai cairan PSG yang dipakai untuk membilas DE 52 berwarna bening. Setelah proses pencucian selesai, larutan DE 52 disesuaikan pHnya sampai mencapai pH 8,00 dengan penambahan orthophosphoric acid. Larutan PSG dibuat dari larutan stok PS yang ditambah glukosa 1 %. Larutan stok PS terdiri dari Nat HP04 anhydrous 13,48 gram; Na H2PO4 2H20 0,78 gram; NaCI 4,25 gram; semua bahan dilarutkan dalam air suling (aquades) sampai 1 liter. Larutan PS yang akan dipakai dibuat dengan cara mencampur 6 bagian stok PS dengan 4 bagian aquades . Larutan PSG dibuat dengan cara menambahkan glukosa dengan konsentrasi 1%.
a a
Gambar 1 . Penyiapan kolom DE 52 untuk pemisahan T. evansi dari sel darah
16
Temu Tekms Fungsional non Penetin 2000
Teknik pentbuatan antigen untuk ELISA deteksi antibodi
Sebanyak 15 ml darah diambil dari 3 ekor tikes albino yang sudah diinfeksi dengan T. evansi, dash dan tikes albino tersebut diambil langsung dan jantung, setelah tikes dibunuh dengan ether, dengan menggunakan spwt 5ml yang telah diisi dengan heparin cair 5 IU/ml. Darah tikes ditampung dalam tabung yang disimpan dalam es. Pemisahaan Typanosoma dari sel-sel darah dilakukan menurut rnetode dari LANHAM & GODFREY (1970), alat yang dipakai untuk pemisahan Tiypanosoma dari sel darah disusun menurut petunjuk pada Gambar 1. Lautan DE 52 kemudian &tuangkan ke dalam koloin sampai batas garis yang ada pada alat tersebut, yang sebelumnya bagian bawah dari kolom diben kertas saring. Kertas saying (Wbatman no 4) diletakkan di bagian atas DE 52 sebagai penutup. Kolom DE 52 hates dijaga supaya tetap lembab dengan cars terus menerus menambahkan PSG sedikit dens sedikit. Ketika kolom DE 52 sudah cukup padat, dash tikes putih yang mengandung T. evansi dituangkan ke kolom DE52 dan dbiarkan sampai mwendam selutose. Ketika darah sudah mulai turun ke dalam kolom, lanrtan PSG ditambahkan seddcit demi sed ldt agar kolom tidak keying. Trypanosoma evami yang tidak terikat pada selulose ditampung pada gelas erlemeyer yang disimpan dal-am es. Trypanosoma yang terpisah dan sel darah Ialu dipindahkan ke tabung sentrifus 50 ml, kemudian &sentrifm dengan kecepatan 3000 rpm pada tempwatur 4° C selama 30 menit dan cairan Stan dibuang, kemudian dijadikan sate tabung (10 ml) lalu dihomogenkan dengan pipet pasteur, perlakuaii ini diulang sacupai 3 kali dengan tiap-tiap perlakuan cairan PSG diganti dengan yang baru, sentrifuse kembah 3000 rpm denon cairan PBS pH 7,4 selama 10 menit dan cairannya dibuang. Larutan carbonatelbicarbonate coating buffer pH 9,6 kemudian ditambahkan ke pelet T. evansi dengan perbandingan 1 :6 dan dihomogenkan dengan menggunakan pipet pastetir. Campuran T. evam dan carbonatelbicarbonate coating buffer pH 9,6 dwW antplitud maksimum selama 20 dedk untuk mengbancmkan 7: evansi. Trypanosoma yang sudah disonikasi kemudian disentrifuse dengan keoepatan 12000 rpm selama 15 mead. Setelah selesai sentrifugasi larutan antigen pada supernatan &simpan pada suhu -700 C. Pengukuran kadar protein antigen T. evansi Kadar protein dalam antigen T evansi diukur dengan menggunakan kit protein assay dari PIERCE (Illinois, USA) . Secara ringkas, terlebih dahulu disiapkan larutan standar yaitu bovine serum albumin (BSA) yang diencerkan dengan air yang telah dideionisasi (18 MM) pada stoic pengenceran 400 (200 0 BSA + 800 0 air deionisasi); pengenceran 300 (150 0 BSA pengenceran 400 + 50 0 air deionisasi ); pengenceran 200 (1000 BSA pengenceran 300 + 100pl air deionisasi); pengenceran 100 ( 150 0 BSA pengenceran 200 + 50 0 air deionisasi ) dan pengenceran 0 yang terdiri atas air deionisasi saja . Larutan BSA dengan pengenceran 400, 300, 200, 100, dan 0 tersebut kemudian dimasukkan ke lubang plate ELISA, masing-masing sebanyak 17
Tenor Tekms Fungsiorwd non Penef 2000
10 N.l dam tiap pengenceran BSA tersebut dimamkkan ke tiga lubang plate . Antigen T. evansi yang akan diukur kadar proteinnya dimasukkan ke dalam 3 lubang plate ELISA masing-masing sebanyak 5 pl. Reagent yang terdiri atas campuran BSA dam Curve++ (1:50) kemudian ditambahkan masng-masing 200 Nl ke tiap lubang yang telah berisi laratan BSA dam antigen. Plate tersebut kemudian diinkubas kan selama 30 menit pada suhu kamar dam basil realm dibaca secara spektofotometrik memakai ELISA platereader (Dynatech). Absorben yang dibaca pads 540 nm kemudian dianalisis secara regt+esi linear. Penentuan pengenceran optimal antigen T. evansi Antigen yang akan dipakai untuk coating plate ELISA ( Immulon I, Dynek) terlebih dahulu diencerkan 1 : 50 dengan carbonate coating buffer. Semua lubang dalam kolom I dari plate ELISA diisi dengan 200 0 larutan antigen (1 : 50), sisa lubang plate (kolom 2 - 12) diisi masing-masing dengan 100 wl coating buffer. Tahap selanjutnya adalah pengenceran ganda dari antigen dari kolom 1 ke kolom-kolom berikutnya. Setelah coating, plate ELISA tersebut kemudian di in( ubasi pada suhu 4 ° C semalam. Keesokan harinya antigen dibuang dam plate dicuci dengasn PBS yang mengandung detergem twwen 20 0,05% (PBS tween) sebanyak 3 kali pencucian. Tahap berikutnya adalah penambahan serum kontrol positif dam negatif yang dieneerkan 1 : 800 dalam PBST tambahkan ke tiap lubang dibaris A, B dam C pada plate ELISA masing-masing 100 0 larutan serum control positif Serum control negatif ditambahkan ke tiap lubang dibaris D, E dam F pads plate ELISA, masing-masing 100 O.Tiap lubang pada baris G danH dari plate, ELISA diisi dengan PBST masingmasing 100 0 sebagai control maksi antigen - konjugate. Tahap-tahap selanjutnya adalah sama dengan tahapan uji ELISA deteksi antigen Tevarrsi seperti yang telah dilaporkan oleh Solihat (1999)
HASIL DAN PEMBAHASAN Hash bacaan estimasi protein stamlar menunjukan hubungan linear antara absorben pada 540 nm dengan pengenceran standar (rz = 0,99) (Gambar 2 ). Hasil estimasi protein antigen T. evansi ditunjukkan pada Tabel 1. Tabel 1 . Hasil estimasi protein dari antigen T. evansi . No. BAIQT 576 103 249
18
Mat T. evansi Asal Isolat Pemalan Pekalon Pekalongan
Konsentrasi protein ml 1600 2500 2800
Tem Tekrds FWggxond non Penelio 2000
Untuk keperluan uji ELISA deteksi antibodi, perlu ditentukan pengenceran yang dioptimal dari antigen T. evansi . Antigen T. evansi yang berasal dan isolat BAKIT 103 dipilih untuk dipakai pada uji ELISA deteksi antibodi karena jumlah persediannya mkup banyak . Hash bacaan standarisasi antigen T. evansi (BAKIT 103) menunjukan hubmigan exponensial antara pengenceran T. evansi dengan absorben pads 450 nm (rz = 0,77 dan rl x,97). Dari hash tersebut diperoleh kesimpulan bahwa konsentrasi optimal antigen T. evansi yang dipakai untuk uji ELISA deteksi antibodi adalah 1 : 1000 yang ekuivalen konsentasi protein 2,5 4ml. Pengenceran ini dipilih dengan pertimbangan bahwa perbedaan nilai absorben antara kontrol serum positif dan negatif cukup besar (0,16 untuk kontrol negatif dan 1,96 untuk kontrol posittf) . Selain alasan tersebut pads pengenceran antigen 1:1000 tidak ada reaksi antara antigen konjugat dimana hal ini sangat penting untuk diagnosa serologi karena reaksi positif palsu sering ditemui pada uji serologi seperti ELISA. Pada uji ELISA deteksi antibodi antigen diadsorpsi ke permukaan phrstik dan sebagian besar dari protein tersebut akan teradsorpsi oleh permukaan plastik . ikatan antara plastik dan antigen terjadi secara fisdal dan ada kemungkinan antigen yang telah terikat tersebut akan hilang sewaktu proses pencucian dan inkubasi pada uji ELISA. Pengikatan protein yang tidak spesifik oleh permukaan plastik mungkin terjadi karena adanya adsorpsi yang fisikal. Hal ini terutama terjadi pada proses inkubasi dengan sampel serum atau konjugat, dimana munkin ada ikatan antigen/antibodi yang spesifik. Adsrospsi yang tidak spesifik ini dapat dikurangi sampai minimal dengan memakai deterjen non - ionik, misalnya Tween 20. Detergen Tween 20 ini berfungsi untuk mencegah mteraksi antara plastik dengan serum atau konjugat tetapi adak ada efek dalam proses pertama adsorpsi antigen dan plastik . Pada titrasi pengenceran antigen, diperoleh pengenceran optimal yaitu 1 1000 yang ekuivalen dengan konsentrasi protein 2,5 gg/ml. Konsentrasi antigen Trypanosoma antara 1 - 40 4ml adalah konsentrasi optimal yang biasanya dipakai untuk ELISA (LUCKINS, 1976; LUCKINS et al., 19'79). Uji ELISA deteksi antibodi T. evansi adalah uji serologik yang rutin dipakm di Bahtvet untuk memonitor kejadian soma di lapangan . Reaksi silang dengan antibodi heterologus mungkin terjadi pada uji ELISA deteksi antibodi yang memakai crude antigen (LUCKINS,1977) . Usaha untuk memurnikan antigen telah dilakukan antara lain dengan fiaksinasi antigen non protein dengan kolom kromatografi (JAGBONE et al., 1989) dan dimana depan, pemakian antigen rekombinan diharapkan dapat memperbaiki spesifisitas dan standarisasi uji antibodi yang lebih baik (MASAKE et al., 1995).
Terms reknis Fungsional non Penefiti 2000
Gambar 2. Kurva standar estimasi pmtein
0
50
100
150
200
250
300
Pengenceran standar protein
330
400
450
T-Tebda FunsnonaeoaPenlia200b
Ganbar 3. Kurva standarpengenceran antigen Trypanosono evansi BT
4 3
y = 7.3637e"W'' W :OL7722
2 y =Q.628'lea 2wax
rt=asvos
o
-+--,
Tens TekMs Fungsiond Mn Penelft, 2000
KESIMPULAN Antigen T. evansi telah dihasilkan dari 3 isolat lokal dari Pekalongan dan Pemalang. Estimasi protein dari ketiga isolat tersebut menghasilkan konsentrasi protein antara 1600 -2800 gg/ml. Pada titrasi antigen diperoleh pengenceran optimal 1 : 1000 yang setara dengan 2,5 gg/ml untuk uji elisa deteksi antibodi.
UCAPAN TERIMA KASIH
Pada kesempatan ini penulis tidak lupa mengucapkan banyak tenma kasih kepada Dr.Ismu Prastyawati Sukanto, MSc atas segala bimbingan dan sarannya selama penulisan makalah ini, sehingga dapat terselesaikan dengan baik. Ucapkan term kasih ditujukan pula kepada Drh. Didik Tulus Subekti yang telah melakukan uji statistik.
DAFI'AR PUSTAKA ADIWINATA-T and A; DACHLAN. 1969. A brief on Suva in _Indonesia ELVEKA Fol Vet 3 : 11-15. UAG BONE. I.F., C . STAAK, and R RIENHARD. 1989. Fractionation of trypanoome antigen for species -specifik ser+o-diagnosis . Vet. Parasit. 32 :292 - 299 LANHAM, S.M. and D .G. GODFREY . 1970. Isolation of salivarian trypanosome from man and other mammalas using DEAE-cellulose. Exp.Parasitol . 28 : 521 -528 LUCKINS, 1976. The immune response of Zebu cattle to infection with Trypanosoma congolense and T. vivax. Ann. Trop. Med. Parasit. 70 : 521-528 . LUCKINS, A.G. 1977. Detection of antibodies in trypanosome infected cattle by means of a microplate enzyme-linked ilhmunosorbent assay. Trop. Anim. HIM and Prod 9 : 53-62 . LUCKINS, A.G., R BOID,P.F.RAE, MM Mahmoud, K.H. EL MALIK and . .R A GRAY . 1979. Serndiagoosis of Trypwwsoma evansi in camels in the Sudan. Trop Anim. HIth. Prod. 11 : 1-12 MAHMUD, KM and A.R GRAY. 1980. Trypanosomiasis due to Trypanosoma evansi (Steel, 1885) Baibani,1888 . A review of recent research. Trop. Anim. HIth Prod. 12:35 - 47 MASAKE, RA., K. ONESMO, OLE,Y.,T. URAKAWA, H. HIRUMI, P.A.O. MAJIWA, C.W. WELLS, S.H MINJA, J.M. MAKAU, and ekpression in escherichia coli and baculovirussystem of aTrypanosoma vivax antigen detected in the blood of infected animal . Exp Parasitology. 81 : 536 545 . NIESCHULZ, D. 1930. Surraubertragung versuche auf Java and Sumatra. Veeartsenijkundige Mededeeling Departemen van Lanbouw, Nijverheid en Handel Nederlandsh - Indie (Nr. 75) .utrecht : Kemmink en zoon N.V.
22
Tsnw Tsknis Flrngaona non Par ba 2OW
RAE, RE and AG Lucidns .1984. Detection of circulating Trypanosomal antigen by enzyme Immuno assay. Ann Trep. Med. Parasit 77: 587 - 596. RUKMANA, M.P. 1979. Metoda mikrohematrokit sebagai teknologi baru. diagnora surra. dan relevansi kaitannya dengan sosial ekonomi peternakan. Ph.D [Thesis]. Universitas Padjadjaran, Bandung. 356 pp. SOLIHAT, L. 1999. Teknik diagnosa T. evwW dengan uji ELISA deteksi antigenProsiding Temu Ilmiah Litkayasa . Balm Penelitian Veteriner. Pusat! penelitian don Pengembengan Peteruakan. Badan Litbang Pertanian hal 138-144 . WOO, P.T.K-1970. Evaluation of the haematrocit owe and other technigeus for field of human Trypanosomiasis and Nwiotas. Cmc J. Zoo 1. 47 : 921 923.
