Erjesztési sajátosságok A „terroir” élesztők jelentősége a borminőségben Dr.Magyar Ildikó
SZBI Borászati Tanszék
Élesztőgombák
Terroir élesztők (helyi, autochton élesztők) • Mindazok a Saccharomyces és nemSaccharomyces fajokhoz tartozó törzsek, melyek egy adott borvidéken a helyi környezeti adottságokhoz adaptálódva a szőlőbogyón és/vagy a pincészetekben – tartósan , nagy számban jelen vannak – hosszabb vagy rövidebb ideig részt vesznek a helyi borok spontán erjesztésében • A bor minőségére gyakorolt hatásuk összetett (pozitív és negatív)
A spontán erjedés általánosított populáció dinamikája (Fleet, 1990)
Saccharomyces sp.
Candida sp.
Kloeckera sp.
A szőlőn előforduló fontosabb élesztők: nem- Saccharomyces nemzetségek! 1. Kloeckera/Hanseniaspora fajok – Az egészséges szőlő jellemző fajai világszerte – Domináns fajok a spontán erjedés kezdetén •Bipoláris sarjadzás – citrom forma (apikulátusz élesztők)
•Erjesztőképesek, de rossz alkohol toleranciakb. 4-5 % •Legtöbb törzsük sok illó észtert és ecetsavat termel •A spontán erjedés gyors megindításában hasznosak •Egy borvidéken belül is nagy genetikai és fenotípusos változatosság
Mustból izolált Hanseniaspora uvarum törzsek változatossága azonos borvidéken, 57 törzs vizsgálata alapján (Dél-Olaszország, Basilicata, Capece at al.,2005) átlag mg/l Magasabbrendű alkoholok
84,92
legkisebb mg/l 38
leg-nagyobb mg/l
acetoin ecetsav acetaldehid
158,88 2211,67 25
49 649 10
279 7736 93
bétaglükozidáz aktivitás
0,71
0
2,32
173
Szőlőről és a spontán erjedésből gyakran izolálható fajok
2. Metchnikovia pulcherrima (Candida pulcherrima)
•Gyenge erjesztőképessége miatt borászati szerepe nem jelentős: spontán erjedésben gyors pusztulás – Nagyon sokféle észtert termel!
– Terpénalkoholok, tiolok felszabadítása (alfaarabnozidáz aktivitás) – Jelentős fajon belüli diverzitás! • Starterkultúraként újabban forgalmazzák- beoltás 2-3 nappal a S. cerevisiae előtt
Szőlőről és a spontán erjedésből gyakran izolálható fajok
3. Candida zemplinina,
Candida stellata
• Botrítiszes bogyókon domináns, de az egészségesen is előfordul • Viszonylag jó alkoholtűrés hosszabb ideig életben maradhat a spontán erjedésben • Lassú erjesztés, cukortűrés, hidegtűrés • Gyenge alkohol képzés, de jó glicerin termelés. Savtermelés.
• Fruktofil karakter! • Jelentős fajon belüli diverzitás! • Speciális aromaanyagokat nem termel • Kevert starterkultúraként ígéretes
Tokaj fontos terroir élesztőfaja!
Borélesztők: S. cerevisae és S. bayanus Honnan kerül a borélesztő a mustba? • Döntően nem a szőlőbogyóról! • Spontán erjedésnél – a pince saját élesztőflórájából • kiszelektálódott „helyi” törzs (valódi saját élesztő) • korábban használt v. behurcolt és a pincében „megtelepedett” fajélesztő – a pincébe betárolt idegen borokból/sűrítményből – esetleg az ültetvényből (nagyon kis számban) • Irányított erjesztésnél – kereskedelmi fajélesztő készítményekből – a pince saját élesztőflórájából is!
A borélesztő bióta változékonysága • A S. cerevisiae lényegesen gyakoribb a S. bayanusnál. Ritkán hibrid törzsek is előfordulnak. – A S. bayanus általában ritka (hiányozhat is), de egyes borvidékeken nagyon gyakori!-pl. Tokaj
• Minden borvidéken belül nagy genetikai változatosság, főként a S. cerevisae esetén! • A borvidékek között találhatók jelentős eltérések, de átfedések is! • Borvidéken belül a pincészeteknek vannak „közös” és különböző, „saját” törzseik is. • A kereskedelmi törzsek gyakran betelepülnek a pincészet saját élesztő biótájába – Részben változatlanul kimutathatók – Részben genetikai változásokon átesve és alkalmazkodva „saját” élesztővé válnak
Molekuláris biológiai módszerek az élesztőfajok/törzsek elkülönítésére Ribotipizálás (ARDRA)
DGGE profilok
RAPD
S. cerevisiae és S. bayanus törzsek genetikai sokfélesége 6 ausztriai pincészetben - 4 borvidéken, spontán erjedés során (Lopandic at al. 2008) Genetikai diverzitás: S. cerevisiae - Összesen 181 izolátumból 153 törzs 13 genotípusba sorolható 28 törzs egyedi genotípussal rendelkezik S bayanus – összesen 11 törzs 8 genotípusba sorolható Előfordulás a pincészetekben: • A törzsek kb. 30 %-a (2 genotípus) minden pincészetben előfordult („közös” törzsek). • A pincészetek egyedi törzsekkel is rendelkeznek • Szőlőfajtától nem v. kevéssé függ Kereskedelmi starterrel való egyezést nem vizsgálták (de nem zárták ki) Hasonlóság AFLPmintázat alapján
Spontán erjedő tokaji aszúborból izolált S. cerevisiae törzsek genetikai változatossága különböző aszúáztatási módszerek esetén (Pomázi et al., 2003) B, áztatás starterkultúrával erjesztett borral
A, áztatás spontán erjedő musttal
starter
starter
A helyi törzsek mellett az üzemben (más borhoz ) használt starter is megjelenik!
Az alapborból származó starter mellett számos helyi törzs is megjelenik!
Az alkoholos erjedés dinamikája tokaji aszúborban, helyi S.cerevisiae és S. bayanus izolátumokkal végzett beoltás után (15 oC-on) Brix
S.cerevisiae strains
SB 34/1.01
S. bayanus strains
SB 20/1.13
30
SB RA3106
30
SC RA4106
SB I/O/C
SC 11/1.24 28
SB I/O/1
SC 34/1.03
28
SC RA100
SB I/1/8
SC PM321 26
SB I/2/7
SC UVA PM
26
SB I/2/12
SC I/O/A
SB I/5/1M
SC I/1/7
24
24
SB I/8/11M
SC I/3/A 22
SC I/10/3M SC I/9/z1
Ref%
Ref%
SC I/2/D
SB I/8/2LM 22
SB I/10/6M SB I/2/z2
SC I/3/4 20
SC I/3/5
20
SB CBS 380 SB I/3/BI
18
SB I/5/2
SC I/0/z3 SC II/0/o7
18
SC II/4/z1
SB I/8/13
SC II/6/z2 16
SC IV/6/z2
16
SB I/10/1
SC IV/8/z2 SC Actiflor 14 0
2
4
6
8
10
12
14
SB II/2/z9a SB IV/0/z4
14 0
2
4
6
8
time (weeks)
time (weeks)
2015.01.29.
Magyar Ildikó
Borászati Tanszék
10
12
14
SB CBS 395 SB I/0/B
mg glycerol / 1 g sugar
0
2015.01.29.
*Yields of glycerol on fermented sugar CZ PM602
120
CST 20/1.12
S.cerevisiae
ACTIFLOR
Glycerol production*
SC IV/6/z2
SC II/4/z1
SC I/0/z3
SC I/3/4
SC I/10/3M
SC I/2/D
SC I/O/A
SC 34/1.03
S.bayanus
SC 4106
SB CBS 395
SB II/2/z9a
SB I/8/13
SB I/3/BI
SB I/2/z2
SB 1/8/2LM
SB I/5/1M
SB I/2/7
SB I/O/1
SB TK 01
SB 34/1.01
Erjedési melléktermékek Glicerin C.stellata C.zemplinina
100
80
60
40
20
A glicerin termelés gyakoriság-eloszlása tokaji S. cerevisiae (n= 72) és S. bayanus/uvarum (n=39), izolátumok esetén, aszúerjesztés során
S. bayanus
60
60
50
50
Frequency %
Frequency %
S. cerevisiae
40 30 20 10 0
40 30 20 10 0
20
40
60
80
More
20
glycerol (mg/1 g sugar)
40
60
80
more
glycerol (mg/1 g sugar) 2015.01.29.
mg acetic acid / 1 g sugar
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0
2015.01.29. CZ PM602
CST 20/1.12
S.cerevisiae
ACTIFLOR
SC IV/6/z2
SC II/4/z1
SC I/0/z3
SC I/3/4
SC I/10/3M
SC I/2/D
SC I/O/A
S.bayanus
SC 34/1.03
SC 4106
SB CBS 395
SB II/2/z9a
SB I/8/13
SB I/3/BI
SB I/2/z2
SB 1/8/2LM
SB I/5/1M
SB I/2/7
SB I/O/1
SB TK 01
SB 34/1.01
Illósav
Volatile acid production* C.stellata C.zemplinina
*Yields of acetic acid on fermented sugar
Az illósav termelés gyakoriság-eloszlása tokaji S. cerevisiae (n= 72) és S. bayanus/uvarum (n=39), izolátumok esetén, aszúerjesztés során S. bayanus
35
40
30
35
Frequency %
Frequency %
S. cerevisiae
25 20 15 10
30 25 20 15 10
5
5
0
0 1
3
5
1
7
2
3
4
5
6
7
More
volatile acid (mg/1 g sugar)
volatile acid (mg/1 g sugar)
2015.01.29.
Kéndidrogén képzés Genetikailag változó tulajdonság! A helyi törzsek között előfordulnak szulfid termelők
A helyi mikrobióta összetételét befolyásoló tényezők • Szőlő mikrobiótájára hat (elsősorban vadélesztőkre) – Évjárat • Egészségi állapot • Időjárás • Növényvédelem • Borászati üzem mikrobiótájára hat (Saccharomyces törzsek összetételére) – Évjárat kevésbé – A pincészet kora – Kereskedelmi starterkultúra alkalmazása – Vásárolt anyagok (pl. bor, sűrítmény) és használt eszközök (pl. fahordó)
A spontán erjedés (helyi élesztők) értékelése • Előnyök – A vadélesztők (nem-Saccharomyces fajok) hosszabb ideig, jelentősebben hozzájárulnak a bor aromájához – jó helyi törzsek esetén komplexebb bor – A helyi Saccharomycesek aromatermelése egyedibb lehet – A fruktofil fajok kedvezően befolyásolják a G:F arányt – A terroir élesztők alkalmazása marketing értékű! • Hátrányok/ kockázatok: – Lassan indul be, főként tisztított mustban – oxidáció – Éles musttisztítást nem lehet alkalmazni – Kiszámíthatatlan dinamika – Nagyobb a hibás erjedés veszélye (káros vadélesztő fajok, tejsavbaktériumok) – Genetikailag hibás Saccharomyces is felszaporodhat – Nagyobb az elakadás veszélye
Saját élesztő(k) alkalmazása starterkultúraként 703
Törzsszelekció
302 701
Élesztő szelekció lépései 1. Izolálás, vadélesztők kiszűrése Borminta 1
Borminta 2
Borminta 9
Borminta 3
Higítási sor
Szélesztés DRBC agarra
Szoliter kolóniák izolálása 45 db
Mikroszkópos vizsgálat
Tiszta tenyészet készítés 34 db
Növekedés Lizinen
Yes
lehetséges Saccharomyces törzsek
Nem-Saccharomyces EX
2. Azonos törzsek kiszűrése
lehetséges Saccharomyces törzsek
Kioltás ferde agarra, tárolás
Kioltás Bi agarra
Kioltás BKZ agarra
Kioltás acetát agarra
Kioltás maláta agarra
Kioltás steril mustba
Szulfitképzés vizsgálata (szín) 1 hét
Telepmorfológia (szín, állag)
Spórakápzés vizsgálata 1 hét
Spóraképzés vizsgálata 1 hét
Erjesztés és/vagy Hártyaképzés mustban
Szulfitképzés vizsgálata (szín) 1 hét
Telepmorfológia (szín, állag)
Spórakápzés vizsgálata 1 hét
Spóraképzés vizsgálata 1 hét
Asszimilációs vizsgálatok
EX
Yes
Azonos törzsek?
Yes
Saccharomyces törzsek?
No
no 20 db valószínűleg különböző Saccharomyces törzs
Molekuláris biológiai vizsgálatok
3. Molekuláris biológiai vizsgálatok • Molekuláris tipizálással (pl. RAPD) meghatározni és kizárni az ismétlődő, azonos törzshöz tartozó izolátumokat (klónokat) • Molekuláris identifikációs módszerrel (pl. ribotipizálás) meghatározni, hogy az izolátumok a Saccharomyces sensu stricto csoporton belül mely fajhoz tartoznak (S. cerevisiae vagy S. bayanus?) • Feltárni a kereskedelmi starterrel való szoros rokonságot: kereskedelmi starter kizárása!
Spontán erjedő somlói borokból izolált Saccharomyces törzsek összesített dendrogramja OPA 13 GTG 3 (RAPD) A
B starter
C
D
Borászati Tanszék
4. Borászati tulajdonságok vizsgálata laboratóriumi erjesztésekben
• erjedési dinamika • alkoholtermelés • erjedési melléktermékek – – – – –
illósav glicerin acetaldehid kénhidrogén Kéndioxid
• habzás • ülepedés
5. Mikrovinifikációs kísérletek analitikai és érzékszervi értékelés 6. Üzemi kísérletek analitikai és érzékszervi értékelés 7. Starter jelöltek genetikai stabilitásának vizsgálata 8. Szelektált törzs(ek) fenntartása, felszaporítása, (szárítása?)
Szelektált helyi borélesztők érzékszervi értékelése kereskedelmi törzshöz ( ) viszonyítva (példák különböző törzsszelekciós kísérletekből). Somló, száraz bor, 2008
Tokaji aszú, 2004 17
Összes pontszám, a-b-c átlagában
Etyek, száraz bor (Csernus 2008) 15 14 13 12 11 10 228
301
404
704
Sp
Tokaj, száraz bor (Dankó, 2012)
80 1A
70 3A
70 1A
50 2A
30 5A
30 2A
60 1A
10 3A
A SB 12 A
PM
SB27+SC35
PM321
SC10
SC35
SC53
SC57
Actiflor
C.Zemplinina
C.Stellata
SB46
SB27
SB26
SB12
5
VA
9
U
11
VA 22 8
13
A
18 17 16 15 14 13 12 11 10
15
7
átlagopont
Összpontszám
starter
U
átlagpontszám
19
703 starter
Helyi törzsek
A beoltott starterrel a helyi törzsek versenyben maradhatnak az erjedés végéig!
Saját élesztő - starterkultúraként Következtetések • Saját mikrobiotából szelektált Saccharomyces törzs(ek) alkalmazhatók anyaélesztős beoltásra – Jól egyesíti a spontán erjedés (egyedibb aroma) és a fajélesztős erjesztés (biztonság) előnyeit – A legjobb kereskedelmi starterkultúrákhoz képest a szelektált „terroir” törzsek általában nem kiemelkedőek (kisebb választékból szelektálva) – Törzskeverékek alkalmazása ajánlható
• A „valódi saját élesztők” izolálása és szelektálása költséges és időigényes • A szelektált törzs fenntartása/felszaporítása, esetleg szárítása problémákat vet fel
Köszönöm a figyelmet!
Vadélesztők • minden nem-Saccharomyces faj, ami a szőlőn, mustban, borban előfordul • közülük csak 15-20 faj játszik tényleges szerepet • lehetnek károsak, közömbösek v. hasznosak • lehetnek jól-, gyengén vagy nem erjesztő fajok • a jól erjesztő fajoknak valamilyen hátrányuk, hiányosságuk van a borélesztőkkel szemben – pl. káros aromaképzés, lassú szaporodás, borstabilitási probléma stb… Magyar Ildikó
Borélesztők 2 faj a „régebbi” Saccharomyces sensu stricto fajok közül
• S. cerevisiae – borélesztő, pékélesztő, aletípusú sörélesztő (felső erjesztésű)
• S. pastorianus – (korábban: S. carlsbergensis) – sörélesztő (alsó erjesztésű)
• S. bayanus – borélesztő
• S. paradoxus
S. uvarum S. bayanus
– csak természetes anyagokon
A természetes élesztőpopulációk változása tokaji aszú spontán erjedése során, 12 oC-on Aszú extracted with young wine Összes élesztő Total yeasts C.stellata Zyg.bailii Saccharomyces
8
13
7
12
6
11
5
10
4
9
3 2
8
1
7 0
2
4
6
8
10 12 14 16 18
lg TKE/ml
NonVadélesztő Sacch. Z.rouxii Kloeckera Alkohol
Alkohol V/V%
lg TKE/ml
Total yeasts Összes élesztő C.stellata Z.bailii Saccharomyces
Vadélesztő NonZyg. rouxii Sacch. Kloeckera sp alcool
8
13
7
12
6
11
5
10
4 3
9
2
8
1
7 0
2
Time (weeks)
4
6
8
10 12 14 16 18
Time (weeks)
2015.01.29.
Alkohol V/V%
Aszú extracted with must
• Nem-Saccharomyces fajok (vadélesztők) – Melyek a legfontosabb fajok? – Honnan származnak (hol tenyésznek) ezek az élesztők? – Mennyire változatos a faji illetve fajon belüli összetételük (borvidéken belül, illetve borvidékek között) • Saccharomyces fajok – A S. cerevisie és S. bayanus előfordulásának gyakorisága – Honnan származnak (hol tenyésznek) ezek az élesztők? – Mennyire változatos a faji illetve fajon belüli összetételük (borvidéken belül, illetve borvidékek között
