SEMMELWEIS EGYETEM GYÓGYSZERÉSZTUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA
Doktori (Ph.D.) tézisek
ENHANCER ANYAGOK: (-)-DEPRENIL ÉS (-)-BPAP, AZ AGYI NEURONOK KÜLÖNLEGES SERKENTŐI
MIKLYA ILDIKÓ
Témavezető: Dr. Knoll József, akadémikus
Készült: MTA-SE, Neuropszichofarmakológiai Kutatócsoportjában
Budapest, 2002
BEVEZETÉS Knoll József közel 40 éve dolgozta ki a (-)-deprenilt, mint új típusú pszichoenergetikumot. Az első publikációk, melyek 1964/65-ben jelentek meg, bizonyították, hogy a vegyületnek sajátos farmakológiai spektruma van, mivel nem rendelkezett az amfetamin származékokra jellemző vérnyomásemelő hatással, éppen ellenkezőleg csökkentette azt. A klinikumban igazolt kezdeti antidepresszív hatása után először a szelektív MAO-B enzim bénító hatását mutatták ki, mely szintén nagy jelentőségű volt, hiszen az addig létező MAO bénítókra jellemző ’sajt reakció’-nak nevezett mellékhatással nem rendelkezett, így biztonsággal adhatták depressziós betegeknek. Kezdetben úgy gondolták, hogy a (-)-deprenil az irreverzibilis MAO-B enzim bénító hatásának köszönhetően fokozza a központi idegrendszer nigrostriatalis rendszerében a dopamin mennyiségét és ezért alkalmas vegyület a Parkinson-kór kezelésére, melynek alapján először Európában majd 10 évvel később az USA-ban is törzskönyvezték. Később hatásmechanizmusát alaposan elemezve neurotoxinok elleni védő, scavenger funkciót fokozó, tanulási képességet és teljesítmény javító hatását mutatták még ki az élettartamot szignifikánsan meghosszabbító hatás mellett. Ezeket a hanyatló szervezet számára kedvező hatásokat mind a mai napig vizsgálják szerte a világon és az eddigi eredmények alapján már százezrekre becsülik azoknak a számát akik profilaktikus célból az agy öregedése lassulásának reményében szedik a (-)deprenilt. A vegyület komplex hatásmódjáról eddig több ezer tudományos cikk jelent meg a világirodalomban, de pontos hatásmechanizmusa csak az elmúlt évek során vált ismertté. Knoll József a (-)-deprenil hatásmódjának elemzése során az 1990-es évek elején felfedezett egy új élettani fontosságú regulációt, az enhancer mechanizmust, melynek lényege, hogy az agytörzsben olyan neuronok vannak, melyek képesek specifikus endogén ’enhancer’ anyagok hatására a másodperc törtrésze alatt ingerlékenységüket növelni. A PEA és a triptamin az eddig kivizsgált két endogén enhancer hatású vegyület. A PEA-nak, csakúgy mint származékainak, az amfetaminoknak, erőteljes biogén aminokat felszabadító, ’releasing’ hatása elfedte az enhancer hatást. A (-)deprenil volt az első amfetamin származék, mely elvesztette releasing hatását, de megtartotta az enhancer hatást, így lehetővé tette e mechanizmus felfedezését. A (-)-
2
BPAP, az első triptamin származékú szinetetikus enhancer vegyület, a jelenleg ismert legspecifikusabb és leghatékonyabb anyag az enhancer reguláció vizsgálatára. E tanulmány célja a két endogén enhancer vegyület (PEA, triptamin), valamint a referens anyagként használt szintetikus enhancer vegyületek {(-)-deprenil, (-)-PPAP, (-)-BPAP} hatásának és hatásmódjának elemzése.
CÉLKITŰZÉSEK 1./ Az enhancer reguláció működésének bizonyítása patkány központi idegrendszerében és a hatás néhány sajátosságának jellemzése katecholaminerg szerkezetű, ismert szintetikus {szelektív MAO-B bénító (-)-deprenil} és endogén (β-feniletilamin, tiramin) anyagok segítségével. 2./ A (-)-metamfetamin, a (-)-deprenil egyik fő metabolitja enhancer hatásának vizsgálata. 3./ Olyan amfetamin változatú, szelektívebb és hatékonyabb enhancer vegyület, a (-)PPAP, hatásának analízise, melynek segítségével igazoltuk, hogy az enhancer hatás független a MAO-B enzim bénításától. 4./ A triptamin, mint indol struktúrájú, ismert endogén enhancer anyag hatásának vizsgálata annak bizonyítására, hogy az enhancer hatás nem kötött katecholamin struktúrához. 5./ A (-)-deprenil kémiai szerkezetétől már jelentősen eltérő, de annál sokkal erősebb enhancer hatással rendelkező, szelektív, triptamin-származékú újonnan kifejlesztett vegyület, a (-)-BPAP hatásspektrumának jellemzése patkány agyban.
3
MÓDSZEREK Munkánk során kétféle metodikával határoztuk meg az endogén és szintetikus enhancerek hatására létrejött biogén aminok felszabadulását. Mindkét kísérletsorozatban 200-220 g-os Wistar hím patkányokat használtunk. 1./ Egyrészt jelzett noradrenalin, dopamin, szerotonin felszabadulását mértük izolált patkány
agytörzsből,
melynek
során
preinkubációval
inkorporáltunk
[3H]-
noradrenalint, [3H]-dopamint vagy [3H]-szerotonint a MAO- bénítót, antioxidást, majd uptake gátlót is tartalmazó Krebs oldatba helyezett agytörzs szövetébe. 100 perces átmosással szövetfürdőjében a preparátumot equilibráltuk, majd az átáramló Krebs oldatból 3 perces frakciókat gyűjtve határoztuk meg a kiáramló transzmitter mennyiségét luiqid-szcintillációs spektrométerrel. A preparátumot meghatározott időközönként elektromos négyszög impulzusokkal (3 Hz, 1 ms, 60 V) ingereltük. 2./ Másrészt izolált patkány agyrészletekből dopamin, noradrenalin és szerotonin felszabadulást mértünk elektrokémiai detektoros HPLC technika alkalmazásával. A dopamin release mértékét: substantia nigrából, tuberculum olfactoriumból, striatumból; a noradrenalin felszabadulást: locus coeruleusból és a szerotonin release-t: rapheból határoztuk meg. A meghatározott szövetmintákat 20 percig normál Krebs oldatban inkubáltuk, majd az oldatot frissre cserélve újabb 20 percig áztattuk. A második 20 perces 2 ml mennyiségű Krebs oldatot centrifugálás után mikrooszlopon tisztítottuk, és az így nyert minták biogén amin tartalmát a HPLC-hez csatlakoztatott integrátor által számolt, belső standardhoz viszonyított csúcsok alatti területekből.
EREDMÉNYEK 1./ A (-)-deprenil fokozza az idegingerlésre felszabadult [3H]-noradrenalin, a [3H]dopamin és a [3H]-szerotonin mennyiségét izolált patkány agytörzsön. Az enhancer hatású anyag leghatékonyabban a [3H]-dopamin release-t fokozta a négyszög impulzusok hatására. Már 0.2 pg/ml (-)-deprenil is szignifikánsan növelte a dopaminerg
4
neuron aktivitását. Hasonló hatást eredményezett a noradrenerg neuronokon 0.2 µg/ml koncentrációban. A (-)-deprenil legkevésbé a [3H]-szerotonin felszabadulását befolyásolta az elektromos stimuláció hatására, de itt is kimutatható volt. A (-)-deprenil egyszeri dózisaival előkezelt patkányok agyrészletein a noradrenerg (locus coeruleus) és a dopaminerg (substantia nigra, tuberculum olfactorium, striatum) rendszer működése szignifikánsan és dózis-függően fokozódott. Ebben az in vivo végzett kísérletben is a (-)-deprenil MAO-B bénító dózisnál (0.25 mg/kg) kisebb adagban ( 0.025 mg/kg) fejtette ki az enhancer hatását. A (-)-deprenil a szerotonerg rendszerre 0.01-0.025 mg/kg dózis tartományban nem hatott, sőt az ennél nagyobb koncentrációban enyhe, de szignifikáns gátlást mutatott. A (-)-deprenil olyan PEA származék, mely már nem rendelkezik a PEA származékokra jellemző ’release’ hatással, csak az enhancer hatása maradt meg. Izolált patkány agytörzsön analizálva a PEA és a tiramin enhancer hatását megállapítottuk, hogy mindkettő nagy aktivitású enhancer anyag 2 µg/ml koncentrációban. 2./ A (-)-metamfetamin is, mely a (-)-deprenil egyik fő metabolitja egy PEA származékú vegyület és hozzá hasonlóan rendelkezik mind a release mind az enhancer hatással. A (-)-metamfetamin enhancer hatását mértük mindkét módszer segítségével és megállapítottuk, hogy az izolált patkány agytörzsön (-)-deprenilhez hasoló mértékben fokozta a jelzett biogén aminok felszabadulását, míg az egyszeri dózisokkal történt kezelés után 10-25-ször gyengébben hatott az izolált patkány agyrészleteken. 3./ Mértük a (-)-PPAP enhancer aktivitását , mely egy MAO-B enzim bénítással nem rendelkező (-)-deprenil-származék. A (-)-PPAP az anyavegyületéhez, a (-)-deprenilhez, hasonlóan a [3H]-dopamin felszabadulást fokozta a legjobban (0.2 µg/ml). A [3H]noradrenalin felszabadulást 2 µg/ml (-)-PPAP mennyisége jelentősen fokozta és a leggyengébb szintén a szerotonerg rendszeren kifejtett hatása volt. 4./ Analizálva a triptamin enhancer hatását megállapíthatjuk, hogy 2 µg/ml koncentrációban a [3H]-noradrenalin mennyisége, 0.2 µg/ml koncentrációban a [3H]szerotonin mennyisége és 5 µg/ml koncentrációban a [3H]-dopamin mennyisége fokozódott az idegingerlés hatására. A triptamin enhancer hatásából kiindulva
5
kifejlesztettünk egy új nagyhatékonyságú szelektív triptamin-származékú enhancer vegyületet, a (-)-BPAP-t, mely 130-szor hatékonyabb in vivo kísérletekben mint a (-)deprenil. 5./
R-(-)-1-(Benzofuran-2-yl)-2-propilaminopentan
HCl,
(-)-BPAP
jelenleg
a
leghatényabb enhancer vegyület, mely mind in vivo mind ex vivo kísérletekben jellegzetes harang alakú dózis-hatás görbét mutat két dózis tartományban. A sajátos hatást kiimutattuk a nanomoláris (10-16-10-12) és a mikromoláris (10-8-10-4) koncentrációkkal, melyeket elválaszt egy hatástalan dózis-tartomány. A vegyület szelektivitását mutaja, hogy a MAO gátlók, a re-uptake gátlók és a dopamin receptor agonisták enhancer hatása a (-)-BPAP mellett nem volt kimutatható.
EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE (-)-Deprenil, a PEA származékú enhancer vegyület, jelenleg az egyetlen világszerte használt gyógyszer, mely specifikus módon serkenti az agytörzsi neuronok működését. Az a felfedezés, hogy a triptamin is enhancer hatással rendelkezik, vezetett el a (-)BPAP, az első triptamin származékú enhancer vegyület kidolgozásához, mely jelenleg a gyógyszerré fejlesztés preklinikai stádiumában van. A (-)-BPAP reményteljes jelölt arra, hogy a (-)-deprenilt követő új enhancer hatású gyógyszerré fejlődjön. A (-)-BPAP már a nanomoláris koncentráció tartományban szignifikánsan fokozza agytörzsből az idegingerlés hatására kiáramló [3H]-noradrenalin, [3H]-dopamin, [3H]-szerotonin mennyiségét. Katecholaminerg (striatum, substantia nigra, tuberculum olfactorium, locus coeruleus) illetve szerotonerg (raphe) izolált agyszövetből is a (-)-BPAP nanomoláris koncentrációjának jelenlétében szignifikánsan fokozódik a kiáramló transzmitter mennyiség. A (-)-BPAP ugyancsak nanomoláris koncentrációban serkenti a tenyésztett hippocampalis kolinerg neuronok működését. A (-)-BPAP enhancer hatását nagyon sajátos módon fejti ki. Találunk két harang alakú koncentráció-hatás görbét. Az első, az élettani szempontból nyílvánvalóan elsőrendű fontosságú, a nanomoláris koncentráció tartományban; a vizsgált neurontól függően a csúcsérték a 10-12-10-14 M-nál van. A második a mikromoláris tartományban 10-6-10-8
6
M-nál található. Nagyon figyelemre méltó a további kutatások és az enhancer reguláció élettana szempontjából, hogy csak az agytörzsi neuronokon találtuk ezt a bipoláris hatást. Kéreg sejteken (patkány tenyésztett kérgi neuronjain) és glia sejteken (egér tenyészett astrocytáin) csak a mikromoláris koncentráció tartományban van a (-)-BPAPnak hatása és nanomoláris koncentrációkban hatástalan. Az enhancer reguláció a drive (hajtóerő) élettani alapját jelentő mechanizmus és e regulációnak kor-függő csőkkenése felelős minden valószínűség szerint az agy teljesítményének öregkori hanyatlásáért. Ez magyarázhatja, hogy miért bizonyult a (-)deprenil, az egyetlen forgalomban levő enhancer hatású gyógyszer, hatékony ’antiaging’ szernek, hogy miért lassítja (-)-deprenil kezelés a korfüggő neurológiai betegségek (Parkinson kór, Alzheimer kór) progresszióját, hogy miért hosszabbítja meg szignifikánsan állatok élettartamát a fiatal kortól halálig tartó (-)-deprenil kezelés és hogy, miért érhető el egyes állatokon még a technikai élethatár (technical life span, TLS) túllépése is. Az enhancer reguláció alaposabb megismerésével és annak lehetőségével, hogy e reguláció korfüggő csökkenését olyan szelektív és hatékony enhancer vegyülettel, mint a (-)-BPAP lassítani tudjuk, elérhetőnek ígérkezik, hogy az élet hanyatló szakaszában az enhancer regulációt a fiatalabb életszakaszra jellemző állapot felé toljuk el. A (-)deprenillel már megismert állatkísérletes és klinikai adatok valószínűsítik, hogy a szexuális érettségtől a halálig tartó profilaktikus enhancer adagolással az öregkori életminőség javulhat, kitolódhat a természetes halál ideje, csökkenhet az öregkori depresszió, valamint a korfüggő neurológiai betegségek manifesztálódásának veszélye.
AZ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA Az indirekt módon ható endogén szimpatomimetikus aminok {β-feniletilamin (PEA), tiramin}, miként tartós hatású szintetikus analógjaik az amfetaminok, erőteljesen fokozzák a katecholaminok kiáramlását a transzmitter raktárakból (’releasing’ hatás). A 90-es években kiderült, hogy a ’releasing’ hatás évtizedekig elfedte a PEA és az amfetaminok fő hatását. Ezek a vegyületek fokozzák az idegingerlés hatására bekövetkező katecholamin és szerotonin kiáramlást, az exocitózist, az agyi neuronokban
7
(’enhancer’ hatás). A (-)-deprenil (Selegiline, Jumex) volt az első, és máig is az egyetlen klinikumban használt PEA derivátum, mely elvesztette anyavegyületének ’releasing’ hatását, de megtartotta az ’enhancer’ hatást. Emellett a (-)-deprenil volt az elsőként leírt szelektív MAO-B bénító, és e hatása alapján került a figyelem középpontjába. A (-)deprenil enhancer hatása független a MAO-B enzim bénító hatásától, mert egy olyan (-)-deprenil analóg vegyület, a (-)-PPAP is ’enhancer’ hatású, mely már nem rendelkezik MAO gátló tulajdonsággal. Ezenkívül más MAO gátlók, mint a klorgilin (a MAO-A szelektív bénítója) és a lazabemid (a MAO-B szelektív bénítója) nem rendelkeznek enhancer hatással. További kutatások bizonyították, hogy az endogén indol-analóg, a triptamin, is hatékony enhancer vegyület. Ez a felismerés vezetett egy olyan triptamin analóg, a (-)-BPAP, kidolgozásához, mely hatékonyabb és szelektívebb mint a (-)-deprenil. A (-)-deprenil enhancer hatásának köszönheti, hogy lassítja a szexuális és tanulási képesség korfüggő csökkenését, meghosszabbítja az élettartamot és szignifikánsan csökkenti a Parkinson és Alzheimer kór progresszióját. A (-)-BPAP, kísérleteink szerint várhatóan minden tekintetben hatékonyabb lesz mint a (-)-deprenil.
A TÉZISEK ALAPJÁT KÉPEZŐ KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Miklya I, Knoll J: Small-dose administration of (-)deprenyl, (-)PPAP and (-)metaphetamine enhances catecholaminergic and diminishes serotoninergic tone in the brain. Polish Journal of Pharmacology 46:4, 1994 Miklya I, Rácz D, Knoll J: CNS effect of (-)deprenyl unrelated to MAO-B inhibition. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology 72. Suppl. 1, 1994 Knoll J, Yen TT, Miklya I: Sexually low perfoming male rats die earlier than their high performing peers and (-)deprenyl treatment eliminates this difference Life Sciences 54:1047-1057, 1994 Knoll J, Miklya I: Multiple, small dose administration of (-)deprenyl enhances catecholaminergic activity and diminishes serotoninergic activity in the brain and these effects are unrelated to MAO-B inhibition. Arch Int Pharmacodyn Ther 328:1-15, 1994
8
Knoll J, Miklya I: Enhanced catecholaminergic and serotoninergic activity in rat brain from weaning to sexual maturity: rationale for preventive (-)deprenyl medication. Life Sciences 56:611-620, 1995 Miklya I, Knoll J: Single, small dose administration of (-)metamphetamine (MA) and ()deprenyl (D), in contrast to (+)MA enhances catecholaminergic activity and diminishes serotoninergic activity in the brain stem of rats. Pharmacological Research Suppl 31: 351, 1995 Knoll J, Miklya I, Knoll B, Markó R, Kelemen K: (-)Deprenyl and (-)PPAP act primarily as potent stimulants of action protential - transmitter release coupling in the catecholaminergic neurons. Life Sciences 58:817-827, 1996 Knoll J, Knoll B, Miklya I: High performing rats possess significantly higher brain noradrenergic and serotoninergic activity and are more sensitive toward (-)PPAP, a catecholaminergic activity enhancer compound , than their low performing peers. Life Sciences 58:945-952, 1996 Knoll J, Miklya I, Knoll B, Markó R, Rácz.D: PEA and tyramine are mixed-acting sympatomimetic amines in the brain. Life Sciences 58:2101-2114, 1996 Miklya I, Knoll B, Knoll J: Bretylium enhances vasoconstrictor responses of the rabbit ear artery to field stimulation of intramural sympathetic nerves. Archives of Pharmacology Suppl.2. 358:591, 1998 Miklya I, Knoll B, Knoll J: Catecholaminergic and serotoninergic activity enhancer (CAE/SAE) substances. Fundamental & Clinical Pharmacology Suppl.1, 13:49S, 1999 Knoll J, Yoneda F, Knoll B, Ohde H, Miklya I: (-)1-(Benzofuran-2-yl)-2propylaminopentane, (-)BPAP, a selective enhancer of the impulse propagation mediated release of catecholamins and serotonin in the brain. British Journal of Pharmacology 128:1723-1732, 1999 Knoll J, Miklya I, Knoll B, Dalló J: Sexual hormones terminate in the rat the significantly enhanced catecholaminergic/serotoninergic tone in the brain characteristic to the post-weaning period. Life Sciences 67:765-773, 2000 Yoneda F, Moto T, Sakae M, Ohde H, Knoll B, Miklya I, Knoll J: Structure activity studies leading to (-)1-(Benzofuran-2-yl)-2-propylaminopentane, (-)BPAP, a highly potent, selective enhancer of the impulse propagation mediated release of catecholamines and serotonin in the brain. Bioorganic & Medicinal Chemistry 9:11971212, 2001
9
Miklya I, Knoll B: Analysis of the catecholaminergic/serotoninergic activity enhancer effect of (-)BPAP. Neuropsychopharmacologia Hungarica Suppl. 3:40, 2001 Knoll J, Miklya I, Knoll B: Stimulation of the catecholaminergic and serotoninergic neurons in the brain by R-(-)-1-(benzofuran-2-yl)-2-propylaminopentane, (-)-BPAP. Life Sciences 71:2137-2144, 2002 Knoll J, Miklya I, Knoll B, Yasusa T, Shimazu S, Yoneda F: 1-(Benzofuran-2-yl)-2(3,3,3-trifluoropropyl)aminopentane HCL, 3-F-BPAP, antagonizes the enhancer effect of (-)-BPAP in the shuttle box and leaves the effect of (-)-deprenyl unchanged. Life Sciences 71:1975-1984, 2002 Magyar K, Lengyel J, Bolehovszky A, Knoll B, Miklya I, Knoll J: Tha fate of (-)1(benzofuran-2-yl)-2-propylaminomentane HCl, (-)-BPAP, in rats, a potent enhancer of the impulse-evoked release of catecholamines and serotonin in the brain. European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics 27:157-161, 2002 Miklya I: A (-)deprenilnél hatékonyabb új enhancer vegyület, a (-)BPAP szelektív hatásának bizonyítása. Neuropsychopharmacologia Hungarica 4:84-90, 2002 Miklya I: A (-)deprenyl és a (-)BPAP enhancer hatásáról és e hatás jellegzetes dózisfüggéséről. Neuropsychopharmacologia Hungarica 4:91-98, 2002 Miklya I, Knoll B, Knoll J: Miért volt a (-)-deprenil (Selegilin, Jumex) hatékony és az α-tokoferol hatástalan a DATATOP vizsgálatban? Neuropsychopharmacologia Hungarica 4:168-172, 2002 Miklya I, Knoll J: Evidence for the selectivity of the effect of (-)-BPAP, the newly developed more specific and more potent enhancer substance than (-)-deprenyl (Selegiline). Life Sciences 2003 (in press) Miklya I, Knoll B, Knoll J: A pharmacological analysis elucidating why, in contrast to (-)-deprenyl (Selegiline), α-tocopherol was ineffective in the DATATOP study. Life Sciences 2003 (in press) Miklya I, Knoll B, Knoll J: An HPLC tracing of the enhancer regulation in selected discrete brain areas of food deprived rats. Life Sciences 2003 (in press)
10
A TÉZISEK ALAPJÁT KÉPEZŐ ELŐADÁSOK, POSZTERBEMUTATÓK Miklya I, Knoll J: Small-dose administration of (-)deprenyl, (-)PPAP and (-)metaphetamine enhances catecholaminergic and diminishes serotoninergic tone in the brain 4th Joint Meeting of Hungarian, Italian and Polish Pharmacological Societies Poznan, Poland, September 19-21, 1994. Miklya I, Rácz D, Knoll J: CNS effect of (-)deprenyl unrelated to MAO-B inhibition. 12th International Congress of Pharmacology Montreal, Canada, July 24-29, 1994. Miklya I, Knoll J: Single, small dose administration of (-)metamphetamine (MA) and (-)deprenyl (D), in contrast to (+)MA enhances catecholaminergic activity and diminishes serotoninergic activity in the brain stem of rats. 1st European Congressof Pharmacology (EPHAR) Milan, Italy, June 16-19, 1995. Miklya I, Knoll B, Knoll J: An anomalous effect of bretylium. 6th Joint Meeting of the Italian, Hungarian and Polish Pharmacological Societies Pisa, Italy, May 14-16, 1998. Rácz D, Miklya I, Knoll J: Comparison of (-)methamphetamine, (+)methampetamine and (-)deprenyl catecholaminergic and serotoninergic activity in the brain stem of rats. 6th Joint Meeting of the Italian, Hungarian and Polish Pharmacological societies. Pisa, Italy, May 14-16, 1998. Miklya I, Knoll B, Knoll J: Bretylium enhances vasoconstrictor responses of the rabbit ear artery to field stimulation of intramural sympathetic nerves. 13th International Congress of Pharmacology (IUPHAR) München, Germany, July 26-31, 1998. Miklya I, Knoll B, Knoll J: Catecholaminergic and serotoninergic activity enhancer (CAE/SAE) substances. 2nd European Congress of Pharmacology (EPHAR) Budapest, Hungary, July 3-7, 1999. Miklya I, Knoll B: Analysis of the catecholaminergic/serotoninergic activity enhancer effect of (-)BPAP. Collegium Internationale Neuro-psychopharmacologia (CINP), Hungarian Hungarian Regional Congress jointly with the 4th Neuropsyhopharmacologic Congress, Symposium, Budapest, Hungary, September 2023, 2001.
11
